UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS TERMODINÁMICO DE LOS

COMPLEJOS DE INCLUSIÓN ÁCIDO FERÚLICO-

CICLODEXTRINAS

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE:

M. EN C. PRODUCTOS NATURALES Y ALIMENTOS

PRESENTA:

I.A. ARMANDO TORRALBA GONZÁLEZ

DIRECTORA DE TESIS:

DRA. EDITH GRACIELA GONZÁLEZ MONDRAGÓN

CO-DIRECTOR:

DR. RAFAEL ARTURO ZUBILLAGA LUNA

Huajuapan de León Oaxaca, México, Noviembre 2014

I

El presente trabajo fue realizado en las Instalaciones

de la Universidad Tecnológica de la Mixteca, así

como en la Universidad Autónoma Metropolitana-

Unidad Iztapalapa.

Para la realización del trabajo se contó con el apoyo

económico de CONACyT para Armando Torralba

González a través de la beca de maestría y beca

mixta, con número de registro 288504, y para el

proyecto 181049. Parcialmente por el PROMEP, de

la Secretaría de Educación Pública, con clave

UTMIX-PTC-037. De la empresa WACKER

Mexicana S.A. de C.V. con la donación de las

ciclodextrinas comerciales grado alimenticio.

II

AGRADECIMIENTOS

Por medio de estas líneas quiero agradecer a todas las personas que ayudaron

directa e indirectamente en la realización de este proyecto.

Al Posgrado de Productos Naturales y Alimentos por su contribución a mi

formación como Maestro en Ciencias, por su disponibilidad en asesorías, por facilitar en

tiempo y forma el proceso de titulación.

Al Área de Biofisicoquímica de Proteínas del Departamento de Química de la

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa por el apoyo proporcionado

durante mi estancia para la realización de la parte experimental del proyecto de tesis. Así

mismo agradecer a los compañeros que ahí se encuentran por compartir sus

conocimientos y por hacer de esa estancia una agradable experiencia.

Quiero expresar también mi más sincero agradecimiento al comité revisor

conformado por la Dra. Edith G. González Mondragón, la Dra. Araceli Vega Paz, la M.

en C. Alma Y. Salazar Govea, el Dr. Rafael A. Zubillaga Luna y el Dr. Vania S.

González Robles por tomarse el tiempo para la revisión, discusión y análisis del

documento de tesis durante el desarrollo del proyecto.

A la empresa WACKER Mexicana S.A. de C.V. por la donación de las

ciclodextrinas comerciales grado alimenticio.

A la Dra. Edith González Mondragón por su aporte invaluable no solamente en la

realización del proyecto, sino también en mi formación como estudiante, como trabajador

y como persona.

Al Dr. Rafael A. Zubillaga Luna por aceptarme como su estudiante, por guiar y

realizar importantes aportes al proyecto, por brindarme la confianza y el conocimiento en

el manejo de los equipos de calorimetría de titulación isotérmica así como el de

espectrofotómetro de fluorescencia, y sobre todo por mostrarme que la investigación no

está desvinculada de la convivencia y sana diversión.

Debo agradecer de manera especial a la Dra. Araceli Vega Paz por facilitar los

medios para que se llevara a cabo la experimentación con las técnicas de calorimetría

diferencial de barrido y termogravimetría. También por la asesoría en el análisis de los

resultados y discusión de los mismos.

Al Dr. Ponciano García Gutiérrez por sus charlas amenas y por darse el tiempo

para enseñarme el uso de software mediante el cual se obtuvo la simulación

computacional (docking).

Al M. en C. Atilano Gutiérrez Carrillo adscrito al Laboratorio de RMN de la

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa por el apoyo, la orientación y

por tomarse el tiempo para analizar y establecer las mejores condiciones para llevar a

cabo la experimentación de RMN de los complejos con ciclodextrinas. Además por

compartir su amplia experiencia en el tema.

Así mismo mi agradecimiento al Dr. Domingo Salazar Mendoza por siempre ser

accesible al préstamo del uso de sus equipos de laboratorio y de material didáctico.

Al Dr. Vania por facilitarme el uso del laboratorio de Biotecnología para poder

realizar parte de la experimentación del presente proyecto.

A Francisco Gómez Castillo por su apoyo en el préstamo de material y equipo de

laboratorio.

III

DEDICATORIA

Hoy puedo ver alcanzada esta meta en gran parte por ustedes, ya que siempre

estuvieron motivándome a lo largo de este proceso. Gracias por su aliento, comprensión,

consejos y su amor infinito.

A mis padres, María Antonieta y Armando

A mis hermanos, Eduardo y Miguel

A ti por ser mi musa, mi fuente de energía, de sabiduría, calma y consejo en todo

momento.

Dani

Por su compañía a través de mensajes, sus palabras y la mejor vibra del mundo.

Gracias mans!

Stefi, Karla, Andrea, Eréndira, Erick, Iván y

Omar

Mil palabras no bastarían para agradecerles su apoyo, su energía y sus consejos en

cada momento de mi vida.

Mandos

IV

CONTENIDO

ÍNDICE DE FIGURAS VII

ÍNDICE DE TABLAS VIII

ABREVIATURAS IX

RESUMEN 1

I. MARCO TEÓRICO 2

1.1. ÁCIDO FERÚLICO 2

1.1.1. ESTRUCTURA QUÍMICA, PROPIEDADES

FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS DEL ÁCIDO

FERÚLICO

3

1.1.2. IMPORTANCIA DEL ÁCIDO FERÚLICO EN

ALIMENTOS

5

1.2. CICLODEXTRINAS ALFA, BETA Y GAMA 7

1.2.1. PAPEL BIOLÓGICO, ESTRUCTURA QUÍMICA,

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS E INOCUIDAD

7

1.2.2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS 10

1.2.3. IMPORTANCIA DEL USO DE LAS αCD, βCD Y γCD

EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS

14

1.2.4. MÉTODOS DE ACOMPLEJAMIENTO EMPLEANDO

CICLODEXTRINAS

16

1.2.5. TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA

CARACTERIZACIÓN DE LA FORMACIÓN DE

COMPLEJOS CON CICLODEXTRINAS

17

1.2.5.1. ANÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE

COMPLEJOS

18

1.2.5.1.1. ESPECTROSCOPÍA DE

INFRARROJO

18

1.2.5.1.2. CALORIMETRÍA DIFERENCIAL

DE BARRIDO Y

TERMOGRAVIMETRÍA

19

1.2.5.1.3. DIAGRAMAS DE

SOLUBILIDAD DE FASES

21

1.2.5.2. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL

PROCESO EN LA FORMACIÓN DE

COMPLEJOS

23

1.2.5.2.1. CALORIMETRÍA DE

TITULACIÓN ISOTÉRMICA

23

1.2.5.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE

FLUORESCENCIA

24

1.2.5.3. EFECTO DEL ESTADO DE

PROTONACIÓN EN EL

ACOMPLEJAMIENTO CON

CICLODEXTRINAS

26

1.2.5.3.1. SIMULACIÓN

COMPUTACIONAL (DOCKING)

26

V

II. ESTADO DEL ARTE 28

2.1. FORMACIÓN DEL COMPLEJO ÁCIDO FERÚLICO-

CICLODEXTRINA Y SU ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL

29

2.2. ANÁLISIS DE LA ENERGÉTICA DEL PROCESO DE

ACOMPLEJAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON LAS

CICLODEXTRINAS

31

III. JUSTIFICACIÓN 35

IV. HIPÓTESIS 37

V. OBJETIVOS 38

5.1. OBJETIVO GENERAL 38

5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 38

VI. MATERIALES Y MÉTODOS 39

6.1. PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES DE ÁCIDO

FERÚLICO Y DE LAS CICLODEXTRINAS, EMPLEANDO UN

MISMO DISOLVENTE

39

6.2 OBTENCIÓN DE LOS COMPLEJOS SÓLIDOS DE ÁCIDO

FERÚLICO-CICLODEXTRINA

41

6.3. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LOS

COMPLEJOS DE ÁCIDO FERÚLICO-CICLODEXTRINA

41

6.3.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO 41

6.3.2. TERMOGRAVIMETRÍA Y CALORIMETRÍA

DIFERENCIAL DE BARRIDO

42

6.3.3. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASES AF-CD 42

6.4. ENERGÉTICA DEL PROCESO DE ACOMPLEJAMIENTO DEL

ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS

42

6.4.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA 42

6.4.2. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 43

6.5. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF EN EL

PROCESO DE ACOMPLEJAMIENTO CON

CICLODEXTRINAS

45

6.5.1. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 45

6.5.2. SIMULACIÓN DEL ACOPLAMIENTO

MOLECULAR (DOCKING)

45

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 47

7.1. SOLUBILIZACIÓN A HOMOGENEIDAD DEL ÁCIDO

FERÚLICO Y DE LAS CICLODEXTRINAS, EN UN

DISOLVENTE COMÚN

47

7.2. CONFIRMACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO AF-

CD

48

7.2.1. ESPECTROS DE INFRAROJO 48

7.2.2. TERMOGRAMAS DE TERMOGRAVIMETRÍA Y

CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO

51

7.2.3. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASES 54

7.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DE LA FORMACIÓN DEL

COMPLEJO

55

7.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA 55

VI

7.3.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA 58

7.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE

LA AFINIDAD DE ACOMPLEJAMIENTO

62

7.4.1. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA 62

7.4.2. SIMULACIÓN COMPUTACIONAL (DOCKING) 67

VIII. CONCLUSIONES 70

IX. PERSPECTIVAS 72

X. REFERENCIAS 74

VII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ácido ferúlico unido por enlace ester con lignina y un polisacárido. 3

Figura 2. Isómeros de la molécula de ácido ferúlico: (A) trans y (B) cis. 3

Figura 3. Estados de protonación que presenta el AF en disolución a pH 4.0, 7.0 y

9.0.

4

Figura 4. Estabilización por resonancia del radical de ácido ferúlico. 5

Figura 5. Estructura química de las alfa, beta y gama ciclodextrinas. 7

Figura 6. Disposición estructural de los hidroxilos primarios y secundarios en las

ciclodextrinas.

8

Figura 7. Posibles formas de inclusión de la molécula huésped en las

ciclodextrinas.

11

Figura 8. Tipología de los diagramas de solubilidad de fases. 22

Figura 9. Metodología realizada para el análisis de la formación de los

complejos AF-CD así como de la energética del proceso de su

acomplejamiento.

39

Figura 10. Comparación de los espectros de IR. 49

Figura 11. Comparación de los termograma de TGA. 51

Figura 12. Comparación de los termograma de CDB. 53

Figura 13. Diagrama de solubilidad de fases del ácido ferúlico en presencia de

αCD (●), βCD (■) y γCD (♦).

54

Figura 14. Titulaciones calorimétricas isotérmicas del AF con αCD (A), βCD (B) y

γCD (C).

56

Figura 15. (A) Espectros de emisión de fluorescencia del AF durante la titulación

fluorométrica con αCD, βCD y γCD a pH 9.0. (B) CME del AF al inicio

y al final de la titulación fluorométrica con la αCD, βCD y γCD.

59

Figura 16. Curvas de titulación fluorométrica del AF con la αCD (●), βCD (■) y

γCD (♦) a pH 9.0.

61

Figura 17. (A) Espectros de emisión de fluorescencia del AF con carga 1- durante

la titulación fluorométrica con αCD, βCD y γCD a pH 7.0. (B) CME del

AF al inicio y al final de la titulación fluorométrica con la αCD, βCD y

γCD, a los pHs 7.0 y 4.0.

63

Figura 18. Curvas de titulación fluorométrica del AF con la αCD (●), βCD (■) y

γCD (♦) a pH 7.0 (A) y pH 4.0 (B).

65

Figura 19. Estructuras en 3D de los complejos AF-αCD (A), AF-βCD (B) y AF-

γCD (C).

68

VIII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Características fisicoquímicas de las ciclodextrinas. 9

Tabla 2. Constantes de acomplejamiento de algunos saborizantes incluidos en

αCD y βCD.

15

Tabla 3. Análisis espectroscópico por IR de la formación de complejos entre

algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas por vía enzimática y

química.

18

Tabla 4. Análisis por calorimetría diferencial de barrido de la formación de

complejos entre algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas por

vía enzimática y química.

20

Tabla 5. Análisis por termogravimetría de la formación de complejos entre

algunos compuestos con ciclodextrinas.

20

Tabla 6. Estudios de solubilidad de fases de algunos compuestos acomplejados

con ciclodextrinas.

22

Tabla 7. Parámetros termodinámicos obtenidos por CTI del proceso de

acomplejamiento entre algunos compuestos con las ciclodextrinas

naturales.

24

Tabla 8. Análisis por espectroscopía de fluorescencia de la formación de

complejos entre algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas por

vía enzimática y química.

26

Tabla 9. Técnicas utilizadas para el estudio de las propiedades

termodinámicas y estructurales de los complejos formados entre el

ácido ferúlico con las CDs naturales y sintetizadas químicamente.

28

Tabla 10. Solubilidad del AF y las CDs empleando diferentes disolventes. 47

Tabla 11. Permanencia o desaparición de las bandas características del AF libre y

acomplejado con la αCD, βCD y γCD.

49

Tabla 12. Temperaturas y porcentajes de pérdidas de peso obtenidos a partir de

los termogramas de TGA del AF, la αCD, βCD y γCD así como de los

complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.

51

Tabla 13. Temperaturas de las transiciones conformacionales obtenidas a partir de

los termogramas de CDB del AF, la αCD, βCD y γCD, así como de los

complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.

53

Tabla 14. Cálculo de la Ks para el acomplejamiento del AF con las CDs naturales. 55

Tabla 15. Parámetros termodinámicos de la formación de los complejos AF-αCD,

AF-βCD y AF-γCD obtenidos por CTI.

56

Tabla 16. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los complejos

αCD-AF, βCD-AF y γCD-AF.

62

Tabla 17. Valores de la Ka y de la ΔGa obtenidos por titulación fluorométrica de la

formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD a pH 9.0, 7.0

y 4.0.

65

Tabla 18. Puntuaciones de ΔGa de los complejos αCD-AF, βCD-AF y γCD-AF a

distintos estados de protonación del AF (0 y 1-).

67

IX

ABREVIATURAS

AF Ácido ferúlico

CDs Ciclodextrinas

αCD Alfa ciclodextrina

βCD Beta ciclodextrina

γCD Gama ciclodextrina

AF-CD Complejo Ácido ferúlico-Ciclodextrina

AF-αCD Complejo Ácido ferúlico-Alfa ciclodextrina

AF-βCD Complejo Ácido ferúlico-Beta ciclodextrina

AF-γCD Complejo Ácido ferúlico-Gama ciclodextrina

Ka Constante de acomplejamiento

Ks Constante de solubilidad ΔGa Energía libre de Gibbs de acomplejamiento

ΔHa Entalpía de acomplejamiento

ΔSa Entropía de acomplejamiento

CTI Calorimetría de titulación isotérmica

CDB Calorimetría diferencial de barrido

TGA Termogravimetría

IR Infrarojo

1

RESUMEN

En el presente trabajo se acomplejó al ácido ferúlico (AF) con las ciclodextrinas (CDs)

naturales αCD, βCD y γCD; todas las moléculas fueron solubilizadas en fosfatos 50 mM,

pH 9.0. La formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD, se comprobó

mediante un análisis comparativo de las moléculas libres con respecto a los complejos

formados empleando las técnicas de calorimetría diferencial de barrido (CDB), Infrarojo

(IR), termogravimetría (TGA) y diagramas de solubilidad de fases. Además, se empleó

por primera vez la técnica de calorimetría de titulación isotérmica (CTI) para el estudio

de la energética del proceso de acomplejamiento del AF con la αCD, βCD y γCD,

obteniendo de manera directa los valores de la entalpía (ΔHa), la constante de equilibrio

(Ka) así como de la estequiometria (n); y mediante relaciones termodinámicas, se

calcularon los parámetros de acomplejamiento ΔGa (energía libre de Gibbs) y ΔSa

(entropía). La espectroscopía de fluorescencia se utilizó como técnica comparativa para

obtener Ka y ΔGa. Estos parámetros también fueron determinados empleando la titulación

fluorométrica y variando la carga del AF (0, 1- y 2

-). Además, se realizó una simulación

del acoplamiento molecular (docking) para evaluar el efecto del AF con carga 0 y 1-, en el

valor de la ΔGa. Los resultados mostraron que en la condiciones experimentales usadas el

AF se introdujo en la cavidad de la αCD, βCD y γCD, observándose cambios o

desaparición de bandas (espectros de IR), picos (termogramas de CDB) y pendientes

(termogramas de TGA) característicos de algunos grupos funcionales de las moléculas

libres, así como un incremento en la solubilidad del AF. Por otro lado, los valores

negativos de la ΔHa y ΔGa indicaron que la formación de los complejos fue exotérmica y

espontánea, y que el proceso del acomplejamiento fue entrópicamente favorecido para la

βCD y la γCD, pero no para la αCD. Además, que la afinidad del acomplejamiento fue en

el siguiente orden βCD>γCD>αCD, lo cual se corroboró con los resultados de la

espectroscopía de fluorescencia. El efecto del estado de protonación del AF provocó

cambios en la Ka, mostrando que la carga 1- generó valores más negativos de ΔGa en el

acomplejamiento con las tres CDs naturales estudiadas. Los órdenes de afinidad para el

AF con carga 0 y 2- fueron βCD>γCD>αCD, y con carga 1

- βCD>αCD>γCD. Por otro

lado, el análisis por docking generó las posibles estructuras en 3D de los complejos AF-

CD, mostrando que el AF se introdujo en las tres CDs con la misma orientación, en

donde el anillo del benceno se ubicó en el centro de la cavidad, el ácido carboxílico

interaccionó con la entrada más ancha de la CD, mientras que el alcohol y el grupo

metoxilo se encontraron en contacto con la entrada más angosta; y en el caso del

acomplejamiento con la αCD la molécula del AF quedo más expuesta al disolvente con

respecto a las otras dos CDs. Los valores de la ΔGa obtenidos del análisis por docking

indicaron que la carga del AF no influyó en la afinidad del acomplejamiento, contrario a

lo observado con los resultados experimentales; esto pudo deberse a que no se

consideraron las moléculas de agua en la simulación de docking, las cuales pueden tener

un papel muy importante en las interacciones que se forman durante el proceso de

acomplejamiento, o contribuir de manera significativa en el valor de la ΔS de

desolvatación. En base a los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede concluir

que las condiciones experimentales establecidas permitieron utilizar la técnica de CTI

para determinar los parámetros termodinámicos de manera confiable, además que la βCD

sería la más recomendada para acomplejar al AF, independientemente de su carga, en

base al orden de afinidad observado (βCD>γCD>αCD).

2

I. MARCO TEÓRICO

En esta sección se presenta información sobre la estructura química, las

propiedades fisicoquímicas y biológicas tanto del ácido ferúlico (AF) como de la αCD,

βCD y γCD. También se muestra la importancia de estas moléculas en la industria

alimentaria. Por último, se expone información sobre algunas de las técnicas más

utilizadas para la obtención de complejos utilizando ciclodextrinas (CDs), y para el

análisis de la energética del proceso de formación de dichos compuestos.

1.1. ÁCIDO FERÚLICO

Actualmente existe un gran interés sobre la ingesta de compuestos polifenólicos

debido a que se les ha conferido un efecto positivo en la salud de los consumidores (El

Gharras, 2009). Estos compuestos se encuentran ampliamente distribuidos en el reino

vegetal y provienen del metabolismo secundario de las plantas aportándoles aromas,

sabores o coloraciones característicos y/o como mecanismo de defensa (Cheynier, 2005).

Se les ha clasificado en ácidos fenólicos (ácido hidroxibenzoico e hidroxicinámico),

flavonoides (flavonoles, flavanoles flavonas, flavononas, isoflavonas, proanticianidinas),

estilbenos y ligninas (Manach, Williamson, Morand, Scalbert & Rémésy, 2005).

El ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico), es un compuesto que

pertenece al grupo de los ácido fenólicos y se sintetiza bioquímicamente por la vía

metabólica del ácido shikímico en la ruta de los fenilpropanoides (Dewick, 2002). Se

encuentra localizado en la pared celular de las plantas unido por un enlace éster a algunos

polisacáridos, derivados glicosilados o ésteres de los ácidos quínico, shikímico y tartárico,

formando de este modo parte de una estructura compleja (Figura 1) (Saulnier & Thibault,

1999; Harris & Trethewey, 2010); por ejemplo, en los granos de cereal el AF es el más

abundante y se encuentra unido a los arabinoxilanos de la pared celular (El Gharras,

2009). La concentración de AF varía dependiendo del material vegetal, en granos de trigo

la concentración puede ser de 5 g/kg, en azúcar de remolacha 9 g/kg, en los granos de

maíz 5 g/kg y los granos de arroz contienen del 1.5 al 2.8% de este ácido (Ou et al.,

2007).

3

Figura 1. Ácido ferúlico unido por enlace éster con lignina y un

polisacárido (Buranov & Mazza, 2009).

Para liberar al AF de la pared celular se utilizan métodos químicos o enzimáticos,

en los primeros se lleva a cabo una hidrólisis con ácidos o bases concentrados (2N)

(Kumar & Pruthi, 2014); en el segundo caso se utiliza a la feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73)

producida principalmente por hongos, siendo más eficiente esté último método, Xiros et

al. (2009) lograron recuperar el 80% de AF a partir de bagazo de cereales utilizados en la

producción de cerveza, usando a la enzima producida por Fusarium oxysporum.

1.1.1. ESTRUCTURA QUÍMICA, PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y

BIOLÓGICAS DEL ÁCIDO FERÚLICO

La estructura base de la molécula del AF corresponde al ácido cinámico, donde el

anillo bencénico esta hidroxilado en la posición para- y oxigenado en la posición meta-,

con respecto al enlace vinílico unido a un grupo carboxílico. Esta disposición de los

sustituyentes en el benceno hace que la molécula sea altamente conjugada (Figura 2).

Figura 2. Isómeros de la molécula de ácido ferúlico: (A) trans y (B) cis.

El AF tiene una masa molar de 194.18 g/mol y punto de fusión de 174 °C, es

fotosensible, termoestable, posee un sabor muy astringente y amargo (Zhao &

A

8.96 Å

5.98 Å

B

4

Moghadasian, 2008). Es un ácido dibásico debido a que en solución acuosa tiene la

capacidad de desprender dos protones; la primera desprotonación produce un anión

carboxilato y la segunda genera el anión fenolato (Figura 3), con valores de pKa de 4.29 y

8.75, respectivamente (Goldberg, Lang, Selig & Decker, 2011).

Figura 3. Estados de protonación que presenta el AF en disolución a pH

4.0, 7.0 y 9.0.

Los porcentajes de las cargas mostradas en la figura anterior fueron obtenidos

mediante la siguiente ecuación para el grado de desprotonación σ (0< σ <1) (Karshikoff,

2006):

σ =

Ec. 1

La molécula de AF fluoresce con longitudes de onda máximas de excitación y

emisión de 310 nm y 330 nm, respectivamente (Zhang, Li, Jia, Chao & Zhang, 2009). En

solución acuosa a pH 6.0 (configuración trans-) este compuesto es capaz de absorber luz

en la región del ultravioleta presentado dos máximos de absorción a los 284 nm (log ԑ =

4.18) y 307 nm (log ԑ = 4.19) (Graf, 1992). Es altamente soluble en metanol, etanol y

acetato de etilo; moderadamente soluble en éter, y presenta muy baja solubilidad con

benceno, éter de petróleo y agua (0.69 mg/mL). El AF recuperado de plantas usualmente

se encuentra como el isómero trans-, y una vez disuelto en agua después de dos semanas

a temperatura ambiente solamente el 23% cambia a la forma cis- (Graf, 1992). Con la

finalidad de incrementar la solubilidad del AF en disolventes acuosos, Kikugawa,

Tsuchiyama, Kai & Sakamoto (2012) esterificaron al AF con diglicerol, empleando un

proceso enzimático, lo que no afectó su actividad antioxidante así como su propiedad

para absorber luz UV, y lograron una solubilidad de 980 mg/mL. También se ha estudiado

pH 4.0

Carga 0: 66.1%

Carga 1-: 33.9 %

pH 7.0

Carga 1-: 98.3%

Carga 2-: 1.7 %

pH 9.0

Carga 1-: 36%

Carga 2-: 64 %

5

la inclusión del AF en CDs, este método es muy prometedor debido a que la formación de

los complejos le brinda a la molécula huésped estabilidad y mayor solubilidad en

disolventes acuosos.

