Universidad Rey Juan Carlos

Escuela Superior de Ciencias Experimentales y Tecnología

Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Curso académico 2016/2017

Trabajo Fin de Grado

INHIBICIÓN DE LA MELANOSIS ALTERNATIVA AL USO DE SULFITOS EN LANGOSTINO AUSTRAL (Pleoticus muelleri) Y ESTUDIO DE VIDA ÚTIL EN REFRIGERACIÓN Y ATMÓSFERA

MODIFICADA

Autora: Selene Pérez García

Director: Ángel Peral Yuste

Co-Directoras: Pilar Montero García y Carmen Gómez Guillén

Colaboradores: Elvira López, Ailén Alemán y Daniel Marín

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero dar las gracias a la persona que me ha dirigido este trabajo, Ángel Peral Yuste, por haber confiado en mí para la realización del mismo.

En segundo lugar, al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC), especialmente a María Pilar Montero y María del Carmen Gómez, por haberme dado la oportunidad de trabajar en su grupo y co-dirigirme la parte experimental del trabajo, enseñándome siempre todo lo posible y más.

También, agradecer a Daniel Marín por haber estado a mi lado en el laboratorio desde el principio y haber estado disponible en todo momento para aclarar mis dudas, así como al resto de los compañeros del Departamento de Productos, que me han hecho sentir parte del grupo diariamente.

Por último, y no menos importante, agradecer a mi familia y amigos por su apoyo constante, su plena confianza y sus sabios consejos, sacando siempre lo mejor de mí.

Todas las páginas de este trabajo han sido posibles gracias a vosotros.

ÍNDICE 1 RESUMEN .................................................................................................................................................................... 1 2 INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................................... 2 3 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................................................................................................... 7

3.1 OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................................................... 7 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................................................ 7

4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................................. 8 4.1 MATERIA PRIMA ............................................................................................................................................. 8 4.2 REACTIVOS ........................................................................................................................................................ 8 4.3 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMELANÓSICO DEL 4-HEXILRESORCINOL Y SUS NIVELES RESIDUALES EN LANGOSTINO AUSTRAL .......................................................................................................... 8

4.3.1 Preparación de las muestras ............................................................................................................ 8 4.3.2 Evaluación mediante inspección visual ....................................................................................... 9 4.3.3 Niveles residuales de 4-hexylresorcinol...................................................................................... 9

4.4 ESTUDIOS DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN REFRIGERACION Y ATMÓSFERA MODIFICADA ....................................................................................................................................... 9

4.4.1 Preparación de las muestras ............................................................................................................ 9 - Envasado en atmósfera modificada ................................................................................................ 10

4.4.2 Preparación del extracto de piel y albedo de granada........................................................ 10 4.4.3 Inspección visual: “Score de melanosis” ................................................................................... 11 4.4.4 Análisis físico-químico durante la conservación .................................................................. 11

- Determinación de la textura ............................................................................................................... 11 - Determinación del color ....................................................................................................................... 11 - Determinación del pH ........................................................................................................................... 12 - Determinación del nitrógeno básico volátil total (NBVT) ..................................................... 12

4.4.5 Análisis microbiológico durante la conservación ................................................................. 12 4.4.6 Análisis bioquímico durante la conservación ........................................................................ 13

- Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO) .......................................................... 13 Obtención de extracto crudo con PPO a partir de caparazón .......................................... 13 Obtención de extracto crudo con hemocianina a partir de vísceras ............................. 13

4.4.7 Análisis estadístico ............................................................................................................................ 13 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................................................ 14

5.1 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMELANÓSICO DEL 4-HEXILRESORCINOL Y SUS NIVELES RESIDUALES EN LANGOSTINO AUSTRAL ....................................................................................................... 14

5.1.1 Evaluación mediante inspección visual .................................................................................... 14 5.1.2 Niveles residuales de 4-hexilresorcinol .................................................................................... 16

5.2 ESTUDIO DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN REFRIGERACIÓN ....................... 18 5.2.1 Inspección visual: “Score de melanosis” ................................................................................... 18 5.2.2 Análisis físico-químico durante la conservación .................................................................. 19

- Determinación de la textura ............................................................................................................... 19 - Determinación del color ....................................................................................................................... 20 - Determinación del pH ........................................................................................................................... 20 - Determinación de nitrógeno básico volátil total (NBVT) ....................................................... 21

5.2.3 Análisis microbiológico durante la conservación ................................................................. 22 - Recuento de mesófilos aerobios totales ........................................................................................ 22 - Recuento de enterobacterias ............................................................................................................. 23 - Recuento de Pseudomonas spp......................................................................................................... 23 - Recuento de bacterias totales (15°C) ............................................................................................. 24 - Recuento de organismos productores de H2S ............................................................................. 25 - Recuento de bacterias anaerobias totales .................................................................................... 25

5.2.4 Análisis bioquímico durante la conservación ........................................................................ 26 - Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO) .......................................................... 26

5.3 ESTUDIO DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN ATMÓSFERA MODIFICADA ... 28 5.3.1 Análisis del espacio de cabeza ...................................................................................................... 28 5.3.2 Inspección visual: “Score de melanosis” ................................................................................... 28 5.3.3 Análisis físico-químico durante la conservación .................................................................. 29

- Determinación de la textura ............................................................................................................... 29 - Determinación del color ....................................................................................................................... 30 - Determinación del pH ........................................................................................................................... 31 - Determinación de nitrógeno básico volátil total (NBVT) ....................................................... 31

5.3.4 Análisis microbiológico durante la conservación ................................................................. 32 - Recuento de mesófilos aerobios totales ........................................................................................ 32 - Recuento de Pseudomonas spp. y de organismos productores de H2S ............................ 33 - Recuento de bacterias totales (15°C) y anaerobias totales ................................................... 34

5.3.5 Análisis bioquímico durante la conservación ........................................................................ 36 - Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO) .......................................................... 36

6 CONCLUSIONES ..................................................................................................................................................... 38 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................................. 39

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1 RESUMEN La Comisión del Codex Alimentarius define la melanosis, como el desarrollo de pigmentos

oscuros en las zonas del cefalotórax, abdomen y telson de crustáceos, causados por reacciones enzimáticas oxidativas, seguidas de una autooxidación y polimerización (Rotllant et al., 2002). Estas manchas se producen horas después de la captura cuando entran en contacto con oxígeno (Gokoglu & Yerlikaya, 2008), dando lugar a una vida útil relativamente corta del producto. Este proceso se acelera cuanto más elevada es la temperatura, por lo que la conservación por frío retrasa pero no inhibe este fenómeno. Por ello, es de gran importancia llevar a cabo investigaciones sobre el efecto de los antimelanósicos comerciales y las tecnologías de conservación, así como buscar alternativas que reemplacen los aditivos químicos, en especial, aquellos que puedan causar inconvenientes al consumidor o al manipulador del alimento.

En el presente trabajo se estudiaron los efectos del antimelanósico comercial Crustaxyl, basado en 4-hexilresorcinol, como alternativa al metabisulfito, que es el habitualmente utilizado. Para ello, se estudiaron a diferentes concentraciones y tiempos de tratamiento en langostino austral (Pleoticus muelleri), así como sus niveles residuales en la parte comestible. Una vez elegida la relación concentración-tiempo que deja la cantidad máxima de residuo en concentraciones permitidas por la legislación, se evaluó la vida útil en estado refrigerado y su efecto combinado con atmósfera modificada (60% N2 y 40% CO2) en langostinos tratados con Crustaxyl y se comparó con el efecto de un extracto natural como es el extracto de piel y albedo de granada (etanólico más acetónico). Para su evaluación se determinó la aparición de melanosis (Score), las propiedades físico-químicas (textura, color, pH y nitrógeno básico volátil total), microbiológicas (mesófilos aerobios, enterobacterias, bacterias lácticas, Pseudomonas, organismos productores de H2S, bacterias luminiscentes y bacterias sulfito reductoras) y bioquímicas (actividad de la polifenoloxidasa) de los langostinos tratados.

Concentraciones inferiores a 1% de Crustaxyl durante un tratamiento de 10 segundos no fueron suficientes para inhibir la melanosis en langostinos conservados en estado refrigerado, mientras que concentraciones superiores dieron lugar a langostinos con aspecto reseco y blanquecino en su caparazón. La vida útil de los langostinos conservados en estado refrigerado fue relativamente corta para el lote tratado con extracto de piel y albedo de granada, mientras que los individuos tratados con Crustaxyl al 1% se conservaron durante 10 días. En cambio, el envasado en atmósferas modificadas fue efectivo en ambos lotes, dando lugar a una vida útil mayor, probablemente debido a que la mezcla de gases provocó una disminución de los recuentos de bacterias y una menor actividad de la polifenoloxidasa.

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2 INTRODUCCIÓN El langostino austral o patagónico (Pleoticus muelleri), también denominado langostino

rojo argentino o gambón austral, habita principalmente en aguas del sudoeste del océano Atlántico (América del Sur) frente a la Patagonia, con unas temperaturas entre 6 y 20°C. Alrededor de 12.000 toneladas de langostino austral se pescan anualmente en aguas argentinas representando económicamente entre el 25 y 33% de las exportaciones anuales del sector pesquero (Risso et al., 2005). Lamentablemente, su vida útil es relativamente corta debido a la aparición de manchas negras principalmente bajo el caparazón del cefalotórax (Nirmal & Benjakul, 2011) y la cutícula de los individuos, fenómeno conocido como melanosis. Dada su importancia económica, resulta fundamental el empleo de aditivos con el fin de evitar la melanosis. De hecho, el langostino austral principalmente se comercializa congelado, debido a su rápido deterioro en estado refrigerado.

El proceso de melanosis en crustáceos es un fenómeno natural post-morten provocado por una enzima endógena, denominada polifenoloxidasa (PPO), capaz de oxidar los fenoles a quinonas en presencia de oxígeno, los cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos de alto peso molecular, denominados melanina, con una coloración oscura característica, lo que a su vez es la causa del pardeamiento enzimático (Díaz López et al., 2003).

