UNIVERSIDAD DE COLIMA

MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA

RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNERO Pachyphytum(CRASSULACEAE), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

IGNACIO GARCÍA RUIZ

ASESORES:

M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ

DRA. JUNE SIMPSON

Tecomán, Col. Marzo de 2003

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

OFICIO No, 175/2003.

C. IGNACIO GARCIA RUIZEGRESADO DE LA MESTRÍA EN CIENCIASAREA: BIOTECNOLOGÍAPRESENTE

Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área; deBiotecnología de esta Facultad a mi cargo de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de queefectuó las correcciones y acato las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo,se le autoriza la impresión de la tesis “RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNEROPachyphytum (Crassulaceae), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP”,misma que ha sido dirigida por los C.C., M.C. Salvador Guzmán González, Profesor –Investigador de la Universidad de Colima y la Dra. June Simpson W., Profesora delDepartamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV, Unidad Irapuato.

Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a formay contenido por los C.C. Dra. Martha I. Vergara Santana, Dr. Alfonso Pescador Rubio, M.C.Salvador Guzmán González. Profesores –Investigadores de la Universidad de Colima.

Sin otro particular de momento me despido de usted muy cordialmente.

C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNOC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTEC.C.P. ARCHIVORVMD nlpv** Of. No. 175/2003. “2003, 45º ANIVERSARIO DE LA FACULTAD DE DERECHO”

Km 40 Autopista Colima- Manzanillo Tecomán, Colima, México C.P.28100Tel.01(313)322 94 05 Ext.. 52251 Fax 52252 fcba@tecoman.ucol.mx

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional por haberme brindado la beca de la COTEPABE yCOFAA para realizar los estudios de Maestría durante dos años y seis meses.

A la Universidad de Colima, por permitirme ingresar al posgrado de la Facultad deCiencias Biológica y Agropecuarias.

Al Dr. Silvio Maldonado Bautista, Director del CIIDIR-IPN Michoacán, por suconfianza y apoyo incondicional.

Al Dr. Oscar Comas, por su confianza en apoyarme con la Beca SUPERA-ANUIES

Al Director de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Ing. Rodolfo V.Morentín Delgado, por sus finas atenciones.

Al Coordinador del posgrado Dr. Sergio Aguilar, por su paciencia y finas atenciones.

A todos los profesores del Programar Drs. Jaime Molina Ochoa, Roberto Lezama,Javier Farias, Oscar Rebolledo, Alfonso Pescador, Rocío Flores, y a los M.C.Trinidad Ramírez y Arnoldo Michel quienes aportaron comentarios valiosos durantemi formación profesional.

A la Dra. June Simpson, del CINVESTAV Irapuato, por el apoyo en la realización dela fase final del trabajo de laboratorio (técnica AFLP).

Al M. C. Salvador Guzmán González, por su amistad brindada, paciencia, dirección yorientación, del trabajo desarrollado durante mi formación.

Al comité revisor de la Facultad, Dra. Martha Vergara y Dr. Alfonso Pescador, por supaciencia y por sus atinadas sugerencias en el orden y redacción del documento final.

A todos los compañeros del laboratorio de Genética (L-6), del Cinvestav Irapuato,por su amistad y auxilio en el trabajo experimental, en especial al Dr. RaúlRodríguez, Sanjuana Hernández, así como a Katia, Mónica, Alfredo, Alex, Lulú, Tetéy Fernando Hernández.

A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología Campus Tecomán, por su apoyoen el desarrollo preliminar del trabajo experimental, en especial a Miguel A. Flores yGilberto Manzo. Asimismo a Mario Orozco, Ramiro Ruiz, Argelia Juárez, EmeterioPayró, José Luis Rosas, por su amistad y confianza.

A todos los compañeros del posgrado que convivieron conmigo y que me brindaronsu amistad, en especial a Francisco J. Santana, Rocío Nadal, Miguel A. Manzanilla,Manuel Robles, Ramón Govea.

Al Dr. Alejandro Bravo y Biól. Jaime Nava, del CIIDIR-IPN Michoacán, asimismo alDr. Aarón Rodríguez de la Universidad de Guadalajara, por la lectura crítica ysugerencias en alguna de las versiones de este trabajo.

Al Dr. Jerzy Rzedowski, del Instituto de Ecología A.C., Región Bajío, por su apoyo yconfianza brindada. Del mismo centro, un agradecimiento especial para el M.C.Emmanuel Pérez-Calix, por su apoyo con material y salidas de campo, literatura,sugerencias e ideas, pero sobretodo por su amistad. Al M.C. Eleazar Carranza, porcompartir material colectado en campo; al Dr. Sergio Zamudio por su amistad y porfacilitarme la revisión del herbario IEB.

Al Dr. Octavio Martínez de la Vega, del Cinvestav Irapuato, por su asesoría en lautilización del programa estadístico S-Plus 2000.

Por su disposición y excelente compañía en colectas y exploración de campo: J.Antonio Machuca, Servando García, Jesús García, Yolanda Hernández, MelissaGarcía, Karen Angelina García, Germán Hernández, Miguel Cházaro, Raúl Acevedoy Mario Mendoza.

Al Dr. Jorge Meyrán por facilitarme parte del material original de Pachyphytumcoeruleum.

A Charly Glass (q.e.p.d.), por haberme compartido su amistad, material y literatura.

A todos mis amigos y compañeros del CIIDIR-IPN Michoacán, por su amistad yapoyo brindado desinteresadamente, en especial a Elizabeth del Río, GuadalupeArceo, y Fabián Villalpando.

A TODOS MUCHAS GRACIAS

DEDICATORIA

Con todo respeto a mis padres Angelina Ruiz (q.e.p.d.), y Andrés García, por suconstante apoyo, cariño, y amor fraterno que nunca me han faltado.

A mi esposa Yolanda y a mis hijas Melissa y Karen Angelina, por su paciencia,amor, calidez y dulce compañía que me han brindado.

A todos mis hermanos y hermanas, por su cariño, comprensión y apoyo.

A todos mis sobrinos y sobrinas, deseando que el presente sea considerado unpequeño ejemplo de superación que nos permita mejorar en todos los niveles de vida.

A todos los integrantes de mi familia política, por su atención, apoyo y amistadbrindada.

A todos mis profesores del posgrado por sus experiencias compartidas.

A todos mis parientes y amigos.

En remembranza a una idea de un Profesor del, posgrado:

"Existen dos principales problemas en el mundo: la pobreza y la ignorancia; a

nosotros nos corresponde tratar de resolverla ignorancia."

ÍNDICE

PáginaÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS vii

RESUMEN xABSTRACT xiI INTRODUCCIÓN 1

II REVISIÓN DE LITERATURA 5

2.1 Diversidad genética 5

2.1.1 Variación genética 5

2.1.2 Poliploidia en las plantas 6

2.1.3 Evolución 7

2.1.4 Especiación 8

2.1.5 Especiación y método sistemático 11

2.1.6 Conservación de la herencia 12

2.1.7 Fenotipo y genotipo 13

2.1.8 Mutación 14

2.1.9 Aislamiento reproductivo 14

2.2 Sistemática 16

2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica 17

2.4 Filogenia y sistemática molecular 19

2.4.1 Enzimas de restricción 23

2.4.2 Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos 25 Amplificados (AFLP)

2.5 Supuestos biológicos y estadísticos sobre los marcadores 31

2.5.1 Homología de los fragmentos 31

2.5.2 Neutralidades de los alelos 32

2.6 Unidades operacionales taxonómicas (OTUs) 33

2.6.1 Medidas de similaridad genética 34

2.6.2 Métodos estadísticos para el análisis de la diversidad 36 genética

2.7 Representaciones gráficas de análisis numéricos 38

2.7.1 Métodos de obtención de dendrogramas 40

2.7.2 Intervalos de confianza y pruebas de hipótesis 41 sobre dendrogramas

2.8 Análisis estadístico de datos moleculares 43

2.9 Generalidades de la familia Crassulaceae 44

2.9.1 Distribución de las Crassulaceae 45

2.9.2 Estudios filogenéticos en las Crassulaceae 48

2.10 Ubicación taxonómica del género Pachyphytum 51

2.10.1 Descripción botánica 52

2.10.2 Secciones del género Pachyphytum 55

III MATERIALES Y MÉTODOS 63

3.1 Material Biológico 63

3.2 Extracción de ADN 66

3.3 Purificación del ADN 66

3.4 Cuantificación del ADN 67

3.5 Integridad del ADN 68

3.6 Análisis AFLP del ADN 69

3.7 Restricción del ADN 69

3.8 Ligación de los adaptadores 69

3.9 Primera amplificación 70

3.10 Marcaje y selección de los iniciadores 70

3.11 Segunda amplificación 71

3.12 Separación de productos de amplificación 72

3.13 Análisis de datos 73

3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias 73

3.13.2 Análisis del agrupamiento 73

IV RESULTADOS 75

4.1 Reacciones de la técnica AFLP 76

4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP 76

4.3 Relaciones genéticas interespecíficas 80

V DISCUSIÓN 87

5.1 Uso de la técnica AFLP 87

5.2 Polimorfismo del ADN 90

5.3 Evidencia filogenética 92

5.4 Implicaciones taxonómicas 94

5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual 101

5.6 Importancia y status del género Pachyphytum 103

VI CONCLUSIONES 108

VII LITERATURA CITADA 109

ÍNDICE DE CUADROS

Descripción . Página

Cuadro 1. Localidades reportadas de las especies de Pachyphytum 57

Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado 65

Cuadro 3. Resultados obtenidos con el análisis de marcadores tipo 77

AFLP

vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Número Descripción Página

Figura 1. Pachyphytum machucae García, Glass et Cházaro. Tomado de Acta 54

Botánica Mexicana.

Figura 2. Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum. 64

Figura 3. Electroforésis en .gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especies 75 estudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de Pachyphytum; 18-22 especies testigo. La marca de peso molecular a los costados derecho e izquierdo.

Figura 4. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones 78de bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo(18-22), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinaciónde iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas del costado izquierdoseñalan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.

Figura 5. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de 79 bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (18- 22), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de las bandas monomórficas. La escala de la izquierda son las pares de bases (Pb) del marcador de peso molecular usado (escalera 123 Pb). La escala de la derecha indica la numeración de las bandas legibles encontradas.

Figura 6. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 “Manhattan” /average. La especie P. glutinicaule , queda fuera del grupo principal, junto con los grupos testigo.

Figura 7. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 "Manhattan" / compact. La especie testigo B. glabrifolia, separa en dos a las especies en estudio, lo cual no es factible.

Figura 8. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética 81 "Manhattan" / connected. De nuevo, la especie P. glutinicaule se comporta junto con los grupos testigo.

Figura 9. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética de 82 Jaccard ó "Binary" / average. Este gráfico, agrupa de manera clara las especies testigo, no así con el grupo en estudio.

Figura 10. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / 82 connected. Similar al anterior en el grupo en estudio no se encuentran claros los agrupamientos formados.

Figura 11. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / 82 compact. Gráfico con mayor representatividad, la separación entre el grupo en estudio y el testigo son más claras.

Figura 12. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 compact. Similar al anterior, se agrupan más claramente las especies en estudio, mejora la interpretación de sus relaciones.

Figura 13. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 connected. Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del grupo en estudio.

Figura 14. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / 83 average. Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las especies del género Pachyphytum.

Figura 15. Dendrograma obtenido por medio de "Nei" y compact con un bootstrap 85 de 3000 repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos de intersección con la línea punteada a un nivel de disimilaridad de 0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B) logrados, los números en los nodos significan los valores de confianza en cada agrupación. Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies problema” de ubicar dentro de alguna sección del género Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremos superior e inferior.

Figura 16. Relaciones geográficas y afinidades genéticas de las especies del 99 género Pachyphytum. Primer grupo especies 1-6, segundo grupo especies 7-17.

ix

RESUMEN

El género Pachyphytum son plantas de ornato con poblaciones naturales reducidas,

tiene cinco especies cuya ubicación taxonómica es incierta a nivel de sección. Se

considera que la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a

nivel sección, se modificará si se agrupan con relación a su polimorfismo genético.

Para probar esto, se planteó el objetivo de determinar las relaciones genéticas

interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su

polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). El ADN de las 17

especies de Pachyphytum fue extraído y analizado a través de marcadores AFLP,

utilizando cinco combinaciones de iniciadores. La longitud de las bandas obtenidas

varió de 175 a 525 pb y el número total de bandas legibles fue de 406, de las cuales

el 92.4 % fueron polimórficas. Las bandas polimórficas fueron analizadas por

diferentes métodos de agrupamiento, donde el que brindó mejor información fue

“Nei” /compact. Un remuestreo (bootstrap) de 3000 repeticiones apoyó al

dendrograma obtenido, el cual confirmó la asociación de dos grupos principales,

presentándose cuatro de las especies problema en uno de estos. Se concluye que

las tres agrupaciones formadas con base en características fenotípicas de la

taxonómica clásica, en las secciones del género Pachyphytum, no se correlacionan

con las dos agrupaciones conformadas por medio de la similaridad genética.

Palabras clave: Pachyphytum, Crassulaceae, marcadores genéticos, AFLP.

x

ABSTRACT

The genus Pachyphytum includes ornamental plants with reduced natural

populations, contains five species whose taxonomic location is uncertain at the

section level. It is considered that the classic taxonomic classification of the

Pachyphytum species at the section leve¡ will be modified if they are grouped in

relation to genetic polymorphism. In order to shidy this hypothesis, the objective of

this work was to determine the interspecific genetic relations of plants of the

Pachyphytum genus by means of the analysis of Amplified Fragment Length

Polymorphisms (AFLP). The DNA of 17 species of Pachyphytum was extracted and

analyzed through AFLP genetic markers, by employing five combinations of primers.

The length of the bands obtained varied from 175 to 525pb and the total number of

legible bands was of 406, of which 92, 4 % were polymorphic. The polymorphic bands

were analyzed by different grouping methods. The Nei/compact method was the most

adequate in tucos information provide. A resampling (bootstrap) of 3000 repetitions

supported the obtained dendrogram, which confirmed the existence of two main

groups, in one of wich, four problem species were found to group. The three groups

formed on a phenotypic basis using classical taxonomic in the Pachyphytum genus

sections, are not correlated with the two groups formed based on genetic similarity

using molecular markers.

Key words: Pachyphytum, Crassulaceae, genetic markers, AFLP.

xi

I INTRODUCCIÓN

La biodiversidad es el resultado del proceso evolutivo, mutación y selección

determinan las características y cantidad de diversidad biológica que existe en un

lugar y momentos dados, en el contexto conservacionista se refiere a la diversidad

de especies, variación genética, variación intraespecífica e intrapoblacional, (Halffter

y Ezcurra 1992), patrones complejos de variación pueden empañar los límites entre

especies y conducir a la complejidad taxonómica (Matolweni et al., 2000), por lo que

pueden presentarse taxa de posición incierta. Uno de los principales inconvenientes

que presenta la clasificación taxonómica actual, es la falta de ubicación adecuada de

especies problema; ya que existen varios taxa con características intermedias que no

es posible precisar su ubicación en alguno de los diferentes niveles taxonómicos,

inclusive familias botánicas de posición incierta (Bremer et al., 1998). Judd et al

(1999), consideran que a los sistemáticos les corresponde la identificación e

interpretación de grupos de organismos producto de la evolución. De esta forma los

estudios taxonómicos, los aspectos prácticos de exploración en campo, colecta de

especimenes, así como el descubrimiento y descripción de especies son la base

empírica para estudiar sus similitudes e interpretar sus relaciones de parentesco y

posteriormente clasificarlas (Mishler y De Luna 1997).

Los caracteres morfológicos, tradicionalmente, han servido como la única base

para la mayoría de los estudios taxonómicos (Stevens 1984, 1986). La incorporación

de nuevos tipos de datos, particularmente los moleculares, ha sido necesaria en taxa

donde los caracteres morfológicos, por sí solos no han resuelto los problemas

taxonómicos (González 1997). Los sistemas de clasificación resultantes son una

forma de comunicación del conocimiento de la diversidad biológica, de tal forma que

cada sistema de clasificación implica una hipótesis particular de relaciones

filogenéticas entre los taxa clasificados; también implica una serie de hipótesis sobre

los orígenes comunes de las similitudes entre tales taxa (Mishler y De Luna 1997).

1

En este sentido teórico, las clasificaciones son el marco histórico para

interpretar los patrones de similitudes entre taxa, interacciones ecológicas y su

distribución geográfica (Brooks 1981; Cracaft 1983; Eldredge y Cracaft 1980; Farris

1979). El concepto de especie ha tenido un papel muy importante en muchas áreas

de la biología; en el sentido teórico, la especie se ha considerado el fundamento en

la construcción de las clasificaciones (Mishler y De Luna 1997). Un problema

filosófico en la taxonomía consiste en decidir qué conocimiento es aceptable, o qué

debe usarse como base confiable para la clasificación biológica: las similitudes por sí

solas o las inferencias sobre las relaciones filogenéticas (De Luna 1995).

La sistemática vegetal se basa usualmente en caracteres morfológicos,

producto de la expresión genética, en cambio, los polimorfismos del ADN brindan la

observación directa del genotipo de las plantas (Matsumoto et al., 1997). La

existencia de polimorfismos en las poblaciones es de gran importancia para el

estudio de procesos biológicos en la ecología evolutiva y la sistemática (González

1998). Por lo que, la eficacia del carácter utilizado en sistemática será mayor si no

resulta de la influencia del medio sobre el fenotipo; en virtud de lo anterior el uso

directo del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales para

una clasificación (Crawford 1990). Con la ventaja adicional de que el número de

datos que se pueden obtener está limitado solo por el tamaño del genoma (Hillis

1987).

La mayoría de los autores que abordan estos temas, usan las filogenias de

una u otra forma para tomar decisiones taxonómicas y construir una clasificación

(Nelson 1973; Wiley 1980). Forey (1992) menciona que la filogenia ocupa un lugar

central entre la sistemática y la taxonomía al ayudar a resolver problemas de

ubicación y de nomenclatura; por lo que una alternativa que contribuye al

esclarecimiento sobre la ubicación de especies problema, son los estudios genéticos

o moleculares de las especies. Se considera que las especies problema son un

desacierto de los biólogos al acordar como se deben identificar las especies, ya que

se deben tomar en cuenta aspectos evoautivos (O’Hara 1993; Hey 2001). Wolf et al

2

(1991) consideran que los taxa que poseen grandes problemas en sistemática

proporcionan excelentes modelos de .estudio del proceso evolutivo. Por lo que una

alternativa es el estudio genético de las especies con alguna de las diferentes

técnicas actuales derivadas del análisis del ADN.

Una de las técnicas que ha proporcionado la mayoría de los datos para la

reconstrucción filogenética de las angiospermas es a través del mapeo de sitios de

restricción del genoma entero del DNA del cloroplasto (cpDNA) (Palmer et al., 1988;

Jansen et al., 1991; Olmstead y Palmer, 1992). Dichos análisis se han usado para

conocer el grado de relaciones a nivel de género y familia, y brindan gran potencial

de apoyo a la botánica sistemática (Olmstead y Palmer 1994), asimismo, ha sido de

utilidad en análisis filogenético de especies congenéricas y entre géneros

relacionados, así como en niveles taxonómicos superiores (Soltis et al., 1992,

1997a). Se puede considerar el hecho de que los análisis filogenéticos enfocados a

todos los niveles de los grupos superiores de plantas, han planteado algunos de los

cambios más dramáticos en la clasificación y en los conceptos de sus relaciones

(Soltis y Soltis 2000a). Al grado que se ha propuesto un nuevo código que remplace

al actual Código Internacional de Nomenclatura Botánica (ICBN) (Cantino y de

Queiroz 2000; Berry 2002; Stevens 2002; Brummitt 2002).

La clasificación actual del género Pachyphytum Link, Klotch y Otto, semejante

al de muchas especies, obedece a que durante el período pre-evolutivo a finales del

siglo XIX, la mayoría de los datos disponibles para los taxónomos fueron los

morfológicos, anatómicos y geográficos; los cuales hoy en día, aún son considerados

un componente importante de la taxonomía (Heywood 1976). El género

Pachyphytum pertenece a la familia Crassulaceae y usualmente ha sido

considerado dentro de la subfamilia Echeverioideae (Berger 1930), sin embargo en

la última década, Hart, (1995), lo ubica en la subfamilia Sedoideae. Este género

comprende las secciones Pachyphytum, Diotostemon e Ixiocaulon, diferenciadas por

rasgos de morfología floral y foliar principalmente (Berger 1930; Walther 1931; von

Poellnitz 1937; Moran 1968a). Sin embargo Pachyphytum machucae por sus

3

características intermedias respecto al tamaño de los pétalos y sépalos, así como por

el grado de superposición de las brácteas florales, es difícil precisar su ubicación

taxonómica a nivel de sección (García et al., 1999), situación similar ocurre con P.

garciae y P. brevifolium (Pérez-Calix et Glass 1999), y con P. rzedowskii (García et

al., 2002).

Algunos elementos de la familia Crassulaceae en general y algunas especies

del género Pachyphytum, en particular tienen gran importancia en la horticultura

como plantas de ornato, sobre todo en Europa y Norteamérica. En contraste sus

poblaciones naturales están reduciéndose por sobrecolecta y alteración de su

hábitat; sin embargo ninguna de sus especies se encuentra citada en los apéndices

de la Norma Oficial Mexicana. Pachyphytum es endémico del centro de México; es

poco conocido, no tiene reportes en sistemática molecular, filogenia, biodiversidad ni

conservación genética.

Del total de especies reportadas de este grupo (16), se presentan cuatro (P.

machucae, P. garciae, P. brevifolium y P. rzedowskii), que por sus características

morfológicas es difícil ubicarlas en alguna de las secciones conocidas. Otra más (P.

contrerassi) cuyo reporte científico está actualmente en prensa, guarda un escenario

similar; por lo que se considera una situación problemática dentro de la clasificación

del grupo, y a la vez podría ser un modelo para realizar un análisis de sus relaciones

genéticas interespecíficas con marcadores moleculares, ya que se tiene como

hipótesis que la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a

nivel sección, se modificará si se agrupan con relación a su polimorfismo genético.

Para probar esto, se plantea el siguiente objetivo:

Determinar las relaciones genéticas interespecíficas de plantas del género

Pachyphytum mediante el análisis de su polimorfismo genético con marcadores

AFLP.

4

II REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Diversidad genética

2.1.1 Variación genética

Ledig (1988), considera que la diversidad genética puede conceptualizarse

jerárquicamente en tres niveles: de alelo, de grupos de alelos que tienden a variar en

su conjunto y del genoma completo de una especie. La variación genética, con base

en la mutación y recombinación genética dentro de especies y poblaciones,

constituye la materia prima de la selección natural y deriva génica, de esta forma

algunas variantes pueden conferir ventajas adaptativas sobre los individuos que las

poseen, donde cada individuo podría ser proveedor en el sentido “darwiniano”, y

podría dejar más descendientes que aquellos que poseen menores variantes (Lewin

999; Judd et al., 1999). Matolweni y colaboradores (2000) consideran que patrones

complejos de variación pueden empañar los límites entre especies y conducir a la

complejidad taxonómica. Hillis y Holder (2000), indican el interés de los biólogos por

escribir la historia de la vida usando las relaciones evolutivas como una fuente de

datos de análisis biológicos de otros campos, y que los árboles evolutivos o

filogenéticos proveen de la estructura básica para interpretar la variación biológica.

Asimismo, Singh (1999), reporta que la variación genética puede resultar de

una mutación, como un cambio en el genotipo de un organismo, el cual no fue

heredado de sus ancestros; y considera que es la última fuente de variación en una

especie que reabastece el suministro de variabilidad genética. El mismo Singh,

agrega que una mutación puede ser (puntual), o presentarse como un cambio mayor

en la estructura del cromosoma (cromosómica); al ser de esta última forma, puede

deberse a deleción, inversión, aneuploidia, o poliploidia, por lo que la recombinación

consistirá en un rearreglo de cromosomas, realizado de manera conjunta por medio

de la meiosis y la fertilización del material genético de distintos parientes,

produciendo un nuevo genotipo (Singh 1999).

5

Por su parte Lewin (1999), agrega que la mayoría de las especies existen

como poblaciones separadas geográficamente, no sólo como una simple población y

que como resultado, poblaciones individuales de la misma especie generalmente

desarrollan diferentes variaciones genéticas, donde cada variante se extiende a otras

poblaciones solo cuando los individuos se mueven entre poblaciones y empiezan a

aparearse. El mismo comenta que si las poblaciones permanecen completamente

aisladas una de otra (separadas por un gran sistema de ríos ó ubicadas entre

montañas), entonces las distinciones sustantivas genéticas pueden acumularse

dentro de las poblaciones, y a veces da como resultado el establecimiento de

subespecies, o a nivel de especies diferentes.

La variabilidad fenotípica de las poblaciones tiene tres componentes: (1) las

modificaciones inducidas por el ambiente; (2) la recombinación génica; y (3) las

mutaciones (Stebbins 1978, 1999; Ayala et al., 2000), y consideran que la mayor

parte de la variabilidad observada en las poblaciones es consecuencia de las dos

primeras; ya que las modificaciones inducidas por el ambiente alcanzan su máxima

expresión en los organismos' sometidos a fluctuaciones drásticas de su entorno, y

afecta mucho más a las características secundarias de los procesos metabólicos que

a las básicas, de tal forma que entre al ADN génico y la expresión final de un

carácter fenotípico se interpone una trama compleja de interacciones moleculares.

