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Universidad de Córdoba
Departamento De Genética Molecular Máster En Zootecnia Y Gestión Sostenible
Ganadería Ecológica E Integrada
ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN ENTRE LOS SNPS DE LA KAPPA CASEÍNA
(CSN3) Y VALORES GENÉTICOS PARA LA PRODUCCIÓN LECHERA EN LA
RAZA CAPRINA MURCIANO-GRANADINA
Tutor: Vincenzo Landi
Alumna: M Gabriela Pizarro Inostroza
Córdoba, Julio 2012
INDICE
RESUMEN .......................................................................................................................................1
ABSTRAC .........................................................................................................................................2
INTRODUCCION ..............................................................................................................................3
MATERIALES Y METODOS ...............................................................................................................7
RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................................................................................ 11
CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 15
REVISION BIBLIOGRAFICA……………………………………………………………………………………………………………..16
1
RESUMEN
Las proteínas de la leche en la especie caprina, pertenecientes al tipo “caseína”, están
controladas por cuatro genes situados en el complejo caseína, localizados en el cromosoma
6. Son muchos los estudios realizados en los que se relacionan los genotipos para dichas
caseínas con su cantidad correspondiente en la leche o con varias cualidades técnicas como
la capacidad de coagulación de las proteínas para la producción quesera. Sin embargo,
existe dificultad para encontrar una población bajo un control de rendimientos adecuado y
por lo tanto con observaciones fenotípicas estandarizadas en esta especie. Este trabajo
forma parte de un proyecto más amplio, cuyo objetivo es estudiar el complejo de las
caseínas (CNS1S1, CNS1S2, CNS2 y CSN3) en la raza caprina Murciano Granadina.
En este primer estudio, los SNPs presentes en el gen de la Kappa caseína se han analizado
mediante la técnica de SnapShot, para posteriormente aplicar un modelo estadístico con el
fin de evaluar sus efectos sobre el valor genético de los caracteres de producción láctea. Los
resultados obtenidos muestran una asociación significativa del genotipo con la producción
total de la leche estandarizada a los 210 días. También se encontraron diferencias entre los
dos genotipos (AA y BB), sugiriendo que existe algún tipo de relación entre los genotipos
de este gen y los valores de cría estudiados. Es necesario realizar un estudio más amplio
incluyendo más animales y los tres genes de las caseínas restantes.
2
ABSTRACT
The milk proteins of casein type in goats are controlled by four genes located in the so
called casein complex on chromosome 6. Many studies have confronted the genotypes of
these genes with the amount of the corresponding proteins in milk or with several technical
features as the clotting ability of proteins to produce cheese. The great problem is finding a
population under production control and with standardized phenotypic observations in this
species. This work is part of a larger study aimed to study the casein complex (CSN1S1,
CSN2, CSN1S2, y CSN3) in Murciano- Granadina goat breed.
In this first study, the SNPs present in the K casein gene were analyzed using the technique
of SnapShot Kit (priemer extencion) including them in an statistical model to assess if does
exist association between breeding values for milk production traits of animals studied. The
results show a significant association between genotype with total milk production at 210
days. A difference between the two genotypes has been found. Further studies including
more animals and the other three casein genes which are still remaining, are necessary.
3
INTRODUCCIÓN
La cabra, es considerada un animal “multi propósito“, capaz de proporcionar carne, pelo,
piel, leche y estiércol (Haba, 2001), fue domesticada por el hombre hace unos 10.000 años.
Desde entonces entró a formar parte de la alimentación del hombre, acompañándole así en
sus desplazamientos y participando de su forma de vida nómada y sedentaria. Además de
su difusión mundial a través de las grandes rutas comerciales y pecuarias (Crespo, 1994).
Dentro de las razas caprinas domesticas nos encontramos a la cabra Murciano-Granadina,
que una de las cuatro poblaciones de animales domésticos mas importante en España, junto
con lo el Cerdo Ibérico, el Caballo y el Español ovino Merino, sean las cuatro poblaciones
referidas con claridad en la literatura del Siglo XV (Rodero et al.1992).