La profenoloxidasa (pro-PPO), forma inactiva de la polifenoloxidasa, es un proenzima que se localiza principalmente en la cutícula de los crustáceos, aunque también ha sido encontrada en el interior de las vísceras (en el hepatopáncreas, donde se sintetiza), en el músculo, o en la hemolinfa (Yang et al., 1993). Tras la muerte del animal se inicia el proceso de melanosis, dando lugar a la salida de diversas enzimas de sus compartimentos de origen. Debido a la autolisis del hepatopáncreas se liberan enzimas proteolíticas digestivas en el cefalotórax, así como aminoácidos y péptidos que actúan como substrato de la PPO. Las enzimas proteolíticas degradan los tejidos liberando la hemolinfa, y por tanto la pro-PPO, en el cefalotórax provocando así la activación de la polifenoloxidasa (Zamorano et al., 2009).

La polifenoloxidasa otorga a los crustáceos en vida dos funciones fisiológicas importantes: acción inmunológica (Söderhall & Ajaxon, 1982) y esclerotización o endurecimiento de la quitina del caparazón tras la muda. La PPO participa pues activamente en la cicatrización de heridas, evitando el paso de microorganismos a través de la herida gracias a la producción de compuestos antimicrobianos y fungicidas (Díaz López et al., 2003). Además, la melanosis varía según la especie, los métodos de captura, la manipulación (Otwell et al., 1992; Bartolo & Birk, 1998) y con la estación del año, siendo mayor durante el ciclo de muda (Gómez-Guillén et al., 2005).

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En los trabajos de caracterización parcial de la polifenoloxidasa como los de gamba rosa (Penaeus duorarum) (Simpson et al., 1988), gamba blanca (Penaeus setiferus) (Díaz López et al., 2003), gamba negra atigrada (Penaeus monodon) (Rolle et al., 1991), langostino atigrado (Penaeus japonicus) (Montero et al., 2001a) y gamba blanca (Parapenaeus longirostris) (Montero et al., 2004) esta enzima muestra diferencias con respecto al peso molecular, punto isoeléctrico, pH óptimo, termoestabilidad y parámetros cinéticos, pero no se han encontrado trabajos sobre el langostino austral (Pleoticus muelleri).

El proceso de la melanosis en crustáceos implica grandes pérdidas económicas en la industria puesto que, a pesar de que no es un índice de deterioro y no produce sustancias tóxicas, daña las características sensoriales, disminuyendo su calidad, vida útil y, posteriormente su valor comercial (Gómez-Guillén et al., 2005), provocando en los consumidores un rechazo del producto (Martínez-Álvarez et al., 2005a). Para controlar esta alteración, los crustáceos se suelen tratar con antimelanósicos comerciales, ya sea por inmersión o espolvoreo, junto con métodos de conservación, tales como la refrigeración, congelación, e incluso pueden ser sometidos previamente a cocción. Frecuentemente pueden ir tratados por una tecnología coadyuvante que a modo de barrera pueda aumentar la vida útil de los crustáceos. Entre estas tecnologías destacan la irradiación, altas presiones o atmósferas modificadas/controladas.

El tratamiento de los crustáceos por inmersión presenta más ventajas que por espolvoreo. En primer lugar, porque distribuye de manera más homogénea el aditivo, y en segundo lugar, porque frecuentemente, los aditivos utilizados por espolvoreo suponen un mayor peligro para el personal manipulador, causando irritación de ojos, piel y sistema respiratorio. El espolvoreo también afecta negativamente a los resultados de los niveles residuales, dando lugar a una mayor desviación estándar como consecuencia de la heterogeneidad en la distribución del polvo (Montero et al., 2006). De esta forma, algunos individuos pueden acumular gran cantidad de aditivo, mientras que otros pueden permanecer libres y desarrollar melanosis con mayor intensidad (Gómez-Guillén et al., 2005). Por el contrario, el tratamiento por inmersión es más complicado cuando se trata de capturas en barcos, es decir, de crustáceos salvajes, donde es más dificultoso por las limitaciones de espacio y el tratamiento rápido y corto.

En la actualidad, existe una amplia gama de aditivos alimentarios capaces de inhibir la melanosis, los cuales son considerados como compuestos seguros (Martínez-Álvarez et al., 2005b). Estos se clasifican en base a su primer modo de acción, donde encontramos principalmente los agentes reductores/antioxidantes, acidulantes, quelantes, agentes complejantes e inhibidores enzimáticos (Díaz López et al., 2003).

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Los agentes reductores tienen como función principal reducir las o-quinonas hasta difenoles no coloreados o reaccionar irreversiblemente con las o-quinonas formando productos coloreados estables. Dentro de este grupo se encuentran los sulfitos, ácido ascórbico, ácido eritórbico, cisteína y antioxidantes fenólicos. Tradicionalmente se han utilizado los sulfitos y sus derivados como antimelanósicos comerciales (Ferrer et al., 1989). Según la legislación vigente, el límite máximo de sulfitos se clasifica según las unidades de crustáceos por kg de las familias Penaeidae, Solenoceridae y Aristeidae, siendo de 135 mg/kg para 80 unidades/kg, 180 mg/kg para cantidades entre 80-120 unidades/kg y 270 mg/kg para cantidades superiores.

El metabisulfito sódico fue el aditivo más utilizado desde los años 50 en la industria pesquera del langostino (Risso et al., 2005). Este aditivo inhibe la melanosis de manera efectiva puesto que reacciona con las quinonas formando sulfoquinonas, lo que produce una reacción irreversible con la PPO, provocando su inactivación completa (Gómez-Guillén et al., 2005). Sin embargo, los sulfitos no evitan la melanosis total y pueden presentar un riesgo para la salud (Martínez-Álvarez et al., 2005a), tales como reacciones alérgicas, causando trastornos graves en personas asmáticas (Basiri et al., 2015), e incluso dolores de cabeza y abdominales, náuseas y vómitos. Por ello, buscar alternativas a su utilización es de gran importancia para su consumo.

Los acidulantes tienen la capacidad de disminuir el pH del medio (

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Varios estudios en diferentes especies de crustáceos utilizaron 4-hexilresorcinol encontrando diferencias en las dosis efectivas para la total inhibición de la melanosis. Entre estos estudios, se necesitó una dosis de 4-hexilresorcinol de 50 mg/kg en camarón marrón del norte (Penaeus Aztecus) y en camarón rosado (Penaeus duorarum) (López-Caballero et al., 2007), mientras que para la gamba blanca (Parapenaeus longirostris) se necesitó 100 mg/kg (Guandalini et al., 1998). Esas diferencias pueden deberse a variaciones entre especies, susceptibilidad fisiológica, concentración del inhibidor o método de aplicación, entre otros factores (Montero et al., 2006).

Sin embargo, según la legislación vigente, el límite máximo admisible de residuos para el 4-hexilresorcinol en la parte comestible de los crustáceos se ha establecido en 2 mg/kg en la Unión Europea, lo cual compromete en gran medida su efectividad como antimelanósico durante el almacenamiento en refrigeración. Por ello, es de gran importancia buscar una serie de alternativas más sanas a los conservantes químicos, como por ejemplo, el uso de antimelanósicos naturales, los cuales pueden emplearse a modo de coadyuvantes, permitiendo reducir la dosificación de los aditivos químicos. Entre ellos, destacan los extractos naturales polifenólicos derivados de las semillas de pomelo, granada y uva (Udayasoorian et al., 2017).

La granada (Púnica granatum) es una fruta que se cultiva principalmente en Asia, África del Norte, Mediterráneo y Oriente Medio (Sarkhosh et al., 2006). Esta fruta contiene compuestos importantes que proporcionan efectos funcionales y medicinales, tales como antioxidantes, antibacterianos, antiinflamatorios y anticancerígenos (Duman et al., 2009). Concretamente, la semilla y el extracto de la cáscara (piel y albedo) mostraron una alta actividad antioxidante en coincidencia con un alto contenido en polifenoles (Li et al., 2006). Desde el punto de vista de la salud, su uso lo convierten en una alternativa natural eficiente a los conservantes químicos (Yuan et al., 2016) en combinación con un método de conservación convencional, como por ejemplo, el almacenamiento en congelación, refrigeración o en atmósferas modificadas como coadyuvante de la refrigeración. Además del interés adicional de utilizar un residuo de la industria alimentaria para obtener un producto de valor añadido económico y consecuentemente una mejora medioambiental.

La congelación evita el deterioro de los crustáceos, manteniendo a éstos lo más “frescos” posible, aunque con largos periodos de almacenamiento causa cambios físicos, químicos y sensoriales (Pardio et al., 2011), dando lugar a olores desagradables, rancidez, deshidratación, pérdida de peso, pérdida de jugosidad, exudado y endurecimiento, así como deterioro microbiano y autolisis (Boonsumrej et al., 2007). Sin embargo, si se realiza correctamente, puede dar lugar a una vida útil de más de un año (Chevalier et al., 2000).

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La refrigeración consiste en la aplicación de temperaturas entre -1°C y 8°C a alimentos perecederos para prolongar el tiempo que permanecen higiénicamente seguros y organolépticamente aceptables. Los principales efectos de la refrigeración son evitar el crecimiento de microorganismos termófilos y muchos mesófilos, alargar el periodo de latencia de los microorganismos psicrótrofos y disminuir la velocidad de las reacciones químicas y bioquímicas. Todo ello, conduce a conservar la calidad, manteniendo las cualidades organolépticas, poder nutritivo, textura y apariencia de los alimentos. Sin embargo, no destruye microorganismos ni anula las reacciones químicas y bioquímicas, por lo que los alimentos refrigerados no se conservan indefinidamente, es decir, su vida útil es corta. Por tanto, el uso de refrigeración en langostinos no impide la melanosis, sino que reduce su desarrollo ya que la PPO permanece activa (Mendes et al., 2006), entre otros factores que acontecen en refrigeración y en última instancia conducen al deterioro.