2.1.2 Poliploidia en las plantas

Sobre las diferencias entre las especies intervienen muchos genes y hay a

menudo también, cambios cromosómicos, de igual forma, la transformación de una

especie en otra en el transcurso del tiempo, o la disociación de una especie ancestral

en dos o varias derivadas es, por lo tanto, un proceso lento; no obstante, junto a esta

manera gradual de formación de especies, también pueden surgir especies nuevas

en una sola generación mediante la poliploidia (Dobzhansky 1975; Soltis y Soltis

2000b). Esto puede ocurrir, ya sea mediante la duplicación del complemento

cromosómico en los híbridos de dos especies previamente existentes (alopoliploidia),

6

o bien por la multiplicación de los cromosomas de una sola especie (autopoliploidia),

se considera que en uno y otro caso el poliploide posee, al menos inicialmente todos

los genes que estaban presentes en sus antepasados sin tener ninguno nuevo. Sin

embargo, la especie ancestral puede seguir existiendo al lado del poliploide; la

diversidad orgánica aumenta por lo tanto y la formación de especies mediante

poliploidia ha ocurrido en todos los grupos importantes de plantas (Dobzhansky

1975; Soltis y Soltis 2000b; Holsinger 2000). J. Simpson (comunicación personal,

enero del 2.003) señala que la poliploidia permite que las mutaciones actúen sobre un

juego de genes, sin afectar las funciones de las otras copias de genes.

2.1.3 Evolución

El concepto implica el desarrollo de una entidad en el transcurso del tiempo a

través de una secuencia gradual de cambios de un estado simple a uno más

complejo (Savage 1978). Judd y colaboradores (1999), consideran a la evolución

como el cambio genético a través del tiempo y que es la mayor fuente de diversidad

del propio árbol de la vida. Indican también, que un ingrediente esencial de la evolución

es la variación natural entre individuos, por lo que es importante el

entendimiento del surgimiento de esta variación así como de su distribución

geográfica. Stebbins (1999), agrega que la evolución es un proceso de dos pasos

que inicialmente requiere de variación genética dentro de poblaciones, así como el

moldeado de esta variación mediante la recombinación genética y la selección

natural; ninguna de las dos, la estructura genética de poblaciones ni el moldeado por

medio de la selección natural es dominante, las dos situaciones son

interdependientes y de igual importancia.

Teoría Sintética de la Evolución

Esta básicamente reconoce cinco tipos básicos de procesos a saber (Stebbins

1978, 1981, 1999; Soltis y Soltis 2000a):

A) Mutación génica,

B) Cambios en la estructura y número de cromosomas,

7

C) Recombinación génica

D) Selección natural y

E) Aislamiento reproductivo.

Las tres primeras causan la variabilidad genética sin la cual no pueden ocurrir

cambios. La selección natural y el aislamiento reproductivo dirigen las poblaciones de

organismos hacia diferentes canales adaptativos.

Tres procesos accesorios ejercen influencia sobre la operación de las cinco

causas básicas:

a) La migración de individuos de una población a otra.

b) La hibridación interracial de especies emparentadas aumentan la magnitud

de variabilidad genética disponible en una población.

c) Los efectos del azar, sobre poblaciones poco numerosas pueden alterar la

modalidad en que la selección natural dirige el curso de la evolución.

2.1.4 Especiación

La especiación puede definirse como la separación permanente de sistemas

poblacionales que migran de un sistema y que podrían ser una desventaja cuando se

incorporan a otro, dichas desventajas podrían ser prevenidas por la ausencia de

pareja de los migrantes, cuando los dos sistemas estuvieran aislados

reproductivamente; también se puede considerar como el proceso que crea unidades

discretas de variación (taxa) y especialmente la formación de especies (Judd et al.,

1999).

El tipo de origen puede tener efectos sobre el tipo subsiguiente de variación

mostrado por la especie, así mismo en especies heterocigóticas equilibradas el

“crossing-over” también actuará, dando lugar a grandes mutaciones aparentes

(Huxley 1965; Holsinger 2000).

8

En :o que se refiere al modo de acción de la selección natural, las especies

pueden ser divididas en dos categorías contrapuestas: A) aquella donde la selección

natural nada tiene que ver con la evolución de los caracteres específicos básicos, y

actúa simplemente sobre las especies como tal, en competencia con sus afines;

abarca todas las especies en las que la divergencia de carácter es abrupta e inicial; y

B) aquellas formas en las que la modificación del carácter es gradual, en este caso la

selección natural puede, como demuestran los argumentos deductivos e inductivos,

desempeñar un papel en la producción de los caracteres de la especie y no solo

abarca todas las formas en las que la separación de grupos tiene lugar por

aislamiento geográfico, fisiológico o ecológico, sino también aquellas en las que la

separación inicial es genética y no implica diferenciación visible (Huxley 1965;

Stebbins 1978; Schaal y Olsen 2000).

Al parecer es inexistente razón a priori para que una sola especie no se

extienda sobre una amplia zona geográfica, variando de región a región, aunque

todas las variedades reales o potenciales formen parte de un grupo interfecundo, y

tampoco existe razón alguna a priori para que mas de una especie de la misma

familia o género se presente en mismo hábitat ecológico (Huxley 1965). El mismo

agrega, que sin embargo, en ninguno de los dos casos queda confirmada dicha

suposición, ya que numerosas especies se presentan sin que su existencia parezca

tener a primera vista, una razón o significación. Estudiando más a fondo el problema

vemos que esto depende de dos series de hechos, uno concerniente a la relación del

organismo con su medio, y el otro referente a su base genética (Simpson y Cracaft

1995). El medio sufre cambios que crean barreras entre una región y otra, de esta

forma el aislamiento de grupos que pertenecieron originalmente a la misma especie

quedan incomunicadas, de esta forma, el completo aislamiento permite diferencias,

unas por adaptación y otras casuales y sin utilidad, que se acumulan en cada uno de

los grupos, hasta que en muchos casos se transforman en nuevas especies (Huxley

1965; Schaal y Olsen 2000).

9

Posteriormente la base cromosómica de la herencia sufre accidentes, como

las inversiones, el intercambio segmentario, el hibridismo y la poliploidia, que mas

pronto o más tarde reducen o terminan por abolir los cruzamientos fecundos entre el

tipo nuevo y el viejo; de este modo gran número de nuevas especies esencialmente

semejantes a aquellas de las que surgieron llegan a ponerse en contacto, y las

nuevas y viejas especies rivalizan entre si en habitats idénticos o (muchas veces

como resultado de la emigración subsiguiente) en habitats que se superponen

(Huxley 1965, Holsinger 2000).

La formación de muchas especies geográficamente aisladas y la mayor parte

de las genéticamente aisladas carece, pues, de alcance sobre el proceso principal de

la evolución (Stebbins 1999). Este último consiste en el desarrollo de nuevos tipos

dotados de mecanismos de gran eficacia biológica, en radiación adaptativa de esos

tipos para valerse de todas las clases y medios y modos de vivir en la colonización

de nuevas regiones de la superficie del globo, en la obtención de nuevos recursos

para su explotación y en un más rápido desarrollo de los recursos obtenidos

(Stebbins 1999; Soltis y Soltis 2000a).

Los principales procesos de la evolución consisten, esencialmente en una

mayor extensión de las actividades vitales en nuevas áreas de eventos sustanciales,

en una explotación más intensa y en un progresivo aumento del control de la vida

sobre el medio, independizándose de él (Huxley 1965). Superpuestos a estos

procesos y teniendo poca o nula influencia sobre ellos, se hallan los procesos de

formación de las especies, tal como han sido descritos, y que son la consecuencia de

accidentes en el medio o en el mecanismo genético de la vida (Judd et al., 1999).

En gran parte la diversidad sistemática que se observa mínimamente en la

naturaleza carece de importancia para el curso principal de la evolución, y son solo

variedades superpuestas de un modelo más amplio; se puede comentar que aunque

es inevitable que la vida se divida en especies y que el amplio proceso de la

evolución opere con especies como unidades de organización, el número que se

10

necesita para esto es mucho menor que el número que realmente existe (Huxley

1965), comenta además, que la formación de especies constituye un aspecto de la

evolución pero una gran parte de ellas es en cierto sentido, un accidente, un

desenfreno biológico al azar, sin influencias sobre las direcciones esenciales y

continuas del proceso evolutivo.

2.1.5 Especiación y método sistemático

Huxley (1965), considera tres principales fases sobre la especiación en la

historia de la taxonomía moderna: base filosófica, fase darwinista (doctrina de la

descendencia con modificaciones) y el período mendeliano basado en la teoría de

citogenética de la herencia particularizada y mutación. Esta doctrina de fijeza de las

especies era en un aspecto la racionalización o reflexión, por la necesidad práctica

de identificar las plantas para fines medicinales; una vez aceptada se prestaba a la

fácil identificación. Si las especies son inmutables y constituyen entidades diferentes,

el principal objeto de la sistemática sería establecer una distinción entre ellas (Huxley

1965; Simpson y Cracaft 1995).

Al llegar la época .darwinista, todo cambió, la homología, en lugar de ser

esencialmente un término descriptivo que sólo significaba la particularización de un

plan arquetipo común, vino a ser un término explicativo que implicaba la intervención

de un plan general en la descendencia desde un antepasado común (Huxley 1965).

La base de la clasificación vino a ser en teoría al menos, filogenético, ya que el grado

de semejanza era tomado como índice de la intimidad del parentesco, y las

categorías taxonómicas fueron definidas suponiendo que cada una de ellas

representaba una rama de un orden superior o inferior en el árbol filogenético

(Huxley 1965; Stebbins 1978).

A comienzos del presente siglo, puede considerarse como un subperíodo,

caracterizado por el uso de distribución geográfica como un criterio taxonómico,

aparte de los caracteres morfológicos; esto también significó el abandono de los

11

últimos vestigios de un “linneismo” subconsciente, y la adopción de un esquema

completamente filogenético tanto en la sistemática major como en sistemática minor

(Huxley 1965; Weller y Sakai 1999; Crawford 2000).

Huxley (1965) considera que una clasificación basada sobre la idea de la

sucesión filogenética pertenece mas bien al campo de la especulación, salvo en

algunas líneas fósiles, ya que no se puede conocer el curso real de los sucesos en la

evolución de un grupo; comenta además, que en la mayor parte de los grupos el

único dato que poseemos para basar nuestro esquema de clasificación es el

referente a las especies, subespecies y variantes genotípicas que existen en la

actualidad, pues son los únicos grupos con existencia biológica concreta. Agrega

también que, lo que ahora sabemos acerca de los diferentes métodos para la

formación de nuevas especies y de los mecanismos genéticos y fisiológicos que

rigen su producción y mantenimiento nos permite observar el problema con mayor

claridad, y comenzamos a darnos cuenta de que será necesaria una nueva base para

la clasificación por lo que se refiere a la diversidad sistemática minor, aunque el

método filogenético continúe siendo aplicable a los grupos major (Huxiey 1965). Judd

et al (1999), por su parte consideran que la especiación usualmente requiere de

alguna separación geográfica entre sistemas de poblaciones que evite el flujo

genético, ya que la especiación alopátrica incluye la división de una especie en dos o

más poblaciones que divergen en aislamiento físico.

2.1.6 Conservación de la herencia

La herencia es una fuerza conservadora. En efecto, los genes desempeñan la

función de plantillas para la producción de réplicas exactas de sí mismos; al hacer

que la prole se parezca a sus progenitores, la herencia da estabilidad a los sistemas

biológicos. La evolución en cambio, es la antítesis de la inmutabilidad. Una definición

mas amplia de la evolución considera que “el estado actual de un sistema es

resultado de un cambio más o menos continuo del estado que tuvo originalmente”

12

(Lewontin 1968). Por su parte Dobzhansky (1975), agrega que si la herencia fuera

siempre perfecta, la evolución no tendría lugar.

La parte complementaria de la herencia es la variación, la cual tiene dos

aspectos, uno estático y otro dinámico (Dobzhansky 1975), añade además, que la

variación como calidad (variabilidad) es la diversidad observable entre individuos o

grupos dentro de una misma especie, o la diversidad entre especies distintas. La

variabilidad como proceso implica que el desarrollo de los individuos puede verse

modificado por influencias ambientales, y que la dotación hereditaria puede alterarse

mediante la recombinación de los genes o la mutación (Philiptschenko 1927;

Dobzhansky 1975). La selección natural darwiniana y la deriva genética al azar han

manipulado la evolución dé la enorme diversidad vegetal; el papel principal de la

variación heredada es la reproducción diferencial o selección natural (Judd et al.,

1999).

2.1.7 Fenotipo y genotipo

El fenotipo de un individuo es lo que en él puede descubrirse mediante la

observación, a saber: los elementos estructurales y las funciones de su organismo, o

sea lo que un ser viviente es para nuestros órganos de los sentidos sin que

recurramos a otros medios para estudiarlo (Dobzhansky 1975), por otra parte el

genotipo, en cambio, es la suma total de materiales hereditarios que un individuo

recibe de sus progenitores y otros antepasados. Al respecto Judd y colaboradores

(1999), consideran que todos los organismos desempeñan funciones por medio de

los mismos patrones metabólicos, y que hace que el ADN del genotipo registre la

información genética y transmita esta información (generalmente con algunas

variantes) para coordinar el desarrollo del fenotipo, que sería la parte externa de

todos los organismos. Su comentario final al respecto es que los mayores cambios

son generalmente registrados en los fenotipos.

13

2.1.8 Mutación

La fuente primaria de la diversidad orgánica es la mutación.

La teoría de la mutación afirma que las propiedades de los organismos están

integradas por unidades notoriamente distintas. Los grados intermedios, que tan

numerosos son entre las formas externas de plantas y animales, no existen entre

tales unidades como tampoco existen entre las moléculas de la química (Dobzhansky

1975), de tal forma que una mutación es, un cambio en uno o más genes. La

mutación y la recombinación genética proveen la variación requerida para el cambio

evolutivo; dicha mutación incluye cambios en el ADN, desde cambios en una simple

base hasta la adición en el genoma total (Judd et al., 1999).

2.1.9 Aislamiento reproductivo

El aislamiento de especies en el mismo grupo de organismos suele lograrse

por diferentes medios, de esta manera el aislamiento de una pareja dada de

especies fines puede ser el resultado de diversos mecanismos de aislamiento cuyos

efectos se refuerzan los unos a los otros Dobzhansky (1937). El mismo autor

propuso el nombre de “mecanismos fisiológicos de aislamiento” para designar en

general todas las causas, con excepción del aislamiento geográfico, que impide el

intercambio de genes entre las poblaciones. El término fisiológico en este contexto

fue causa de equívocos y tomando esto en cuenta, Mayr (1942) lo cambio por

"mecanismos de aislamiento reproductivo". Según Levin (1971), los mecanismos de

aislamiento reproductivo pueden clasificarse acorde a su tiempo de efecto durante su

reproducción.

Por lo que todo aislamiento reproductivo es resultado de diferencias genéticas

entre las poblaciones, en tanto que el aislamiento geográfico no se debe

necesariamente a esto mismo; el aislamiento de hábitat casi llena la brecha, pero

aún en este caso, el apego de las diferentes especies a habitats diferentes se debe

14

evidentemente a sus constituciones genéticas (Dobzhansky 1975; Mayr 1977; Judd

et al., 1999).

Complementando lo anotado anteriormente, según Singh (1999) y Judd et al.,

1999), agregan que los mecanismos de aislamiento pueden dividirse en dos grandes

categorías:

A. mecanismos precigóticos (anteriores a la formación del cigoto).

I. Mecanismos pre polinización

1. Aislamiento geográfico. Separadas geográficamente

2. Aislamiento ecológico. En mismas regiones geográficas, pero diferente

nicho.

3. Aislamiento estacional. Las flores abren en diferentes épocas.

4. Aislamiento temporal. Las flores abren a diferentes horas.

5. Aislamiento etológico. Tienen diferentes polinizadores.

6. Aislamiento mecánico. Entre especies cercanas, la polinización se previene

por diferentes estructuras de la flor.

II. Mecanismos post polinización

1. Aislamiento gametofítico. La polinización cruzada ocurre, pero el polen falla

en la germinación, o si germina, los gametos masculinos no alcanzan al

huevo dentro del saco embrional.

2. Aislamiento gamético. Dentro del huevo, la fusión gamética o endospérmica

puede no ocurrir.

B. Mecanismos post zigótico (posteriores a la formación del cigoto)

1. Incompatibilidad de la semilla (la semilla no se forma)

2. Inviabilidad híbrida. Los F1 mueren antes de florecer.

3. Esterilidad híbrida. El F1 no produce semillas viables

4. Esterilidad híbrida F2, los híbridos F2 mueren antes de florecer o las

semillas no germinan.

15

Se considera que estos conceptos son las bases para conocer el estado y la

relaciones genéticas de que guardan los organismos dentro una población o en una

comunidad, por lo que, como lo anota Llorente (1995), el hombre, ya sea

individualmente o en las sociedades que forma, ha tenido que reconocer su universo

biológico y describir sus similitudes y discontinuidades, a la vez que descubrir y

establecer las unidades, principios y leyes que subyacen en la variedad y el número

de los seres vivos. El mismo autor agrega que, de esta manera, se han formulado

arreglos clasificatorios que han permitido entender a los seres vivos; los fundamentos

que han servido a los taxónomos o naturalistas. de antaño para proponer

clasificaciones biológicas han variado a lo largo de la historia de la humanidad y de la

ciencia.

2.2 Sistemática

La sistemática es la rama de la biología que trata de detectar, describir y

explicar la diversidad biológica (Moritz y Hillis 1996; Martínez 1997). Los primeros

sistemas de clasificación como el de Linneo en 1735, consistían simplemente en

asignar jerarquías de manera que se pudiera recuperar la información. Los siguientes

sistemas utilizaron numerosos caracteres seleccionados a posteriori para producir

una clasificación llamada “natural”, como los desarrollados por Jussieu hacia finales

de 1700 (Martínez 1997). La teoría de Darwin sobre el origen de las especies ha

servido mas para explicar los patrones de similitud observados que para alterar las

clasificaciones existentes, sobre todo en las más recientes (filéticas) como las de

Engler y Prantl de 1887-1915 (Stuessy 1990; Martínez 1997). Por su parte Judd y

colaboradores (1999), consideran a la sistemática como la ciencia de la diversidad

organísmica; que incluye el descubrimiento, descripción e interpretación de la

diversidad biológica, así como a la síntesis de información sobre la diversidad en

forma de un sistema de clasificación predecible. Anderson et al (2002), agregan que

la taxonomía es la parte medular de la sistemática, que se encarga de la descripción

y clasificación formal de las cosas vivientes; los sistemáticos fueron de los primeros

en reconocer e interpretar patrones evolutivos significativos en la naturaleza.

16

En todos los sistemas de clasificación elaborados hasta mediados del siglo

XX, las decisiones se tomaron de manera intuitiva, arbitraria y sin criterios rigurosos,

por lo que Bremer y Wanntrop (1978), concluyeron que la clasificación filética no se

podía considerar ciencia, sino un arte altamente personal no reproducible. Esta

inconformidad con el análisis subjetivo de la información llevó al desarrollo de

métodos de análisis más rigurosos, la fenética, basada en similitud general (“overall

similarity”) obtenida por el análisis estadístico de un gran número de caracteres

(Stuessy 1990), y la cladística que reconstruye las genealogías de los organismos

para proponer su clasificación (Scotland 1992; Mayr 1974; Martínez 1997).

Las fuentes de información taxonómica hasta principios de los años cincuenta

fueron la toma directa de características morfológicas, anatómicas, embriológicas,

palinológicas y citológicas. A mediados de los cincuenta se inició la etapa

experimental de la sistemática, al incluirse el uso de la química secundaria para la

obtención de datos, sobre todo de flavonoides, en muchos trabajos de taxonomía

clásica (Martínez 1997). El uso de esta metodología se extendió hasta los años

ochenta (Crawford 1989). La popularidad de éstos métodos se basa en que cualquier

carácter utilizado para un análisis sistemático debe reflejar cambios genéticos

(Martínez 1997). Cada día se tiene más arraigo sobre la idea de que la clasificación

fundamental de los seres vivos es aquella que se conoce como evolutiva o

filogenética, lo que significa que las similitudes y diferencias entre los organismos

son un producto o consecuencia de las relaciones de ancestría o descendencia de

las poblaciones y especies a las que pertenecen (Llorente 1995).

2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica

La taxonomía numérica es una rama desarrollada de la taxonomía, la cual

tiene un gran avance con el desarrollo de las computadoras. Este campo de estudio

es también conocido como taximetría (Rogers 1963), taxometría (Mayr 1966),

taxonomía matemática (Jardine y Sibson 1971), morfometría multivariada (Blackith y

Reyment 1971) y fenética. Los métodos modernos de taxonomía numérica tuvieron

17

sus inicios con las contribuciones de Sneath (1957), Michener y Sokal (1957), Sokal

y Michener (1958), los que culminaron con la publicación de “Principios de

taxonomía numérica” (Sokal y Sneath 1963), con una versión expandida y

actualizada “Taxonomía numérica” (Sneath y Sokal 1973).

De acuerdo con Singh (1999), en las recientes décadas se observó un fuerte

debate sobre la disponibilidad de las “técnicas empíricas” o “técnicas operacionales”

en estudios de sistemática. El mismo autor, considera que, la taxonomía empírica

forma clasificaciones sobre juicios taxonómicos basados en la observación de datos

y no en suposiciones, por otro lado la taxonomía operacional se basa en métodos

operacionales y experimentación para evaluar y observar datos, antes de una

clasificación final. El mismo Singh, agrega que la taxonomía numérica encuentra un

balance entre las dos, ya que es empírica y operacional. De tal manera que la

taxonomía numérica no produce nuevos datos o un nuevo sistema de clasificación,

sino que más bien es un nuevo método de organizar dichos datos que pudieran

ayudar en un mejor entendimiento de sus relaciones; y las clasificaciones especiales

se basan en uno o algunos caracteres, o sobre un juego de datos, por último

comenta que la taxonomía numérica busca la base de la clasificación sobre un gran

número de caracteres de muchos juegos de datos en un esfuerzo por producir una

clasificacicn fenética completa de máxima predicción (Singh 1999).

Además añade que, la metodología de la taxonomía numérica incluye la

selección de unidades operacionales (poblaciones, especies, géneros, etc., de las

cuales se reúne información) y caracteres; la información de estos es registrada y la

similaridad (y/o distancia) entre unidades determinadas usando varias fórmulas

estadísticas, y agrega que, los análisis finales incluyen la comparación de datos de

similaridad y la construcción de diagramas o modelos, los que brindan un resumen

del análisis de los datos. Estos modelos o diagramas son usados para una síntesis

final y un mejor entendimiento de las relaciones.

18

Singh (1999), tambien menciona, que las mayores ventajas de la taxonomía

numérica sobre la taxonomía convencional incluyen: (1) poder para integrar datos de

una gran variedad de fuentes, como la morfología, fisiología, fitoquímica,

embriología, anatomía, palinología, cromosómica, ultraestructuras, micromorfología y

molecular; (2) automatización considerable del procesamiento de datos; (3) datos

codificados en forma numérica que pueden integrarse con sistemas de

procesamiento de datos en varias instituciones, que pueden usarse en la descripción

de claves, catálogos, mapas y otros documentos; (4) los métodos son cuantitativos,

dando discriminación a lo largo del espectro de diferencias taxonómicas, y poder

brindar mejores clasificaciones y claves; (5) la creación de datos explícitos en tablas

necesarias en la taxonomía numérica, mediante el uso de más y mejores caracteres

descritos, lo que necesariamente mejorará una taxonomía convencional; (6) la

aplicación de la taxonomía numérica propone preguntas recientes concernientes a la

clasificación e inicia los esfuerzos para la reexaminación de sistemas de

clasificación; (7) un número de conceptos biológicos y evolutivos han sido

reinterpretados, por lo se introduce un interés renovado en la investigación biológica.

2.4 Filogenia y sistemática molecular

La filogenia puede ser definida como las relaciones históricas entre linajes de

organismos y sus componentes (por ejemplo los genes) (Hillis et al., 1996). Existen

dos principales componentes de la filogenia: la cladogénesis, que es el patrón de

ramificación de la filogenia, y la anagénesis que es el grado de divergencia y la

cantidad de cambio evolutivo que ocurre entre los puntos de ramificación expresados

como la cantidad total de cambio evolutivo dentro de linajes ( a lo largo de diferentes

ramas del filograma). Así la filogenia es algo más que sólo la secuencia de

ramificaciones. El escenario filogenético, incluye el grado de divergencia y cantidad

de cambios evolutivos seguido de las ramificaciones, por lo tanto requiere de ambos

análisis, cladísticos y anagenéticos (Takhtajan 1997).

19

Un punto de desacuerdo es el uso de las filogenias obtenidas. La mayoría de

los autores usan estas filogenias de una u otra forma para tomar decisiones

taxonómicas y construir una clasificación (Nelson 1973; Wiley 1980), pero otros

autores sostienen que la clasificación y la reconstrucción filogenética son actividades

separadas y complementarias que deben mantenerse así (Felsenstein 1984; Mayr

1981). Dowling y colaboradores (1996), señalan que las filogenias obtenidas son de

las moléculas, que pueden diferir de la de los organismos debido, entre otras cosas,

a introgresiones y conversiones de genes.

Los estudios filogenéticos incluyen dos tipos básicos de datos del ADN:

cambios en el contenido u orden del genoma y la substitución de nucleótidos

(Downie y Palmer 1992), o como lo interpretan Hillis y colaboradores (1994),

fragmentos de restricción y secuencia del ADN. La variación a nivel del ADN puede

observarse directamente por la secuencia del ADN o del ARN, o directamente por la

observación de los polimorfismos detectados con alguna de las endonucleasas de

restricción que comercialmente están disponibles, las cuales son empleadas

comúnmente en la técnica de polimorfismos en la longitud de fragmentos de

restricción (RFLP) (Doyle 1993). La eficacia sistemática será mayor si el carácter

utilizado no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, por lo que el

uso directo del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales

para una clasificación (Crawford 1990; Clegg y Durbin 1990), con la ventaja adicional

de que el número de datos que se pueden obtener está limitado solo por el tamaño

del genoma (Hillis 1987).