Los compuestos polifenólicos poseen varias propiedades biológicas; en el caso del

AF puede actuar como antioxidante cediendo el hidrógeno de su grupo hidroxilo para

neutralizar a los radicales libres, produciéndose el radical fenoxilo que tiene la capacidad

de deslocalizar al electrón por resonancia confiriéndole de este modo estabilidad a la

molécula, lo cual se esquematiza en la figura 4 (Tsuchiyama, Sakamoto, Fujita, Murata &

Kawasaki, 2006). También se reportó que no es un compuesto mutagénico y que además

mostró actividad antimutagénica del 50% contra 5NFAA [ácido-3-(5-nitro-2-furil)-

acrílico] y azida de sodio (Birošová, Mikulášová & Vaverková, 2005). De igual modo, se

le ha conferido al AF actividad antiinflamatoria, antitrombótica y anticancerígena (Fujita

et al., 2008; Ramar et al., 2012; Urbaniak, Szela & Marcin, 2013).

Figura 4. Estabilización por resonancia del radical de ácido ferúlico

(Graf, 1992).

1.1.2. IMPORTANCIA DEL ÁCIDO FERÚLICO EN ALIMENTOS

Se sabe que el AF se absorbe en el tracto digestivo para que pueda ser

metabolizado (Bourne & Rice-Evans, 1999). El AF presenta baja toxicidad a una dosis

letal media (DL50) de 2,113 mg/kg en ratas (Tada, Tayama & Aoki, 1999).

El AF en el área de alimentos ha sido utilizado como precursor en la producción

de la vainillina, como aditivo alimentario ya sea por su función antioxidante o

antimicrobiana, o como ingrediente para la formulación de alimentos funcionales (Ou &

Kwok, 2004).

Tal es la importancia del AF que se han generado patentes para su producción

6

(Satya & Jasmine, 2008), o su uso como materia prima para producir vainillina mediante

procesos enzimáticos (Funk & Brodelius, 1992; Rosazza, Huang, Dostal, Volm &

Rousseau, 1995; Westcott, Cheetham & Barraclough, 1993; Ramachandra Rao &

Ravishankar, 2000; Priefert, Rabenhorst & Steinbuchel, 2001; Overhage, Steinbüchel &

Priefert, 2003; Ali et al., 2008; Rui Zhou et al., 2014).

Por otro lado, como antioxidante el AF a dosis de 5 y 10 μM mostró ser más

eficaz en la inhibición de la oxidación de lípidos y proteínas, con respecto al ácido gálico,

galato de propilo, ácido cafeico, malvidina, delfinidina, catequina, epicatequina, rutina o

quercetina (Heinonen et al., 1998).

Como agente antimicrobiano, fue capaz de inhibir el crecimiento de bacterias,

hongos, y levaduras (Lattanzio, De Cicco, De Venere, Lima & Salerno, 1994). Como

conservador, se estudió también el efecto del AF en la inhibición de la enzima polifenol

oxidasa así como en la carga microbiana en camarones (Litopenaeus vannamei),

empleando soluciones de AF al 1 y 2% (w/v), almacenándolos en hielo durante 10 días.

Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones mencionadas, el AF fue

capaz de inhibir la actividad de la polifenol oxidasa, así mismo, se observó una

disminución en el crecimiento de bacterias mesofilas y psicrófilas, Estos resultados

fueron comparables con los observados cuando se usó metabisulfito de sodio al 1.25 %

(Nirmal & Benjakul, 2009).

El uso del AF fue aprobado en Japón como aditivo alimentario, y en Europa y

Estados Unidos fue legislada su aplicación como antioxidante en bebidas por parte la

FDA (Graf, 1992). Se ha observado que el AF en los alimentos es menos afectado por los

cambios de pH en comparación con otros ácidos fenólicos, tales como el clorogénico,

cafeico y gálico (Friedman & Jürgens, 2000). En el tema de los alimentos funcionales,

existen patentes de la formulación de alimentos suplementados con AF para prevenir y

corregir situaciones de hipertensión (Atsushi, Ryuji & Ichiro, 2006; Atsushi et al., 2008).

También, es ampliamente utilizado como una sustancia ergogénica en alimentos

deportivos debido a que es un potente antioxidante y estimula la secreción de hormonas

(Ou & Kwok, 2004).

Por todo lo señalado, el AF es una molécula de interés motivo por el cual

actualmente se está realizando investigación para su recuperación a partir de fuentes

7

naturales y desechos agroindustriales como el salvado de trigo utilizado para la

producción de aceite en el Reino Unido (Charalampopoulos, 2014), el agua generada en

el proceso de nixtamilización (Asaff, 2010) y a partir de pulpa de remolacha (López et al.,

2011).

1.2. CICLODEXTRINAS ALFA, BETA Y GAMA

1.2.1. PAPEL BIOLÓGICO, ESTRUCTURA QUÍMICA, PROPIEDADES

FISICOQUÍMICAS E INOCUIDAD

En la naturaleza algunos microorganismos aseguran su fuente de carbono y

energía excretando al medio ambiente a la enzima ciclodextrinaglucosil transferasa (EC

2.4.1.19), la cual sintetiza moléculas de CDs usando como sustrato al almidón,

posteriormente, las CDs son internalizadas al microorganismo a través de una proteína de

unión específica, y una vez dentro, son degradas hasta maltosa o glucosa por la enzima

ciclomaltodextrinasa (EC 3.2.1.54) (Hashimoto, Yamamoto, Fujiwara, Takagi & Imanaka,

2001). Las CDs, también conocidas como cicloamilosas, ciclomaltosas o dextrinas de

Schardinger, son oligosacáridos cíclicos que constan de seis (αCD), siete (βCD) u ocho

(γCD) unidades de glucopiranosa (Figura 5) unidas por enlaces α-(1,4) (Brewster &

Loftsson, 2007; Palem, Chopparapu, Subrahmanyam & Yamsani, 2012; Kurkov &

Loftsson, 2013).

Figura 5. Estructura química de las alfa, beta y gama ciclodextrinas.

Estructuralmente, las CDs tienen forma de un cono truncado con una cavidad

hidrofóbica mientras que la parte exterior es hidrofílica, originada por la conformación de

8

silla que presentan las unidades de las glucopiranosas. Además, poseen dos aberturas en

los extremos de la molécula, donde una es más amplia que la otra debido a la disposición

de los grupos hidroxilos primarios y secundarios (Vyas, Saraf & Saraf, 2008).

La disposición que presentan los hidroxilos primarios (hidroxilos unidos al

carbono que no forma parte del anillo de glucosa) hace que tengan una rotación libre lo

que ocasiona una reducción en el diámetro efectivo de la cavidad (Figura 6). Por otra

parte, los hidroxilos secundarios (hidroxilos unidos al anillo de glucosa) permiten que se

forme un mayor tamaño de la cavidad porque no tienen una rotación libre (Astray,

Gonzalez-Barreiro, Mejuto, Rial-Otero & Simal-Gándara, 2009).

Figura 6. Disposición estructural de los hidroxilos primarios y

secundarios en las ciclodextrinas.

En la cavidad más estrecha de la βCD, se pueden llegar a formar puentes de

hidrógeno intramoleculares los cuales le confieren rigidez a la molécula, como es el caso

del hidroxilo unido al carbono 2 de una unidad de glucopiranosa que puede formar un

puente de hidrógeno con el hidroxilo del carbono 3 de la unidad de glucopiranosa

adyacente, esto posiblemente da origen a la baja solubilidad de la βCD (Naidoo, Chen,

Jansson, Widmalm & Maliniak, 2004). En la cavidad de la αCD los puentes de hidrógeno

formados no son los suficientes para conferirle una rigidez como la presentada por las

βCDs, esto se debe a que una unidad de glucopiranosa está en una posición distorcionada.

Por lo anterior, únicamente se generan cuatro de los seis posibles puentes de hidrógeno

que pueden formarse. Por su parte la γCD cuenta con una estructura no coplanar, que le

confiere más flexibilidad que las otras dos CDs, por lo que es la más soluble (Steed &

Atwood, 2000).

Algunos estudios espectroscópicos han demostrado la distorsión de la

9

conformación molecular de las αCD y γCD, y la simetría de la estructura de la βCD, tanto

en solución acuosa como en el estado cristalino (Astray et al., 2009). La solubilidad de

las CDs es más baja con respecto a los azúcares acíclicos, debido a su entalpía de

disolución desfavorable (más positiva) y a su entropía de disolución favorable (menos

positiva) (Astray et al., 2009). En la tabla 1 se enlistan algunas de las características

fisicoquímica de las CDs naturales.

Tabla 1. Características fisicoquímicas de las ciclodextrinas.

Características αCD βCD γCD

Unidades de glucopiranosa 6 7 8

Masa molar (g/mol) 972 1135 1297

Solubilidad en agua (g/L)

20 ºC 90 16.4 185

25 ºC 127 18.8 256

35 ºC 204 28.3 390

Diámetro exterior (Å) 14.6 15.4 17.5

Diámetro de la cavidad (Å) 4.7-5.3 6.0-6.5 7.5-8.3

Altura del cono (Å) 7.9 7.9 7.9

Volumen de la cavidad (Å3) 174 262 427

ΔHo de solución (kJ/mol) 32.1 34.7 32.2

ΔSo de solución (J/molK) 57.7 48.9 61.4

Agua (% en peso) 10.2 13.2-14.5 8.13-17.7

pKa (método potenciometrico a 25 ºC) 12.33 12.20 12.08

(Steed & Atwood, 2000; Del Valle, 2004; Cal & Centkowska, 2008)

Como puede observarse (Tabla 1), existe una relación directamente proporcional

entre el número de unidades de glucopiranosas con el aumento del diámetro interno y

externo, de la masa molar así como del volumen de la cavidad de las CDs. También hay

variación en la ΔS° siendo mayor para la γCD. La altura de las CDs es la misma para las

tres; los valores de la ΔH° de solución y pKa, son similares.

Respecto a la degradación en el organismo humano de las tres CDs naturales, se

estableció que tanto la αCD como la βCD son metabolizadas mediante un proceso de

fermentación en el colon por medio de Bacteroides (Antenucci & Palmer, 1984); y en el

caso de la γCD se degradada por acción de la α-amilasa pancreática de la saliva (John

10

Marshall & Miwa, 1981; Kurkov & Loftsson, 2013). Las CDs no son tóxicas y estan

consideradas como compuestos GRAS (de sus siglas en inglés Generally Recognized as

Safe) (Steed & Atwood, 2000; Munin & Edwards-Lévy, 2011). Bellringer, Smith, Read,

Gopinath & Olivier (1995) determinaron que el efecto tóxico de la βCD se presenta arriba

de los 0.7-0.8 g/kg/día en ratas y aproximadamente 2 g/kg/día en perros.

La situación reglamentaria respecto a la inocuidad de las CDs difiere entre países,

en los Estados Unidos las αCD, βCD y γCD se consideran sustancias GRAS desde 1998;

en Japón son reconocidas como productos naturales por lo que su comercialización en el

sector de la alimentación está restringida sólo por su pureza. Otros países como Nueva

Zelanda y Australia clasificaron a la αCD y la γCD como alimentos nuevos, esto en los

años 2003 y 2004, respectivamente (Cravotto, Binello, Baranelli, Carraro & Trotta, 2006).

La CD más utilizada en la industria alimentaria ha sido la βCD, para la cual la

recomendación por parte de un comité mixto FAO-OMS fue de una ingesta de 5 mg/kg

por día (Szente & Szejtli, 2004). Por otro lado, la Norma emitida por el Codex

Alimentarius para la βCD establece que la cantidad máxima permitida en aperitivos a

base de patatas y en bebidas a base de agua es de 500 mg/kg, en pastas o fideos

precosidos no debe exceder 1 mg/kg, y finalmente, en gomas de mascar su incorporación

no debe ser mayor de los 20 mg/kg (FAO, 2014). Para la αCD y la γCD aún no se han

establecido las normas correspondientes.

1.2.2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS

Las CDs tienen la capacidad de formar complejos de inclusión (anfitrión-huésped)

con una variedad de compuestos tanto sólidos, líquidos como gaseosos, tales como:

alifáticos de cadena lineal o ramificada, aldehídos, cetonas, alcoholes, ácidos orgánicos,

ácidos grasos, compuestos aromáticos, gases y compuestos polares tales como halógenos

y aminas (Del Valle, 2004). La αCD por lo general sólo puede acomplejar moléculas de

bajo peso molecular o compuestos con cadenas laterales alifáticas, la βCD forma

complejos de manera preferente a compuestos aromáticos complejos y heterocíclicos, y la

γCD puede incluir en su cavidad moléculas más grandes tales como macrociclos y

esteroides (Vyas, Saraf & Saraf, 2008).

11

Las CDs han sido utilizadas para mejorar la solubilidad de las moléculas huésped

que generalmente son altamente insolubles, confiriéndoles también protección contra la

oxidación, la luz visible o ultravioleta y al calor, control en la volatilidad y sublimación

de las moléculas acomplejadas, también se han aplicado en separaciones cromatográficas,

han sido útiles en el enmascaramiento de sabores o en la eliminación de olores

desagradables así como en la liberación controlada de fármacos y sabores (Marques,

2010).

La capacidad de las CDs para acomplejar a la molécula huésped está en función

de dos aspectos principalmente: i) factor estérico, el cual depende tanto del volumen de la

cavidad de la CD como de la molécula huésped. Por ejemplo, en el caso de algunas

moléculas de bajo peso molecular, puede suceder que más de una se inserte en la cavidad

de la CD, pero que con moléculas más grandes solamente se acomplejen en una relación

1:1 o no se forme el complejo. En principio, sólo una porción de la molécula puede

incluirse en la cavidad para formar el complejo, sin embargo, la inclusión no sigue un

mismo patrón (Figura 7). ii) formación de interacciones no covalentes entre los diferentes

componentes del sistema (CD, huésped y disolvente), para que el complejo se pueda

generar debe haber interacciones energéticamente favorables que mantengan a la

molécula huésped en la cavidad de la CD. Se ha observado que el acomplejamiento es

temporal y está regido por enlaces no covalentes, tales como interacciones hidrofóbicas,

puentes de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones ión-dipolo, dipolo-

dipolo, así como por el reordenamiento de las moléculas de solvente que originalmente

rodean tanto a la CD como al compuesto huésped (Castronuovo & Nicolli, 2006).

Figura 7. Posibles formas de inclusión de la molécula huésped en las

ciclodextrinas (Rayner, Mackevica & Hansen, 2010).

En términos generales, hay cuatro aspectos que podrían dirigir el equilibrio hacia

F ormation of complexes

Cyclodextrins in aqueous

solutions welcome “guest

molecules”, other than water, in

their hydrophobic cavities (Szejtli,

1998). The interaction of a CD

and a guest molecule has usually a

molar ratio of 1:1, but other kinds

of interactions can be found, as

showed in figure 3 (Stella et al.

2008). This complex formation

can then increase the solubility of

some drug molecules (Stella et al.

2008 and Loftsson et al. 1996).

Throughout the formation of

complexes between cyclodextrins

and drug molecules, no breakages

of covalent bonds are noticed, but

what leads to the formation of

such complexes is the release of

water molecules from the cavity

of the cyclodextrins,

hydrophobic interactions,

hydrogen bonding, among others (Loftsson 2004). Complexes formed by HP-0.6-β-CD and β-CD

with some bile salts: glycocholate (GC), glycodeoxycholate (GDC) and glycochenodeoxycholate

(GCDC) are the most relevant complexes for this report.

2.2. Bile Salts

Figure 4 : Cholesterol conversion to 7-hydroxy-Cholesterol (Stamp & Jenkins, 2008)

This section will explain the basic and important aspects of BS while also distinguishing the

difference between what is known as BS and bile acid (BA).

Figure 3: Formation of complexes

(http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n12/images/nrd1576-f3.jpg)

12

la formación del complejo de inclusión (Brewster & Loftsson, 2007):

1. El desplazamiento de moléculas de agua desde la cavidad de la CD hacia

el agua de bulto.

2. El aumento del número de puentes de hidrógeno formados entre la

molécula huésped y las glucopiranosas de la CD, conforme el agua se

desplazada hacia afuera de la molécula anfitriona.

3. Una reducción del área de contacto entre la molécula huésped hidrófoba y

su entorno acuoso.

4. Un aumento de las interacciones hidrofóbicas entre la molécula huésped y

el interior de la CD.

Por otro lado, también debe considerarse el tipo de disolvente utilizado porque a

mayor solubilidad de las CDs más disponibles estarán para el proceso de

acomplejamiento. Además, la molécula huésped debe ser capaz de sacar al disolvente de

la cavidad de la CD. El agua es el disolvente generalmente utilizado para solubilizar a las

CDs y es muy fácil de desplazar. De igual modo, es conveniente usar la cantidad de

disolvente adecuada para garantizar la formación de complejo ya que se corre el riesgo de

que cuando sea muy alta, las CDs y el analito estén tan diluidos que no entren en contacto

con la misma facilidad con que lo harían en una solución más concentrada (Brewster &

Loftsson, 2007).

Los compuestos que se suelen incluir en las CDs tienen baja solubilidad en

disolventes acuosos, lo cual implica que la formación del complejo pudiera llevarse a

cabo lentamente (Gonnet, Lethuaut & Boury, 2010). En tal caso, se recomienda disolver a

la molécula en un disolvente orgánico que no genere interacciones con la cavidad de la

CD, y de este modo facilitar la eliminación del mismo (Szejtli, 1998).

Con respecto a la estabilidad del complejo formado ésta tiende a aumentar

conforme incrementa el carácter donador de electrones de las moléculas huésped, y la

especie acomplejada puede lograr una permanencia en la cavidad proporcional a las

interacciones no covalentes que se generen como resultado de la disposición espacial

producida (Szente & Szemán, 2013).

La inclusión de una molécula en la CD es un proceso estequimétrico donde se

generan una variedad de fuerzas no covalentes, como ya se mencionó anteriormente, las

13

cuales son las responsables de la formación de un complejo estable (Castronuovo &

Niccoli, 2013); dichas fuerzas pueden ser determinadas a partir de un análisis

termodinámico, que incluye parámetros tales como la entalpía (ΔHa), la entropía (ΔSa) y

la energía libre Gibbs (ΔGa) del proceso de acomplejamiento. Esta última puede

calcularse a partir de la constante de equilibrio de la formación del complejo (Ka),

empleando la siguiente ecuación (Connors, 1997; Brewster & Loftsson, 2007).

ΔGa = -RT lnKa Ec. 2

Donde R es la constante de los gases ideales y T la temperatura absoluta.

La Ka se puede determinar experimentalmente empleando técnicas tales como

titulación fluorométrica y cromatografía electrocinética capilar, y se expresa en términos

de las concentraciones de los reactivos (huésped y CD) y del producto (complejo

huésped-CD), como se muestra en la siguiente ecuación (Loftsson, Masson & Brewster,

2004):

huésped + CD huésped-CD

𝐾𝑎 =[huésped−CD]

[huésped][CD ] Ec. 3

La ecuación anterior evidencia que la Ka permite cuantificar la afinidad de la

unión entre ambas moléculas, ya que el valor de dicha constante está asociado con la

concentración de complejo formado (Klotz, 1997). Cabe señalar que la Ka depende del

pH del medio, de la temperatura, fuerza iónica del medio y del solvente en el que se

encuentre.

Como ya se mencionó, a partir de Ka puede calcularse el valor de la ΔGa, el cual

proporciona información cuantitativa respecto a la espontaneidad del proceso, es decir, si

el acomplejamiento se puede llevar a cabo o no. Se sabe que la ΔGa está gobernada por

dos contribuciones principales que son la ΔHa y la TΔSa (Ecuación 4) (Alberty, 1969).

ΔGa= ΔHa -TΔSa Ec. 4

La ΔHa mide la energía liberada o absorbida necesaria para la conversión de los

reactivos en productos, mientras que la ΔSa mide la disminución o aumento en los grados

14

de libertad de las moléculas que intervienen en el acomplejamiento (Klotz, 1997).

En base a estudios realizados con moléculas modelo (Klotz, 1997; Liu & Guo,

2002) se estableció que los cambios negativos en ΔHa y TΔSa revelan que el proceso de

acomplejamiento está entálpicamente dirigido y puede asociarse al incremento en los

enlaces de puente de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Por el contrario, si los

cambios de ΔHa y TΔSa son positivos, indican que el proceso de inclusión está controlado

por la entropía, manifestando un posible incremento en las interacciones hidrofóbicas y

de desolvatación, ya que la inclusión impide la rotación de la molécula así como el

desplazamiento de moléculas de agua de la cavidad de la CD al agua de bulto (Novotny,

Bruccoleri, Davis & Sharp, 1997).

Es importante mencionar que la estequiometria de la reacción (n) juega un rol

importante porque la unión entre una molécula huésped y un receptor no siempre se da en

una relación 1:1 (Figura 7), lo que implica cambios en las interacciones e influye en los

valores de los parámetros termodinámicos antes mencionados.

1.2.3. IMPORTANCIA DEL USO DE LAS αCD, βCD Y γCD EN LA INDUSTRIA

DE ALIMENTOS

El uso de las CDs en formulaciones de alimentos es amplio, por ejemplo, las γCD

pueden llegar a estabilizar y proteger a moléculas precursoras de color, sabor y olor

durante el proceso de cocción o pasteurización, congelación, descongelación, etc. (Li et

al., 2007). Asimismo, con el objetivo de evitar el efecto de oxidación, se han incorporado

CDs a los jugos, zumos de frutas y de verduras, por su capacidad de formar complejos de

inclusión con la enzima polifenol oxidasa y con los compuesto que son susceptibles a la

oxidación, como es el caso del ácido clorogénico (Astray, Mejuto, Morales, Rial-Otero &

Simal-Gándara, 2010).

Por lo anterior, es importante conocer la afinidad de acomplejamiento entre las

moléculas huésped y las CDs, por ello se han realizado experimentos para determinar la

Ka. Astray et al. (2010) estudiaron el acomplejamiento de 14 saborizantes con la αCD y

la βCD (Tabla 2), empleando la técnica de espectrofotometría de UV-Vis y el siguiente

modelo matemático:

15

𝐴𝑇−𝐴𝐺

𝐴𝐺 𝐶𝐷−𝐴𝑇= 𝐾𝑆[𝐶𝐷] Ec. 5

Donde (AT) es la absorbancia total, (AG) es la absorbancia en ausencia de la αCD

o la βCD, (AG–CD) la absorbancia cuando todo el sustrato se une a cada una de las CDs,

[CD] es la concentración de la αCD o la βCD, y Ks es la constante de acomplejamiento.

Tabla 2. Constantes de acomplejamiento de algunos saborizantes

incluidos en las αCD y βCD.