El envasado en atmósfera modificada consiste en la sustitución del aire del recipiente por un gas o una mezcla de gases pudiendo contener cierta cantidad de oxígeno. La principal ventaja es que debido a la composición de la atmósfera, rica en CO2 pero pobre en O2, se extiende la fase de latencia, se reduce el crecimiento bacteriano en la fase logarítmica (Gonçalves & Oliveira, 2016) y se retrasa la degradación enzimática (Martínez-Álvarez et al., 2005c). Además, evita el colapso del envase sobre el alimento, dando lugar a una presentación más agradable del producto. Sin embargo, diversos estudios han demostrado que la textura del producto se vio afectada tras la cocción, provocando pérdidas en el sabor (Martínez-Álvarez et al., 2005a). Esto puede deberse al exceso de CO2 en la atmósfera, que trae consigo un aumento de la acidez muscular debido a su difusión (Sivertsvik et al., 2002; Martínez-Álvarez et al., 2005a).

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3 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS El langostino austral (Pleoticus muelleri) es una especie que habitualmente se comercializa

en estado congelado debido a su rápido deterioro en estado refrigerado. No obstante, cada vez es más frecuente que el consumo demande éste y otros langostinos en estado refrigerado para poder ser utilizado inmediatamente, por lo que se suelen descongelar en los centros de comercialización para ser vendidos como refrigerados, con la consecuente reducción de vida útil. Dado que el langostino austral es muy sensible a la melanosis a temperaturas de refrigeración, en este caso, es imprescindible tratar el langostino con antimelanósicos en dosis efectivas, por lo que se pretende utilizar los máximos posibles dentro del límite que permite la legislación. La búsqueda de antimelanósicos efectivos en estas especies, que puedan paliar la melanosis y garantizar una vida más larga, supone un reto de gran importancia económica. Por tanto, la hipótesis sería la utilización de antimelanósicos alternativos a los sulfitos o derivados y la aplicación de atmósferas modificadas como coadyuvantes de la refrigeración.

3.1 OBJETIVO GENERAL El objetivo principal de este trabajo es la aplicación de tratamientos antimelanósicos

basados en 4-hexilresorcinol y extracto natural polifenólico de piel y albedo de granada en langostino austral y el estudio de vida útil de los langostinos tratados mediante refrigeración y atmósferas modificadas a 4°C.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Dentro de este objetivo general, se llevan a cabo los siguientes objetivos específicos:

o Determinar la concentración de Crustaxyl (producto comercial basado en 4-hexilresorcinol) y el tiempo de tratamiento más adecuado para la inhibición de melanosis en langostino austral, evitando superar el límite máximo de residuo establecido para el 4-hexilresorcinol (2 mg/kg).

o Estudiar el efecto de Crustaxyl y extracto de piel y albedo de granada, como antimelanósico alternativo, en langostinos conservados en refrigeración, analizando su apariencia y sus propiedades físico-químicas y microbiológicas.

o Evaluar el efecto de Crustaxyl y extracto de piel y albedo de granada en langostinos refrigerados y conservados en atmósferas modificadas, analizando su apariencia y sus propiedades físico-químicas y microbiológicas.

o Determinar la actividad de la polifenoloxidasa en langostinos tratados con Crustaxyl y extracto de piel y albedo de granada durante su conservación en refrigeración y atmósferas modificadas.

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4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 MATERIA PRIMA o Langostino austral (Pleoticus muelleri) capturado en la costa patagónica (Puerto

Madryn), recibido en el ICTAN en estado congelado (Iberconsa, Vigo, España) sin tratar. El tamaño medio es de 17 cm con un peso de 40 g. Se almacena a -20°C previo a su uso.

o Piel y albedo de granada comercial para obtener un extracto polifenólico concentrado.

4.2 REACTIVOS o Crustaxyl: aditivo libre de sulfitos compuesto por ácido ascórbico (E-300), ácido cítrico

(E-330) y 4-hexilresorcinol (E-586). o Todos los reactivos utilizados fueron de grado de laboratorio: acetona, acetonitrilo, ácido

acético, ácido clorhídrico, ácido perclórico, agua desionizada, agua de peptona, Brij, catecol, cloruro de sodio, etanol, fenolftaleína, hidróxido de sodio, indicador Tashimo, L-prolina, metanol, polivinilpirrolidona y tampón fosfato sódico.

4.3 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMELANÓSICO DEL 4-HEXILRESORCINOL Y

SUS NIVELES RESIDUALES EN LANGOSTINO AUSTRAL

4.3.1 Preparación de las muestras

Se prepararon 9 lotes (9 langostinos por lote), por lo que se emplearon un total de 81 individuos. El tratamiento químico se llevó a cabo por inmersión en una solución salina (NaCl al 2%, p/v) a diferentes concentraciones de Crustaxyl (0,5%-2%, p/v) durante 10 ó 60 segundos, con relación 1:2,5 (langostino:agua) y pH 3, aproximadamente. Previamente al tratamiento, los langostinos se descongelaron dentro de bolsas de plástico mediante inmersión en agua fría durante 30 minutos. Los lotes se denominaron con acrónimos mediante una C (Crustaxyl) seguido de su concentración en % (-0,5) y del tiempo de tratamiento en segundos (10/60):

o Lote 1 (C-0,5/10): Crustaxyl 0,5% durante 10 segundos. o Lote 2 (C-0,75/10): Crustaxyl 0,75% durante 10 segundos. o Lote 3 (C-1/10): Crustaxyl 1% durante 10 segundos. o Lote 4 (C-1,5/10): Crustaxyl 1,5% durante 10 segundos. o Lote 5 (C-2/10): Crustaxyl 2% durante 10 segundos. o Lote 6 (C-0,5/60): Crustaxyl 0,5% durante 60 segundos. o Lote 7 (C-0,75/60): Crustaxyl 0,75% durante 60 segundos. o Lote 8 (C-1/60): Crustaxyl 1% durante 60 segundos. o Lote 9 (C-0): Control.

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4.3.2 Evaluación mediante inspección visual

Se llevó a cabo un seguimiento del desarrollo de melanosis mediante evaluación visual periódica de los langostinos tratados y del control, realizando fotografías a días 0, 1, 2 y 5.

4.3.3 Niveles residuales de 4-hexylresorcinol

Para cada determinación se realizaron 3 réplicas representativas, a partir de músculo de 3 langostinos picados y mezclados. A partir de los cuales, se pesó un gramo de músculo, se añadió 3 ml de acetonitrilo, se agitó vigorosamente en orbital durante 10 minutos y se retiró el volumen de acetonitrilo. La extracción se repitió dos veces más. A continuación, la totalidad del volumen de acetonitrilo recogido en las tres extracciones se disolvió en agua desionizada en una proporción 1:3, y se pasó por columnas de extracción en fase sólida (C:18, 500 mg, de Waters), previamente activadas con 3 ml de metanol a vacío y lavadas con 10 ml de agua desionizada. De esta forma, el 4-hexilresorcinol quedó retenido en la columna.

Posteriormente, se lavaron las columnas con 10 ml de agua desionizada y se añadió 3 ml de etanol absoluto para arrastrar el 4-hexilresorcinol. Por último, se recogió el etanol, se midió el volumen en tubos de ensayo graduado, se filtró mediante filtro de jeringa (13mm Nylon, 0,45µm, de Phenomenex) y se conservó en congelación. La cuantificación de 4-hexilresorcinol se realizó mediante HPLC-MS (cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas) con triple Q (Agilent 1260LC MSD 6410B QqQ), utilizando un flujo isocrático 50% agua y 50% acetonitrilo con flujo de 1ml/min. El patrón usado fue 4-hexilresorcinol 98% (Sigma Aldrich Ref: 209465-25G).

4.4 ESTUDIOS DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN

REFRIGERACION Y ATMÓSFERA MODIFICADA

4.4.1 Preparación de las muestras

Para el estudio en refrigeración se prepararon 3 lotes (28 langostinos para los lotes 1 y 2) y un tercer lote como control, únicamente para el análisis microbiológico. Previamente al tratamiento, los lotes se descongelaron en aire a temperatura ambiente y a continuación, se conservaron en cámara a 4°C. Se realizaron 5 controles a día 0, 3, 6, 8 y 10, además de una inspección visual (“Score” de melanosis) diaria durante 10 días.

o Lote 1: fue denominado con el acrónimo C-1/90. Este lote se trató por inmersión en una solución de Crustaxyl al 1% durante 90 segundos a pH 3.

o Lote 2: se denominó con el acrónimo PG-6. Se trató por inmersión en una solución de extracto de piel y albedo de granada al 6% durante 30 minutos a pH 3,5.

o Lote 3: denominado con el acrónico C, siendo este lote el control (langostinos sin tratar).

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Para el siguiente estudio, envasado en atmósfera modificada y conservado en estado refrigerado, se prepararon 3 lotes (60 langostinos para el lote 1 y 2) y un tercer lote como control, únicamente para el análisis microbiológico. Se llevaron a cabo 5 controles a días 1, 5, 8, 13 y 18, además de una inspección visual diaria (“Score” de melanosis) durante 18 días.

o Lote 1: fue denominado con el acrónimo C-0,5/90. Este lote se trató por inmersión en una solución de Crustaxyl al 0,5% durante 90 segundos a pH 3. Previo al tratamiento, los langostinos se descongelaron en aire a temperatura ambiente.

o Lote 2: denominado con el acrónimo PG-6+C-0,5/90. Se descongeló durante 30 minutos en una solución de extracto de piel y albedo de granada al 6% a pH 3,5 y posteriormente, se trató por inmersión en una solución de Crustaxyl al 0,5% durante 90 segundos.

o Lote 3: se denominó con el acrónico C, siendo este lote el control (langostinos sin tratar).