El uso de marcadores moleculáres para resolver problemas taxonómicos en

plantas se inició en la década de los cincuenta con las isoenzimas (Market y Moller

1959), ya en los setenta fue la electroforésis de enzimas (Gottlieb 1971), y hacia los

ochenta las técnicas de manipulación y análisis habían avanzado lo suficiente como

para poder estudiar la variación del ADN y ARN (Moritz y Hillis 1996). Las tres

grandes áreas de aplicación de la sistemática molecular son en la estructura genética

de poblaciones (como variación geográfica, heterogocidad), delimitación de especies

20

(incluyendo híbridos) e inferencia filogenética (Baverstock y Moritz 1996).

Actualmente el uso de estos marcadores se ha vuelto tan común, que de 71 trabajos

publicados en la revista Systematic Botany en 1994 y 1995, el 52% incluían técnicas

moleculares (Martínez 1997).

Las técnicas moleculares que se han usado para resolver problemas

taxonómicos en plantas son la secuencia de :aminoácidos, serología, hibridación

ADN-ADN, electroforésis de énzimas, cambios en sitios de restricción y secuencia de

ácidos nucleicos. Las dos primeras han tenido un impacto marginal debido a

problemas de técnica o interpretación (Martínez 1997).

El contenido y orden de genes es muy estable en las plantas, y se ha

demostrado que la tasa de cambio evolutivo en la molécula es apropiada para

estudios filogenéticos prácticamente a cualquier nivel taxonómico (Palmer 1986;

1987; Palmer et al., 1988). El ADN del cloroplasto por su tamaño relativamente

pequeño y naturaleza conservadora lo hace una molécula ideal, ya que es fácil de

manipular, y analizar con diferentes técnicas (endonucleasas restrictivas, secuencia

genética). Además este genoma se presenta en múltiples copias por ende su

aislamiento del tejido fotosintético es relativamente sencillo y requiere pocas

cantidades de tejido (Wallace 1995; Cota y Wallace 1996). En la familia

Crassulaceae se realizó el análisis filogenético del ADN del cloroplasto usando la

variación de sitios de restricción. (Ham 1994, 1995, Ham et al., 1994, Ham y’t Hart,

1998).

Tipos de marcadores y sus usos

Se puede definir como “marcador” (biológico) cualquier característica

heredable que nos permita estudiar la diversidad biológica; hasta hace unos cuantos

años la mayoría de los "marcadores" que se utilizaban, eran marcadores

morfológicos (fenotípicos), posteriormente con el advenimiento de las técnicas de

estudio de material genético (ADN) que se han desarrollado a partir del

descubrimiento de su estructura en 1953, y en forma explosiva durante la última

21

década con las modernas técnicas de biología molecular, la tendencia actual es el

estudio de la diversidad y variabilidad del material genético mismo y no de su

expresión fenotípica (Avise 1994).

El mismo autor afirma que, los marcadores genotípicos son aquellos que se

refieren a diferencias en la información genética misma, y no en su expresión como

sucede con los marcadores fenotípicos, y que estos se pueden dividir en dos tipos:

1) Secuencias de un gen o una región en particular (secuencias de ADN

mitocondrial, del cloroplasto y en general para cualquier gen o genes para los

cuales conocemos su secuencia.

2) Polimorfismos en tamaños de fragmentos (marcadores de ADN que no se

basan en diferencia de secuencia, por Ej. RFLP, RAPD, AFLP y polimorfismos

en secuencias repetidas como mini o microsatélites).

El mismo Avise (1994) señala, que las secuencias de genes funcionales están

sujetas a una fuerte selección natural, teniendo relativamente pocos “grados de

libertad” (bases que pueden variar sin alterar la función del gen y resultar letales); por

tanto las diferencias en las secuencias de genes funcionales evolucionan

“lentamente”; sirven por tanto para estudiar la filogenia de grupos taxonómicos

bastante separados (casi en todos los casos, mas alejados que género), y que por

otro lado, los polimorfismos en la longitud de secuencias homólogas de ADN son

extremadamente útiles en el estudio de la diversidad genética intraespecífica, ya sea

desde el punto de vista de poblaciones o también muestreando individuos

representativos de diferentes poblaciones.

Los objetivos de los métodos de análisis de la diversidad pueden ser

considerados de dos tipos: a) para inferir el árbol filogenético de los individuos

estudiados; b) para inferir el parecido genético (o relación) entre individuos

estudiados; por lo que considera que, el objetivo será filogenético cuando se está

22

trabajando con individuos representativos de especies muy diferentes,

reconstruyendo el árbol evolutivo de los individuos (Avise 1994). En cambio si se

está trabajando con poblaciones de la misma especie, de especies relacionadas o

individuos representativos de poblaciones de la misma especie, entonces en la

mayoría de los casos el objetivo será la caracterización de las poblaciones y el

estudio de la variabilidad dentro de ellas (Hillis et al., 2000).

2.4.1 Enzimas de restricción

Dowling y colaboradores (1996), consideran que las enzimas de restricción

son endonucleasas tipo II (secuencias definidas) producidas por bacterias como

mecanismo de defensa contra ADN extraño, y que cada enzima corta la doble

cadena de ADN en un sitio de reconocimiento :específico y simétrico, ya que es el

mismo si se lee a partir de la'porción 5’ o de la 3’ de cada cadena; dependiendo de

donde corte, pueden quedar porciones colgantes en la cadena 5’, en la 3’, o en

ninguna, y esta simetría permite que la cadena se vuelva a unir.

Bult y Zimmer (1993), comentan que las enzimas pueden cortar ADN ya sea

de origen nuclear o de organelos, aunque el ADN mitocondrial no se usa en

sistemática vegetal; agregan que, debido a los frecuentes rearreglos en el ADN

nuclear; la porción más usada es el ADN ribosomal, que se puede usar a muy

diferentes niveles taxonómicos en virtud de que los genes que codifican para los

fragmentos 18S y 25S son poco variables, mientras que los espaciadores

(transcritos) son variables en mayor proporción. Una de las limitantes es que el ADN

ribosomal está metilado, es decir tiene un grupo metilo en su molécula, por lo que

existen pocas enzimas que lo corten (Bogler y Simpson 1995). Otra limitante es la de

analizar solamente una región muy específica del genoma (comunicación personal,

J. Simpson enero, del 2003).

Por su parte Jansen y colaboradores (1998), considera que existen dos

métodos para interpretar datos de enzimas de restricción: por la presencia o

ausencia de cada fragmento o de sitio de restricción, por lo que las diferencias en los

23

fragmentos de restricción pueden presentarse como substitución, supresión o

inserción de nucleótidos. Los mismo autores agregan que, los mapeos de sitios de

restricción distinguen dos tipos de cambios entre uno y otro, ya que si se compara un

taxon muy relacionado con otro, a un nivel bajo de secuencia y divergencia (< 1.0%),

es posible que se interpreten adecuadamente los cambios de sitios de restricción por

cada inspección de patrones, o de fragmentos del patrón. A mayores niveles la

divergencia es esencial para mapear los sitios de restricción y la substitución de

bases (inserción/supresión), para hacer una acertada determinación de los

caracteres de homología en comparaciones filogenéticas (Jansen et al., 1998).

Los mismos autores consideran, que en virtud de que el mapeo de sitios de

restricción claramente consume más tiempo que la interpretación de datos de los

fragmentos, éstos deben ser más completos en comparación con genomas a

mayores niveles de diversidad de secuencias (> 1.0%), en la obtención de árboles

genéticos confiables. Una de las ventajas es que mediante el uso de un mayor

número de enzimas, el análisis de datos de sitios de restricción puede mostrar mayor

diversidad de secuencias que la misma secuenciación del ADN (Jansen et al., 1998).

Dos estudios recientes (Cummings et al., 1995, Hillis et al., 1994) sugieren que

con el análisis en sitios específicos a lo largo del genoma, es más factible obtener la

información completa de un genoma entero, ó una correcta filogenia; que con la de

los sitos contiguos.

Jansen et al (1998) consideran que dentro de las limitaciones sobre el uso de

sitios de restricción, están: 1) que dicha técnica generalmente requiere de altas

cantidades de ADN purificado; mientras que el ADN para de secuenciación requiere

pequeñas cantidades de ADN aislado de ejemplares de herbario o material fósil, 2)

para el estudio de secuencia, el ADN de diferentes laboratorios se combina más

fácilmente, mientras que no ocurre esto en el caso de datos de sitios de restricción,

la combinación de secuencias rbcL de varios laboratorios es un excelente ejemplo

(Chase et al., 1993). Limitaciones complementarias serian, 3) se sospecha que existe

más ambigüedad acerca del carácter homólogo en los datos de los sitios de

24

restricción, que en !a secuenciación del ADN, y 4) los datos de sitios de restricción

no son considerados para la comparación sobre evolución molecular, como las

secuencias del ADN; finalmente concluyen que el conocimiento de la actual

secuencia de nucleátidos permite comparaciones más exactas de los patrones y

rangos de la secuencia evolutiva.

Por lo que, hasta ahora se recomienda que los análisis de sitios de restricción

continúen usándose para estudios filogenéticos en plantas, especialmente a bajos

niveles taxonómicos donde el valor de divergencia es bastante baja (usualmente

< 1 %) en los cuales los sitios de mapeo no son necesarios (Jansen et al., 1998).

2.4.2 Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos

Amplificados

Una de las técnicas moleculares más nuevas es la del AFLP o polimorfismos

en la longitud de los fragmentos amplificados. La metodología de dicha técnica fue

desarrollada por Marc Zabeau para la Compañía Dutch Keygene y publicada por

primera vez por Vos y colaboradores (1995). El procedimiento esta basado en la

amplificación selectiva de fragmento restringido, usando la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR). Los polimorfismos detectados son de hecho cambios en, o cerca

de los sitios de restricción (Simpson 1997ª, Simpson et al., 1999).

El método AFLP es una combinación de RFLP con PCR ya que en este caso

la amplificación de la reacción es realizada usando iniciadores específicos para sitios

con enzimas de restricción. Como en el caso de los RFLP’s los polimorfismos

observados son debidos a mutaciones o a sitios cercanos con enzimas de

restricción. Los RAPD, DAF (huella digital amplificada del DNA) y AFLP son

marcadores moleculares multi-locus (Simpson 1997b, Simpson et al., 1999). Los

datos AFLP se obtienen de marcadores genéticos producto de una combinación del

ADN digerido con enzimas de restricción, y la ligación de las secuencias de

nucleótidos específicos enlazados en los extremos por los fragmentos de restricción,

25

seguidos por dos rondas de amplificaciones en la PCR usando iniciadores

etiquetados con base .en las secuencias enlazadas (Vos et al., 1995; Wolfe y Liston

1998).

Simpson (1997ª) y Simpson et al (1999), consideran, que en otras palabras, la

técnica consiste en la digestión del ADN genómico completo usando dos enzimas de

restricción, generalmente las más usadas son EcoRI y Msel, al final de los sitios de

restricción se usan adaptadores moleculares adhesivos y entonces se ligan a los

fragmentos digeridos para producir fragmentos de ADN genómico bordeados por

adaptadores de secuencias especificas. Los mismos autores agregan que,

subsecuentemente, dos reacciones de amplificación PCR son llevadas a cabo; en

que los oligonucleótidos usados en la primera amplificación corresponden a los

adaptadores moleculares más un nucleótido extra interno al fragmento, finalmente el

resultado de esta amplificación son sólo fragmentos con el nucleótido extra, seguido

directamente por los sitios de restricción que pueden ser amplificados; se asume que

el 25 % de todos los posibles fragmentos están en igual probabilidad que A, C, T, y G

seguido en cada sitio. Una alícuota de esta primera reacción de amplificación es

tomada para experimentar la segunda amplificación (Simpson 1997ª). El mismo autor

comenta que en la segunda reacción se usan tres nucleótidos seleccionados (ANN),

lo que significa que sólo fragmentos con esta combinación en particular de 6

nucleótidos adyacentes a los sitios de restricción deben ser amplificados. Uno de los

oligonucleótidos en la amplificación de la segunda reacción (normalmente el

homólogo al hexa-cortador), es etiquetado radiactivamente, lo subsecuente es la

separación de los fragmentos amplificados sobre geles de secuenciación de

poliacrylamida, las bandas pueden ser detectadas por auto-radiografía o detección

fluorescente (Simpson 1997ª; Simpson et al., 1999).

Normalmente en el caso del ADN genómico de plantas bajo estas condiciones

de amplificación, se observan 50-100 bandas por muestra (Simpson 1997ª). La

selección ocurre en diferentes niveles, produciéndose tres tipos de fragmentos en la

digestión de original: ECORI-ECORI, EcoRl-Msel y Msel-Msel; en general, los

26

fragmentos EcoRl-EcoRl podrían ser. mas largos que EcoRl-Msel o Msel-Msel y

muchos podrían estar disponibles para entrar a la secuencia en el gel o engañar la

capacidad de las reacciones de la amplificación PCR (Simpson 1997ª, Simpson et

al., 1999). Vos y colaboradores (1995), sugieren que los fragmentos Msel-Msel están

pobremente amplificados debido a la formación de estructuras parecidas a un

“ganchillo”.

Los fragmentos podrían también estar sin detectar al final del análisis desde

que el oligonucleótido específico EcoRl está etiquetado, por lo que sólo fragmentos

cortos EcoRl-EcoRl o EcoRl-Msel podrían ser detectados; este tamaño de fragmento

de selección es combinado con el uso de bases específicas seleccionadas como se

menciona anteriormente, para producir un número de bandas las que son fácilmente

separadas y analizadas en una secuencia de geles (Simpson 1997ª). La posibilidad

de usar diferentes combinaciones de oligonucleótidos selectos en cada sitio de

restricción y también el uso de diferentes enzimas de restricción hacen de la técnica

AFLP poderosa en la detección de polimorfismos a lo largo del genoma (Vos et al.,

1995). Pequeñas variantes al protocolo de Vos y colaboradores se han propuesto,

entre éstas, la de Reineke y Karlovsky (2000), en que remplazan el iniciador

etiquetado por la incorporación de nucleótidos α -etiquetados durante el PCR; o la

detección por medio de quimioluminiscencia (Lin et al., 1997).

Las bandas observadas sobre los geles de AFLP son clasificadas como

presentes o ausentes en cada individuo y el método es más comúnmente usado

como un sistema dominante/recesivo (Simpson 1997ª). Sin embargo van Eck et al.,

(1995) han hecho habitual el uso de este método como un sistema codominante por

comparación de intensidades de bandas en orden para determinar heterocigotos.

Aunque los AFLP’s teniendo rasgos en común con los marcadores polimórficos

amplificados al azar (RAPD’s) son mucho más reproducibles debido al uso de largos

oligonucleótidos iniciadores que son 100% homólogos con el sitio objeto, permitiendo

así las condiciones para el uso de amplificaciones estringentes (Simpson 1997ª). El

mismo autor y colaboradores (1999), consideran que, la principal ventaja de los

27

AFLP's es la capacidad de analizar muchos loci de manera simultánea del genoma

total y rápidamente calificar gran número de marcadores; sin embargo agregan, que

aunque actualmente es necesario equipo sofisticado y/o radiactivo para llevar a cabo

los análisis AFLP, el método puede ser fácilmente automatizado por el alto

rendimiento de muestras producidas. Las marcas fluorescentes o

quimioluminiscentes están reemplazando a las radiactivas, y él número de puntos de

datos producidos en un corto tiempo exceden los costos (Vaillancourt et al., 1992;

Huang y Sun 1999).

Aplicaciones

El análisis de la variación genética con marcadores de polimorfismo en la

longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), consiste en el uso combinado con

PCR (reacción en cadena de la polimerasa), donde la amplificación permite la

detección de polimorfismos genómicos en los fragmentos de restricción. Los

marcadores tipo AFLP han demostrado ser útiles para evaluar diferencias genéticas

entre individuos, poblaciones, incluyendo linajes independientes, dentro de especies

(Mueller y Wolfenbarger, 1999), así como para el análisis de las relaciones entre especies,

estudio de la diversidad genética y pedigrí, relaciones genéticas y estudios

de variación, caracterización de genotipos, entre otros (Caicedo et al., 1999; Bai et

al., 1999; Barret et al., 1998; Lombard et al., 2000; Saunders et al., 2001; Massa et

al., 2001; Shaun et al., 2000; Miyashita et al., 1999; Cervera et al., 2001; Schaal y

Olsen 2000; Koopman et al., 2001).

La técnica AFLP tiene muchas aplicaciones actualmente, y además de mapeo

y huella digital se usa en diferentes formas para estudios de expresión de RNA, así

como para la detección de la metilación en cambios del estado de desarrollo de

organismos (Reyna-López et al., 1997, en Simpson 1997a). También han sido

usados en un amplio rango de taxa, incluyendo plantas, hongos, animales y

bacterias, para resolver problemas de variación genética, o de especies

cercanamente relacionadas en que ha sido imposible resolver con datos

28

morfológicos, o con otro tipo de caracteres moleculares sistemáticos (Heun et al.,

1997; Russell et al., 1997).

Los marcadores multi-locus brindan información rápida del genoma sobre

distintos individuos, debido a esto dichos marcadores son escogidos para

discriminación en materia legal en cuanto a estudios filogenéticos (Lin y Kuo 1996).

Los AFLP han sido usados para inferir relaciones filogenéticas basadas en medidas

de disimilaridad genéticas en especies cercanamente relacionadas (Sharma et al.,

1996; Huys et al., 1996; Hill et al., 1996; Tohme et al., 1996; Heun et al,1997; Keim

et al., 1997; Yee et al., 1999; Angiolillo et al., 1999; Hansen et al., 1999; Mace et al.,

1999a, Ibid. 1999b; Roldán-Ruiz et al., 2000; Loh et al., 2000a); en relaciones

intergenéricas e interespecíficas (Loh et al., 2000b; Xu et al., 2000; Van

Huylenbroeck et al., 2000; Saunders et al., 2001); relaciones filogenéticas entre

especies (Aggarwal et al., 1999); estudios filogenéticos en varios organismos

incluyendo plantas, bacterias (Lin et al., 1997; Aggarwal et al., 1999), y hongos

(Majer et al., 1996).

Los AFLP también son usados en el agrupamiento de linajes cercanos

relacionados en el examen de la biodiversidad (Karp et al., 1996; Sharma et al.,

1996; Lerceteau y Szmidt 1999), evaluando la diversidad genética (Yee et al., 1999;

Xu et al., 2000; Barret et al., 1998; Lombard et al., 2000); para el mapeo del genoma

y/o desarrollo de plantas, genes marcados (se revisaron más de 20 trabajos al

respecto).

La técnica AFLP presenta potencial para el estudio de poblaciones donde es

importante el monitoreo a escala fina del genotipo de individuos (Travis et al., 1996;

Teulat et al., 2000). Se ha demostrado la eficiencia de la técnica AFLP en la

caracterización de germoplasma (coto-Yamamoto 2000), de ecotipos (Miyashita et al

1999; Shaun et al., 2000). Esta técnica también ha sido usada en estudios genéticos

de poblaciones para caracterizar poblaciones ,naturales de antracnosis del frijol,

29

patógeno en México donde tiene una fuerte correlación entre la estructura clonal de

la población y la distribución geográfica observada (González et al., 1998).

Se ha propuesto que los AFLP's podrían ser usados para saturar la región en

un gene de interés y así producir enlaces marcados muy cercanos (Tanksley et al.,

1995), así como en la construcción primaria de mapeo genético y distancias entre

marcadores, las cuales son de mejor resolución en comparación con los RAPDs,

RFLP y SSR (Van Deer Lee et al., 1997; Miyashita et al., 1999). Cuando se añade la

efectividad en el mapeo genético, los marcadores AFLP tienen gran capacidad de

extensión al cubrir totalmente el genoma y disminuir la distancia media entre distintos

marcadores (Cervera et al., 1996b). Por lo que, se considera que los AFLPs están

surgiendo como marcadores adicionales en la elección de mapeo genético para

incrementar los ya existentes RFLP y RAPD (Mueller y Wolfenbarger, 1999). De igual

forma Innan y colaboradores (1999) presentan un método de estimación de la

diversidad del nucleótido en base a los AFLP. Hedren y colaboradores (2001), los

consideran útiles en el estudio detallado de poliploidía y evolución en la familia

Orchidaceae.

Ventajas y limitantes de los AFLP

Las ventajas de la técnica incluye: (1) No se requiere información a priori de

secuencias para el análisis de AFLP; (2) Se detectan un gran número de bandas

polimórficas; (3) La técnica es altamente reproducible existiendo paquetes

estandarizados disponibles; (4) Las amplificaciones AFLP son dirigidas bajo

condiciones de alta selectividad (alta estringencia), “mostrando casi una perfecta

replicabilidad” (Wolfe y Liston 1998; Mueller y Wolfenbarger 1999). Por ejemplo

la mayoría de las aplicaciones basadas en PCR incluyen sólo una ronda de

amplificaciones, esta técnica requiere dos. (5) Los análisis AFLP requieren pequeñas

cantidades de ADN, pudiendo las muestras estar parcialmente degradadas; (6) Este

tipo de marcadores pueden ser generados a gran velocidad; (7) Estos pueden

segregarse en una moda mendeliana y pueden ser usados para poblaciones

genéticas y análisis tipo QTL; (8) El nivel de resolución puede ser llevado a cabo

30

desde la electroforésis del gel de agarosa, en el gel de acrilamida o con el auxilio de

mecanismos automatizados (Mueller y Wolfenbarger 1999).

Las limitantes incluyen el número de pasos requeridos para la producción de

resultados, asimismo la mayoría de otros métodos basados en PCR pueden usar

geles de agarosa para llevar a cabo la electroforésis y teñidos con Bromuro de Etidio.

Costos adicionales y/o como las enzimas de restricción para el ADN total y ligación

de enlaces requieren la compra de enzimas y licencia del paquete. Adicionalmente la

separación de fragmentos radioetiquetados necesita del uso de electroforésis en

geles de poliacrilamida en un aparato secuenciador del gel o tener acceso a un

secuenciador automatizado para fragmentos etiquetados radiactivamente (Wolfe y

Liston 1998). Una limitante adicional, para el uso de las técnicas moleculares es que

en nuestro país su costo es mayor, comparada con las técnicas tradicionales

(Martínez 1997).

2.5 Supuestos biológicos y estadísticos sobre los marcadores

moleculares

2.5.1 Homología de los fragmentos

En el caso de los RFLP, RAPD, AFLP y otros sistemas parecidos, se asume

que los fragmentos comigrantes son homólogos; es decir que si se tienen bandas

que se observan en la misma posición de un gel en dos muestras (individuos)

diferentes, entonces estos fragmentos pertenecen al mismo locus, en el sentido de

estar exactamente en la misma posición en los cromosomas de los individuos

estudiados (Arnold y Emms 1998), por lo que se supone que la secuencia de dichos

fragmentos es idéntica. Se considera importante la utilización de este tipo de

marcadores sólo en especies fuertemente relacionadas, con tiempos muy cortos de

divergencia (microevolución) o bien en especies muy relacionadas (Hillis et al.,

1996).

31

2.5.2 Neutralidad de los alelos

Otro supuesto es que los diferentes fragmentos muestreados son

selectivamente neutros; es decir que no confieren al portador ni ventaja ni desventaja

para su sobrevivencia (Hillis et al., 1996). Estos mismos autores consideran que, una

gran cantidad del ADN de los organismos no codifica directamente; es decir que no

porta información, por lo que este tipo de ADN es selectivamente neutro y es el tipo

de cadena que presentará mayor polimorfismo, puesto que esta libre de variar y

cualquier mutación que ocurra se puede perpetuar sin estar sujeta a selección.

Independencia de los Fragmentos

La independencia probabilística de dos eventos se refiere a que la

probabilidad de que dos eventos sucedan al unísono es un producto de la

probabilidades individuales; es decir si los dos eventos son “A” y “B”, serán

independientes si P [AB]= P [A] P [BI, o dicho de otra forma, si el hecho de que un

evento haya ocurrido no afecta la probabilidad de que ocurra en el otro (Everit 1993).

Desde el punto de vista de los marcadores éstos serán independientes si y sólo si: 1)

están situados en diferentes cromosomas (de otra manera, los marcadores “ligados”

en el mismo cromosoma tenderán a heredarse juntos); 2) La (s) población (es) se

encuentra(n) en equilibrio Hardy-Weinberg; es decir, no hay mutación, migración,

selección ni deriva génica (Everit 1993; Hillis et al., 1996).

El proceso de especiación (generación de nuevas especies) fue concebido

como algo gradual acorde con la teoría darwinista, en consecuencia existió un

continuo de especies incipientes que era más fácil diferenciar por métodos

matemáticos, según los seguidores de Adanson (Llorente 1995). El mismo autor

anota que, la práctica era interpretar ciertas diferencias morfológicas en términos de

discontinuidad reproductiva, entonces las medidas cuantitativas y métricas

propuestas constituían una alternativa, y en vez de especies hablaban de unidades

taxonómicas operacionales, con su acrónimo: OTU’s; y concluye que, con las

32

especies biológicas no podían operar y consideraban que las prácticas subjetivas y

arbitrarias en su reconocimiento prohibían su uso en la taxonomía numérica.