Saborizante λ (nm) Ks (αCD) Ks (βCD)

Maltol 230 0.4 ± 0.1 2.1 ± 0.5

4-Hidroxi-2,5-dimetil-3-furanona 285 1.1 ± 0.2 7 ±1

Vainillina 300 1.6 ± 0.3 17 ± 3

Cinamato de metilo 391 4 ± 1 20 ± 4

Cineol 250 6 ± 1 29 ± 4

Citral 210 8 ± 2 31 ± 6

Mentol 530 10 ± 1 35 ± 7

Geraniol 240 9 ± 1 44 ± 9

Alcanfor 280 3 ± 1 19 ± 6

4-α,5-Dimetil-1,2,3,4,4α,5,6,7-octahidro-7-ceto-3-

isopropenilnaftaleno 254 7 ± 1 32 ± 5

Eugenol 210 5 ± 1 23 ± 4

p-Vinil guayacol 220 2.0 ± 0.5 17 ± 5

Limoneno 400 14 ± 3 55 ± 11

Astray et al., 2010

Los resultados mostraron que para todos los saborizantes acomplejados las

constantes de unión fueron mayores cuando se utilizó la βCD y, considerando que la

formación del complejo es reversible, el tiempo de permanecía de la molécula huésped

dentro de la cavidad de la CD también fue mayor conforme aumentó la afinidad, lo que

podría repercutir en la protección y tiempo de liberación de las moléculas acomplejadas

con la βCD con respecto a la αCD.

El acomplejamiento no solo sirve para conferir protección sino también para

eliminar olores y sabores desagradables en los alimentos, por ejemplo, como en los

zumos de cítricos el sabor astringente es la principal razón que limita la aceptación, por

eso se han empleado CDs para acomplejar compuestos como la naringina en la toronja y

16

la hesperidina en la naranja (Konno & Miyawaki, 1982).

Se han realizado diversas investigaciones en las cuales buscan determinar la

afinidad de compuestos que promueven un beneficio a la salud (antioxidantes, vitaminas

y aceites esenciales) con las CDs, esto con la finalidad de que al ser incorporados los

complejos en los alimentos, puedan soportar las condiciones de humedad, temperatura y

oxidación. De esta manera al momento de ser ingeridos los complejos, dichos

compuestos que aportan un beneficio a la salud se encuentren disponibles y viables para

cumplir su función (Choi, Ruktanonchai, Min, Chun & Soottitantawat, 2010; Folch-Cano,

Jullian, Speisky & Olea-Azar, 2010; Ponce Cevallos, Buera & Elizalde, 2010; Dos Santos,

Buera, & Mazzobre, 2012; Fang, Comino & Bhandari, 2013).

Considerando el costo para la obtención de los tres tipos de CDs así como la

variedad de moléculas con la cuales pueden llegar acomplejarse, la αCD y la γCD no son

muy utilizadas, sin embargo, la βCD abarca el 97 % del mercado, y en el 2007 la

comercialización de las CDs fue en el siguiente orden βCD>αCD>γCD, con un precio en

el mercado de 5, 45 y 80 $US/kg, respectivamente (Li et al., 2007). Para el 2014 el

mercado de la αCD y la γCD continua siendo el más pequeño debido a sus bajos

rendimientos de producción y su precio elevado, y sigue la misma tendencia en su

comercialización (Li, Chen, Gu, Chen & Wu, 2014).

1.2.4. MÉTODOS DE ACOMPLEJAMIENTO EMPLEANDO

CICLODEXTRINAS

Existen varios métodos para obtener los complejos empleando las CDs, tales

como el de co-precipitación que es el más utilizado, donde las CDs se disuelven en agua

y con agitación constante se añade la molécula huésped poco a poco. En muchos casos, la

solución de CD y el huésped debe ser enfriada mientras se agita hasta que se forme un

precipitado, este se recoge por decantación, centrifugación o filtración. La principal

desventaja de este método se presenta cuando se quiere escalar el proceso de

acomplejamiento, debido a la solubilidad limitada de las CDs, se tienen que usar grandes

cantidades de agua (Del Valle, 2004).

También existe el método de suspensión en el cual no es necesario disolver

completamente a la CD para poder formar el complejo, debido a que las moléculas

17

huésped se incluirán en la cavidad de las CDs que se encuentran en solución. El complejo

así formado saturará la fase acuosa, y el complejo puede ser recuperado del mismo modo

que en el método de coprecipitación (Del Valle, 2004).

Otro método que se ha utilizado es el denominado pegado, el cual es una

variación del método de suspensión, donde sólo una pequeña cantidad de agua es añadida

para formar una pasta, la cual se mezcla con la CD utilizando un mortero, o en gran

escala utilizando un amasador. La cantidad de tiempo requerido depende de la molécula

huésped (Del Valle, 2004).

Finalmente, el método por extrusión se caracteriza por realizar el

acomplejamiento en un sistema continuo, donde la CD, la molécula huésped y el agua

pueden ser mezclados añadiendolos a una prensa de extrusión. El grado de mezclado, la

cantidad de calentamiento así como el tiempo pueden ser controlados en el equipo.

Dependiendo de la cantidad de agua, el complejo extruido puede secarse mientras se

enfría o empleando un horno (Del Valle, 2004).

1.2.5. TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA

FORMACIÓN DE COMPLEJOS CON CICLODEXTRINAS

La caracterización de la formación de los complejos de inclusión entre las CDs y

la molécula huésped se suele realizar empleando varias técnicas, las cuales brindan

información sobre diferentes aspectos tales como la formación o ruptura de enlaces e

interacciones químicas, la energética del proceso de acomplejamiento, el desplazamiento

de las moléculas de disolvente de la cavidad de las CDs, así como la forma en que se

incluyó la molécula huésped.

Los métodos más utilizados para estudiar los complejos con CDs son los

siguientes de acuerdo a lo reportado por Singh, Bharti, Madan & Hiremath (2010):

Para el análisis de la formación del complejo se suele emplear:

• Espectroscopía infrarroja

• Calorimetría Diferencial de Barrido (CDB)

• Termogravimetría (TGA)

• Diagramas de solubilidad de fases

18

Para el análisis termodinámico del proceso de la formación del complejo se

pueden utilizar:

• Calorimetría de titulación isotérmica (CTI)

• Espectroscopía de fluorescencia

• Simulación computacional (docking)

A continuación se ahonda sobre las técnicas que se utilizaron en el presente

trabajo para la caracterización del complejo de inclusión del AF con las CDs naturales.

1.2.5.1. ANÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS

1.2.5.1.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO

La técnica de espectroscopía de infrarojo (IR) se basa en la detección de la energía

desprendida de los movimientos vibracionales de las moléculas, y en el caso de las

orgánicas, pueden ser identificados los grupos funcionales que las conforman en la región

del infrarrojo medio (MIR) (2500-25000 nm o de 4000-400 cm-1

) (Takahashi, Veiga &

Ferraz, 2012). Esta técnica ha sido utilizada para corroborar la formación de complejos

empleando CDs, a partir de un análisis comparativo entre los espectros correspondientes

a la molécula huésped, la CD y del complejo huésped-CD (Tabla 3).

Tabla 3. Análisis espectroscópico por IR de la formación de complejos

entre algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas por vía

enzimática y química.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada

Principales cambios en los espectros de

los complejos Referencia

αCD

βCD

HE-βCD

HP-βCD

M-βCD

Ácido

rosmarínico

La banda del enlace OH del fenol en

1200 cm-1

y la banda en 1500 cm-1

del

grupo aromático del ácido rosmarínico

desaparecieron en el espectro del

complejo.

Celik, Ozyürek,

Tufan, Güçlü &

Apak, 2011

βCD

HP-βCD

M-βCD

Paracetamol

La banda en 3388 cm-1

del paracetamol

cambió a 3402 cm-1

en el espectro del

complejo.

El-Kemary,

Sobhy, El-Daly &

Abdel-Shafi, 2011

HP-βCD

Rifampicina

El espectro del complejo mostró

diferencias muy marcados con respecto a

los espectros de la CD y la rifampicina.

He et al., 2013

HE-βCD: Hidroxietil- βCD; HP-βCD: Hidroxipropil-βCD; M-βCD: Metil-βCD.

19

Cualquier cambio de posición, disminución o incluso desaparición de las bandas

de los grupos funcionales que presente el espectro del complejo con respecto a las bandas

en los espectros de las moléculas huésped y la CD, son indicativo de que se formó el

complejo. La presencia de bandas sin cambios en el espectro del complejo se asocian a

porciones de la molécula huésped que no fueron incluidas en la cavidad de la CD

(Takahashi, Veiga & Ferraz, 2012).

1.2.5.1.2. CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO Y

TERMOGRAVIMETRÍA

Ambas técnicas se utilizan para medir las propiedades físicas de una sustancia en

función de la temperatura, bajo una atmósfera controlada, proporcionando información

sobre su comportamiento térmico, el cual es registrado en gráficas denominadas

termogramas (Volonté & Quiroga, 2013).

La técnica de termogravimetría (TGA) indica la temperatura y la magnitud de los

cambios de peso de una muestra, mientras que la calorimetría diferencial de barrido

(CDB) mide los cambios de energía a través de transiciones entálpicas.

La técnica de CDB permite determinar si los cambios de energía se deben a un

proceso endotérmico como la fusión, vaporización, sublimación o desorción, o bien a un

proceso exotérmico como la cristalización, condensación, solidificación, adsorción o

quimisorción (Clas, Dalton, & Hancock, 1999; Menczel & Prime, 2009). En los

termogramas los picos endotérmicos representan el punto de fusión, esto en base a que en

el estado final el cristal fundido tiene más energía que en su estado inicial; por lo

contrario el proceso de cristalización está representado por los picos exotérmicos, debido

a que el estado final (cristal) es menos energético que el inicial (sólido amorfo). A

temperaturas muy altas tiene lugar la degradación de la muestra observándose caídas en

las curvas de los termogramas (Mei & Lu, 2007). Los cambios observados por la técnica

de TGA pueden corroborarse con los resultados obtenidos mediante CDB y viceversa,

porque ambas técnicas monitorean las transiciones moleculares en función del

incremento de la temperatura.

A continuación se muestran algunos estudios en los cuales se utilizaron las

técnicas de CDB (Tabla 4) y TGA (Tabla 5), para confirmar la formación de complejos

20

empleando CDs.

Tabla 4. Análisis por calorimetría diferencial de barrido de la formación

de complejos entre algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas

por vía enzimática y química.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada Perfiles de CDB Referencia

βCD Timol

Cinamaldehído

En el termograma del timol se observó un

pico endotérmico a 50 °C el cual no se

identificó en el termograma del complejo.

De igual forma no se presentó un pico

endotérmico en el termograma del

complejo cinamaldehído-βCD.

Ponce et al.,

2010

βCD Ácido

clorogénico

El termograma del ácido clorogénico

presentó un pico endotérmico a 191 °C, y el

del cinamaldehído a -10 °C, los cuales no

se observaron en los termogramas

correspondientes a los complejos.

Zhao, Wang,

Yang & Tao,

2010

βCD

HP-βCD

α-Terpineol

Ácido mirístico

El termograma del α-terpineol registró un

pico endotérmico a 35 °C y el del ácido

mirístico cercano a los 50 °C, los cuales ya

no se observaron en los termogramas de los

complejos.

Dos Santos,

Buera &

Mazzobre,

2012

HP-βCD

Rifampicina

El termograma de la rifampicina presentó

un pico endotérmico a 259 °C el cual

desapareció del termograma del complejo.

He et al., 2013

HP-βCD: Hidroxipropil-βCD

Tabla 5. Análisis por termogravimetría de la formación de complejos

entre algunos compuestos con ciclodextrinas.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada Perfiles de TGA Referencia

HP-βCD β-lapacona

El complejo mostró diferencias del 5% en

las pérdidas de peso con respecto a las

moléculas sin acomplejar.

Cavalcanti et

al., 2011

βCD

Me-βCD Sulfadiazina

El complejo mostró diferencias en las

pérdidas de peso entre los 25 a 100 °C con

respecto a las moléculas sin acomplejar

Delrivo, Zoppi

& Longhi,

2012

βCD

Ácido gálico

El complejo mostró diferencias en los

porcentajes de pérdidas de peso (13.8 y

10.6 %) a temperaturas más elevadas (100.6

y 254.7 °C) con respecto a las moléculas sin

acomplejar.

da Rosa et al.,

2013

HP-βCD: Hidroxipropil-βCD; Me-βCD: Metil-βCD

21

Los perfiles de TGA de los complejos mostraron que sí se generó el

acomplejamiento de las moléculas huésped proporcionándoles protección de los mismos,

ambas afirmaciones son evidenciadas por las diferencias en las pérdidas de porcentaje de

peso con respecto a las moléculas sin acomplejar.

Con lo que respecta a los cambios registrados en los termogramas de CDB

correspondientes a los complejos se observó que el pico endotérmico, perteneciente al

punto de fusión de los huéspedes puros, no se presentó al formarse los correspondientes

complejos de inclusión.

Los resultados mostrados en la tabla 4 y 5, premitieron confirmar la formación del

complejo huésped-CD, y establecer que tanto TGA como CDB son herramientas útiles

para este tipo de estudio por la información generada.

1.2.5.1.3. DIAGRAMAS DE SOLUBILIDAD DE FASES

La inclusión de moléculas huésped en CDs puede demostrarse mediante el

análisis de diagramas de solubilidad de fases (Higuchi & Connors, 1965), que consiste en

poner en contacto una solución de concentración alta de una molécula poco soluble en

agua con una solución de CD preparada en un intervalo de concentraciones. A partir de

dicho experimento se obtiene el diagrama de solubilidad de fases (Figura 8), el cual

representa el incremento en la solubilidad de la molécula huésped en función de la

concentración de CD agregada. Existen dos tipos de diagramas de solubilidad de fases en

base al efecto que tiene la CD sobre la disolución del complejo formado: el tipo A y el B

(Figura 8). El primero muestra la relación lineal que existe entre el aumento de la

cantidad de molécula huésped solubilizada con respecto al aumento de la concentración

de CD. El diagrama tipo A se subdivide en tres tipos dependiendo del orden de reacción

de acomplejamiento: AL (primer orden), AP (segundo orden), y AN si disminuye el

acomplejamiento a causa del incremento en la concentración de CD. Por otro lado, el

diagrama tipo B presenta un decrecimiento de la curva debido a que el complejo formado

con la CD se torna insoluble, y se clasifica en dos tipos: BI, el cual muestra que la

formación del complejo es insoluble, generando una curva en forma de meseta; y BS, en

donde se observa un incremento parcial de la solubilidad (curva lineal) y posteriormente

22

una caída en la misma (curva tipo meseta).

Figura 8. Tipología de los diagramas de solubilidad de fases. Aumento

lineal de la solubilidad del huésped en función de la concentración de CD

(AL), aumento lineal con un orden de reacción 2 (AP), aumento lineal con

disminución del acomplejamiento (AN), complejo insoluble (BI) y

complejo con solubilidad limitada (BS) (Higuchi & Connors, 1965).

La constante de solubilidad del complejo Ks se obtiene a partir del ajuste de los

datos experimentales utilizando la ecuación:

Ks = m/S0(1-m) Ec. 6

Donde S0 es la solubilidad intrínseca de la molécula huésped en ausencia de CDs

y m es la pendiente de la recta. A continuación se muestran algunos reportes de

investigación (Tabla 6) en los cuales se evaluó el cambio en la solubilidad de moléculas

poco solubles cuando fueron acomplejadas con CDs.

Tabla 6. Estudios de solubilidad de fases de algunos compuestos

acomplejados con ciclodextrinas.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada

Tipo de

diagrama

Ks Referencia

βCD

Quercetina

AL 602 Jullian, Moyano, Yanez

& Olea-Azar, 2007 HP-βCD AL 1419

SBE-βCD AL 4032

γCD

Docetaxel

AL ND

Mazzaferro et al., 2011 HP-βCD AL ND

SBE-βCD AP ND

Me-βCD AP ND

HP-βCD: Hidroxipropil-βCD; SBE- βCD: Sulfobutil éter-βCD; Me-βCD: Metil-βCD.

ND: No determinado.

23

En ambos estudios las moléculas acomplejadas tuvieron un aumento en su

solubilidad por el acomplejamiento con las CDs. En el caso de la quercetina el aumento

de la solubilidad fue directamente proporcional al aumento en la concentración de CD

(diagrama tipo AL), mostrando que el orden de afinidad para acomplejar a dicha molecula

fue SBE-βCD>HP-βCD>βCD, en base a los valores obtenidos de la Ks. Los distintos

tipos de CDs evaluadas en el acomplejamiento del docetaxel mostró que no se siguió un

mismo comportamiento en el incremento de su solubilidad; el acomplejamiento con la

SBE-βCD y la Me-βCD generó un diagrama de solubilidad de fases tipo AP mientras que

con la HP-βCD y la βCD los diagramas fueron tipo AL, lo cual evidencio que el

acomplejamiento no sigue un patrón común. En dicho estudio no reportaron el valor de la

Ks.

1.2.5.2. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO EN LA FORMACIÓN

DE COMPLEJOS

1.2.5.2.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA

La técnica de calorimetría de titulación isotérmica (CTI) se basa en la medición

del calor liberado o absorbido generado por la interacción entre dos moléculas. A partir

de dicha medición de calor se obtienen las constantes de acomplejamiento o de

estabilidad (Ka) y los parámetros termodinámicos que caracterizan el fenómeno de

reconocimiento molecular que ocurre entre dos moléculas (huésped-anfitrión). La técnica

de CTI es muy sensible de tal manera que permite caracterizar complejos que presenten

constantes de acomplejamiento bajas (menores a 10 M-1

) y altas (superiores a 107 M

-1).

La caracterización de la energética de unión se puede realizar en un solo experimento de

titulación, en la que se obtiene simultáneamente la Ka y la entalpía de unión (ΔHa),

además a partir de dichos parámetros se puede calcular la energía de Gibbs (ΔGa) y la

entropía de unión (ΔSa) (Jelesarov & Bosshard, 1999; Bouchemal & Mazzaferro, 2012).

En contraste, para la estimación de la Ka, ΔHa, ΔGa, y ΔSa utilizando técnicas no

calorimétricas se requiere de varios experimentos evaluando el acomplejamiento a

diferentes temperaturas, y de un posterior análisis de la dependencia de la Ka con respecto

a la temperatura. Por lo anterior, la técnica de CTI es única porque proporciona una

determinación directa de los parámetros termodinámicos (Tabla 7).

24

Tabla 7. Parámetros termodinámicos obtenidos por CTI del proceso de

acomplejamiento entre algunos compuestos con las ciclodextrinas

naturales.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada

Parámetros termodinámicos

Referencia ∆Ha

(kJ·mol-1)

∆Sa

(J·mol-1·K-1)

∆Ga

(kJ·mol-1)

βCD Catequina -35.1 -12.6 -22.5

Kríz, Koca,

Imberty, Charlot

& Auzély-Velty,

2003

βCD Valsartan -24.90 -0.041 -12.45 de Matos Jensen

et al., 2010

βCD Ácido

clorogénico -12.9 7.45 -14.93 Álvarez-Parrilla

et al., 2010

αCD Resveratrol -27.18 -10.38 -16.80

Li, Xu, Liu, Sun

& Li, 2010 βCD Resveratrol -26.16 -9.16 -17.00

γCD Resveratrol -1.50 25.19 -26.69

Como se pudo observar, la CD más utilizada en los reportes ha sido la βCD. La

formación del complejo se llevó a cabo con la liberación de energía (ΔHa negativo),

fueron procesos espontáneos (ΔGa negativo) y en su mayoría fueron entálpicamente

dirigidos a excepción del acomplejamiento del resveratrol con la γCD, que mostró estar

entrópicamente dirigido.

1.2.5.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

La técnica de espectroscopía de fluorescencia se puede utilizar primeramente para

comprobar la formación de complejos, en base a los cambios en la polaridad del ambiente

que rodea al fluoróforo presente en el receptor o en la molécula huésped, cuando se forma

el complejo. Este cambio en la polaridad produce un corrimiento en la longitud de onda

de emisión, que se determina comparando los espectros de emisión de las moléculas

libres y acomplejadas a través de los valores de sus centros de masa espectral (CME). De

igual modo, el aumento o disminución en la intensidades de fluorescencia (IF)

observados durante las titulaciones fluorométricas proporciona información sobre la

25

formación del complejo entre las moléculas analizadas (Lakowicz & Masters, 2008).

La IF emitida por un fluoróforo depende de la polaridad del medio en que se

encuentra inmerso, siendo mayor cuando ésta disminuye por el efecto de relajación del

disolvente, lo que implica un corrimiento adicional al desplazamiento de Stokes del

fluoróforo. En el caso específico del acomplejamiento con CDs en solución acuosa, la

inclusión de una molécula fluorescente en su cavidad hidrófoba provoca un aumento en

la IF (Wagner & Fitzpatrick, 2000; Lakowicz & Masters, 2008).

Si los cambios en la intensidad de fluorescencia se miden en función de la

concentración de CD, se puede determinar la Ka a partir del ajuste de los datos

experimentales empleando un modelo matemático, tratando en la medida de lo posible

que la mayoría de las moléculas huésped estén acomplejadas con las CDs (saturación),

con lo que la variación en la señal de IF puede ser considerada como constante, lo cual

permitirá tener un buen ajuste y que la Ka represente adecuadamente el acomplejamiento

entre las moléculas estudiadas (Lakowicz & Masters, 2008).

La información de la tabla 8 muestra que para el acomplejamiento de moléculas

se ha utilizado a la βCD principalmente, también se han usado CDs modificadas y en

menor medida la αCD. Por otra parte, se pudo corroborar mediante los valores negativos

de la ΔGa, que el acomplejamiento fue un proceso espontáneo. Además, a partir de los

datos de la Ka se observó que las CDs modificadas químicamente tuvieron una mayor

afinidad por los compuestos con respecto a las sintetizadas enzimáticamente, esto debido

posiblemente a la formación de un mayor número de enlaces no covalentes.

Así mismo, el efecto de las interacciones en el acomplejamiento del (E)-3-(4-

metilaminofenil) se pudo asociar a las micropolaridades generadas por el contacto entre

la molécula y la cavidad de la αCD promoviendo un mejor ajuste que con la βCD.

26

Tabla 8. Análisis por espectroscopía de fluorescencia de la formación de

complejos entre algunos compuestos con ciclodextrinas sintetizadas por

vía enzimática y química.

Ciclodextrina

Molécula

acomplejada

Parámetros

termodinámicos Referencia

Ka (M-1) ∆Ga (kJ·mol-1)

βCD

Catequina 3000 -20.16

Folch-Cano et al., 2010 Galato de

epigalocatequina 7470 -22.46

Galocatequina galato 15500 -24.30

βCD Serotonina

126.06 -12 Chaudhuri, Chakraborty

& Sengupta, 2010 SHP-βCD 461.62 -15.2

αCD

Ácido

rosmarínico

82 -10.92

Celik et al., 2011

βCD 164 -12.64

HE-βCD 168 -12.70

HP-βCD 267 -13.84

Me-βCD 328 -14.35

αCD (E)-3-(4-

Metilaminophenil)

3400 -26.16 Ghosh, Jana, & Guchhait,

2011 βCD 530 -20.189

αCD

Vainillilamina

235 -13.73 Sivasankar, Antony

Muthu Prabhu, Karthick

& Rajendiran, 2012

βCD 365 -14.86

HP-αCD 297 -14.34

HP-βCD 440 -15.33

SHP-βCD: Succinil-(2-hidroxipropil)-βCD; HE-βCD: Hidroxietil- βCD; HP-βCD: Hidroxipropil-βCD; Me-

βCD: Metil-βCD.

1.2.5.3. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN EN EL

ACOMPLEJAMIENTO CON CICLODEXTRINAS

1.2.5.3.1. SIMULACIÓN COMPUTACIONAL (DOCKING)

La herramienta computacional denominada docking es ampliamente utilizada en

áreas como la bioinformática, la química y la farmacéutica, porque puede simular la

unión entre un receptor y un ligando. Uno de los programas que se utilizan para realizar

el análisis por docking es MOE (Molecular Operating Enviorement), por medio del cual

se identifican, utilizando algoritmos matemáticos, las posibles orientaciones estructurales

de cómo la molécula huésped se une en algunos sitios de una macromolécula particular.