- Envasado en atmósfera modificada Los langostinos se envasaron en bandejas tipo barqueta (4 langostinos por bandeja) de

dimensiones 17x12x3 cm mediante una envasadora (modelo A300/52, Multivac, Alemania) con una atmósfera de 60% N2 y 40% CO2 y se conservaron en estado refrigerado en cámara a 4°C. A lo largo de la conservación, se llevó a cabo un control periódico de la composición del espacio de cabeza de las bandejas, verificando así que la mezcla de gases se mantenía dentro de lo establecido. Las medidas se llevaron a cabo por triplicado mediante un analizador de gas (modelo ChekMate 9900, Dansensor, España) perforando una aguja a través de un septum sobre la superficie del film de las bandejas, lo que permitió determinar la cantidad de CO2 y de O2.

4.4.2 Preparación del extracto de piel y albedo de granada

Las pieles y albedo de granada se secaron en estufa a 50°C y se molieron mediante un molinillo de café de acero inoxidable (Taurus Aromatic 150, España) hasta conseguir un polvo.Se pesaron 60 gramos de piel y albedo de granada y se suspendieron en una solución etanol/agua (70/30). La solución se calentó en un baño a 60°C durante 30 minutos, se sonicó 5 minutos a un 95% de amplitud mediante una sonda de ultrasonicación (modelo Q700, Qsonica sonicators, Newton, CT, USA), se mantuvo en agitación 15 minutos y a continuación se centrifugó en ultracentrífuga Beckman a 12.000 g a 4°C durante 15 minutos.

El sobrenadante obtenido se filtró, se llevó a rotaevaporar a 60°C hasta eliminar el etanol, y se conservó en refrigeración. Por otro lado, el precipitado de la centrifugación se suspendió en una solución acetona/agua (80/20) y se sonicó 5 minutos a un 95% de amplitud. La solución se llevó a rotaevaporar a 60°C hasta eliminar la acetona y se conservó en refrigeración. Ambos extractos se juntaron y se obtuvieron 420 ml de extracto.

11

4.4.3 Inspección visual: “Score de melanosis”

Inspección realizada por jueces previamente entrenados, los cuales evaluaron las zonas anatómicas en las que se visualiza la melanosis, por un lado, cefalotórax y parápodos y por otro lado, abdomen, pleópodos y telson, puntuando así el grado de melanosis como “ausencia”, “leve”, “acentuada” o “muy acentuada” (Tabla 1). El valor máximo de score para cada una de las zonas anatómicas es 100, que se corresponde con el 100% de jueces que atribuyen una propiedad al 100% de los individuos. Además, se evaluaron las cabezas amarillentas, la separación de la cabeza del cefalotórax y los individuos comercializables, aunque a estos últimos aspectos no siempre se les atribuye importancia y depende del crustáceo a evaluar.

Tabla 1: Plantilla de Score de melanosis

4.4.4 Análisis físico-químico durante la conservación

- Determinación de la textura La determinación de la textura se realizó mediante la prueba de Kramer o de resistencia a

la cizalla. Se cortaron porciones de músculo de langostino de dimensiones similares y se midió la textura mediante un texturómetro (Analyser TA-XT, Plus, NY, EE.UU.) con una célula de carga de 30 kg y una sonda Kramer de 5 cuchillas. Se realizaron 8 réplicas por muestra y los resultados obtenidos se expresaron como N/g.

- Determinación del color Los parámetros L* (luminosidad), a* (+a indica rojo, -a indica verde) y b* (+b indica amarillo, -b indica azul) se midieron con un colorímetro (Konica Minolta CM- 3500 d, Madrid, España), con iluminador D65 (luz natural) y observador estándar D10. Se calibró primero el patrón negro y a continuación el blanco, previo a las medidas, las cuales se realizaron en 10 zonas diferentes de cada muestra. Para ambos ensayos se realizaron al menos 5 réplicas.

12

- Determinación del pH Para la determinación de pH las muestras se homogeneizaron en un homogeneizador

Ultraturrax IKA (IKA-Werke GmbH & Co.Kg Janke & Kunke-Str, Staufen, Alemania) durante 1 minuto con agua destilada en proporción 1:10 (p/v). Las muestras se dejaron reposar durante 10 minutos y se determinó el pH con un pHmetro digital (Thermo Orion 3 Star, EE.UU.) previamente calibrado, a temperatura ambiente y, al menos, por cuadruplicado.

- Determinación del nitrógeno básico volátil total (NBVT) Se pesaron 10 gramos de músculo de langostino, se añadieron 90 ml de ácido perclórico

(PCA) al 6% y se homogeneizó en un Ultraturrax IKA. Se filtró en Whatman No.1 y se enrasó hasta 100 ml con PCA al 6%. A continuación se traspasaron 25 ml del filtrado a un tubo de destilación, y se añadieron 2 gotas de fenolftaleína y 5 ml de NaOH al 20%. Se prepararon matraces con 100 ml de ácido bórico al 3% y 4 gotas de indicador Tashimo, se llevó a cabo una destilación hasta 150 ml y finalmente se valoró con HCl 0,1N. Los resultados obtenidos son media de al menos 4 réplicas y se expresaron como mg NBVT/100 g.

4.4.5 Análisis microbiológico durante la conservación

El análisis se llevó a cabo por triplicado y para ello, se pesaron asépticamente 10 gramos de músculo, de al menos 5 langostinos de distintos envases, en campana de flujo laminar y se transfirieron a bolsas estériles (Sterilin, Stone, Staffordshire, Reino Unido) con 90 ml de agua de peptona 0,1% (Scharlab, España). Se llevó a cabo una homogeneización en un equipo Stomacher (modelo Colworth 400, Seward, Londres, Reino Unido), obteniendo así una solución 1:10. Posteriormente se realizaron las diluciones decimales apropiadas para la determinación de los siguientes microorganismos, expresándose los recuentos como el logaritmo de las unidades formadoras de colonias por gramo de muestra (log ufc/g).

o Mesófilos aerobios totales sembrados en profundidad en agar para recuento en placa, PCA (“Plate Count Agar”, Panreac, España) que se incubaron a 30°C durante 72 h.

o Enterobacteriaceae en VRBG (“Violet red bile glucose agar”, Panreac, España), en profundidad doble capa, que se incubaron a 30°C durante 48 h.

o Bacterias lácticas en agar MRS (“Man Ragosa & Sharpe”, Merk, España), en profundidad doble capa, que se incubaron a 30°C durante 72 h.

o Pseudomonas spp., sembrados en superficie en placas de PAB (“Pseudomonas agar base”, Oxoid, UK) con suplemento para Pseudomonas spp. CFC (“Cetrimida, Fucidine, Cefalosporina”, Oxoid, UK) y 5 ml de glicerina que se incubaron a 25°C durante 72 h.

o Recuento de bacterias totales viables en placas de IA (“Iron agar”, Microkit, España), en superficie, con NaCl 1%, que se incubaron a 15°C entre 3-5 días.

13

o Organismos productores de H2S, como colonias negras, en placas de IA, con NaCl 1%, en superficie, que se incubaron a 15°C entre 3-5 días.

o Bacterias luminiscentes en placas de IA, con NaCl 1%, en superficie, que se incubaron a 15°C entre 3-5 días.

o Bacterias sulfito reductoras en placas de TSC (“Tryptose Sulphite Cycloserine Agar”, Biomérieux, España), en profundidad, que se incubaron en jarra de anaerobiosis a 36°C durante 48 h.

4.4.6 Análisis bioquímico durante la conservación

- Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO)

Obtención de extracto crudo con PPO a partir de caparazón Los caparazones del cefalotórax se lavaron con agua, se cortaron en tiras pequeñas y se

mezclaron (1:3 p/v) con 0,1 M de tampón fosfato sódico (pH 7,2) conteniendo NaCl 1M, 0,2% Brij 35 y 2% polivinilpolipirrolidona (PVPP). La suspensión se mantuvo en agitación durante 3 horas a 4°C y posteriormente se centrifugó en ultracentrífuga Beckman a 20.000 g durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante se filtró a través de ocho capas de muselina (gasa), se llevó a alícuotas de 500 µl y se congeló a -80°C.

Obtención de extracto crudo con hemocianina a partir de vísceras Las vísceras del cefalotórax se extrajeron y se homogeneizaron (1:2 p/v) con 0,1 M de

tampón fosfato sódico (pH 7) en un Omnimixer. La suspensión se centrifugó en ultracentrífuga Beckman a 50.000 g durante 20 minutos a 4°C y el sobrenadante obtenido se filtró a través de ocho capas de muselina (gasa). Finalmente, se llevó a alícuotas de 500 µl y se congeló a -80°C.

Ambos extractos se llevaron a un espectrofotómetro de placas (PowerWave XS, Biotek, Vermont, USA) para determinar la actividad PPO. Para ello, se disolvió catecol en ácido acético 0,05 M y L-prolina en buffer tampón fosfato (pH 7). Seguidamente, se mezclaron en la placa 20 µl de extracto crudo, 20 µl de L-prolina, 20 µl de catecol y 220 µl de tampón fosfato 0,1 M (pH 7). La reacción se monitorizó espectrofotométricamente a 30 ᵒC y 540 nm, determinando el aumento de absorbancia a cada minuto. La actividad enzimática se expresó como unidades de actividad enzimática por ml de extracto (U/ml), considerando la unidad (U) como el incremento de A/min. Los parámetros cinéticos se evaluaron según el gráfico de Lineweaver Burk.

4.4.7 Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) utilizando el programa SPSS (Statistical Software, Inc., Chicago, IL, USA) aplicando el test de Tukey, con un nivel de significación de P≤0.05 (datos no mostrados).

14

5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMELANÓSICO DEL 4-HEXILRESORCINOL Y

SUS NIVELES RESIDUALES EN LANGOSTINO AUSTRAL Tal y como se ha comentado previamente, los lotes de langostinos fueron sometidos a una

inmersión en una solución salina (NaCl al 2%, p/V) a diferentes concentraciones de Crustaxyl (0,5%-2%, p/v) a pH 3 durante 10 ó 60 segundos. Previamente al tratamiento, los langostinos se descongelaron dentro de bolsas de plástico mediante inmersión en agua fría durante 30 minutos. A continuación, se muestran y discuten los resultados obtenidos más destacables.