2.6 Unidades operacionales taxonómicas (OTUs)

El primer paso en el análisis numérico incluye la selección de Unidades

Taxonómicas Operacionales (OTUs), que son muestras de las cuales se registrarán

los datos. Aunque sería ideal seleccionar individuos de una población como OTUs,

consideraciones prácticas hacen necesario seleccionar los miembros dei rango

inferior como OTUs. Así los OTUs para el análisis de especies podrían ser varias

poblaciones, para el estudio de un género podrían ser las diferentes especies, y para

una familia podrían ser los diferentes géneros. Esto no sería aconsejable, sin

embargo, para el uso de géneros y rangos superiores como OTUs la mayoría de

caracteres podrían mostrar variación de una especie a otra y de esta manera no

sería apropiado para comparación. La solución práctica podría ser el uso de un

representante de cada taxon. Por ejemplo si una familia va a ser analizada y sus

géneros comparados, los datos de una especie representativa de cada género

pueden ser usados para el análisis (Singh 1999).

El mismo autor agrega que la enorme cantidad de datos que generalmente se

maneja en estudios numéricos hacen esencial el uso de la computadora, por lo que

los caracteres mas adecuados para su manejo son de dos-estados (binario ó

presencia-ausencia). Los dos estados ó caracteres binarios son mejor codificados

como 0 y 1 para dos estados alternos; como una codificación es manejada muy

eficientemente por computadoras, los datos codificados pueden ser inscritos en

forma de una matriz con t números de hileras (OTUs) y n número de columnas

(caracteres) con la dimensión de la matriz (y el número de atributos) siendo t x n

(Singh 1999); por lo que, una vez que se han codificado los datos y asentados en

forma de una matriz, el próximo paso es calcular el grado de parecido entre cada par

de OTUs. Dicho autor finalmente anota, que un gran número de fórmulas han sido

33

propuestas para calcular la disimilaridad o similaridad (distancia taxonómica) entre

las OTUs

2.6.1 Medidas de similaridad genética

Una disimilaridad entre dos OTUs es una estimación cuantitativa sobre que

tan divergente son las OTUs (Singh 1999). Las unidades de disimilaridad dependen

de la naturaleza del resumen de la información molecular (Avise 1994). La medida de

disimilaridad genética varía entre cero (para OTUs cercanamente relacionadas) a

uno (Nei 1987). Para cada OTU corresponde una línea en el gel de electroforésis, se

pueden tener n números, cero es la banda ausente y uno la banda presente. Para

medir la disimilaridad genética entre dos OTUs es necesario comparar los patrones

de sus bandas. Patrones similares indican que los individuos están genéticamente

cercanos, por otro lado patrones disimilares indican divergencia genética. Se puede

medir la disimilaridad genética entre OTUs como el número de discrepancias (0,1 ó

1,0) dividido entre el número de comparaciones (bandas) (Weir 1996; Simpson et al.,

1999).

Los mismos autores, así como Weir (1996), consideran que la disimilaridad

genética es perceptible, ya que en los datos de los AFLP amplificados para un

número de bandas dado en dos OTUs, así como la ausencia de amplificación indican

homología a nivel del ADN, al menos en los sitios reconocidos por las enzimas, y

agregan que, de esta manera la disimilaridad entre OTUs, A y B pueden estimarse

por medio de la siguiente formula: D(A, B)= ( ∑ | Ai - Bi | ) / n; donde Ai y Bi,

i=1,2,...n; son los códigos numéricos para la lectura en la banda i, y el símbolo “| |“

denotan los valores absolutos.

Everit (1993) y Singh (1999), anotan que, la estimación de la disimilaridad

entre dos OTUs es determinada, como la suma de los valores absolutos de las

diferencias dividida entre el número de bandas comparadas, y que esta medida de

diversidad genética, es llamada en estadística “parejas simples” (“simple matching”)

34

o disimilaridad “Manhattan”. Si se tienen k OTUs, las medidas de diversidad genética

entre éstas pueden ser escritas en una tabla k por k o una matriz (Singh 1999). Esta

matriz deba ser simétrica, con ceros en la diagonal principal (Simpson et al, 1999), y

agregan que, al comparar un par de patrones de bandeo AFLP de dos individuos, el

cuestionamiento es ¿que tan similares. son? o equivalentemente ¿que tan diferentes

(disimilares) son?; por lo que es necesario dar una respuesta numérica, existen

varias formas de hacerlo, resumiéndose en un coeficiente de similaridad

o disimilaridad.

Los coeficientes de similaridad según, Everit (1993) y Sneath y Sokal (1973) son de

tres tipos:

a) El Coeficiente de Nei y Li (Nei y Li 1979). Este índice se calcula como el

doble del número de bandas compartidas sobre el total de bandas (en ambos

individuos); SNL= 2D/ (B+C+2D); valor 0.5556

b) Coeficiente de Apareamiento Simple (Sneath y Sokal, 1973; Skroch et al.,

1992; “manhattan”. Sitios iguales (0,0 ó 1,1) entre total de sitios. SAS = (A+D)/N;

valor 0.4667

c) Coeficiente de Jaccard (Sneath y Sokal, 1973); “binary”; SJ= D/ (B+C+D);

valor 0.3846

Una de las diferencias importantes entre los coeficientes consiste en si se

toman en cuenta los casos en donde ambas muestras tienen una banda ausente (0 y

0) ó no. Los coeficientes de Nei y Li y el de Jaccard, dependen solamente de las

bandas presente en los individuos que se están analizando; mientras que el

coeficiente de “Apareamiento simple” (Simple matching coefficient) sí los toma

(Sneath y Sokal 1973; Skroch et al., 1992).

Se considera que mientras no exista una base teórica sólida, no es posible

decidir sobre cual de los coeficientes es más adecuado. Desde el punto de vista

práctico, cuando la proporción de (0 y 0) en un grupo de individuos es menor al 20%,

35

las conclusiones sobre la estructura genética de éstos son aproximadamente las

mismas, independientemente del coeficiente que se utilice (Swofford et al., 1996).

2.6.2 Métodos estadísticos para el análisis de la diversidad genética

Existen diferentes métodos estadísticos para realizar el análisis de la

diversidad genética, entre estos destacan, máxima parsimonia, máxima verosimilitud,

distancia genética y métodos de agrupamiento (Hillis et al 1996).

Máxima parsimonia

Debido en parte al gran número de caracteres involucrados, estos datos se

analizan por métodos de distancia, parsimonia o máxima verosimilitud con los que es

posible obtener una filogenia (Hillis et al., 1996).

Se utiliza aquí la palabra “parsimonia” en el sentido de “simplicidad” y los

métodos de máxima parsimonia operan seleccionando los árboles filogenéticos que

minimizan el número de eventos evolutivos necesarios para explicar los datos. Esto

está basado en el principio filosófico de la “navaja de Occam”, principio científico que

dice: que si dos hipótesis explican igualmente los datos, la hipótesis más simple debe

de preferirse. Los métodos de máxima parsimonia están implementados en una

enorme variedad de algoritmos de búsqueda que trata de encontrar el “árbol” más

parsimonioso” bajo algún criterio específico (Hillis et al., 1996).

Máxima verosimilitud

El concepto de máxima verosimilitud es central a la inferencia estadística y

básicamente se trata de elegir el valor del (o los) parámetros de un modelo que son

más creíbles o "verosímiles" dada la información que dan los datos. En general, la

implementación del modelo, los supuestos que es necesario hacer y lo complejo de

la búsqueda numérica que hay que efectuar, hacen que los métodos de máxima

verosimilitud no puedan ser, aplicados a datos demasiado complejos (muchos

caracteres y/o muchos individuos) (Swofford y Olsen, 1990).

36

Distancia genética

Este método ha sido (y continúa siendo) confundido muy a menudo en la

literatura con la disimilaridad genética. El concepto de distancia genética se basa en

las diferentes frecuencias de alelos en las poblaciones; es una función de las

frecuencias génicas en cada población. Existen diferentes fórmulas para medir la

distancia genética (Weir 1996) y, en todos los casos, aquí el sujeto de estudio es la

población y no el individuo en sí, de manera que podemos estudiar la variación

dentro y entre poblaciones y, en algunos casos tratar de obtener dendrogramas o

árboles filogenéticos que relacionen a las poblaciones. Para hacer esto utilizando

datos de distancia genéticas se requiere de algún método en particular: máxima

parsimonia, máxima verosimilitud o agrupamiento. En realidad la “distancia genética”

no es un método de análisis sino un tipo particular de datos, la mayoría de los

estudios con isoenzimas caen dentro de este tipo, y este tipo de estudios se

caracterizan por estudiar muchos individuos (de cada población) en pocos loci (Weir

1996).

Agrupamiento

Son técnicas jerárquicas las cuales producen un dendrograma, este método

se inicia con el cálculo de las distancias de cada individuo hacia la totalidad de

individuos, los grupos se forman por el proceso de aglomeración o división (Manly

1986), la fase complementaria incluye la sepáración de individuos removidos dentro y

fuera en los diferentes estados del análisis. El proceso se completa cuando los dos

últimos agrupamientos se combinan dentro de uno solo, el cual contiene todos los

taxa originales (Swofford y OIsen 1990). Los métodos de agrupamiento son

algorítmicos; ya que no se busca un dendrograma “óptimo”, como ocurre en el caso

de los métodos de máxima parsimonia o verosimilitud; en contraste se tiene una

“receta” con la cual se obtiene un único dendrograma. Los métodos de agrupamiento

constan de dos pasos: 1) una fórmula para medir la disimilaridad genética, que

permite obtener una matriz de similaridad (o disimilaridad) con todas las medidas de

37

disimilaridad entre todos los posibles pares de individuos y 2) un algoritmo para

construir un dendrograma (Avise 1994; Everit 1993).

2.7 Representaciones gráficas de análisis numéricos

La taxonomía numérica auxilia en la determinación de las relaciones fenéticas

entre organismos o taxa. Cain y Harrison, (1960) definen las relaciones fenéticas

como un arreglo por similitud global, basada en todos los caracteres sin alguna

importancia en particular. Sneath y Sokal, (1973) definen las relaciones fenéticas

como similaridad (parecido) basado en un juego de características fenotípicas del

objeto u organismo bajo estudio. Es una manera distinta de relaciones cladísticas, las

cuales son una expresión reciente de un ancestro común y está representado por

una red ramificada de relaciones ancestro-descendiente. Mientras que las relaciones

fenéticas están representadas a través de un fenograma, las relaciones ciadísticas

son mostradas en un cladograma (Singh 1999).

Dendrograma

Un dendrograma es una forma gráfica de visualizar las medidas de

disimilaridad que se tienen en una matriz. Un árbol filogenético es, en contraste, una

aseveración sobre la historia evolutiva de un grupo de individuos. La escala de un

dendrograma está dada en disimilaridad (o similaridad), en contraste, la escala del

árbol filogenético (la longitud de sus ramas) representa tiempo de divergencia (Singh

1999). Por lo que un dendrograma refleja hasta cierto punto, la historia micro-

evolutiva de los individuos, esta presunción está justificada pero es necesario más

trabajo teórico para llegar a sustentarla (Hillis et al., 1996).

Fenograma

Un Fenograma es un diagrama que se construye con base en análisis

numéricos. Cada diagrama resulta de la utilización de un gran número de caracteres,

usualmente de todos los campos disponibles e incluye cálculos de similaridad entre

taxa y la construcción de un diagrama a través del análisis de agrupamiento (Cluster

38

analysis) (Everit 1993; Singh 1999). El diagrama es útil, ya que está basado en un

gran número de caracteres y la clasificación jerárquica resultante puede ser usada

para decidir sobre los niveles de umbral de similaridad entre taxa. Consta de dos

pasos: una fórmula para medir la disimilaridad genética y un algoritmo para construir

un dendrograma (Avise 1994; Everit 1993).

Se considera el hecho de que un fenograma esta relacionado con un

dendrograma, por el sustento teórico con que ambos son construidos. Por otro lado,

un “árbol filogenético” y un “dendrograma” son gráficas que se parecen y a menudo

se confunden. Sin embargo, existen diferencias muy importantes. En un árbol

filogenético cada nodo representa un “ancestro común”, en cambio en los nodos de

un dendrograma son simplemente, los puntos donde dos individuos o grupos se unen

(Singh 1999). Estos representan el nivel de disimilaridad (o similaridad) que existe

entre los individuos (o grupos) (Singh 1999).

El término fenético (como opuesto a filogenético o filético) expresa relaciones

en términos de similaridades entre ¡al propiedades actuales de los organismos sin

referencia de cómo éstas son dominantes (Caín y Harrison 1960; Sneath y Sokal

1973). Algunas fuentes de información, más que los filéticos, pueden usarse en la

construcción de clasificaciones fenéticas, como las químicas, citológicas,

embriológicas y de rasgos genéticos (DNA) pueden ser incluidos, así como fuentes

tradicionales como la morfología y anatomía; esto no implica el significado evolutivo

de como se producen los grupos (Heywood 1976).

Cladograma

Por su parte Wiley (1981), considera como cladograma a un diagrama

ramificado de entidades en las cuales las ramificaciones se basan o infieren por

conexiones históricas entre entidades evidenciadas por sinapomorfias, de esta

manera se considera una filogenia o dendrograma histórico. Las relaciones

cladísticas describen patrones de ancestría, sobre como son los caracteres de los

organismos en torno a la evolución sin estar de acuerdo con el estado actual. Los

39

parecidos en grupos fenéticos, lo cual es debido a ancestría común es denominado

patristico, la similaridad debida a paralelismo y convergencia es llamada

homoplástica (Wiley 1981). Estos dos componentes juntos hacen la similaridad

fenética. La similaridad patrística puede a su vez dividirse en primitiva y derivada

acorde a si es o no conservadora de algunos de los mismos linajes evolutivos como

su inmediato o mas remoto ancestro común (Heywood 1976).

2.7.1 Métodos de obtención de dendrogramas

Una vez que se define la forma en que se mide la disimilaridad genética, es

posible obtener una matriz conteniendo toda la información relevante. Es decir, una

matriz que contenga todos los n(n-1)/2 coeficientes de disimilaridad entre los

posibles pares de individuos (n es el número de individuos) (Everit 1993). Existen

dos razones para construir dendrogramas: 1) proporcionan una manera de resumir

información presente en la matriz de disimilaridad y 2) se espera que el dendrograma

sea similar (al menos en forma) al árbol filogenético de los individuos estudiados

(Everit 1993). Los métodos o algoritmos para la obtención de dendrogramas difieren

entre si en la forma en que se mide la distancia entre grupos (Everit 1993; Efron y

Tibshirani 1993; Simpson et al., 1999).

Se conocen tres métodos para la elaboración de dendrogramas, acorde a las

distancias que presentan entre sí los individuos estudiados:

a) Método del promedio

El promedio aritmético no ponderado por pares (UPGMA): “unweighted pair

group with arithmetic average”, representa el promedio aritmético de las distancias

entre todos los posibles pares de individuos en los dos grupos (Swofford y Olsen

1990; Singh 1999).

40

b) Método del vecino cercano

La distancia mínima, ligamiento simple o de conexión significa la distancia

menor entre miembros de los dos grupos (Swofford y Olsen 1990; Singh 1999).

c) Método del vecino lejano

La distancia máxima, ligamiento completo o compacto significa la distancia

mayor entre miembros de los dos grupos. Este método generalmente podría conducir

a un estrecho agrupamiento discreto que se une a otros solo con dificultad y a

relativamente bajos valores de similaridad totales (Swofford y Olsen 1990;

Singh 1999).

2.7.2 Intervalos de confianza y pruebas de hipótesis sobre

dendrogramas

El valor estimado de un parámetro de interés es inútil si no va acompañado de

un enunciado que permita evaluar que tan preciso es dicho valor, o sea conocer que

tanta confianza podemos tener que el valor obtenido esté cerca del verdadero valor

del parámetro (Everit 1993). En estadística este problema se soluciona por medio de

los intervalos de confianza; en vez de dar como valor estimado un solo punto, se da

un intervalo o región de la cual se tiene confianza que incluya el verdadero valor del

parámetro.

Existen dos aspectos separables que determinan un dendrograma: 1) su

forma o topología; es decir, quien se une con quien y en que orden y 2) la escala, o

disimilaridades en las cuales ocurre las uniones (Efron y Tibshirani 1993).

Cada método de agrupamiento define un tipo de función que determina la

topología del dendrograma. Todas estas funciones tienen como característica común

que dan un resultado “discreto” (un determinado grupo existe o no existe) como

respuesta a valores continuos (las disimilaridades). Es razonable pensar que para

41

cada algoritmo y para cada matriz de disimilaridad existirán límites dentro de los

cuales los valores de la matriz de disimilaridad se pueden mover sin alterar la

topología del dendrograma. Sin embargo, encontrar estos límites es una tarea difícil,

dada la complicada estructura de correlación que existe entre los elementos de la

matriz de disimilaridad (el cambio de posición de una banda en un individuo particular

puede alterar a todo el renglón correspondiente (y columna) de la matriz de

disimilaridad) (Efron y Tibshirani 1993; Weir 1996; Efron et al., 1996).

Es de poco interés la topología del árbol cerca de las unidades, y más bien se

centra en la parte “alta”; es decir es posible tener varios individuos representando

una población que acertadamente deberán formar un grupo compacto, pero no hay

interés en la topología de esa rama, sino en lo que está ocurriendo más arriba del

árbol, es d9cir dónde diferentes poblaciones (ó especies) se unen (Everit 1993). Para

buscar el estadístico de interés, se deben hacer algunos supuestos sobre las

distribuciones de los datos originales (presencia o ausencia de cada banda en cada

individuo). En virtud de que no se ha desarrollado un modelo teórico que tome en

cuenta de manera equilibrada las bases biológicas de los métodos, no es posible

hacer supuestos razonables sobre la distribución de éstos (Everit 1993). Por ello una

de las soluciones asequibles es utilizar métodos de remuestreo, en particular,

“bootstrap” (Felsenstein 1985), para aproximar las distribuciones de los estadísticos

de interés (Brown 1994; Efron et al., 1996).

En el caso que nos ocupa, los datos son presencia/ausencia de n bandas

(renglones de la matriz de datos) colectadas para k individuos (columnas de la matriz

de datos). El estadístico de interés es el dendrograma (obtenido por dos pasos: I-

obtener la matriz de distancia y ll- aplicar el algoritmo de agrupamiento), y una

muestra boostrap (o réplica) que se compone de una matriz de n renglones, tomados

al azar con reemplazo de la matriz original y k columnas, por ejemplo: 1, 2...n; para

obtener una réplica hacemos n “sorteos” donde cada número es escogido del

conjunto {1,2,...n} y en el sorteo cada número tiene la misma oportunidad de ser

elegido: 1 /n ( Efron et al., 1996; Simpson et al., 1999).

42

Una vez que se tiene un gran número de réplicas del dendrograma, es posible

hacer ciertas comparaciones entre el dendrograma original (DO) y los dendrogramas

obtenidos a partir de cada una de las B réplicas digamos, {D1, D2 ....DB}. En

particular, es posible observar, para cada uno de los n-2 nodos del dendrograma

original, si ese nodo (“X” agrupación) existe en cada una de las réplicas (Everit

1993). Contando el número de veces que cada uno de los nodos del dendrograma

original se repite en las réplicas obtenemos un estimado del nivel de confianza para

dicho nodo. Si un determinado nodo se repite en el 100% de los casos se podrá estar

muy seguro de que dicho nodo realmente existe en el verdadero dendrograma (Everit

1993). Por el contrario, si un nodo se repite en raras ocasiones, digamos solamente

en el 5% de las réplicas, se pensará que dicho agrupamiento es producto del azar.

En el sentido de no tener suficiente evidencia de que en realidad dicho nodo exista

en el verdadero dendrograma. (Felsenstein 1985; Efron et al., 1996; Simpson et al.,

1999).

2.8 Análisis estadístico de datos moleculares

El S-plus es un sistema de análisis estadístico, no está diseñado

especialmente para el análisis de datos moleculares o para la aplicación de

algoritmos jerárquicos, sin embargo da la posibilidad de programar rápida y

eficientemente nuevos métodos (Everit 1993); así como de intervalos de confianza,

utilizando el método de Felsenstein (1985), el cual es un método de remuestreo

(varias replicas del dendrograma) para aproximar las distribuciones de los

estadísticos de interés por medio de un sorteo al azar en donde cada número tiene la

oportunidad de ser elegido: Una vez que se tiene un gran número de réplicas del

dendrograma es posible compararlo con el dendrograma original, en particular es

posible para cada uno de los nodos n-2 del dendrograma original, ver si ese nodo

(grupo) existe en cada una de las réplicas. Contando el número de veces que cada

uno de los nodos del dendrograma original se repite en las réplicas se obtiene un

nivel estimado de confianza para dicho nodo (Felsenstein 1985; Efron et al., 1996).

43

2.9 Generalidades de la familia Crassulaceae

La familia Crassulaceae comprende 1200-1500 especies, agrupadas en seis

subfamilias, y cinco grandes géneros: Sedum, Crassula, Kalanchoe, Echeveria y

Sempervivum (Berger, 1930). De acuerdo con van Ham (1994,1995) Ham y 't Hart

(1994), en las crasuláceas existen dos líneas evolutivas y consecuentemente el

número de subfamilias disminuye. Estas son la Crassuloideae (sensu Berger 1930),

la cual se distingue de las demás Crassulaceae por la combinación de flores

haplostemonas (aquellas cuyo androceo consta de un solo verticilio estaminal), y de

hojas opuestas; está representada por dos géneros, y cerca de 200 especies; y la

Sedoideae la cual se caracteriza por flores obdiplostemonas (aquellas que presentan

los estambres del verticilio externo epipétalo), y hojas en espiral; representada por

cerca de 30 géneros y entre 1000 a 1200 especies (‘t Hart 1997).

En la subfamilia Echeverioideae, casi la totalidad de estos géneros presentes

en Norteamérica actualmente son aceptados, por ejemplo: Echeveria,

Graptopetalum, Pachyphytum, Tacitus, Thompsonella, incluyendo Sedum Sección

Pachysedum, pero excluyendo Dudleya y probablemente también Villadia (Eggli et

al., 1995), estos mismos autores reportan para México 12 especies de Pachyphytum,

género cercano a Echeveria con el que se pueden originar híbridos, pero también es

posible hibridizar con muchas otras especies de géneros norteamericanos. Al

respecto se reportan híbridos entre Pachyphytum con Echeveria (Walther 1934;

Moran 1965; Uhl 1994ª, 1995ª, 1995b, 1996, 1997, 1999); entre Pachyphytum y

Lenophyllum (Uhl 1993a); entre Pachyphytum y Thompsonella (Uhl 1994b); entre

Pachyphytum y Tacitus (Uhl 1993b, 1995c) entre Pachyphytum y Villadia (Uhl

1994c).

Walter (1972), incluye aproximadamente 150 taxa de Echeveria mexicanas.

Jacobsen (1978) enlista 29 taxa mexicanos de Dudleya, más de 30 de Villadia y 89

de Sedum. Adicionalmente a las anteriores, con recientes descripciones Fitz y

Anderson (1997), reportan 13 especies de Pachyphytum, 14 de Graptopetalum,

44

cuatro de Lenophyllum, tres de Thompsonella, una de Tacitus y tres de Kalanchoe.

Por lo que hasta ahora se consideran aproximadamente 350 taxa mexicanos de

Crassulaceae.

Con respecto a la clasificación de la familia Crassulaceae, ésta ha

permanecido sin cambios desde el tratado de Berger (1930), el cual tiene parte de

sus orígenes en una temprana clasificación infrafamiliar publicada por De Candolle

(1828). Asimismo, de manera parcial Britton y Rose (1903) abordan los taxa

americanos de Crassulaceae. Estudios recientes, sobre todo los de van Ham et al

(1992), Ham (1994, 1995) Ham y ‘t Hart (1998) permiten incremento y claridad en el

conocimiento de la actual clasificación a nivel infrafamilia, posteriores a los que

planteó Berger en 1930. Otros estudios en varios niveles y con diferentes objetivos

dentro de las Crassulaceae, acuerdan en que la mayor división entre la familia es

entre los taxa haplostemonos y los obdiplostemonos, o como lo planteó Berger en

1930 (Berger 1930), entre las Crassuloideae y el resto de la familia.

Aunque la familia no incluye ningún cultivo masivo en grandes áreas, un

número considerable de especies son importantes para la horticultura; por ejemplo

Kalanchoe blossfeldiana, así como el desarrollo de varios híbridos producto de

cruzas intergenéricas (UN 1992; Thiede 1995).

Un gran número de especies de esta familia son usados intensamente en

estudios de fisiología, ya que la característica suculencia de sus hojas, cutícula

serosa, estomas hundidos y hábito en roseta constituyen la más importante

adaptación a ambientes áridos (Denton 1982), acorde con esta adaptación son

nombrados los miembros de la familia Crassulaceae, como plantas “CAM”,

refiriéndose al metabolismo ácido de las Crassulaceae (Pilon-Smits 1992).

2.9.1 Distribución de las Crassulaceae

La distribución de las crasuláceas es casi cosmopolita e incluye todo el

hemisferio norte así como el sur de África, con evidentes centros de diversidad en

45

México, Sudáfrica, Europa y en las montañas templadas de Asia (van Ham 1994), y

sus especies contribuyen de una manera importante a las comunidades vegetales de

habitats en montañas y lugares semiáridos de regiones templadas y subtropicales.

Thiede (1995), considera que con cerca de 407 especies, América es el

continente con mayor diversidad de crasuláceas, y México tiene el mayor número de

ellas; con 305 especies (75% de todas las especies americanas), Sudáfrica es el

segundo con cerca de 225 especies. El mismo autor agrega que, en América,

Estados Unidos de Norteamérica es el segundo en diversidad de especies con 77,

Centro América y Sudamérica comprenden 18 y 38 especies, respectivamente; por lo

que en México el porcentaje de especies de crasuláceas endémicas es 89.8% y para

Echeveria es de 97.1 %, lo que probablemente representa el más alto grado de

endemismo dentro de las familias y géneros en este país.