Para determinar la posible colocación del huésped en la molécula anfitrión se

utilizan distintos algoritmos matemáticos de colocación, afinidades y campos de fuerza;

para el primero se puede utilizar el método tipo triángulo alfa, el cual asigna un contorno

27

esférico a la molécula huésped y posteriormente se generan las superposiciones del

mismo. Respecto a las afinidades existen distintos funciones tales como la Affinity DG y

London DG, la primera se usa para estimar la contribución entálpica a la energía libre de

Gibbs usando una función lineal que considera las interacciones hidrofóbicas, iónicas,

puentes de hidrógeno y las condiciones de ligación de metal, la segunda permite calcular

la energía libre de Gibbs del huésped en base a la libertad de movimiento de sus enlaces,

los puentes de hidrógeno formados y la desolvatación. Finalmente, los campos de fuerza

que se pueden utilizar son MMFF94x y AMBER99, el primer campo de fuerza se emplea

regularmente en simulaciones con moléculas orgánicas pequeñas, el segundo se usa en el

estudio de simulación con biomoléculas. Al término de la simulación se obtienen los

valores de ΔGa del acomplejamiento, considerando que entre menor sea éste indicará una

mayor afinidad, también se generan las posibles estructuras en 3D de los mismos

(Halperin, Ma, Wolfson & Nussinov, 2002).

Estudios previos del acomplejamiento del trolox y el resveratrol con la HP-βCD

emplearon el programa MOE para hacer un análisis computacional de docking. Los

resultados mostraron que los valores de ΔGa fueron -14.98 y -19.52 kcal/mol para trolox

y el resveratrol, respectivamente, sugiriendo una mayor afinidad de HP-βCD por el

resveratrol (Sapinoa et al., 2008; Sapino

b, Carlotti, Caron, Ugazio & Cavalli, 2008).

28

II. ESTADO DEL ARTE

En este apartado se presentan las técnicas empleadas hasta el momento para el

análisis de la obtención de los complejos del AF con las CDs naturales y obtenidas por

síntesis química, para el estudio de la energética de su proceso de acomplejamiento así

como su elucidación estructural (Tabla 9).

Tabla 9. Técnicas utilizadas para el estudio de las propiedades

termodinámicas y estructurales de los complejos formados entre el ácido

ferúlico con las CDs naturales y sintetizadas químicamente.

Ciclodextrina Técnica utilizada Propiedad

determinada Referencia

αCD, βCD, γCD, la mono [6

(2-amino aminoetile-)-6-

desoxi]-β-ciclodextrina

y la mono [6 (5-amino-3-

azapentilamino)-6-desoxi]-β-

ciclodextrina

Fluorescencia Ka Qi, Li & Liu,

2003

γCD CTI y titulaciones

potenciométricas ΔHa y Ka

Casolaro,

Anselmi &

Picciocchi, 2005

γCD

Calorimetría diferencial de

barrido, difractometría de

rayos X y RMN

Estructura Anselmi et al.,

2004

αCD RMN Estructura Anselmi et al.,

2008

βCD

Hidroxipropil-βCD

UV-vis, Fluorescencia y

RMN

Ka y

estructura Zhang et al., 2009

αCD HPLC Ka Monti et al., 2011

Hidroxipropil-βCD UV-vis, IR y CDB Ka y

estructura

Wang, Zhong,

Xue & Fu, 2011

αCD, βCD y γCD Cromatografía electrónica

capilar Ka

Zhang, Cheung,

Shangguan &

Zheng, 2012

Como se puede apreciar, las técnicas utilizadas solamente han permitido

determinar la Ka, a partir de la cual se ha llegado a calcular ΔGa empleando una ecuación

matemática. También se observa el marcado interés por la elucidación estructural de los

complejos AF-CD estudiados. A continuación se presenta el análisis de los trabajos

referidos en la tabla 9.

29

2.1. FORMACIÓN DEL COMPLEJO ÁCIDO FERÚLICO-CICLODEXTRINA Y

SU ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL

Para el estudio de la capacidad de unión del AF con la γCD Anselmi et al. (2004)

obtuvieron el complejo AF-γCD sólido y fue caracterizado utilizando las técnicas de

calorimetría de barrido diferencial (CDB), difracción de rayos X, resonancia magnética

nuclear (RMN 1H) y modelado molecular. Los autores obtuvieron el complejo AF-γCD

mezclando en una relación 1:1 ambas moléculas (0.038 mol) en 500 mL de agua, con

agitación constante durante una hora, a temperatura ambiente y en completa obscuridad;

bajo estas condiciones obtuvieron el complejo precipitado. El análisis comparativo de los

perfiles térmicos del complejo mostró la desaparición del pico de fusión del AF libre

(175.2 ºC) y el ensanchamiento de bandas características de la γCD (269.7-269.7 y 93.7-

85.7 ºC) comparado con la molécula pura (288.3 ºC). Por otro lado, el análisis mediante

rayos X sugirió la formación del complejo a partir de las diferencias en el espacio

interplanar, tanto de los picos relativos así como los ángulos de difracción. Los análisis

por RMN 1H mostraron que la porción del anillo de benceno y del etileno del AF

quedaron dentro de la cavidad de la γCD, además que sus grupos –COOH, el hidroxilo

del fenol y el metoxilo se encontraron cercanos a la abertura más ancha de la molécula de

la CD, y orientados hacia el exterior de esta, lo cual fue apoyado con sus resultados del

modelado molecular, los cuales les permitió concluir que el AF sí fue acomplejado con la

γCD.

Anselmi et al. (2008), también caracterizaron el acomplejamiento del AF con la

αCD, a dos relaciones molares (1:1 y 2:1) por el método de co-precipitación, mezclando

una solución de metanol de AF con las CDs disueltas en agua, con agitación constante en

completa oscuridad por 24 h, a temperatura ambiente. La formación del complejo fue

corroborada con CDB y difractometría de rayos X. Utilizaron las técnicas de RMN 1H y

modelado molecular para la elucidación estructural del complejo. La inclusión del AF en

la cavidad de la CD comprendió básicamente al grupo –COOH, a los grupos α, β-

insaturados y parte de su fracción aromática. El grupo fenol y metoxilo de la molécula del

AF se encontraron ubicados en el plano del borde más amplio de la cavidad de la αCD.

Para el análisis comparativo de la formación del complejo entre el AF y la βCD

modificada (HP-βCD) y sin modificar Zhang et al. (2009) obtuvieron los diagramas de

30

solubilidad de fases (Higuichi & Connors, 1965), así como los espectros de absorbancia

en la región del UV, además de la estructura de los complejos por RMN 1H y un

modelado molecular. Para la técnica de UV-vis se usaron soluciones 1x10-3

M de AF

disuelto en agua, y 1x10-2

M de cada una de las CDs disueltas en amortiguador de

fosfatos, no especificaron la concentración del amortiguador ni del pH. A partir del

diagrama de solubilidad de fases determinaron que la solubilidad del AF aumentó al

doble cuando se acomplejo con la HP-βCD comparado con el complejo AF-βCD, pero no

dieron el valor de Ks. Los resultados que obtuvieron con los espectros de absorción en el

UV mostraron una disminución de la señal con respecto al aumento de la concentración

de βCD y HP-βCD, con este último complejo además observaron un corrimiento de la

longitud de onda de 290 a 315 nm, lo que les dió indicio de que el AF fue acomplejado

por esta CD. Finalmente, a partir del análisis de los datos de RMN y el modelado

molecular concluyeron que en ambas CDs el anillo aromático y la cadena lateral del

etileno del AF fueron incorporados en la cavidad de las CDs, dejando a los grupos más

polares hacia fuera de la cavidad.

En un trabajo reportado (Monti et al., 2011) utilizaron el complejo AF-αCD para

la preparación de diferentes formulaciones cosméticas, porque se obtiene un complejo

más estable con esta CD de acuerdo a lo reportado por Anselmi et al., (2008). El

complejo utilizado por Monti et al. (2011), fue obtenido por el método de co-

precipitación, utilizando una relación molar 1:1; el AF fue disuelto en metanol y la αCD

en agua, ambas soluciones fueron mezcladas durante 24 h en la oscuridad y a temperatura

ambiente. Para la caracterización del complejo se utilizaron las técnicas de rayos X y

RMN. En este trabajo mostraron que la molécula del AF no fue afectada por el pH de los

diferentes tipos de formulaciones cosméticas estudiadas, lo cual fue atribuido a la forma

como se incluye el AF en la cavidad de la αCD.

A pesar de que el complejo AF-HP-βCD, fue previamente caracterizado (Zhang et

al., 2009), Wang et al. (2011), obtuvieron dicho complejo a una relación molar 1:1,

mezclando 0.06 M de AF y de CD, en 50 mL de agua. Posteriormente, la mezcla fue

filtrada para remover el exceso de AF y la solución resultante fue liofilizada a -80°C, con

el objetivo de minimizar la degradación del AF. El análisis de la formación del complejo

se realizó con las espectroscopías de UV-vis (200 a los 400 nm), de infrarrojo de

31

Transformada de Fourier (IR-TF), CDB, difractometría de rayos X y microscopía

electrónica de barrido; además determinaron la solubilidad de fases (Higuchi & Connors,

1965). Cada técnica fue realizada usando el complejo AF-HP-βCD así como cada una de

las moléculas por separado y mezcladas (mezcla física). A partir de los resultados que

obtuvieron mostraron que con el método empleado para obtener al complejo lograron

tener un rendimiento del 60.16±0.23% de recuperación. Del análisis comparativo de los

espectros de UV para el AF libre, acomplejado con la HP-βCD y en la mezcla, obtuvieron

tres espectros parecidos los cuales mostraron longitudes de onda máxima a los 217, 286 y

310 nm; la mayor señal fue para el AF libre, seguido del contenido en la mezcla y

finalmente el AF acomplejado con la CD, este último mostro un corrimiento a 291 y 313

nm, posiblemente debido a un ligero desplazamiento de los electrones del cromóforo

cuando se incluyó en la cavidad de la CD. A partir de los resultados del resto de las

espectroscopías utilizadas también pudieron constatar el acomplejamiento del AF con la

HP-βCD, tomando como base las diferencias que mostraron los espectros

correspondientes entre el AF libre, en la mezcla y el acomplejado. Por último, la

constante de estabilidad calculada para el complejo AF-HP-βCD fue 166.3 M-1

, lo que

indicó una fuerte asociación entre ambas moléculas, además de un incremento de la

solubilidad de 15 veces con respecto a la del AF libre.

2.2. ANÁLISIS DE LA ENERGÉTICA DEL PROCESO DE

ACOMPLEJAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON LAS

CICLODEXTRINAS

El primer reporte en este tema (Qi, Li & Liu, 2003), tuvo como objetivo analizar

el acomplejamiento con las αCD, βCD y γCD además de dos derivadas de la βCD, con

cuatro moléculas importantes dentro de la medicina tradicional china, entre las cuales se

encontró al AF. Para obtener los valores de Ka, referida por los autores como constante de

estabilidad (Ks), utilizaron la técnica de titulación fluorométrica del AF con las CDs a 25

°C, y a partir de dichos datos calcularon ΔGa. El AF fue disuelto en metanol a una

concentración de 0.002 M, y de esta solución se hizo una dilución 1:200 en amortiguador

de fosfatos pH 7.2, para tener una concentración final de 0.01 mM. Las CDs fueron

disueltas en el mismo amortiguador y las concentraciones alcanzadas en la celda de

32

reacción fueron de 0 a 2.0 mM. Además, supusieron una estequiometria 1:1 del

acomplejamiento del AF con las CDs. Para obtener el valor de Ks utilizaron una ecuación

no lineal para ajustar los datos experimentales de la curva de titulación. Los resultados

mostraron que el acomplejamiento del AF con las tres CDs naturales generó un aumento

en la intensidad de fluorescencia el cual fue proporcional al incremento en la

concentración de las CDs en la celda de reacción, efecto contrario a lo observado con las

dos CDs modificadas, lo cual pudo deberse al cambio del microambiente de la cavidad de

estas últimas siendo más hidrófobo, ya que se ha reportado que la intensidad de

fluorescencia aumenta cuando el fluoróforo pasa de la solución acuosa polar a la cavidad

hidrófoba de la CD. Por otro lado, en todos los casos el valor de ΔGa fue negativo, y los

valores de Ks con las CDs naturales fueron en el siguiente orden βCD>αCD>γCD. La

posible explicación que dieron a esto fue que por el tamaño pequeño de la molécula del

AF solo pudo incluirse parcialmente en la cavidad de la γCD lo cual condujo a una

interacción débil en comparación con las que se generaron con las otras dos CDs.

La técnica de calorimetría de titulación fue utilizada para determinar la energética

de la protonación del AF libre y acomplejado con la γCD (Casolaro, Anselmi & Picciocchi,

2005). En este reporte las constantes de basicidad del AF y del complejo AF-γCD fueron

obtenidas mediante potenciometría. El complejo usado fue un compuesto comercial

denominado FerudexTM

, proporcionado por la empresa japonesa Tsuno Rice Chemical

Co. Ltd. Los valores de las constantes de basicidad determinadas para el AF fueron logK1

= 8.94±1 y logK2 = 4.48±1, y para el complejo AF-γCD fueron logK1 = 8.69±1 y logK2 =

4.47±1. La protonación del grupo hidroxilo del AF fue asociada al valor de logK1, siendo

el más básico, mientras que logK2 se relacionó con la del anión carboxilato. El ΔH de

protonación fue obtenido mediante la técnica de CTI a 25 °C, la ΔG fue calculada

utilizando los valores de las constantes de basicidad, y ΔS fue determinada mediante la

ecuación:

∆𝑆 = (∆𝐻−∆𝐺

T) Ec. 7

Los resultados revelaron para el grupo carboxilo del AF del FerudexTM

una mayor

entalpía de protonación (5.4 veces) y una menor entropía (3.2 veces) con respecto al AF

33

libre. Según los autores, lo anterior pudo deberse a una mayor protección de la carga

negativa conferida por la γCD al grupo metoxilo de la molécula del AF.

Anselmi et al. (2008), determinaron el valor de la Ka del AF acomplejado con la

αCD mediante experimentos de espectroscopía de efecto Overhauser nuclear de marco

rotatorio (ROESY). El complejo sólido fue obtenido por el método de co-precipitación,

mezclando una solución de metanol de AF con la αCD disuelta en agua (1:1), con

agitación constante y en completa oscuridad por 24 h, a temperatura ambiente. Con sus

resultados corroboraron que la estequiometría del acomplejamiento se llevó a cabo en una

proporción 1:1, y el valor de Ka fue 1162±410 M-1

.

El efecto del estado de protonación del AF sobre el valor de la Ka, al acomplejarse

con la βCD modificada (HP-βCD) y sin modificar fue evaluado por Zhang et al., (2009).

Para esto utilizaron la técnica de fluorescencia empleando soluciones 1x10-3

M de AF

disuelto en agua, y 1x10-2

M de cada una de las CDs disueltas en amortiguador de

fosfatos, no especificaron la concentración del amortiguador ni del pH. Los valores de Ka

fueron generados ajustando los inversos de los datos experimentales con un modelo

matemático lineal. En la evaluación del efecto de protonación del AF en la Ka por la

técnica de fluorescencia, se usaron soluciones de AF a pH de 3.05, 7.5 y 10.53, en este

caso no mencionaron los amortiguadores utilizados ni la concentración de los mismos.

Cabe señalar, que no se describió la temperatura a la cual se realizaron los experimentos.

Los espectros mostraron un aumento en la señal de la intensidad de fluorescencia con el

incremento de la concentración de las CDs, lo que fue atribuido a una mayor protección

del AF del apagamiento de fluorescencia y de otros procesos que ocurren en el disolvente.

Respecto a los valores de Ka, fue mayor para la HP-βCD (98 M-1

) que para la βCD (87 M-

1) probablemente por un incremento en el tamaño e hidrofobicidad de la cavidad de la CD

modificada. En cuanto al efecto del estado de ionización del AF en la Ka, el orden en la

afinidad de acomplejamiento con HP-βCD fue AF1-

>AF0>AF

2-, con respecto al complejo

AF-βCD no determinaron el valor de la Ka al pH de 10.53. Concluyeron que sí existe una

interacción selectiva de las CDs con los diferentes estados de protonación del AF.

Empleando la técnica de cromatografía electrocinética capilar se estudió el efecto que

tienen las CDs naturales así como la concentración de cada una de ellas, en la separación

de los componentes de una mezcla metanólica de polifenoles a una concentración de 100

34

g mL-1

, entre los que se encontró el AF (Zhang et al., 2012). Las CDs fueron disueltas

en tetraborato de sodio 20 mM, pH 9.4, a las concentraciones de 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mM.

El estudio se realizó a cuatro temperaturas diferentes: 15, 20, 25 y 30 °C. Los datos del

cambio de movilidad electroforética con respecto al incremento de la concentración de la

CD, permitieron calcular las constantes de acomplejamiento para cada polifenol,

empleando tanto una ecuación lineal como una no lineal. También se determinaron los

parámetros termodinámicos ΔGa; ΔHa (utilizando la ecuación de van’t Hoff), así como

ΔSa. Los electrocromatogramas obtenidos mostraron que sin la presencia de CD la

migración de los compuestos se basa únicamente en su relación carga/masa, además que

tanto el tipo de CDs como su concentración, influyeron en la separación de los

componentes de la mezcla de los polifenoles, teniéndose los mejores resultados con la

βCD a las concentraciones de 2 y 3 mM. Los valores de Ka obtenidos con la regresión

lineal para el AF fueron 61±18 M-1

(αCD) y 81±25 M-1

(βCD); y con la regresión no

lineal 36±9 M-1

(αCD) y 36±9 M-1

(βCD). No se logró formar el complejo AF-γCD

debido al mayor tamaño de la cavidad de esta con respecto a las otras dos CDs, según los

autores. La Ka a diferentes temperaturas se determinó únicamente con la βCD porque es

con la que se obtuvieron los mayores valores de afinidad, y en el caso del AF los valores

fueron 121±18 M-1

(15 °C), 66±23 M-1

(20 °C), 81±25 M-1

(25 °C) y 127±33 M-1

(30 °C).

Los parámetros temodinámicos (ΔGa, ΔHa y ΔSa) únicamente fueron calculados a 25 °C;

y en el caso del AF solamente se reportó el valor de ΔGa (-10.9 kJ mol-1

), pero no el de

los otros parámetros, posiblemente por que la Ka no mostró una tendencia inversamente

proporcional al incremento de la temperatura, lo cual si fue observado con otros

polifenoles.

35

III. JUSTIFICACIÓN

La importancia del AF en la industria de alimentos es como precursor para la

síntesis de vainillina y como antioxidante natural en la formulación de alimentos

funcionales. Sin embargo, su uso está limitado por su baja solubilidad en disolventes

acuosos e inestabilidad de la molécula (sensibilidad a la luz y al calor), así como por su

sabor astringente y amargo. El acomplejamiento de la molécula del AF con las αCD, βCD

y γCD es una alternativa para mejorar los inconvenientes mencionados.

Debido a que la inclusión de los compuestos en la cavidad de las CDs no sigue un

patrón común, es necesario analizar los factores que juegan un papel importante en la

geometría de inclusión tales como el tamaño de la cavidad de la CD, la formación de

enlaces no covalentes y el reordenamiento de las moléculas del disolvente que

originalmente rodean tanto a las CDs como al AF, y en base a esto determinar cuál o

cuáles CDs son las más recomendadas para acomplejar al AF.

Respecto a la energética del acomplejamiento del AF con CD, a la fecha existen

valores de ΔGa calculados a partir de datos de Ka, pero no hay reportes de las

contribuciones entálpicas y entrópicas a este parámetro termodinámico, lo que no ha

permitido establecer las posibles fuerzas moleculares que se generan por el proceso de

inclusión del AF en la cavidad de la αCD, βCD y γCD.

A diferencias de otras técnicas la de CTI permite determinar en un solo

experimento y de manera directa los valores de ΔHa, Ka, y la estequiometria del

acomplejamiento (n), a partir de los cuales, y mediante ecuaciones matemáticas, se

pueden obtener los valores de ΔGa y ΔSa. Cabe señalar, que hasta el momento no se ha

utilizado CTI para obtener los parámetros termodinámicos del acomplejamiento AF-CD

por lo que en el presente trabajo de investigación se utilizó para el análisis comparativo

de la energética del proceso de acomplejamiento del AF con la αCD, βCD y γCD.

Por otro lado, se sabe que el estado de protonación del AF es importante en el

proceso de acomplejamiento con las CDs, motivo por el cual se estudió este efecto con la

αCD, βCD y γCD, empleando la técnica de espectroscopía de fluorescencia y realizando

un análisis computacional de docking.

Por último, es importante señalar, que las moléculas de AF y las tres CDs fueron

36

disueltas empleando un mismo disolvente, a diferencia de otros trabajos en los cuales

solubilizaron al AF primeramente en metanol y después realizaron una dilución en agua o

en amortiguador de fosfatos, la cual fue utilizada en sus trabajos de investigación. Para

comprobar que bajo estas condiciones de disolvente el AF puede formar complejos con la

αCD, βCD y γCD se utilizaron en el estudio comparativo las técnicas de CDB, IR, TGA y

diagramas de solubilidad de fases. Las tres últimas técnicas no se han utilizado para el

análisis del complejo AF-CD.

37

IV. HIPÓTESIS

1. El uso de un mismo disolvente para preparar soluciones homogéneas de

concentración igual o mayor a 1 mM, tanto del AF como de las CDs naturales, permitirá

minimizar los calores de dilución y por lo tanto utilizar de manera confiable la técnica de

CTI.

2. Bajo las condiciones experimentales establecidas todas las CDs naturales

acomplejarán al AF con diferentes afinidades, porque el proceso de inclusión estará

limitado por el tamaño de su cavidad, y el acomplejamiento será favorecido

entrópicamente por la salida de moléculas de disolvente de dicha cavidad hidrofóbica

hacia el agua de bulto.

3. El estado de protonación del AF, y por la tanto la carga eléctrica que tenga,

influirá en el tipo de interacciones anfitrión-huésped que se establezcan y

consecuentemente en la estabilidad del complejo.

38

V. OBJETIVOS

5.1. OBJETIVO GENERAL

Obtener complejos de ácido ferúlico con la αCD, βCD, y γCD, y analizar la

termodinámica del proceso de acomplejamiento.

5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Establecer las condiciones para disolver a homogeneidad al AF y a las αCD, βCD,

y γCD, empleando un mismo disolvente.

2. Confirmar la formación de los complejos AF-CD, a partir del análisis de los

espectros de IR, termogramas de CDB y TGA, así como de diagramas de

solubilidad de fases.

3. Hacer el análisis comparativo de la energética del proceso de acomplejamiento

del AF con la αCD, βCD, y γCD, empleando la técnica de CTI para obtener los

parámetros termodinámicos correspondientes.

4. Realizar un análisis comparativo de los valores de la Ka y ΔGa del proceso de

inclusión del AF en las αCD, βCD, y γCD, obtenidos por las técnicas de CTI y

titulación fluorométrica.

5. Estudiar el efecto del estado de protonación del AF en el proceso de

acomplejamiento con la αCD, βCD, y γCD, empleando la técnica de titulación

fluorométrica y a partir de una simulación computacional (docking).

39

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

La metodología que se llevó a cabo para analizar la formación de los complejos

AF-CD así como de la energética del proceso del acomplejamiento, se esquematiza en la

figura 9.

Figura 9. Metodología realizada para el análisis de la formación de los complejos

AF-CD así como de la energética del proceso de su acomplejamiento.

Materiales

La αCD, βCD y γCD grado alimenticio fueron donadas por la empresa WACKER

Mexicana S.A de C.V. Los solventes metanol y etanol fueron grado reactivo JTBaker, el

AF con un grado de pureza del 99% fue adquirido con Sigma Aldrich. Todas las sales de

los diferentes reactivos utilizados fueron de la marca JTBaker.

