I

Universidad de Colima

DIFERENCIAS REGIONALES EN LOS POTENCIALES DE ACCIÓN DEL

VENTRÍCULO DE MAMÍFERO

Monografía que para obtener el grado de

Maestro en Ciencias Fisiológicas con especialidad en Fisiología

presenta

Q.F.B Carlos Antonio Anell Medina

Asesor Dr. Alejandro Manuel Elizalde Lozano

Colima, Col. Noviembre de 2001

II

AGRADECIMIENTOS A todas las personas que me apoyaron para llevar a cabo este trabajo, especialmente al

M. en C. José Fausto Atonal Flores y al Biol. Juan Fernando Fernández Gómez, por los

consejos y el apoyo técnico que me brindaron.

A mis maestros, en especial al Dr. Alejandro M. Elizalde, por la guía y los

conocimientos que me dieron.

A mi familia, a mi papá José A. Anell y a mi mamá I. Minerva Medina, por su apoyo

incondicional.

Este trabajo se realizó con la ayuda de las becas otorgadas por el CONACyT y por el

fondo “Juan García Ramos” de la Universidad de Colima.

Y a todos mis amigos.

III

ÍNDICE

Introducción. 1

Función del corazón. 1

Potenciales de acción en el músculo cardiaco. 3

Mecanismos iónicos del potencial de acción cardiaco. 5

Diferencias regionales del potencial

de acción del ventrículo de mamífero. 10

Perro 10

Cobayo 18

Rata 21

Humano 22

Conejo 23

Gato 23

Resultados Preliminares. 24

Métodos 24

Solución de Tyrode 25

Protocolo experimental 25

Análisis de los datos 26

Análisis estadístico 27

Resultados. 27

Implicaciones fisiológicas y fisiopatológicas

de las diferencias regionales en la forma

del potencial de acción de la pared ventricular de mamífero. 33

Conclusión y perspectivas. 38

Bibliografía 40

IV

ÍNDICE DE TABLA Y FIGURAS

FIGURA PÁGINA

1 Sistema de conducción cardiaco. 1

2 Registros del potencial de acción en

diferentes regiones del corazón. 3

3 Fases del potencial de acción. 4

4 Representación esquemática de las

corrientes iónicas. 7

5 Potenciales de acción registrados en

el ventrículo de perro. 11

6 Restitución eléctrica del potencial de

acción en el ventrículo de perro. 12

7 Restitución eléctrica del potencial de

acción en el ventrículo de perro en presencia de 4-AP. 13

8 Potencial de acción y Vmax registrados

en la pared de ventrículo de perro. 14

9 Potencial de acción registrado en la

pared del ventrículo de perro a

diferentes frecuencias de estimulación. 15

10 Potenciales de acción registrados en

miocitos aislados del ventrículo de perro. 16

11 Potencial de acción registrado en la

pared ventricular de gato. 27

12 Potencial de acción registrado en la

pared ventricular de gato a

diferentes frecuencias de estimulación. 28

13 Efecto de la frecuencia de estimulación

en la duración del potencial de acción. 29

V

14 Efecto de la frecuencia de estimulación

en la magnitud de la fase 1. 30

15 Restitución eléctrica del potencial de

acción registrado en el ventrículo de gato. 31

16 Recuperación de la magnitud de la

fase 1. 32

17 Recuperación de la duración del

potencial de acción. 33

18 Trazado electrocardiográfico. 34

19 Correlación temporal entre el

electrocardiograma y el potencial de

acción ventricular. 35

20 Registros del potencial de acción en

la pared del ventrículo de perro. 37

TABLA

1 Corrientes de potasio en el ventrículo de perro. 17

2 Corrientes de potasio en el ventrículo de cobayo. 19

3 Duración del potencial de acción en el ventrículo de cobayo. 20

VI

ABREVIATURAS EMPLEADAS

4-AP 4-aminopiridina

DPA90 duración del potencial de acción al 90 % de la repolarización

ECG electrocardiograma

EGTA ácido etilenglicol-bis-(b-aminoetil éter)-N,N,N',N'-2-etanosulfónico

ENDO endocardio

EPI epicardio.

FP fibras de Purkinje.

HAV haz auriculoventricular.

LQT síndrome del QT largo

M zona media de la pared ventricular.

MF1 magnitud de la fase 1.

Nodo AV nodo auriculoventricular.

Nodo SA nodo senoauricular.

pdm potencial diastólico máximo.

PDT posdespolarizaciones tempranas.

PMR potencial de membrana en reposo.

QTc intervalo QT corregido

QT intervalo QT

S1 estimulo basal

S2 estimulo extra

VD ventrículo derecho.

VI ventrículo izquierdo.

Vmax velocidad máxima de despolarización.

VII

RESUMEN

Se conoce que existen diferencias electrofisiológicas en el potencial de acción de las células de

la pared del ventrículo de perro. Los datos experimentales han proporcionado evidencia de la

existencia de la existencia de tres tipos de células: células endocardicas (ENDO), células de la

región media (células M) y células epicardicas (EPI). Los potenciales de acción de las células

M y EPI muestran una morfología de espiga y domo, que no se presenta en las células de

ENDO. Además, la duración del potencial de acción de las células M se prolonga mas que en

células de EPI o ENDO, cuando son estimuladas a a bajas frecuencias o cuando se exponen a

fármacos antiarrítmicos de la clase III. En este trabajo se revisan las propiedades fisiológicas

de estas células ventriculares de perro y de otros mamíferos. Además, se presentan datos

preliminares que indican que en la zona media de la pared ventricular de gato existen células

tipo M.

ABSTRACT

It is know that transmural heterogeneity exists in electrophysiological characteristics of action

potentials in dog ventricle. The experimental data have provided evidence for tree functionally

different cell types: endocardial cells (ENDO), midmyocardium cells (M) and epicardial cells

(EPI). Action potentials of epicardial and M cells shows the spike and dome morphology but

not in endocardial cells. The action potential duration is longer in M cells than EPI and

ENDO. In addition, the action potential of M cells is disproportionate prolonged by the

exposure to class III antiarrhythmic drugs or when they are stimulated at low frequencies in

comparison with the other cell types. In the present work the evidence about the physiological

properties of these cells in dog and other mammals are revised. Furthermore, preliminary data

about the existence of M cells in cat ventricular wall are presented.

1

DIFERENCIAS REGIONALES EN LOS POTENCIALES DE ACCIÓN

DEL VENTRÍCULO DE MAMÍFERO

INTRODUCCIÓN

Función del Corazón:

El corazón bombea sangre hacia las arterias para su distribución a todos los tejidos del

organismo. El bombeo ocurre por la contracción de las paredes de las aurículas y los

ventrículos, constituidas por músculo cardiaco (Berne y Levy, 1997; Schlant et al, 1990).

Para su apropiada función, las aurículas y los ventrículos, se deben contraer y relajar en

Figura 1: Sistema de conducción cardiaco. Aurículas (AI = izquierda, AD =

derecha) ventrículos (VI = izquierdo, VD = derecho), nodo senoauricular (NSA), nodo auriculoventricular (NAV), sistema de conducción: haz auriculoventricular o haz de His (HAV) y ramas derecha e izquierda y fibras de Purkinje (FP). Modificado de Harary y Farley, 1962.

2

forma ordenada. La alternancia entre la relajación y la contracción del órgano permite que

durante la relajación (diástole) las cavidades cardiacas se llenen con sangre y durante la

contracción (sístole) la sangre sea expulsada hacia las arterias.

Los eventos que conducen a la contracción son disparados por la excitación del

miocardio. Este fenómeno eléctrico consiste en la generación de potenciales de acción y su

propagación de célula a célula, a través de todo el órgano. Sin embargo debido a la diversidad

celular del miocardio, esta propagación adquiere características diferentes conforme avanza a

lo largo del corazón (Schmidt y Thews, 1987).

La actividad eléctrica cardiaca se inicia en el nodo seno auricular (nodo SA), estructura

localizada cerca de la desembocadura de la vena cava superior (véase figura 1), constituida por

células cardiacas pequeñas que poseen poca contractilidad pero tienen la propiedad de generar

de manera automática potenciales de acción. El nodo senoauricular es el marcapaso cardiaco

debido a que este grupo celular exhibe descargas automáticas de potenciales de acción con una

mayor frecuencia (70/min) que otras estructuras que poseen automatismo (nodo auriculo-

ventricular 40-60/min; fibras de Purkinje 20/min; (Katz, 1992; Schmidt y Thews, 1987).

Desde el nodo SA el potencial de acción se propaga por las paredes auriculares con una

velocidad de conducción de 1 a 1.2 m/s hacia el nodo auriculo-ventricular (nodo AV).

Este nodo conecta eléctricamente a las aurículas con el sistema de conducción rápida,

el cual esta constituido por el haz de His, sus ramas derecha e izquierda y las fibras de

Purkinje, que finalmente conducen la excitación hacia las células de los ventrículos.

A nivel del nodo AV normalmente existe un retardo en la conducción de la excitación

de unos 0.10 s debido a su baja velocidad de conducción (0.02 a 0.05 m/s).

Las células del sistema de conducción son células grandes, contienen abundante

glucogeno y escasas miofibrillas por lo que se contraen débilmente, su principal función es la

conducción rápida de potenciales de acción (1.2 a 4 m/s) hacia los ventrículos asegurando su

activación casi sincrónica (Billette y Shrier, 1995; DiFrancesco et al, 1995; Katz, 1992;

Schmidt y Thews, 1987).