México ocupa el tercer lugar entre los países con mayor diversidad biológica

(Rzedowski 1991, 1992). Existen tres tipos de manifestaciones de la diversidad en el

ámbito específico o supraespecífico: α (diversidad de especies), β (heterogeneidad

ecológica) y (heterogeneidad biogeográfica) (Williams-Linera et al., 1992).

El grado de endemismo de las crasuláceas en México, es mayor que el de las

Cactáceas (78%) (Hernández 1994). En las Crassulaceae, tres géneros son

endémicos de México, que representan el 23% del total de esta familia; ó el 30% de

todos los géneros mexicanos de plantas con flores (Thiede, 1995). En general el

endemismo genérico en México es estimado de ser cercano al 10% (Rzedowski,

1993). Los endemismos corresponden a taxa que se encuentran únicamente, en un

lugar, región o país, según la unidad territorial en que se base el análisis, su pérdida

equivale a la extinción. (Williams-Linera et al., 1992).

Según van Ham (1994,1995), México es uno de los centros de diversidad de

crasuláceas, con cerca de 300 especies endémicas distribuidas en 5 géneros:

Echeveria, Graptopetalum, Pachyphytum, Sedum y Villadia. Todas las Crassulaceae

46

del México Central pertenecen a la misma línea evolutiva (van Ham 1994, 1995, van

Ham y Hart 1998).

Van Ham (1994, 1995) y ‘t Hart (1995), indican que la mayor parte de la

riqueza de especies de las crasuláceas de Norte América, se ubica a lo largo de un

gradiente altitudinal casi constante, relativamente menor a bajas altitudes,

se incrementa por arriba de los 800 m. y alcanza picos pronunciados entre los 1,800 a

2,400 m., que a mayor altitud la riqueza baja y sólo pocas especies se encuentran

por arriba de los 3,400m. La riqueza de especies a lo largo del gradiente latitudinal

muestra un incremento pronunciado hacia latitudes tropicales y alcanza un máximo

en el sur de México, En la región tropical mexicana, las crasuláceas generalmente se

restringen a las montañas y tierras altas, que conjuntamente forman la “Provincia de

las tierras altas Mexicanas” dentro del holártico “Región Madre” (Thiede 1995).

Este último autor añade que, en base en los patrones de distribución de todas

las especies, se pueden distinguir 11 centros regionales de endemismos en México y

uno en Guatemala, considerando que el mayor centro geográfico evolutivo de las

crasuláceas mexicanas tropicales tiene rangos cercanos continuos desde el estado

de Hidalgo y Querétaro hasta Oaxaca. Incluye los centros regionales de Hidalgo-

Querétaro, México-Morelos, Orizaba, Tehuacán y Oaxaca, los cuales se

interconectan de varias formas expresando similitudes florísticas, y que comprende

un alto número de taxa infragenéricos, y elevado número y porcentajes de especies

endémicas (también a nivel infragenérico), y la mayoría de centros de riqueza de

especies dentro de grupos infragenéricos de Echeveria y Sedum tropicales (Thiede

1995).

El impacto de diferentes amenazas (sobrecolecta, saqueo, cambio de uso del

suelo, etc.), sobre las cactáceas y otras suculentas mexicanas depende sobre todo

de la característica individual de la población de especies. La mayoría de los cactus

mexicanos amenazados ocurre en pequeñas poblaciones disyuntas de regiones

áridas y semiáridas del país, y una proporción signíficante de ellas son representadas

47

sólo por una o pocas poblaciones. La mayoría de estas especies tiene una

combinación de atributos biológicos y ecológicos haciendo que éstas sean

extremadamente vulnerables a alguna forma de disturbio (Fitz y Anderson 1997).

Estos mismos autores agregan que, estas plantas usualmente tienen pequeñas tasas

de desarrollo, largos ciclos de vida y la repoblación por individuos (vegetativa), es

extremadamente baja.

Estas características de ser vulnerables por pequeñas tasas de desarrollo,

largos ciclos de vida, etc., determinan una lenta respuesta demográfica de las

poblaciones después del disturbio. Sin embargo, la información general sobre

poblaciones vegetales no está disponible, por lo que resulta muy difícil evaluar con

precisión el grado de amenaza sobre dichas especies en particular (Fitz y Anderson

1997).

La Subtribu Sedinae incluye la mayoría de crasuláceas americanas (cerca del

96% de las especies) y todos los géneros de la antigua Subfamilia Echeveriodeae (‘t

Hart 1995). Dicha subtribu está representada por 2 grandes géneros (Sedum y

Echeveria) dos de tamaño medio (Villadia y Dudleya) y 6 géneros pequeños (en el

que queda incluido Pachyphytum). Excepto por Sedum , los géneros de Sedinae son

endémicos de América. Los patrones de distribución, centros de riqueza de

endemismos de especies, así como la evolución de Crassulaceae americanas son

todavía enormemente desconocidas, considerándose que en apariencia los géneros

monotípicos son representantes antiguos, paleoendémicos o de linajes aislados (‘t

Hart 1995).

2.9.2 Estudios filogenéticos en las Crassulaceae

La familia Crassulaceae comprende según Berger (1930), seis subfamilias

(Sedoideae, Echeverioideae, Cotyledonodeae, Kalanchoideae, Sempervivoideae y

Crassuloideae), sin embargo posteriormente a los estudios realizados por van Ham

48

(1994, 1995), van Ham, et al (1994), van Ham y ‘t Hart (1998), consideran que dicha

familia comprende sólo dos líneas evolutivas: Sedoideae y Crassuloideae.

Particularmente, la familia Crassulaceae es considerada dentro de las

angiospermas como monofilética (Berger 1930; Cronquist 1981; Thorne 1983;

Haskings y Hayden 1987), y es clasificada en el complejo orden Rosales,

relacionándose con las familias Penthoraceae y Saxifragaceae (Takhtajan 1980,

1997), afiliaciones que fueron confirmadas mediante caracteres serológicos (Grund y

Jensen 1981) y la comparación de secuenciación del ADN del cloroplasto rbcl a nivel

de género (Albert et al., 1992). Posteriormente, amplios análisis filogenéticos

basados en secuencias del gen rbcl (Chase et al, 1993; Morgan y Soltis 1993), así

como de secuencias del gen 18S del ADN ribosomal (Soltis y Soltis 1997; Soltis et

al., 1997b) indican que las Crassulaceae forman parte del ciado de las Saxifragales.

El análisis de la secuencia del gen matK sobre 112 especies de ésta familia

indican fuertemente a las Crassulaceae como un grupo monofilético (Mort et al.,

2001), que se caracteriza primordialmente por tener una estructura floral

relativamente primitiva que consiste de flores regulares, usualmente pentámeras con

múltiplos, carpelos libres y una o dos series de estambres (Takhtajan 1980). De

manera secundaria la familia exhibe un gran número de rasgos xerofíticos como son:

hojas gruesas y suculentas, cutícula serosa y generalmente hábitos o formas

arrosetadas formando setos, y desarrollan formas parecidas a tapetes (Denton

1982), de tal forma que reflejan adaptación a habitats áridos.

La subfamilia Echeverioideae agrupa a los géneros Pachyphytum, Echeveria

y Villadia y es señalada como un grupo polifilético. Este clado Acre (uno de los

siete), es de los más sorprendentes, porque como grupo se muestra ascendente en

la parte superior del cladograma, éstas se unen a las especies americanas,

altamente diferenciadas y afines a Echeveria, las cuales se han hipotetizado como

las más primitivas, o al menos derivadas del Sedum acre de las Crassulaceae, (‘t

Hart y Koek-Noorman, 1989; ‘t Hart, 1992).

49

El Clado Acre es el más diverso en México y comprende en adición a Sedum,

los géneros Echeveria, Graptopetalum, Lenophyllum, Pachyphytum, Tacitus,

Thompsonella y Villadia (Thiede 1995). Mort et al., (2001) señala que, con base en

información cromosómica, este clado ubica a la mayoría de los taxa mas variables y

confusos, que incluyen a Pachyphytum, Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y

las especies mexicanas de Sedum . Van Ham y ‘t Hart (1998), apoyan la monofilia de

Pachyphytum, y consideran que este clado Acre comprende un tercio de la

diversidad genética de la familia Crassulaceae.

Los árboles filogenéticos de las crasuláceas basados en enzimas de

restricción del ADN del cloroplasto presentados por van Ham (1994, 1995)

comprende 44 especies, de 19 géneros; que representan seis de las subfamilias

planteadas por Berger, pero un estudio más extenso de las relaciones intergenéricas

dentro de la familia requieren de mayor número de muestreos taxonómicos. Sin

embargo, se considera que estos resultados pueden ser usados como referencia

para la clasificación a nivel infrafamilia y genérica de las crasuláceas. Asimismo, los

estudios de van Ham et al., (1994), van Ham (1995) concluyen que el análisis de

secuencia de un espacio entre los genes trnL y trnF pueden también ser usados

para inferir relaciones filogenéticas dentro de las crasuláceas.

Estudios en plantas cultivadas combinando estudios de citología y morfología

de plantas bajo condiciones semejantes de cultivo, han mejorado el entendimiento

del significado de variación intraespecífica y especiación en la familia Crassulaceae y

se considera perfeccionada la delimitación entre especies (‘t Hart 1991). Los trabajos

de van Ham y Hart, (1998) revelaron las interrelaciones moleculares de los

principales grupos de la familia Crassulaceae. Asimismo, otros estudios sobre el

ADN reafirman el conocimiento sobre las relaciones evolutivas dentro de la familia, y

han auxiliado en verificar la prueba de una temprana propuesta de tendencias

evolutivas (van Ham 1994, 1995).

50

2.10 Ubicación taxonómica del género Pachyphytum

De acuerdo con ‘t Hart, (1995), la familia Crassulaceae tiene la siguiente

ubicación taxonómica:

FAMILIA Crassulaceae

SUBFAMILIA Sedoideae Berger in Engler y Prantl.-

Sinónimos: Subfamilia Cotyledonoidae, Subfamilia Echeverioideae, Subfamilia

Kalanchoideae, Subfamilia Sempervivoideáe, Subfamilia Dudleyoideae

TRIBU Sedeae ‘t Hart, Trib. nov.

β SUBTRIBU Sedinae ‘t Hart Subtrib. Nov.-

β CLADO-ACRE

GENERO Pachyphytum Link, Klotzsch & Otto in Allg. Gartenzeit 1841

El género Pachyphytum fue descrito por Link, Klotzsch y Otto en 1841 (Stearn,

1937), la planta tipo fue colectada por Ehrenberg en México, sin localidad definida, tal

especie fue nombrada como Pachyphytum bracteosum . Salm-Dick 20 años más

tarde encontró y describió Diotostemon hookeri (Salm-Reifferscheid-Dyck, 1854), el

cual posteriormente se reconoció como Pachyphytum hookeri (Berger, 1930). Entre

1905 y 1911 Rose, describe P. longifolium, P. brevifolium y P. compactum, asimismo

reubica otras especies que se presentaron como sinónimos del mismo o de otros

géneros. La primera revisión de este grupo se debe a Von Poellnitz (1937),

destacando la información del material colectado hasta esas fechas. En la misma

década, el género fue abordado por Walther (1931, 1937), y más recientemente por

Moran (1960, 1963, 1965, 1967ª, 1967b, 1968ª, 1968b, 1968c, 1971, 1989, 1990,

1991ª, 1991b, 1992); Meyrán (1963); UN y Moran (1973); Kimnach y Moran (1993),

mismos que han descrito algunas especies y publicado aspectos relacionados a

Pachyphytum. Los más reciente descubrimientos, aportan la descripción de tres

especies: dos del estado de Michoacán (García et al., 1999, 2002), y otra en el

estado de Querétaro (Pérez-Calix et Glass, 1999), asimismo, existe una más del

estado de Jalisco, cuyo reporte técnico se encuentra “en prensa”.

51

2.10.1 Descripción botánica

Pachyphytum Link, Klotzsch y Otto (Link, Klotzsch y Otto, 1841). Plantas

herbáceas o sufruticosas, carnosas, perennes, glabras, frágiles, solitarias, o bien en

colonias densas; tallo simple o ramificado; hojas fácilmente caedizas, alternas,

dispuestas en espiral o agrupadas en rosetas alargadas o compactas en los ápices

de los tallos, semicilíndricas, rollizas o aplanadas, carnosas, ápice generalmente

mucronado, verdes, rojizas o violáceas, comúnmente glaucas; pedúnculo verde,

anaranjado o rojizo, provisto de brácteas alternas, sésiles, la base prolongada más

debajo de su inserción con el tallo; inflorescencias en forma de cincinos laterales y

axilares, ocasionalmente las flores solitarias; las flores subtendidas por brácteas

grandes o pequeñas; cáliz de 5 sépalos unidos en la base, iguales o desiguales en

longitud y ancho, adpresos, en algunas especies más largos que los pétalos; corola

algo campanulada a urceolada, de color blanco, verde, anaranjado, rojo o

combinando estos colores, pétalos 5, unidos cerca de la base, erectos y extendidos

en el ápice, cada pétalo con un par de escamas en su interior (similar a un pliegue

del mismo segmento); estambres 10, 5 libres, alternando con los pétalos, los otros 5

epipétalos alternos a los sépalos, adnados a los lóbulos de la corola; nectarios 5;

gineceo de 5 pistilos libres; fruto de folículos divergentes en la madurez; semillas

pequeñas numerosas (Link et al., 1841).

El género Pachyphytum posee 12 especies (Eggli et al., 1995). Actualmente

con las descripciones de P. caesium, P. machucae, P. Garciae y P. Rzedowskii suman 16

las especies descritas, si se incluye en este listado P. contrerassi, cuyo reporte

técnico actualmente está “en prensa”, sumarian 17. La totalidad son de distribución

restringida al centro de México, de la región meridional de Tamaulipas a Guanajuato

e Hidalgo, Jalisco y Michoacán. Se desarrollan en laderas rocosas entre los 600 y

2500 m s.n.m. (Uhl y Moran 1973).

Las plantas del género Pachyphytum, por la belleza de sus flores, de sus

estructuras vegetativas, así como por su aparente facilidad de reproducción, son

recomendadas por varios autores para su cultivo, incluyendo los híbridos obtenidos

52

al cruzar este con otros géneros relacionados. Al respecto (Uhl y Moran 1973),

mencionan que el número de cromosomas estándar de Pachyphytum es de 31-33 ó

sus múltiplos, ya que algunas especies presentan poliploidías.

El género Pachyphytum es considerado cercano a Echeveria (Eggli et al.,

1995), del cual se diferencia principalmente por presentar un par de apéndices en

forma de escamas en la superficie interna de cada segmento de la corola uno a cada

lado del filamento epipétalo (fig. 1).

53

Figura 1. Pachyphytum machucae I. García, Glass et Cházaro. A. Habito. B. Hoja envista ventral, a-b sección transversal de la hoja. C. Bráctea a-d sección transversal de labráctea. D. Flor en vista lateral. E. Vista interior de los pétalos. F. Carpelos y nectarios. G.Vista dorsal del cincino joven. (Dibujo basado en material tipo I. García Ruiz 4497, CIMI, IEB,ENCB, MEXU y realizado por Rogelio Cárdenas), (tomado de: Acta Botánica 47: 1 1).

54

2.10.2 Secciones del género Pachyphytum

Berger (1930), dividió al género Pachyphytum en dos grupos, llamados

sección Diotostemon (Salm-Dyck) Walter, y sección Pachyphytum, las cuales han

sido aceptadas desde entonces. Walther (1931), añade la sección Echeveriopsis , a la

cual Moran (1961a), reintegra al género Echeveria. La sección Pachyphytum es

tipificada por la especie P. bracteosum Klotzsch. La sección Diotostemon es

tipificada por P. hookeri (Salm-Dyck) Berger. Moran (1968a), propone la sección

Ixiocaulon, tipificada por la especie P. glutinicaule.

De tal forma que las secciones propuestas con sus respectivas especies

quedan de la siguiente manera:

Sección Pachyphytum

Caracterizada por tener grandes brácteas del cincino joven imbricadas,

pétalos más cortos que el cáliz y pedicelos florales cortos, con una gran mancha roja

en el interior de los pétalos, las hojas basales varían de elípticas a obovadas y de

menos de 2 a más de 5 veces más anchas que gruesas. Las especies son las

siguientes:

P. bracteosum Klotzsch

P. caesium Kimnach y Moran

P. kimnachi Moran

P. longifolium Rose

P. ovíferum C.A. Purpus

P. viride E. Walther

P. werdermannüv. Poellnitz

55

Sección Diotostemon

En esta sección, las brácteas del cincino floral joven son reducidas, no están

imbricadas, los sépalos son menores que los pétalos, los sépalos están adpresos a

los pétalos, los pedicelos son largos. Esta constituida por las especies:

P. coeruleum Meyrán

P. compactum Rose

P. hookeri (Salm-Dyck) Berger

Sección Ixiocaulon

En este subgénero las brácteas del cincino joven son imbricadas, los sépalos

son más cortos que la corola, el tallo es inicialmente víscido, las hojas son ovobada-

espatuladas, dos veces más ancho que grueso. Conformada por las especies:

P. glutinicaule Moran

P. fiftkaui Moran

La distribución geográfica conocida de la totalidad de las especies,

corresponde a las colectas registradas de material botánico para cada especie

(cuadro 1).

56

Cuadro 1. Localidades donde se han reportado especies del género Pachyphytum

P. bracteosumHidalgo: Barranca de Meztitlan; entre Jihuico y poco antes deMeztitlan; barrancas entre Atzcatzintlan y Meztitlan 1200 m H. E.Moore 2115 (BH); canon de venados, Lindsay ex Moran 6413(SD); cerca de San Juan, 1300 m, Moran y Uhl 13415 (BH,ICF,SD); La Paila, 1300m, Moran y Kimnach7793 (BH, SD); Tajode Caballero 1850 m arriba de San Juan Mezquititlan, Moran10071 (BH, SD); San Juan al SE de Meztitlan, enero 9 del 2000, I.Garcia y S. Garcia 5684 (CIMI, IEB).

P. brevifolium Guanajuato: Tipo: Cerca de Guanajuato, enero, 1898, A. Dugés153 (GH, US); cascada cerca de Picones, municipio deGuanajuato, 2150m.s.n.m., E. Pérez y E. Carranza 2875 (IEB);alrededores de Picones, cerca del río, municipio de Guanajuato,2150m.s.n.m, E. Perez y C. Glass 3793 (IEB); Canada delCapulín, cerca de la Sauceda, municipio de Guanajuato,2000m.s.n.m., E. Perez y C. Glass 3796 (IEB).

P. caesium Tipo: Aguascalientes: Cerca de 2 km al N del pueblo Presa dela Serna, cerca de los 2000m, suroeste de Aguascalientes. Abril1990, W. Minnich 12101 (HNT, holotipo; MEXU, isotipo); Arroyoagua zarca, 7.3 millas camino al noroeste de Milpillas de arriba,cerca de los 2000 m. Julio 24, 1989, W. Baker 7073 (CAS, HNT,MEXU, SD, US paratipos).

P. coeruleum Queretaro: Entre Cadereyta y Zimapan, Hgo. (Adquirida por elSr. Jorge Meyran) del Sr. Yoshida, sin localidad exacta. TipoMEXU (52609); UC (1175244)

P. compactum Hidalgo: Tipo lxmiquilpan, marzo 1905, C.A. Purpus (No. 05/801J. N. Rose, Cultivada), Holotipo floracion en Washington, marzo1910, (US 574499)Queretaro: Cerro El Mexicano, 2100m, Moran 14758 (ARIZ, BH,CAS, ENCB, HNT, K, MEXU, MICH, NY, SD, TEX, UC, US);ladera norte cerro de la Cruz, 1950 m W de la canada, Moran14794 (BH, CAS, GH, MEXU, MO, SD, US); cerca de acueducto,Queretaro H. Fittkau ex Moran 14720 (CAS, SD, US); San Jose elAlto, 4 km N-NE de la Ciudad de Qro., Moran 14792 (SD); Cerrode La Cruz,. La Canada, municipio de El Marques, R. Moran14794 (MEXU); Cerro el Mexicano, municipio de Colon, R. Moran14758 (ENCB, MEXU); 5-6 km al NW de la Carbonera, municipiode Colon, E. Carranza y S. Zamudio 4025 (IEB); 8 km del pobladoEl Zamorano, camino al Cerro Zamorano, municipio de Colon, E.Perez y E. Carranza 2756 (IEB); km al NE de Presa de Rayas,municipio de Colon, S. Zamudio 7382 (IEB); Cerro de las TresMadres, El Terreno, municipio de Toliman, S. Zamudio 2009(IEB); 3 km al SE de San Juan de la Rosa, municipio deCadereyta, S. Zamudio 2933 (IEB).

57

P. contrerassi Jalisco: Salto Cascada “Cola de Caballo” o Mirador Dr. Ati, aprox.Km 14 carr. Guadalajara-Zacatecas, Cantiles rocosos, laderaNorte, alt. 1240m, en bosque tropical caducifolio, marzo 7 de1999, I. Garcia Ruiz y J.A. Machuca 5569 (CIMI).

P. fittkaui Guanajuato: Tipo: 13 millas al este de San Luis de La Paz,enero 25 de 1968, R. Moran 14770 (SD 67775); 14 km decanada de Moreno, carretera San Luis de La Paz-Xichu,municipio Victoria, 2100m, E. Perez y E. Carranza 2901 (IEB).San Luis Potosi: Balneario de Lourdes, Glass y Foster 969 (SD).

P. garciae Queretaro: Tipo: El Zapote, ± 4 km al NW de Rio Blanco,municipio de Penamiller, alt... 1600m, canada con matorralsubmontano,,E. Perez y S. Zamudio 3574 (IEB); El Zapote, ± 4km al NW de Rio Blanbo, municipio de Penamiller, alt. 1600m, E.Perez y E. Carranza 3798 (IEB)

P. glutinicaule Hidalgo: Tipo: Ladera norte, Rio Tula a 1550 m, (puenteTasquillo) 13 millas al norte de lxmiquilpan, diciembre 1° de 1959,Moran y Kimnach. 7805. Area circundante del geiser deTecozautla; barranca de Toliman, cerca de Zimapan, fondo de labarranca 1200 m y en la mina Lomo de toro a 1400 m; CerroTathi, cerca de Zimapan, Walther (1936).Queretaro: 6 km al N del río Extorax, municipio de Penamiller, J.Meyran 2692, segun Moran (1963); Ibíd., E. Pérez y S. ZamudioS/n. (IEB); Tziquia, frente a la Sabina, municipio de Cadereyta, S.Zamudio 9013 (IEB).

58

P. hookeri San Luis Potosi: Puente Tecolote, Sierra Fria, Ahualulco SanJose de la Purisima, Escalerilla, ranchito de Juarez, acantiladosen montanas de Aguascalientes y oeste de San Luis Potosi entre2000 y 2500 m. Rocosidades de San Luis Potosí, C.A. Purpus7685 (UC); disperso sobre acantilados cerca del norte al este dela carretera, cañón de Rio Cracalbaquero, 10 mi. Al norte deAhualulco, 2000 m. C.H. Uhl 1534 (BH, CAS, SD, US).Localmente comun acantilados cerca del norte Puente Tecolotekm 52 sobre Ia carretera San Luis Potosi a Zacatecas, J. Meyran2301 (BH, CU, MEXU?, SD). Moran y Uhl 13349 (BH, SD, UC);comun sobre rocosidades de Escalerilla 2200 m. Moran yKimnach 7639 (BH, CAS, CU, SD, US); rocosidades 2400 marriba de San Jose de la Purisima, Moran y Kimnach 7645 (CU,SD); sobre rocosidades 2100 m arriba de Ranchito Juarez, 7 mi.SE de Zaragoza, Moran y Kimnach 7660(CU, MEXU, SD, US),R.T. Clausen, 50-37 (BH, CU) comprada en la calle de San LuisPotosi, dicen que es de un canon y montanas en un mirador de laciudad, E. Palmer in 1902, Rose 499 (holotipo de P. uniflorumRose, US 399948; isotipos NY, US)

Guanajuato: Cascada cerca de Picones, municipio deGuanajuato, E. Perez y E. Carranza 2875 (IEB); Guanajuato,municipio de Guanajuato, A. Duges 153 (GH, US), segun Britton yRose (1903).Se ha observado en bosque de encino. Alt. 2150 m.florece en febrero.

Aguascalientes: Rocosidades volcanicas sombreadas arriba de2400, ca. 20 km al este de Rincón de Romos, R. McVaugh 23749(MICH); acantilados igneos cara norte de Sierra Fria, 3.4 mi. Aleste de Tepezala 8400 ft. C.H. Uhl 2109 (BH, SD)

P. kimnachi Tipo: San Luis Potosi: Ladera este del Pico Agujon, Sierra de laEquiteria, 22 julio, 1962 Myron Kimnach 290, fl. Abril (SD 64541).Ladera sur Cerro Agujon, marzo 19 del 2000, I. Garcia y G.Hernandez 5693 (CIMI, IEB).

P. longifolium Hidalgo: Paredes de la barranca y aparentemente epifita sobrearboles de pino, Mpio. Meztitlan. Comun sobre rocas Iadera NEcerca de la laguna Meztitlan J. Henrickson y B. Christman 2066/(BH, SD). 2mi. NW de San Cristobal, 1200 m, R. Moran y C. H.Uhl 13417(BH, MEXU, MICH, SD, UC, US); 3 mi. NW de Meztitlan1200m R. Moran y C. H. Uhl 13416 (BH, HNT, ICF, SD, MICH,NY, UC, US); sobre acantilados y arboles del rio Tolantongo, F.Otero 01 (SD?). Toxhico, al SW de Meztitlán, enero 9 del 2000, I.Garcia y S. Garcia 5682 (CIMI, IEB).