5.1.1 Evaluación mediante inspección visual

Analizando los resultados de la evolución de la melanosis (Figura 1) se observó que la concentración de 4-hexilresorcinol de los lotes C-0,5/10 y C-0,75/10 no fue suficientemente efectiva, puesto que a día 2 ya aparecieron manchas negras en el telson y en el cefalotórax, dando lugar a una vida útil del producto relativamente corta. Esto se debe a la baja concentración de 4-hexilresorcinol empleada, junto con la aplicación de un tratamiento de inmersión relativamente corto.

Por otro lado, las concentraciones de los lotes C-1,5/10 y C-2/10 inhibieron la melanosis al menos durante 5 días, sin embargo, le proporcionaron al langostino un aspecto reseco y blanquecino, no agradable para el consumidor. En cuanto al lote C-1/10, fue capaz de inhibir la melanosis en los langostinos (a excepción del telson), durante casi los 5 días de conservación, sin afectar a su aspecto.

Figura 1: Evolución de la melanosis de langostinos en función de la concentración de Crustaxyl.

15

En la Figura 2 se muestra el desarrollo de la melanosis en función de la concentración de Crustaxyl y el tiempo de tratamiento. Con respecto al tiempo de tratamiento, se observó que una inmersión durante 10 segundos, independientemente de la concentración de Crustaxyl, no fue suficiente para frenar la melanosis debido posiblemente a que el aditivo no penetró lo necesario. Esto se pudo observar a día 2 en los lotes C-0,5/10, C-0,75/10 y C-1/10 donde se apreciaron manchas negras en la parte del cefalotórax y el telson de los individuos, mientras que con los tratamientos equivalentes durante 60 segundos, las manchas no aparecieron tan rápidamente.

Por otro lado, en relación a la concentración de Crustaxyl, se observó que las soluciones al 0,5% y 0,75% no resultaron efectivas para evitar o reducir la melanosis durante 5 días, sino que para ello, fue necesario emplear, al menos, un 1% de Crustaxyl. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el límite máximo para el 4-hexilresorcinol en la parte comestible de los crustáceos se ha establecido en 2mg/kg según la ley vigente de la Unión Europea, por lo que se hace necesario buscar una solución de compromiso entre la efectividad del tratamiento antimelanósico y los niveles residuales del aditivo en el músculo.

Figura 2: Evolución de la melanosis de langostinos en función de la concentración de Crustaxyl y tiempo de tratamiento.

16

5.1.2 Niveles residuales de 4-hexilresorcinol

Tal y como se muestra en la Figura 3, a día 0 no se apreciaron diferencias significativas entre los lotes (P>0.05), mostrando todos valores dentro del intervalo de 1-2 ppm de 4-hexilresorcinol. Sin embargo, a día 2 los individuos de los lotes C-1,5/10 y C-2/10 superaron el límite máximo de 4-hexilresorcinol permitido en el músculo, el cual es 2 ppm. Esto se debe a la alta concentracion de antimelanósico comercial en la solución de tratamiento y a la tendencia a aumentar los niveles residuales durante el almacenamiento refrigerado por una mayor difusión al músculo (Montero et al., 2006).

Figura 3: Niveles residuales de 4-hexilresorcinol en la porción comestible de langostinos.

Por último, a día 5 se observó que la mayoría de los lotes aumentaron drásticamente sus niveles de 4-hexilresorcinol, a excepción de los lotes C-0,5/10 y C-0,5/60. Este incremento tan acusado en el tiempo puede deberse, en parte, a una posible pérdida de la capacidad de retención de agua del músculo durante el almacenamiento, lo que ocasiona un aumento de la concentración del antimelanósico.

17

Los resultados mostraron claramente que la dosis de antimelanósico comercial y el tiempo de inmersion de los individuos son parámetros importantes que afectan al nivel residual de 4-hexilresorcinol en el músculo (Mendes et al., 2006).

Por tanto, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el apartado 5.1.1 y en el presente apartado (5.1.2), se llegó a la conclusión de que la concentración de Crustaxyl más adecuada para frenar la melanosis es del 1% durante un tiempo de tratamiento de 60 segundos, si bien puede superar el límite máximo establecido de 4-hexilresorcinol en músculo durante el periodo de almacenamiento.

Una posible estrategia tecnológica para paliar este efecto sería la aplicación de tratamientos con una concentración de Crustaxyl menor al 1%, pero en combinación con otros métodos coadyuvantes tales como antimelanósicos naturales, y/o atmósferas modificadas. Esta estrategia podría mejorar el aspecto visual del langostino sin sobrepasar los límites admisibles de resorcinol durante la conservación.

18

5.2 ESTUDIO DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN REFRIGERACIÓN El presente estudio se basa en dos lotes, por un lado, langostinos sometidos a inmersión

en una solución de Crustaxyl al 1% a pH 3 durante 90 segundos (C-1/90) y por otro lado, sometidos a inmersión en una solución de extracto de piel y albedo de granada al 6% a pH 3,5 durante 30 minutos (PG-6). Previamente, ambos lotes se descongelaron en aire ambiente y, posterior al tratamiento, se conservaron en refrigeración a 4°C durante 10 días.

5.2.1 Inspección visual: “Score de melanosis”

En la Figura 4 se muestran los resultados de la inspección visual (Score de melanosis) de los lotes detallados anteriormente. A lo largo de los 9 días de almacenamiento, la aparición de melanosis en el lote C-1/90 fue prácticamente despreciable en la zona del abdomen; sin embargo, a partir del día 3 se pudo observar un leve aumento de manchas negras únicamente en la zona del cefalotórax y parápodos. Las cabezas son normalmente más susceptibles a la melanosis que la región del abdomen, debido a la presencia del contenido visceral rico en proteasas y a la hemocianina contenida en la hemolinfa, factores que amplifican la actividad PPO (Montero et al., 2006).

Figura 4: Score de melanosis en langostinos durante la refrigeración.

19

Por el contrario, el lote PG-6 desarrolló melanosis más rápidamente, observando así manchas leves a partir del día 1. La zona del cefalotórax y los parápodos fue la más afectada, registrándose melanosis de manera acentuada en más de un 50% a partir del día 3. En cambio, la melanosis en el abdomen y los pleópodos se desarrolló lentamente, manteniéndose constante a lo largo de la conservación, con un grado de manchas negras leve-acentuada.

Por tanto, se llegó a la conclusión de que el uso individual de extracto de piel y albedo de granada como antimelanósico no es suficiente para inhibir la melanosis, mientras que una concentración de Crustaxyl al 1% si. Sin embargo, un posible efecto conservador del extracto de piel y albedo de granada podría mostrarse en combinación con bajas concentraciones de antimelanósicos comerciales y otras tecnologías de conservación (Qian et al., 2015).

5.2.2 Análisis físico-químico durante la conservación

- Determinación de la textura Se utilizó la resistencia al corte o cizalla mediante la célula de Kramer para evaluar la

textura de la cola o el músculo, lo cual da una idea de masticabilidad general. Analizando los valores obtenidos para la evolución de la textura a lo largo de la conservación en estado refrigerado (Figura 5), se pudo observar que inicialmente el lote C-1/90 registró una fuerza de 14 N/g mientras que el lote PG-6 fue de 10,5 N/g. Es decir, los individuos del lote C-1/90 tenían una textura más dura que los del lote PG-6 tras ser tratados a día 0 (P≤0.05). A lo largo del almacenamiento en refrigeración los individuos del lote C-1/90 fueron disminuyendo suresistencia a la cizalla, registrando valores de 12 N/g a día 10. Sin embargo, el lote PG-6 fue aumentando su resistencia hasta obtener un valor final de 13 N/g lo cual se puede atribuir a la pérdida de exudado al final del periodo de conservación.

Figura 5: Evolución de la resistencia a la cizalla de langostinos durante la refrigeración.

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10

Fuer

za (N

/g)

Día

Resistencia a la cizalla

C-1/90PG-6

20

- Determinación del color A la vista de los resultados (Tabla 2), al inicio del estudio la luminosidad (L*) del

langostino tratado con Crustaxyl presentó ligeramente un valor mayor que el langostino tratado con extracto de piel y albedo de granada (P≤0.05). Sin embargo, al final de la conservación ambos lotes obtuvieron el mismo valor de L, siendo éste de 43,4.

Tabla 2: Evolución de los parámetros de color (L, a, b) en langostinos durante la refrigeración.

Día 0 Día 3 Día 6 Día 8 Día 10

C-1/90 L* 47,1 ± 1,8 45,7 ± 1,2 44,2 ± 1,1 44,5 ± 1,0 43,4 ± 1,3

a* 0,6 ± 1,9 -0,1 ± 1,5 3,2 ± 2,2 1,5 ± 1,8 2,1 ± 1,7b* 2,2 ± 1,6 2,6 ± 0,9 2,8 ± 1,6 3,9 ± 1,0 5,0 ± 1,3

PG-6 L* 43,3 ± 2,3 46,1 ± 2,0 45,9 ± 1,3 43,0 ± 1,6 43,4 ± 1,1a* 3,3 ± 2,5 0,0 ± 2,0 -0,1 ± 1,9 2,2 ± 2,0 1,6 ± 1,8b* 3,9 ± 1,6 1,8 ± 1,2 3,0 ± 1,4 4,8 ± 1,9 5,6 ± 1,7

En cuanto a los parámetros a* y b*, el color rojizo (+a) en el lote C-1/90 fue aumentando a lo largo de la conservación, pero en el lote PG-6 fue disminuyendo levemente. Por otro lado, el color amarillento (+b) aumentó en ambos lotes, alcanzando a día 10 un valor aproximadamente de 5. Esto demuestra que a pesar de la aparición de melanosis acentuada en el lote PG-6 durante los primeros días de la conservación, el color del músculo se mantiene prácticamente igual que el del lote C-1/90, el cual no presentó apenas manchas negras durante toda la conservación. Por tanto, se pone de manifiesto que este tratamiento podría ser efectivo para evitar la melanosis en colas de langostinos crudos sin piel, muy comercializados en numerosos países (EU, USA, etc.), siendo suficiente para evitar el efecto atribuido a la PPO de la hemolinfa.