En las paredes de las aurículas y los ventrículos se encuentran células miocárdicas que

presentan estriaciones transversales típicas del músculo estriado y cuya función principal es la

de contraerse y realizar el trabajo mecánico, la propagación de la excitación en los ventrículos

se realiza con una velocidad de ≈ 1 m/s (Katz, 1992).

3

Potencial de Acción en el Músculo Cardiaco.

En las células del miocardio el potencial de membrana en reposo varia entre –80 a –90

mV en el sistema de conducción, aurículas y ventrículos. En los nodos no hay un potencial de

reposo estable pero alcanza por tiempos breves valores de –50 a –60 mV en el potencial

diastólico máximo. Las características de los potenciales de acción obtenidos usando la técnica

de registro con microelectrodos intracelulares, difieren en cada una de las células antes

mencionadas, como puede observarse en la figura 2 en la que se ilustran las diferencias en la

forma del potencial de acción que se registran en distintas regiones del corazón.

Durante la generación del potencial de acción, la membrana se despolariza y el

Figura 2: Potenciales de acción registrados en diferentes regiones del corazón. a)

nodo senoauricular, b) aurícula, c) nodo auriculoventricular, d) haz de His, e) fibras de

Purkinje, f) ventrículo. Modificado de Hoffman y Cranefield, 1960.

4

potencial de membrana se invierte (el interior cambia a positivo respecto al exterior) por

algunos milisegundos, finalmente ocurre la repolarización y la célula recupera el potencial de

reposo (Berne y Levy, 1997).

En la figura 3 se ilustran las fases del potencial de acción en células del nodo

senoauricular y de ventrículo. Se observa que en el nodo (figura 3a) existe una despolarización

espontánea lenta (denominada fase 4) desde el potencial diastólico máximo, (pdm) hasta

alcanzar el umbral (u) de disparo del potencial de acción, dando lugar a la despolarización, o

fase 0 del potencial de acción en la cual el potencial de membrana apenas alcanza valores

positivos por un tiempo breve. Después ocurre la fase 3 o de repolarización hasta alcanzar los

valores del potencial diastólico máximo. La velocidad de despolarización durante la fase 0 en

los tejidos nodales es baja, del orden de 4 a 8 V/s. Debido a la despolarización espontánea

(potencial de marcapaso) que ocurre durante la fase 4, en estas células no existe un verdadero

potencial de reposo y descargan potenciales de acción de manera continua y automática

Figura 3: Fases del potencial de acción. a) nodo senoauricular y b) ventrículo. Modificada de Hoffman y Cranefield, 1960.

5

(Billette y Shrier, 1995; DiFrancesco et al, 1995; Fozzard y Baumgarten, 1991; Katz, 1992).

En contraste, en las células ventriculares (figura 3b) el potencial durante la fase 4 se

mantiene estable (PMR). Una vez que la onda de excitación alcanza a estas células o se les

aplica un estímulo de intensidad umbral, se inicia la despolarización (fase 0) de manera

abrupta y rápida, del orden de ≈ 200 V/s en células ventriculares de trabajo y hasta ≈ 500 V/s

en fibras de Purkinje. En las células ventriculares después de la fase de inversión del potencial

en la fase 0, ocurre una repolarización temprana denominada fase 1 que es seguida por la fase

2 o meseta del potencial de acción. Durante la fase 2, el potencial de membrana se mantiene

en valores positivos durante varios milisegundos antes de iniciarse la repolarización o fase 3,

al final de la cual se recupera el potencial de reposo (DiFrancesco et al, 1995; Gilmour y

Zipes, 1980; Opie, 1991).

Mecanismos Iónicos del Potencial de Acción Cardiaco:

El potencial de acción es generado por el flujo de iones a través de canales iónicos

dependientes de voltaje; esto se debe a que su apertura y cierre dependen del potencial de

membrana. Cuando un canal iónico se abre (se activa) permite el flujo de iones a través de la

membrana celular, la dirección de este movimiento depende del gradiente electroquímico del

ion para el cual el canal es selectivo. Este flujo iónico puede registrarse por medio de técnicas

electrofisiológicas como corriente iónica.

Por convención una corriente es de entrada cuando un ion positivo se mueve del

exterior al interior de la célula y una corriente de salida es el movimiento inverso. Si el ion es

negativo, una corriente es entrante cuando el ion se mueve del interior al exterior; si lo hace en

sentido inverso se conoce como corriente de salida. Las corrientes de entrada despolarizan a la

membrana y las de salida la repolarizan (Katz, 1992; Jalife et al, 1998).

El potencial de acción cardiaco que se observa en el ventrículo, es generado por la

participación de varias corrientes iónicas. Estas son: La corriente de entrada de sodio (INa), la

corriente transitoria de salida de potasio (Ito1), corriente transitoria de salida acarreada por

cloro y activada por calcio intracelular (Ito2), corriente de entrada de calcio (ICa), corriente de

salida de potasio de rectificador saliente o tardío (IK) y corriente de salida de potasio de

rectificador entrante o anómalo (IK1) (Catterall, 1995; Fozzard y Hanck, 1991; Gintant et al,

1991; Kass, 1995; Katz, 1992; Marban y O´Rourke, 1995; Pelzer, 1991).

6

En la figura 4 se representa de manera esquemática y aproximada la correspondencia

temporal de las principales corrientes iónicas con las fases del potencial de acción de las

células del miocardio.

La fase 0 corresponde a la despolarización rápida de la membrana que se genera

cuando los canales de sodio se activan y en consecuencia aumenta la conductancia al ion Na,

por lo que aparece la corriente entrante de sodio o INa. Los canales de sodio pueden encontrarse

en tres estados: cerrado, abierto e inactivado. Cuando un estimulo umbral despolariza la

membrana, hace que los canales de sodio pasen del estado cerrado de reposo al abierto debido

a la apertura de la compuerta de activación. Cuando los canales se encuentran abiertos

permiten el movimiento del ion sodio hacia el interior de la célula, desplazando el potencial de

membrana hacia el potencial de equilibrio del sodio (≈ +40 mV); sin embargo, cuando el

potencial de membrana alcanza valores de ≈ +20 y +30 mV, los canales de sodio pasan del

estado abierto al inactivado, por el movimiento de la compuerta de inactivación que bloquea el

paso a los iones de Na+. Para que el canal de sodio pase del estado cerrado e inactivado al

estado cerrado de reposo (disponible para abrirse de nuevo) el potencial de membrana debe

regresar al potencial de reposo (Catterall, 1995; Fozzard y Hanck, 1991).

La INa es una corriente muy rápida y de gran magnitud, se estima que la conductancia

pendiente es del orden de 12.3 pS (-80 a –20 mV) correspondiendo a una densidad de 2 a 4

canales /µm2 (en miocitos de cobayo, Mitsuiye y Noma, 1987).

La fase 1 se debe en parte a la inactivación de la INa, pero son dos las corrientes que

contribuyen principalmente a la repolarización temprana de la membrana en esta fase: Ito1 e Ito2

(Gintant, 1991; Jalife et al, 1998; Kass, 1995).

La corriente Ito1 es acarreada por potasio, se activa en el rango de potenciales de ≈ –20

mV y –30 mV; tiene una conductancia pendiente de 14 pS (+50 a +150 mV; miocitos de

aurícula de conejo) con una densidad de canales en la membrana plasmática de 1-3

canales/µm2 (Gintant et al, 1991; Kass, 1995). La densidad de corriente de Ito1 es de 102 pA/pF

(a +80 mV) y se bloquea con 4-AP (Furukawa et al 1990).

Hiraoka y Kawano (1989) encontraron una corriente transitoria de salida que no era

bloqueada por la 4-AP; esta corriente a diferencia de Ito1 se bloqueaba al sustituir el Ca2+

extracelular por Sr2+, o en presencia de rianodina en la solución del baño o EGTA en la

7

solución de la pipeta. Estas evidencias farmacológicas sugerían que esta corriente era activada

por iones Ca2+ liberados del retículo sarcoplásmico. Se ha propuesto que esta corriente es

acarreada por iones Cl-. (Zygmunt y Gibbons, 1991) ya que la corriente se inhibe al eliminar el

ion Cl- de la solución dentro del baño y al utilizar bloqueadores de canales de cloro. Esta

corriente es conocida como corriente Ito2, se activa a potenciales de ≈ -30 y -20 mV y la

densidad de corrientes es del orden de 10 pA/pF a +60 mV (Furukawa et al, 1990).

Se ha propuesto que a frecuencias de estimulación bajas, la contribución de Ito1 a la

Figura 4: Representación esquemática de las corrientes iónicas de entrada: INa, ICa-

L, ICa-T (trazos hacia abajo) y de salida: IK1, Ito, IKs e IKr (trazos hacia arriba) y su correspondencia aproximada con las fases del potencial de acción. La magnitud de las corrientes no esta a escala. (Modificada de Priori et al, 1999)

8

repolarización es mayor que la de Ito2, porque bajo estas condiciones el intervalo entre dos

potenciales de acción permite una completa recuperación de Ito1, lo que combinado con el

hecho de que la densidad de Ito2 es pequeña, la fase 1 del potencial de acción depende mas de

Ito1. Con altas frecuencias de estimulación, el intervalo entre dos potenciales de acción

sucesivos es insuficiente para que Ito1 logre recuperarse completamente de la inactivación, por

lo tanto la cantidad de corriente que fluye a través de este canal se reduce (Tseng y Hoffman,

1989). Debido a este factor y al hecho de que la activación de la corriente Ito2 depende del

calcio liberado a partir del retículo sarcoplásmico (Zygmunt y Gibbons, 1991) y de que el

calcio tiende a acumularse en el citoplasma con la estimulación de alta frecuencia (Fozzard et

al, 1991), en estas condiciones la fase 1 del potencial de acción depende mas de la corriente

Ito2 (Kass, 1995).

