UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS

RELACIONADAS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO DEL TOMATE

DE ÁRBOL (Solanum betaceum CAV.) CULTIVADO EN DOS

ZONAS CON DIFERENTES ALTURAS (m.s.n.m.)

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO DE

ALIMENTOS

CARLOS ROBERTO CEVALLOS NAVARRETE

DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI

Quito, Mayo 2013

© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2013

Reservados todos los derechos de reproducción

DECLARACIÓN

Yo CARLOS ROBERTO CEVALLOS NAVARRETE, declaro que el trabajo aquí

descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún

grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias

bibliográficas que se incluyen en este documento.

La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos

correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad

Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.

____________________________

Carlos Roberto Cevallos Navarrete

1724014327

CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo que lleva por título “DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD DE ENZIMAS RELACIONADAS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO

DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum CAV.) CULTIVADO EN DOS

ZONAS CON DIFERENTES ALTURAS (m.s.n.m.)”, que, para aspirar al título

de Ingeniero de Alimentos fue desarrollado por Carlos Cevallos, bajo mi

dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple

con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación

artículos 18 y 25.

____________________________

Bioq. María José Andrade Cuvi

DIRECTORA DEL TRABAJO

1712338373

AGRADECIMIENTOS

A mi madre, por darme la oportunidad de estudiar y por proporcionarme los

medios para llegar a ser una persona exitosa.

A mi directora María José y a Nubia por reconocer mi talento, tomarme en

cuenta y apoyarme a lo largo de toda la carrera y por las palabras de aliento

que me brindaron al final.

Al programa de investigación en tratamiento poscosecha de frutos Ecuatorianos

de la facultad de ciencias de la ingeniería de la Universidad Tecnológica

Equinoccial por brindarme la oportunidad de hacer de un proyecto de

investigación mi trabajo de titulación.

Gracias en especial a Michelle, por toda la ayuda que me brindo en las largas

jornadas que tomó la realización de la parte práctica de este trabajo y por todo

el cariño que me da cada día.

A mis compañeros y amigos de la carrera por todos los momentos que

compartimos a lo largo de todos los años de estudio. Un agradecimiento

especial a Lore Cuesta, mi compañera de proyecto por su serenidad, paciencia,

responsabilidad y compromiso, que nos llevaron a formar un excelente equipo

de investigación.

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN viii

ABSTRACT x

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 4

2.1 TOMATE DE ÁRBOL 4

2.1.1 ORIGEN 4

2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y CLASIFICACIÓN

TAXONÓMICA 4

2.1.3 VARIEDADES DE TOMATE DE ÁRBOL 5

2.1.4 COSECHA 7

2.1.4.1 Índices de cosecha 7

2.1.4.2 Recolección del fruto 8

2.1.5 POSCOSECHA 9

2.1.5.1 Operaciones poscosecha 9

2.2 ESTRÉS OXIDATIVO 11

2.2.1 RADICALES LIBRES 12

2.2.1.1 Especies reactivas de oxígeno (EROs) 13

2.2.1.2 Especies reactivas de nitrógeno (ERNs) 14

ii

PÁGINA

2.2.2 TIPOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS

RELACIONADOS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO 16

2.2.2.1 Estrés hídrico 16

2.2.2.2 Estrés por alta y baja temperatura 17

2.2.2.3 Estrés por salinidad 18

2.2.3.4 Estrés por alta o baja irradiancia 19

2.2.3 LA ALTURA DE CULTIVO (m.s.n.m.) COMO FACTOR

ABIÓTICO CAUSANTE DE ESTRÉS OXIDATIVO 20

2.3 SISTEMAS ANTIOXIDANTES 22

2.3.1 ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS 23

2.3.2 ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS 24

2.3.2.1 Peroxidasa (POX) 24

2.3.2.2 Ascorbato peroxidasa (APX) 25

2.3.2.3 Catalasa (CAT) 27

2.3.2.4 Superóxido dismutasa (SOD) 30

3. METODOLOGÍA 32

3.1 MATERIAL VEGETAL 32

3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 32

3.2 MEDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 34

3.2.1 PEROXIDASA (POX) 34

3.2.1.1 Preparación del extracto enzimático 34

3.2.1.2 Determinación de las condiciones óptimas de

reacción 34

iii

PÁGINA

3.2.1.3 Medida de actividad de peroxidasa 35

3.2.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX) 36

3.2.2.1 Preparación del extracto enzimático 36

3.2.2.2 Determinación de las condiciones óptimas de

reacción 36

3.2.2.3 Medida de actividad de ascorbato peroxidasa 37

3.2.3 CATALASA (CAT) 38

3.2.3.1 Preparación del extracto enzimático 38

3.2.3.2 Determinación de las condiciones óptimas de

reacción 38

3.2.3.3 Medida de actividad de catalasa 39

3.2.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) 39

3.2.4.1 Preparación del extracto enzimático 39

3.2.4.2 Determinación de las condiciones óptimas de

reacción 40

3.2.4.3 Medida de actividad de superóxido dismutasa 40

3.2.5 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA 41

3.2.6 ANALISIS ESTADÍSTICO 42

3.3 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN HOJAS 43

3.3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO 43

3.3.2 TITULACIÓN Y CÁLCULO DE LA CANTIDAD DE

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 44

3.3.3 ANALISIS ESTADÍSTICO 45

iv

PÁGINA

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS 46

4.1 ACTIVIDAD DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES 46

4.1.1 PEROXIDASA (POX) 46

4.1.1.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 46

4.1.1.2 Medida de actividad enzimática de POX 49

4.1.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX) 53

4.1.2.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 53

4.1.2.2 Medida de actividad enzimática de APX 55

4.1.3 CATALASA (CAT) 57

4.1.3.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 57

4.1.3.2 Medida de actividad enzimática de CAT 59

4.1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) 63

4.1.4.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción 63

4.1.4.2 Medida de actividad enzimática de SOD 67

4.2 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN HOJAS 70

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 71

5.1 CONCLUSIONES 71

5.2 RECOMENDACIONES 73

BIBLIOGRAFÍA 75

v

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura 1. Principales variedades de tomate de árbol 6

Figura 2. Corte y recolección del tomate de árbol 8

Figura 3. Daños en tomate de árbol por plagas y daño mecánico 10

Figura 4. Centro de acopio de una plantación y la clasificación de tomates

de árbol 10

Figura 5. Formación de principales especies reactivas de oxígeno 14

Figura 6. Principales especies reactivas de nitrógeno y su formación 15

Figura 7. Incremento de la radiación UV-B con la altitud en latitud 33°S 21

Figura 8. Reacción catalizada por peroxidasa 24

Figura 9. Reacción catalizada por POX, donde se oxida el guayacol a

tetrahidroguayacol 25

Figura 10. Reacción catalizada por ascorbato peroxidasa 26

Figura 11. Ciclo del Ascorbato-Glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada 27

Figura 12. Reacción catalizada por catalasa 28

Figura 13. Actuación de la enzima catalasa. Acción catalítica y acción

oxidativa 29

Figura 14. Reacción catalizada por superóxido dismutasa 30

Figura 15. Congelación de las hojas con nitrógeno líquido y trituración en

mortero 33

Figura 16. Separación del endocarpio del tomate de árbol 33

Figura 17. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio y

mesocarpio de tomate de árbol en la mezcla de reacción de

POX 47

Figura 18. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla

de reacción de POX con extracto enzimático del endocarpio y

mesocarpio de tomate de árbol 48

vi

PÁGINA

Figura 19. Ensayo de variación de la concentración de guayacol en la

reacción con extracto enzimático del mesocarpio de tomate de

árbol en reacción de POX 49

Figura 20. Actividad de la enzima peroxidasa (POX) en el endocarpio y

mesocarpio del tomate de árbol 51

Figura 21. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio de

tomate de árbol en reacción de APX 53

Figura 22. Ensayo de variación de concentración de H2O2 realizado con

extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de

APX 54

Figura 23. Ensayo de variación de concentración de Asc-Na realizado con

extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de

APX 54

Figura 24. Actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX) en el

endocarpio del tomate de árbol 56

Figura 25. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio y

mesocarpio de tomate de árbol en la mezcla de reacción de

CAT 58

Figura 26. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla

de reacción de CAT con extracto enzimático del endocarpio y

mesocarpio de tomate de árbol 59

Figura 27. Actividad de la enzima catalasa (CAT) en el endocarpio y en el

mesocarpio del tomate de árbol 61

Figura 28. Actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en el

endocarpio y mesocarpio del tomate de árbol 68

vii

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1. Clasificación taxonómica del tomate de árbol 5

Tabla 2. Características del fruto de las variedades más cultivadas de

tomate de árbol en Ecuador 6

Tabla 3. Resultados del ensayo de variación de concentración de

riboflavina para ensayo de SOD 64

Tabla 4. Resultados del ensayo de variación de tiempo de incubación para

ensayo de SOD 64

Tabla 5. Resultados del ensayo de variación de concentración de

metionina para ensayo de SOD 65

Tabla 6. Resultados del ensayo de variación de la intensidad lumínica

para ensayo de SOD 66

Tabla 7. Resultados del ensayo de variación de volumen de extracto para

ensayo de SOD 67

Tabla 8. Porcentaje de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de tomate

de árbol 70

viii

RESUMEN

El estrés oxidativo se produce en la célula cuando se pierde el equilibro entre la

producción/eliminación de especies reactivos de oxígeno (EROs) que son

producidos normalmente por el metabolismo celular o se induce su síntesis

cuando el tejido es afectado por estrés de tipo biótico o abiótico. Uno de los

factores abióticos que influyen en el estrés oxidativo de las plantas es la altitud

de cultivo, que se manifiesta con el incremento en la incidencia de radiación

UV-B. Para retrasar o controlar la concentración de EROs la célula utiliza

sistemas antioxidantes de tipo enzimático (como las enzimas peroxidasa - POX,

ascorbato peroxidasa - APX, catalasa - CAT y superóxido dismutasa - SOD) y

no enzimático (como compuestos fenólicos, entre otros). Se ha comprobado

que cualquier tipo de estrés induce cambios en estos sistemas con el fin de

evitar la muerte celular. En este sentido, son escasos los estudios que

relacionen la altura como factor abiótico y la actividad enzimática antioxidante

en frutos. Para el presente estudio, se recolectaron tomates de árbol de

variedad “mora”, de dos localidades con diferente altitud, Pelileo (2660

m.s.n.m.) y Chiquicha (2440 m.s.n.m.) y en diferente estado de madurez

(inmaduro y maduro). También se recolectaron hojas de tomate de árbol de las

dos localidades. Parte de los frutos maduros se mantuvieron a temperatura

ambiente durante 17 días para su sobremaduración. A demás se separó el

endocarpio y el mesocarpio de los frutos y se congelaron a -20°C. Las hojas se

congelaron en nitrógeno líquido, se trituraron en un mortero y se almacenaron a

-20°C. Se determinó la actividad enzimática de POX, APX, CAT y SOD con

técnicas espectrofométricas UV-VIS. La proteína se determinó por el método de

Lowry. Se determinó la concentración de H2O2 en las hojas con una titulación

permanganométrica. Los resultados mostraron diferencia significativa entre las

dos alturas de cultivo y entre las dos partes del fruto para todas las enzimas y

ix

se observó que la actividad de POX, APX, CAT y SOD disminuye durante la

maduración del fruto. Se encontró una mayor concentración de peróxido de

hidrógeno (H2O2) en las hojas de tomate de árbol provenientes de la localidad

de Pelileo (2660 m.s.n.m.) que en las de Chiquicha (2440 m.s.n.m.). Se

determinó una relación negativa en relación a la altura de cultivo con la

actividad enzimática antioxidante (POX, APX, CAT y SOD) dado que los frutos

de la localidad de Chiquicha, de inferior altura (2440 m.s.n.m.) y por tanto

expuestos a menor incidencia de radiación UV-B presentaron mayor actividad

en las enzimas analizadas que en los frutos provenientes de Pelileo (2660

m.s.n.m.). Estas diferencias podrían deberse, entre otros factores bióticos y

abióticos, al tiempo de producción del cultivo y a las condiciones más idóneas

del suelo. Son necesarios más estudios para elucidar la relación de la altura de

cultivo con la producción de EROs y la actividad enzimática antioxidante en los

frutos de tomate de árbol.

x

ABSTRACT

Oxidative stress is produced in the cell when the balance between

production/elimination of reactive oxygen species (ROS) is tainted. ROS are

normally produced by the cell metabolism or its synthesis is induced when the

tissue is affected by biotic and abiotic types of stress. One of the abiotic factors

that influences in oxidative stress in plants is the culture altitude, directly linked

with the increase of UV-B radiation incidence. In order to delay or control the

ROS concentration, the cell uses enzymatic antioxidant systems (enzymes like

peroxidase - POX, ascorbate peroxidase - APX, catalase - CAT and superoxide

dismutase - SOD) and non-enzymatic antioxidant systems (like phenolic

compounds, among others). It has been proved that any kind of stress induces

changes in these systems in order to avoid cell death. In this line, studies that

relate the highness as an abiotic factor and the antioxidant enzyme activity in

fruits are scarce. For the present study, tree tomatoes from “blackberry” variety,

were collected from two locations with different altitudes Pelileo (2660 m.s.n.m.)

and Chiquicha (2440 m.s.n.m.) and in two different stages of ripening (immature

and ripe). Tree tomato leaves were also collected from the two locations. Some

of the ripe fruits were kept at room temperature during 17 days for over ripening.