- Determinación del pH Los cambios de pH son uno de los principales indicadores de los cambios postmortem del

langostino y de la degradación de proteínas musculares y nucleótidos durante el almacenamiento (Udayasoorian et al., 2017). Está documentado en la bibliografía que la forma de conservación del langostino, al igual que su forma de captura, influye en el pH, con valores que suelen oscilar entre 6,2 – 7,2 (Gonçalves et al., 2003). El pH inicial fue de aproximadamente 7,3 para ambos lotes (Figura 6), sin embargo, a día 3 se observó un aumento significativo (P≤0.05) llegando a un valor de 8,1. A partir de este punto, el pH de ambos lotes se mantuvo prácticamente constante, llegando al final de la conservación a un valor máximo de 8,4. Este incremento del valor de pH pudo deberse a la acumulación de compuestos básicos originados por la acción enzimática, tanto endógena como microbiana (López-Caballero et al., 2007).

21

Figura 6: Evolución del pH de langostinos durante la refrigeración.

- Determinación de nitrógeno básico volátil total (NBVT) La determinación del NBVT es una de las principales pruebas analíticas que se utilizan

para evaluar el grado de frescura de los productos pesqueros. Esta prueba cuantifica compuestos nitrogenados volátiles no proteicos liberados durante el proceso de degradación postmortem, que normalmente producen un aumento en el pH y que, en refrigeración, se asocian principalmente al deterioro microbiano, lo que ayuda a determinar la calidad del producto. La Figura 7 muestra el progreso del contenido en NBVT en los individuos tratados durante la conservación en estado refrigerado.

Inicialmente, ambos lotes presentaron un contenido relativamente elevado de NVBT, siendo este de 20 mg /100g, atribuido a las características iniciales del material de partida. A lo largo de la conservación, dicho valor fue aumentando hasta alcanzar un máximo de 65 mg /100 g para ambos lotes, valor muy por encima del recomendado como límite de vida útil en langostino (30 mg/100 g) (Nirmal & Benjakul, 2011). En este momento de la conservación, el periodo de vida útil se encontró ampliamente rebasado, y de hecho los langostinos desprendían un fuerte olor amoniacal.

Se pudo observar que el lote PG-6 obtuvo niveles ligeramente inferiores que el lote C-1/90 en los días intermedios de la conservación (P≤0.05). Esto podría deberse a cierto efecto antimicrobiano de los compuestos fenólicos del extracto de piel de granada, inhibiendo ligeramente el crecimiento microbiano, especialmente de bacterias de deterioro (Basiri et al., 2015).

7,27,47,67,8

88,28,48,6

0 2 4 6 8 10Día

pH

C-1/90PG-6

22

Figura 7: Evolución del Nitrógeno Básico Volátil Total de langostinos durante la conservación.

5.2.3 Análisis microbiológico durante la conservación

- Recuento de mesófilos aerobios totales Los crustáceos son muy perecederos debido principalmente al rápido crecimiento de los

microorganismos naturalmente presentes o de los procedentes de contaminación. La Figura 8muestra la evolución de este grupo, donde los recuentos iniciales en langostino recién descongelado (materia prima) fueron de 3,55 log ufc/g.

Figura 8: Mesófilos aerobios totales en langostinos durante la refrigeración.

010203040506070

0 2 4 6 8 10

mg

NBV

T/10

0g

Día

NBVT

C-1/90PG-6

01234567

0 2 4 6 8 10

Log

ufc/

g

Día

Mesófilos aerobios totales

CC-1/90PG-6

23

La aplicación de los compuestos objeto de estudio por inmersión redujo la microbiota. El lote PG-6 registró un valor inicial de 2,15 log ufc/g y fue aumentando de forma exponencial, alcanzando un valor final de 5,9 log ufc/g. Con valores iniciales similares, el lote C-1/90presentó recuentos superiores a 1 unidad al extracto de piel y albedo de granada en estadíos iniciales de la conservación (P≤0.05), recuentos que fueron aumentando hasta alcanzar su punto máximo a día 6 de 5,24 ufc/g.

- Recuento de enterobacterias Las enterobacterias son microorganismos Gram-negativos potencialmente patógenos,

considerados indicadores de la calidad microbiológica de los alimentos, particularmente de las condiciones del procesado a las que se someten. El desarrollo de este grupo se muestra en la Figura 9. Su valor estuvo por debajo del límite de detección (

24

Figura 10: Pseudomonas spp. en langostinos durante la refrigeración.

- Recuento de bacterias totales (15°C) Los recuentos en Iron Agar estuvieron por debajo del límite de detección (

25

- Recuento de organismos productores de H2S La evolución de organismos productores de H2S (colonias negras) fue prácticamente

idéntica en ambos lotes (Figura 12) y permanecieron por debajo del límite de detección (2 log ufc/g) hasta el día 8, llegando ambos a un valor aproximadamente de 4 log ufc/g, tras 10 días de almacenamiento.

La importancia de este grupo de bacterias es enorme porque a este grupo pertenece Shewanella putrefaciens, bacteria Gram-negativa implicada en el deterioro de productos de la pesca. Cabe destacar, que no se detectó presencia de colonias luminiscentes (Photobacterium phosphoreum), microorganismos psicrotrofos característicos en productos de la pesca implicados también en el deterioro.

Figura 12: Organismos productores de H2S en langostinos durante la refrigeración.

- Recuento de bacterias anaerobias totales Los recuentos de bacterias anaerobias (Figura 13) se determinaron como control para el

siguiente ensayo en atmósferas modificadas y en ambos lotes se observó un comportamiento similar. No se detectó su presencia durante los primeros 8 días de almacenamiento, a partir del cual se apreció un crecimiento llegando a valores de 3 log ufc/g para el lote C-1/90 y de 4 log ufc/g para el lote PG-6 (P≤0.05). Durante el ensayo no se detectó la presencia de presuntos Clostridium perfringens dentro de este grupo anaerobio, que puede aparecer como contaminantes de alimentos.

-1

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10

Log

ufc/

g

Día

Organismos productores de H2S

CC-1/90PG-6

26

Figura 13: Bacterias anaerobias totales en langostinos durante la refrigeración.

No se registró crecimiento de bacterias ácido lácticas, las cuales pueden, en ocasiones, mejorar las características sensoriales como el sabor, color, textura y calidad nutritiva del producto. Sin embargo, en estudios anteriores se observó que el crecimiento de este grupo de bacterias se vio favorecido por la presencia de 4-hexilresorcinol (López Caballero et al., 2006).

A la vista de los resultados, se puede concluir que la evolución de los grupos estudiados fue muy similar en ambos lotes, si bien Crustaxyl preserva la calidad higiénica del gambón porque previene el desarrollo de enterobacterias. El género Pseudomonas spp. parece ser el grupo que predomina durante la conservación en refrigeración.

5.2.4 Análisis bioquímico durante la conservación

- Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO) La estabilidad de la PPO depende de factores tales como la temperatura, pH, sustrato

utilizado, fuerza iónica, sistema tampón y tiempo de incubación (Gonçalves & Oliveira, 2016). Tal y como se muestra en la Figura 14, se pudo observar que la actividad fue mayor en vísceras que en caparazón y en el lote PG-6 que en el lote C-1/90 (P≤0.05). La actividad PPO del lote C-1/90 se mantuvo constante durante toda la conservación, con un valor de 42 y 140 U/ml para caparazón y vísceras, respectivamente. En cuanto al lote PG-6, se observó que al comienzo de la conservación disminuyó la actividad PPO, mientras que a partir del día 3 dejó de hacer efecto, aumentando hasta un valor de 100 y 220 U/ml para caparazón y vísceras, respectivamente. El hecho de que la PPO muestre un efecto inhibitorio solo al comienzo del estudio puede deberse a que tiene lugar una inhibición reversible, hasta que a día 3 el sustrato se va liberando.

-1

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10

Log

ufc/

g

Día

Bacterias anaerobias totales

CC-1/90PG-6

27

La mayoría de los estudios parecen estar de acuerdo en que la PPO no es estable a pH ácido, esto explicaría los resultados inferiores de la actividad enzimática en C-1/90 (pH 3) frente al lote PG-6 (pH 3,5), lo que pone de manifiesto el mayor poder inhibitorio del Crustaxyl.

Figura 14: Evolución de la actividad PPO en caparazón y vísceras de langostinos durante la conservación.

Atendiendo a lo anteriormente comentado, se pudo observar que ambos lotes, C-1/90 y PG-6 obtuvieron el mismo valor de pH (7,3 inicial y 8,1 final) y de NBVT (20 mg/ 100 g inicial y 65 mg/ 10 g final). Además, el color no tuvo muchas fluctuaciones entre ambos, siendo levemente más rojizo el músculo de los langostinos tratados con Crustaxyl. En cuanto a la textura, al comienzo de la conservación el lote PG-6 era más blando que el lote C-1/90, aunque ambos llegaron a un valor final similar, el cual oscilaba entre 12-13 N/g. En cuanto a la actividad PPO, resultó ser mayor en vísceras que en caparazón, y en el lote PG-6 que en el lote C-1/90.Según los resultados del análisis microbiológico, ambos lotes obtuvieron recuentos similares, a excepción de que el lote PG-6 presentó crecimiento de enterobacterias y el lote C-1/90 no. Finalmente, según los resultados de melanosis, los langostinos tratados con Crustaxyl no presentaron apenas manchas negras, mientras que los tratados con extracto de piel de granada si, y de manera evidente a partir de los primeros días de conservación.

Por tanto, se llegó a la conclusión de que el extracto de piel y albedo de granada de manera individual no tuvo efecto inhibitorio alguno de la melanosis, sin embargo, en combinación con antimelanósicos comerciales en cantidades reducidas y otras técnicas de conservación podría ser interesante, dado que el resto de parámetros estudiados que conducen a evaluar la vida útil, no difieren de manera acusada con respecto al otro tratamiento ensayado (C-1/90).