La capacidad de adaptación de la raza Granadina a los entonces emergentes sistemas de
producción intensiva durante el paso de las décadas provocó su desaparición, por lo cual la
poblaciones de cabras que se encuentran en peligro de extinción, con un censo que no
superaba los 2000 individuos, por la mayoría en régimen ecológico. Filogenéticamente la
cabra Granadina se considera una de las razas más antiguas de la península ibérica, puesto
que su tronco étnico según Aparicio (1947) procede de la Capra aegagrus (grupo europeo),
cuya formación secundaria es la cabra pirenaica. Según Porter (1996) se trata de una
combinación de dos antiguas razas lecheras. Posteriormente esta situación derivo en la
combinación de dos razas lecheras, (Murciana y Granadina), reconociendo así la existencia
de unos animales de mayor formato y con una tendencia a poseer capas negras. A través de
su evolución, se determino la actual raza Murciano Granadina adaptadas a regiones de
mayor altitud y a regímenes extensivos y semiextensivos; frente al de animales más frágiles
y de menor tamaño. Estando distribuida prácticamente en todas las comunidades autónomas
países de Europa.
4
El censo actual de la raza es de 508.000 ejemplares, y el 20% registrado en los libros
genealógicos (León et al. 2005), y está presente en seis regiones: Murcia,
Andalucía, Comunidad Valenciana, Castilla-La mancha, Cataluña e Islas Baleares.
La leche de cabra es cada vez más, una valiosa fuente de proteínas en muchos países
africanos, asiáticos y europeos (Hayes et al. 2006). Siendo probablemente el mejor
alimento conocido con respecto a su biosíntesis, composición, y la estructura química de
sus componentes individuales (Martin y Grosclaude 1993).
La leche de los rumiantes contiene seis proteínas principales: las caseínas caseínas alfas1,
alfa s2, Beta y Kappa (respectivamente As1, As2, b, y k) y las proteínas del lactosuero (β
-lactoglobulina y A-lactalbúmina). Las cuatro caseínas son el componente mayoritario,
estos genes que están situados en el cromosoma 6 del ganado caprino y representan un
grupo de ligamiento único de 250 Kbps (Vacca et al. 2009), constituyendo el 76-86 % de la
proteína total de la leche (Swaisgood, 1992). La k-caseína (k-Cn) es esencial para la
formación y estabilización de las micelas y tiene un efecto importante sobre las propiedades
de la leche.
5
La k-Cn caprina fue aislada de la leche por Zittle y Custer (1966) y su secuencia de 171
aminoácidos fue determinada posteriormente por Mercier et al. (1976). La k-Cn caseína
representa el 15% de las proteínas de la leche caprina y es codificada por un gen constituido
por 5 exones (Yahyaoui et al. 2003), de los cuales el exón 4 contiene más del 90% de la
región que codifica para la proteína madura. Los polimorfismos encontrados que afectan a
este gen son 16 correspondientes a 13 variantes proteicas diferentes, así como una gran
variedad de polimorfismos neutros (Caroli et al. 2006). Este tipo de caseína históricamente
no ha sido relacionada con las caseínas “sensibles al calcio” pero es funcionalmente
importante para la estabilización de las micelas (Pirisi et al.1999); también determina el
tamaño y la estabilidad del coágulo que es una característica importante en la producción de
queso (Yahyaoui et al. 2003). Sin embargo, la influencia del CSN3 sobre los caracteres
productivos de la leche no ha sido aclarada aún (Hayes et al. 2006).
Debido a la importancia de la k-Cn en las propiedades tecnológicas de la leche, varios
grupos han analizado esta proteína en cabras., Recientemente, se han descrito
polimorfismos en la región 3' no codificante y en la región promotora del gen de la
lactoglobulina (Pena et al. 2000; Yahyaoui et al. 2000). En la especie caprina se han
encontrado un elevado número de polimorfismos que afectan a la porción codificante de
estos genes y que tienen efectos sobre la producción lechera, hecho que hace difícil un
estudio (Caroli et al. 2006).
6
Sin embargo, no se han caracterizado las diferencias en la secuencia de aminoácidos de las
variantes encontradas. También, se ha descrito un polimorfismo de restricción (Di Gregorio
et al. 1989) en el gen de la k-Cn por digestión con BamHI, EcoRV y PvuII, e hibridación
con una sonda correspondiente al cDNA de la k-Cn bovina.
El esquema de selección de la raza caprina Murciano Granadina establece como uno de
los pilares fundamentales para su adecuado desarrollo la contrastación de la genealogía de
los animales que participan en él y es obvio que las mejores técnicas existentes para ello
son las basadas en polimorfismos de ADN y, especialmente, los marcadores moleculares, la
eficacia del control genealógico de campo tanto en los animales nacidos de inseminación
artificial como de monta natural. El incremento de la producción de los animales se logra
por lo tanto a través de dos vías: mejorando el ambiente en que viven y mejorando su
capacidad genética para producir.