The endocarp and the mesocarp of the fruits were separated and stored at

-20°C. The leaves were frozen with liquid nitrogen, then crushed in a mortar and

stored at -20°C. Enzymatic activity of POX, APX, CAT and SOD was determined

using UV-VIS spectrophotometric techniques. Protein content in the enzyme

extracts was determined using Lowry’s method. The H2O2 concentration in the

leaves was determined using permanganometric titration. The results showed a

significant difference between the two culture altitudes and between the two

parts of the fruit for all the enzymes. The results also showed that the enzymatic

activity of POX, APX, CAT and SOD decreases during fruit ripening. A higher

xi

concentration of hydrogen peroxide (H2O2) was found in Pelileo leaves (2660

m.s.n.m.) compared to the concentration found in Chiquicha (2440 m.s.n.m.)

leaves. A negative relation was determined between the culture highness and

the antioxidant enzymes activity (POX, APX, CAT and SOD), given that the

fruits from Chiquicha of lower altitude (2440 m.s.n.m.), and consequently

exposed to a lower UV-B radiation incidence showed a higher activity of the

analyzed enzymes than the fruits of Pelileo (2660 m.s.n.m).These differences

could be due to, among other biotic and abiotic factors, to the culture’s

production time and the soil conditions. Further studies are necessary to

determine the relation between the culture highness, the ROS production and

the antioxidant enzymes activity in tree tomato fruits.

1

1. INTRODUCCIÓN

El tomate de árbol es uno de los principales cultivos permanentes en la sierra

ecuatoriana. Se cultiva en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha,

Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Bolívar, Cañar, Azuay y Loja (Revelo,

Pérez y Maila, 2011). En total en el país se cultivan 14748 hectáreas, siendo la

provincia de Tungurahua la mayor productora, con 8300 hectáreas (CORPEI,

2008).

En la provincia de Tungurahua, se cultivan distintas variedades de tomate de

árbol en las localidades de los diferentes cantones. Debido a que la provincia

presenta una accidentada geografía, los cultivos del fruto varían en altitudes

desde cerca de los 1000 m.s.n.m. hasta casi los 3000 m.s.n.m. Dos de las

principales zonas productoras de tomate de árbol variedad mora son Chiquicha

y los alrededores de Pelileo.

El tomate de árbol resalta por sus cualidades nutricionales, especialmente sus

propiedades de reducción de colesterol, su alto contenido de fibra, vitaminas A

y C, y su bajo nivel de calorías. Es rico en minerales, especialmente calcio,

hierro y fósforo; contiene niveles importantes de proteína, carotenos y pectina.

Fortalece el sistema inmunológico y la visión, además de funcionar como

antioxidante (Lucas, Maggi y Yagual, 2011).

En el Ecuador, el tomate de árbol se consume en forma de jugo, mermelada,

jaleas y postres. Tradicionalmente, a este fruto también se le han atribuido

propiedades medicinales, éstas están relacionadas con las afecciones de

garganta y gripe. Por ejemplo, es común aplicar el fruto o las hojas previamente

calentadas o soasadas, en forma tópica contra la inflamación de amígdalas o

anginas.

2

En fruto terapia el tomate de árbol es muy apreciado por la variedad de

aplicaciones y excelentes resultados. El consumo de la fruta fortalece el cerebro

y la memoria, contribuye al tratamiento de migrañas y cefaleas severas, a

controlar la rinitis y beneficia el sistema circulatorio (Albuja y Miño, 2005). Todas

estas características han hecho que el tomate de árbol haya llegado a

convertirse en una fruta de exportación (CORPEI, 2008).

Muchos de estos efectos beneficiosos del tomate de árbol tienen relación con

los antioxidantes que posee el fruto. La cantidad de antioxidantes que existen

en un fruto depende de la producción de radicales libres dentro de él originados

ya sea por el metabolismo propio del tejido o por respuesta a condiciones de

estrés causados por factores bióticos (insectos y microorganismos que afecten

al desarrollo de la planta) ó por factores abióticos (condiciones

medioambientales adversas para la planta) (Carrillo y Valle, 2005).

Estas condiciones adversas producen un incremento de radicales libres en las

células vegetales. Las plantas han desarrollado sistemas antioxidantes que

previenen que estos radicales libres dañen a la célula, destruyéndolos ó

inactivándolos (Miranda y Castro, 2007). Estos sistemas se dividen en

antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. Los antioxidantes no enzimáticos

son compuestos que donan potencial reductor a los radicales libres

inactivándolos, mientras que los antioxidantes enzimáticos es un grupo de

enzimas que eliminan a los radicales libres (Loscos, 2007). Entre las principales

enzimas antioxidantes se encuentran las catalasas, superoxido dismutasas y la

ascorbato peroxidasa (Montoliu, 2010). La peroxidasa, aunque se encuentre

ligada con el pardeamiento enzimático, también tiene propiedades antioxidantes

(Miranda, 2003).

La cuantificación de compuestos antioxidantes y la determinación de la

actividad de enzimas antioxidantes es importante, debido al valor nutricional

3

agregado que le dan estas al fruto, y la influencia de estos compuestos en la

vida útil poscosecha (Navarro, et. al., 2006; Ndidi y Akeem, 2011).

Dado que la altitud modifica de alguna forma las condiciones en cada cultivo, se

la podría considerar como un factor abiótico que incide en el desarrollo de las

plantas y sus frutos. Siendo así, la cantidad de antioxidantes y la actividad de

enzimas antioxidantes se podrían ver afectada por este factor. Estudiar la altitud

de cultivo como factor abiótico podría proporcionar información de en cuáles

cultivos este fruto presenta las mejores características antioxidantes, de manera

que beneficien al consumidor.

El principal propósito de del presente trabajo de investigación fue determinar la

actividad de enzimas antioxidantes relacionadas con el estrés oxidativo del

tomate de árbol (Solanum betaceum cav.) cultivado en dos zonas con diferente

altitud (m.s.n.m.), para determinar cuál de las dos zonas produce frutos con

mejores características antioxidantes.

Los resultados del presente trabajo forman parte del PROGRAMA DE

INVESTIGACIÓN EN TRATAMIENTO POSCOSECHA DE FRUTOS

ECUATORIANOS y son antecedentes para futuros trabajos de investigación.

Los objetivos del presente trabajo de investigación fueron:

Determinar la actividad enzimática de peroxidasa, ascorbato peroxidasa,

catalasa y superóxido dismutasa en el endocarpio y mesocarpio de frutos

de tomate de árbol cultivado en dos zonas con diferente altitud (m.s.n.m.)

y en tres estados de madurez.

Cuantificar la cantidad de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de

tomate de árbol cultivado en dos zonas con diferente altitud (m.s.n.m.).

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1 TOMATE DE ÁRBOL

2.1.1 ORIGEN

El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) también conocido como tamarillo,

es una fruta exótica originaria de la parte oriental de los Andes, específicamente

Perú, Ecuador y Colombia. Investigaciones recientes sostienen que según

evidencias moleculares, estudios morfológicos y datos de campo; el tomate de

árbol se habría originado en Bolivia. (Del Cisne, 2011).

2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

El tomate de árbol es una planta arbustiva con tallos semileñosos, de follaje

grande, alcanzando una altura de 2 a 3 m. El sistema radical de la planta de

tomate de árbol posee una raíz principal y raíces secundarias que salen de esta

y a su vez se ramifican. (Pilco, 2009). Las hojas son cordiformes (forma de

corazón), carnosas, levemente pubescentes y muy grandes. Posee flores son

de color rosa y lavanda, agrupadas en racimos terminales, las cuales florecen

de manera escalonada (Calvo, 2009). Los frutos son solitarios ó se encuentran

agrupados, de colores variables, del amarillo al rojo, dependiendo de la

variedad (Jibaja, 2010), de forma ovoidal con ápices puntiagudos, contienen

muchas semillas pequeñas en cantidades de 120 a 150. (Revelo, et. al, 2011).

La clasificación taxonómica del tomate de árbol se describe en la Tabla 1.

5

Tabla 1. Clasificación taxonómica del tomate de árbol.

Reino: Vegetal

División Fanerógamas

Subdivisión: Angiospermas

Clase: Dicotiledóneas

Subclase: Simpétalas

Orden: Tubifloras

Familia: Solanaceae

Género: Solanum

Especie: betaceum (Cav.)

Nombre Común: Tomate de Árbol

(Pilco, 2009)

2.1.3 VARIEDADES DE TOMATE DE ÁRBOL

Existen en la actualidad 8 genotipos de tomate de árbol que se cultivan en

Ecuador, según Revelo, et. al. (2011):

Amarillo

Negro

Redondo

Puntón (común)

Rojo

Anaranjado ó Amarillo gigante

Mora (Neozelandés)

Mora (Ecuatoriano)

Varios de estos genotipos resultan del cruce de una variedad con otra. Los

principales cultivos de tomate de árbol comprenden las variedades puntón,

redondo, anaranjado ó amarillo gigante y mora (Ecuatoriano ó Neozelandés), se

muestran en la figura 1.

6

Figura 1. Principales variedades de tomate de árbol (Ávila, 2009).

En la tabla 2, se puede observar una comparación entre valores promedio de

las características del fruto de cada una de estas variedades.

Tabla 2. Características del fruto de las variedades más cultivadas de tomate

de árbol en Ecuador.

Variedades

Parámetros Puntón Redondo Gigante Mora

N° de frutos maduros / Inflorescencia

2,4 3,0 4,0 4,0

Peso (g) 75 75 118 117

Longitud (cm) 6,8 5,5 7,0 8,0

Firmeza (N) 25 15 23 18

Semillas (N°) 196 243 308 296

Color

Piel anaranjado Rojizo oscuro

Pulpa anaranjado Anaranjado

Mucílago anaranjado Rojo oscuro -

morado

(León y Viteri, 2004)

7

2.1.4 COSECHA

Dependiendo de la localidad, la cosecha se inicia aproximadamente desde los

10 a los 14 meses después del trasplante, siendo más temprana a altitudes de

1500 m.s.n.m. con clima templado y más tardía a altitudes de 2600 m.s.n.m.

con clima frío. Dependiendo de la altitud y el manejo de la plantación, puede

producir de 3 a 4 años. La producción es permanente en zonas con clima

templado y es estacionaria en zonas frías (Revelo, et. al, 2011).

2.1.4.1 Índices de cosecha

La madurez del tomate de árbol puede medirse visualmente a partir de su

coloración externa y confirmada al examinar el contenido de pulpa, así como

por medio de la prueba de yodo (Codex Alimentarius, 2011).

Otros índices, son el cambio en la firmeza, contenido de jugo y sólidos solubles

en la fruta. Para especies de color rojo (puntón), el cambio de color de la

cáscara se da desde un color verde en la primera etapa, pasando por un

morado oscuro (debido a la clorofila y antocianinas) en su segunda etapa,

aproximadamente a los 120 días, y que llega finalmente a tener su color rojo en

su madurez completa en la tercera etapa aproximadamente a los 140 días

(FAO, 2006). Es recomendable su cosecha entre la segunda y tercera etapa

para asegurar mayor vida útil (Cantwell, 2005).