En la fase 2 (meseta) la corriente ICa, es la responsable de mantener la membrana a

potenciales positivos, contrarrestando el efecto de las corrientes de salida de potasio que se

conducen durante la meseta (Ito, IK). ICa se activa a potenciales de membrana mas positivos (≈

–40 a –30 mV) que la INa. La relativa lenta activación de ICa es responsable de la gran duración

del potencial de acción en el corazón, excepto en los nodos donde la meseta no es apreciable y

en las que esta corriente es responsable de la fase cero del potencial de acción. La meseta

ocurre debido a un balance entre las corrientes de entrada (ICa) y de salida acarreadas por

potasio (Ito e IK) (Jalife et al, 1998; Katz, 1992; Marban y O´Rourke, 1995).

En el corazón existen al menos 2 tipos de canales que acarrean la corriente de calcio

(Opie, 1991), ICaL (de umbral alto) que se activa a –40 mV, se inactiva lentamente y tiene una

conductancia pendiente de 20.6 pS (-30 a +40 mV) e ICaT (de bajo umbral) que se activa a -50

mV, se inactiva rápidamente y tiene una conductancia pendiente de 7.5 pS (-40 a +40 mV).

Una de las funciones de los canales de calcio tipo L cardiacos es en el acople excitación-

contracción, es decir, la entrada de calcio por este tipo de canal produce la liberación de calcio

del retículo sarcoplásmico, mecanismo denominado liberación de calcio inducido por calcio

(Fabiato, 1983; Nilius et al, 1986).

En los nodos los canales de calcio tipo T están involucrados en la actividad de

marcapaso participando en el ultimo tercio de la despolarización espontánea o fase 4 (Billette

y Shrier, 1995; DiFrancesco et al, 1995).

9

La densidad de los canales de calcio tipo L en miocitos ventriculares de cobayo es de

1-3 canales/µm2 (Jalife et al, 1998; Pelzer et al, 1991).

En las células del nodo senoauricular la despolarización del potencial de membrana en

la fase cero es producida por la activación de canales de calcio tipo L (Fozzard y Baumgarten,

1991).

Hacia el final de la meseta la magnitud de ICaL se reduce porque se inactiva (constante

de inactivación 30 ms a 0 mV, 35 °C, miocitos de cobayo, Pelzer et al, 1989) y la IK alcanza la

magnitud suficiente como para iniciar la fase 3 o de repolarización del potencial. La IK tiene

dos componentes, un componente de activación lenta o corriente IKs, que tiene una constante

de activación de 400 a 2500 ms que no rectifica y un componente de activación rápida o IKr

que tiene una constante de activación de 50 ms y que rectifica hacia adentro. IK es la

responsable de repolarizar la membrana hasta el potencial de reposo, sin embargo, en la parte

final de la fase 3 también contribuye a la repolarización la corriente IK1 (Jalife et al, 1998;

Katz, 1992).

En las células miocárdicas excepto los nodos, la fase 4 del potencial de acción

corresponde al potencial de reposo de la membrana (Katz, 1992). El potencial de reposo se

mantiene estable porque los canales del rectificador anómalo (IK1) conducen corriente a

potenciales negativos. Aparentemente, las células del nodo seno auricular carecen de estos

canales o bien son escasos, por tal motivo, en estas células no existe un verdadero potencial de

reposo. Al no contar con un potencial de reposo estable estas células presentan una

despolarización espontánea y automatismo.

Las corrientes responsables de la despolarización espontánea de las células del nodo

senoauricular son dos principalmente: IK e If. Se ha propuesto que después de la

despolarización rápida del potencial de membrana producida por la corriente de calcio (ICaL),

la corriente IK repolariza la célula hasta su potencial diastólico máximo (≈ -60 mV), y se activa

la corriente If que se activa con la hiperpolarización (rango de activación -50 a -40 mV; Jalife

et al, 1998). Simultáneamente al desactivarse IK (constante de desactivación 3 s) el potencial

de membrana se despolariza lentamente, al alcanzar valores mas positivos, se activa la

corriente de calcio acarreada por los canales tipo T (≈ -50 mV) y la activación de la corriente

de calcio tipo T despolariza el potencial de membrana hasta alcanzar el umbral de activación

10

de la corriente de calcio acarreada por los canales tipo L (≈ -40 mV), para producir un nuevo

potencial de acción (Fozzard y Baumgarten, 1991).

En células aisladas del tejido cardiaco se han descrito otras corrientes de potasio que

pueden contribuir a la repolarización del potencial de membrana, estas son la corriente de

potasio activada por acetilcolina IK(Ach) y la corriente de potasio dependiente de ATP IK(ATP).

La corriente IK(Ach) es una corriente que se activa cuando la acetilcolina se une al receptor

muscarinico (M2) de las células produciendo una hiperpolarización; a través de este

mecanismo el sistema parasimpático puede modular la frecuencia de disparo del nodo

senoauricular (Nemec et al, 1999; Jalife et al, 1998). La corriente IK(ATP), se activa cuando los

niveles intracelulares de ATP disminuyen como ocurre en la isquemia del miocardio, situación

en la que se produce una repolarización mas temprana de las células con el consecuente

acortamiento en la duración del potencial de acción (Furukawa et al, 1991).

La participación de las diferentes corrientes iónicas en la generación del potencial de

acción y sus fases, explica las diferencias que se observan en la forma del potencial de acción

cardiaco en los distintos tipos celulares hasta aquí descritos (Jalife et al, 1998).

Por otra parte, se conoce que también hay diferencias en la forma del potencial de

acción que se registra en distintas zonas de la pared de los ventrículos y que existen

diferencias entre especies de mamíferos en la forma del potencial de acción de los ventrículos

(Gilmour y Zipes, 1980; Kimura et al, 1990; Litovsky y Antzelevitch, 1988; Watanabe et al,

1983; Watanabe et al, 1985).

En este trabajo revisaremos las evidencias acerca de las variaciones regionales en la

forma del potencial de acción observadas en la pared del ventrículo en distintas especies de

mamífero. Además se presentan datos electrofisiológicos preliminares sobre la variedad

celular M en el ventrículo de gato, acerca de las cuales no existen datos publicados a la fecha

de la realización de esta tesis.

DIFERENCIAS REGIONALES DEL POTENCIAL DE ACCIÓN DEL VENTRÍCULO DE

MAMÍFERO.

Perro:

Durante varios años se pensó que en el ventrículo de mamífero solo existían

diferencias en la forma del potencial de acción entre las células del sistema de conducción

11

(fibras de Purkinje) y las células de trabajo (ventrículos) (Antzelevitch et al, 1995). Gilmour y

Zipes (1980) fueron uno de los primeros grupos en reportar diferencias en la forma que tiene

el potencial de acción en epicardio (EPI), con respecto a la que se observa en el endocardio

(ENDO) de la pared del ventrículo derecho de perro.

Posteriormente Litovsky y Antzelevitch (1988) estudiaron con mayor detalle las

características electrofisiológicas de los potenciales de acción del ventrículo izquierdo de

perro y reportaron que en las células del epicardio de perro la forma del potencial de acción

presenta una configuración característica consistente en una fase 1 pronunciada seguida de una

meseta elevada, (configuración denominada de espiga y domo, figura 5), que no se observa en

el endocardio.

Para comparar las diferencias entre EPI y ENDO utilizaron los siguientes parámetros

Figura 5: Potenciales de acción registrados en el ventrículo izquierdo de perro. MF1:

magnitud de la fase 1; : duración del potencial de acción al 90 % de la repolarización

(DPA90). Modificado de Litovsky y Antzelevitch, 1988.

del potencial de acción: a) La amplitud de la fases 0, 1 y 2 del potencial de acción, medidas

como la diferencia en mV entre el potencial de membrana en reposo (PMR) y el pico máximo

de la fase correspondiente, que en el caso de la fase 1 fue la máxima repolarización alcanzada

antes de iniciarse la meseta; b) La magnitud de la fase 1 (MF1), fue medida como la diferencia

en mV entre la amplitud de la fase 0 y la amplitud de la fase 1; y c) La duración del potencial

de acción al momento en el cual la repolarización se completaba al 90 % (DPA90).

Los resultados mostraron que: la amplitud de la fase 0 es mayor en el endocardio

(106.6 mV) que en el epicardio (91.3 mV), la magnitud de la fase 1 es mayor en el epicardio

(14.3 mV) con respecto al endocardio (7.4 mV) y la duración del potencial de acción al 90 %

de la repolarización del endocardio (164 ms) es mayor que la registrada para epicardio (143.8

ms).También estudiaron la restitución de la forma del potencial de acción en EPI y ENDO

Figura 6: Restitución eléctrica del potencial de acción en el ventrículo de perro a

dos frecuencias de estimulación diferentes. Frecuencia (Hz): a y c: 2.5; b y d: 0.5.

Modificado de Litovsky y Antzelevitch, 1988.

12

13

empleando el siguiente protocolo: después de 10 estímulos (S1) a la frecuencia control de 0.5

Hz y en estado estable, se aplicó un estimulo extra (S2) después de la repolarización del

décimo potencial generado por S1. Este protocolo se repitió variando el intervalo de tiempo

entre S1 y S2.