La escasez de poblaciones caprinas bajo un esquema de selección moderno (BLUP), no ha
permitido la realización de estudios sobre la relación de los polimorfismos con los
rendimientos fenotípicos.. En efecto, se sabe que algunos polimorfismos de la CSN3 son
responsables de la presencia de una mayor cantidad de proteínas en la leche, así como, de la
mejora de las cualidades tecnológicas del cuajo, pero todavía no hay resultados claros
(Caravaca et al. 2009) del efecto de la CSN3 sobre los caracteres de producción. De las 7
mutaciones presentes en el exón 4 del gen de la κ caseína, sólo 3 se han identificado en las
razas caprinas de la Península Ibérica, y que se corresponden a los tipos A, B y C
(Yahyaoui et al. 2003). De esta forma el objetivo de este estudio fue genotipar los
polimorfismos de las caseínas CSN3 y ver sus frecuencias alélicas prevalentes en
sementales de la raza Murciano Granadina, utilizando para esto marcadores moleculares
(SNPs), conociendo la relación en su producción de leche, por ende podemos avanzar en la
selección de caracteres de importancia en razas de cabra Murciano Granadina.
7
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo de Animales.
Este estudio se baso en los resultados de la evaluación genética del año 2010 de la raza
Caprina Murciano Granadina, seleccionando los primeros 47 sementales, escogidos según
la fiabilidad de su valor de cría o valor mejorante. Con ello se garantiza disponer de
animales con un mayor nivel de confianza asociado a este valor genético predicho. Los
valores de cría se han calculado según los fenotipos recolectados en controles funcionales
y estandarizados a 210 días de lactación, utilizando la metodología BLUP Modelo Animal
con observaciones repetidas.
Extracción de DNA a partir de muestras de Sangre y Amplificación del DNA
mediante Técnica de PCR.
Se extrajo DNA utilizando el método de Walsh (1991), utilizando 5 µl de sangre de cada
muestra. Es un método alternativo de extracción de ADN a partir de sangre total, el cual no
requiere de extensivas etapas de purificación, en el cual se aprovecha la capacidad quelante
que tiene la resina Chelex-100 para extraer ADN desde células sanguíneas. La diferencia
fundamental con el método descrito por Walsh et al. (1991), de otros métodos, radica en la
separación previa de los leucocitos de la sangre mediante lisis selectiva de los eritrocitos y
separación de los leucocitos mediante centrifugación.
Con los cebadores 5´-TCC CAA TGT TGT ACT TTC TTA ACA TC-3´ y 5´-GCG
TTGTCC TCT TTG ATG TCT CCT TAG-3´, diseñados a través del software Primer 3
(Rozen & Skaletsky. 2000), (Imagen 1) y utilizando la secuencia AF485339 se amplificó,
mediante PCR, un fragmento de 400 bp del IV exón del gen de la k caseína. La PCR se
realizó en 25 µl totales, compuestos por: 1 U de polimerasa Taq (Biotools Madrid) ,1X
PCR buffer, 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTPs, 0,1 µM de cada cebador y 25 ng
de DNA genómico.
8
Imagen I: Secuencia de los cebadores diseñados por el software Primer 3.
Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 95 ˚C durante 5 minutos, 35 ciclos
de 95 ˚C-25 segundos, 55 ˚C-45 segundos y 72 ˚C-45 segundos. 5 µl del producto de la
reacción fueron purificados con 1U de Shrimp Alkaline Phosphatase y 0,2 U de
Esonuclease I (Fermentas) incubándolos a 37°C durante 3 horas, a 80° C y durante 15
minutos para inactivar las enzimas.
9
Amplificación del DNA mediante Técnica de PCR mediante SNAPShot.
El producto purificado se utilizó como DNA molde para la reacción de primera extensión,
utilizando el kit comercial SNAPShot multiplex system (Applied Biosystems).
La reacción estuvo compuesta por 5 µl del producto de la PCR purificado, 0,4 µl de
SNAPSHOT miХ, 1µl de buffer de PCR 5Х, 0,2 µM de los cebadores
328Rmer:AGCAATGGTATTGATGGCAGGGA,440Fmer(AT),13GAAGCTTCCTCAGA
ATCGATTG, y agua hasta 10 µl. Los ciclos térmicos empleados fueron los aconsejados
por el fabricante.