8

2.1.4.2 Recolección del fruto

La recolección se hace a lo largo del día, utilizando unas varas con una cuchilla

en el extremo para facilitar el corte del tomate. La recolección se divide en dos

etapas (figura 2), la primera de corte del tomate con la vara, el cual dejan caer

directamente al suelo, y la segunda de recolección de toda la fruta que está en

el suelo, producto de la anterior práctica (Reinel, Brito y García, 2008).

Figura 2. Corte y recolección del tomate de árbol (Reinel, et. al, 2008).

La recolección en la mayoría de plantaciones de tomate de árbol se realiza con

una frecuencia de 15 días, dejando el pedúnculo adherido a la fruta para evitar

su deshidratación, el ingreso de patógenos por la base del fruto, retrasar la

maduración y mejorar su aspecto (Revelo et. al, 2011).

El tomate es recolectado en diferentes recipientes, desde carretillas hasta

bolsas de lona, pasando por canecas, baldes y canastillas (Reinel, et. al, 2008).

9

2.1.5 POSCOSECHA

La poscosecha de la fruta parte desde el momento en que se separa el fruto del

árbol. Cualquier golpe, roce o lastimadura que se provoque al fruto en el

momento de la cosecha y durante su transporte afectará la calidad de la fruta y

por lo tanto su precio (Revelo, et. al., 2011).

2.1.5.1 Operaciones poscosecha

Los productores de tomate de árbol emplean generalmente solo 4 operaciones

básicas de poscosecha: selección de frutos sanos, clasificación por color,

tamaño y forma, almacenamiento y transporte (Revelo, et. al, 2011).

2.1.5.1.1 Selección

El tomate de árbol es seleccionado durante su recolección. La selección

consiste en separar los productos malos, es decir, aquellos que presenten

defectos que impidan su venta o procesamiento (Pinto y Mozo, 2006). Las

causas más frecuentes para descartar un tomate son el ataque de plagas y

enfermedades o el daño mecánico (figura 3).

10

Figura 3. Daños en tomate de árbol por plagas y daño mecánico (Reinel, et. al,

2008).

2.1.5.1.2 Clasificación

Es la separación de los frutos según propiedades escogidas por el comprador o

consumidor. En el caso del tomate de árbol, se clasifican por color, forma y

tamaño (Pinto y Mozo, 2006). Esta operación se hace en los centros de acopio

de las plantaciones (figura 4).

Figura 4. Centro de acopio de una plantación y la clasificación de tomates de

árbol (Reinel, et. al, 2008).

11

2.1.5.1.3 Almacenamiento

Debido a que el proceso de poscosecha es seguido inmediatamente por la

comercialización, el almacenamiento se lo hace por períodos máximos de 1 a 2

días, en bodegas rústicas cuya temperatura oscila alrededor de 25°C (Revelo

et. al, 2011).

2.1.5.1.4 Transporte

El tomate de árbol es transportado a los centros de comercialización y

distribución en algunos casos en los mismos vehículos de los productores.

También se da el caso en el que los intermediarios recogen los frutos en

camiones de estaca con carpa en lona oscura (Reinel, et. al, 2008).

2.2 ESTRÉS OXIDATIVO

El estrés se identifica como una desviación significativa de las condiciones

óptimas para la vida. Dichas condiciones ocasionan cambios en todos los

niveles funcionales de los organismos. Desde un punto de vista biológico,

según Larcher (1995): “el estrés tiene una connotación más amplia, refiriéndose

a los cambios ambientales que alteran al estado fisiológico de los organismos

vivos”. Dentro de la fisiología vegetal, el término estrés se lo define como

cualquier factor ambiental, biótico ó abiótico, que reduce la tasa de algún

proceso fisiológico por debajo de la tasa máxima que puede alcanzar (Lambers,

12

Stuart-Chapin III y Pons, 1998). Miranda y Castro (2007), establecen que la

duración, severidad y velocidad de un estrés al que se ven sometidas las

plantas, influyen directamente en sus respuestas fisiológicas.

Dadas las condiciones adversas para la planta, independientemente de su

causa, esta tiende a la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno,

conocidas como EROs (ROS, por sus siglas en inglés: Reactive Oxigen

Species) (Inze y Van Montagu, 1995). El estrés oxidativo, según Simontacchi

(2001), es un estado alterado de la homeostasis de óxido-reducción intracelular,

es decir, el balance entre oxidantes y antioxidantes. La susceptibilidad a estrés

oxidativo depende en general de éste balance (Cafaro, 2005).

Dada su gran reactividad y en ausencia de mecanismos que las depuren, las

EROs y otros radicales producen daños en membranas, lípidos, proteínas,

ácidos nucléicos y otros componentes celulares, llevando finalmente a la muerte

celular y a la aparición de lesiones necróticas (Foyer y Noctor, 2005).

2.2.1 RADICALES LIBRES

Se define a un radical libre como una molécula o fragmento molecular que

contiene uno o más electrones desapareados en el orbital más externo. Una

molécula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia como por pérdida

de electrones. Al romperse un enlace covalente en forma simétrica, ambos

fragmentos retienen un electrón, y por tanto, se convierten en radical libre. Este

electrón desapareado le confiere al radical libre inestabilidad, tanto energética

como cinética, lo que los hace compuestos altamente reactivos (Cabrera y

Robles, 2010). Para conseguir la estabilidad modifican a moléculas de su

alrededor provocando la aparición de nuevos radicales, por lo que se crea una

13

reacción en cadena que daña a muchas células y puede ser indefinida si los

sistemas antioxidantes no intervienen (FEC, 2008).

2.2.1.1 Especies reactivas de oxígeno (EROs)

Las EROs, son compuestos altamente reactivos, que se producen durante los

procesos de respiración y fotosíntesis bajo condiciones fisiológicas normales,

en mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas de las células vegetales (Gilll y

Tuteja, 2010). Estos compuestos se incrementan cuando la planta está

expuesta a un medio ambiente desfavorable y son eliminados por complejos

sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos (Airaki, 2012).

El oxígeno molecular (O2), se encuentra en su estado basal como triplete; esto

quiere decir que sus dos electrones ligantes poseen spins paralelos (figura 5),

de modo que solo puede reaccionar a velocidades apreciables con compuestos

provistos de electrones paralelos en sus orbitales de valencia, lo cual es

infrecuente (Boveris, 1984). Se conoce a este fenómeno como restricción de

spin e impone barreras cinéticas insalvables para la reacción bivalente con

biomoléculas y favorece los intercambios de un electrón (Carrillo y Valle, 2005).

Se considera al O2 un radical libre, ya que no tiene completamente apareados

sus electrones. Sus dos electrones tienen el mismo número cuántico de spin, es

decir, sus spins son paralelos; de aquí su gran capacidad para reaccionar con la

mayoría de las moléculas que no son radicales (Halliwell, 2006).

Existen numerosos procesos biológicos capaces de provocar reducciones

monoelectrónicas, generando sucesivamente, como se muestra en la figura 5,

superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (OH)-. Por

otra parte, fenómenos de transferencia de energía pueden lograr la inversión de

spin con producción de oxígeno singlete (1O2). Todos estos compuestos, las

14

EROs, son más reactivos que el O2 y en consecuencia, más tóxicos (Fridovich,

1998).

Figura 5. Formación de principales especies reactivas de oxígeno (Miranda y

Castro, 2007).

2.2.1.2 Especies reactivas de nitrógeno (ERNs)

Las especies reactivas de nitrógeno, se forman por la interacción del óxido

nítrico (NO) con otros radicales y con el oxígeno. El óxido nítrico puede existir

como tres especies distintas, ya que puede adoptar estructuras más

energéticas, ganando o perdiendo un electrón. Estas tres especies son el propio

radical (NO), el anión nitroxilo (NO-) y el catión nitrosonio (NO+), las cuales

difieren en sus propiedades y su reactividad (Wojtaszek, 2000). Las ERNs

pueden o no ser radicales libres.

15

Las principales especies reactivas de nitrógeno son las 3 especies de NO, y las

moléculas relacionadas con estas, como el peroxinitrito (ONOO-), el trióxido de

dinitrógeno (N2O3), la 3-nitrotirosina (n-Tyr), el dióxido de nitrógeno (NO2) y el S-

nitrosoglutation (GSNO) (Haillwell, 2006). La formación de estos compuestos se

puede apreciar en la figura 6.

Figura 6. Principales especies reactivas de nitrógeno y su formación (Airaki,

2012).

Los ERNs pueden perjudicar a las células por distintos mecanismos, entre ellos,

la inactivación de distintos complejos en la cadena respiratoria, daño a

proteínas y lípidos e inhibición de la síntesis proteica o de ADN (Airaki, 2012).

El aumento de las ERNs debido a factores a varios tipos de estreses, tanto

bióticos como abióticos, genera un desequilibrio, conocido como estrés

nitrosátivo (Valderrama, et. al., 2008).

16

2.2.2 TIPOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS RELACIONADOS CON

EL ESTRÉS OXIDATIVO

Existen variadas clasificaciones de los factores de estrés. En general, estos

pueden ser clasificados en físicos, químicos y bióticos, siendo los dos primeros

agrupados bajo el término de ‘estreses abióticos’ (ITESCAM, 2012). Son

múltiples los factores ambientales o abióticos que pueden inducir el estrés en

plantas, como son el déficit hídrico, la salinidad, las temperaturas extremas, la

excesiva o insuficiente radiación luminosa y los factores mecánicos como las

lesiones, que en muchos casos pueden estar asociados a un estrés biótico

(Montoliu, 2010). Todos estos tipos de estrés pueden generar a su vez un

estrés oxidativo en la planta (García, 1998; Carrillo y Valle, 2005; Miranda y

Castro, 2007).

A continuación se describen las condiciones de estrés generadas por factores

abióticos más relevantes, que pueden a su vez generar condiciones de estrés

oxidativo en plantas.

2.2.2.1 Estrés hídrico

El estrés hídrico incluye en realidad dos tipos de estrés contrapuestos: por

déficit o por exceso de agua en el suelo. El déficit hídrico limita la producción

vegetal en el planeta más que ningún otro factor ambiental, y generalmente la

tasa de crecimiento de una comunidad vegetal ó un cultivo es proporcional a la

disponibilidad de agua (Boyer, 1982).

Es bastante frecuente que dos o más factores de estrés coexistan, pudiendo su

interacción ser sinérgica (Nilsen y Orcutt, 1996). El término sequía denota en

muchos casos esta interacción entre baja disponibilidad hídrica, alta

17

temperatura y alta irradiación. La sequía es un concepto meteorológico más que

fisiológico, ya que se refiere a un período en el cual las precipitaciones no

compensan el agua perdida por evapotranspiración (Passioura, 1996).

A causa de su papel esencial en el metabolismo de las plantas, el déficit de

agua afecta rápidamente los procesos que van desde la fotosíntesis hasta la

respiración (Basurto, et. al, 2008). Dentro de los procesos biofísicos más

afectados por la carencia de agua se encuentran la expansión celular y el

crecimiento (Benavides, 2002).

2.2.2.2 Estrés por alta y baja temperatura

Las plantas son organismos poiquilotémicos, es decir cuya temperatura

depende de la del ambiente (Kratsch y Wise 2000). La temperatura tiene una

influencia directa en casi todos los procesos de la planta como la fotosíntesis,

respiración, transpiración, germinación de la semilla, floración y maduración del

fruto (Nilsen y Orcutt, 1996; Benavides, 2002).

De acuerdo a Tambussi (2000), el término ‘bajas temperaturas’ se utiliza para

designar aquellas temperaturas por encima (‘chilling’) o por debajo de 0 ºC

(‘freezing’) que causan algún tipo de daño a las plantas. Uno de los efectos

mejor caracterizados de las bajas temperaturas es la disminución de la fluidez

de las membranas, que si se prolonga en el tiempo, impide a la biomembrana

mantener los gradientes iónicos y el metabolismo comienza a sufrir alteraciones

(Nishida y Murata, 1996).

A menudo se relaciona la exposición a bajas temperaturas con el déficit hídrico

de la planta. Esto podría deberse, según Allen y Ort (2001), a la disminución de

la conductividad hidráulica de las raíces y alteraciones en el grado de control

18

estomático conduciendo a un desbalance entre captación de agua y

transpiración.