Investigaciones previas sobre las características de langostinos, de otras especies, sometidos a refrigeración en combinación con atmósfera modificada mostraron resultados prometedores (Gonçalves et al., 2003; Thepnuan et al., 2008). Por ello, se estimó conveniente disminuir la concentración de Crustaxyl en el siguiente ensayo con atmósferas modificadas, para así no superar el nivel de residuos establecido en la parte comestible durante el almacenamiento.

28

5.3 ESTUDIO DE VIDA ÚTIL DE LANGOSTINO AUSTRAL EN ATMÓSFERA

MODIFICADA Para este tercer y último estudio del presente trabajo, se llevaron a cabo dos lotes. Por un

lado, el lote denominado C-0,5/90 que se descongeló en aire ambiente y posteriormente se trató por inmersión en una solución de Crustaxyl al 0,5% a pH 3 durante 90 segundos. Y por otro lado, el lote denominado PG-6+C-0,5/90 que se descongeló en una solución de extracto de piel y albedo de granada al 6% a pH 3,5 durante 30 minutos y posteriormente se trató por inmersión de la misma manera que el lote anteriormente comentado. Ambos se envasaron bandejas en atmósfera modificada y se conservaron en refrigeración a 4 °C durante 18 días.

5.3.1 Análisis del espacio de cabeza

Tal y como se muestra en la Figura 15, ambos lotes presentaron mínimas fluctuaciones en la composición de la mezcla de gases (N2 y CO2) establecida al inicio del estudio. Esto se debe a los diferentes envases, aunque la composición se mantiene prácticamente constante (P>0.05). Se pudo observar una disminución leve de la concentración de CO2 a lo largo del envasado en atmósferas modificadas, probablemente debida a su disolución en la fase acuosa de los tejidos de los langostinos tratados, lo cual aumenta a temperaturas bajas (4°C). Esta reducción de CO2también se observó en otros estudios para camarón blanco (Parapenaeus longirostris) y pescado (Gonçalves et al., 2003). Sin embargo, la concentración de CO2 y O2 podría haber aumentado debido a la respiración microbiana de los individuos tratados, pero no fue el caso.

Figura 15: Evolución de la composición de la mezcla de gases durante los 18 días de conservación.

5.3.2 Inspección visual: “Score de melanosis”

A la vista de los resultados de la Figura 16, se observó que el lote C-0,5/90 se mantuvo prácticamente en ausencia de melanosis durante la primera semana, hasta que a día 8 apareció cierto grado de manchas negras en la zona del cefalotórax y parápodos, aumentando levemente hasta el final de la conservación. A pesar de reducir la concentración de Crustaxyl a la mitad, este comportamiento fue semejante al lote C-1/90.

29

La melanosis en el lote PG-6+C-0,5/90 se desarrolló con una progresión similar, aunque más acentuada. A día 8 ya se empezaron a observar leves manchas negras tan sólo en el cefalotórax y parápodos, llegando a acentuarse a día 18. Comparando este lote con el lote PG-6del estudio anterior en refrigeración, hay grandes diferencias (P≤0.05). El extracto de piel y albedo de granada en refrigeración no mostró efecto alguno en el retraso de la melanosis, dando lugar a día 3 a manchas negras de manera acentuada, mientras que en atmósferas se mantuvo aceptable hasta el día 18, lo cual es atribuido al efecto combinado de la presencia de resorcinol y el envasado en atmósfera prácticamente libre de oxígeno, que inhibe la actividad de la PPO.

Figura 16: Score de melanosis de los langostinos en atmósfera modificada.

5.3.3 Análisis físico-químico durante la conservación

- Determinación de la textura La Figura 17 representa la evolución de la textura de los langostinos tratados.

Inicialmente, ambos lotes mostraron una resistencia a la cizalla de aproximadamente 12 N/g que se mantuvo constante hasta el día 8. Al comenzar la segunda semana de conservación, se observó un aumento lineal de la firmeza de ambos lotes (P>0.05). Finalmente, el lote C-0,5/90obtuvo una fuerza de 16 N/g mientras que para el lote PG-6+C-0,5/90 fue de 14 N/g.

30

Figura 17: Evolución de la resistencia a la cizalla de los langostinos en atmósfera modificada.

El comportamiento del lote PG-6+C-0,5/90 fue similar al del lote PG-6 en refrigeración, mostrando una tendencia al endurecimiento en los últimos días de almacenamiento. Sin embargo, los resultados de textura obtenidos para el tratamiento únicamente con Crustaxyl fueron diferentes en ambos ensayos, ya que mientras que en estado refrigerado se ablandó, en atmósfera modificada y conservación en refrigeración se endureció a partir del día 8 de conservación, efecto que podría deberse a la exudación de fluidos propiciado por el envasado en atmósfera, provocando así su endurecimiento.

- Determinación del color La Tabla 3 representa la evolución de los parámetros L*, a* y b* para el ensayo en

atmósferas modificadas, registrando valores similares al ensayo en refrigeración. El valor inicial de la luminosidad para ambos lotes fue de 46,1 y ligeramente fue disminuyendo a lo largo de la conservación, pero se mantuvo estable.

Tabla 3: Evolución de los parámetros de color (L, a, b) de los langostinos en atmósfera modificada.

Día 1 Día 5 Día 8 Día 13 Día 18

C-0,5/90 L* 46,1 ± 1,1 44,5 ± 1,3 44,5 ± 1,3 45,3 ± 1,5 45,1 ± 1,2

a* 0,8 ± 1,3 1,9 ± 1,9 1,3 ± 2,8 2,3 ± 2,3 2,3 ± 2,2b* 1,8 ± 1,1 2,6 ± 1,3 5,5 ± 1,5 5,5 ± 1,8 5,0 ± 1,4

PG-6+C-0,5/90 L* 46,1 ± 1,9 45,0 ± 1,0 46,2 ± 1,6 46,2 ± 1,6 44,9 ± 1,3a* 1,3 ± 2,2 1,5 ± 2,0 1,0 ± 2,0 2,0 ± 2,9 3,9 ± 2,9b* 2,1 ± 1,6 2,5 ± 1,5 2,8 ± 1,7 4,4 ± 1,9 6,0 ± 1,5

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20

Fuer

za (N

/g)

Día

Resistencia a la cizalla

C-0,5/90PG-6+C-0,5/90

31

Con respecto a los valores de a* (tendencia rojo/verde), ambos lotes se mantuvieron más o menos constantes, sin embargo, a día 18 el lote PG-6+C-0,5/90 obtuvo un valor al final de la conservación ligeramente mayor que el lote C-0,5/90, adquiriendo tonos rojizos característicos (P≤0.05). Por último, los valores de b* (tendencia amarillo/azul) de ambos lotes fueron similares al comienzo de la conservación, pero mientras que el lote tratado con Crustaxyl aumentó de manera acusada a partir del día 5, el lote PG-6+C-0,5/90 fue aumentando poco a poco (P≤0.05).

- Determinación del pH En la Figura 18 se muestra el progreso del pH para los lotes C-0,5/90 y PG-6+C-0,5/90.

Ambos obtuvieron un pH de 7,7 a día 1 y dicho parámetro fue aumentando ligeramente durante el almacenamiento (P≤0.05) hasta registrar a día 18 valores de 8,2. Cabe destacar que los dos lotes tratados en el ensayo de vida útil de refrigeración obtuvieron este valor a día 3, por lo tanto, nuevamente se pone de manifiesto el papel relevante del envasado en atmósfera modificada para prolongar la vida útil de los langostinos refrigerados.

Figura 18 Evolución del pH de los langostinos en atmósfera modificada.

- Determinación de nitrógeno básico volátil total (NBVT) Tal y como se muestra en la Figura 19, a día 1 ambos lotes obtuvieron un contenido de 20

mg NBVT/100g, igual que en el estudio anterior de vida útil en refrigeración, y se mantuvo constante a lo largo de la primera semana de conservación. Sin embargo, a día 8 se observó un aumento drástico del contenido en NBVT, llegando a un valor final de 126 y 93 mg NBVT/100g para C-0,5/90 y PG-6+C-0,5/90, respectivamente (P≤0.05). Estos resultados ponen de manifiesto que, si bien el extracto de granada no mostró un evidente efecto antimelanósico, sí ejerce un efecto coadyuvante de la conservación, reduciendo de manera significativa el acúmulo de compuestos del deterioro en los últimos días de almacenamiento.

7,27,47,67,8

88,28,48,6

0 5 10 15 20Día

pH

C-0,5/90PG-6+C-0,5/90

32

Figura 19: Evolución del Nitrógeno Básico Volátil Total de los langostinos en atmósfera modificada.

El contenido en NBVT de los individuos tratados con Crustaxyl fue totalmente diferente para ambos estudios, ya que se obtuvo una mayor vida útil en atmósfera modificada, de 18 días, frente a los 10 días del estudio del almacenamiento en estado refrigerado. De este modo, a día 10 para el lote C-1/90 el contenido fue de 65 mg NBVT/100 g, mientras que para el lote C-0,5/90fue de 40 mg NBVT/100 g (P≤0.05).

Esto demuestra una mayor calidad de los individuos tratados con Crustaxyl en atmósfera modificada que en refrigeración, a pesar de que la concentración del aditivo fue la mitad. Este efecto conservante se atribuye directamente al efecto de la mezcla gaseosa del envase, con reducido contenido en oxígeno, que inhibe el crecimiento bacteriano y la producción de metabolitos del deterioro.

5.3.4 Análisis microbiológico durante la conservación

- Recuento de mesófilos aerobios totales Con recuentos iniciales de 3,55 log ufc/g (materia prima), de nuevo se observó un

descenso en los recuentos por efecto de los compuestos aplicados. La evolución de mesófilos aerobios totales (Figura 20) presentó alguna fluctuación entre lotes. Ambos registraron un valor inicial en torno a 2-2,5 log ufc/g, y tras la aplicación de la mezcla gaseosa se observó una fase de latencia de 5 y 8 días para los lotes PG-6+C-0,5/90 y C-0,5/90, respectivamente. Así, mientras que el lote PG-6+C-0,5/90 fue aumentando de manera lineal desde el día 5, el lote C-0,5/90 presentó crecimiento exponencial desde el día 8, llegando ambos a un valor final de 5,6 log ufc/g.