Encontraron que en EPI, si el intervalo entre S1 y S2 era pequeño, la amplitud de la

fase 0, 1 y 2 del potencial producido por S2 era mayor que en el control (S1). La forma de

espiga y domo desaparece si el intervalo entre S1 y S2 es pequeño y se recupera

progresivamente al aumentar la duración de este intervalo (véase figura 6).

En el endocardio el intervalo entre estímulos (S1 y S2), no afecta de manera importante

al potencial de acción. Sin embargo en endocardio y epicardio se observa que si S2 es muy

cercano a S1, la amplitud de la fase 0 es menor a la registrada en el control (figura 6).

La corriente principal que determina la magnitud de la fase 1 es Ito1, por lo tanto, para

comprobar de manera indirecta si las diferencias en la configuración del potencial de acción

entre EPI y ENDO se debían a la presencia de esta corriente en EPI y no en ENDO, utilizaron

Figura 7: Restitución eléctrica del potencial de acción en el ventrículo de perro en

condiciones control (a y b) y en presencia de 1 mM de 4-aminopiridina ( c y d) ). EPI (a y

c); ENDO (b y d). Frecuencia de estimulación 0.5 Hz. Modificado de Litovsky y

Antzelevitch, 1988.

14

la 4–aminopiridina (4-AP) un bloqueador de Ito1 a una concentración de 1 mM. En presencia

de 4-AP se observo que en ENDO no se producían cambios significativos excepto un

incremento de la duración del potencial de acción de 9.22 % (n = 8, p<0.05). En el epicardio,

la 4-AP produjo un incremento significativo en la amplitud de la fase 0 y 1, en un 4.84 % y

41.97 % respectivamente (n = 9, p<0.01), eliminaba la forma característica de espiga y domo y

producía un acortamiento en la duración del potencial de acción en un 7.32 % (n = 9, p<0.05;

Figura 7).

Estos resultados apoyan la idea de que en el epicardio la corriente Ito1 determina de

manera importante la configuración de espiga y domo. Trabajos posteriores han confirmado

Figura 8: Potenciales de acción y Vmax (trazos centrales) registrados en la pared del

ventrículo derecho de perro (a: EPI; b: zona M; c: ENDO). Frecuencia de estimulación 0.5

Hz. Modificado de Sicouri y Antzelevitch, 1991.

15

estos hallazgos (Antzelevitch et al, 1991; Liu et al, 1993; Litovsky y Antzelevitch, 1988; Yan

et al, 1998).

Sicouri y Antzelevitch (1991) encontraron en la zona media de la pared de los

ventrículos de perro, unas células diferentes a EPI y a ENDO desde el punto de vista

electrofisiológico a las que denominaron células M (o de la parte media de la pared).

Estas células presentaban las siguientes características: a) La duración del potencial de

acción y la Vmax (velocidad máxima de despolarización de la fase 0 o dV/dtmax) de las células

Figura 9: Potenciales de acción registrados en el ventrículo derecho de perro a

diferentes frecuencias de estimulación. Modificado de Sicouri y Antzelevitch, 1991.

16

M es mayor a la registrada en EPI y ENDO, cuando la frecuencia de estimulación es baja (0.5

Hz) y presentan la configuración de espiga y domo (figura 8).

b) A frecuencias de estimulación alta (3 Hz), la magnitud de la fase 1 se reduce en células M y

EPI sin cambios en la Vmax .

c) Otra característica que se observó es que la duración del potencial de acción, dependía mas

de la frecuencia de estimulación en las células M que en ENDO y EPI (figura 9). Al tratarlas

con 4-AP el potencial de acción de las células M perdía la forma de espiga y domo. Estos

Figura 10: Potenciales de acción registrados en miocitos aislados del ventrículo

izquierdo de perro a diferentes frecuencias de estimulación. Frecuencia (Hz): a (3.3); b (2);

c (1.25); d (0.5); e (0.25); f (0.13). Modificado de Liu et al, 1993.

17

hallazgos condujeron a los autores a proponer que la corriente responsable de la configuración

de espiga y domo en las células M era también Ito1. (Sicouri y Antzelevitch, 1991).

Los resultados encontrados en preparaciones multicelulares fueron confirmados en

células aisladas. Liu et al, (1993) encontraron que en miocitos aislados del ventrículo

izquierdo de perro el potencial de acción en EPI y M presenta una configuración de espiga y

domo la cual esta ausente en ENDO (figura 10). Estas diferencias se observan a altas y bajas

frecuencias de estimulación. Con estos resultados se confirmó que la forma de espiga y domo

del potencial de acción es una propiedad intrínseca de las células de epicardio y la zona media

del ventrículo (células M) y que no se debe a un artefacto (Litovsky y Antzelevitch, 1988). (-

20 mV)Además en este trabajo pudieron confirmar que también existían diferencias en la

corriente Ito1 en estas variedades celulares.

La densidad de la corriente Ito1 no es significativamente diferente en las células M con

respecto a EPI, pero la densidad de corriente en ENDO si es menor al compararla con

cualquiera de los dos tipos celulares. También estudiaron la corriente del rectificador anómalo

Tabla 1. Corrientes de potasio en el ventrículo de perro

Región Ito1 (+70 mV) Ito2 IK1 IKs

(-20 mV) IKr

(-20 mV)

EPI 29.0±13.7 (1) ¿? ns(1) 1.99± 0.14 (2) ns(2)

zona M 32.8±11.6 (1) ¿? ns(1) 0.92± 0.14

(2)** ns(2)

ENDO 5.59±3.19 (1)* ¿? ns(1) 1.83± 0.18 (2) ns(2)

Densidad de corriente (expresada en pA/pF al voltaje indicado en el paréntesis) para las

corrientes de potasio de las células de la pared del ventrículo de perro (¿?: no hay datos en la

literatura;(ns: diferencia no significativa); Diferencias significativas: *p<0.01 entre ENDO y

EPI; ** p<0.05 entre M y EPI ). 1. Liu et al, 1993; 2. Liu y Antzelevitch, 1995.

18

(IK1) y no encontraron diferencias significativas entre los tres tipos de células (Tabla 1) (Liu et

al, 1993).

Posteriormente, Liu y Antzelevitch (1995) encontraron que la magnitud de corriente

del rectificador tardío (IK) es menor en la zona M con respecto a las otras 2 regiones de la

pared del ventrículo izquierdo del perro. Este resultado podría explicar la mayor duración del

potencial de acción encontrado en células M.

Se sabe que IK esta compuesta por al menos 2 corrientes con propiedades

farmacológicas y electrofisiológicas diferentes, denominadas IKs e IKr (Barajas et al, 2000;

Kass, 1995; Matsuura et al, 1987; Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990; Sanguinetti y Jurkiewicz,

1991; Zeng et al, 1995).

Liu y Antzelevitch (1995) separaron los componentes de IK en miocitos aislados del

ventrículo de perro y encontraron que en las células M la densidad de corriente IKs era menor

que en epicardio o en endocardio. No se encontraron diferencias significativas en IKr entre las

3 regiones de la pared ventricular (Tabla 1). Por lo tanto, se puede concluir que la menor

densidad de IK en la región M es la responsables de la mayor duración del potencial de acción

encontrada en células M cuando se compara con epicardio y que el componente involucrado es

IKs.

Cobayo:

En el cobayo, no existe un acuerdo general acerca de las diferencias regionales halladas

en el potencial de acción cardiaco de los ventrículos. Watanabe et al, (1985) reportaron que

tanto en preparaciones multicelulares como en miocitos aislados del ventrículo izquierdo, la

duración del potencial de acción era mayor en ENDO que en EPI. Propusieron que esto se

debía a diferencias en el flujo neto de la corriente iónica a través de los distintos canales de la

membrana. Mas adelante, Main et al, (1995) confirmaron estos hallazgos.

Sicouri et al, (1996) reportaron la existencia de 3 tipos de células, de acuerdo con su

localización en el ventrículo. A 0.2 Hz La duración del potencial al 90 % de la repolarización

era mayor en las células de la región media del ventrículo que en las otras dos regiones (M:

185 ms, ENDO: 135 ms y EPI: 133 ms). Además la células de la región media tenían

características similares a las células M encontradas en perro (Sicouri y Antzelevitch, 1991).

19

Debido a que en el cobayo no existe Ito1, (Hirano y Hiraoka, 1988; Ryder et al, 1993;

Sicouri et al 1996), proponen que las diferencias regionales en la duración del potencial de

acción de la pared del ventrículo izquierdo de cobayo, pueden deberse a las diferencias

presentes en la corriente del rectificador tardío (IK), y que, probablemente el componente lento

(IKs) del rectificador tardío, sea menor en las células de la región M con respecto a las otras

dos regiones.

Main et al, (1998) estudiaron las corrientes iónicas y el potencial de acción usando

miocitos aislados de la pared ventricular, en los que encontraron diferencias regionales en la

duración del potencial de acción y la magnitud de IK. La duración del potencial de acción al 90

% de la repolarización fue mayor en células M que en ENDO o EPI (Tabla 3).

La corriente IK a fue mayor en EPI que en ENDO o la región M. La diferencia de la

densidad de corriente IK entre ENDO y M no fue significativa. IKr fue mayor en EPI que en la

zona M o ENDO (Tabla 2).