Por otra parte, las altas temperaturas pueden dañar la planta rápidamente por la

desnaturalización de las proteínas, ó lentamente por desecación, quemaduras

solares (por abrasión) y el aumento de la tasa respiratoria hasta superar a la

tasa fotosintética, con lo cual la planta agota sus subsistencias de reserva

(Benavides, 2002). Las altas temperaturas en algunos casos también están

ligadas a un déficit de hídrico.

El nivel de afectación de la planta por altas o bajas temperaturas, depende de la

especie. Pero, generalmente, una desviación del rango de temperatura óptimo

para la planta genera una sobreproducción de EROs y puede inducir a la planta

a un estrés oxidativo (García, 1998; Carrillo y Valle, 2005; Miranda y Castro,

2007).

2.2.2.3 Estrés por salinidad

Un hábitat salino se define por la presencia de un contenido normalmente muy

alto de sales solubles (Basurto, et. al, 2008). Durante la temporada de

crecimiento, las sales se acumulan en el dosel de las plantas, después de que

las hojas mueren y caen al suelo para descomponerse. Las sales que contenían

se acumulan en el suelo, y su cantidad porcentual se ve incrementada muy

fuertemente en las áreas desérticas, donde la tasa anual de evaporación del

suelo supera la cantidad de agua proveniente de las precipitaciones

(Benavides, 2002). La acumulación de sales básicas eleva el pH del suelo

(Basurto, et. al, 2008).

El principal efecto fisiológico de la salinidad sobre las plantas es la reducción

del crecimiento. Los sistemas enzimáticos de la glicólisis, ciclo de Krebs y la

19

fotofosforilación son especialmente sensibles a las soluciones salinas, y dan

como resultado una menor disponibilidad de energía y adquisición de nutrientes

(Larcher, 1995).

La reducción del crecimiento también se debe a tres factores: a un efecto

osmótico inducido por la disminución del potencial osmótico del medio, una

toxicidad específica típicamente asociada con la absorción excesiva de iones

Na+ y Cl- y a un desequilibrio nutricional debido a la interferencia de los iones

salinos con los nutrientes esenciales. Muchas veces estos tres efectos se

combinan. Como consecuencia de estos efectos primarios también se produce

un daño oxidativo (Zhu, 2001).

2.2.3.4 Estrés por alta o baja irradiancia

La irradiancia, es la potencia incidente por unidad de superficie, en este caso,

de radiación solar. Las plantas están separadas en 3 grupos: las que están

adaptadas a poca irradiancia llamadas “plantas de sombra”, las que están

adaptadas a alta irradiancia llamadas “plantas de sol” y las que poseen un

amplio rango de adaptación a una cantidad variable de irradiancia (García,

1998). Cada una posee características físicas y fisiológicas adaptadas para la

cantidad de luz que reciben.

Una cantidad irradiancia que sobrepase el nivel de adaptación de las plantas

causa reducción de la actividad fotosintética de la planta. Si la energía que llega

a los centros de reacción, excede la cantidad de energía que puede utilizarse,

se puede generar daños en el aparato fotosintético (Lucinski y Jackowski,

2006).

La flexibilidad del metabolismo celular y su rápida aclimatación a los cambios de

las condiciones ambientales es el paso esencial para evitar el estrés. Las

20

plantas con baja tolerancia a cambios en la irradiancia, alcanzan muy

rápidamente estados de daño agudo y estrés (García, 1998).

2.2.3 LA ALTURA DE CULTIVO (m.s.n.m.) COMO FACTOR ABIÓTICO

CAUSANTE DE ESTRÉS OXIDATIVO

La altura se define como la distancia vertical de un cuerpo hacia una superficie

tomada como referencia. El termino altitud, en geografía, se conoce como la

distancia vertical de un punto en la superficie terrestre hasta el nivel medio del

mar. La altitud, junto con la latitud son los factores abióticos de un ecosistema

que causan cambios térmicos, y consecuentemente cambian los climas y la

distribución de los seres vivos (Manzano, 2009).

La altitud está asociada a varios factores abióticos que pueden influir en el

desarrollo y el comportamiento de los seres vivos. Entre los factores más

importantes que cambian con la altitud están: temperatura, presión atmosférica

(Muñoz, 2003) e incidencia de radiación UV-B (Rubio, et. al., 2002; Rivas, et.al,

2002; Rivas et, al., 2008).

De todos estos factores, el más estudiado es la influencia de la radiación UV-B.

Según el estudio de Rubio y colaboradores (2002) en zonas andinas de Chile,

la radiación UV-B aumenta de forma proporcional con la altura en un estudio

realizado entre altitudes de 850 y 2650 m.s.n.m. en una latitud de 33° Sur. El

resultado del estudio se presenta en la figura 7.

21

Figura 7. Incremento de la radiación UV-B con la altitud en latitud 33°S (Rubio,

et. al., 2002)

Dado que a medida que las latitudes se alejan de la línea equinoccial la

radiación solar debe atravesar una mayor cantidad de atmósfera, es probable

que en el territorio ecuatoriano, específicamente en la provincia de Tungurahua

ubicada entre las latitudes 1°S y 1°30’S la radiación y su tasa de variación con

la altitud sean mayores.

El espectro de radiación UV, abarca longitudes de onda entre 200nm y 400nm.

Este se divide en UV-C (100nm – 280nm), UV-B (280nm – 315nm) y UV-A

(315nm – 400nm). De estas, la UV-A llega con mayor intensidad a la superficie

terrestre, mientras que la UV-B lo hace en cantidad 15 veces menor, y la UV-C

tiene una incidencia casi nula (Casal, 2008). Las plantas se han adaptado a las

distintas incidencias de la radiación UV-B. Por lo general las plantas de altura

más expuestas a la incidencia de esta radiación son pequeñas y poseen

internudos más cortos (Kakani, et. al., 2003).

22

Distintos estudios han relacionado el aumento de radiación UV-B con la

generación de EROs, dando cuenta además de la activación de mecanismos de

defensa similares a los desarrollados en ataque de patógenos, lo que sugiere

que la radiación UV-B activaría procesos de lipoperoxidación en la membrana

plasmática (Foyer, et. al., 1994; Izaguirre, et. al., 2003).

Las investigación de Casati y Walbot (2003) en plantas de maíz expuestas a

radiación UV-B, revelaron el aumento de la expresión de genes de proteínas

antioxidantes como la ascorbato peroxidasa. La radiación UV-B provoca una

explosión oxidativa a nivel celular e induce cambios significativos en un grupo

importante de proteínas como lo son las enzimas antioxidantes superóxido

dismutasa, catalasa, peroxidasa, glutatión reductasa y ascorbato peroxidasa,

además de las moléculas antioxidantes como el glutatión, ascorbato, α-tocoferol

y carotenoides, lo que demuestra la participación de especies reactivas de

oxígeno (EROs) en la respuesta a UV-B (Rao, Paliyath y Ormrod, 1996).

Las EROs por efecto de la radiación UV-B actuarían no tan solo como radicales

destructivos a nivel celular sino también como señales moleculares esenciales

para gatillar modificaciones en la expresión de genes y así contrarrestar el

efecto de la radiación UV-B sobre las plantas. Las ERNs también estarían

implicadas en la activación de genes involucrados en la respuesta a UV-B (A-H-

Mackerness, et.al., 2001).

2.3 SISTEMAS ANTIOXIDANTES

Las plantas han desarrollado estrategias para eliminar el exceso de EROs.

Estos mecanismos celulares son diversos, y tienen complejas relaciones entre

ellos, dependiendo de los compartimentos celulares en los que se encuentran.

23

Existen mecanismos de protección enzimáticos y no enzimáticos que atrapan e

inactivan eficientemente las EROs (Miranda y Castro, 2007). El principal

objetivo de estos mecanismos es disminuir el riesgo de estrés oxidativo,

manteniendo el estado redox a nivel celular en niveles estables (Loscos, 2007).

2.3.1 ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS

Los antioxidantes no enzimáticos son también conocidos como antioxidantes

estequiométricos por su capacidad de neutralizar de forma equimolar un radical

libre por molécula (Halliwell y Gutteridge, 2007). La función química de los

antioxidantes es ceder potencial reductor a los compuestos oxidantes capaces

de dañar a los componentes celulares. Los productos finales de esta reacción

de disipación energética antioxidante-oxidante son comúnmente el O2 y el H2O,

acompañados de liberación de calor (Miranda y Castro, 2007).

Existen varias sustancias de las que se describe actividad antioxidante y que

están presentes en los tejidos vegetales. Sin embargo, en muchos casos, en los

tejidos muchas veces no se encuentran en las concentraciones necesarias para

manifestar esta capacidad (Airaki, 2012). Es por eso que se dice que los

compuestos antioxidantes actúan normalmente a concentraciones altas

(Halliwell y Gutteridge, 2007). Los compuestos antioxidantes son generalmente

de baja masa molecular y pueden ser de naturaleza liposoluble (como

carotenoides, flavonoies, poliaminas, entre otros) e hidrosoluble (como

ascorbato y glutatión) (Loscos, 2007).

24

2.3.2 ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS

Los sistemas antioxidantes enzimáticos constituyen un grupo variado de

enzimas con la propiedad común de ser capaces de eliminar, suprimir o

neutralizar a los radicales libres y a las especies activas de oxigeno (De Paula,

1994; Loscos, 2007). Las principales enzimas que componen este sistema son

las superóxido dismutasas (SOD), catalasas (CAT) y las enzimas del ciclo

ascorbato-glutation (ASC-GSH) (Loscos, 2007; Montoliu, 2010).

2.3.2.1 Peroxidasa (POX)

La peroxidasa (E.C., 1.11.1.7, POX) es una hemoproteína monomérica que

cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos donadores (fenoles,

aminas aromáticas e hidroquinonas) utilizando el peróxido de hidrógeno (H2O2)

como cofactor, y consecuentemente, reduciéndolo a H2O (Wellinder, 1991;

Hernández, 2006). Su mecanismo de acción se ilustra en la figura 8, donde A

es un agente reductor ó donador.

Figura 8. Reacción catalizada por peroxidasa (Welinder, 1991).

Para el caso puntual de la guayacol peroxidasa, la reacción de oxido-reducción

con el guayacol y el peróxido de hidrógeno se muestra en la figura 9.

25

Figura 9. Reacción catalizada por POX, donde se oxida el guayacol a

tetrahidroguayacol (Rodríguez, et. al., 2001).

Las peroxidasas en la célula vegetal se ubican en los peroxisomas,

cloroplastos, vacuolas y pared celular (Narváez, 2002). Su característica de

oxidar compuestos fenólicos, la relaciona con el grupo de enzimas

responsables del pardeamiento, pero la característica de reducir el H2O2 a H2O

es lo que la ubica dentro del sistema enzimático antioxidante (Miranda, 2003).

Un incremento en la actividad y/o expresión de isoenzimas de peroxidasas es

característico de la defensa de las plantas ante condiciones de estrés biótico u

abiótico (Hernández, 2006). La POX también participa en varios procesos

celulares como el desarrollo y organogénesis de la planta y la senescencia

(Gechev, et. al, 2003).

2.3.2.2 Ascorbato peroxidasa (APX)

La ascorbato peroxidasa (E.C., 1.11.1.11; APX) es una enzima hemínica y que

requiere la presencia de ascorbato en cantidades considerables para su

estabilidad y funcionalidad (Montoliu, 2010). Esta enzima reduce el H2O2 a H2O

26

utilizando ascorbato como agente reductor, el cual después de la reacción se

oxida a monodehidroascorbato (MDA), como se observa en la figura 10. La APX

se encuentra ligada al ciclo del ascorbato-glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada,

donde lleva a cabo la primera reacción (De Paula, 1994; Naya; 2007; Miranda y

Castro, 2007; Montoliu, 2010; Airaki, 2012).

Figura 10. Reacción catalizada por ascorbato peroxidasa (Airaki, 2012).