020406080

100120140

0 5 10 15 20

mg

NBV

T/10

0g

Día

NBVT

C-0,5/90PG-6+C-0,5/90

33

Figura 20: Mesófilos aerobios totales en langostinos en atmósfera modificada.

Si se comparan estos resultados con los obtenidos en el ensayo de refrigeración, se observa que a los 10 días de conservación, el lote con extracto de piel y albedo de granada registró valores cercanos a 6 log ufc/g, mientras que en el presente ensayo son de 4,3 log ufc/g en ambos lotes, lo que supone 2 ciclos logarítmicos menos por efecto de la mezcla gaseosa.

- Recuento de Pseudomonas spp. y de organismos productores de H2S Las Figuras 21 y 22 muestran la evolución del grupo de pseudomonas y de los

organismos productores de H2S en atmósfera modificada.

Figura 21: Pseudomonas spp. en langostinos en atmósfera modificada.

01234567

0 5 10 15 20

Log

ufc/

g

Día

Mesófilos aerobios totales

CC-0,5/90PG-6+C-0,5/90

-0,50

0,51

1,52

2,53

3,54

0 5 10 15 20

Log

ufc/

g

Día

Pseudomonas spp.

CC-0,5/90PG-6+C-0,5/90

34

Figura 22: Organismos productores de H2S en langostino en atmósfera modificada.

La combinación de extracto de piel y albedo de granada y Crustaxyl en atmósfera modificada fue efectiva (PG-6+C-0,5/90), evitando el crecimiento de pseudomonas y microorganismos productores de H2S, al contrario que en el estudio de refrigeración. Estos grupos sí que se detectaron en el lote C-0,5/90, a día 13 con un valor de 3,3 log ufc/g y de 4,5 log ufc/g para Pseudomonas ssp. y organismos productores de H2S, respectivamente. Estos microorganismos se encontraron en concentraciones inferiores a las registradas en el ensayo de conservación en refrigeración, especialmente en el caso de Pseudomonas spp.

- Recuento de bacterias totales (15°C) y anaerobias totales La aplicación de la mezcla gaseosa aumentó la fase de latencia de bacterias totales (15°C)

durante la primera etapa de conservación (Figura 23). En ambos lotes comenzó el crecimiento a partir del día 8, donde se pudo observar un aumento acusado, llegando a día 13 al valor más alto de aproximadamente 6 log ufc/g y 5 log ufc/g para el lote C-0,5/90 y PG-6+C-0,5/90 (P≤0.05),respectivamente. El valor final fue similar en ambos ensayos, pero se alcanzó más tarde en atmósfera modificada.

Por otro lado, la evolución de la flora anaerobia (Figura 24) fue semejante a la registrada para el grupo anterior. A pesar de las condiciones de exclusión de O2, esta flora no se detectó en los primeros 8 días de conservación, hasta que alcanzó un valor final en torno a 5 log ufc/g en ambos lotes. Como era de esperar, el recuento de este grupo aumentó en atmósfera modificada en comparación con el estudio en refrigeración. No se detectó durante el estudio la presencia de bacterias sulfito reductoras como C. perfringens.

-1

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20

Log

ufc/

g

Día

Organismos productores de H2S

CC-0,5/90PG-6+C-0,5/90

35

Figura 23: Bacterias totales viables en langostinos en atmósfera modificada.

Figura 24: Bacterias anaerobias totales en langostino en atmósfera modificada.

Cabe destacar que no hubo desarrollo de bacterias lácticas durante toda la conservación, al igual que en el estudio en refrigeración. Tampoco se observó crecimiento de enterobacterias en ambos lotes, mientras que para el estudio en refrigeración si se registró crecimiento de estas en el lote PG-6. El efecto del envasado en atmósfera modificada fue evidente, retrasando el crecimiento en la mayoría de los grupos estudiados hasta el día 8, probablemente debido al efecto bacteriostático del CO2 (Kalleda et al., 2013) y al aumento del efecto gracias a la disminución de la temperatura de almacenamiento en refrigeración (Udayasoorian et al., 2017).

-101234567

0 5 10 15 20

Log

ufc/

g

Día

Bacterias totales (15°C)

CC-0,5/90PG-6+C-0,5/90

-1

0

1

2

3

4

5

6

0 5 10 15 20

Log

ufc/

g

Día

Bacterias anaerobias totales

CC-0,5/90PG-6+C-0,5/90

36

5.3.5 Análisis bioquímico durante la conservación

- Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO) Tal y como se muestra en la Figura 25, la actividad PPO registrada en vísceras fue

notablemente mayor que en caparazón, al igual que en el estudio en refrigeración. El hecho de que en los langostinos la melanosis habitualmente se inicia en el cefalotórax, puede tener relación con su elevada actividad a nivel de la enzima contenida en las vísceras. Por otro lado, al ser un tratamiento por inmersión tan corto, resulta ser menos efectivo en el interior del crustáceo (vísceras y hemolinfa) que en la superficie (cutícula), donde se produce un contacto inmediato. Sin embargo, gracias al envasado en atmósfera modificada, ambos lotes disminuyeron su actividad, en comparación con el estudio previo en refrigeración (P≤0.05).

Figura 25: Evolución de la actividad PPO en caparazón y vísceras de los langostinos en atmósfera modificada.

Al inicio de la conservación, la actividad PPO en el caparazón fue de 30 y 40 U/ml para los lotes PG-6+C-0,5/90 y C-0,5/90 respectivamente, y fueron aumentando hasta día 5 donde comenzaron a disminuir levemente. En cambio, la evolución de la actividad PPO en vísceras aumentó de manera lineal siendo de un valor inicial de 120 U/ml para ambos lotes hasta llegar a día 13 con un valor de 170 y 150 para C-0,5/90 y PG-6+C-0,5/90 respectivamente. Es interesante marcar que mientras que en refrigeración la actividad PPO de los langostinos tratados con Crustaxyl mostraban mayor inhibición que los tratados con extracto de piel y albedo de granada, en este caso sucede al contrario, por lo que la presencia de una atmósfera modificada juega un papel importante, además los valores de actividad son significativamente inferiores (P≤0.05), tanto en caparazón como en vísceras.

Atendiendo a los resultados obtenidos para ambos estudios, se observó que no aparecieron manchas negras en ningún lote conservado en atmósfera modificada, hasta día 8 donde se desarrollaron de manera leve, al contrario que en el lote PG-6 en refrigeración que aparecieron a día 3. Por otro lado, los langostinos conservados en atmósfera modificada se endurecieron ligeramente, a diferencia de los langostinos conservados en refrigeración.

37

El valor de pH fue más elevado, llegando a 8,2 a día 3 en atmosfera modificada y a día 10 en el estudio en refrigeración. En cuanto a los resultados de NBVT, también se encontraron fluctuaciones, registrando un valor de 65 mg/100g a día 10 en refrigeración, mientras que en el estudio combinado se alcanzó este valor a día 14. Teniendo en cuenta los resultados del análisis microbiológico, en el estudio de refrigeración se desarrolló crecimiento de Pseudomonas y de organismos productores de H2S en ambos lotes, mientras que en el presente estudio combinado con atmósfera modificada solo se desarrolló en el lote C-0,5/90. Además, en el lote PG-6 en refrigeración se registró crecimiento de enterobacterias, mientras que en el presente estudio no.

Por último, en ambos ensayos la actividad PPO fue mayor en vísceras que en caparazón, sin embargo, los resultados del lote PG-6+C-0,5/90 disminuyeron bastante en comparación con el lote PG-6. Por otro lado, mientras que los resultados obtenidos de la actividad PPO, tanto en caparazón como en vísceras, fue similar en los lotes C-1/90 y PG-6+C-0,5/90, en el lote C-0,5/90 fue ligeramente superior, probablemente debido a la disminución de la concentración de Crustaxyl, a pesar del efecto positivo del tratamiento en atmósferas modificadas para el resto de parámetros estudiados.

Como era de esperar, el efecto de la mezcla de gases fue efectivo para inhibir la melanosis en ambos lotes, dando lugar a una preservación mejorada hasta día 17 de su calidad y vida útil, al contrario que en el estudio en refrigeración (Udayasoorian et al., 2017).

38

6 CONCLUSIONES o La concentración más adecuada de Crustaxyl para inhibir la melanosis en langostino

austral es de 1% en solución durante un tiempo de tratamiento de 60 segundos, a pesar de que puede superar el límite máximo establecido de 4-hexilresorcinol en la parte comestible (2mg/kg) a lo largo del periodo de conservación.

o El uso individual de extracto de piel y albedo de granada como antimelanósico natural no fue suficiente para inhibir la melanosis durante el almacenamiento en refrigeración.

o El envasado en atmósfera modificada combinado con un tratamiento de Crustaxyl al 0,5 % en solución, con o sin extracto de piel y albedo de granada, fue efectivo para inhibir la melanosis en los langostinos tratados durante 18 días.

o El envasado en atmósfera modificada disminuyó considerablemente el crecimiento de microrganismos en los lotes estudiados, siendo mejor el que contenía el extracto de piel y albedo de granada.

o La actividad PPO fue ligeramente mayor en el lote con Crustaxyl al 0.5 % del estudio en atmósfera modificada, en comparación con el lote con Crustaxyl al 1% en refrigeración. El Crustaxyl al 0,5 % más el extracto de piel y albedo de granada en atmosfera modificada fue el tratamiento más efectivo para inhibir la PPO.

o El envasado en atmósfera modificada combinado con un tratamiento de Crustaxyl al 0,5 % en solución, con o sin extracto de piel y albedo de granada, dio lugar a una mayor vida útil de los langostinos tratados (alrededor de 15 días) en comparación con el Crustaxyl al 1 % sin atmósfera modificada (10 días).

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