59

P. machucae Tipo: Michoacán: Municipio Pajacuarán, 2 km al este dePajacuarán, Barranca del Agua, cerca de El Cometa, alt.1850 m,enero 7 de 1997, I. Garcia Ruiz 4497 (IEB, CIMI, ENCB, MEXU);El Cometa, alt. 1850 m. bosque tropical caducifolio, J.A. MachucaN., I. Garcia Ruiz y M. Chazaro B. 7862 (IBUG, WIS, XAL).

P. oviferum San Luis Potosí: Barranca Bagre, cerca de minas San Rafael1911 C.A. Purpus

P. rzedowskii Michoacán: Tipo: municipio de Tuxpan, Cerro Piedra Redonda,al W de Las Caleras, unos 12 km al W de Tuxpan, alt. 2140 m.19.X1.1989, R. Torres y P. Ramirez 13705 (holotipo: IEB);aproximadamente 1 km al SW de Tuxpan, Cerro de la Vibora, enbosque tropical caducifolio, enero 27 del 2000, I. Garcia 5686(CIMI); Ibid., marzo 5 del 2000, I. Garcia y J. Garcia 5690 (CIMI).

P. viride Guanajuato: El Álamo, SW de Xichú, municipio de Xichú, E.Pérez y E. Carranza 2899 (IEB). Querétaro: Aproximadamente2.5 km al S de Arroyo Seco, municipio de Arroyo Seco, E.Carranza 2413 (IEB); ladera NE del Cerro La Tembladera, 10.5km al NE de Pena Blanca, municipio Penamiller, S. Zamudio 9038(IEB); Ibid., E. Perez y S. Zamudio 2748 (IEB); Cerro LaTembladera ladera N al Sur de Camargo, municipio dePenamiller, E. Carranza 4712 (IEB); Santa María del Mexicano,ca. 20 km, adelante de Colón municipio de Colon, R. Moran10179 (ENCB); cliffs 7.7mi NE de Cadereyta, S of San Javier,municipio de Cadereyta, C.H. Uhl 1853 (MEXU). Crece sobreriscos casi verticales, en matorral xerófilo. Alt. 1600-2200 m.florecen durante la mayor parte del ano, principalmente denoviembre-mayo.

P.werdermannii

Tamaulipas: Tipo: Valle de Jaumave, al lado de una montañaentre cactus y arbustos bajos, cerca de 600-700 m, 1933. Prof. E.Werdermann

Fuente: Purpus (1919); Von Poellnitz, (1937); Werdermann (1937) Walther (1936,1937) Moran 1963,

1965, 1967a, 1967b, 1968b, 1968c, 1971, 1989, 1990, 1991 a, 1991 b, 1992); Meyrán (1963); Kimnach

y Moran (1993); García et al (1999, 2002); Pérez-Calix et Glass (1999). Tambien se revisaron

ejemplares del género Pachyphytum en los Herbarios CIMI del CIIDIR-IPN Michoacan y del IEB del

Instituto de Ecología, A.C., en Pátzcuaro, Michoacán.

60

Se reconoce que teóricamente, las clasificaciones son el marco histórico para

interpretar los patrones de similitudes, interacciones ecológicas y su distribución

geográfica entre taxa como lo mencionan Brooks (1981); Cracaft (1983); Eldredge y

Cracaft (1980); Farris (1979), y que la eficaz sistemática será mayor si el carácter

utilizado no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, el uso directo

del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales para una

clasificación (Crawford 1990; Clegg y Durbin 1990). Es considerado “marcador”

(biológico) cualquier característica heredable que nos permita estudiar la diversidad

biológica (Avise 1994). Hasta hace unos cuantos años la mayoría de los

“marcadores” que se utilizaban, eran marcadores morfológicos (fenotípicos), en la

actualidad con el advenimiento de las técnicas de estudio de material genético

(ADN), la tendencia actual es el estudio de la diversidad y variabilidad del material

genético (marcadores moleculares), mismo y no de su expresión fenotípica (Avise

1994).

Los marcadores moleculares pueden ser: las secuencias de ADN y el análisis

de su polimorfismo; con respecto a ésta última, una de las técnicas más recientes es

la del polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), la cual es

una combinación de RFLP con PCR (Vos et al., 1997), usada entre otros, para

resolver problemas de variación de especies cercanamente relacionadas, que ha

sido difícil de resolver con datos morfológicos (Heun et al., 1997; Rusell et al; 1997).

Actualmente la clasificación taxonómica presenta el problema de ubicar varios

taxa con características intermedias dentro de alguno de los diferentes niveles

taxonómicos (Bremer et al., 1998), considerando a las “especies problema”, como un

desacierto de los biólogos al no acordar con exactitud sobre la identificación de las

especies, actualmente se estima conveniente tomar en cuenta aspectos filogenéticos

dentro de la clasificación (O’Hara 1993; Hey 2001).

Se toma como modelo de estudio al género Pachyphytum, ya que dentro del

conocimiento actual del grupo, los taxa: P. machucae I. García, Glass et Cházaro; P.

61

brevifolium Rose, P. garciae Pérez-Calix et Glass, (Pérez-Calix y Glass 1999.) y P.

rzedowskii I. García, Pérez-Calix et Meyrán (García et al., 2002) es difícil asignarles

un lugar apropiado en el esquema tradicional clasificatorio dentro de alguna de las

tres secciones del género Pachyphytum (García et al, 1999, 2002; Pérez-Calix et

Glass, 1999). Adicionalmente una especie cuyo reporte actualmente se encuentra en

“prensa” (P. contrerassi), por sus características morfológicas se ubica en una

situación taxonómica similar que P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P

rzedowskii; por lo que se considera necesario determinar las relaciones genéticas

interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su

polimorfismo genético con marcadores AFLP.

62

III MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Material biológico

Para determinar las relaciones genéticas y sistemáticas del género

Pachyphytum fueron colectadas las 17 especies que conforman este grupo, de las

cuales existen ejemplares de respaldo en un herbario que corroboran su existencia.

Algunos de estos materiales fueron obtenidos de localidades tipo (lugar donde

se desarrollan las especies de plantas descritas originalmente) en diversos estados

de la republica, como Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Guanajuato, Hidalgo,

Aguascalientes, Michoacán y Jalisco (fig. 2).

Con respecto a las especies testigo se consideraron miembros de distintos

grupos relacionados con el género en estudio (Qiu-Yun et al., 1996); y relacionados

con la familia Crassulaceae, (Mort et al., 2001); de tal manera que representen a

grupos específicos de linajes adoptivos asociados a la sección (Starr et al., 1999;

Hansen et al., 1999; Virk et al., 1998; Schmidt y Jensen 2000; van Ham et al., 1994;

van Ham y ‘t Hart 1998).

Las especies testigo de la misma familia botánica que fueron seleccionadas

por encontrarse muy relacionadas fueron: Graptopetalum pachyphyllum, G.

amethystinum, Sedum corynephyllum y Echeveria fulgens, y como grupo externo se

utilizó Bursera glabrifolia de la familia Burseraceae (cuadro 2).

El material usado se colectó directamente de campo y se acondicionó en

invernadero mediante el transplante en macetas rígidas con un sustrato de arena, jal

y tierra negra en igual proporción, manteniéndose a 30°C de temperatura, con una

humedad relativa de 80%, y riego con agua corriente cada 5-7 días. Aunque por

seguridad, también se mantuvo hasta su utilización, tejido fresco de las especies en

ultracongelador (REVCO) a -70°C.

63

Figura 2. Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum, en México.

a) P. bracteosum Klotzsch. Estado de Hidalgob) P. brevifolium Rose Estado de Guanajuatoc) P. longifolium Rose Estado de Hidalgod) P. compactum Rose Estado de Querétaroe) P. oviferum C. A. Purpus Estado de San Luis Potosíf) P. hookeri (Salm-Dyck) Berger Estado de San Luis Potosíg) P. viride E. Walter Estado de Querétaroh) P. werdermanniV. Poellnitz Estado de Tamaulipasi) P. coeruteum Meyrán Estado de Quérétaroj) P. glutínicaule Moran Estados de Hidalgo y Querétarok) P. kimnachi Moran Estado de San Luis Potosí1) P. fittkaui Moran Estado de Guanajuatom) P. caesium Kimnach y Moran Estado de Aguascalientesn) P. machucae 1. García, Glass et Cházaro Estado de Michoacáno) P. garciae Pérez-Calix et Glass Estado de Querétarop) P. rzedowskii 1. García, Pérez-Calix et Meyrán Estado de Michoacánq) P. contrerassi Pérez-Calix, 1. García et Cházaro (en prensa) Estado de Jalisco

64

Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado

TAXAORIGEN, LOCALIDAD, COLECTOR, NÚMERO, COLECCIÓN

Pachyphytum bracteosum Klotzsch Cultivado de San Juan Meztitlán, Hidalgo; I. García y S.

García 5684 (CIMI, IEB)P. brevifollum Rose

Cultivado del municipio de Guanajuato, Gto. E. Pérez y C. Glass

P. caeslum Kimnach y Moran Cultivado de localidad Tipo, Aguascalientes; I. García

5570 (CIMA; cultivado S/N de C. GlassP. coeruleum Meyrán Material Tipo, sin localidad conocida. Cultivado del Sr. Yoshida; J.

Meyrán 523, (MEXU52609)P. compactum Rose

Cultivado del Cerro Zamorano, Querétaro; E. Pérez y E. Carranza

P. contrerassl Pérez-Calix, 1. García et Cházaro Cultivado de localidad Tipo; Barranca al N. de Guadalajara, Jalisco;

P. fittkaui MoranCultivado del municipio de Victoria, Guanajuato ; E. Pérez y E.

Carranza 2901 (IEB)P. garclae Pérez-Calix et Glass Cultivado de localidad Tipo. Querétaro; E. Pérez y S. Zamudio

3574 (IEB); 1. García 5571 (CIMI)

P . glutinicaule Moran Cultivado Del Río Extórax, Querétaro; E. Pérez y S. Zamudio S/N,

P. hookeri (Salm-Dyck) BergerCultivado de localidad Tipo. Guanajuato; C. Glass S/N; Municipio

P. kimnachl MoranCultivado de localidad Tipo, Cerro agujón, San Luis Potosí; L

García y G. Hernández 5693 (CIMI, IEB)P. longifolium RoseCultivado del Oeste de Meztitlán, Hidalgo; 1. García y S.

García 5686 (CIMI, IEB)P. machucae I. García, Glass et Cházaro

Cultivado de localidad Tipo, Pajacuarán, Michoacán; García 4497

P. oviferum C.A. Purpus Cultivado de C. Glass, localidad Tipo San Luis Potosí; l. García

5573, 5686-C (CIMI)P. rzedowskll 1. García, Pérez-Calix et Meyrán

Cultivado del municipio Tuxpan, Michoacán, I García et al

5574,5686, 5690 (CIMI, IEB)

P. viride E. WaltherCultivado del Cerro de la Tembladera Querétaro; Col. E. Pérez y S.

Zamudio 2748 (lEB); L García 5125-bis (CIMI)P. werdermannü v. Poellnitz Cultivado del Valle de Jaumave, Tamaulipas; De J. Gpe. Martínez

SIN.; 1. García 5686-D (CIMI)Graptopetalum pachyphyllum Rose

Cultivado de Querétaro; De J. Meyrán S/N

Graptopetalum amethystinum (Rose) E. Walth.Cultivado de La Sierra de Bolaños, Jalisco; C. Glass S/N

Sedum corynephyllum (Rose) Fróderstróm Cultivado de Aprox. 8 km al E del Cerro Agujón, San Luis Potosí; I.

García y G. Hernández SINEcheverla fulgens Lemaire Cultivado del Cerro Prieto, Nuevo Parangaricutíro, Michoacán; I

García et al 4532 (CIMI, IEB, MICH)Bursera glabrifolla (H. B. K.) Engl.

Cultivado del NE de Jungapeo, Mich.; 1. García S /N

65

3.2 Extracción de ADN .

Para la extracción del ADN se usó el método denominado del “bromuro de

cetil metilamonio” (CTAB) (Doyle y Doyle, 1987, 1990), el cual consiste en: triturar el

tejido vegetal con nitrógeno líquido para minimizar la degradación del ADN. El hielo

formado sirve de abrasivo, el polvo se extrae con el detergente catiónico CTAB, que

solubiliza membranas y desplaza cationes unidos al ADN. El material se tomó

directamente de tejido foliar fresco de plantas cultivadas en invernadero, aunque

también se mantuvo por seguridad material en refrigeración a -70°C, hasta su

utilización. Se molieron dos gramos de tejido fresco en nitrógeno líquido sobre un

mortero y con ayuda de un pistilo hasta obtener un polvo fino; posteriormente el

polvo se mezcló en un tubo de vidrio con 7.5 ml de solución amortiguadora de

extracción [(CTAB 3% (p/v) sigma, NaCI 1.4 M, 2-Mercaptoetanol al 0.1 % (v/v),

EDTA 50 mM, Tris-HCI 100mM, 1 % (p/v) de poi ivinilpirrolidona P.M. 40000, pH 8.0)],

precalentada a 60 °C luego se incubó durante 30-40 min., a 60 °C, agitando por

inversión suave cada 10 min., y enseguida se dejó enfriar (Doyle y Doyle, 1987,

1990).

Posteriormente, se realizó una extracción de los ácidos nucleicos con un

volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1, v/v); se agitó vigorosamente y luego

el homogenizado se centrifugó a 4 °C a 12000 rpm durante 10 minutos; el

sobrenadante fue transferido a otro tubo limpio y el ADN fue precipitado con la

adición de 1 ml de isopropanol y 0.5 vol. de acetato de amonio 7.0 M (0.1 vol. De

acetato de sodio 3.0 M. pH 5.2), seguido por la incubación en hielo hasta la

formación de hebras (Doyle y Doyle, 1987, 1990).

3.3 Purificación del ADN

Las hebras del ADN observadas en las extracciones con el CTAB fueron

colectadas con un gancho de vidrio y se transfirieron a un tubo eppendorf de 1.5 ml.

Estas fueron lavadas con 500p.1 de una solución de etanol al 70% y 10mM de acetato

66

de amonio y luego fueron disueltas en 300µl de solución TE (50mM HCI, 10 mM

EDTA). El ARN fue eliminado con adición de 3µ l de RNAsa a (10mg/ml) e incubados

a 37°C por 60 minutos. Después se le adicionó un volumen igual de la solución fenol-

cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 v/v); se agitó vigorosamente con la mano y

luego fue centrifugado a 12,000 r.p.m. durante 10 minutos, a 4°C. El sobrenadante

fue transferido a un tubo eppendorf nuevo y el ADN fue precipitado con la adición de

0.1 volumen de acetato de sodio 3.0M pH 5.2 y 0.6. volumen de isopropanol. Las

hebras del ADN fueron compactadas por centrifugación y el sobrenadante eliminado

por decantación. La pastilla del ADN fue lavada en dos ocasiones con etanol al 70%.

Una vez seco se resuspendió en 300µl de. TE [Tris-HCI 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0],

(Doyle y Doyle 1990; Dellaporta et al., 1983; Lefort y Douglas 1999). El ADN se

guardó en TE a 4°C durante varias semanas.

3.4 Cuantificación del ADN

La concentración de ADN obtenido se calculó por ta medición de la

absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro (Spectronic 21 VM Spectrofotometer

Bauch & Lamb); la pureza respecto a proteínas y polifenoles se determinó por la

relación de absorbancia entre260/280 nm (A260/A280) y 260/ 230 (A260/A230)

respectivamente (Labarca y Paigen 1980; Dabo et al., 1993). Para ello 3µ l de

extracto de ADN fueron disueltos en 600µ l de solución TE (10mM Tris HCI pH 8.0, 1

mM EDTA pH 8.0) y transferidos a una celda de cuarzo de 700µl, para obtener la

absorbancia de la solución. Enseguida con este valor se determinó la concentración

© del extracto de ADN, utilizando la fórmula:

C (µg/ml) = (Ab 260/0.020) F

Ab 260= es la lectura de absorbancia a 269 nm.

C= concentración de ADN en microgramos por mililitro.

67

Donde:

F es el factor de dilución F= Volumen total / Volumen de la muestra

La calidad del ADN fue analizada en muestras por duplicado, sobre la base de

la integridad y a la respuesta a enzimas de restricción y ala amplificación al azar por

la PCR.

3.5 Integridad del ADN

La integridad del ADN purificado, fue analizada por electroforésis sobre un gel

de agarosa de 0.5 cm de grosor al 0.8% (p/v) en el amortiguador de corrida TAE 1X

(40 mM Tris HCI, 10 mM EDTA pH 8.o, 20mM ácido acético glacial). Un volumen de

1µ l de la solución de ADN se mezcló con 2.5µ l de solución amortiguadora TAE 1X y

con 2.5µ l de amortiguador de carga “blue juice” 10X (65% p/v sucrosa, 10 mM Tris

HCI pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.3% p/v de azul de bromofenol). Posteriormente, la

dilución fue colocada en los pozos del gel de agarosa con ayuda de micropipetas.

También se colocaron en los pozos de los extremos laterales 3µ l del marcador de

peso molecular 1 Kb plus (de la empresa Gibco). El gel se corrió durante 10 minutos

a 100mA, posteriormente alrededor de 90 minutos a 85 mA, en una cámara de

electroforésis horizontal conteniendo el TAE 1X. Una vez terminada la corrida

electroforética, el gel se tiñó en una solución de 0.5µ l/ml de bromuro de etidio en

agua de acuerdo a Lucey et al., (1997). Se agitó suavemente por aproximadamente 5

minutos y luego se enjuagó con agua destilada por 15 minutos. Enseguida el gel fue

examinado en el transiluminador de luz ultravioleta para visualizar las bandas de

ADN y captar la imagen, con el sistema de análisis de imágenes Eagle EyeTM II,

(Stratagene), para su posterior edición e impresión.

68

3.6 Análisis AFLP del ADN

La técnica AFLP, constó de tres pasos principales: a) el ADN genómico fue

cortado con endonucleasas de restricción (Eco RI y Msel) (adquiridas por el

Cinvestav-Irapuato) y ligado a adaptadores específicos (Eco RI y Msel), b)

amplificación por PCR de los fragmentos cortados y c) el análisis de los fragmentos

amplificados en geles de poliacrilamida por medio de radioisótopos (Vos et al., 1995).

(Esta técnica se desarrolló en el laboratorio de genética (L-6) del Cinvestav-Irapuato).

3.7 Restricción del ADN

0.5 ng de ADN fueron mezclados con 5p.l de solución amortiguadora RL 10X

[Tris-HCI 10mM, acetato de magnesio 10mM, acetato de potasio 50mM DTT pH 7.5]

1µ l de endonucleasa EcoR1 de 10U/µ l (Boehringer) y 1µ l de la enzima Msel (se usó

el isosquisómero Tru91) a 4U/µ l (Biolabs). La mezcla se aforó a 50µ l con agua

desionizada estéril, se agitó por inversión y se incubó 4 horas a 37°C. Posteriormente

las enzimas se desactivaron sometiendo la mezcla a 70°C por 15 minutos, después

de lo cual los tubos se colocaron en hielo (Vos et al., 1995, Simpson et al., 1999).

3.8 Ligación de los adaptadores

Los iniciadores y adaptadores utilizados fueron sintetizados en el laboratorio

de Química de ADN del CINVESTAV, Unidad Irapuato, la secuencia de los

adaptadores fue la siguiente:

Adaptador EcoRl: 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ 3’- CTGACGCATGGTTAA-5’

Adaptador Msel: 5’-GACGATGAGTCCTGAG –3’ 3’- TACTCAGGACTCAT-5’

A los tubos conteniendo ADN digerido se les agregó la mezcla de ligación

compuesta por 1µ l del adaptador EcoR1 de 10U/µ l, 1µ l del adaptador Mse1 de

69

1 OU/µ l, 1.2 µ l de ATP 1 0mM pH 7, 1µ l de amortiguador RL 1 0X, 1 µl de ligasa T4 de

ADN 1U/µ l y 4.8µ l de agua desionizada estéril. La mezcla se incubó toda la noche a

15°C, y después los productos se guardaron a -20°C hasta su utilización en la

primera amplificación (Vos et al., 1995; Simpson et al., 1999).

3.9 Primera amplificación

Después de varias pruebas, y en función de la cantidad de ADN presente en

cada muestra, el producto ligado se diluyó 1:15 ( muestras 1-13), y 1:5 ( muestras

14-22), y se tomaron 5µ l, los cuales se colocaron en tubos eppendorf de 0.5 ml,

mismos que se les adicionó 2.5µ l de la mezcla 1 de iniciadores, compuesta por 1.5µ l

de EcoR1+1, y 1.5µ l de Mse1+1, 2µ l dNTPs (10mM) en 20µ l de agua desionizada;

asimismo se adicionaron 2µ l de la mezcla 2 compuesta por 0.2µ l Taq polymerasa,

5µ l del amortiguador PCR .10X, (contenido) en 14.8µ l de agua desionizada.

Posteriormente la mezcla contenida en el tubo fue agitada por inversión, luego se

sometió a la reacción de amplificación en un termociclador Pelkin Elmer 9600, por 30

segundos a 94°C de desnaturalización, 60 segundos a 56°C de empalme o

acoplamiento y 60 segundos a 72°C de polimerización, por 20 ciclos. Los productos

obtenidos se almacenaron a 4°C hasta la utilización en la segunda amplificación (Vos

et al., 1995, Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).

3.10 Marcaje y selección de los iniciadores

El iniciador que se marcó radioactivamente fue el EcoR1 +3. El marcaje se

realizó con la siguiente mezcla: 1µ l de 32P (gama-ATP, 750 Ci/mmol), 2.5µl del oligo

EcoR1 +AGG, 0.5µ l de Kinasa T4 (10U/µ l), 2p.l de amortiguador-T4 Kinasa 5X, y se

agregaron 4 µ l de agua desionizada estéril, después esta reacción se incubó una

hora a 37°C, transcurrido este tiempo la enzima T4 Kinasa se inactivó al haberla

sometido a 65°C durante 10 minutos (Simpson et al., 1999). Se probaron dos

70

combinaciones de iniciadores para la primera amplificación, de las cuales se

seleccionaron: EcoRI+A y Msel+A

3.11 Segunda amplificación

Los iniciadores utilizados para la segunda amplificación fueron:

EcoRl+3 5-GACTGCGTACCAATTC/AGG-3’

Msel+3 5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ATC-3’ 5’-GATGAGTCCTGAGTAAIACC-3’ 5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ACA-3’ 5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ACG-3’ 5’-GATGAGTCCTGAGTAA/AAA-3’

En un tubo de PCR se colocaron 5µ l directamente de cada muestra de la

primera amplificación, al cual se adicionaron 5.0µ l de la mezcla 1 [0.5µ l 32P EcoR1+3

(10ng/µ l), 0.6µ l del oligo Mse1+3 (50ng/µ l), 0.4µ l de dNTPs (10mM), 3.5µ l de agua

desionizada estéril], también se adicionaron 10µ l de la mezcla 2 (2.0µ l de

amortiguador de PCR 10X, 0.2µ l de taq polimerasa (Boehringer) y 7.8µ l de agua

desionizada estéril). Posteriormente el tubo se agitó por inversión y se colocó en el

termociclador, y se corrió 1 ciclo a 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 30

segundos de empalme a 65°C y 60 segundos de polimerización a 72°C, seguido de

otros 24 ciclos a las mismas condiciones, excepto la temperatura de empalme, que

fue descendiendo 0.7°C durante los primeros 11 ciclos, hasta llegar a 56°C (Vos et

al., 1995, Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).

Para la segunda amplificación se seleccionaron cinco combinaciones de

oligonucleótidos para la evaluación final -(AGG/ATC, AGG/ACC, AGG/ACA,

AGG/ACG, y AGG/AAA). Dicha selección se realizó con base al número de bandas

polimórficas producidas.

71

3.12 Separación de productos de amplificación

La solución para preparar los geles de acrilamida al 6% se realizó a partir de

150 ml de una solución base de acrilamida al 40% [ la cual se preparó utilizando 380

gr de acrilamida Gibco, 20 gr de bisacrilamida (Gibco), seguida de una desionización

con 2% de resina AG501-X8 de bio-radpor durante una hora a temperatura ambiente,

después se filtró la solución con membrana de 1.2 mM millipore y se aforó a un litro

con agua desionizada estéril], 100 mi de solución TBE 10X (Tris base 1 M, ácido

bórico 1 M, EDTA 20mM), finalmente se adicionaron 700 ml de solución de urea 8 M

ajustándose a un volumen de un litro con agua desionizada estéril. La separación de

los fragmentos amplificados se realizó en geles de 35X45 cm, para la preparación del

gel se tomó de la solución de acrilamida al 6%, a la cual se le adicionó 360µ l de

persulfato de amonio al 10% y 36 µ l de TEMED. Las cámaras de electroforesis que

se utilizaron fueron las de secuencia de Bio-Rad 3000, el gel se precorrió con

amortiguador TBE 0.5X durante 30 minutos a 2000 volts (Dowiing et al., 1996;

Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).