Tabla 2: Corrientes de potasio en el ventrículo de cobayo

Región IK (+80 mV) IKs

IKr (+60 mV)

IK (+60 mV)

IKs (+60 mV)

IKr (0 mV)

EPI 1.59± 0.16 (1)* ns(1) 0.5± 0.04

(1)* 3.90± 0.41

(2) 3.52± 0.41

(2) ns(2)

zona M 1.13± 0.11

(1) ns(1) 0.38± 0.05

(1) 4.05± 0.09

(2) 3.47± 0.25

(2) ns(2)

ENDO 1.16± 0.12

(1) ns(1) 0.25± 0.05

(1) 2.74± 0.27

(2)** 2.29± 0.33

(2)*** ns(2)

Corrientes iónicas (expresadas como pA/pF al voltaje indicado en el paréntesis) para

los canales de potasio de las células de la pared del ventrículo de cobayo,(ns: no hay

diferencia significativa); Diferencias significativas: * p<0.05 entre EPI y ENDO; ** p<0.01

entre ENDO y EPI; *** p<0.03 entre ENDO y EPI. 1. Main et al, 1998; 2. Bryant et al, 1998.

20

Bryant et al, (1998), en miocitos aislados de la pared del ventrículo izquierdo de

cobayo, encontraron que la duración del potencial de acción al 90% de la repolarización fue

mayor en ENDO respecto a la región M y a EPI (Tabla 3).

En estos experimentos IK en ENDO fue de menor densidad que la encontrada en EPI o

la región M. Pero, aunque la densidad de IK es mayor en la región M que en EPI, la diferencia

no fue significativa. En la separación de los dos componentes de IK, se reporta que la densidad

de IKs es menor en ENDO que en EPI o la zona M. La densidad de IKr para las tres regiones no

es significativamente diferente entre si (Tabla 2).

Estos datos confirman que en EPI una mayor magnitud de la corriente IK corresponde a

una menor duración del potencial de acción. Podemos concluir que en la pared del ventrículo

de cobayo no existen células M porque la densidad de corriente IKs no es menor con respecto a

EPI o ENDO. Otro dato que descarta la existencia de células M en la pared ventricular de

cobayo es que la duración del potencial de acción en las células de la región media de la pared

ventricular no es mas larga que la encontrada en ENDO (Bryant et al, 1998; Main et al, 1998).

Tabla 3: Duración del potencial de acción en el ventrículo de cobayo

Región DPA90 (1 Hz)

DPA90 (0.2 Hz)

EPI 204± 7 (1)* 227± 9 (2)

zona M 251± 7 (1) 243± 8 (2)

ENDO 237±8 (1) 292± 12

(2)**

Duración del potencial de acción al 90% de la repolarización (expresada en ms a la

frecuencia indicada en el paréntesis; DPA90) de las células de la pared ventricular de

cobayo(Diferencias significativas: * P<0.05 entre EPI y ENDO; **: P<0.05 entre ENDO y

EPI). 1. Main et al, 1998; 2. Bryant et al, 1998.

21

Rata:

Watanabe et al, (1983) registraron potenciales de acción con microelectrodos en

miocitos aislados de la pared de ambos ventrículos de rata y clasificaron los potenciales de

acción según su duración en tres grupos. El grupo I con duración al 75 % de la repolarización

de 21.5 ± 3.6 ms, el grupo II con duración de 38.2 ± 6.7 ms y grupo III con duración de 46.0 ±

4.1 ms (frecuencia de estimulación 1 Hz).

Después Clark et al, (1993) demostraron las diferencias en la forma del potencial de

acción entre EPI (punta del corazón o ápex) y ENDO (base) de miocitos aislados a partir de la

pared del ventrículo izquierdo de rata. Utilizando la técnica de fijación de corriente en la

configuración de célula completa (Whole-Cell) encontraron que la duración del potencial de

acción al 50 % de la repolarización (frecuencia de estimulación 0.2 Hz) fue mayor en ENDO

(93 ms) que en EPI (16.7 ms). En presencia de 4-AP (5 mM) observaron que a una frecuencia

de 0.2 Hz la duración del potencial de acción al 50 % de la repolarización se alarga mas en

EPI (112.5 ms) que en ENDO (144.4 ms) respecto a los valores control. Lo cual sugería la

existencia de una mayor densidad de corriente Ito1 en EPI. Al realizar fijación de voltaje

(Whole-Cell) para estudiar la corriente Ito1, encontraron que efectivamente la corriente Ito1 fue

mayor en EPI (a +50 mV: 2.24 ± 0.72 nA), que en ENDO (0.59 ± 0.19 nA). Con estos

resultados concluyen que las diferencias en la forma del potencial de acción entre EPI y

ENDO, se deben a una corriente Ito1 mas prominente en EPI. Recientemente Volk et al, (1999)

confirmaron que la densidad de corriente Ito1 es mayor en EPI (a +40 mV: 24· 0 ± 2· 6 pA/pF)

que en ENDO (12· 1 ± 2· 6 pA/pF; n=12; P < 0· 01).

En otro estudio (Shipsey et al, 1997) realizado en el ventrículo izquierdo de rata

usando la misma técnica se reporto que la duración del potencial de acción a una frecuencia de

estimulación de 1 Hz fue mayor en ENDO (126 ± 8 ms) que en la zona M (112 ± 12 ms) y EPI

(96 ± 10 ms). Al variar la frecuencia de estimulación, se observo que a frecuencias bajas la

duración del potencial de acción en las células M no se alarga de manera desproporcionada

como ocurre en otras especies; por lo que de acuerdo a este ultimo criterio se concluye que en

la pared del ventrículo izquierdo de rata no existen células M (Shipsey et al, 1997).

22

Recientemente Volk et al, (2001) encontraron que la IK es similar entre las 3 regiones

de la pared del ventrículo izquierdo de rata (a +40 mV: 7.2 ± 0.3 pA/pF ENDO; 6.7 ± 0.6

pA/pF zona M; 6.4 ± 0.5 pA/pF EPI). IK1 también es similar en las 3 zonas de la pared al igual

que la conductancia cuerda para el canal (-120 a –90 mV; ENDO 323 ± 24 pS/pF; zona M 331

± 27 pS/pF; EPI 327 ± 54 pS/pF). Con estos datos, concluyen que la duración del potencial de

acción de la rata depende de Ito1, (Volk et al, 2001).

Humano:

Nabauer et al, (1993) fueron los primeros investigadores en reportar una corriente con

las características de Ito1 en humanos. En su trabajo se describe una corriente transitoria de

salida de K+ con características similares a la corriente Ito1 reportada en otras especies de

mamíferos (Fedida y Giles, 1991; Clark et al, 1993; Liu et al, 1993). La corriente registrada

resulto sensible a la 4-AP. Ito1 es eliminada completamente por la 4-AP (5 mM). Con esta

evidencia farmacológica, se sugiere que Ito1 en el humano es similar a la reportada en otros

mamíferos.

Wettwer et al, (1994) por su parte determinaron las diferencias entre EPI y ENDO en la

densidad de corriente Ito1. La densidad de Ito1 en EPI resultó mayor respecto a la obtenida en

ENDO (a +60 mV: 7.9 ± 0.7 pA/pF vs. 2.3 ± 0.3 pA/pF). Posteriormente Drouin et al, (1995)

utilizando registros con microelectrodos en preparaciones multicelulares, encontraron células

que comparten características similares a las células M del perro (Sicouri y Antzelevitch,

1991).

Nabauer et al, (1996) en miocitos aislados del ventrículo izquierdo de humano

confirmaron que la corriente Ito1 fue mayor en EPI (a +40 mV: 10.6 pA/pF) que en ENDO

(2.63 pA/pF). También observaron que la duración del potencial de acción fue mayor en

ENDO (486.2 ± 32.6 ms) que en EPI (424 ± 20.9 ms; frecuencia de estimulación 0.03 Hz).

Li et al, (1998) reportaron en el ventrículo derecho que la duración del potencial de

acción fue mayor en la zona M (426 ms; frecuencia de estimulación 1 Hz) que en EPI (298

ms) o ENDO (281 ms), también encontraron que la corriente Ito1 fue mayor en EPI (a +60 mV:

6.9 pA/pF) y M (6 pA/pF) que en ENDO (2.2 pA/pF), ellos no encuentran diferencias

significativas entre las tres regiones para la corriente IK1.

23

Se ha propuesto que a lo largo de la pared de los ventrículos del humano existe un

gradiente de corriente Ito1, que fue mayor en EPI y zona M y menor en ENDO y que estas

diferencias al igual que en otras especies de mamíferos se deben a la mayor densidad de

canales Ito1 en EPI y zona M que en ENDO (Nabauer et al, 1996; Li et al, 1998). Al no

encontrase diferencias en la corriente IK1 entre los tres tipos celulares de la pared del

ventrículo de humano, se propone que las diferencias regionales en la duración del potencial

de acción pueden atribuirse a las diferencias regionales en la densidad de Ito1.

Conejo:

En miocitos aislados de conejo, el potencial de acción de EPI tiene la forma de espiga

y domo, no así en ENDO (Fedida y Giles, 1991). Con la técnica de fijación de voltaje (Whole-

Cell) se encontró que la responsable de estas diferencias fue la corriente Ito1 que se encuentra

presente en EPI pero esta ausente o es pequeña en el ENDO. Fedida y Giles (1991) observan

que en los potenciales de acción obtenidos de EPI, cuando se disminuye la frecuencia de

estimulación se acentúa la forma de espiga y domo, y esta se atenúa o disminuye al aumentar

la frecuencia de estimulo. La duración del potencial de acción de ENDO cambia al variar la

frecuencia de estimulación, a bajas frecuencias la duración del potencial aumenta y disminuye

cuando se incrementa la frecuencia de estimulación.