6.1. PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES DE ÁCIDO FERÚLICO Y DE

LAS CICLODEXTRINAS, EMPLEANDO UN MISMO DISOLVENTE

Como se mencionó anteriormente el disolvente recomendado para solubilizar a

Encontrar un disolvente en común

para solubilizar a homogeneidad tanto al AF como a las CDs

Obtención de los complejos sólidos

de AF-CD

Determinación de la formación de los complejos

IR CDB TGA Diagramas de

solubilidad de fases

Energética del proceso de

acomplejamiento

Análisis termodinámico de la formación

del complejo

Titulación fluorométrica

CTI

Efecto del estado de protonación del

AF en el acomplejamiento

con CDs

Titulación fluorométrica

Docking

40

homogeneidad al AF es el metanol y para las CDs es el agua, estos disolventes reaccionan

exotérmicamente al mezclarse y el calor es perceptible al tacto. Por lo anterior, la primera

actividad del presente trabajo fue establecer un mismo disolvente para preparar las

disoluciones de AF y de cada una de las CD, debido a que el uso de la técnica de CTI

requiere que las soluciones de las moléculas analizadas sean homogéneas, de

concentraciones en el orden milimolar y que la mezcla de los disolventes en los cuales se

encuentran los compuestos no genere efectos de calor que puedan ser detectados por el

calorímetro o que no sean mayores a los registrados por el proceso de acomplejamiento.

Los disolventes evaluados fueron los siguientes:

Alcoholes. Se utilizó metanol (50 y 100%) para disolver a las CDs, mientras que

el etanol (60, 70 y 100%) se uso para solubilizar al AF y a las CDs naturales,

considerando que está permitido en las formulaciones para alimentos. Los distintos

porcentajes de los solventes se establecieron con la finalidad de poder determinar su

concentración mínima requerida en la preparación de las soluciones mencionadas.

Hidróxido de sodio. De acuerdo a lo reportado para la solubilización de moléculas

con estructura química similar a la del AF, donde se recomienda el uso de disoluciones de

hidróxido de sodio al 10% (McMurry, 2001), se utilizaron soluciones de NaOH al 0.5%

(pH 9.1) y 10% (pH 12.0), como disolventes de las moléculas estudiadas. El

potenciómetro utilizado fue de la marca HANNA modelo pH 211.

Solución de fosfatos. Se ha reportado que es el disolvente que se recomienda usar

en la técnica de CTI (Bouchemal & Mazzaferro, 2012), por lo que se evalúo esta solución

a una concentración de 50 mM a pH de 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 y 12.0, con la finalidad de

determinar cual podría disolver a homogéneidad al AF.

Todos los disolventes fueron filtrados pasándolos a través de un acrodisco de 13

mm con membrana de nylon de tamaño de poro de 0.45 μm, previo a la incorporación del

AF y las CDs.

Las concentraciones de la solución de AF (3.5 mM) así como de las diferentes

CDs naturales (130, 16.5 y 197.3 mM, para αCD, βCD y γCD, respectivamente), se

establecieron en base a las concentraciones máximas requeridas en las diferentes técnicas

utilizadas en el presente trabajo.

Las muestras fueron disueltas a homogeneidad con agitación constante empleando

41

un vortex marca IKA modelo Genius 3, a temperatura ambiente por treinta minutos.

Seguido, se midió nuevamente el pH para constatar que no varió. La concentración de la

solución de AF fue verificada por un método espectrofotométrico, midiendo la

absorbancia a 307 nm y usando el coeficiente de absortividad ε=log 4.18 M-1

cm-1

(Graf,

1992), se empleó un espectrofotómetro HACH modelo DR500. El uso de este coeficiente

previamente fue corroborado midiendo la A307nm de varias soluciones de AF de

concentración conocida gravimétricamente, y empleando la ecuación de Lambert-Beer.

6.2 OBTENCIÓN DE LOS COMPLEJOS SÓLIDOS DE ÁCIDO FERÚLICO-

CICLODEXTRINA

En un frasco ámbar se mezclaron en una relación molar 1:1, 3.5 mmol de AF y de

la CD en turno, se disolvieron con 50 mL de una solución de fosfatos (50 mM a pH 9.0),

la mezcla se mantuvo con agitación constante por 24 h a temperatura ambiente. Una vez

transcurrido este tiempo, el disolvente se evaporó por calentamiento en una estufa (Felisa

modelo FE-292AD) a 45 ºC por 6 horas y de esta manera se pudo recuperar al complejo

en estado sólido. Después el complejo se colocó en una membrana de nylon de 10 cm,

con tamaño de poro de 0.45 μm, y fue lavado dos veces con 3 mL de una solución de

fosfatos pH 9.0 con la finalidad de remover al AF y las CDs que no se acomplejaron. El

sólido seco se guardó en un desecador hasta que fue analizado por las técnicas de IR,

TGA y CDB.

6.3. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LOS COMPLEJOS DE

ÁCIDO FERÚLICO-CICLODEXTRINA

6.3.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO

Se obtuvieron los espectros de IR de las moléculas sin acomplejar del AF así

como de la αCD, βCD y γCD, también de una mezcla física (AF+CD) y de los

respectivos complejos (AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD). Se realizaron las mediciones por

separado empleando 30 mg de cada una de las muestras analizadas. Para la preparación

de la mezcla física 1:1 se combinaron 15 mg de AF y de la CD en turno, y posteriormente

se generaron los espectros de IR. Las determinaciones se hicieron en un

42

espectrofotómetro de infrarrojo marca Brucker, en el cual se midieron las señales de

transmitancia en un intervalo de 4000 a 500 cm-1

, el espectro final fue el resultado de un

promedio de 24 barridos.

6.3.2. TERMOGRAVIMETRÍA Y CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE

BARRIDO

Empleando un equipo NETZSCH STA 409 PC/PG, se obtuvieron de manera

simultánea los termogramas de CDB y TGA a partir de la medición del flujo de calor y de

la pérdida de peso en el intervalo de temperatura de 0 a 300 °C, tanto para el AF, las αCD,

βCD y γCD, así como los complejos (AF-CD). Se trabajó en una atmósfera controlada de

nitrógeno, con un tamaño de muestra de 5 a 10 mg de cada una de los compuestos

mencionados.

6.3.3. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASES AF-CD

Los diagramas de solubilidad de fases se obtuvieron de acuerdo al método

reportado por Higuchi y Connors (1965). Se prepararon soluciones de AF (3.5 mM) y de

las αCD, βCD y γCD utilizando como disolvente agua destilada. Las solución de la CD

en turno fue incorporada a la del AF en las siguientes relaciones molares 1:0, 1:0.2, 1:0.4,

1:0.6, 1:0.8 y 1:1. La reacción de acomplejamiento se llevó a cabo en tubos de ensaye,

con agitación constante empleando un vortex a su máxima velocidad, por 30 minutos y a

temperatura ambiente. Pasado este tiempo, las muestras fueron filtradas utilizando

acrodiscos de 13 mm de nylon de 0.45 μm. Del filtrado se preparó una dilución 1:50

empleando agua destilada, para determinar la concentración de AF por el método

espectrofotométrico antes descrito. Se generaron los diagramas de solubilidad de fases

graficando la concentración de AF disuelto contra la concentración de CD utilizada; se

ajustó la ecuación de una recta a los datos experimentales utilizando la ecuación 6.

6.4. ENERGÉTICA DEL PROCESO DE ACOMPLEJAMIENTO DEL ÁCIDO

FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS

6.4.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA

Se utilizó un calorímetro de titulación isotérmica MicroCal iTC200, que consta de

43

un sistema de inyecciones automático, una celda de muestra de 200 μL y una pipeta de

inyección de 40 μL. Para llevar a cabo la titulación calorimétrica tanto el AF como las

CDs fueron disueltas en solución de fosfatos 50 mM, pH 9.0. En la celda del equipo

fueron colocados 200 μL de la solución del AF a una concentración de 3.5 mM, la cual

fue establecida en experimentos previos con la finalidad de poder obtener mediciones de

calor por encima del límite de detección del calorímetro. Las soluciones que se utilizaron

fueron desgasificadas previamente a una presión de 460 mmHg, con agitación moderada,

durante 5 minutos a 25 ºC. El programa de titulación usado consistió de 20 inyecciones,

el volumen de la primera inyección fue de 0.4 μL y las 19 subsecuentes de 2 μL, con un

intervalo de tiempo entre cada inyección de 180 s. Las condiciones en el equipo fueron:

temperatura de 25.0 ºC, velocidad de agitación de 1000 rpm y una señal de referencia de

11.4 μcal/s. Una vez finalizada la titulación calorimétrica se midió el pH de las soluciones

para determinar algún cambio. Las soluciones fueron preparadas al momento de su uso.

El volumen total de la solución de CDs con el que se tituló a la del AF fue de 38.4 μL a

una concentración de 130.0, 16.5 y 197.3 mM de la αCD, βCD y γCD, respectivamente.

También se midió el calor de dilución, para lo cual se tituló amortiguador con cada una

de las CDs bajo las condiciones experimentales ya mencionadas.

Mediante el software del calorímetro se realizó la integración del área bajo la

curva de cada pico, tanto de la reacción de acomplejamiento como la del calor de dilución,

a los calores de reacción se les restó el calor de dilución, obteniendo de este modo el

valor que fue graficado generando la curva de titulación; se realizó una regresión no

lineal con los datos experimentales y de esta manera se obtuvieron los valores de la Ka,

de la ΔHa así como de la estequiometria de unión (n). Posteriormente se calculó la ΔGa y

la ΔSa a partir de los parámetros anteriores, con las ecuaciones 2 y 7.

6.4.2. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Se empleó un espectrofluorímetro marca ISS, modelo K2 Champaing, IL, E.U.A.

para obtener los cambios en la intensidad de fluorescencia por la formación del complejo

AF-CD. El AF (3.5 mM) y las αCD (130.0 mM), βCD (16.5 mM) y γCD (197.3 mM)

fueron disueltas, por separado, en solución de fosfatos 50 mM a pH 9.0. Para la solución

44

del AF las longitudes de onda máximas de excitación y de emisión, fueron 340 y 445 nm,

respectivamente. La intensidad de fluorescencia del AF para cada adición de CD durante

la titulación, fue el valor promedio de cinéticas con una duración de 114 s. El volumen

inicial de AF en la celda fue de 2500 μL a una concentración de 0.020 mM. El número y

volumen de cada una de las inyecciones de la solución de CD se estableció en base a la

saturación requerida. Los datos de intensidades de fluorescencia inicial y de cada

concentración del complejo AF-CD fueron corregidos restándole el valor promedio de la

señal de fluorescencia del amortiguador.

La intensidad de fluorescencia del AF fue medida al inicio (IFt) y después de cada

adición de CD (IFi). El cambio de la IF se determinó empleando la ecuación 8, para la

titulación con αCD, y la ecuación 9 para el caso de βCD y γCD.

Y= (IFi/ IFt)-1 Ec. 8

Y=1-(IFi/ IFt) Ec. 9

Donde Y representa la intensidad de fluorescencia que la molécula de AF perdió

por su inclusión en la cavidad de la CD. El valor de Y fue graficado contra la

concentración de CD correspondiente, y se ajustó con la ecuación 10 mediante una

regresión no lineal.

Y =a

2AT(AT + Kd + X ± √(AT + Kd + X)2 − 4ATX) Ec. 10

Donde

AT: concentración del AF alcanzada en cada adición de titulante.

Kd: constante de disociación del complejo.

X: concentración de la CD alcanzada en cada adición de titulante

a: constante de apagamiento

Del valor inverso de la Kd se obtuvo el dato de la Ka, tomando como base que la reacción

de la formación de complejo es reversible AF+CD AF-CD. A partir de Ka se calculó la

ΔGa (Ecuación 2).

Adicionalmente, se registraron los espectros de emisión generados de cada

45

titulación del AF con la CD, a partir de los cuales se calcularon los centros de masas

espectrales (CME), utilizando la siguiente ecuación:

CME =∑λiIFi

∑ IFi Ec. 11

Donde IFi es la intensidad de fluorescencia que corresponde a cada longitud de

onda λi, del espectro de emisión (350-500 nm). La λ de excitación fue 340 nm. El análisis

de los datos de los CME permitió determinar si el acomplejamiento del AF con CD

promovió desplazamientos en su máxima longitud de onda, lo cual proporciona

información de cambios en la polaridad del medio que rodea a la molécula del fluoróforo

(AF).

6.5. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF EN EL PROCESO DE

ACOMPLEJAMIENTO CON CICLODEXTRINAS

6.5.1. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Para analizar el efecto de la carga del AF (0, 1- y 2

-) en la Ka durante el proceso de

acomplejamiento con las CDs, se realizaron titulaciones fluorométricas siguiendo la

metodología descrita en el apartado 6.4.2., a tres diferentes pHs: 4.0 (amortiguador de

citratos), 7.0 (amortiguador de fosfatos) y 9.0 (amortiguador de boratos), todos a una

concentración de 50 mM. Las longitudes de onda de excitación y de emisión máximas

usadas para el AF fueron: a pH 4.0 de 340 y 435 nm; a pH 7.0 de 310 y 400 nm, y por

último a pH 9.0 de 340 y 445 nm.

6.5.2. SIMULACIÓN DEL ACOPLAMIENTO MOLECULAR (DOCKING)

Para obtener información teórica a nivel molecular del efecto del estado de

protonación del AF sobre la afinidad en el proceso de su acomplejamiento con CDs, se

realizó un análisis computacional (docking) empleando el programa Molecular Operating

Environment (MOE), de la molécula de AF únicamente con carga 0 y 1-, considerando

que experimentalmente fueron los estados de protonación con mayor afinidad.

Se hizo un análisis de puntuación de ΔGa de la formación del complejo del AF

46

con la αCD, la βCD y la γCD, además se obtuvieron las estructuras en 3D de cada uno de

los complejos. Las estructuras cristalográficas correspondientes a las αCD, βCD y γCD

fueron tomadas de la base de datos Protein Data Bank (2014), y en el caso de la

estructura de la molécula de AF fue construida con MOE.

Para realizar la simulación del acomplejamiento se utilizó una orientación tipo

triángulo alfa para la colocación del AF dentro de las cavidades de las CDs, se asignaron

las funciones Affinity DG y London DG, así como los campos de fuerza MMFF94x y

AMBER99. Al parámetro dieléctrico se le asigno un valor de 4 porque la formación del

complejo se llevó a cabo en un sistema acuoso.

Una vez construidas y parametrizadas las moléculas, se realizó la minimización

de energía y se inició el proceso de acoplamiento (docking). Se generaron 100

confórmeros del modo en que el AF se puede llegar a introducir en la cavidad de las CDs.

Estos confórmeros fueron registrados y enlistados en orden descendente, en base a la

puntuación de ΔGa, comenzando por los valores más negativos.

47

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En esta sección los resultados y discusión se presentan en cuatro apartados: i) el

disolvente y las condiciones que se establecieron para solubilizar a homogeneidad tanto

al AF como a las CDs; ii) la confirmación de la formación del complejo mediante el

análisis y discusión de los espectros de IR, de los termogramas de CDB y TGA, así como

de diagramas de solubilidad de fases; iii) el estudio de la energética del proceso de

acomplejamiento entre el AF y las CDs a partir de los datos generados por CTI, además

del análisis comparativo de la Ka y ΔGa obtenidos mediante CTI y titulación

fluorométrica; y iv) el efecto del estado de protonación del AF sobre la afinidad de

acomplejamiento con cada una de las CDs, realizado por titulación fluorométrica y

modelado molecular (docking).

7.1. SOLUBILIZACIÓN A HOMOGENEIDAD DEL ÁCIDO FERÚLICO Y DE

LAS CICLODEXTRINAS, EN UN DISOLVENTE COMÚN

Los resultados de las pruebas de solubilidad para el AF y las CDs se muestran en

la tabla 10.

Tabla 10. Solubilidad del AF y las CDs empleando diferentes disolventes.

Se llevó a cabo con agitación constante, a temperatura ambiente por 30

min y sin exposición a la luz.

Disolvente

Ácido

ferúlico

(mM)

Ciclodextrinas (mM)

Alfa Beta Gama

1 3.5 130 16.5 197.3

Metanol 50 % H H NH NH NH

100% H H NH NH NH

Etanol

60 % H H NH NH NH

70 % H H NH NH NH

100 % H H NH NH NH

NaOH 0.5 % H H H H H

10 % H H H H H

Fosfatos, 50

mM

pH 7.0 H NH H H H

pH 8.0 H NH H H H

pH 9.0 H H H H H

pH 10.0 H H H H H

pH 11.0 H H H H H

pH 12.0 H H H H H

H: Solución homogénea. NH: Solución no homogénea.

48

Estos resultados mostraron que no se obtuvieron soluciones homogéneas cuando

se utilizó al etanol en ninguno de los porcentajes ensayados, y que las tres CDs fueron

insolubles en metanol. Los disolventes con los cuales se lograron obtener soluciones

homogéneas tanto del AF (1 mM) como de las CDs fueron el NaOH (0.5 y 10 %) y la

solución de fosfatos en el intervalo de pH ensayado; para la concentración 3.5 mM de AF

solamente se obtuvieron soluciones homogéneas a partir del pH 9.0. De lo anterior, se

decidió trabajar con la solución de fosfatos 50 mM a pH 9.0, sin embargo, de acuerdo con

los valores de pKa (2.14, 7.19 y 12.35), a pH 9.0 no funciona como amortiguador, y

debido a que hasta el momento se desconocía si el proceso de acomplejamiento entre AF

y las CDs generaría cambios en el pH del medio de reacción, se decidió utilizar también

como disolvente una solución de boratos 50 mM, pH 9.0 (pKa 9.23), con el que se

lograron obtener, de la misma forma soluciones homogéneas.

7.2. CONFIRMACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO AF-CD

A continuación se muestran los resultados generados con cada una de las técnicas

utilizadas, a partir de los cuales se pudo confirmar la formación del complejo sólido entre

el AF con cada una de las CDs.

7.2.1. ESPECTROS DE INFRAROJO

Se realizó el análisis de los espectros de IR de los compuestos puros, la mezcla

física (AF+CD) y de los complejos correspondientes: AF-αCD (Figura 10), AF-βCD y

AF-γCD. Comparando los espectros de las moléculas sin acomplejar con los espectros de

las mezclas físicas no se observaron modificaciones en la longitud de onda de la

vibración atribuida a los grupos funcionales principales. Las CDs del complejo mostraron

un cambio a 1641 cm-1

y en el caso de la αCD se observó además a los 997 cm-1

, con

respecto a las moléculas libres. En lo tocante al AF, en la tabla 11 se muestra de manera

comparativa los números de onda de las vibraciones de sus grupos funcionales

característicos, contra los obtenidos de cada uno de los complejos. Se presentaron ligeros

cambios en la forma e intensidad de las vibraciones de los complejos en relación a las

bandas correspondientes del AF libre.

49

Figura 10. Comparación de los espectros de IR. Ácido ferúlico (línea

azul), αCD (línea negra), mezcla física de AF con αCD (AF-ACD) (línea

verde) y el complejo entre el AF con αCD (AF-ACD) (línea roja).

Tabla 11. Permanencia o desaparición de las bandas características del

AF libre y acomplejado con la αCD, βCD y γCD.

Enlace AF (cm-1

) AF-αCD AF-βCD AF-γCD

O-Hácido carboxílico 3431 P P P

C-HMetilo 2839 NP NP NP

C=Oácido carboxílico 1687 NP NP NP

C=Caromático 1661 NP NP NP

C=Caromático 1617 NP NP NP

C=Caromático 1589 NP NP NP

C=Caromático 1509 NP NP P

-CH3 1430 NP NP P

O-Hfenol 1265 P P P

C-Haromático (para-) 850 NP NP NP

C-Haromático (para-) 801 NP NP NP

C-Haromático (meta-) 751 NP P P

C-Haromático (meta-) 685 NP P P

P: Permanece; NP: No permanece.

Frecuencias asignadas en base a lo reportado por Schrader (2008).

50

Las bandas de los dobles enlaces del anillo bencénico del AF (1661 a 1509 cm-1

)

ya no se observaron en el espectro del complejo formado con cada una de las CDs. Por

otro lado, las bandas correspondientes al O-H del ácido carboxílico (3431 cm-1

) y del

fenol (1265 cm-1

) ambos grupos de la molécula del AF, en el espectro de los complejos

con la αCD, βCD y la γCD permanecieron, lo que indicaría que tanto la sección del ácido

carboxílico como la del fenol se encuentran fuera de la cavidad de las CDs. Con respecto

al enlace metilo de la estructura del AF (1430 cm-1

), en el caso de las αCD y βCD no

permaneció lo cual implicaría que quedó al interior de la cavidad, caso contrario se

observó cuando el AF fue acomplejado con la γCD ya que la banda de este enlace se

mantuvo.

Las diferencias en los espectros de IR entre las moléculas de AF y CDs libres y

formando el complejo AF-CD, indicaron que el AF fue acomplejado con la αCD, βCD y

la γCD; los cambios observados en las bandas de algunos de los enlaces característicos de

las moléculas del AF y las CDs, revelaron que el AF se introdujo parcialmente en la

cavidad de las CDs estudiadas.

Hasta el momento, no se ha reportado el uso de espectroscopía de infrarrojo para

analizar la formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD, AF-γCD. Wang et al. (2011)

utilizaron esta técnica para confirmar la inclusión del AF en la HP-βCD, comparando los

espectros del complejo con el de las moléculas sin acomplejar y de una mezcla física (AF

+ HP-βCD). No observaron cambios en los espectros de IR de las moléculas libres con el

de la mezcla física, sin embargo, sí mostraron diferencias con respecto al del complejo,

tales como el desplazamiento y decremento en intensidad de algunas bandas

correspondientes al anillo aromático (1620-1205 cm-1

), mientras que otras desaparecieron

totalmente: 2836 cm-1

(C-H del grupo metilo), 1431 cm-1

(núcleo aromático) y 804 cm-1

(átomos de hidrógeno del anillo fenilo del AF). También observaron el aumento de la

intensidad de la banda alrededor de los 3415 cm-1

, debido al incremento en el número de

grupos hidroxilo. Los autores concluyeron que el AF se incluyó en la cavidad de la HP-

βCD sugiriendo además que el anillo aromático se encuentra dentro de la CD y que la

parte polar (ácido carboxílico) de la molécula del AF quedó hacia afuera de esta. Los

resultados reportados por Wang et al. (2011) concuerdan con los obtenidos en el presente

trabajo con los complejos AF-αCD, AF-βCD, AF-γCD, lo que implicaría que el modo de

51

inclusión del AF en las CDs naturales fue similar al que se llevó a cabo con la

ciclodextrina modificada.

7.2.2. TERMOGRAMAS DE TERMOGRAVIMETRÍA Y CALORIMETRÍA

DIFERENCIAL DE BARRIDO

Al comparar los termogramas de TGA correspondientes a las moléculas del AF,

la αCD, la βCD, la γCD así como de los complejos AF-αCD (Figura 11), AF-βCD y AF-

γCD, revelaron diferencias en las temperaturas y en el porcentaje de pérdida de peso

(Tabla 12).

Figura 11. Comparación de los termogramas de TGA. Ácido ferúlico

(línea azul), αCD (línea verde) y el complejo AF-αCD (línea roja).

Tabla 12. Temperaturas y porcentajes de pérdidas de peso obtenidos a

partir de los termogramas de TGA del AF, la αCD, βCD y γCD así como

de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.