Se tomó una alícuota de 3µ l del ADN amplificado y se colocó en un tubo

Eppendorf, al cual se le adicionaron 3µ l de amortiguador de carga (formamida 955,

azul de bromofenol 0.05%, Xilen-cianol 0.05%, EDTA 10 mM). Después se colocó en

un agitador durante 3 minutos a 95°C para desnaturalizar el ADN; se enfrió

rápidamente, colocando los tubos en hielo. Posteriormente, se tomó una alícuota de

4 µ l de dicha mezcla y se cargaron en el gel, incluyendo el marcador de peso

molecular en escalera de 123 pares de bases (Dowling et al., 1996). El gel se corrió

a 2000 volts durante 3 horas. Después de terminada la electroforésis, se retiró el gel

de la cámara, poniéndose los cristales sobre la mesa y con ayuda de una espátula,

éstos se separan. Posteriormente, sobre el gel se colocó una hoja de papel whatman

de 3 mm cortado a la medida, se levantó el papel con el gel adherido, en seguida el

papel se clocó sobre la mesa y se cubrió con papel celofán, luego se puso a secar

en un secador de geles. Posteriormente el gel se fijó con cinta adhesiva al cassete

de exposición y esta se cubrió con la película BioMax de 35X43 cm de Kodak (Lin y

72

Kuo 1996, Simpson et al., 1999), finalmente el cassete se colocó en un refrigerador

Revco a -80°C durante un promedio de 24 horas. Finalmente, se realizó el revelado

dentro del cuarto obscuro, retirando la película (autorradiograma) del cassete que la

contenía, el revelado es inmediato de similar forma que las películas instantáneas de

Kodak.

3.13 Análisis de datos

3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias

Los patrones de las bandas obtenidos con los diferentes iniciadores, se

examinaron visualmente en los autorradiogramas obtenidos de los geles de

acrilamida. Para generar una tabla de contingencia, tales datos fueron registrados

como variables discretas utilizando 1 para indicar la presencia y 0 para la ausencia

de las bandas en cada una de las especies, a partir de esta tabla de contingencia se

obtuvo el estimador de distancias genéticas utilizando el método de Skroch et al.,

(1992). Posteriormente de la interpretación ocular de presencia o ausencia (1 ó 0) de

bandas polimórficas de ADN en las autorradiografías producto del gel de acrilamida,

se elaboran las tablas de contingencia construyéndose con estos datos una matriz

de las medidas de similaridad genética de las unidades taxonómicas operacionales

(OTUs) por medio de un algoritmo.

3.13.2 Análisis del agrupamiento

A partir de los estimadores de las distancias genéticas (tabla de contingencia,

0/1), se elaboró una matriz con la cual se construyó el dendrograma. El análisis por

agrupamiento, se realizó con diferentes medidas de similaridad genética, esto con la

finalidad de comparar los diversos métodos, y detectar el que se ajustara mejor a las

condiciones “reales” de agrupamiento: A) Coeficiente de apareamiento simple

(Sneath y Sokal 1973; Sckroch et al., 1992) “Manhattan”, con base en sitios iguales

(0, 0 ó 1, 1) entre total de sitios. B) Nei y Li, “Nei” (Nei y Li 1979), que dice: “el doble

del número de bandas compartidas sobre el total de bandas” (en ambos individuos).

73

C) Jaccard, “binary” (Sneath y Sokal, 1973). Posteriormente se utilizaron diferentes

métodos de obtención de dendrograma: UPGMA (average ó promedio), Vecino

cercano (connected), y Vecino lejano (compact).

Con respecto al análisis de agrupamiento de las relaciones genéticas entre las

especies del género Pachyphytum, la disimilaridad genética se midió con los

diferentes métodos mencionados, seleccionándose por la claridad del gráfico, el del

coeficiente Nei y Li (“Nei”), el cual no toma en cuenta las lecturas (0,0); esto es,

cuando las bandas están ausentes en los individuos muestreados, y les da mayor

peso a las coincidencias (1,1). La obtención del dendrograma fue por medio del

método del vecino lejano “compact”, el cual mostró una distribución de las

agrupaciones mas clara que con los otros métodos. Se utilizaron los intervalos de

confianza de Felsenstein “bootstrap” (Felsenstein 1985), con 3000 repeticiones.

Todas las operaciones se realizaron utilizando el programa estadístico S-Plus 2000

(Everit 1994; Schumaker 2001).

74

IV RESULTADOS

La técnica empleada para la extracción del ADN (CTAB), permitió obtener

material suficiente y de considerable grado de pureza de las 17 especies en estudio,y las cinco del grupo testigo. Dos de las especies (Pachyphytum compactum, y P.caesium) presentaron dificultad para la extracción de dicho material genético, por locual fue necesario realizar adecuaciones a la técnica (fig. 3).

Figura 3. Electroforésis en gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especiesestudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de Pachyphytum;18-22 especies testigo. La marca de peso molecular 1 Kb plus (Gibco) a los costadosderecho e izquierdo.

75

4.1 Reacciones de la técnica AFLP

En el gel de electroforésis de acrilamida se presentó un patrón de bandeo muy

variable, siendo necesario realizar una revisión de la técnica en las reacciones

llevadas a cabo en la primera y segunda amplificación del ADN. En principio se

sospechó que se debió al uso de la Taq polimerasa de la marca Gibco. Por lo que se

procedió a realizar distintas pruebas, iniciando con la variación del amortiguador T4

(Exchange y Forward), y el uso de Taq polimerasa marca Roche y Gibco, así como

con una marca radioactiva (32P ℘ -ATP) más reciente; además de modificar el

producto de la primera amplificación en una proporción 1:30. Los resultados tuvieron

diferencias que favorecieron el patrón de bandeo con el uso de la Taq polimerasa

marca Roche y el amortiguador T4 forward. Esto pudiera ser efecto de mejores

condiciones con la mezcla dei material.en estudio.

Apreciando lo anterior, el número de bandas observadas en los geles de las

distintas combinaciones (AGG/ATC, AGG/ACC, AGG/ACA, AGG/ACG, y AGG/AAA),

presentaron un número considerable de bandas polimórficas, lo que se traduce en

mayor cantidad de información de cada especie, consecuentemente en mayor

probabilidad de obtener resultados confiables.

4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP

Es importante notar sobre el patrón de bandeo que manifestó la especie

Pachyphytum glutinicaule, fue legible desde los 50, hasta por arriba de los 525 pares

de bases en todas las combinaciones de iniciadores usadas, situación que no se

presentó en ninguna de las demás especies muestreadas. Podría esto deberse a que

los iniciadores usados permitieron mejor expresión en dicha muestra, o que el ADN

de dicha especie resultase de mejor calidad.

76

Se obtuvieron un total de 497 bandas distintas con las cinco combinaciones

usadas. De éstas resultaron legibles 406 bandas, siendo polimórficas 375, el 92.4 %

(cuadro 3).

Cuadro 3. Número de bandas obtenidas con el análisis de marcadores tipo AFLP, con cincocombinaciones de iniciadores de 17 especies de Pachyphytum.

COMBINACIÓN BANDAS TOTALESOBTENIDAS

BANDAS LEGIBLES

AGG/ATC 96 79AGG/ACC 103 91AGG/ACA 92 75AGG/ACG 103 81AGG/AAA 103 80

El número de bandas polimórficas por combinación de oligonucleótidos varió de 75 a

91, con un promedio de 81.2, mientras que la longitud de las bandas se manifestaron

entre los 75 y 525 pares de bases (pb) con respecto al peso molecular (Figura 4 y 5).

77

Figura 4. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo deespecies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo(18-22), obtenido a partir de latécnica AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas delcostado izquierdo señálan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.

78

Figura 5. Autorradiograma del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo deespecies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (18-22), obtenido a partir de la técnicaAFLP, con la combinación de iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de lasbandas monomórficas. La escala de la izquierda corresponde a las pares de bases (Pb) delmarcador de peso molecular usado (escalera 123 pb). La escala de la derecha indica lanumeración de las bandas legibles encontradas.

79

4.3 Relaciones genéticas interespecíficas

Una vez que se obtienen las autorradiografías con las diferentes

combinaciones, se interpretan las bandas polimórficas y se elaboró la tabla de

contingencias con los valores de presencia/ausencia (1, 0). Con esta tabla en el

programa Excel de Word, se exportó al programa S-plus 2000, en el cuál por medio

de un algoritmo, se obtuvo una matriz; a partir de la ésta se les asignó cierta función

del coeficiente de similaridad genética por medio de la cual se construyeron los

diferentes dendrogramas de las relaciones interespecíficas.

Se presentan los dendrogramas logrados por agrupamiento con las diferentes

coeficientes de similaridad genética (Nei y Li “Nei”; apareamiento simple “manhattan” y

Jaccard “ Binary”), así como por medio de tres métodos de obtención de los mismos

(UPGMA, método del promedio de grupo ó “average”; distancia mínima, ligamiento

simple o de conexión corrnected, ó tambien llamada del “vecino cercano” y distancia

máxima, ligamento completo, ó denominada compacto, compact ó “vecino lejano”),

(figs. 6-14).

80

Figura 6. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética "Manhattan" / average.La especie P. glutinicaule, queda fuera del grupo principal, junto con los grupos testigo.

Figura 7. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / compact.La especie testigo B. glabrifolia, separa en dos a las especies en estudio, lo cual no es factible.

Figura 8. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / connected.De nuevo, la especie P. glutinicaule se comporta junto con los grupos testigo.

81

Figura 9. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / average.Este grafico, agrupa de manera clara las especies testigo, no así con el grupo en estudio.

Figura 10. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / connected.Similar al anterior, en el grupo en estudio no se encuentran claros los agrupamientos formados.

Figura 11. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / compact. Gráficocon mayor representatividad, la separación entre el grupo en estudio y el testigo son más claras.

82

Figura 12. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / compact. Similar alanterior, se agrupan más claramente las especies en estudio, mejora la interpretación de susrelaciones.

Figura 13. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / connected.Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del grupo en estudio.

Figura 14. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / average.Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las especies del género Pachyphytum.

83

De acuerdo con la topología y el desarrollo de los diversos dendrogramas, se

considera que el agrupamiento obtenido con el coeficiente de Nei y Li “Nei” con el

método “compact” (fig. 12), brinda la información más adecuada sobre las dos

principales asociaciones entre las especies del género Pachyphytum, lo que permite

corroborar la hipótesis planteada inicialmente respecto a la modificación de la

clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel sección, si

se agrupan con relación a su polimorfismo genético.

Los resultados obtenidos con el remuestreo bootstrap (3000 repeticiones)

respecto, a las relaciones genéticas en el dendrograma, realizado mediante el

método de agrupamiento con el coeficiente “Nei” y por medio del análisis del vecino

lejano (compact), indican que la topología del árbol obtenida no varió con respecto a

la mostrada originalmente, lo cual confirma que entre las especies del género

Pachyphytum, se forman dos agrupaciones principales; los valores en los nodos

indican sus respectivos niveles de confianza (fig. 15).

El análisis del dendrograma obtenido (fig. 15), muestra que a un nivel de 46%

de disimilaridad (ó 54% de similaridad) aproximadamente, se forman dos principales

agrupaciones: (A), formado con Pachyphytum glutinicaule, agrupado con P.

longifolium, P. bracteosum P. brevifolium, P. oviferum, y P. hookeri. El segundo B),

más numeroso incluye al resto de las especies del género, con P. machucae, P.

garciae, P. viride, P. werdermannü, P. coeruleum, P. caesium , y P. rzedowskii, P.

contrerassi, P. compactum, P. kimnachi, P. fittkaui.

84

Figura 15. Dendrograma obtenido por medio de “Nei” y compact con un bootstrap de 3000repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos de intersección con la líneapunteada a un nivel de disimilaridad de 0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B)logrados, los números en los nodos significan los valores de confianza en cada agrupación.Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies problema” de ubicar dentro dealguna sección del género Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremossuperior e inferior.

85

En la primera agrupación (A), se ubican seis especies; formando tres

subagrupaciones principales, una sólo incluye a Pachyphytum glutinicaule, que se

une a otro subgrupo a un 60% de similaridad, y un coeficiente del 17% de confianza;

este subgrupo está conformado a su vez por Pachyphytum longifolium unido a un

71 % de similaridad y un 99% de confianza con un par de especies conformadas por P.

bracteosum y P. brevifollum las cuales se agrupan a un 82% de similaridad y con

un intervalo de confianza de 86%; estas últimas tres especies unen a un 65% de

similaridad con otras dos y con un 42% de confianza, estas son P. oviferum y P.

hookeri unidas entre si a 68% de similaridad con un 19% de confianza.

La segunda agrupación (B), incluye al resto de las especies (11); y lo

conforman cuatro principales subgrupos; el primero constituido por Pachyphytum

machucae unido a P. garciae a un 77% de similaridad con un 81 % de confianza, las

que a su vez se agrupan a un 58% de similaridad y un 45°lo de confianza con la

segunda subagrupación: P. viride y P. werdermannii unidas a un 74% de similaridad

y con un 81 % de confianza; estas se unen una agrupación a un 63% de similaridad

con una confianza de un 8%, dicha agrupación se subdivide para formar el tercer

grupo conformado por P. coeruleum unida a un 67% de similaridad y un 46% de

confianza Con P. caesium y P. rzedowskii las cuales están agrupadas a un 68% de

similaridad y una confianza de 98%; éstas se unen al cuarto subgrupo a un 64% de

similaridad y con un 8% de confianza. Las especies de este cuarto subgrupo lo

conforman P. contrerassi unido con P. compactum a un 68% de similaridad y una

confianza de 31 %, así como a P. kimnachi y P. fittkaui las cuales están unidas entre

si a un 82% de similaridad y con un 100% de confianza.

86

V DISCUSIÓN

5.1 Uso de la técnica AFLP

Se considera necesario incorporar nuevos tipos de datos, en particular los

moleculares, donde los caracteres morfológicos no han resuelto los problemas

taxonómicos (González 1997). Como se ha mencionado desde la aparición de la

técnica AFLP en 1995 (Vos et al), reportes de datos publicados en varios artículos

han demostrado su eficiencia para la caracterización de germoplasma, estudios

filogenéticos en diferentes organismos incluyendo plantas, bacterias, hongos; así

como en estudios de caracterización de poblaciones genéticas y para el mapeo de

diferentes especies de interés económico (Lin y Kuo 1996; Majer et al., 1996; Becker

et al., 1995; Cervera et al., 1996a). Además de que ha sido rápidamente adoptada

por grupos que trabajan campos del mapeo molecular y filogenias (Simpson 1997b).

Acorde con lo anotado por Soltis y Soltis (2000a), los árboles filogenéticos

brindan las bases críticas, no solo para estudios sistemáticos, sino también para

investigaciones en evolución molecular y genética comparativa. Las hipótesis sobre

sus relaciones ya sea basada en datos moleculares (incluyendo DNA, datos de

secuencias, cambios estructurales y pérdidas de gen/intron), morfología y otros

caracteres relacionados con el DNA, o una combinación de caracteres, proveen de

una red muy útil de comparación evolutiva.

La gran utilidad de marcadores moleculares surge de seis propiedades inherentes

que las distinguen de los marcadores morfólógicós (Powell et al., 1996).

• El fenotipo de la mayoría de los marcadores morfológicos pueden ser

determinados en todos los niveles de plantas, por lo que pueden ser hallados

en loci moleculares de tejidos y niveles celulares.

• La frecuencia de alelos tiende a ser mayor en loci moleculares comparados

marcadores morfológicos.

87

• Adicionalmente los mutantes morfológicos tienden a asociarse con efectos

fenotípicos no deseables.

• Los alelos en loci morfológicos interactúan de manera dominante- recesivo que

limita la identificación de genotipos heterogocigotos.

• Los loci moleculares exhiben una forma de herencia codominante que permite

la identificación genotípica de individuos en una población segregada.

• Pocos efectos epistáticos o pleiotrópicos se observan con marcadores

moleculares como con marcadores morfológicos, por esto un gran número de

marcadores polimórficos pueden generarse y monitorearse de un cruzamiento.

Por lo que se demuestra que los AFLP brindan una técnica diferente, la cual

muestra gran potencial para el uso e investigación del genoma (Poweil et al., 1996).

Con respecto a la comparación de la información obtenida con los AFLP y otras

técnicas referentes al estudio del análisis de diversidad y filogenia (Sharma et al.,

1996), concluyen que los AFLP detectaron mayor nivel de polimorfismo que con los

RAPDs. Ya que el nivel de variación detectado con los análisis AFLP indican que

esta es una mayor y mejor tecnología en la construcción de mapas de linajes

genéticos. Al respecto Simpson (19972) menciona que los AFLP son marcadores

multilocus, los cuales brindan una amplia información del genoma de diferentes

individuos. Asimismo menciona que la principal ventaja radica en el análisis de

muchos loci de manera simultánea de la totalidad del genoma, registrando

rápidamente un gran número de marcadores (Simpson 1997b).

El uso de marcadores moleculares presenta ventajas y desventajas, de manera

general se puede mencionar que todas las técnicas basadas en el análisis del ADN

son caras comparativamente con las isoenzimas o marcadores morfológicos, sin

embargo la cantidad de información obtenida compensa este factor (Simpson

1997b). El uso de los RAPDs y DAFs no ocupan del uso de radiactividad y son

relativamente más baratos, sin embargo estos sistemas de marcadores han sido

criticados por la ausencia de reproducibilidad. La técnica AFLP incluye el uso de

88

radiactividad, pero actualmente se ha empezado a hacer uso de la etiquetación por

medio de fluorescencia (Simpson 1997b). Por lo que puede considerarse que la

integración de métodos de marcadores moleculares es esencial para el análisis y

caracterización de genoma en distintos grupos de interés.

Comparativamente con el método normal de RFLP, pruebas específicas son

usadas en una reacción de hibridación en orden para detectar secuencias homólogas

a la prueba entre cientos de fragmentos producidos cuando el ADN es objetó de

digestión con una enzima de restricción (Simpson 1997b). Los polimorfismos ocurren

cuando las mutaciones afectan la posición de un sitio en una enzima de restricción

de un individuo al ser comparado con otro. Los fragmentos de restricción resultantes

podrían ser de diferentes tamaños y bandas migrantes diferenciadas durante la

electroforésis podría observarse siguiendo al análisis de hibridación. En el caso de

los AFLP una selección o grupo de fragmentos de restricción del genoma digerido,

mismo que puede ser fácilmente obtenido y analizado (Simpson 1997ª).

La existencia de variación en los patrones de bandeo resultantes del gel de

acrilamida con las diferentes combinaciones usadas en el presente estudio,

permitieron la revisión de cada paso en la primera y segunda amplificación de la

técnica AFLP (Vos et al., 1995; Simpson 19971), considerándose importante la

proporción de ADN de la primera amplificación (1:30), así como una marca

radioactiva más reciente. Con el uso de estas estrategias se obtuvo una mejor

resolución en el patrón de bandeo obtenido. Una alternativa al uso de la marca

radioactiva, es la detección mediante la quimioluminiscencia o la fluorescencia (Lin et

al., 1997; Vaillancourt et al., 1992; Huang y Sun 1999).

Durante la segunda amplificación realizada (de la técnica AFLP) se seleccionaron

cinco combinaciones de oligonucleótidos para la evaluación final (AGG/ATC,

AGG/ACC, AGG/ACA, AGG/ACG, y AGG/AAA), mismas que permitieron la

obtención de un numero adecuado de bandas legibles así como una proporción de

bandas polimórficas para su análisis. Es .probable que con un mayor número de

89

combinaciones, el número de bandas proporcionalmente se incremente, mejorando o

haciendo más confiables los resultados, como ha sido estimado en otros trabajos por

Yee y colaboradores (1999). El hecho de realizar el análisis con un número reducido

de iniciadores podría ser considerado como una limitante; sin embargo es también

probable que los resultados finales obtenidos (matriz y dendrograma) no se vean

alterados. Esto sólo podrá probarse en la práctica con la realización de una mayor

cantidad de combinaciones de iniciadores, además del uso de diferentes métodos de

agrupamiento y por medio de diversos programas estadísticos de cómputo para su

interpretación como el PHYLIP, PAUP o el MaCClade entre otros (Backeljau et al.,

1996).

5.2 Polimorfismo del ADN

Como se observó el análisis AFLP de las distintas especies del género

Pachyphytum nos arrojó un total de 497 bandas, de las cuales resultaron legibles 406

de estas. Para esto se llevaron a cabo cinco combinaciones de iniciadores selectivos

E+3/M+3: EcoRI+ATC, EcoRI+ACC, EcoRI+ACA, EcoRI+ACG y EcoRI+AAA

(Cuadro 3). El promedio de bandas polimórficas fue de 92.4%. Comparativamente

mayor que otros análisis AFLP de estudios similares (Mace et al., 1999a; Lecerteau y

Szmidt 1999; Yee et al., 1999; Teulat et al., 2000), por lo que resulta alto el valor

obtenido, e indica la proporción de loci polimórficos, así, el significado de

heterogeneidad por locus, brinda una manera de medir la diversidad genética dentro

de especies; como es anotado por Sharma y colaboradores (1996).

El dendrograma obtenido por el método del vecino lejano “compact” fue el que

se mostró mejor desarrollado, sin embargo como lo anota Koopman y colaboradores

(2001), al menos parte de las bandas representan marcadores codominantes que

tienen tres estados de carácter 0/0, 1/0, 1/1, lo cual puede incluir homoplasias en el

juego de datos y posiblemente divida a un árbol con topologías erróneas en el

análisis cladístico. Asimismo, dichos autores consideran que los análisis fenéticos y

cladísticos realizados en Lactuca, en casos de topologías idénticas, las homoplasias

90

son menores, lo que no afecta a las conclusiones de las relaciones entre las

especies; inclusive cuando las homoplasias son mayores por diferencias entre los

análisis, las interrelaciones no se afectan a pesar de las objeciones teóricas. Este

tipo de análisis de agrupamiento también fue usado por Xu, et al (2000), con éxito

para caracterizar cultivos de Vigna angularis entre poblaciones y entre individuos.

Se considera que el método ó coeficiente (Nei y Li), sobrestima (no toma en

cuenta los casos 0,1), la disimilaridad entre individuos sobre todo en situaciones de

especies de la misma población o individuos de la misma especie (Everit, 1993);

acorde con el primer punto; sin embargo se piensa que con respecto al segundo, no

fue el caso del presente' trabajo, ya que se emplearon distintas especies de

diferentes poblaciones.

La toponimia, o forma general en que se presentaron las agrupaciones en el

árbol por medio del coeficiente de Nei y Li “Nei” y el de Jaccard “Binary”, a través

del método “compact”, están muy relacionados, coincidiendo con lo anotado al

respecto por Milbourne, et al., (1997), y Koopman, et al., (2001), excepto por los

valores de similaridad que presentan, considerándose que el coeficiente de “Nei” le

da mayor peso a las coincidencias que al coeficiente de “Jaccard” (Everit, 1993).

Las asociaciones de marcadores genéticos por medio del análisis de

agrupamiento se consideran muy útiles ya que incluyen un gran número de

caracteres y porque es una clasificación jerárquica que puede ser usada para decidir

los niveles umbrales de similaridad entre especies (Singh 1999). Asimismo, indican la

formación de agrupaciones muy distintas a las consideradas a partir del

planteamiento clásico basado en análisis morfológico y anatómico.

A pesar de la frecuente utilización de datos moleculares, existen controversias

sobre su uso en sistemática. El principal hace referencia, que si los datos

morfológicos son mejores que los moleculares para inferir filogenias o viceversa, a

pesar de que hay pocos estudios comparativos y los existentes han demostrado que

91

la divergencia morfológica y la molecular son muy independientes (Wilson et al.,

1974, 1977). Hillis (1987) concluye que la combinación de datos moleculares con los

morfológicos maximizará, tanto la utilización como el contenido de la información, y

este tipo de análisis son los que se están realizando (por ejemplo Chase et al., 1995;

Uhi et al, 1995; Kress 1995).

Los sistemáticos evolutivos intentan utilizar toda la información contenida en

las diferentes dimensiones de la filogenia (Takhtajan 1997). Esto debe dejar claro

que la elaboración de clasificaciones (incluso a nivel de especies) consiste en

realizar los análisis cladísticos y desarrollar la clasificación a partir de la serie de

grupos monofiléticos descubiertos en un cladograma (Mishler y De Luna 1997).

De esta manera se considera que sí existe variación entre las agrupaciones de

las especies del género Pachyphytum a partir de marcadores moleculares tipo

AFLP, y las agrupaciones de las secciones conocidas por aspectos morfológicos;

ubicando a la mayoría de la especies problema (P. machucae, P. garciae P.

rzedowskii y P. contrerassi) en el grupo (B), y a P. brevffolium en el grupo (A)

conformado por seis especies.

5.3 Evidencia Filogenética

Como es mencionado por Cantino y Wagstaff (1998), la filosofía general

aplicada en este tipo de estudios son que la clasificación debe reflejar una filogenia

cuando existe evidencia filogenética; cuando no se ha realizado ningún análisis

cladístico, o cuando los resultados de cada análisis son indecisos, uno podía

delimitar los taxa lo mejor que se pueda sobre las bases de una combinación de

probables sinapomorfias y discernir sobre vacíos de información fenética.

De igual forma es considerado que las clasificaciones formales se elaboran

para varios propósitos, lo cuales incluyen: comunicación almacenamiento de datos,

predictividad y su función en teorías. El último criterio mencionado es posiblemente el

92

menos conocido como una propiedad deseable de una clasificación. No obstante, el

papel que las clasificaciones tienen en teorías es el propósito más importante

(Mishier y De Luna 1997).

Los taxa filogenéticos son naturales en el sentido de que son entidades

resultantes de (y participantes en) procesos evolutivos. Indudablemente, es posible

que estos procesos y la selección natural puedan moldear organismos que son

similares a pesar de que no estén filogenéticamente relacionados. Aún en estas

situaciones, las similitudes no se presentan en todos los casos, sino sólo algunos

caracteres particulares influidos por la selección funcional. En relación a todos los

caracteres, es mucho más probable que la mayoría de las similitudes se deban a

ancestría común (homología táxica) que a la selección por un ambiente común

(analogía). Esta posición es robusta ya sea para el análisis de datos morfológicos o

moleculares (Mishler y De Luna 1997).