El ciclo Ascorbato-Glutatión (ASC-GSH) es un sistema antioxidante exclusivo

de las plantas muy importante para la eliminación de H2O2, especialmente en

los compartimentos celulares donde se produce este metabolito y no existe

catalasa, como en los cloroplastos y el citosol (Halliwell y Gutteridge, 2007). La

principal enzima de este sistema, y la más abundante es la ascorbato

peroxidasa (Naya, 2007). Una vez reducido el ascorbato a

monodehidroascorbato (MDA), como se muestra en la figura 14, este es

reducido por la enzima Monodehidroascorbato reductasa (MR) de nuevo a

ascorbato, requiriendo de NADH. Dos moléculas de MDA pueden

desproporcionarse convirtiéndose en ASC y Dehidroascorbato (DHA). El DHA

se regenera a ASC con la enzima Dehidroascorbato reductasa, que usa

glutatión (GSH) como reductor. El ciclo se completa con la reducción del

glutatión oxidado (GSSG) por la enzima Glutation reductasa (GR) utilizando

NADPH (Carrillo y Valle, 2005; Naya, 2007; Miranda y Castro, 2007; Airaki,

2012). El ciclo ASC-GSH completo se puede apreciar en el esquema de la

figura 11.

27

Figura 11. Ciclo del Ascorbato-Glutatión ó ciclo de Halliwell-Asada (Naya,

2007).

La ascorbato peroxidasa, a diferencia de la catalasa, tiene una gran afinidad por

el sustrato (H2O2), por lo que puede actuar a concentraciones muy bajas del

mismo (Shigeoka, et. al., 2002). Se ha descrito ampliamente que la expresión

de APX se incrementa bajo condiciones de sobreproducción de H2O2 como las

inducidas por diversos tipos de estrés, tanto bióticos como abióticos (Dat, et. al.,

2000).

2.3.2.3 Catalasa (CAT)

La catalasa (E.C., 1.11.1.6; CAT) es una enzima tetramérica, antioxidante que

contiene un grupo hemo, y se encuentra en todos los organismos aeróbicos

(Martínez, 2003). Las catalasas tienen una función clave en la protección de las

células contra el estrés oxidativo por la dismutación del H2O2 a O2 y H2O sin

necesidad de poder reductor. Su mecanismo de acción simplificado, se puede

observar en la figura 12. Esta ventaja energética frente a las peroxidasas es

contrarrestada por la baja afinidad de la enzima por el sustrato, por tanto, la

catalasa es activa tan sólo a altas concentraciones de H2O2 (Naya, 2007).

28

Figura 12. Reacción catalizada por catalasa (Marín y Roustan, 2000).

La catalasa actúa fundamentalmente sobre el peróxido de hidrógeno producido

en la β-oxidación de los ácidos grasos (glioxisomas) y en la fotorrespiración

(peroxisomas), que es donde se concentran altas cantidades de H2O2 (De

Paula, 1994; Kuk, et. al., 2003; Vuleta, et. al., 2010). La función de CAT sería la

de eliminar todo el exceso de H2O2 en situaciones de estrés oxidativo (Mittler,

2002), antes de que éste se difunda al citoplasma y pueda reaccionar con las

biomoléculas (Montoliu, 2010).

La catalasa puede presentar dos actividades: catalítica y peroxidativa, con

características cinéticas completamente distintas (Elstner, 1987). Ambas

actividades requieren la formación de un compuesto intermedio (Compuesto I)

entre la enzima y una molécula de peróxido de hidrógeno (figura 13), unidos a

través del hierro del grupo hemo, que pasa a tener estado de oxidación +5.

29

Figura 13. Actuación de la enzima catalasa. Acción catalítica y acción oxidativa

(De Paula, 1994).

El Compuesto I puede reaccionar con otra molécula de H2O2 (actividad

catalítica) liberando oxígeno molecular y agua o bien puede formar el

Compuesto II, inactivo. Así mismo, el Compuesto I puede actuar sobre otros

compuestos donadores de electrones (actividad peroxidativa) formando los

respectivos productos de oxidación (De Paula, 1994; Marín y Roustan, 2000;

Halliwell y Gutteridge, 2007).

La expresión de la enzima está regulada durante el desarrollo de la planta, pero

también responde a diversas señales ambientales como el exceso de luz y las

temperaturas extremas, ya que generalmente la enzima se inhibe tanto a

temperaturas bajas como ante un shock térmico (Dat, et. al., 2000).

30

2.3.2.4 Superóxido dismutasa (SOD)

La enzima superóxido dismutasa (E.C., 1.15.1.1; SOD) es una metaloproteína

que cataliza la dismutación del radical superóxido (O2-) para formar oxígeno

molecular (O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2) (De Paula, 1994; Martínez, 2003;

Airaki, 2012), según la reacción en la figura 14. Las SOD son la primera

defensa contra los efectos tóxicos del radical superóxido producido en los

diferentes compartimientos celulares (Halliwell y Gutteridge, 2007).

Figura 14. Reacción catalizada por superóxido dismutasa (Airaki, 2012).

Se conocen tres familias principales de SOD que difieren en el metal

constituyente del grupo prostético: cobre/zinc (Cu/Zn-SOD), manganeso (Mn-

SOD) o hierro (Fe-SOD) (Martínez, 2003).

2.3.2.4.1 Cu/Zn-SOD

Las Cu/Zn-SODs son proteínas diméricas que presentan un átomo de Cu y otro

de Zn en cada subunidad. Esta enzima es la más abundante de las SODs en

plantas superiores, y se localiza en el citosol, cloroplasto y peroxisomas (Arines,

et. al., 1994; Del Rio, et. al., 2002).

31

Se ha descrito que las Cu/Zn-SODs catalizan la descomposición de S-

nitrosotioles de bajo pero molecular, generando óxido nítrico (Johnson, et. al.,

2001). Según Fridovich (1986), estas enzimas son inhibidas irreversiblemente

por la presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) y reversiblemente por la

presencia de cianuros (CN-).

2.3.2.4.2 Mn-SOD

Las Mn-SODs de plantas son proteínas homotetraméricas y se encuentran en

las mitocondrias y peroxisomas (Halliwell y Gutteridge, 2007). La actividad de la

Mn-SOD no es inhibida por la presencia de cianuros (CN-) ni de peróxido de

hidrógeno (H2O2) (Fridovich, 1986).

2.3.2.4.3 Fe-SOD

Las Fe-SODs son proteínas homodiméricas y se encuentran principalmente en

cloroplastos y Peroxisomas (Asada, 1994). Según fridovich (1986), la actividad

de la Fe-SOD no es inhibida por la presencia de cianuros (CN-), pero si por la

presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2).

32

3. METODOLOGÍA

3.1 MATERIAL VEGETAL

El material vegetal fue recolectado en la provincia de Tungurahua, en las

localidades de Pelileo (2660 m.s.n.m.) y Chiquicha (2440 m.s.n.m). Se

cosecharon tomates de árbol variedad “Mora”, con una madurez del 50% y del

75%. Además se recolectaron hojas de la planta, considerando que no se

encontraran en estado de senescencia, que no fueran nuevas y estuviesen

libres de defectos.

3.1.1 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

El material vegetal fue trasladado al laboratorio el día de cosecha a °T ambiente

en canastas de plástico. Las hojas fueron cortadas en tiras, congeladas en

nitrógeno líquido (figura 15), trituradas en un mortero hasta obtener partículas

finas y almacenadas en frascos de polipropileno a -20°C.

33

Figura 15. Congelación de las hojas con nitrógeno líquido (a) y trituración en

mortero (b).

Los frutos fueron limpiados y clasificados según su estado de madurez en 2

grupos: inmaduros y maduros. El 50% de los frutos maduros, fue almacenado a

temperatura ambiente en bandejas plásticas durante 17 días para la

sobremaduración.

Los frutos fueron pelados y cortados en 4 cuartos y, de cada uno, se separó el

endocarpio con una cuchara (figura 16). Las muestras fueron conservadas en

congelación a -20°C para su posterior análisis enzimático.

Figura 16. Separación del endocarpio del tomate de árbol.

34

3.2 MEDIDA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

3.2.1 PEROXIDASA (POX)

3.2.1.1 Preparación del extracto enzimático

Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.

Aproximadamente, 5g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se

homogenizaron en 15mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH

6) conteniendo Tritón X-100 0,1%. La suspensión resultante fue sometida a

agitación durante 30 min y luego se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se

separó el sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas

fueron almacenadas en congelación a -20°C hasta su análisis.

3.2.1.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción

Se obtuvo extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de

tomate de árbol, por separado.

Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto

enzimático del endocarpio, se mantuvo un volumen constante de 500μL de

guayacol 0,25% (v/v) (0,0625% (v/v) en la mezcla de reacción), se varió la

cantidad de extracto entre 50μL y 350μL y la cantidad de H2O2 25mM entre

50μL y 140μL (entre 6,25μM y 17,5μM en la mezcla de reacción). El volumen

final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4

0,1M pH 6).

35

En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se varió la cantidad de

guayacol 0,25% (v/v) entre 100μL y 300μL (entre 0,0125% y 0,0375% (v/v) en la

mezcla de reacción), el extracto entre 100μL y 350μL y la cantidad de H2O2

25mM entre 50μL y 140μL (entre 6,25μM y 17,5μM en la mezcla de reacción).

El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y

KH2PO4 0,1M pH 6).

3.2.1.3 Medida de actividad de peroxidasa

La actividad POX fue estimada por la medida del incremento de la absorbancia

por formación del producto de dehidrogenación del guayacol a 470nm, durante

120s, según el método de Flurkey & Je (1978), con ligeras modificaciones en

las concentraciones de los componentes de la reacción.

Para medir la actividad de peroxidasa en el endocarpio, la mezcla de reacción

contenía 250μL de extracto enzimático, 0,0625% (v/v) de guayacol, H2O2 15μM

y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 6) para completar un volumen final de

2mL. En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción

contenía, 300μL de extracto enzimático, 0,025% (v/v) de guayacol, H2O2 15μM

y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 6) para completar un volumen final de

2mL.

Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo

Scientific en una celda de vidrio de 10mm. Una unidad de actividad de POX fue

definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).

36

3.2.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX)

3.2.2.1 Preparación del extracto enzimático

Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.

Aproximadamente 4 g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se

homogenizaron en 20mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH

7) que contenía EDTA 0,1mM y ascorbato de sodio 2,5mM. La suspensión

resultante se sometió a agitación durante 30 min y luego se centrifugó a 6000

rpm durante 30 min. Se separó el sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas

de 1,5mL. Las alícuotas fueron almacenadas en congelación a -20°C hasta su

análisis.

3.2.2.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción

Se realizaron extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de

tomate de árbol, por separado.

Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto

enzimático del endocarpio, se varió la cantidad de ascorbato de sodio 0,25 mM

entre 300μL y 600μL (entre 37,5μM y 75μM en la mezcla de reacción), la

cantidad de extracto entre 250μL y 500μL y la cantidad de H2O2 0,1M entre

450μL y 950μL (entre 22,5mM y 47,5mM en la mezcla de reacción). El volumen

final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4

0,1M pH 7).

En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se ensayaron 2 volúmenes

constantes de ascorbato de sodio 0,25mM (100μL y 500μL) (12,5μM y 62,5μM

37

en la mezcla de reacción). Se varió la cantidad de extracto entre 250μL y 600μL

y la cantidad de H2O2 0,1M entre 100μL y 450μL (5mM y 22,5mM en la mezcla

de reacción). El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL con buffer

(Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7).

3.2.2.3 Medida de actividad de ascorbato peroxidasa

La actividad de la enzima APX fue determinada según el método de Nakano &

Asada (1987) con ligeras modificaciones en las concentraciones de los

componentes de la reacción. Se cuantificó la variación en la absorbancia

medida a 290nm durante 120s, manifestada por la cantidad de ascorbato de

sodio que es oxidado por la enzima en presencia de H2O2.

Para medir la actividad de APX en el endocarpio, la mezcla de reacción

contenía 62,5μM de ascorbato de sodio, 450µL de extracto enzimático, 42,5mM

de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7) para completar un

volumen final de 2mL. En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla

de reacción contenía 62,5μM de ascorbato de sodio 600µL de extracto

enzimático, 5mM de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7) para

completar un volumen final de 2mL.

Se realizaron dos controles de reacción: sin extracto (para considerar la

posibilidad de oxidación química debida a otros componentes de la mezcla de

reacción) y sin H2O2 (para considerar la oxidación del ascorbato dependiente

del extracto). La actividad de APX se corrigió por la substracción de la oxidación

del ácido ascórbico dependiente del H2O2 (Andrade, 2008).

Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo

Scientific en una celda de cuarzo de 10mm. Una unidad de actividad de APX

fue definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).