Ácido ferúlico

Temperatura (ºC) 299.3

Pérdida de peso (%) 73.73

αCD βCD γCD

Temperatura (ºC) 56 98 141 298.9 130 299.4 142 298.9

Pérdida de peso (%) 0.58 6.26 1.07 5.53 10.98 4.80 6.30 6.50

AF-αCD AF-βCD AF-γCD

Temperatura (ºC) 130 247 395 162 227 376 120 226 387

Pérdida de peso (%) 7.02 5.35 44.12 7.61 3.65 44.87 9.91 3.98 45.58

52

En el gráfico del AF (Figura 11) se observó que al incrementarse la temperatura el

peso se mantuvo constante (10.2 mg), sin embargo, a patir de los 180°C se formó una

meseta con una caída del 73.73% del peso al llegar a 299.3°C, es decir, se perdieron 7.52

mg y se recuperaron del experimento 2.68 mg del peso, lo que sugiere una

descomposición de la molécula de AF. Respecto a las CDs, todas tuvieron pérdida de

peso (4.8-6.5%) aproximadamente a los 299 °C (Tabla 12). En los termogramas de αCD

se presentaron varios hombros a diferencia de la βCD y la γCD; a los 40 °C se apreció un

pequeño decaimiento del peso (0.58%) y alrededor de 56 °C se observó otra pendiente

mas pronunciada debida a un segundo cambio de masa, mientras que a los 98 °C se

presentó una tercer caída mucho mas suave y pequeña. Al continuar el incremento en

temperatura no se apreciaron cambios en la estructura hasta llegar a los 270 °C aprox.

donde se originó un hombro con una pendiente pronunciada, indicando un proceso de

descomposición de la estructura orgánica. En el caso de las βCD y γCD, el porcentaje de

pérdida entre una temperatura y otra solamente fue del 2.2 y 0.96 %, respectivamente

(Tabla 12). La pérdida de peso de 130 a 142 °C en las CDs pudo ser debida al

desprendimiento de moléculas de agua.

De acuerdo a los datos presentados en la tabla 12, los tres complejos estudiados

mostraron pérdidas de peso en los siguientes porcentajes 7.02-9.91, 3.65-5.35 y 44.12-

45.58, en los intervalos de temperatura de 120-162 °C, 226-247 °C y 376-395°C,

respectivamente. Del análisis anterior, podemos proponer que los cambios observados

pueden deberse a la inclusión del AF en la cavidad de las CDs naturales.

da Rosa et al. (2013) usaron TGA para analizar la formación del complejo entre

ácido gálico (AG) y la βCD; el termograma del AG presentó una pérdida del 8.3 y 10 %

(101 y 225.6 °C, respectivamente), y para el AG-βCD fue del 10 y 13.2 % (85 y

245.2 °C, respectivamente), comprobando de esta manera la formación del complejo

entre el AG y la βCD. Esta información concuerda con los resultados que se encontraron

en el presente estudio, porque la pérdida de peso para el complejo fue hasta del 45 % a

los 400 °C aprox., comparado con el 73 % a los 300 °C para el AF libre. Hasta el

momento no se han reportado estudios de TGA para la determinación de la formación del

complejo AF-CD.

53

Respecto a las curvas de CDB (Figura 12), se debe mencionar que en el

termograma del AF destacó un pico endotérmico a 177 °C, correspondiente a la

temperatura de fusión de dicha molécula. Así mismo, se observaron transiciones

conformacionales a 45.4 y 252.8 °C, la última temperatura posiblemente corresponde a la

degradación de la molécula. Por otro lado, el pico endotérmico del AF en 177 °C

prácticamente desapareció en los termogramas de los complejos, por lo que se puede

decir que posiblemente la cavidad de las CDs le confirió protección al AF. Además, el

punto de fusión de cada una de las CDs fue menor a los 300 ºC, y mayor que este valor

para los complejos correspondientes (Tabla 13). En el gráfico del complejo se observó un

pico exotérmico el cual está relacionado posiblemente con un proceso de

descomposición, es decir, se liberó la energía acumulada de los procesos de fusión de

cada molécula implícita en el complejo.

Figura 12. Comparación de los termogramas de CDB. Ácido ferúlico

(línea azul), αCD (línea verde) y el complejo AF-αCD (línea roja).

Tabla 13. Temperaturas de las transiciones conformacionales obtenidas a

partir de los termogramas de CDB del AF, la αCD, βCD y γCD, así como

de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.

Temperaturas de las transiciones conformacionales (ºC)

Ácido ferúlico 45.4 177 252.8

αCD βCD γCD

56.2 88.8 141.3 289.5 86.7 221.3 299.4 70.7 122 286.4 295.6

AF-αCD AF-βCD AF-γCD

46.60 202.4 323.2 51.0 209.4 326 50.0 201.2 320.6

54

En el 2004 Anselmi et al. mediante la técnica de CDB analizaron la formación del

complejo AF-γCD, comparando los termogramas del AF, de la γCD y del complejo.

Observaron la desaparición del pico del punto de fusión del AF a 175.2 ºC, también hubo

un desplazamiento y la ampliación de dos bandas características de la γCD (288.3 a 269.7

◦C y de 93.7 a 85.7 ºC), lo cual fue indicativo de una interacción entre el AF y la CD. Los

cambios en los termogramas de CDB concuerdan con lo observado en el presente estudio,

respecto a la desaparición de la banda característica del punto de fusión del AF y al

corrimiento de la banda con la formación del complejo AF-γCD.

7.2.3. DIAGRAMA DE SOLUBILIDAD DE FASES

La capacidad que tienen la αCD, la βCD y la γCD para incrementar la solubilidad

al AF se demostró con el diagrama de solubilidad de fases (Figura 13), donde se observó

un aumento directamente proporcional a la concentración de cada una de las CDs, en el

siguiente orden βCD>γCD>αCD (Tabla 14).

Figura 13. Diagrama de solubilidad de fases del ácido ferúlico en

presencia de αCD (●), βCD (■) y γCD (♦). Las concentraciones

utilizadas de CDs fueron 0.7, 1.4, 2.1, 2.8 y 3.5, para el AF fue de 3.5

mM. El disolvente fue agua destilada pH 6.7 y 25 ºC.

55

Tabla 14. Cálculo de la Ks para el acomplejamiento del AF con las CDs

naturales. El valor de la pendiente se obtuvo a partir del ajuste de los

datos experimentales con la ecuación de la recta.

Ciclodextrina αCD βCD γCD

Pendiente (m) 0.2327 0.2609 0.2403

R2 0.9809 0.9770 0.9874

Ks (M-1

) 125.84 146.47 131.25

El diagrama de solubilidad de fases mostró un aumento de la solubilidad del AF

conforme se incrementó la concentración de cada una de las CDs, y el orden de reacción

fue 1, por lo que se concluyó que el diagrama de solubilidad de fases en los tres casos fue

del tipo AL (Higuchi & Connors, 1965).

La solubilidad del AF a una concentración de 3.5 mM, se incrementó 1.40, 1.36 y

1.34 veces cuando se incorporó la βCD, la γCD y la αCD, respectivamente. Zhang et al.

(2009) reportaron un aumento de seis veces la solubilidad del AF cuando se utilizó la HP-

βCD, y 3 veces cuando se utilizó 10 mM de la βCD, cuyo valor fue el doble al

determinado en el presente estudio, sin embargo, utilizaron una concentración 3 veces

mayor de la CD. Por otro lado, Wang et al. (2011) reportaron la una Ks 166.3 M-1

cuando

el AF se acomplejó con 8.4 mM HP-βCD, registrando un incremento de 15 veces en la

solubilidad del AF. Marques, Hadgraft & Kellaway, (1990), llevaron a cabo un estudio

comparativo de solubilidad de fases para el acomplejamiento del salbutamol con la αCD,

βCD y γCD, observando un incremento en la solubilidad del compuesto en el siguiente

orden βCD>γCD>αCD, comportamiento similar al del presente trabajo.

7.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO

7.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA

En la figura 14 se muestran los gráficos correspondientes a las curvas de

titulación del AF con cada una de las CDs, en solución de fosfatos 50 mM pH 9.0. A

partir del ajuste de la curva de titulación calorimétrica, tanto en solución de fosfatos

como en amortiguador de boratos, se calcularon los valores de los parámetros

termodinámicos para el proceso de acomplejamiento de dichas moléculas y se reporta el

promedio de tres experimentos (Tabla 15).

56

Figura 14. Titulaciones calorimétricas isotérmicas del AF con αCD (A),

βCD (B) y γCD (C). Se utilizó como disolvente una solución de fosfatos

50 mM, pH 9.0 y 25 °C. La concentración de AF fue de 3.5 mM y 130,

16.5 y 197.3 mM para las αCD, βCD y γCD, respectivamente.

Tabla 15. Parámetros termodinámicos de la formación de los complejos

AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD obtenidos por CTI. Las moléculas fueron

disueltas en soluciones de fosfatos y boratos (50 mM, pH 9.0) a 25 ºC.

DISOLVENTE COMPLEJO Ka

(M-1

)

ΔHa

(kJ/mol)

TΔSa

(kJ/mol)

ΔGa

(kJ/mol)

FOSFATOS

AF-αCD 53.10 ± 2.67 -18.32 ± 1.00 -8.48 ± 0.00 -9.84 ± 0.13

AF-βCD 90.23 ± 17.12 -9.43 ± 2.00 1.70 ± 0.01 -11.13 ± 0.45

AF-γCD 81.35 ± 39.10 -4.95 ± 1.09 5.80 ± 0.01 -10.75 ± 1.24

BORATOS

AF-αCD 53.20 ± 3.41 -18.00 ± 0.75 -8.15 ± 0.00 -9.85 ± 0.16

AF-βCD 176.50 ± 4.95 -6.36 ± 0.47 6.46 ± 0.00 -12.82 ± 0.07

AF-γCD 19.37 ± 0.40 -11.27 ± 0.36 -3.92 ± 0.00 -7.35 ± 0.05

El análisis comparativo de los parámetros ΔGa, ΔHa y TΔSa con la difetentes CDs

(tabla 15), se ilustra en el gráfico 1, donde podemos observar que los valores de ΔGa

revelaron que el proceso de acomplejamiento del AF con las tres CDs naturales se lleva a

cabo de manera espontánea debido a una entalpía favorable, tanto en solución de fosfatos

como en boratos. En el caso de la βCD (fosfatos y boratos) y la γCD (fosfatos), el

proceso de acomplejamiento también fue entrópicamente favorecido.

A B C

57

Gráfico 1. Parámetros termodinámicos de la formación de los complejos

AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD obtenidos por CTI. Las moléculas fueron

disueltas en soluciones de fosfatos y boratos (50 mM, pH 9.0) a 25 ºC.

Empleando ambos disolventes, las entalpías obtenidas indicaron una liberación de

energía en el proceso de formación de los complejos y posiblemente la generación de

interacciones de van der Waals y puentes de hidrógeno entre el AF y la cavidad de la CD;

la αCD fue la que mostró un valor mayor de entalpía. Además, en fosfatos la entropía

obtenida para los complejos AF-βCD y AF-γCD fue positiva, lo que puede asociarse con

la liberación de moléculas de disolvente de la cavidad de la CD para la formación del

complejo (desolvatación); mientras que el valor negativo para αCD puede ser debido a

una disminución en la libertad de movimiento de la molécula del AF una vez que se

introdujo en su cavidad.

Se observó que el cambio de disolvente influyó en los valores de los parámetros

termodinámicos de la formación de los complejos AF-βCD y AF-γCD, lo cual no ocurrió

cuando se realizó el acomplejamiento con la αCD. Este hecho fue observado también con

la técnica de fluorescencia.

El análisis comparativo del valor de la Ka y la ΔGa mostró que a 25 ºC y pH 9.0 la

afinidad para acomplejar el AF cambió conforme al uso de disolvente, cuando se utilizó

como disolvente fosfatos el orden fue βCD>γCD>αCD, mientras que cuando se usó

boratos el orden fue βCD>αCD>γCD (Gráfico 2). El uso de fosfatos como disolvente

generó el mismo orden de afinidad con las dos técnicas, por lo que se concluye que fue el

mejor disolvente para el análisis comparativo de los parámetros termodinámicos del

proceso de acomplejamiento del AF con las CDs.

58

Gráfico 2. Comparativo de las ΔGa obtenidas mediante CTI. Las

moléculas fueron disueltas en soluciones de fosfatos y boratos (50 mM,

pH 9.0) a 25 ºC.

Hasta el momento no se ha realizado el estudio de la energética del proceso de

acomplejamiento entre AF y las αCD, βCD y γCD utilizando CTI, sin embargo, en el

2010 Álvarez-Parrilla et al. estudiaron la inclusión del ácido clorogénico en la βCD

empleando ésta técnica a pH 5 y 25 ºC. Los resultados mostraron que para que se llevara

a cabo la introducción del ácido clorogénico en la cavidad de la βCD se tuvieron que

haber generado fuerzas de van der Waals y puentes de hidrógeno, ya que los parámetros

termodinámicos obtenidos fueron negativos para la entalpía y positivos para la entropía;

lo cual coincide con lo observado en el presente estudio. El valor de la ΔGa que presentó

el acomplejamiento del ácido clorogénico con la βCD es negativo, lo que indicó que el

proceso se llevó a cabo de manera espontánea al igual que la inclusión del AF en la

cavidad de la αCD, βCD y γCD.

Por otro lado, en un estudio del acomplejamiento del resveratrol con las tres CDs

naturales se observó que la unión de esta molécula con αCD generó el valor mayor de la

entalpía (Li et al., 2010) al igual que el presente estudio. Con respecto al complejo

resveratrol-βCD su formación fue favorecida entálpica y entrópicamente, generando

posiblemente interacciones de van der Waals y puentes de hidrógeno, así como la

desolvatación de moléculas de agua de la cavidad de la CD, un comportamiento similar a

lo observado en la formación de complejo AF-βCD.

7.3.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA

El acomplejamiento del AF con la αCD generó un incremento en la intensidad de

fluorescencia, mientras que la unión con la βCD y la γCD mostraron un descenso de la

misma (Figura 15). Este comportamiento fue observado tanto con la solución de fosfatos

59

A

como en la de boratos. Como anteriormente se expuso, estos cambios están asociados a la

formación del complejo.

El incremento observado en la intensidad de fluorescencia por el acomplejamiento

con la αCD pudo ser generado por un cambio en la polaridad del ambiente que rodea al

AF, pasando de uno polar, como lo es el amortiguador, a uno menos polar, como lo es la

cavidad de la CD. Este aumento en la intensidad de fluorescencia es el esperado en un

proceso de acomplejamiento de un fluoróforo. Sin embargo, se observó un

comportamiento inusual en el cambio de la intensidad de fluorescencia cuando se

acomplejó el AF con la βCD y γCD, presentándose un descenso de la misma.

Figura 15. (A) Espectros de emisión de fluorescencia del AF (0.020 mM)

durante la titulación fluorométrica con αCD (0-18.7 mM), βCD (0-0.9

mM) y γCD (0-5.9 mM) a pH 9.0. (B) CME del AF al inicio y al final de

la titulación fluorométrica con la αCD, βCD y γCD. Las moléculas

fueron disueltas en soluciones de fosfatos y boratos (50 mM, pH 9.0) a

25 ºC.

B

60

Tomando en cuenta que el AF a pH 9.0 se encuentra con carga 2- debido a la

formación del carboxilato y el fenolato, se pudo haber generado un mayor número de

puentes de hidrógeno en las cavidades de las βCD y γCD provocando un fenómeno de

apagamiento, es decir, que la energía del estado excitado se perdió por contacto del AF

con la cavidad de la CD. Cabe señalar que la formación de puentes de hidrógeno para el

caso de los complejos βCD y γCD, fue determinado a partir del análisis de la energética

mediante CTI. Por otro lado, utilizando como disolvente fosfatos, el CME para el AF

mostró un corrimiento al azul de 3.1 nm al formar el complejo con la αCD, lo que indicó

que el AF pasó de un medio polar a uno no polar, lo cual concuerda con el aumento en la

intensidad de fluorescencia. Los CME obtenidos del acomplejamiento con la βCD y γCD

utilizando como disolvente fosfatos no mostraron un cambio mayor a 1 nm, por lo que se

puede deducir que el acomplejamiento no estuvo regido por el cambio en la polaridad del

medio si no por las interacciones generadas entre las dos moléculas, lo que se vió

reflejado en el descenso en la intensidad de fluorescencia.

Cuando se utilizó como disolvente el amortiguador de boratos también se observó

una disminución en los valores de CME de 0.5, 3.2 y 4.3 nm para αCD, βCD y γCD,

respectivamente (Figura 15), indicando que el AF pasó de un entorno polar a uno no

polar. Además de la formación de puentes de hidrógeno entre al AF con la βCD y la γCD,

lo que posiblemente generó el apagamiento de fluorescencia, como se mencionó

anteriormente.

Por otro lado, los complejos en 3D obtenidos por docking, mostraron que la

introducción del AF en la cavidad de la αCD fue total mientras que en las cavidades la

βCD y la γCD fue parcial, quedando el ácido carboxílico más expuesto en la abertura

amplia de las CDs, posiblemente por la formación de puentes de hidrógeno, lo cual pudo

haber generado el fenómeno de apagamiento de fluorescencia.

Los resultados obtenidos por Zhang et al. (2009) mostraron un incremento en la

intensidad de fluorescencia cuando se acomplejó el AF con la βCD, sin embargo, en

ninguno de estos estudios se mencionó el pH en el que se llevó a cabo la titulación

fluorométrica.

El acomplejamiento con CDs de moléculas como la vainillilamina, la serotonina y

las catequinas, mostraron un aumento en la intensidad de fluorescencia, lo que sólo

61

concuerda con lo observado en el acomplejamiento con la αCD y no con las otras dos

CDs, cabe mencionar que en estos estudios las moléculas fueron disueltas en soluciones

metanol/agua o etanol/agua para favorecer su solubilidad. Esto pudo influir en los

cambios de intensidad de fluorescencia (Sivasankar et al., 2012; Chaudhuri, Chakraborty

& Sengupta, 2010; Folch-Cano et al., 2010).

De las curvas de titulación fluorométricas (Figura 16) se determinó la

concentración requerida de CD para acomplejar a la mayor cantidad de moléculas de AF

en solución, es decir que se alcance la saturación. La CD con la cual se necesitó la mayor

concentración fue la αCD, seguida de la γCD, y por último la βCD, en base a lo anterior

se pudo concluir que el orden en la afinidad para la formación del complejo con el AF fue

βCD> γCD> αCD.

A partir de los ajustes mostrados en la figura 15, se obtuvieron los valores de Ka y

de ΔGa para cada complejo formado (Tabla 16).

Figura 16. Curvas de titulación fluorométrica del AF con la αCD (●),

βCD (■) y γCD (♦) a pH 9.0. Las moléculas fueron disueltas en las

soluciones de fosfatos (A) y de boratos (B), ambos a una concentración

de 50 mM, pH 9.0 y 25.0 °C. El inserto muestra una ampliación de las

curvas de titulación en la gráfica A y B en la escala de la intensidad de

fluorescencia (0 a 0.5), y de la concentración de CD (0-2x10-03

M).

A B

62

Tabla 16. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los

complejos αCD-AF, βCD-AF y γCD-AF. Las moléculas fueron disueltas

en las soluciones de fosfatos y de boratos, ambos a una concentración 50

mM, pH 9.0 y 25.0 °C.

DISOLVENTE COMPLEJO Ka (M-1

) ΔGa (kJ/mol)

FOSFATOS

AF-αCD 131.88 ± 29.63 -12.07 ± 0.56

AF-βCD 7,596.15 ± 141.40 -22.15 ± 0.05

AF-γCD 1,417.44 ± 116.86 -17.98 ± 0.20

BORATOS

AF-αCD 23.58 ± 4.40 -7.81 ± 0.47

AF-βCD 22,882.31 ± 1555.83 -24.88 ± 0.17

AF-γCD 4,623.18 ± 553.91 -20.91 ± 0.30

El análisis termodinámico del proceso de acomplejamiento por fluorescencia

mostró que la mayor afinidad para acomplejar al AF corresponde a la βCD, seguida de la

γCD y la de menor afinidad fue la αCD, lo que concuerda con los resultados obtenidos

por la técnica de CTI (Gráfico 3).

Gráfico 3. Comparativo de las ΔGa obtenidas mediante la técnica de

titulación fluorométrica. Se utilizaron como disolventes fosfatos y

boratos (50 mM) a pH 9.0 y 25.0 ºC.

7.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE LA

AFINIDAD DE ACOMPLEJAMIENTO

7.4.1. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA

El acomplejamiento del AF con carga 1

- con cada una de las CDs naturales,

presentó un comportamiento inusual ya que la intensidad de fluorescencia disminuyó,

debido tal vez a la generación de un mayor número de interacciones con la αCD, la βCD

63

y la γCD, de tal manera que se hizo presente el fenómeno de apagamiento en todos los

casos de acomplejamiento (Figura 17).

La intensidad de la fluorescencia del AF con carga 0 (pH 4.0) y 2- (pH 9.0),

acomplejado con la αCD mostró un aumento, mientras que la introducción del AF en las

cavidades de la βCD y la γCD generó un descenso de la misma, lo que pudo deberse

como ya se mencionó a un fenómeno de apagamiento generado por las interacciones

entre el AF y la CD. Mientras que el acomplejamiento del AF por la αCD solo se vió

afectado por el cambio en la polaridad del ambiente que lo rodea mostrando un

incremento en la intensidad de fluorescencia.

Figura 17. (A) Espectros de emisión de fluorescencia del AF (0.020 mM)

con carga 1- durante la titulación fluorométrica con αCD (0-0.4 mM),

βCD (0-0.08 mM) y γCD (0-0.4 mM) a pH 7.0. (B) CME del AF al

inicio y al final de la titulación fluorométrica con la αCD, βCD y γCD a

los pHs 7.0 y 4.0. Las moléculas fueron disueltas en amortiguador de

fosfatos y citratos a pH 7 y 4 respectivamente ambos a 50 mM y 25 ºC.

A B

64

Cuando se realizaron las titulaciones a pH 7.0 se observó un aumento en los

valores de CME de 2.2 nm para αCD, y de 1.2 nm para βCD y γCD (Figura 17), lo cual

indicó que en el acomplejamiento ocurrió un cambio en la polaridad del ambiente que

rodea al AF, pasando a uno más polar. Los CME obtenidos a pH 4.0 mostraron un

corrimiento en la longitud de onda de emisión máxima de 2.3, 2.1 y 2.5 nm cuando se

formó el complejo con la αCD, la βCD y la γCD, respectivamente, lo que indicó que el

AF paso de un medio polar a uno no polar, lo cual concuerda con el aumento en la

intensidad de fluorescencia obsevado en el caso de la αCD, pero no para las otras dos

CDs.

Qi, Li y Liu (2003) no reportaron ningún comportamiento inusual en la intensidad

de fluorescencia por el acomplejamiento del AF con la αCD, la βCD y la γCD, sin

embargo, cabe señalar que el AF fue disuelto en metanol/agua, lo cual pudo tener

inferencia sobre el efecto en el incremento en la intensidad de fluorescencia.

No obstante, se tiene la evidencia del comportamiento inusual en el cambio de la

intensidad de fluorescencia en otros trabajos, por ejemplo, la titulación de la cumarina

334 con la βCD (Chandrasekaran & Enoch, 2013), mostró una disminución en la

intensidad de fluorescencia a causa del acomplejamiento, dando la posible explicación de

que la generación de un catión en la cumarina 334 por efecto del pH pudo haber

provocado la formación de puentes de hidrógeno con los hidroxilos de la βCD, y de ésta

manera se originó el fenómeno de apagamiento de la fluorescencia. También Wang et al.

(2011) observaron que el acomplejamiento de una molécula (adamantano carboxilato o

deoxicolato) con tres CDs modificadas fluorescentes no siguió un patrón común en el

cambio de intensidad de fluorescencia. La posible explicación que dieron fue que la

benzamida (estructura que confiere fluorescencia a las CDs) no se desplazó totalmente

fuera de la cavidad de la CD, por la formación de puentes de hidrógeno con los hidroxilos

de la misma y el contacto con las moléculas de agua del disolvente, generando el

fenómeno de apagamiento de fluorescencia.