Para verificar si las diferencias en la forma del potencial de acción entre EPI y ENDO

se debían a una mayor densidad de la corriente Ito1, se analizaron la densidad y la cinética de

activación e inactivación del canal (con la técnica de fijación de voltaje en modo de Cell-

Attached). La densidad de corriente para Ito1 fue mayor en EPI (a +20 mV: 7.66 pA/pF) que en

ENDO (3.69 pA/pF). No existen diferencias significativas en la cinética del canal Ito1 entre las

regiones estudiadas. Por lo anterior, se propone que las diferencias regionales en la forma del

potencial de acción se deben a variaciones en la densidad de Ito1 entre los distintos tipos

celulares de la pared ventricular de conejo.

Gato:

En la pared del ventrículo de gato se han reportado diferencias en la forma del

potencial de acción de miocitos aislados de EPI y ENDO (Furukawa et al, 1990; Furukawa et

al, 1991; Kimura et al, 1990).

24

En miocitos de EPI los potenciales de acción mostraban la forma característica de

espiga y domo y la duración del potencial de acción fue menor (181 ms) que la de ENDO (205

ms; p<0.01; 1 Hz) (Furukawa et al, 1991). En el epicardio cuando se agrega 4-AP (2 mM) y

cafeína (5 mM), la forma de espiga y domo desaparece. En endocardio no se observan

cambios importantes en el potencial de acción al exponerlas a estos fármacos (Furukawa et al,

1990).

Al igual que en otras especies, la corriente responsable de la configuración de espiga y

domo del potencial de acción es Ito1. Furukawa et al (1990), estudiaron la corriente Ito1 y el

efecto de la 4-AP sobre la magnitud de la corriente. Encontraron que la densidad de corriente

Ito1 en estas células fue de 102.0 pA/pF (a +80 mV) para los miocitos aislados del EPI y de 3.3

pA/pF para los de ENDO, basados en este hallazgo concluyen que las diferencias regionales

en la forma del potencial de acción se deben a una mayor densidad de corriente Ito1 en EPI que

en ENDO (Furukawa et al, 1990).

Hasta donde es de nuestro conocimiento, no se encuentran datos en la literatura acerca

de la existencia de células M o de sus características electrofisiológicas en el ventrículo de

gato. A continuación presento los resultados preliminares de los experimentos que realicé

utilizando la técnica convencional de registro de potenciales de acción con microelectrodos

intracelulares, para estudiar las características del potencial de acción de células de la región

media de la pared del ventrículo derecho de gato para determinar si existen o no células M en

la pared ventricular de gato

RESULTADOS PRELIMINARES.

MÉTODOS

Se utilizaron gatos adultos (sin distinción de sexos) con un peso de 2 a 3.5 kg. Veinte

minutos antes de anestesiar a los animales se les administro heparina sodica (400 UI/kg; i.p.).

Los gatos se anestesiaron con pentobarbital sodico (45 mg/kg; i.p.). Posteriormente se extirpo

el corazón y se sumergió en solución Tyrode burbujeada con una mezcla de 95 % de O2 y 5%

de CO2 (carbógeno) a una temperatura de 24 °C. Se disecó el corazón y se aisló la pared del

ventrículo derecho, de donde con tijeras finas se cortaron tiras de tejido de 2 x 3 mm y se

montaron en una cámara de experimentación constituida de acrílico y cuyo fondo estaba

cubierto con Sylgar (Dow Corning). Dependiendo del experimento se expuso la cara

epicardica o endocardica hacia arriba. La preparación fue estimulada con pulsos cuadrados de

25

3 ms de duración a la frecuencia de 1 Hz por medio de un electrodo bipolar de plata acoplado

a una unidad aisladora de estímulos (Weco S-100) conectada a un estimulador (Winston

Electronics T-10). La temperatura de la solución de perfusión (Tyrode) se mantuvo constante

en 35 ± 0.4 oC utilizando un baño de circulación (Fisher Scientific) y un intercambiador de

calor.

Una vez iniciada la perfusión con la solución de Tyrode normal se estimulo a la

preparación a una frecuencia de 1 Hz y se mantuvo en estas condiciones durante al menos 4

horas antes de iniciar los procedimientos experimentales.

Para registrar el potencial de acción (PA) se utilizo un registro diferencial, con la

técnica convencional de microelectrodos (resistencia 10 a 25 MΩ) llenos con KCl 3 M,

acoplados a un par de amplificadores de alta impedancia de entrada (WPI Electro 750) por

medio de alambres de plata clorurada. Las señales fueron amplificadas (10x) con un

acondicionador de señal (Cyberamp 320, Axon Instruments); posteriormente la señal fue

digitalizada a un frecuencia de muestreo de 10 kHz con un convertidor analógico/digital

(LabMaster TM 100; sin usar filtro) usando el programa de adquisición Axotape, (Axon

Instruments) y se visualizaron simultáneamente en un osciloscopio (Tektronix 5113) y en la

pantalla una computadora. Los datos fueron almacenados en el disco duro de la computadora

(Pentium, BTC) para su análisis posterior con el programa de análisis Clampfit (Axon

Instruments).

SOLUCIÓN DE TYRODE

La Solución de Tyrode tuvo la siguiente composición (mmol/L): 125 NaCl, 5.4 KCl, 1.05

MgCl2, 24 NaHCO3, 0.42 NaHPO4, 1.8 CaCl2 y 11 de dextrosa). Todas las sales utilizadas

fueron de grado analítico (Baker ).

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Una vez estable la preparación, se procedió a registrar el potencial de acción de la zona

epicardica, en algunos experimentos se monto con la cara endocardica hacia arriba para

registrar los potenciales de acción de células endocardicas. De un potencial de acción de

características típicas se realizaron los siguientes protocolos:

26

a) variación de la frecuencia de estimulo: se realizaron registros a diferentes

frecuencias de estimulación (0.1-3 Hz), después de que se alcanzo un estado estable

(no cambiaba ya su forma y duración) los registros del potencial de acción fueron

almacenados.

b) Restitución eléctrica: En la frecuencia de estimulación de 0.2 Hz y con la

preparación en estado estable, se inicio el protocolo que consistió en aplicar

después de diez estímulos constantes (S1) un estimulo (S2) a intervalos variables,

estos intervalos iban de 20 a 1000 ms, entre S1 y S2.

Después de este protocolo y en la misma preparación se penetro con el electrodo hacia

capas mas profundas (2 mm) para determinar si existían diferencia en las propiedades

electrofisiológicas del epicardio y las siguientes capas que pudiesen explicar la existencia de

células M.

ANÁLISIS DE LOS DATOS

Se midieron los siguientes parámetros del potencial de acción: amplitud de la fase 0 y 1

del potencial de acción, magnitud de la fase 1 (MF1) y duración del potencial de acción (DPA)

al 90 % de la repolarización.

Para describir los cambios que se presentaron al variar la frecuencia de estimulación en

los parámetros del potencial de acción, se realizaron dos tipos diferentes de gráficas (a:

frecuencia vs. DPA90 y b: Frecuencia vs. MF1): a) se represento las variaciones que se

observaron en la DPA al cambiar la frecuencia de estimulación (al 90 % de la repolarización)

y b) se represento los cambios que sufre la magnitud de la fase 1 al variar la frecuencia de

estimulación.

Para analizar la restitución eléctrica del potencial de acción se utilizaron dos tipos de

gráficas (a: intervalo S1-S2 vs. ∆MF1 y b: intervalo S1-S2 vs. ∆DPA90): a) se represento como

se recupera la magnitud de la fase 1 (S2), al variar el intervalo de tiempo entre S1 y S2. Se

midió la magnitud de la fase 1 del potencial de acción registrado con el estimulo S2,

posteriormente, se resto este valor a la magnitud de la fase 1 del potencial de acción registrado

con el estimulo S1 (control), para facilitar su comparación los datos se normalizaron a la MF1

en S1 (∆MF1 = (MF1S1 – MF1S2) / MF1S1). y b) se represento la recuperación que tiene la

DPA90 (S2) con respecto al control (S1) al incrementar el tiempo entre S2 y S1. Se midió

27

como se recuperaba la duración del potencial de acción al 90 % de la repolarización (DPA90),

para esto, se midió la DPA90 del potencial de acción registrado con el estimulo S2 y se resto a

la DPA90 del potenc ial de acción registrado con el estimulo S1 (control), los datos se

normalizaron para facilitar su comparación a la DPA90 en S1 (∆DPA90 = (DPA90S1 – DPA90S2)

/ DPA90S1).

Posteriormente se ajusto la grafica intervalo S1-S2 vs. ∆MF1 (a) a una función de

decaimiento de doble exponencial con el programa Microcal Origin versión 5.0.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Los datos se presentaron como la media ± el error estándar. El análisis estadístico se

realizo con la prueba t de Student. Diferencias con una p<0.05 fueron considerados como

significativos.

RESULTADOS

En la figura 11 se presentan ejemplos de los potenciales de acción que se registraron en

EPI ZONA M

ENDO

100 ms

20

20

0 0

0

mV

Figura 11: Potenciales de acción registrados en la pared del ventrículo derecho

de gato a una frecuencia de estimulación de 0.5 Hz.

28

EPI, zona M y ENDO del ventrículo derecho de gato, a una frecuencia de estimulación de 0.5

Hz.

Los potenciales de acción obtenidos a partir de EPI y la zona M tienen la configuración

característica de espiga y domo, en cambio ENDO no presento esta configuración. En este

experimento, (frecuencia de estimulación 0.5 Hz) la duración del potencial de acción al 90 %

de la repolarización fue mayor en la zona M (258 ms) que en EPI (205 ms) o ENDO (226 ms).