38

3.2.3 CATALASA (CAT)

3.2.3.1 Preparación del extracto enzimático

Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.

Aproximadamente 5g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se

homogenizaron en 15mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH

7). La suspensión resultante se sometió a agitación durante 30 min y luego se

centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se separó el sobrenadante y se lo

distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas fueron almacenadas en

congelación a -20°C hasta su análisis.

3.2.3.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción

Se realizaron extractos enzimáticos de tejidos del mesocarpio y endocarpio de

tomate de árbol, por separado.

Para la determinación de condiciones óptimas de reacción del extracto

enzimático del endocarpio, se varió la cantidad de extracto entre 50μL y 250μL

y la cantidad de H2O2 1M entre 20μL y 100μL (entre 10mM y 50mM en la

mezcla de reacción). El volumen final de reacción se completó hasta 2000μL

con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75).

En el caso del extracto enzimático del mesocarpio, se varió la cantidad de

extracto entre 50μL y 400μL y la cantidad de H2O2 1M entre 40μL y 120μL

(entre 20mM y 60mM en la mezcla de reacción). El volumen final de reacción se

completó hasta 2000μL con buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75).

39

3.2.3.3 Medida de actividad de catalasa

La actividad de la enzima CAT se determinó según el método de Aebi (1984)

con ligeras modificaciones en las concentraciones de los componentes de la

reacción. Se cuantificó la variación de la absorbancia medida a 240nm durante

240s, debida a la degradación enzimática del H2O2.

Para medir la actividad de catalasa en el endocarpio, la mezcla de reacción

contenía 200µL de extracto enzimático, 30mM de H2O2 y buffer fosfato

(Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 7,75) para completar un volumen final de 2mL.

En la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción contenía,

300µL de extracto enzimático, 50mM de H2O2 y buffer fosfato (Na2HPO4 y

KH2PO4 0,05M pH 7,75) para completar un volumen final de 2mL.

Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo

Scientific en una celda de cuarzo de 10mm. Una unidad de actividad de CAT

fue definida como el cambio de absorbancia por minuto (ΔA/min).

3.2.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

3.2.4.1 Preparación del extracto enzimático

Todos los pasos descritos para la extracción enzimática se realizaron a 4°C.

Aproximadamente 4 g de tejido congelado fueron triturados con un molinillo y se

homogenizaron en 20mL de buffer de extracción (Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH

7) que contenía EDTA 0,1 mM. La suspensión resultante se sometió a agitación

durante 30 min y luego se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min. Se separó el

40

sobrenadante y se lo distribuyó en alícuotas de 1,5mL. Las alícuotas fueron

almacenadas en congelación a -20°C hasta su análisis.

3.2.4.2 Determinación de las condiciones óptimas de reacción

Para la obtención de valores de absorbancia dentro del rango más sensible del

equipo, se ajustó una serie de condiciones que influyen en el desarrollo de la

reacción.

El volumen de riboflavina 0,029mM se varió entre 500μL y 1000μL (entre

4,83µM y 9,67µM en la mezcla de reacción), el tiempo de incubación entre 5min

y 18min, el volumen de metionina 13mM entre 50μL y 300μL (entre 0,216mM y

1,3mM en la mezcla de reacción) y la intensidad lumínica entre 30W y 120W. El

volumen final de reacción se completó hasta 3000μL con buffer (Na2HPO4 y

KH2PO4 0,1M pH 7,8). No se realizó un ensayo de variación de NBT, ya que no

tiene influencia significativa en la absorbancia de la mezcla de reacción

después de incubarse (Andrade, 2008).

Para elegir la cantidad de extracto a usar en la reacción, se ensayó por

separado usando extractos del endocarpio y mesocarpio. Para ambos casos el

volumen de extracto en la reacción se varió entre 25μL y 450μL, para

seleccionar la cantidad donde la mezcla de reacción diera una disminución de la

absorbancia aproximadamente del 50% que una reacción sin extracto.

3.2.4.3 Medida de actividad de superóxido dismutasa

La actividad de SOD fue determinada según la técnica de Giannopolitis & Ries

(1977), con ligeras modificaciones en las concentraciones de los componentes

41

de la reacción. Para medir la actividad de SOD en el endocarpio, la mezcla de

reacción contenía 0,86mM de metionina, 5µM de nitroblue tetrazolium (NBT),

5,8µM de riboflavina, 6,66µM de EDTA, 50µL de extracto enzimático y buffer

(Na2HPO4 y KH2PO4 0,1M pH 7,8) para completar un volumen total de 3mL. En

la medida de la actividad del mesocarpio, la mezcla de reacción contenía

0,86mM de metionina, 5µM de nitroblue tetrazolium (NBT), 5,8µM de riboflavina,

6,66µM de EDTA y 150µL de extracto enzimático y buffer (Na2HPO4 y KH2PO4

0,1M pH 7,8) para completar un volumen total de 3mL.

La mezcla de reacción fue preparada en vasos de precipitación de 10mL, para

asegurar una exposición homogénea a la luz. Una vez homogenizadas, las

mezclas de reacción se colocaron bajo 4 lámparas fluorescentes de 30W, a una

distancia de 25cm, a temperatura ambiente por 18min. La reacción

empieza/termina con el encendido/apagado de las lámparas, respectivamente.

Una mezcla de reacción irradiada, sin extracto enzimático se utilizó como

control. Una mezcla completa de reacción no irradiada fue usada como blanco.

Finalmente, la absorbancia de la mezcla de reacción fue medida a 560nm.

Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo

Scientific en una celda de vidrio de 10mm. Una unidad de actividad de SOD se

definió como la cantidad de enzima que, bajo las condiciones de ensayo, causa

un 50% de inhibición de la reacción (o absorbancia) observada en ausencia de

enzima.

3.2.5 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA

La cantidad de proteína en cada extracto fue determinada por el método de

Lowry (1951). El método se inicia con la reacción de Biuret, en medio alcalino y

42

en presencia de tartrato para evitar la precipitación, donde los iones de Cu2+

forman un complejo con el nitrógeno proteico. Después, los complejos proteína-

Cu2+ reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau, el cual es reducido por la

presencia de grupos fenólicos de las proteínas, dando una coloración azul

oscura (Rodríguez, 2005). La absorbancia máxima de este compuesto fue

establecida en 650nm, por medio de un barrido del compuesto en el

espectrofotómetro.

Se cuantificó la proteína de todos los extractos enzimáticos. La mezcla de

reacción contenía 40μL de extracto para el caso de los pertenecientes al

endocarpio, y 150μL de extracto para los pertenecientes al mesocarpio, 1000μL

del reactivo de Lowry (98% v/v de carbonato sódico 2% en Na(OH) 0,1M + 1%

v/v de sulfato cúprico 1% + 1% v/v de tartrato sódico 2%) y 100μL de Folin-

Ciocalteau (diluido 1:5 en agua destilada). El volumen final de las mezclas fue

completado hasta 1300μL con agua destilada.

Todas las medidas fueron realizadas en un espectrofotómetro de marca Thermo

Scientific en una celda de plástico de 10mm. Se usó albúmina sérica bovina

(BSA) como proteína patrón (2mg/mL), se ensayó la reacción con volúmenes

entre 20μL y 100μL, por triplicado, para obtener una curva de calibración.

3.2.6 ANALISIS ESTADÍSTICO

Se trató por separado los análisis estadísticos de cada parte del fruto

(endocarpio y mesocarpio). Se aplicó a cada uno un diseño multifactorial AxB,

donde el primer factor fue la altura de cultivo y el segundo fue el estado de

madurez del fruto. Se realizó un análisis de varianza. Las medidas fueron

43

comparadas mediante test de Tukey con una significancia de 0,05 utilizando el

software STATGRAPHICS Centurion.

3.3 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN

HOJAS

La determinación del porcentaje de peróxido de hidrógeno (% H2O2) en las

hojas del tomate de árbol, se realizó mediante una titulación

permanganométrica del extracto de tejido congelado.

3.3.1 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

El extracto se preparó según el método de Jana y Choundri (1981), con ligeras

modificaciones. Se pesó en la balanza analítica aproximadamente 2,5g de tejido

congelado y triturado de hojas de tomate de árbol en un tubo Falcon. Se añadió

25mL de buffer (Na2HPO4 y KH2PO4 0,05M pH 6,8) como solución extractora.

Se homogenizó, y se centrifugó a 4°C por 20min.

44

3.3.2 TITULACIÓN Y CÁLCULO DE LA CANTIDAD DE PERÓXIDO DE

HIDRÓGENO

Para la titulación permanganométrica, se vertió 20mL del sobrenadante del

extracto en un matraz erlenmeyer, se añadió 8mL de una solución de H2SO4

12,5% (v/v) y se tituló con KMnO4 0,1N hasta que la solución titulada adquiriera

una coloración rosa intensa (al menos 10 segundos de permanencia).

Para el cálculo del % H2O2 (p/p) se utilizó la ecuación 1.

[1]

Donde:

V1 = Mililitros de KMnO4 0,1N consumidos en la valoración

N = 0,1

Eq = Peso Equivalente del H2O2 = 17

V0 = Volumen al que se diluyó la muestra = 25mL

V = Volumen utilizado para la valoración = 20mL

a = Gramos de muestra pesados para el extracto

45

3.3.3 ANALISIS ESTADÍSTICO

Se aplicó un diseño unifactorial, donde el factor estudiado fue la altura de

cultivo. Los resultados se procesaron mediante un análisis de varianza. Las

medidas comparadas por el test de Tukey con una significancia de 0,05

utilizando el software STATGRAPHICS Centurion.

46

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

4.1 ACTIVIDAD DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES

4.1.1 PEROXIDASA (POX)

4.1.1.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción

Se ensayó la reacción de peroxidasa con distintas concentraciones de extracto,

se seleccionó la cantidad de 250μL de extracto enzimático del endocarpio

(figura 17a) del fruto y 300 uL para el mesocarpio (figura 17b), ya que a partir de

este volumen se encontró la actividad máxima de la enzima, es decir que ésta

se encontraba saturada. La diferencia de volúmenes utilizados en la mezcla de

reacción sugeriría que el endocarpio del tomate de árbol presenta mayor

actividad enzimática que el mesocarpio.

47

Figura 17. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio (A) y

mesocarpio (B) de tomate de árbol en la mezcla de reacción de POX.

Una vez fijada la concentración de la enzima se realizó la variación del sustrato

de la enzima (H2O2) en la reacción (figura 18). Se seleccionó la concentración

correspondiente a la saturación de la enzima, de 15μM de H2O2 tanto para los

extractos de mesocarpio y endocarpio del fruto.

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

50 150 250 350 Δ

Ab

s /

min

Extracto (µL)

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

2,1

50 150 250 350

Δ A

bs

/ m

in

Extracto (µL)

A

B

48

Figura 18. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla de

reacción de POX con extracto enzimático del endocarpio (A) y mesocarpio (B)

de tomate de árbol.

Se realizó también una variación de la concentración de guayacol (figura 19) y

se seleccionó aquella correspondiente al punto de saturación de la enzima, que

fue de 0,025% (v/v), utilizado para posteriores medidas.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

5 10 15 20 Δ

Ab

s /

min

H2O2 (µM)

2

2,2

2,4

2,6

2,8

3

3,2

3,4

3,6

5 10 15 20

Δ A

bs

/ m

in

H2O2 (µM)

B

A

49

Figura 19. Ensayo de variación de la concentración de guayacol en la reacción

con extracto enzimático del mesocarpio de tomate de árbol en reacción de

POX.

4.1.1.2 Medida de actividad enzimática de POX

Los resultados de la medida de la actividad de POX para el endocarpio del fruto

mostraron diferencia significativa entre las dos localidades para los frutos

inmaduros y los sobremaduros, como se aprecia en la figura 20a. En el

mesocarpio de los frutos la actividad de la enzima tuvo valores promedio 10,2

veces mayores a los medidos en el endocarpio. Se encontró diferencia

significativa entre las dos localidades, para los frutos inmaduros y los maduros,

(figura 20b). En las dos partes del fruto y en todos los estados de madurez, los

valores de actividad de la enzima para la localidad de Chiquicha (2440

m.s.n.m.) fueron superiores a los de Pelileo (2660 m.s.n.m.), lo que podría

relacionarse con la menor altura del cultivo y por lo tanto menor incidencia de

radiación UV-B. Considerando éste último factor, Alexieva y col. (2001),

obtuvieron un resultado similar en plantas de trigo, donde la actividad de POX

disminuía después de una exposición a mayor radiación UV-B a diferencia del

0,8

0,85

0,9

0,95

1

1,05

1,1

1,15

0,01 0,02 0,03 0,04 Δ

Ab

s /

min

% Guayacol (v/v)

50

resultado que obtuvieron en plantas de guisante, en las que la actividad

enzimática de POX se incrementó por la mayor incidencia de radiación UV-B.