Estos cebadores individualizan mutaciones, que permiten distinguir las dos principales
definidas en las razas europeas para la K caseína, así como, características de los tipos
alélicos “A” y “B”. La primera es una sustitución A>G, que afecta al nucleótido 328 de la
secuencia AF485339, y la segunda, una sustitución C>T, que afecta al nucleótido 440. Los
tipos alélicos “A” y “B” vienen definidos por combinaciones de SNPs para los dos loci 328
y 440 (GG-CC: tipo “A”; AA-CC: tipo “B”; AA-TT: tipo “C”).
La reacción de extensión se purificó con 1 U de Shrimp Alkaline Phosphatase incubándola
a 37 °C durante 1 hora, y a 80 °C durante 15 minutos. Un total de 1 µl de producto
purificado, 0,15 µl de Liz 120 (Applied Biosystems) y 2 µl de formamida desionizada
fueron cargados en un secuenciador automático ABI Prism 377 después de la
desnaturalización a 95°C durante 3 minutos. Los resultados fueron tipificados
posteriormente con el software ABI Genescan y Genemapper 4 (Applied Biosystems).
(Imagen 2)
10
Imagen 2: Tipificación de los resultados con el software ABI Genescan y Genemapper 4
(Applied Biosystems).
Análisis Genético de los Datos.
El análisis estadístico se realizó con el programa Microsoft Excel 2010 para el cálculo de
las frecuencias alélicas, este cálculo se hace por recuento directo de los alelos presentes en
el total de la muestra, asumiendo que la observación de un solo alelo se corresponde con la
condición de homocigosis, por lo tanto no hay alelos nulos y tampoco alelos no
amplificados. Utilizando el software SAS (SAS Institute 2001), se aplicó el procedimiento
GLM para verificar la relación entre los genotipos y los valores genéticos, y poder observar
así las posibles diferencias existentes entre individuos con genotipos diferentes.
11
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos dentro del análisis de las dos mutaciones en este trabajo,
coinciden con los presentados en otros estudios. En efecto, el SNPs 440mer resultó ser
completamente monomórfico para el alelo C en la muestra estudiada, algo que no se había
considerado en los otros análisis, este mismo resultado coincide con el obtenido en la
misma raza por Yahyaoui et al. (2003). Sin embargo, los mismos autores, en una
publicación anterior (Yahyaoui et al. 2001), encontraron una frecuencia muy baja de
sustitución de Timina (T), que identifica al alelo “C” de la proteína. Estas frecuencias
alélicas son, sin embargó, diferentes de las descritas por Díaz Carrillo (1993) en esta misma
raza; lo que confirma que es muy probable que ambos polimorfismos tengan una base
molecular diferente.
Probablemente, y con una frecuencia tan baja, esta mutación ha podido desaparecer de la
población, o simplemente, como alternativa, que no esté presente en la porción
seleccionada para este estudio; posiblemente, la deriva genética y el efecto fundador han
jugado un papel importante en la distribución de las frecuencias alélicas de los genes de las
proteínas lácteas. pues está asociada a una baja producción. El locus 328mer presentó una
frecuencia alélica del 71,28% para el alelo A y del 28,72% para el alelo G. A nivel
genotípico, se obtuvo un 6,38% de animales homocigotos para el genotipo GG (tipo AA),
mientras que observaron un 12,4% para la misma raza. Se encontró un 48,94% de
homocigotos para el genotipo AA (tipo BB), frente al 41,3% del estudio de Caravaca et al.
(2009); y muy diferente a lo encontrado por (Mercier et al. 1976), el cual encontró el 90%
para este mismo genotipo, Finalmente se identificaron un 44,68% de animales
heterocigotos, es decir, un porcentaje muy similar al 44,20% obtenido por Caravaca et al.
(2009).
Las pequeñas discrepancias observadas entre nuestros resultados y los de la literatura
pueden ser debidas, básicamente, al tipo de muestreo realizado. Por lo que existen pocos
estudios sobre la asociación entre el polimorfismo de la caseína κ y los parámetros
12
productivos. Díaz Carrillo (1993), En el presente trabajo se tomaron en cuenta animales
con valores de cría diferentes, tanto positivos como negativos, pero siempre con elevadas
fiabilidades. Todos los animales de este estudio forman parte del núcleo de selección de la
población caprina Murciano-Granadina.