De manera expresa, hasta la fecha no existe algún trabajo reportado sobre la

filogenia del género Pachyphytum. Sin embargo, análisis cladísticos recientes del

ADN del cloroplasto (cpDNA) en la familia Crassulaceae (Ham 1994; Ham y t’Hart

1998), y del gen matK (Mort et al., 2001), incluyen la representación de Pachyphytum

dentro de la subfamilia Sedoidea y Crassuloideae; la primera con siete clados, dentro

del cual el clado Acre incluye los más variables y confusos taxa, esto en base a datos

cromosómicos, incluidos Pachyphytum, Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y las

especies mexicanas del género Sedum (Mort et al., 2001).

Por lo que las especies recientemente publicadas y otro reporte en prensa

resultan ser las “problemáticas”, difíciles, o necesarias de reexaminar su situación

jerárquica para ubicar dentro de alguna de las secciones conocidas de Pachyphytum,

éstas especies, mencionadas en un principio son; (P. machucae, P. brevifolium y P.

garciae; García et al., 1999; Pérez-Calix et Glass 1999), así como P. rzedowskii

(García et aG, 2002), y P. contrerassi. Por lo que se incluyó en el análisis el estudio

de las 17 especies hasta ahora conocidas del género. Se considera que las

93

decisiones de rango son necesarias en vista de que los taxónomos se han

restringido legislativamente al uso de la jerarquía Linneana. Este es entonces un

elemento de arbitrariedad inherente en el sistema formal de nomenclatura de Linneo,

ya que por un lado los organismos (unidades fisiológicas) son reales tal como son los

linajes (unidades filogenéticos) y los demes (unidades reproductivas). Por el otro,

nuestros sistemas de clasificación son obviamente una construcción humana, con

categorías arbitrarias propuestas para servir a ciertos propósitos de nuestro interés

(Mishler y De Luna 1997).

De manera similar se considera que la asignación de una categoría

taxonómica “apropiada” es arbitraria porque depende de decisiones sobre el grado

de conocimiento de los caracteres, de la ecología y distribución de los organismos,

de la tradición en el grupo taxonómico, la facilidad de identificación de las especies y

la estabilidad de la clasificación (Mishler y De Luna 1997). De hecho esto es lo que

de manera formal se expresa en la clasificación de los grupos de plantas desde el

punto de vista Linneano. Por lo que los elementos de análisis moleculares del ADN

nos permiten hasta ahora diferentes puntos de vista sobre una clasificación,

facilitando la identificación y la separación entre especies relacionadas o entre

individuos de la misma especie.

5.4 Implicaciones taxonómicas

Si se toma en cuenta lo planteado por Stevens (1984, 1986), referente a que

los caracteres morfológicos de manera tradicional han servido como la única base

para la mayoría de los estudios taxonómicos. Esto es lo que inicialmente planteó el

problema de cuatro especies del género Pachyphytum que no coincidían con la

clasificación tradicional a nivel sección o subgénero (P. machucae, P. garciae, P.

brevifolium; y P. rzedoswkii (García, et al., 1999; Pérez-Calix et Glass, 1999; García

et al., 2002). Posteriormente se incluyó en situación similar una especie cuyo reporte

técnico se encuentra en prensa (P. contrerassi). Por lo que se asumió como lo

menciona (González 1997) la búsqueda de nuevos tipos de datos que auxiliaran a

94

resolver este tipo de problemas taxonómicos. De esta forma, los resultados de los

análisis de agrupamiento genético, a partir de marcadores moleculares tipo AFLP

conforman dos agrupaciones muy diferentes a las tres agrupaciones conocidas con

el diseño habitual de clasificación.

Respecto con lo anteriormente señalado, se coincide con lo planteado por

Soltis y Soltis (2000a), en que los resultados de los análisis filogenéticos dirigidos en

todos los niveles taxonómicos de los principales grupos de plantas, han propuesto

los cambios más dramáticos en la clasificación y sus relaciones durante los últimos

100-200 años. La relevancia en examinar estos cambios, con recientes análisis

filogenéticos se ejemplifica bien en las angiospermas, donde se considera más

apropiado no usar esquemas tradicionales de clasificación para inferir altos niveles

de relaciones (Soltis y Soltis 2000a). Sin embargo, Moore (1998), considera que el

método filogenético podría incrementar temporalmente el registro global de nombres,

pero podría hacer más costoso el acceso a la taxonomía así como a la estabilidad y

delimitación de un taxon dado.

Los agrupamientos conformados en el dendrograma final obtenido

(Nei/compact), permiten considerar el hecho de que es necesario un rearreglo

sistemático a nivel dé sección, en virtud de que la clasificación taxonómica clásica,

basada en características morfológicas y anatómicas externas, considera en la

actualidad tres secciones o subgéneros (Pachyphytum, Diotostemon e

Ixiocaulon), dentro de las cuales las especies se encuentran ubicadas (sensu lato)

(Moran 1968a).

Los análisis del ADN por medio de la técnica AFLP permiten separar a la

totalidad de las especies agrupándolas por parecidos genéticos que no coinciden con

las de la clasificación clásica ó linneana, permitiendo plantear la respectiva hipótesis

sobre su relación y posible origen entre éstas.

95

En virtud de lo anterior, se acepta el planteamiento de la hipótesis inicial; ya

que “la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel de

sección, se modifica si se agrupan en relación a su polimorfismo genético”.

Es válido el hecho de plantear un arreglo sistemático a nivel de sección o de

subgéneros, apoyados en el uso de marcadores moleculares, con la posibilidad de

complementar la sistemática basada en la morfología, como lo han considerado

algunos autores (Chase et aG, 1995; Uhl et al., 1995; Kress 1995). Las hipótesis de

las relaciones ya sea basadas en datos moleculares (incluyendo secuencia de datos

del DNA, cambios estructurales y pérdida de genes/intron), morfológicos y otros

caracteres que no incluyen el DNA o una combinación de caracteres, brindan la

estructura más significativa de comparaciones evolutivas (Soltis y Soltis 2000b).

Se considera que el análisis por agrupamiento con el coeficiente de Nei y Li, y

el método de la distancia máxima (vecino lejano ó compact), resultaron herramientas

apropiadas para el esclarecimiento de especies difíciles de ubicar en alguna sección,

a nivel interespecífico, tal como se observó en este estudio, cuyos niveles de

similitud mostrados en el dendrograma permiten considerar dos principales

agrupaciones del género Pachyphytum por arriba del 50% de similaridad. Los

dendrogramas que no fueron tomados en cuenta, fue en virtud de que no reflejaron

aspectos reales de agrupación, se eligió al que brindó aspectos más claros de

relación entre las especies.

Los niveles de confianza el reemuestreo “bootstrap” (3000 repeticiones) variaron

con porcentajes del 8 al 100%. Los valores menores implican agrupamientos

débiles, en virtud de la falta de consistencia en dicha unión, pudiendo este

agrupamiento ser producto del azar. En contraste valores altos por arriba del 80,

hasta el 100%, representan mayor afinidad entre especies, con la seguridad de que

dicho nodo realmente existe en el verdadero dendrograma. Sin embargo en ninguno

de estos casos afectó la formación de las dos principales agrupaciones.

96

En virtud del nivel de similaridad y de confianza (100%) observada en el

agrupamiento entre las especies Pachyphytum kimnachi y P. fittkaui, indica que

ambos están estrechamente .relacionados, siendo factible de que se trate de un solo

taxon, considerándose que los fragmentos comigrantes sean homólogos. Esto con

base en el mayor valor de confianza de su unión y un alto nivel de similaridad.

Asimismo, se puede considerar el hecho de que existen variaciones morfológicas

entre éstos taxa, con pocas diferencias significativas a nivel de genoma; además, sus

poblaciones naturales se encuentran bajo condiciones ecológicas similares y de

cercanía geográfica. En ningún otro caso se presenta un valor tan alto de nivel de

confianza, inclusive la recién. descrita P. rzedowskü, así como P. contrerassi, las

cuales pudieran ser consideradas afines o variante de algún taxon previo.

Con base en el análisis de agrupamiento “Nei” con el método “compact” y

haciendo referencia a las localidades citada para cada especie, se elabora un

esquema de asociaciones genético-geográfico entre las especies del género

Pachyphytum. Los grupos logrados se entrelazan a manera de “herradura” por su

interior. Dicha distribución coincide con uno de los centros regionales de

endemismos de México (Hidalgo-Querétaro), como lo menciona Thiede (1995) (fig.

16).

En los gráficos obtenidos de las agrupaciones conformadas mediante el

análisis de disimilaridad genética entre las especies, destaca la forma aislada en que

se comporta Pachyphytum glutinicaule, unida por la parte superior al resto de las

especies del primer grupo (grupo A), por lo que podría considerarse el taxon mas

primitivo ó basal de este, ó de ambos grupos, o la especie principal que participó en

el proceso de variación genética de los demás taxa; ya que como lo considera Lewin

(1999), esta (la variación genética), constituye la materia prima de la evolución

confiriendo ventajas adaptativas en los individuos que las poseen.

Esto coincide con las relaciones geográficas conocidas de las especies, ya

que se reporta a P. glutinicaule de la zona limítrofe entre los estados de Querétaro e

97

Hidalgo; el resto de las especies son de los alrededores y entorno de estados

circunvecinos. Por otro lado, aquellas “especies problema” mismas que no fue

posible su ubicación taxonómica por medio de características morfológicas a nivel de

sección (P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P. rzedowskii), así como P.

contrerassi actualmente “en prensa”; todas, excepto P. brevifolium, se encuentran en

el grupo B. Pachyphytum brevifolium forma parte del grupo A, conformado por seis

especies.

98

Figura 16. Relaciones geográficas y afinidades genéticasde las especies

del género Pachyphytum. Primer. grupo especies 1-6, segundo grupo

especies 7-17.

1. Pachyphytum glutinicaule 2. P. longifolium 3. P. bracteosum 4. P. brevifolium 5. P. oviferum 6. P: hookeri 7. P. machucae. 8. P. garciae 9. P: viride 10. P. werdermannii 11. P: coeruleum 12 P caesium 13. P. rzedowskil 14. P contrerassi 15. P compactum 16. P kimnachi 17. P. fittkaui

99

Similarmente, en estas agrupaciones se separa Pachyphytum glutinicaule del resto

de especies del grupo A; coincidiendo en parte con lo planteado por Moran (1968ª),

en la sistemática clásica del grupo, que por sus características morfológicas forma

parte de la sección Ixiocaulon junto a P. fittkaui. Asimismo, la agrupación de P.

oviferum, P. longifolium y P. bracteosum ; coincide parcialmente con el agrupamiento

que tradicionalmente conforma la sección Pachyphytum, sin embargo dicha sección

no incluye a P. brevifolium, ni a P. hookeri, (esta última de la sección Diotostemon);

como lo establece la agrupación a partir de los AFLP.

El grupo B se considera de novedad, ya que dicha agrupación incluye

también especies de las tres secciones clásicas; (Pachyphytum, Diotostemon e

Ixicocaulon). Asimismo contiene especies que se consideraron problemáticas de

ubicar taxonómicamente (P. machucae, P. garciae, P. rzedowskii, P. contrerassi).

Además se considera que las especies P. kimnachi y P. fittkaui, de esta agrupación,

comparten la mayor de las similaridades observadas con el mayor valor de confianza

(100%), del género, lo que supone un posible origen común, o admitir el hecho de

que se trate de un solo taxon, coincidiendo en que sus poblaciones se encuentran

muy estrechas geográficamente.

Actualmente es difícil realizar una comparación de los resultados observados

con la técnica (AFLP), con el método de agrupamiento (Nei), ni con el género

Pachyphytum; ya que a la fecha no. se conocen reportes de trabajos previos al

respecto con este modelo, por lo que se puede considerar útil esta primera prueba

realizada. Sin embargo existen trabajos como el de Koopman et al., (2001), quienes

concluyen que dicha técnica molecular es adecuada para el estudio de las relaciones

entre especies cercanas.

Con el avance en el conocimiento de nuevas técnicas que permitan

acercarnos al genotipo de las especies, es muy probable que existan arreglos en

taxa considerados problemáticos de ubicación taxonómica, se estima este ensayo

una primera aproximación al grupo a nivel entre especies. Por lo que se considera

necesario realizar otras pruebas con marcadores genéticos diferentes, como el ADN

100

del cloroplasto (cpADN), secuenciación, RAPD’s, RFLP, etc., que permitan

comparaciones o complementar los resultados presentados. Así como el manejo de

la información por medio del uso de programas estadísticos ex profeso como el

PAUP, PHYLYP, Parsimony Analysis Software, HICLAS, entre otros (Backeljau et al.,

1996).

5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual

Las dos principales actividades de la sistemática vegetal son la clasificación e

identificación (Judd et al., 1999). Ellos mismos añaden que, la primera consiste en la

ubicación de una entidad dentro de un esquema de relaciones lógico y organizado.

Dentro de los organismos este esquema es usualmente jerárquico, que consiste de

grandes grupos incluyentes: el reino vegetal (la totalidad de las plantas verdes), y

grupos menos incluyentes gradualmente en conjuntos de redes como familias,

géneros y especies (Judd et al., 1999). Por lo que fundamentalmente la sistemática

vegetal se basa en caracteres morfológicos como rasgo distintivo entre los

organismos usando las jerarquías linneanas (Stevens 2002). De este modo la

clasificación siempre se ha enfocado en la agrupación y descripción de organismos,

y hasta recientemente se ha interesado con las relaciones filogenéticas (Judd et al.,

1999).

Con el trabajo de Darwin sobre el. origen de las especies en 1859, se ha

estimulado la incorporación de las relaciones generales evolutivas dentro de la

clasificación, un proceso actual que todavía no ha sido totalmente realizado (De

Queiroz y Gauthier 1992). Los sistematas filogenéticos enfocan su atención sobre el

resultado del proceso de descendencia con modificación y separación de linajes, y su

principal propósito es descubrir los productos de este proceso y la crónica de eventos

evolutivos que han resultado con la diversidad presente (De Queiroz y Gauthier

1992).

101

La sistemática tradicional o evolutiva organiza a las especies por su grado de

parentesco dentro del árbol filogenético, agrupa a especies que comparten

caracteres derivados de un antecesor común pero que no necesariamente incluye a

todos los descendientes, así resulta que los árboles filogenéticos tradicionales

incluyen una serie de ramas que se suceden en el tiempo y que tienen la misma

categoría taxonómica (Pough et al., 1996).

Acorde con Mishler (2000), se prevén futuras trayectorias en aspectos de

clasificación, particularmente la necesidad sobre las jerarquías libres en taxonomía.

Aquí cabe mencionar las iniciativas al respecto con trabajos como los de Cantino y

de Queiroz (2000), Stevens (2002), Brummitt (2002) y de Berry (2002); entre otros;

los primeros proponen el nuevo Código Filogenético (Phylocode), el cual vendría a

sustituir al tradicional Código Internacional de Nomenclatura Botánica. Hasta ahora

esta propuesta se fundamenta en la necesidad de que las nuevas clasificaciones se

basen en caracteres puramente evolutivos sugiriéndolo como práctico y de mejor

manejo de la información. Se considera que requiere de tiempo para su total

aceptación, por parte de la comunidad científica.

En base a lo anteriormente expuesto se considera que con el conocimiento de

la filogenia de las especies se tendrá una clasificación más precisa que brinde una

ubicación más clara de los organismos dentro del grupo al que corresponde. Si nos

referimos al caso del estudio del género Pachyphytum, como se ha manifestado en

este trabajo, sin duda repercutirá en que las secciones conocidas por la clasificación

clásica basada en caracteres morfológicos serán solo parte de la historia del grupo.

Sin duda, al realizar algun otro análisis similar basado en el estudio del ADN

de las especies de Pachyphytum, se proporcionarán los elementos que permitan

corroborar y /o aseverar la separación o la conformación de tan solo dos grupos,

como se ha demostrado con los presentes hechos, grupo A y grupo B;

desconociendo por la falta de elementos de coincidencias las tres secciones

reconocidas por Moran (1968a). Para esto sin duda tendrán que realizarse mayor

102

número de análisis al respecto a nivel de diversidad genética entre las poblaciones

que componen el grupo, con un mayor número representativo de muestras.

Ya que como lo aborda Crawford (2000), la sistemática macromolecular

durante los pasados 50 años, ha estado representado por diferentes fases desde los

compuestos secundarios hasta las proteínas. La secuenciación de aminoácidos de

proteínas de los 60’s y 70’s presentaron un impacto en la filogenia, la electroforésis

de enzimas brindó datos a nivel de población y niveles taxonómicos bajos, con lo

cual se estimuló la discusión sobre la especiación. El empleo del ADN

intensivamente en la generación de filogenias se incrementó al brindar datos

moleculares en rangos de grupos de especies y géneros (Crawford 2000).

Por lo que la incorporación de datos moleculares ha tenido un efecto

estimulante positivo en la sistemática vegetal durante las pasadas cinco décadas,

además los resultados de los estudios moleculares son de gran valor cuando estos

son parte de investigaciones que en un sentido amplio incluya técnicas tradicionales

como estudios en campo y de cromosomas (Crawford 2000).

5.6 Importancia y status del género Pachyphytum

La familia Crassulaceae comprende un gran número de especies de gran valor

en la horticultura como plantas de ornato, la mayoría de las cuales pueden ser

fácilmente propagadas y producidas comercialmente (Heywood 1978; ’t Hart 1997),

sobre todo en Europa y Norteamérica, ya que se presentan como hierbas o arbustos

sobretodo perennes, de variadas formas de desarrollo, con hojas crasas de diversas

formas y tamaños, dispuesta en roseta, o en espiral con atractivas flores de varios

tamaños y colores, además de tolerar largos períodos de sequía. En nuestro país es

explotada a baja escala como planta de ornato. Cházaro y Huerta (1995), reportan

que especies exóticas de los géneros Crassula, Aeonium, Graptopetalum, Echeveria,

103

Sedum y Kalanchoe, son cultivadas en Jalisco como plantas de ornato, y consideran

a Echeveria colorata como la más cultivada por este carácter.

Sin embargo si se considera lo anotado por Jacobsen (1978), Walther (1972),

Fitz y Anderson, (1997), con respecto a la riqueza florística que esta familia

representa en México (350 taxa), se tendrían enormes posibilidades de explotar este

recurso mediante el cultivo formal en invernaderos, tanto de especies o de los

numerosos híbridos que se pueden obtener a partir de los géneros conocidos como

lo reporta Uhl (1992) y Thiede (1995). El mismo Uhl (1992), considera que es factible

que puedan hibridarse intergenéricamente - en virtud de que los taxa son

relativamente jóvenes y muestran poca divergencia evolutiva; a este respecto, Ham

(1994), reconoce que todas las crasuláceas mexicanas pertenecen a una misma

línea evolutiva.

En particular, respecto al género Pachyphytum, las posibilidades de

considerarla como planta de ornato son bajas, ya que del total de especies

reportadas (14) por y Fitz y Anderson (1997), al parecer la principal especie que es

objeto de cultivo masivo es, P. oviferum, siendo esto justificable en virtud de que

presenta hojas gruesas y carnosas con una inflorescencia atractiva, además por ser

de fácil propagación vegetativa.

Considerando las 17 especies de Pachyphytum que se reportan en este

trabajo, las posibilidades de explotarlas en la horticultura mediante los diferentes

híbridos obtenidos serian mayores; ya que se pueden hibridar con Echeveria,

Villadia, Lenophyllum, Thompsonella y Tacitus como lo reportan (Walther 1934;

Moran 1965; Uhl 1992,1993a, 1993b,1994a, 1994b,1994c, 1995a, 1995b, 1995c,

1996, 1997, 1999). Por otro lado, Jacobsen (1978), se manifiesta contrario a los

híbridos, ya que el atribuye que esto contribuirá a mayores errores o equivocaciones

haciendo más confusa su identificación.

104

El hábitat en que se desarrollan las crasuláceas principalmente son lugares

rocosos, la alteración o destrucción es debido a la reforestación en lugares

montañosos que localmente pueden reducir su área, esto podría ser de poca

consecuencias; sin embargo es más serio el desarrollo de turismo en masa en

ambientes alpinos afectando poblaciones endémicas estrechas (‘t Hart 1997). Se

considera que la sobrecolecta es otro factor que no se reporta en documentación

escrita, sin embargo es común observar en los mercados, tianguis y viveros

numerosas especies de plantas de las Crassulaceae, que conjuntamente con varios

taxa de las Cactaceae, son extraídas ilegalmente de su hábitat natural y

comercializadas como si fueran producto de explotación en vivero o de invernadero,

algunas de éstas son enviadas al extranjero desde donde se promueve la venta de

plántulas y semillas a través del internet.

Sánchez-Mejorada (1982), anota este problema en el caso de las Cactáceas,

y según él las dos principales causas que amenazan a este grupo de plantas y que

menguan continuamente sus poblaciones son: la destrucción del medio ecológico en

que habitan y la recolección excesiva de ejemplares con fines comerciales. A pesar

de lo anterior no existe alguna restricción para ello, ya que la Norma Oficial

Mexicana, ni en el anexo 11 de suculentas mexicanas amenazadas de la IUCN

(Olfield 1997) reportan alguna especie de Pachyphytum en los apéndices

correspondientes; por lo que se considera proponer en los foros respectivos que

ciertas especies de este género presentan poblaciones muy reducidas y que su

hábitat se esta perdiendo mediante diversas causas como las anteriormente

presentadas, y que en virtud de esto sería conveniente ubicarlas en alguno de los

apéndices de esta Norma.

El género Pachyphytum es endémico de México (Jacobsen 1978), desde

Tamaulipas hasta el oriente de Michoacán y del norte de Hidalgo hasta Jalisco y

Aguascalientes, desarrollándose un mayor número de especies en la región centro

de Querétaro, Guanajuato y San Luis Potosí; sin embargo se considera poco

conocido, en virtud de que se desarrolla de manera natural en rocosidades poco

105

accesibles y hasta recientemente con una mayor exploración botánica se ha

incrementado el número de especies conocidas, creyéndose factible el hallazgo de

algunas otras en los espacios intermedios de la distribución geográfica hasta ahora

conocida.

Hasta ahora no se conocen reportes en sistemática molecular, filogenia,

biodiversidad y conservación genética referente, o exclusiva de Pachyphytum. Van

Ham (1994, 1995), reporta haber incluido P. compactum de el Cerro el Mexicano de

Querétaro en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las Crassulaceae a

partir del ADN del cloroplasto (cpDNA), al respecto comenta que este género

pertenece al clado 7 (Acre), junto con Echeveria y Villadia; así como con especies de

Sedum de diversas partes del planeta. Además concluye que con esta información

generada puede considerarse que es muy poco conocido sobre de la evolución de la

familia Crassulaceae; y que Pachyphytum junto a otros, representa recientes

radiaciones evolutivas de antiguos progenitores parecidos a Sedum. Posteriormente

Ham y Hart (1998); Mort et al (2001), incluyen a Pachyphytum compactum y P.

kimnachi en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las crasuláceas a partir

del cpDNA y del gen del cloroplasto matK respectivamente, con similares resultados

a los reportados por Ham en 1994.

Perspectivas

Acorde a lo reportado por Ham (1994); Ham y Hart (1998), así como Mort y

colaboradores (2001), el clado a que pertenece el género Pachyphtum comprende un

tercio de la diversidad taxonómica dentro de las Crassulaceae, y que acorde con la

hipótesis de Ham y Hart (1998) es necesario mucho más trabajo filogenético para

resolver los límites entre géneros y sus relaciones dentro de este enorme clado. Se

considera .fue dentro de este clado se encuentran los taxa mas variables y confusos

en base a datos cromosómicos e incluyen a los géneros Pachyphytum,

Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y a las especies mexicanas del género

Sedum (Mort et al., 2001). Así mismo como lo anota Stebbins (1999) debería

conocerse el desarrollo del principal objetivo de una . investigación referente a la

106

evolución vegetal, y que ésta incluya la combinación de aspectos morfológicos,

fisiológicos e histológicos, con una cuidadosa observación de las poblaciones

naturales, así como de las poblaciones artificiales que se establecen en jardines,

invernaderos y viveros; el costo económico que representa se verá justificado en

virtud de que constituye un gasto que será recompensado en el futuro por lo efectos

de daños evitados al ambiente.

Por otro lado Hillis y Holder (2000), consideran que aunque la biología

comparativa tiene inmensos beneficios del desarrollo de la tecnología computarizada,

hay muchas técnicas y algoritmos en la ciencia de la computación que no han sido

ampliamente aplicadas a la filogenética. Esto implica que una vez que se han

realizado los aspectos prácticos de la investigación y logrado las tablas de

contingencias respectivas; será necesario usar al límite los algoritmos y programas

conocidos para obtener el máximo provecho de los resultados de la investigación

realizada.

107

VI CONCLUSIONES

Las dos agrupaciones observadas en las relaciones interespecíficas de las

especies del género Pachyphytum por medio del análisis de ADN con marcadores

genéticos tipo AFLP, no se correlacionan con las agrupaciones conformadas a través

de la sistemática clásica basada en características morfológicas y anatómicas

externas, por lo que la situación de la clasificación taxonómica de las secciones

Pachyphytum, Diotostemon e Ixiocaulon varía.

La técnica AFLP permitió detectar un alto nivel promedio (81.2%) de

polimorfismos en las especies de Pachyphytum analizadas, por lo que se considera

dicha técnica como una importante herramienta para precisar “especies problema” de

ubicación taxonómica en especies relacionadas.

108

VII LITERATURA CITADA

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