También se observó que en las células M la duración del potencial de acción depende

mas de la frecuencia de estimulación que en EPI o ENDO (figura 12).

Los estudios previos han establecido con claridad las diferencias que existen en los

potenciales de acción obtenidos de células de EPI y ENDO (Furukawa et al, 1990; Kimura et

al, 1990; Furukawa et al, 1991), por tal motivo, los siguientes experimentos se realizaron para

estudiar las diferencias que existían entre EPI y la zona M.

En los registros de la figura 12 se observo que a frecuencias bajas de estimulación (0.1

Hz) la duración del potencial de acción al 90 % de la repolarización (DPA90) en la zona M fue

mayor que en EPI y ENDO. El aumento promedio en la duración del potencial de acción al 90

Figura 12: Potenciales de acción registrados en la pared del ventrículo derecho de

gato a diferentes frecuencias de estimulación (0.1 a 1.0 Hz).

29

% de la repolarización que se observo al disminuir la frecuencia de estimulación de 1 a 0.1 Hz

fue de 8.78 % en EPI y 23.63 % en la zona M.

En la figura 13 se muestra la relación DPA90 de los potenciales de acción vs.

frecuencia de estimulación para EPI (n = 6) y la zona M (n = 5).

En esta figura se observa que en el rango de frecuencias de 0.5 a 0.1 Hz, al disminuir la

frecuencia de estimulación la duración del potencial de acción en EPI no vario

significativamente al reducir la frecuencia, en cambio, en la zona M la duración del potencial

de acción cambio al pasar de una frecuencia de estimulación alta a una baja. Al aumentar la

frecuencia de estimulación la DPA90 se acorto mas en EPI que en la zona M. Se encontraron

diferencias significativas en la duración del potencial de acción entre EPI y la zona M en todo

el rango de frecuencias estudiadas.

También se observo (figura 14) que en el rango de frecuencias estudiado la magnitud

de la fase 1 (MF1) aumenta al disminuir la frecuencia de estimulación en ambos tipos

celulares, pero no existen diferencias significativas entre la zona M y EPI.

Figura 13: Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la duración al 90 % de la

repolarización (DPA90) de los potenciales de acción de EPI y zona M del ventrículo de

gato. Promedio ± error estándar de n = EPI 6; M 5; * diferencia significativa p<0.05.

30

La restitución de la forma del potencial de acción de las células de EPI y la zona M, se

estudio con un protocolo similar al propuesto por Litovsky y Antzelevitch (1988). En la figura

15 se muestran los registros de un experimento representativo (A: EPI; B: zona M).

El análisis de restitución eléctrica puso en evidencia que, si el intervalo entre S1 y S2

es pequeño (menor a 30 ms), no se pierde totalmente la forma característica de espiga y domo,

disminuye la amplitud de la fase cero, la MF1 y la duración en el potencial de acción

producido por S2, este comportamiento fue similar en ambas regiones de la pared (EPI y M).

Al aumentar el intervalo entre S1 y S2, estos parámetros se recuperaban progresivamente en

el potencial de acción producido por S2.

Es claro en esta figura que la MF1 y la DPA90 se recupera progresivamente al aumentar

el intervalo entre S1 y S2. Para graficar la recuperación de la MF1, se midió la MF1 del

potencial de acción producido con S2 y se resto este valor a la MF1 del potencial de acción

producido con S1, para facilitar su comparación los datos se normalizaron a la MF1 en S1. Los

resultados que se obtuvieron se muestran para un experimento representativo (figura 16).

Figura 14: Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la magnitud de la fase 1

(MF1) de los potenciales de acción en el ventrículo de gato. Promedio ± error estándar

de n = EPI (6); M (5).

31

La recuperación de la magnitud de la fase 1 se ajusto a una función de doble

exponencial, con una τ1 = 34.27 ± 12.01 ms y τ2 = 323.09 ± 54.09 ms para la zona M

(promedio de 4 células) y una τ1 = 42.46 ± 25.19 y τ2 = 497.49 ± 80.38 ms para EPI (promedio

de 2 células). Pero aparentemente no existen diferencias significativas entre ambas regiones.

Para describir la recuperación de la duración del potencial de acción al 90 % de la

repolarización (DPA90), se midió la DPA90 del potencial de acción producido con S2 y se resto

a la DPA90 del potencial de acción producido con S1, los datos se normalizaron para facilitar

su comparación a la DPA90 en S1. En la figura 17 se muestran los datos de un experimento

representativo.

En esta figura se puede observar que aparentemente la recuperación de la DPA90 en

ambos tipos celulares se alcanzo aproximadamente a los 300 ms, después en las células de la

Figura 15: Restitución eléctrica del potencial de acción en el ventrículo de gato.

A: EPI; B: zona M. El primer registro representa el potencial de acción obtenido al final

de la aplicación de un tren de 10 estímulos (S1) a una frecuencia de 0.2 Hz. Los

potenciales subsecuentes fueron producidos por estímulos (S2) aplicados a diferentes

intervalos S1-S2.

32

zona M la DPA90 se vuelve independiente del intervalo entre S1 y S2, pero en EPI la DPA90

sigue creciendo respecto al control al aumentar el intervalo entre S1 y S2.

De acuerdo con estos resultados preliminares se podría afirmar que en la pared del

ventrículo derecho de gato existen células M porque: a) la duración del potencial de acción

(DPA90) en las células de la región M es mayor que la de células de EPI o ENDO (figura 11).

y b) la DPA90 del potencial de acción en las células de la región M depende mas de la

frecuencia de estimulación que EPI o ENDO, especialmente al disminuir la frecuencia de

estimulación (figuras, 12 y 13). Para completar la caracterización de las células M seria

necesario realizar pruebas farmacológicas, ya que existen evidencias de que las células M son

mas sensibles a los fármacos que afectan la duración del potencial de acción (por ejemplo:

quinidina, 4-AP, amilorida, sotalol), aumentando la duración del potencial de acción de

manera mas acentuada en las células M que en ENDO o EPI. (Antzelevitch et al, 1999)

Figura 16: Recuperación de la magnitud de la fase 1 (MF1) normalizada de los

potenciales de acción en el ventrículo de gato en función del intervalo S1-S2

(experimento de la figura 15). ∆MF1 = (MF1S1 – MF1S2) / MF1S1. La línea continua

representa el ajuste bi-exponencial a los datos de la curva de recuperación de la

magnitud de la fase 1. Para EPI se obtuvo una ô1 = 67.65 ms y una ô2= 577.88 ms; los

valores para la zona M fueron de ô1= 12.89 ms ô2 = 351.68 ms.

33

además es necesario caracterizar las corrientes iónicas de las células M (Ito1, Ito2, IKr, IKs e IK1)

y compararlas con las de EPI y ENDO.

IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS Y FISIOPATOLÓGICAS DE LAS

DIFERENCIAS REGIONALES EN LA FORMA DEL POTENCIAL DE ACCIÓN DE

LA PARED VENTRICULAR DE MAMÍFERO.

Con el estudio de las propiedades electrofisiológicas de las células que conforman la

pared ventricular de mamífero se han obtenido evidencias que permiten explicar los

mecanismos de generación de algunas arritmias cardiacas y de las ondas y segmentos

electrocardiográficos asociados a la repolarización ventricular en condiciones normales y

patológicas. (Antzelevitch et al, 1991; Liu et al, 1993; Liu y Antzelevitch, 1995; Lukas y

Antzelevitch, 1993; Topol y Califf, 1998).

Los primeros registros de la actividad eléctrica del corazón asociados con el latido

cardiaco fueron obtenidos con electrodos localizados en la superficie del cuerpo, las

Figura 17: Recuperación de la DPA90. de los potenciales de acción del ventrículo

de gato en función del intervalo S1 – S2. ∆DPA90 = (DPA90S1 – DPA90S2) / DPA90S1.

(experimento de la figura 15).

34

variaciones de potencial eléctrico que se registraban gráficamente se les denominó

electrocardiograma (ECG). El ECG ha resultado ser de utilidad en la clínica para identificar

anormalidades en el ritmo cardiaco (arritmias) y trastornos en la conducción de la actividad

eléctrica en el corazón así como otras patologías (por ejemplo: infarto del miocardio; Dubin,

1974; Ganong, 1995; Goldman, 1968; Topol y Califf, 1998). En la figura 18 se muestra un

ejemplo del registro electrocardiográfico donde se pueden observar las distintas ondas,

intervalos y segmentos que se analizan en el ECG. La despolarización de las aurículas se

registra como una deflexión positiva, esta onda electrocardiográfica se conoce como P. El

tiempo que pasa entre la aparición de la onda P y el complejo QRS se le conoce como

intervalo PR (o PQ si Q esta presente), precede a la activación de los ventrículos y mide el

tiempo de conducción auriculoventricular ( 0.12 a 0.20 s). La activación de los ventrículos se

registra como una deflexión predominantemente positiva que se conoce como complejo QRS,

su duración (intervalo QRS) normal es 0.10 s. En seguida se puede observar un segmento

isoeléctrico, pero que puede desviarse de la línea isoeléctrica normalmente – 0.5 a +2 mm (-

Figura 18: Trazado electrocardiográfico en el que se señalan las ondas, intervalos

y segmentos que se registran y analizan en el electrocardiograma. Modificado de

Goldman, 1968.

35

0.05 a 0.2 mV), el segmento ST, que representa el periodo en el que el ventrículo permanece

despolarizado después de su activación.