En el conjunto global de datos, sólo el valor de cría para los kg de leche estandarizada a los
210 días (Taba l), resultó estar influenciado significativamente por el genotipo del locus de
la caseína CSN3.
Tabla I. Estadísticos simples de los valores de cría (VG). El asterisco en la columna de la
media indica los valores influenciados por el genotipo con P<0,05 (Simple statistical
breeding value (VG). The star indicate the P>0, 05).1
Leyenda: LAC210, valor de cría por kg de leche a 210 días de lactación; GRAS210, PROT210,
SE210, valores de cría para la producción, respectivamente, de proteína total, grasas totales y
extracto seco a 210 días. Para cada valor sigue el numero de observaciones (N), la media (Me), la
desviación estándar (DE) el valor mínimo (Mín) y el valor Máximo (Máx). (LAC210, breeding
value for kg of milk on 210 days; GRAS210, Prot210, SE210 mean breeding value for fat, protein
and dry extract, respectively. For every value follow the number of observations (N), the mean
(Me), the standard deviation (DE), minimum and maximum value (Mín, Máx).
VG N Me DE Min Máx
LAC210 47 -7,46* 29,71 -70,84 61,65
GRAS210 47 -0,37 1,95 -4,67 3,65
PROT210 47 -0,26 1,21 -3,27 2,44
SE210 47 -1,19 5,21 -13,29 9,97
13
Asimismo, los tres diferentes genotipos también resultaron correlacionados
significativamente con las diferencias productivas del mismo carácter fenotípico (Tabla II).
Se observó que el genotipo GG, correspondiente al tipo AA de la CSN3, estuvo asociado a
los valores de cría menos mejorantes para todas las características (Tabla II).
La presencia del genotipo AA (tipo BB), se ha asociado a una mejor calidad de la leche en
diferentes estudios realizados por Chessa et al. (2003) y Caravaca et al. (2009); y
encontrándose, según nuestros resultados, los valores de cría más positivos. Al tratarse de
una heterogénea muestra de fenotipos, tenemos presentes animales con valores genéticos
muy negativos, lo que con lleva que la media sea también negativa.
Inesperadamente, los animales heterocigotos obtuvieron valores de la media ligeramente
superiores a los otros genotipos. Cabe recalcar que el número de animales analizados para
el estudio es bajo, y que la presencia de animales con el genotipo GG (n=3) no permite
obtener resultados estadísticamente significativos y poder llegar así a conclusiones claras.
En estudios futuros se espera poder ampliar, de forma substancial, el tamaño de muestra.
También, y como ya observaron diferentes autores (Jann et al. 2004; Hayes et al. 2006;
Caravaca et al. 2009), las caseínas están codificadas por un clúster de genes que se
comporta como un único haplotipo, y algunas de las caseínas menos estudiadas (CNS1S2 y
β) quizás puedan tener también una repercusión importante en la producción y composición
proteica de la leche en los rumiantes.
Los resultados preliminares obtenidos nos exhortan a plantearnos un estudio en más
profundidad del mismo, que incluya, por una parte, a más animales muestreados, así como,
a los otros tres genes que componen el clúster: CSNS1, CSN2 y CSN1S2.
14
Tabla II. Medias de los valores de cría de las muestras analizadas según el método LS-
MEANS, divididas por genotipos de la caseína CSN3. P<0, 05 (**) (mean value of
breeding value of analyzed samples by Ls-means method divided by genotype).
GENOTIPO TIPO VGLAC210 VGGRAS210 VGPROT210 VGESEC210
AA BB -9,41** -0,62 -047 -1,88
AG AB -0,43** 0,06 0,11 0,05
GG AA -41,78** -1,51 -1,19 -4,62
*: Nomenclatura según Yahyaoui et al. (2003)
15
CONCLUSIONES
Los animales heterocigotos obtuvieron valores de la media ligeramente superiores a
los otros genotipos.
Las pequeñas discrepancias observadas entre nuestros resultados y los de la
literatura pueden ser debidas, básicamente, al tipo de muestreo realizado.
El número de animales analizados para el estudio es bajo, y que la presencia de
animales con el genotipo GG (n=3) no permite obtener resultados estadísticamente
significativos y poder llegar así a conclusiones claras.
Se observó que el genotipo GG, correspondiente al tipo AA de la CSN3, estuvo
asociado a los valores de cría menos mejorantes para todas las características.
16
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