51

Figura 20. Actividad de la enzima peroxidasa (POX) en el endocarpio (A) y

mesocarpio (B) del tomate de árbol.

Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos

localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor

es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma

localidad con una p<0,05 Tukey=0,164 para (A) y una p<0,05 Tukey=1,287 para (B).

b A a A

b A

a A

a A

a A

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

b A b A a A

a A

a B a AB

0

1

2

3

4

5

6

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

B

A

52

La actividad de esta enzima en el endocarpio de los frutos de Pelileo se

mantuvo prácticamente constante durante la maduración, mientras que en los

frutos de Chiquicha, la actividad disminuyó en un 32% en los frutos maduros

con respecto a los inmaduros (aunque no se encontró diferencia significativa),

para luego aumentar ligeramente en los sobremaduros, como se muestra en la

figura 20a. Este aumento de actividad enzimática podría deberse por un lado, a

la concentración de la enzima por deshidratación de los frutos o bien al

aumento de la actividad de la enzima en frutos senescentes según sugieren los

resultados obtenidos por Quian y col. (2012) en pepino chino y por Baquero y

col. (2005) en pitaya amarilla sobremadurada por 15 días.

En el mesocarpio de los frutos de la localidad de Pelileo se mantuvo constante

en los tres estados de madurez, mientras que en los frutos cultivados en la

localidad de Chiquicha, se produjo una disminución de la actividad de la enzima

en un 19% de los frutos maduros con respecto a los inmaduros (se encontró

diferencia significativa entre las muestras), y se observó un ligero incremento en

frutos sobremaduros (figura 20b).

Tanto en el endocarpio como en el mesocarpio de los frutos de las dos

localidades se pudo observar una disminución de la actividad de POX durante

la maduración. Resultados similares fueron reportados por Mondal y col. (2004)

en 2 variedades de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), donde la actividad

enzimática disminuye a medida que el fruto se desarrolla en la planta, debido al

incremento progresivo del estrés oxidativo durante la madurez.

53

4.1.2 ASCORBATO PEROXIDASA (APX)

4.1.2.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción

Se realizó la reacción de ascorbato peroxidasa con distintas concentraciones de

enzima (figura 21), se seleccionó la cantidad de 500μL de extracto enzimático

del endocarpio del fruto, concentración utilizada en ensayos posteriores.

Figura 21. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio de

tomate de árbol en reacción de APX.

Una vez fijada la concentración de la enzima se realizó la variación de

concentración de H2O2 en la reacción (figura 22). Se seleccionó la

concentración de 42,5mM de H2O2 en la mezcla de reacción.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

200 300 400 500

|Δ A

bs|

/ m

in

Extracto (µL)

54

Figura 22. Ensayo de variación de concentración de H2O2 realizado con

extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de APX.

Así mismo, se varió la concentración de ascorbato de sodio (Asc-Na) en la

mezcla de reacción (figura 23). La concentración de Asc-Na se fijó en 62,5μM.

Figura 23. Ensayo de variación de concentración de Asc-Na realizado con

extractos de tejido del endocarpio del fruto en la reacción de APX.

2,5

3

3,5

4

4,5

5

20 30 40 50 1

/|Δ

Ab

s|/

min

H2O2 (mM)

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

45 55 65 75 85

1 /

|Δ

Ab

s| /

min

Asc-Na (μM)

55

Las medidas cinéticas efectuadas a la mezcla de reacción que contenía

extractos de mesocarpio, mostraban un incremento en la absorbancia a lo largo

del tiempo, contrario a la disminución de la absorbancia esperada por la acción

de la enzima por el consumo del sustrato, por lo que se consideró que el

mesocarpio no presentaba actividad enzimática de APX. La APX es una enzima

que utiliza el ácido ascórbico (AsA) como intermediario de sus reacciones;

probablemente la concentración de AsA en el mesocarpio, 4,5 veces menor a la

del endocarpio (Gordon, et. al., 2007), esté relacionada con la prácticamente

nula (o pudiéndose considerar no detectable por el método analítico utilizado)

actividad de APX en el mesocarpio del fruto.

4.1.2.2 Medida de actividad enzimática de APX

En el endocarpio de los frutos, la actividad de APX mostró diferencias

significativas entre las dos localidades para los frutos inmaduros y los maduros,

siendo la localidad de Chiquicha la que presentó valores de actividad

enzimática 40% y 15% mayores respectivamente (figura 24). Ren y col. (2007),

Hassan y col. (2012) y Golbaz y col. (2012) reportaron un resultado contrario en

hojas de dos diferentes especies de álamos en China, en guisantes y en brotes

de girasol respectivamente, donde la actividad de la enzima aumentaba con la

altura del cultivo.

56

Figura 24. Actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX) en el endocarpio

del tomate de árbol.

Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos

localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor

es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma

localidad con un HSD=0,064.

La actividad de APX en el endocarpio de frutos de Pelileo permaneció

prácticamente constante durante la maduración, sin embargo mostró una

disminución en los frutos sobremaduros, existiendo diferencia significativa. Los

frutos de la localidad de Chiquicha presentaron una disminución progresiva de

la actividad de la enzima a lo largo de sus estados de madurez, existiendo

diferencia significativa entre los frutos inmaduros y los sobremaduros que

mostraban un 36% inferior de actividad con respecto a los frutos inmaduros

(figura 24). Oliveira, et. al. (2012) registraron un incremento progresivo de la

actividad de APX durante la sobremaduración de la papaya dorada, sin

embargo, la actividad de la enzima decayó abruptamente después de los ocho

días de sobremaduración. Es posible que el endocarpio del tomate también

b A b A

a B

a A

a AB

a B

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

57

sufriera un incremento en la actividad de APX y luego una caída brusca que se

prolongó hasta el día 17 de sobremaduracíon cuando se efectuaron las

medidas. Por otro lado, el endocarpio del tomate de árbol mostró un descenso

en la actividad de APX a lo largo de sus estados de madurez, que concuerda

con lo observado por Mondal y col. (2004) en dos especies de tomate, pero

contrasta a los resultados obtenidos por Mondal y col. (2009) en guaba, donde

la actividad de la enzima aumentaba con la madurez del fruto en la planta y

poscosecha, mientras que estudios en pepino chino (Quian, et. al., 2012),

muestran un descenso en la actividad de la enzima durante la madurez en el

fruto, seguido por un aumento brusco durante la sobremaduración.

4.1.3 CATALASA (CAT)

4.1.3.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción

Se ensayó la reacción de catalasa con distintas concentraciones de enzima, se

seleccionó la cantidad de 200μL de extracto enzimático del endocarpio (figura

25a) del fruto y 300 uL para el mesocarpio (figura 25b), ya que a partir de este

volumen se encontró la actividad máxima de la enzima.

58

Figura 25. Ensayo de variación de volumen de extracto del endocarpio (A) y

mesocarpio (B) de tomate de árbol en la mezcla de reacción de CAT.

Una vez fijada la concentración de la enzima, se realizó la variación de sustrato

(concentración de H2O2) en la reacción, seleccionando la concentración

(correspondiente a la saturación de la enzima) de 30mM de H2O2 en la mezcla

de reacción con extractos del endocarpio del fruto (figura 26a) y 50mM de H2O2

en la mezcla de reacción con extractos del mesocarpio (figura 26b) para

medidas posteriores.

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 100 200 300 |Δ

Ab

s|/

min

Extracto (µL)

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

0 100 200 300 400

|Δ A

bs|

/ m

in

Extracto (µL)

B

A

59

Figura 26. Ensayo de variación de la concentración de H2O2 en la mezcla de

reacción de CAT con extracto enzimático del endocarpio (A) y mesocarpio (B)

de tomate de árbol.

4.1.3.2 Medida de actividad enzimática de CAT

La actividad de CAT en el endocarpio de los frutos inmaduros y maduros fue

mayor en la localidad de Pelileo, de mayor altitud (2660 m.s.n.m.), que en la

localidad de Chiquicha, de menor altitud (2440 m.s.n.m.), presentando

diferencias significativas (figura 27a). En el mesocarpio de los frutos se observó

lo contrario, siendo la localidad de Chiquicha la que registró mayor actividad

25

30

35

40

45

50

55

15 25 35 45 55 1

/ |Δ

Ab

s| /

t

H2O2 (mM)

130

140

150

160

170

180

190

200

210

25 35 45 55 65

1 /

|Δ

Ab

s| /

min

mM H2O2

B

A

60

enzimática de CAT en los tres estados de madurez (figura 27b). Sin embargo,

únicamente se registró diferencia significativa entre los resultados en los frutos

inmaduros de las dos localidades. Los resultados obtenidos en el endocarpio de

los frutos son similares a los reportados por Alexieva y col. (2001) y por Hassan

y col. (2012) en guisante y por Ren y col. (2007) en una especie de álamo

(Populus kangdingensis), donde la actividad de la enzima aumentaba en

plantas expuestas a mayor radiación UV-B, en contraste estos resultados son

opuestos en el caso del mesocarpio donde la enzima presenta menor actividad

en frutos expuestos a mayores dosis de radiación UV-B.

61

Figura 27. Actividad de la enzima catalasa (CAT) en el endocarpio (A) y en el

mesocarpio (B) del tomate de árbol.

Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos

localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor

es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma

localidad con p<0,05 Tukey=0,0067 para (A) y un p<0,05 Tukey=0,0075 para (B).

a A a A

a A

b A b A

a A

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

b A

a A

a B

a A

a B

a B

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

A

B

62

En el endocarpio de los frutos inmaduros y maduros de la localidad de

Chiquicha, la actividad de la enzima permaneció prácticamente constante para

luego aumentar en un 18% en los frutos sobremaduros respecto a la actividad

de los frutos inmaduros (sin encontrarse diferencia significativa), como se indica

en la figura 27a. Existió un ligero aumento de la actividad de CAT de los frutos

inmaduros a los maduros para las dos localidades, de forma similar a los

resultados obtenido por Mondal y col. (2004) en frutos de tomate y por Abbasi y

col. (2010) en manzana. En las dos localidades, la actividad de CAT en el

endocarpio no varió durante la maduración (de frutos maduros a

sobremaduros), sin decaer bruscamente como en el caso del mesocarpio, al

igual que en pitaya amarilla (Baquero y col., 2005).

Mientras que en el mesocarpio, para los frutos de las dos localidades, la

actividad de CAT tuvo la tendencia a disminuir a lo largo de los tres estados de

madurez analizados. La actividad de la enzima en el mesocarpio de los frutos

inmaduros de Chiquicha fue significativamente diferente a la de los frutos

maduros y sobremaduros, llegando a disminuirse en un 53% en la

sobremaduración. En los frutos de Pelileo, se encontró diferencia significativa

entre los frutos sobremaduros y los frutos maduros e inmaduros. La actividad

enzimática de CAT en estos frutos se redujo en un 52% con respecto a la

actividad en el mesocarpio de los frutos inmaduros (figura 27b). Resultados

similares se han encontrado en pitaya amarilla, donde se encontró una

reducción brusca de la actividad de esta enzima después del máximo

climatérico poscosecha de los frutos (Baquero y col., 2005). Estudios en uva

caimarona (Narváez y Restrepo, 2003) han obtenido resultados semejantes. El

descenso en la actividad de CAT después del máximo climatérico podría

deberse a un desbalance entre la producción y eliminación de EROs, iniciando

así el proceso de degradación de los tejidos del fruto.

63

4.1.4 SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

4.1.4.1 Determinación de condiciones óptimas de reacción

La reacción de determinación de SOD que genera un compuesto de color (azul

formazan a partir de NBT y riboflavina en presencia de metionina), depende de

la concentración de sus componentes, del tiempo de exposición a la luz, y de la

intensidad de la luz. Para ajustar las condiciones óptimas de reacción de SOD,

primero se ajustaron estas condiciones de la reacción en ausencia de enzima,

de tal manera que se alcanzara una absorbancia cercana a 0,8. Posteriormente,

se ensayó la reacción con diferentes cantidades de los dos extractos

enzimáticos (endocarpio y mesocarpio) para evaluar qué concentración de la

enzima causaba aproximadamente el 50% de inhibición de la reacción de

formación del compuesto de color.