Por otro lado, en las curvas de las titulaciones fluorométricas del AF con carga 1-

y 0 (pH 7.0 y 4.0, respectivamente), se observó que la afinidad de acomplejamiento del

AF está en función de la concentración de CD como ya se mencionó antes (Figura 17).

65

Figura 18. Curvas de titulación fluorométrica del AF con la αCD (●),

βCD (■) y γCD (♦) pH 7.0 (A) y pH 4.0 (B). Las moléculas fueron

disueltas en amortiguador de fosfatos (A) y de citratos (B), ambos a una

concentración de 50 mM, pH 7.0 y 4.0 a 25 °C respectivamente. El

inserto muestra una ampliación de las curvas de titulación en la gráfica A

y B en la escala de la intensidad de fluorescencia (0 a 0.5), y de la

concentración de CD (0 a 0.1 m M).

Tabla 17. Valores de la Ka y de la ΔGa obtenidos por titulación

fluorométrica de la formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-

γCD a pH 9.0, 7.0 y 4.0. Se utilizaron los amortiguadores de fosfatos (pH

7.0), boratos (pH 9.0) y citratos (pH 4.0), todos a una concentración de

50 mM y 25 °C.

DISOLVENTE COMPLEJO Ka (M-1

) ΔGa (kJ/mol)

Fosfatos 50 mM, pH 9.0

AF-αCD 131.9 ± 29.6 -12.07 ± 0.56

AF-βCD 7,596 ± 141 -22.15 ± 0.05

AF-γCD 1,417 ± 117 -17.98 ± 0.20

Boratos 50 mM, pH 9.0

AF-αCD 23.58 ± 4.40 -7.81 ± 0.47

AF-βCD 22,882 ± 1,555 -24.88 ± 0.17

AF-γCD 4,623 ± 554 -20.91 ± 0.30

Fosfatos 50 mM, pH 7.0

AF-αCD 50,717 ± 1,157 -26.86 ± 0.06

AF-βCD 1,548,000 ± 581,000 -35.24 ± 0.95

AF-γCD 4,514 ± 642 -20.85 ± 0.35

Citratos 50 mM, pH 4.0

AF-αCD 3,791.9 ± 47.4 -20.43 ± 0.03

AF-βCD 135,995 ± 27,150 -29.28 ± 0.50

AF-γCD 24,459 ± 3,492 -25.04 ± 0.36

Las curvas de titulación fluorométricas mostraron que de las tres CDs la que

requiere menor concentración para acomplejar a la mayoría de las moléculas de AF fue la

βCD seguida de la γCD, y por último la αCD. Por lo que se observó en la figura 18, se

puede deducir que el orden en la afinidad para acomplejar al AF fue βCD> γCD> αCD.

B A

66

A partir de los ajustes de las curvas de titulación fluorométricas a pH 9.0, 7.0 y 4.0

mostrados en las figuras 16 y 18, se obtuvieron los valores de Ka para cada complejo

formado (Tabla 17).

El orden de afinidad por el AF con carga 0 y 2- fue βCD>γCD>αCD, mientras que

con carga 1- el orden fue βCD>αCD>γCD. Como se pudo observar, la βCD fue la que

presentó mayor afinidad por el AF independientemente de la carga. El acomplejamiento

del AF con carga 1- por la βCD generó valores de Ka 204 (fosfatos) y 68 (boratos) veces

mayores, en comparación con la obtenida por la unión del AF con carga 2-, y 25 veces

mayor con respecto a la unión observada del AF con carga 0. Además, es importante

mencionar que el acomplejamiento del AF con carga 2- con las tres CDs generó los

valores de ΔGa más bajos, usando como disolventes fosfatos y boratos (Gráfico 4).

Gráfico 4. Comparación de los valores de la ΔGa a pH de 4.0, 7.0 y 9.0.

Se utilizaron los amortiguadores de fosfatos (pH 7.0), boratos (pH 9.0) y

citratos (pH 4.0), todos a una concentración de 50 mM y 25 °C

El orden de afinidad por el AF que se observó a pH 7.0 concuerda con lo

reportado por Qi, Li y Liu (2003), quienes determinaron la Ka por la técnica de titulación

fluorométrica, empleando una solución de AF 10 mM disuelto en metanol/agua (0.5/99.5)

a 25 ºC. Sin embargo, los valores de la Ka fueron menores comparados con los obtenidos

en el presente trabajo: 24, 76 y 19 veces para αCD, βCD y γCD, respectivamente.

Zhang et al., en el 2009 obtuvieron las Ka utilizando espectroscopía de

fluorescencia para el sistema AF-βCD a tres diferentes pH (3.05, 7.5 y 10.53) donde el

AF (10 μm) fue disuelto en agua. Los valores de las Ka mostraron una mayor afinidad a

67

pH 7.5, seguido por el pH 3.05; lo anterior concuerda con la tendencia de los valores de

las constantes a pH 7.0 y 4.0, sin embargo, para pH alcalino estos autores no reportaron

ningún valor, y no indicaron si no se hizo el ensayo a ese pH o no se pudo obtener

experimentalmente el dato de la Ka.

7.4.2. SIMULACIÓN COMPUTACIONAL (DOCKING)

Las ΔGa obtenidas mediante la función de puntaje Affinity DG (Tabla 18),

mostraron que la afinidad por el AF con carga 0 y 1- por las αCD, βCD y γCD fue

similar, puesto que el valor de ΔGa no fue mayor a 0.5 kcal/mol. Los datos de las ΔGa

tampoco presentaron una variación mayor a 0.5 kcal/mol al evaluar los campos de fuerza

MMFF94X y AMBER 99.

Tabla 18. Puntuaciones de ΔGa de los complejos AF-αCD, AF-βCD y

AF-γCD a distintos estados de protonación del AF (0 y 1-). Se utilizaron

dos campos de fuerza (MMFF94X y AMBER 99) y dos funciones de

puntaje (Affinity DG y London DG).

ΔGa (kcal/mol)

Función de puntaje

Complejo Campo de

fuerza

Affinity DG

(AF carga 0)

Affinity DG

(AF carga 1-)

London DG

(AF carga 0)

London DG

(AF carga 1-)

AF-αCD MMFF94X -2.1621 -2.1416 -7.2228 -6.5532

AMBER 99 -2.7761 -2.3701 -8.0587 -8.4088

AF-βCD MMFF94X -1.8154 -1.7931 -8.2667 -8.3642

AMBER 99 -2.2939 -2.1630 -8.3954 -7.751

AF-γCD MMFF94X -1.8508 -1.7391 -10.2723 -7.7436

AMBER 99 -1.8508 -1.7391 -10.2686 -7.7647

Al evaluar el docking del AF con carga 0 y 1- en las cavidades de la αCD y la βCD,

utilizando la función de puntaje London DG y los dos campos de fuerza mencionados

anteriormente, no se observaron cambios mayores a 0.5 kcal/mol en la ΔGa, sin embargo,

cuando se determinó el acomplejamiento del AF con carga 0 con la γCD se observó una

diferencia de 2.53 kcal/mol con respecto a su acomplejamiento con carga 1-, lo cual

indicó que la carga 0 en el AF predispone a una mayor afinidad para formar el complejo.

Se realizaron estudios de docking de los sistemas resveratrol-HP-βCD (Sapinoa et

al., 2008) y trolox-HP-βCD (Sapinob et al., 2008), y a partir de los resultados obtenidos

68

pudieron hacer un comparación de la estabilidad de los complejos. Encontraron que la

puntuación del ΔGa cuando se acomplejo el resveratrol fue de -19.52 kcal/mol, siendo

mayor 4 kcal/mol en comparación cuando se acomplejo el trolox, esto mostró la

diferencia de afinidades entre dos ligandos con un mismo receptor. El docking de los

complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD en los cuales el ligando es el mismo y las

moléculas anfitriones no, se observó una diferencia mayor a 2.53 kcal/mol en los valores

obtenidos de ΔGa, por lo que se puede deducir que se tiene interacciones similares en la

formación de los tres complejos. En resumen, la simulación computacional mostró que la

carga del AF no fue un factor que contribuya a un aumento o disminución en la afinidad

de acomplejamiento, esto quedó evidenciado por la similitud de los valores de las ΔGa, lo

cual discrepo con los resultados experimentales obtenidos por espectroscopía de

fluorescencia a distinto pH, tal vez porque en la simulación computacional no se toman

en cuenta varios factores como el efecto del disolvente sobre las interacciones entre las

dos moléculas, las cuales fueron clave en el acomplejamiento del AF con las CDs de

acuerdo a los resultados del análisis de la energética realizados en el presente trabajo.

También se obtuvieron las posibles representaciones tridimensionales de los

complejos entre AF con la αCD, la βCD y la γCD (Figura 19).

Figura 19. Estructuras en 3D de los complejos AF-αCD (A), AF-βCD (B)

y AF-γCD (C).

En el caso del acomplejamiento con la αCD la molécula de AF quedo más expuesta

al disolvente por la parte del anillo de benceno y el grupo metoxilo, con respecto a las

otras dos CDs, además se pudo observar que la molécula del AF se introdujo con la

misma orientación en la cavidad de la tres CDs, mostrando que el ácido carboxílico de la

molécula esta interaccionando con la entrada más ancha de las CD, el anillo del benceno

A B C

69

se ubicó en el centro de las cavidades de las mismas, el alcohol y metoxilo del AF se

encontró en contacto con la entrada más estrecha de las CDs. Lo anterior concuerda con

los resultados obtenidos de la simulación computacionalmente utilizando el programa

AMBER para el complejo AF-γCD (Anselmi et al., 2008).

A partir de las estructuras tridimensionales se observó que la disposición de los

grupos hidroxilos del AF (-OH del ácido carboxílico y -OH del fenol) están en la

periferia de las cavidades de las CDs teniendo mayor contacto con el disolvente. Esta

orientación de los grupos hidroxilos esta apoyada con la investigación que realizó

Casolaro, Anselmi & Picciocchi (2005), donde los resultados mostraron que el

acomplejamiento del AF con la γCD no afectó la protonación o desprotonación del

mismo, siendo los valores de las constantes de basicidad similares.

70

VIII. CONCLUSIONES

8.1. Soluciones homogéneas de AF y ciclodextrinas

1.- Se obtuvieron soluciones homogéneas de AF y las distintas CDs estudiadas,

empleando como disolvente fosfatos y amortiguador de boratos, 50 mM a pH 9.0.

8.2. Se pudo corroborar la formación del complejo entre el AF y las αCD, βCD

y γCD, en base a:

1.- Los cambios o desaparición de bandas características de algunos grupos

funcionales en los espectros de IR que presenta el AF puro con respecto al acomplejado.

2.- La desaparición del pico endotérmico que corresponde al punto de fusión del

AF, observada en los termogramas de CDB de los complejos.

3.- Las altas temperaturas de descomposición de los complejos con respecto a la

presentada por el AF sin acomplejar, registradas en los termogramas de TGA.

4.- El incremento en la solubilidad del AF como resultado del acomplejamiento,

determinado a partir del diagrama de solubilidad de fases, siendo mayor cuando se usó la

βCD.

8.3. Se determinaron las contribuciones termodinámicas al proceso del

acomplejamiento, empleando la técnica de CTI:

1.- Los valores negativos obtenidos para ΔHa y ΔGa indicaron que la formación de

los complejos AF-CD fue exotérmica y espontánea.

2.- El acomplejamiento fue entrópicamente favorecido para la βCD y la γCD, pero

no para la αCD.

3.- La afinidad por el AF en base a la ΔGa obtenida por CTI fue βCD>γCD>αCD,

lo cual se corroboró por espectroscopía de fluorescencia utilizando como disolvente tanto

fosfatos y boratos. Cuando se usó este último disolvente en la CTI el orden de afinidad

fue βCD>αCD>γCD. Dado que el uso de fosfatos como disolvente generó el mismo

orden de afinidad con las dos técnicas se concluye que fue el mejor disolvente para el

análisis comparativo de los parámetros termodinámicos del proceso de acomplejamiento

del AF con las CDs.

71

8.4. Se determinó el efecto del estado de protonación del AF en la afinidad de

acomplejamiento:

1.- Las cargas del AF generaron cambios en los valores de Ka y ΔGa obtenidos.

2.- El AF con carga 1- mostró un ΔGa más negativos para las tres CDs estudiadas,

con respecto a los otros dos estados de protonación (0 y 2-).

3.- La CD con mayor afinidad para acomplejar al AF con carga 0, 1- y 2

- fue la

βCD, presentando los siguientes ordenes de afinidad, con carga 1-: βCD>αCD>γCD, con

carga 0 y 2-: βCD>γCD>αCD. El acomplejamiento del AF con carga 2

- presentó los

valores más bajos de la Ka para los sistemas AF-βCD y AF-γCD.

4.- La simulación computacional evidenció que la carga del AF no es un factor que

contribuya a un aumento o disminución en la afinidad de acomplejamiento, esto fue

evidenciado por la similitud de los valores de las ΔGa. Las estructuras en 3D obtenidas

por docking mostraron que el AF se introdujo en las tres CDs con la misma orientación,

en donde el anillo del benceno se ubicó en el centro de la cavidad, el ácido carboxílico

interaccionó con la entrada más ancha de la CD, mientras que el alcohol y el metoxilo se

encontraron en contacto con la entrada más estrecha. En el caso del acomplejamiento con

la αCD la molécula de AF quedó más expuesta al disolvente por la parte del anillo de

benceno y el grupo metoxilo, con respecto a las otras dos CDs.

En base a los resultados obtenidos, la CD más recomendada para acomplejar el AF

es la βCD seguido por la γCD y por último la αCD.

72

IX. PERSPECTIVAS

1. Elucidación estructural de los complejos AF-CD mediante la técnica de RMN.

Los resultados preliminares de la elucidación estructural mediante la técnica de

RMN, de los complejos del AF con la αCD, βCD y γCD, mostraron interferencias en la

señal con la molécula TSP (Ácido trimetilsilil propanoico) utilizada como referencia cero

de los desplazamientos químicos, probablemente por una competencia en el

acomplejamiento con la molécula de AF. En base a lo anterior, se sugiere establecer

condiciones experimentales aumentando la concentración del AF así como de las CDs,

para eliminar dicha interferencia y poder tener reproducibilidad en la elucidación

estructural de los complejos AF-CD mediante RMN.

2. Evaluación de los efectos de protonación del ácido ferúlico en el proceso de

acomplejamiento con CDs.

El calor detectado por la técnica de CTI puede no asociarse únicamente al

acomplejamiento entre el AF con la CD, por lo tanto, sería conveniente demostrarse que

no tuvo inferencia algún otro proceso como la protonación o desprotonación del AF.

Hasta el momento se han realizado dos titulaciones calorimétricas isotérmicas empleando

los amortiguadores de glicina y boratos a pH 9.0, ambos con distintas entalpías de

ionización, a partir de las cuales se obtuvieron dos puntos en el gráfico de cambio en la

entalpia aparente, y no son suficientes para afirmar si ocurre una protonación o

desprotonación del AF durante el proceso de acomplejamiento, lo cual puede contribuir

al calor detectado por CTI. Es por eso que se deberán realizar más titulaciones

calorimétricas a pH 9.0, utilizando amortiguadores que tengan distintas entalpias de

ionización a la de boratos y de glicina para completar el gráfico de cambio en la entalpia

aparente (ΔHaparente vs ΔHionización), mediante el cual se obtendrá el número de protones (n)

transferidos del AF hacia el amortiguador en el proceso de acomplejamiento utilizando la

siguiente ecuación ΔHaparente= ΔH+n ΔHionización.

3. Llevar a cabo un estudio de simulación computacional para obtener más información

sobre el acomplejamiento del AF con CDs.

73

4. Realizar estudios con microscopia electrónica de barrido para obtener información de

la morfología del sólido formado por los complejos en comparación con los sólidos

puros.

5. Realizar estudios con rayos X de polvos para adquirir información sobre la estructura y

el orden tridimensional de la arquitectura atómica de los complejos en comparación con

los sólidos puros.

6. Se ha evidenciado las propiedades antioxidantes y antimicrobianas del AF (Heinonen

et al., 1998; Lattanzio et al., 1994), y dado que el acomplejamiento con CDs mejora su

solubilidad y brinda protección a la molécula, se podrían evaluar los cambios en dichas

propiedades por efecto del acomplejamiento con la αCD, βCD y γCD.

74

X. REFERENCIAS

Alberty, R. A. (1969). Standard Gibbs free energy, enthalpy, and entropy changes as a

function of pH and pMg for several reactions involving adenosine phosphates.

Journal of Biological Chemistry, 244(12), 3290-3302.

Ali Asaff Torres, Mayra De La Torre Martinez, Antonino Berrondo Mir & Roberto

Miguel Macias Ochoa. Process of production of vanillin with immobilized

microorganisms. Estados Unidos CN103060392 A (435/147; C12P724), 19 Abr.

2007, 18 Oct. 2008.

Álvarez-Parrilla, E., Palos, R., Rosa, L. A., Frontana-Uribe, B. A., González-Aguilar, G.

A., Machi, L. & Ayala-Zavala, J. F. (2010). Formation of Two 1:1 Chlorogenic

Acid: β-cyclodextrin Complexes at pH 5: Spectroscopic, Thermodynamic and

Voltammetric study. Journal of the Mexican Chemical Society, 54(2), 103-110.

Anselmi, C., Centini, M., Andreassi, M., Buonocore, A., Rosa, C. L., Facino, R. M., &

Tsuno, F. (2004). Conformational analysis: a tool for the elucidation of the

antioxidant properties of ferulic acid derivatives in membrane models. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35(5), 1241-1249. doi:

10.1016/j.jpba.2004.04.008

Anselmi, C., Centini, M., Maggiore, M., Gaggelli, N., Andreassi, M., Buonocore, A., &

Facino, R. M. (2008). Non-covalent inclusion of ferulic acid with α-cyclodextrin

improves photo-stability and delivery: NMR and modeling studies. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 46(4), 645-652.

doi:10.1016/j.jpba.2007.11.037.

Antenucci, R. N., & Palmer, J. K. (1984). Enzymic degradation of. alpha- and. beta-

cyclodextrins by Bacteroides of the human colon. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 32(6), 1316-1321. doi: 10.1021/jf00126a025

Asaff, T. A. (2010). Transformando riesgos en oportunidades: del nejayote a la vainillina.

Ciencia, Tecnología e innovación para el desarrollo de México. Año 3, No. 60.

Astray, G., Gonzalez-Barreiro, C., Mejuto, J. C., Rial-Otero, R., & Simal-Gándara, J.

(2009). A review on the use of cyclodextrins in foods. Food Hydrocolloids, 23(7),

1631-1640. doi:10.1016/j.foodhyd.2009.01.001

Astray, G., Mejuto, J. C., Morales, J., Rial-Otero, R., & Simal-Gándara, J. (2010).

Factors controlling flavors binding constants to cyclodextrins and their applications

in foods. Food Research International, 43(4), 1212-1218. doi:

10.1016/j.foodres.2010.02.017

Atsushi Suzuki, Ryuji Ochiai & Ichiro Tokimitsu. Use of ferulic acid for treating

hypertension. Alemania, EP1090635 B1(A61K31/192, A61P9/10, A61K45/06,

75

A61K9/00, A61P9/12, A23L1/30, A61K9/48, A61P9/00), 22 Sep. 2000, 15 de

Mar.2006.

Atsushi Suzuki, Ryuji Ochiai & Ichiro Tokimitsu. Caffeic acid, chlorogenic acid and

ferulic acid, and esters or salts, and one or more of central nervous system

stimulating components, food fibers, extracts of plants, organic acids or sugar

alcohols. Estados unidos US7351436 B2 (424/756, 424/760), 25 Jul. 2003, 1 Abr.

2008.

Bellringer, M. E., Smith, T. G., Read, R., Gopinath, C., & Olivier, P. (1995). β-

Cyclodextrin: 52-week toxicity studies in the rat and dog. Food and Chemical

Toxicology, 33 (5), 367-376. doi: 10.1016/0278-6915(94)00149-I

Birošová, L., Mikulášová, M., & Vaverková, Š. (2005). Antimutagenic effect of phenolic

acids. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 149 (2), 489-91.

Bouchemal, K., & Mazzaferro, S. (2012). How to conduct and interpret ITC experiments

accurately for cyclodextrin-guest interactions. Drug Discovery Today, 17(11-12),

623-9. doi:10.1016/j.drudis.2012.01.023

Bourne, L. C., & Rice-Evans, C. A. (1999). [9] Detecting and measuring bioavailability

of phenolics and flavonoids in humans: Pharmacokinetics of urinary excretion of

dietary ferulic acid. Methods in Enzymology, 299, 91-106. doi: 10.1016/S0076-

6879(99)99012-2

Brewster, M. E., & Loftsson, T. (2007). Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers.

Advanced Drug Delivery Reviews, 59 (7), 645-666. doi:10.1016/j.addr.2007.05.012

Buranov, A. U., & Mazza, G. (2009). Extraction and purification of ferulic acid from flax

shives, wheat and corn bran by alkaline hydrolysis and pressurised solvents. Food

Chemistry, 115(4), 1542-1548. doi: 10.1016/j.foodchem.2009.01.059

Cal, K., & Centkowska, K. (2008). Use of cyclodextrins in topical formulations: practical

aspects. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 68(3), 467-478.

doi:10.1016/j.ejpb.2007.08.002

Casolaro, M., Anselmi, C., & Picciocchi, G. (2005). The protonation thermodynamics of

ferulic acid/γ-cyclodextrin inclusion compounds. Thermochimica Acta, 425 (1), 143-

147. doi: 10.1016/j.tca.2004.06.016

Castronuovo, G., & Niccoli, M. (2006). Thermodynamics of inclusion complexes of

natural and modified cyclodextrins with propranolol in aqueous solution at 298K.

Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14(11), 3883-3887. doi:

10.1016/j.bmc.2006.01.052

76

Castronuovo, G., & Niccoli, M. (2013). Thermodynamics of inclusion complexes of

natural and modified cyclodextrins with acetylsalicylic acid and ibuprofen in

aqueous solution at 298K. Thermochimica Acta, 557, 44-49.

doi:10.1016/j.tca.2013.01.037.

Cavalcanti, I. M. F., Mendonça, E. a M., Lira, M. C. B., Honrato, S. B., Camara, C. a,

Amorim, R. V. S., & Santos-Magalhães, N. S. (2011). The encapsulation of β-

lapachone in 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex into liposomes: a

physicochemical evaluation and molecular modeling approach. European Journal of

Pharmaceutical Sciences : Official Journal of the European Federation for

Pharmaceutical Sciences, 44 (3), 332-40. doi:10.1016/j.ejps.2011.08.011

Celik, S. E., Ozyürek, M., Tufan, A. N., Güçlü, K., & Apak, R. (2011). Spectroscopic

study and antioxidant properties of the inclusion complexes of rosmarinic acid with

natural and derivative cyclodextrins. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and

Biomolecular Spectroscopy, 78(5), 1615–24. doi:10.1016/j.saa.2011.02.017

Chandrasekaran, S., & Enoch, I. V. (2013). Binding of Coumarin 334 with -Cyclodextrin

and with C-Hexylpyrogallol [4] arene : Opposite Fluorescence Behavior, Journal of

Spectroscopy, 2013, 13, ID 408506. doi: 10.1155/2013/408506

Charalampopoulos Dimitris. (5 March 2014). Production of ferulic acid from wheat bran.

marzo 2014, de HGCA Sitio web:

http://www.hgca.com/publications/2014/march/05/production-of-ferulic-acid-from-

wheat-bran.aspx

Chaudhuri, S., Chakraborty, S., & Sengupta, P. K. (2010). Encapsulation of serotonin in

β-cyclodextrin nano-cavities: Fluorescence spectroscopic and molecular modeling

studies. Journal of Molecular Structure, 975(1-3), 160-165.

doi:10.1016/j.molstruc.2010.04.014

Cheynier, V. (2005). Polyphenols in foods are more complex than often thought. The

American Journal of Clinical Nutrition, 81(1), 223S-229S.