Al final del segmento ST se observa la onda T que representa la repolarización de los

ventrículos, esta deflexión es positiva en casi todas las derivaciones. Por ultimo,

ocasionalmente se observa la onda U que cuando se presenta es una deflexión positiva que

precede a la onda P del siguiente ciclo; esta onda aparentemente es positiva y precede a la

onda P del siguiente ciclo; esta onda aparentemente se asocia con la repolarización del sistema

His-Purkinje. (Dubin, 1974; Goldman, 1968; Hurst, 1998; Topol y Califf, 1998).

El intervalo QT representa la actividad eléctrica total de los ventrículos ya que incluye

la activación y la repolarización de los ventrículos, también se le ha denominado “sístole

eléctrica”. (Dubin, 1974; Goldman, 1968; Topol y Califf, 1998). La duración del intervalo QT

depende de la frecuencia cardiaca por lo que las mediciones de este intervalo tienen que ser

corregidas tomando en cuenta este hecho. El intervalo QT corregido (QTc) normal es 0.4 s en

el hombre y 0.44 s en la mujer (Topol y Califf, 1998).

En la mayoría de las derivaciones electrocardiográficas (excepto en las derivaciones

DIII y aVF, donde puede ser positiva o negativa) la onda T es positiva, lo que implica que el

Figura 19. Correlación temporal entre el ECG y el potencial de acción

ventricular. Nótese que la meseta correspondería aproximadamente a el segmento ST

isoeléctrico y la onda T se iniciaría en la transición entre el fin de la meseta y el inicio de

la fase 3. Modificado de Katz, 1992.

36

vector medio de la repolarización esta dirigido casi en la misma dirección que el vector medio

del complejo QRS (Hurst, 1998). Para explicar este hecho se propuso que existían gradientes

eléctricos entre base y punta del corazón , ya que la duración de los potenciales de acción en la

punta es mayor que en los de la base, esto contribuiría a generar una onda T positiva (véase

Noble y Cohen, 1978).

Las evidencias revisadas en esta tesis indican que también existen gradientes eléctricos

transmurales, de hecho se considera que en el proceso de repolarización de los ventrículos se

realiza predominantemente desde epicardio a endocardio, lo cual es compatible con la

generación de las ondas T positivas (Antzelevitch et al, 1995; Berne y Levy, 1997; Schmidt y

Thews, 1987; Topol y Califf, 1998). Esta hipótesis fue puesta a prueba recientemente

encontrándose una correlación entre la generación de la onda T y los gradientes de voltaje que

se establecen entre EPI y la zona M y entre esta zona y ENDO, tanto en condiciones normales

como bajo los efectos de fármacos y condiciones experimentales que afectan la duración de

los potenciales de acción (Yan y Antzelevitch, 1998).

En la figura 19 se muestra de manera esquemática la relación que se supone existe

entre el potencial de acción ventricular y el ECG. Este antecedente es útil para entender la

interpretación de los resultados de Yan y Antzelevitch (1998) quienes registraron de manera

simultanea el ECG y los potenciales de transmembrana con microelectrodos intracelulares, en

un segmento de la pared libre del ventrículo izquierdo, prefundido a través de una rama de la

arteria coronaria. Un ejemplo de los registros obtenidos se muestran en la figura 20 donde se

puede observar las diferencias en la duración de los potenciales de acción de células de EPI,

ENDO y zona M y su relación con el ECG transmural.

En esta figura también se observa que el pico de la onda T coincide con el final de los

potenciales de EPI y el fin de T con el final del potencial de acción de las células M, quedando

en un punto intermedio la correspondencia del fin del potencial de ENDO. En B se ve que el

fin del potencial registrado en células de Purkinje no se relaciona con la onda T. De acuerdo

con este resultado la dispersión transmural de la repolarización (la diferencia entre el tiempo

de repolarización de M menos el de EPI) en la pared del ventrículo, puede evaluarse como el

intervalo entre el pico y el final de la onda T del ECG.

37

Se ha propuesto que la duración del intervalo QT depende principalmente de la

duración de los potenciales de acción de las células M (Antzelevitch et al, 1995; Antzelevitch

et al 1999; Topol y Califf, 1998; Yan y Antzelevitch, 1998), y se conoce que bajo la acción de

diversos fármacos (por ejemplo: quinidina, sotalol, 4-AP, amilorida) la DPA90 de las células M

se incrementa en mayor grado que en las células de EPI y ENDO, situación que también se

presenta con la bradicardia o con bajas frecuencias de estimulación. La dispersión de la

repolarización aumentada constituye un sustrato que predispone a la aparición de arritmias por

actividad disparada generadas por posdespolarizaciones tempranas (PDT). También puede

constituir un sustrato para la aparición de arritmias por reentrada al producir una mayor

prolongación del periodo refractario en células de la zona M que en las de EPI o ENDO

(Antzelevitch et al, 1991; Antzelevitch et al, 1999; Liu et al, 1993; Liu et al, 1995; Zeng et al,

1995). Es posible que el mecanismo de iniciación de la arritmia ventricular polimorfica

(“torsade de pointes” o Tdp) que se observa en el síndrome del QT largo (LQT) sea la

aparición de actividad disparada por las PDT y que la arritmia sea sostenida posteriormente

Figura 20. Registros de potenciales de acción de células de la pared ventricular izquierda del perro (A y B de distintas preparaciones). Los estímulos se aplicaron en la superficie endocárdica con un electrodo bipolar a una frecuencia de 0.5 Hz. Las líneas punteadas unen el final del potencial con el punto correspondiente del ECG transmural. Modificada de Yan y Antzelevitch, 1988.

38

con la participación de circuitos de reentrada (Antzelevitch et al 1999; Topol y Califf, 1998;

Yan y Antzelevitch, 1998). El LQT largo esta caracterizado por la aparición de intervalos QT

mas prolongados de lo normal en el ECG, esta condición predispone a la aparición de

arritmias ventriculares polimorficas y Tdp. Existen dos clases diferentes del síndrome QT

largo, el adquirido y el congénito. Los estudios genéticos que se han realizado hasta la fecha,

han identificado las mutaciones genéticas que dan origen a los diferentes tipos del síndrome

QT largo congénito. (Viswanathan y Rudy, 1999).

Los genes responsables de las mutaciones que sufren los canales iónicos se encuentran

localizados en los cromosomas 3, 7, 11 y 21. El síndrome de QT largo tipo 1 (LQT1) se

origina por una mutación en el gen KvLQT1 que codifica para el canal IKs, este gen se

encuentra localizado en el cromosoma 11. El LQT2 (síndrome QT largo tipo 2) esta asociado

con una mutación del gen HERG que codifica para el canal IKr, este gen se encuentra en el

cromosoma 7. El LQT tipo 3 (LQT3) se asocia con una mutación del gen SCNSA que codifica

para la subunidad alfa que forma el canal de sodio, este gen se encuentra localizado en el

cromosoma 3. el síndrome LQT tipo 5 (LQT5) se produce por una mutación en el gen KCNE1

(minK) que codifica para una subunidad que se ensambla con la proteína codificada por el gen

KvLQT1 para formar el canal IKs. (Antzelevitch y Shimizu, 1998; Priori et al, 1999).

En preparaciones multicelulares perfundidas a través de ramas de la arteria coronaria,

la exposición a bloqueadores selectivos de IKs (cromanol) producen cambios semejantes a los

observados en el síndrome LQT1; observándose que la duración del potencial del acción de

los distintos tipos celulares que conforman la pared ventricular de perro se incrementan de

manera proporcional, por lo cual no cambia la dispersión de la repolarización. En estas

preparaciones la administración de un agonista β-adrenergico produce un acortamiento de la

DPA90 de las células de EPI y ENDO mas marcado que en la células de la zona M, esto

produce un incremento de la dispersión de la repolarización, creándose el sustrato necesario

para la aparición de arritmias. (Antzelevitch y Shimizu, 1998; Antzelevitch y Yan, 1998). Este

seria un ejemplo de un síndrome LQT inducido por fármacos (adquirido).

CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS

Las investigaciones realizadas por los diversos grupos de trabajo demuestran

que existen diferencias en las características del potencial de acción de las distintas células que

39

conforman la pared del ventrículo de distintas especies de mamífero. El origen de estas

diferencias se debe a que la densidad de las corrientes que participan en la repolarización es

diferente para cada tipo celular.

Los resultados preliminares obtenidos en este trabajo de tesis indican que en la pared

del ventrículo derecho de gato existen células con característica electrofisiológicas similares a

las células tipo M que se han reportado en otras especies de mamífero; pero se requiere

realizar experimentos adicionales para completar su caracterización electrofisiológica y

farmacológica.

Uno de los aspectos que se requiere estudiar es la respuesta a fármacos que prolongan

la DPA90 del potencial de acción como la 4-AP, sotalol y quinidina; pues se sabe que al

exponerlas a estos fármacos la DPA90 de las células M se prolonga mucho mas que en las de

EPI y ENDO. También habría que estudiar las características del potencial de acción en

células aisladas con la técnica de fijación de corriente, ya que en dichas condiciones las

propiedades intrínsecas del potencial de acción que se presenta en cada tipo celular, no son

influenciadas por las interacciones electrotónicas que ocurren en las preparaciones

multicelulares, lo que permitiría confirmar las observaciones de experimentos realizados en

preparaciones multicelulares. Por otra parte, usando la configuración de fijación de voltaje se

deben caracterizar las corrientes iónicas de las células M y compararlas con las de EPI y

ENDO para determinar si existe diferencias en la densidad y (o) cinética de las corrientes

iónicas que participan en la repolarización y los posibles mecanismos iónicos de la respuesta

de las células M a los cambios en la frecuencia de estimulación.

40

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