4.1.4.1.1 Concentración de riboflavina

En primer lugar se varió la concentración de riboflavina en la reacción (tabla 3).

Se seleccionó la concentración de 5,8μM, ya que presentó un valor de

absorbancia cercano a 0,8.

64

Tabla 3. Resultados del ensayo de variación de concentración de riboflavina

para ensayo de SOD.

Riboflavina (μM)

Absorbancia (560nm)

4,83 0,79

5,8 0,83

6,77 0,905

7,73 0,963

8,7 1,016

9,67 1,087

4.1.4.1.2 Determinación del tiempo de reacción

Se sometió la mezcla de reacción a 6 diferentes tiempos de incubación (tabla

4). Se seleccionó el tiempo de incubación de 18 minutos, ya que para este

tiempo de reacción, presentó un valor de absorbancia cercano a 0,8.

Tabla 4. Resultados del ensayo de variación de tiempo de incubación para

ensayo de SOD.

Tiempo de incubación

(min)

Absorbancia (560nm)

5 0,327

8 0,457

10 0,539

12 0,608

15 0,747

18 0,830

65

4.1.4.1.3 Variación de la concentración de metionina

Se varió la concentración de metionina en la reacción (tabla 5). Se seleccionó la

concentración de 0,867mM, con la que la mezcla de reacción presentó un valor

de absorbancia cercano a 0,8.

Tabla 5. Resultados del ensayo de variación de concentración de metionina

para ensayo de SOD.

Metionina (mM)

Absorbancia (560nm)

0,217 0,67

0,433 0,776

0,65 0,831

0,867 0,846

1,083 0,854

1,3 0,883

4.1.4.1.4 Variación de la intensidad lumínica

Se realizó un ensayo de variación de la intensidad lumínica a la cual se

sometería la mezcla de reacción en ensayos posteriores (tabla 6). Se

seleccionó la intensidad lumínica de 120W, ya que las mezclas de reacción

presentaban valores de absorbancia cercanos a 0,8.

66

Tabla 6. Resultados del ensayo de variación de la intensidad lumínica para

ensayo de SOD.

Intensidad (W)

Absorbancia (560nm)

120 0,848

90 0,782

60 0,656

30 0,432

4.1.4.1.5 Variación de volumen de extracto

Se realizaron dos ensayos con extractos del endocarpio y del mesocarpio del

fruto respectivamente (tabla 7). Para cada ensayo se realizó un control,

incubado sin extracto y un blanco, que contenía 200μL de extracto enzimático y

no fue incubado. Se seleccionó la cantidad de 50μL de extracto enzimático del

endocarpio, y 150μL de extracto enzimático del mesocarpio del fruto. Para

ambos casos, la absorbancia de la mezcla de reacción elegida mostraba

aproximadamente un 50% de inhibición con respecto a la absorbancia de la

mezcla control menos la absorbancia de la mezcla blanco.

67

Tabla 7. Resultados del ensayo de variación de volumen de extracto para

ensayo de SOD.

Extracto (μL)

Absorbancia (560nm)

Endocarpio Mesocarpio

25 0,585 0,739

50 0,225 0,66

100 0,21 0,507

150 0,219 0,369

200 0,146 0,325

250 0,164 0,249

300 0,193 0,169

350 0,133 0,165

400 0,15 0,115

450 0,192 0,162

Control 0 0,74 0,902

Blanco 200 0,212 0,016

4.1.4.2 Medida de actividad enzimática de SOD

La actividad de SOD en el endocarpio fue superior para la localidad de

Chiquicha en los todos los estados de madurez de los frutos. Sin embargo, solo

existió diferencia significativa entre las dos localidades en los frutos inmaduros

(figura 28a). En el mesocarpio, a pesar de que la actividad de SOD de los frutos

maduros e inmaduros muestra valores mayores para la localidad de Pelileo, no

se encontró diferencia significativa (figura 28b). Estudios en trigo (Alexieva y

col., 2001) y guisante (Alexieva y col., 2001; Hassan y col., 2012), muestran el

incremento de la actividad de SOD en plantas expuestas a mayor radiación UV-

B, como ocurre en el mesocarpio del fruto, pero contrario a los resultados

obtenidos en el endocarpio. Otros estudios similares en árboles de álamo

realizados por Ren y col. (2007), coinciden con los resultados de Alexieva y col.

(2001), mostrando un ligero aumento de la actividad de la enzima en plantas

expuestas a una mayor radiación UV-B.

68

Figura 28. Actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en el

endocarpio (A) y mesocarpio (B) del tomate de árbol.

Letras minúsculas indican que el valor es significativamente diferente entre las dos

localidades en un mismo estado de madurez. Letras mayúsculas indican que el valor

es significativamente diferente entre los distintos estados de madurez para una misma

localidad con un p<0,05 Tukey=2,152 para (A) y p<0,05 Tukey=3,561 para (B).

b A

a A a A

a A

a AB

a B

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

a A a A

a A

a A a A a A

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Inmaduro Maduro Sobremaduro

UA

E /

mg

Pro

teín

a

Estado de Madurez

Pelileo

Chiquicha

A

B

69

En los frutos provenientes de Pelileo, la actividad de SOD en el endocarpio

permaneció prácticamente constante, se observó mayor actividad en los frutos

maduros, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre los

estados de madurez. En el endocarpio de los frutos de Chiquicha, la actividad

de la enzima fue disminuyendo a medida que la madurez de los frutos

aumentaba. Se encontró diferencia significativa entre los frutos inmaduros y los

sobremaduros, los cuales presentaron una disminución de 35% de la actividad

con respecto a los frutos inmaduros (figura 28b). En las dos localidades el

endocarpio de los frutos presentó un descenso en la actividad de SOD de los

frutos maduros a los sobremaduros, contrario a lo reportado por Abbasi, et. al.

(2010) en manzana y por Sis et. al. (2012) en durazno Iraní, donde la actividad

de la enzima sufre se incrementa constantemente incluso hasta 20 días

poscosecha.

En el mesocarpio de los frutos de la localidad de Chiquicha la actividad de SOD

permaneció constante a lo largo de la maduración. En el caso de Pelileo (2660

m.s.n.m.), la actividad de SOD fue similar en los frutos inmaduros y maduros y

luego disminuyó en los sobremaduros (figura 28b). No existieron diferencias

significativas entre los estados de madurez.

En las dos partes del fruto y en las dos localidades (excepto en el endocarpio

de los frutos de Pelileo) se pudo observar un descenso en la actividad de SOD

de los frutos inmaduros a los maduros, al igual que lo reportado por Mondal y

col. (2004) en dos tipos de tomate, pero contrario a lo reportado por Quian, et.

al. (2012) en pepinos chinos, donde la actividad de SOD aumentaba con la

maduración.

70

4.2 CUANTIFICACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN

HOJAS

Las medidas del porcentaje de H2O2 presentaron diferencia significativa entre

las localidades e indicaron una mayor concentración de éste compuesto en las

hojas de tomate de árbol de la localidad de Pelileo (2660 m.s.n.m.) en

comparación con las hojas de la localidad de Chiquicha (2440 m.s.n.m.) que

contenían 40% menos de este compuesto, según se observa en la tabla 8.

Tabla 8. Porcentaje de peróxido de hidrógeno (H2O2) en hojas de tomate de

árbol.

% H2O2 (p/p)

Localidad

Pelileo Chiquicha

1,6136 0,956

En los resultados se observó que la exposición a la radiación UV-B genera una

mayor producción de EROs en las plantas, entre ellas de H2O2. Varios autores

han reportado resultados similares, entre ellos Rybus-Zając y Kubiś (2010),

quienes comprobaron un aumento de la cantidad de peróxido de hidrógeno en

cotiledones de pepino al igual que Alexieva y col. (2001) quienes reportaron un

aumento de este compuesto reactivo en plantas de trigo y guisante, en ambos

estudios, tras ser expuesta la planta a radiación UV-B. Como se observa en los

estudios citados, las actividades de las enzimas antioxidantes aumentan por

acción de la radiación UV-B, lo cual podría ser una respuesta frente a la mayor

cantidad de EROs que se producen debido a este tipo de estrés, y como se

mencionó anteriormente, la radiación UV-B está directamente relacionada con

la altura convirtiéndose en un factor abiótico que genera una respuesta de

adaptación del tejido para el control del consumo/producción de EROs en la

célula.

71

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 CONCLUSIONES

Se encontró diferencia en la actividad de enzimas antioxidantes

relacionadas con el estrés oxidativo entre el mesocarpio y el

endocarpio del tomate de árbol, por lo que se cuantificó la

actividad de estas enzimas en forma separada. Esta diferencia se

podría deber a la distinta composición de sistemas antioxidantes

enzimáticos y no enzimáticos de cada una de las partes del fruto.

La enzima APX (ascorbato peroxidasa) se midió únicamente en el

endocarpio del fruto, ya que no se encontró actividad enzimática

en el mesocarpio, mientras que las enzimas POX, CAT y SOD se

cuantificaron tanto en el endocarpio como en el mesocarpio. Esta

diferencia probablemente se deba a que la APX es dependiente

de AsA (ácido ascórbico), y existe una menor concentración de

éste compuesto en el mesocarpio del fruto.

Se encontró diferencia significativa en la actividad de las enzimas

antioxidantes (POX, APX, CAT y SOD) entre las dos alturas de

cultivo (Pelileo 2660 m.s.n.m. y Chiquicha 2440 m.s.n.m.), en las

dos partes del fruto analizadas (endocarpio y mesocarpio) y en

sus distintos estados de madurez (inmaduros, maduros y

sobremaduros). Contrario a lo indicado por varios autores, la

localidad de Chiquicha, de inferior altura (2440 m.s.n.m.) y por

tanto expuesta a menor incidencia de radiación UV-B fue la que

presentó mayor actividad de POX, APX, CAT y SOD. Lo que

72

podría deberse, entre otros factores bióticos y abióticos, al tiempo

de producción del cultivo (6 veces superior al de Pelileo) y/ó a las

condiciones más idóneas del suelo.

Se encontró mayor concentración de peróxido de hidrógeno en las

hojas de tomate de árbol provenientes de la plantación de Pelileo

(2660 m.s.n.m.), lo que podría relacionarse con el incremento en

la radiación UV-B causado por una mayor altitud de cultivo que

genera estrés y promueve la creación de EROs en las hojas de la

planta.

73

5.2 RECOMENDACIONES

Si bien las medidas se realizaron de plantaciones de una misma

variedad de tomate de árbol en plantaciones ubicadas en dos

distintas altitudes, no se tomó en cuenta la edad de los cultivos.

Los cultivos de Pelileo llevaban seis veces menos tiempo

produciendo que los cultivos de Chiquicha. Este factor podría

haber influido en el resultado final, por lo que en próximos

estudios se debe tomar en cuenta.

Son escasos los estudios sobre la altitud como factor abiótico que

influye en el estrés oxidativo en plantas. Los estudios más

cercanos tienen que ver con la incidencia de la radiación UV-B

como factor influyente en el estrés y los análisis en su mayoría

son realizados en las hojas de las plantas. Para futuras

investigaciones se debería analizar cómo afecta la altitud o la

incidencia de radiación UV-B en las propiedades antioxidantes de

los frutos.

Para investigaciones posteriores se podría realizar una

comparación entre las características antioxidantes de varios

fenotipos de tomate de árbol cultivados en el Ecuador, con el fin

de conocer si se presentan las mismas diferencias en las

características antioxidantes entre el endocarpio y mesocarpio del

fruto como ocurrió en la variedad “Mora” utilizada en esta

investigación.

74

Con el fin de realizar una mejor comparación de resultados, se

debería evaluar la concentración del peróxido de hidrógeno en los

frutos con técnicas más precisas, de tal manera que se pueda

comparar este resultado con la actividad de las enzimas

antioxidantes y la cantidad de compuestos antioxidantes y poder

observar qué altitud de cultivo presenta el mayor desbalance

oxidativo.

75

BIBLIOGRAFÍA

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