Choi, M. J., Ruktanonchai, U., Min, S. G., Chun, J. Y., & Soottitantawat, A. (2010).

Physical characteristics of fish oil encapsulated by β-cyclodextrin using an

aggregation method or polycaprolactone using an emulsion–diffusion method. Food

Chemistry, 119(4), 1694-1703. doi: 10.1016/j.foodchem.2009.09.052

Clas, S. D., Dalton, C. R., & Hancock, B. C. (1999). Differential scanning calorimetry:

applications in drug development. Pharmaceutical Science & Technology Today,

2(8), 311-320. doi: 10.1016/S1461-5347(99)00181-9

Connors, K. A. (1997). The stability of cyclodextrin complexes in solution. Chemical

Reviews, 97 (5), 1325-1358. doi: 10.1021/cr960371r

77

Cravotto, G., Binello, A., Baranelli, E., Carraro, P., & Trotta, F. (2006). Cyclodextrins as

food additives and in food processing. Current Nutrition & Food Science, 2, 343-

350. doi: 10.2174/157340106778699485

da Rosa, C. G., Borges, C. D., Zambiazi, R. C., Nunes, M. R., Benvenutti, E. V., Luz, S.

R. Da, & Rutz, J. K. (2013). Microencapsulation of gallic acid in chitosan, β-

cyclodextrin and xanthan. Industrial Crops and Products, 46, 138-146.

doi:10.1016/j.indcrop.2012.12.053

de Matos Jensen, C. E., Dos Santos, R. A. S., Denadai, A. M. L., Santos, C. F. F., Braga,

A. N. G., & Sinisterra, R. D. (2010). Pharmaceutical composition of valsartan: β-

Cyclodextrin: physico–chemical characterization and anti-hypertensive evaluation.

Molecules, 15(6), 4067-4084. doi:10.3390/molecules15064067.

Del Valle, E. M. (2004). Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistry,

39(9), 1033-1046. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9

Delrivo, A., Zoppi, A., & Longhi, M. R. (2012). Interaction of sulfadiazine with

cyclodextrins in aqueous solution and solid state. Carbohydrate Polymers, 87(3),

1980-1988. doi:10.1016/j.carbpol.2011.10.025

Dewick, P. M. (2002). Medicinal natural products: a biosynthetic approach. John Wiley

& Sons. 122-123

Dos Santos, C., Buera, M. P., & Mazzobre, M. F. (2012). Influence of ligand structure

and water interactions on the physical properties of β-cyclodextrins complexes.

Food Chemistry, 132(4), 2030-2036. doi:10.1016/j.foodchem.2011.12.044

El Gharras, H. (2009). Polyphenols: food sources, properties and applications–a review.

International Journal of Food science & Technology, 44(12), 2512-2518.

doi:10.1111/j.1365-2621.2009.02077.x

El-Kemary, M., Sobhy, S., El-Daly, S., & Abdel-Shafi, A. (2011). Inclusion of

Paracetamol into β-cyclodextrin nanocavities in solution and in the solid state.

Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 79(5),

1904-8. doi:10.1016/j.saa.2011.05.084

Fang, Z., Comino, P. R., & Bhandari, B. (2013). Effect of encapsulation of d-limonene on

the moisture adsorption property of β-cyclodextrin. LWT-Food Science and

Technology, 51(1), 164-169. doi: 10.1016/j.lwt.2012.09.016

FAO, (2014) Base de datos en línea de la norma general del codex para los aditivos

alimentarios (GSFA)

http://www.codexalimentarius.net/gsfaonline/additives/details.html?id=289. 13 de

agosto 2014

78

Folch-Cano, C., Jullian, C., Speisky, H., & Olea-Azar, C. (2010). Antioxidant activity of

inclusion complexes of tea catechins with β-cyclodextrins by ORAC assays. Food

Research International, 43(8), 2039-2044. doi:10.1016/j.foodres.2010.06.006

Friedman, M., & Jürgens, H. S. (2000). Effect of pH on the stability of plant phenolic

compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(6), 2101-2110. doi:

10.1021/jf990489j

Fujita, A., Sasaki, H., Doi, A., Okamoto, K., Matsuno, S., Furuta, H., & Nanjo, K.

(2008). Ferulic acid prevents pathological and functional abnormalities of the kidney

in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty diabetic rats. Diabetes Research and

Clinical Practice, 79(1), 11-17. doi:10.1016/j.diabres.2007.08.009

Funk, C., & Brodelius, P. E. (1992). Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures

of Vanilla planifolia Andr. IV. Induction of vanillic acid formation. Plant

Physiology, 99(1), 256-262.

Ghosh, S., Jana, S., & Guchhait, N. (2011). Constrained photophysics of partially and

fully encapsulated charge transfer probe (E)-3-(4-Methylaminophenyl) acrylic acid

methyl ester inside cyclodextrin nano-cavities: evidence of cyclodextrins cavity

dependent complex stoichiometry. Molecular and Biomolecular Spectroscopy,

84(1), 249-55. doi:10.1016/j.saa.2011.09.038

Goldberg, R. N., Lang, B. E., Selig, M. J., & Decker, S. R. (2011). A calorimetric and

equilibrium investigation of the reaction {methyl

ferulate(aq)+H2O(l)=methanol(aq)+ferulic acid(aq)}. The Journal of Chemical

Thermodynamics, 43(3), 235-239. doi:10.1016/j.jct.2010.09.002

Gonnet, M., Lethuaut, L., & Boury, F. (2010). New trends in encapsulation of liposoluble

vitamins. Journal of Controlled Release, 146(3), 276-290. doi:

10.1016/j.jconrel.2010.01.037

Graf, E. (1992). Antioxidant potential of ferulic acid. Free Radical Biology and

Medicine, 13(4), 435-448.

Halperin, I., Ma, B., Wolfson, H., & Nussinov, R. (2002). Principles of docking: An

overview of search algorithms and a guide to scoring functions. Proteins, 47(4),

409-43. doi:10.1002/prot.10115

Harris, P. J., & Trethewey, J. A. (2010). The distribution of ester-linked ferulic acid in

the cell walls of angiosperms. Phytochemistry Reviews, 9(1), 19-33. doi:

10.1007/s11101-009-9146-4

Hashimoto, Y., Yamamoto, T., Fujiwara, S., Takagi, M., & Imanaka, T. (2001).

Extracellular synthesis, specific recognition, and intracellular degradation of

cyclomaltodextrins by the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. strain

79

B1001. Journal of Bacteriology, 183(17), 5050-5057. doi: 10.1128/JB.183.17.5050-

5057.2001

He, D., Deng, P., Yang, L., Tan, Q., Liu, J., Yang, M., & Zhang, J. (2013). Molecular

encapsulation of rifampicin as an inclusion complex of hydroxypropyl-β-

cyclodextrin: design; characterization and in vitro dissolution. Colloids and Surfaces

B, Biointerfaces, 103, 580-5. doi:10.1016/j.colsurfb.2012.10.062

Heinonen, M., Rein, D., Satué-Gracia, M. T., Huang, S. W., German, J. B., & Frankel, E.

N. (1998). Effect of protein on the antioxidant activity of phenolic compounds in a

lecithin-liposome oxidation system. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

46(3), 917-922. doi: 10.1021/jf970826t

Higuchi T. & Connors, K. A. (1965). Phase-solubility techniques. Advances in

Analytical Chemistry and Instrumentation. 4, 117.

Jelesarov, I., & Bosshard, H. R. (1999). Isothermal titration calorimetry and differential

scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of

biomolecular recognition. Journal of Molecular Recognition, 12(1), 3-18.

doi:10.1002/(SICI)1099-1352(199901/02)12:1<3::AID-JMR441>3.0.CO;2-6

John Marshall, J., & Miwa, I. (1981). Kinetic difference between hydrolyses of γ-

cyclodextrin by human salivary and pancreatic α-amylases. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Enzymology, 661(1), 142-147. doi: 10.1016/0005-

2744(81)90093-0

Jullian, C., Moyano, L., Yanez, C., & Olea-Azar, C. (2007). Complexation of quercetin

with three kinds of cyclodextrins: an antioxidant study. Spectrochimica Acta Part A:

Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 67(1), 230-234. doi:

10.1016/j.saa.2006.07.006

Karshikoff, A. (2006). Non-covalent interactions in proteins (p. 1). London: Imperial

College Press. 68-69

Kikugawa, M., Tsuchiyama, M., Kai, K., & Sakamoto, T. (2012). Synthesis of highly

water-soluble feruloyl diglycerols by esterification of an Aspergillus niger feruloyl

esterase. Applied Microbiology and Biotechnology, 95(3), 615-622.

doi:10.1007/s00253-012-4056-6

Klotz, I. M. (1997). Ligand-receptor energetics: a guide for the perplexed. John Wiley &

Sons.

Konno, A., & Miyawaki, M. U.S. Citrus food containing a cyclodextrin. Patent No.

4,332,825. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office. 1982

80

Kríz, Z., Koca, J., Imberty, A., Charlot, A., & Auzély-Velty, R. (2003). Investigation of

the complexation of (+)-catechin by beta-cyclodextrin by a combination of NMR,

microcalorimetry and molecular modeling techniques. Organic and Biomolecular

Chemistry, 1(14), 2590-5. Retrieved from

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12956082

Kumar, N., & Pruthi, V. (2014). Structural elucidation and molecular docking of ferulic

acid from Parthenium hysterophorus possessing COX-2 inhibition activity. 3

Biotechnology, 1-11. Doi: 10.1007/s13205-014-0253-6

Kurkov, S. V., & Loftsson, T. (2013). Cyclodextrins. International Journal of

Pharmaceutics, 453(1), 167-180. doi: 10.1016/j.ijpharm.2012.06.055

Lakowicz, J. R., & Masters, B. R. (2008). Principles of fluorescence spectroscopy.

Journal of Biomedical Optics, 13(2), 9901. doi: 10.1117/1.2904580

Lattanzio, V., De Cicco, V., De Venere, D., Lima, G., & Salerno, M. (1994). Antifungal

activity of phenolics against fungi commonly encountered during storage. Italian

Journal of Food Science, 6(1), 23-30.

Li, H., Xu, X., Liu, M., Sun, D. & Li, L. (2010). Microcalorimetric and spectrographic

studies on host–guest interactions of α-, β-, γ- and Mβ-cyclodextrin with resveratrol.

Thermochimica Acta, 510(1-2), 168-172. doi:10.1016/j.tca.2010.07.011

Li, Z., Wang, M., Wang, F., Gu, Z., Du, G., Wu, J., & Chen, J. (2007). γ-Cyclodextrin: a

review on enzymatic production and applications. Applied Microbiology and

Biotechnology, 77(2), 245-255. doi:10.1007/s00253-007-1166-7

Li, Z., Chen, S., Gu, Z., Chen, J., & Wu, J. (2014). Alpha-cyclodextrin: Enzymatic

production and food applications. Trends in Food Science & Technology, 35(2),

151-160. doi:10.1016/j.tifs.2013.11.005

Liu, L., & Guo, Q. X. (2002). The driving forces in the inclusion complexation of

cyclodextrins. Journal of inclusion phenomena and macrocyclic chemistry, 42(1-2),

1-14. Doi: 10.1023/A:1014520830813

Loftsson, T., Masson, M., & Brewster, M. E. (2004). Self-association of cyclodextrins

and cyclodextrin complexes. Journal of Pharmaceutical Sciences, 93(5), 1091-1099.

doi: 10.1002/jps.20047

López, A. R. Ramírez de Lara, C. Rivero, L. Ruiz, A. E., Torres, Z. C. T. & Vicente, U.

R. (2012). Aplicación de una nueva FAE en la liberación químico-enzimática de

ácido ferúlico a partir de pulpa de remolacha. Ciencias agronómicas, Revista XIX

año 12, 21-25.

81

Manach, C., Williamson, G., Morand, C., Scalbert, A., & Rémésy, C. (2005).

Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97

bioavailability studies. The American Journal of Clinical Nutrition, 81(1), 230S-

242S.

Marques, H. M., Hadgraft, J., & Kellaway, I. W. (1990). Studies of cyclodextrin

inclusion complexes. I. The salbutamol-cyclodextrin complex as studied by phase

solubility and DSC. International Journal of Pharmaceutics, 63(3), 259-266. doi:

10.1016/0378-5173(90)90132-N

Marques, H. M. C. (2010). A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and

volatiles. Flavour and Fragrance Journal, 25(5), 313-326. doi: 10.1002/ffj.2019

Mazzaferro, S., Bouchemal, K., Gallard, J.-F., Iorga, B. I., Cheron, M., Gueutin, C., &

Ponchel, G. (2011). Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-β-

cyclodextrin. International Journal of Pharmaceutics, 416(1), 171-80.

doi:10.1016/j.ijpharm.2011.06.034

McMurry, J. (2001). Química Orgánica, 5ª. Edición, México, Ed. International Thomson

Editores, S.A. de C.V. 127-131

Mei, Q. S., & Lu, K. (2007). Melting and superheating of crystalline solids: from bulk to

nanocrystals. Progress in Materials Science, 52(8), 1175-1262. doi:

10.1016/j.pmatsci.2007.01.001

Menczel, J. D., & Prime, R. B. (2009). Thermal analysis of polymers, fundamentals and

applications. John Wiley & Sons. 350-359

Monti, D., Tampucci, S., Chetoni, P., Burgalassi, S., Saino, V., Centini, M. & Anselmi,

C. (2011). Permeation and distribution of ferulic acid and its α-cyclodextrin complex

from different formulations in hairless rat skin. Aaps Pharmaceutics Science

Technology, 12(2), 514-20. doi:10.1208/s12249-011-9609-y

Munin, A., & Edwards-Lévy, F. (2011). Encapsulation of natural polyphenolic

compounds: a review. Pharmaceutics, 3(4), 793-829. doi:

10.3390/pharmaceutics3040793

Naidoo, K. J., Chen, J. Y. J., Jansson, J. L., Widmalm, G., & Maliniak, A. (2004).

Molecular properties related to the anomalous solubility of β-cyclodextrin. The

Journal of Physical Chemistry B, 108(14), 4236-4238. doi: 10.1021/jp037704q

Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2009). Effect of ferulic acid on inhibition of

polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus

vannamei) during iced storage. Food Chemistry, 116(1), 323-331.

doi:10.1016/j.foodchem.2009.02.054

82

Novotny, J., Bruccoleri, R. E., Davis, M., & Sharp, K. A. (1997). Empirical free energy

calculations: a blind test and further improvements to the method. Journal of

Molecular Biology, 268(2), 401-411. doi: 10.1006/jmbi.1997.0961

Ou, S., & Kwok, K. C. (2004). Ferulic acid: pharmaceutical functions, preparation and

applications in foods. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84(11), 1261-

1269. doi:10.1002/jsfa.1873

Ou, S., Luo, Y., Xue, F., Huang, C., Zhang, N., & Liu, Z. (2007). Seperation and

purification of ferulic acid in alkaline-hydrolysate from sugarcane bagasse by

activated charcoal adsorption/anion macroporous resin exchange chromatography.

Journal of Food Engineering, 78(4), 1298-1304. doi:

10.1016/j.jfoodeng.2005.12.037

Overhage, J., Steinbüchel, A., & Priefert, H. (2003). Highly efficient biotransformation of

eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in recombinant strains of

Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 69(11), 6569-6576.

doi:10.1128/AEM.69.11.6569

Palem, C. R., Chopparapu, K. S. C., Subrahmanyam, P. V. R. S., & Yamsani, M. R.

(2012). Cyclodextrins and their derivatives in drug delivery: a review. Current

Trends in Biotechnology and Pharmacy, 6(3), 255-279. doi:ISSN 097-8916

Ponce Cevallos, P. A., Buera, M. P., & Elizalde, B. E. (2010). Encapsulation of cinnamon

and thyme essential oils components (cinnamaldehyde and thymol) in β-

cyclodextrin: Effect of interactions with water on complex stability. Journal of Food

Engineering, 99(1), 70-75. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2010.01.039

Priefert, H., Rabenhorst, J., & Steinbüchel, A. (2001). Biotechnological production of

vanillin. Applied Microbiology and Biotechnology, 56(3-4), 296-314. doi:

10.1007/s002530100687

Protein Data Bank. (2014).De RCSB Sitio web: http://www.rcsb.org

Qi, A. D., Li, L., & Liu, Y. (2003). Molecular Binding Ability and Selectivity of Natural

α-, β-, γ-Cyclodextrins and Oligo (ethylenediamino) Modified β-Cyclodextrins with

Chinese Traditional Medicines. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic

Chemistry, 45(1-2), 69-72. doi: 10.1023/A:1023090109157

Ramachandra Rao, S., & Ravishankar, G. A. (2000). Vanilla flavour: production by

conventional and biotechnological routes. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 80 (3), 289-304. doi:10.1002/1097-0010(200002)80:3

Ramar, M., Manikandan, B., Raman, T., Priyadarsini, A., Palanisamy, S., Velayudam,

M., & Vaseeharan, B. (2012). Protective effect of ferulic acid and resveratrol against

83

alloxan-induced diabetes in mice. European Journal of Pharmacology, 690(1), 226-

235. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.05.019

Rayner, T. A., Mackevica, A., & Hansen, P. M. P. (2010). Cyclodextrin and Bile Salt

Interactions Using Isothermal Titration Calorimetry (Doctoral dissertation).

Rosazza, J. P. N., Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., & Rousseau, B. (1995). Review:

biocatalytic transformations of ferulic acid: an abundant aromatic natural product.

Journal of Industrial Microbiology, 15(6), 457-471. doi: 10.1007/BF01570016

Rui Zhou, Mohammad Wadud Bhuiya, Xianpeng Cai, Xiaodan Yu & Robert G.

Eilerman. Methods of making vanillin via microbial fermentation utilizing ferulic

acid provided by a modified caffeic acid 3-o-methyltransferase. Francia,

PCT/US2013/078328 (C12P724), 3 Dic. 2013, 3 Jul. 2014.

Sapinoa, S., Trotta, M., Ermondi, G., Caron, G., Cavalli, R., & Carlotti, M. E. (2008). On

the complexation of Trolox with methyl-β-cyclodextrin: characterization, molecular

modelling and photostabilizing properties. Journal of Inclusion Phenomena and

Macrocyclic Chemistry, 62(1-2), 179-186. doi:10.1007/s10847-008-9454-0

Sapinob, S., Carlotti, M. E., Caron, G., Ugazio, E., & Cavalli, R. (2008). In silico design,

photostability and biological properties of the complex resveratrol/hydroxypropyl-β-

cyclodextrin. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 63(1-2),

171-180. doi:10.1007/s10847-008-9504-7

Saulnier, L., & Thibault, J. F. (1999). Ferulic acid and diferulic acids as components of

sugar‐beet pectins and maize bran heteroxylans. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 79(3), 396-402. Doi: 10.1002/(SICI)1097-0010(19990301)79:3<396

Satya Prakash & Jasmine Bhathena. Bioproduction of ferulic acid and uses thereof.

Francia WO2008116319 A1 (A21D2/00, A61K38/46, A23L3/3463, C12N11/02,

D21C9/10, C12G1/022, C12N9/16, A61K8/66, A61P31/00, C12P7/42, A23K1/165,

C02F11/02), 27 Mar. 2007, 2 Oct. 2008.

Schrader, B. (Ed.). (2008). Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications.

John Wiley & Sons. 267-280

Singh, R., Bharti, N., Madan, J., & Hiremath, S. N. (2010). Characterization of

cyclodextrin inclusion complexes-a review. Journal Pharmaceutics Science

Technology, 2(3), 171-183.

Sivasankar, T., Antony Muthu Prabhu, A., Karthick, M., & Rajendiran, N. (2012).

Encapsulation of vanillylamine by native and modified cyclodextrins: Spectral and

computational studies. Journal of Molecular Structure, 1028, 57-67.

doi:10.1016/j.molstruc.2012.06.025

84

Steed, J. W., & Atwood, J. L. (2000). Supramolecular Chemistry. John Wiley & Sons.

321-334

Szejtli, J. (1998). Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. Chemical

reviews, 98(5), 1743-1754.

Szente, L., & Szejtli, J. (2004). Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food

Science & Technology, 15(3), 137-142. doi: 10.1016/j.tifs.2003.09.019

Szente, L., & Szemán, J. (2013). Cyclodextrins in Analytical Chemistry: Host–Guest

Type Molecular Recognition. Analytical Chemistry, 85(17), 8024-8030. doi:

10.1021/ac400639y

Tada, Y., Tayama, K., & Aoki, N. (1999). Acute oral toxicity of ferulic acid, natural food

additive, in rats. Ann Rep Tokyo Metr Lab PH, 50, 311-313.

Takahashi, A. I., Veiga, F. J. B., & Ferraz, H. G. (2012). A literature review of

cyclodextrin inclusion complexes characterization-part ii: x-ray diffraction, infrared

spectroscopy and nuclear magnetic resonance. International Journal of

Pharmaceutical Sciences Review & Research, 12(1). 16.

Tsuchiyama, M., Sakamoto, T., Fujita, T., Murata, S., & Kawasaki, H. (2006).

Esterification of ferulic acid with polyols using a ferulic acid esterase from<i>

Aspergillus niger</i>. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects,

1760(7), 1071-1079. doi:10.1016/j.bbagen.2006.03.022

Urbaniak, A., Szeląg, M., & Molski, M. (2013). Theoretical investigation of

stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid.

Computational and Theoretical Chemistry, 1012, 33-40.

doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018

Volonté, M. G., & Quiroga, P. (2013). Análisis farmacéutico. sedici.unlp.edu.ar

Vyas, A., Saraf, S., & Saraf, S. (2008). Cyclodextrin based novel drug delivery systems.

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 62(1-2), 23-42. doi:

10.1007/s10847-008-9456-y

Wagner, B. D., & Fitzpatrick, S. J. (2000). A comparison of the host–guest inclusion

complexes of 1, 8-ANS and 2, 6-ANS in parent and modified cyclodextrins. Journal

of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 38(1-4), 467-478. doi:

10.1023/A:1008198825835

Wang, L., Zhong, C., Xue, P., & Fu, E. (2011). Fluorescent β-Cyclodextrins Modified by

Isomeric Aminobenzamides: Synthesis, Conformational Analysis, and Fluorescent

Behaviors. The Journal of Organic Chemistry, 76(12), 4874-4883.

doi:10.1021/jo2007829

85

Westcott, R. J., Cheetham, P. S. J., & Barraclough, A. J. (1993). Use of organized viable

vanilla plant aerial roots for the production of natural vanillin. Phytochemistry,

35(1), 135-138. doi: 10.1016/S0031-9422(00)90521-1

Xiros, C., Moukouli, M., Topakas, E., & Christakopoulos, P. (2009). Factors affecting

ferulic acid release from Brewer’s spent grain by Fusarium oxysporum enzymatic

system. Bioresource Technology, 100(23), 5917-5921.

doi:10.1016/j.biortech.2009.06.018

Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., & Zhang, L. (2009). Theoretical and experimental

study of the inclusion complexes of ferulic acid with cyclodextrins. Supramolecular

Chemistry, 21(7), 597-602. doi:10.1080/10610270802596403

Zhang, Q. F., Cheung, H. Y., Shangguan, X., & Zheng, G. (2012). Structure selective

complexation of cyclodextrins with five polyphenols investigated by capillary

electrokinetic chromatography. Journal of separation science, 35(23), 3347-

3353.doi: 10.1002/jssc.201200528

Zhao, Z., & Moghadasian, M. H. (2008). Chemistry, natural sources, dietary intake and

pharmacokinetic properties of ferulic acid: a review. Food Chemistry, 109(4), 691-

702. doi: 10.1016/j.foodchem.2008.02.039

Zhao, M., Wang, H., Yang, B., & Tao, H. (2010). Identification of cyclodextrin inclusion

complex of chlorogenic acid and its antimicrobial activity. Food Chemistry, 120(4),

1138-1142. doi:10.1016/j.foodchem.2009.11.044

C

C