Universidade de Lisboa · 2018. 10. 23. · FCUL – Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa FEUCP – Faculdade de Engenharia da Universidade Católica Portuguesa g –

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Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal

Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter

pylori

Andreia Durão Timóteo

Dissertação de Mestrado

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

2013

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal

Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter

pylori

Andreia Durão Timóteo

Dissertação de Mestrado

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

Orientador Interno: Professor Mário Santos

Orientadora Externa: Professora Filipa Vale

2013

Citações

“A ciência é a inteligência do mundo; a arte, o seu coração"

Máximo Gorky

"Toda a ciência começa como filosofia e termina em arte"

Will Durant

"O conhecimento torna a alma jovem e diminui a amargura da velhice. Colhe, pois, a

sabedoria"

Leonardo Da Vinci

Dedicatória

Gostaria de dedicar este trabalho à minha família e ao meu namorado, que sempre me

apoiaram e acompanharam ao longo destes 2 anos de mestrado. Sem a vossa ajuda e

apoio teria sido muito mais difícil esta fase da minha vida.

http://www.citador.pt/frases/citacoes/a/maximo-gorky

Agradecimentos

Para a elaboração deste estudo contei com a disponibilidade, apoio e

colaboração de várias pessoas e Instituições. Para elas vai o meu reconhecimento e

agradecimento.

Quero começar por agradecer à minha orientadora externa Professora Filipa

Vale pela sua constante disponibilidade, pela sua extrema simpatia, pelos seus sábios

conselhos e orientações técnicas e científicas durante a realização desta tese.

Ao Professor Mário Santos pela simpatia e disponibilidade para ajudar que

sempre me demonstrou.

À Professora Filomena Caeiro, coordenadora do 1º ano do Mestrado por toda a

ajuda e por me ter apresentado este tema de que tanto gosto.

Sem as estirpes de Helicobacter pylori não teria sido possível realizar este

estudo. Assim, quero agradecer à Doutora Mónica Oleastro por me ter recebido no

Laboratório Nacional das Infecções Gastrointestinais do Departamento de Doenças

Infecciosas do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e pelas estirpes que me

disponibilizou. A partir desta fabulosa colecção de estirpes portuguesas, foi possível

reunir estirpes isoladas de doentes com diferentes patologias. Agradeço igualmente a

todos os outros colaboradores desta unidade pela ajuda prestada. Aos Doutores

Francis Mégraud e Philippe Lehours da Université Bordeaux Segalen (França) pelo

envio de uma colecção de estirpes de origem e patologias diversas e pela ajuda

prestada. Quero agradecer ao Dr. Tsachi Tsadok Perets (Head of Gastroenterology

Laboratory of Rabin Medical Center – Beilinson Hospital of Israel) pelo envio de

estirpes de origem asiática.

Agradeço à Stabvida o financiamento da minha inscrição no European

Helicobacter Study Group: XXVth International Workshop on Helicobacter and Related

Bacteria In Chronic Digestive Inflammation and Gastric Cancer (Eslovénia). Neste

congresso a apresentação intitulada “Screening of. Prophage Sequences Among

Helicobacter pylori Isolates”, obteve o prémio de Melhor Apresentação Oral, para a

Professora Filipa Vale pela apresentação de parte dos resultados da minha tese.

Agradeço à Comissão Organizadora e à Comissão Científica do XIV Congresso

Técnico de Anatomia Patológica o prémio, que me atribuiu, de melhor Comunicação

Oral pelo trabalho intitulado “Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de

Fagos de Helicobacter pylori.

Agradeço à Fundação para a Ciência e Tecnologia o financiamento deste

projecto (PTDC/EBB-EBI/119860/2010).

Desta tese resultou a publicação do artigo “Comparison of induction of B45

Helicobacter pylori prophage by acid and UV radiation” em Agosto de 2013 no volume

19 (suplemento S4) da revista Microscopy and Microanalysis no qual parte dos

resultados da dissertação foram incluídos.

Ao meu namorado, Rui Lopes, por todo o apoio que me deu, pela revisão da

tese e, principalmente, pela ajuda que me deu nas tabelas em Microsoft Excel que

utilizei ao longo do estudo, e apoio em formatações variadas.

Aos meus pais e irmão por serem os melhores do mundo, por sempre me

apoiarem, por estarem sempre presentes e disponíveis.

Aos meus avós que estão sempre presentes quando necessito.

Aos meus amigos com quem não tenho estado ultimamente, mas que me

apoiam incondicionalmente.

A todos o meu muito obrigado.

Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013

Andreia Durão Timóteo i

Resumo

A bactéria Helicobacter pylori infecta o estômago de aproximadamente metade da

população humana estando associada ao desenvolvimento de patologias como gastrite,

úlcera péptica e adenocarcinoma gástrico. Como principal terapêutica são utilizados dois

antibióticos e um inibidor da bomba de protões. No entanto, a terapêutica com antibióticos é

ineficaz em aproximadamente 20 a 30% dos pacientes, devido principalmente à resistência

aos antibióticos, tornando necessário o desenvolvimento de novas terapêuticas. A

terapêutica fágica consiste na utilização de bacteriófagos ou proteínas fágicas líticas para

provocar a lise celular, sendo um processo alternativo a fim de evitar a resistência aos

antibióticos.

Para explorar a terapia fágica contra H. pylori é essencial a identificação e

caracterização dos (pro)fagos desta espécie. Assim, este estudo tem como objectivos a

pesquisa por PCR do gene da integrase de fagos de H. pylori de forma a compreender a

prevalência de profagos nesta espécie e determinar a distribuição geográfica e/ou a

patologia associada a estirpes integrase positivas. Em estirpes positivas para o gene que

codifica a integrase foram pesquisados outros genes profágicos, primase e regulador de

transcrição (região do fim do fago).

Em 866 estirpes isoladas de doentes com origem e patologias diversas foi feita a

amplificação por PCR e sequenciação do gene da integrase de fagos de H. pylori. Às

estirpes positivas para o gene da integrase foi feita, também amplificação por PCR e

sequenciação do gene da primase e região do fim do fago. Para as sequências de DNA de

cada gene analisado fez-se a análise filogenética.

A pesquisa por PCR do gene da integrase do fago, mostrou uma prevalência de

19,3%. A análise filogenética da integrase demonstrou haverem clusters de estirpes de

acordo com a região geográfica, não ocorrendo, a mesma situação em relação às

patologias. Os resultados reforçam a abundância de sequências de profagos em H. pylori.

Palavras-chave

Helicobacter pylori, bacteriófagos


Andreia Durão Timóteo ii

Abstract

Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes the human gastric mucosa. This

infection affects approximately half of the human population. H. pylori is associated with

several diseases, such as gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. The therapy against H.

pylori is based on the administration of two antibiotics and a proton pump inhibitor. However,

antibiotic therapy fails in about 20% to 30% of the patients, mainly due to antibiotic

resistance making urgent the development of new therapeutic approaches. Phage therapy

uses bacteriophages or lytic proteins encoded by phages to cause cell lysis and may

become a new therapeutic approach against H. pylori.

To explore phage therapy against H. pylori the identification and characterization of this

(pro)phages is crucial. This study aim is to investigate the presence of the integrase

prophage gene and its association with disease and geographic diversity. In positive strains

for the integrase gene, it is investigated the presence of other prophage genes, the primase

gene and end of the phage.

In 866 strains isolated from patients from several geographic origin and presenting

diverse diseases a PCR strategy recurring to degenerated primers to screen H. pylori

prophages was used. A phylogenetic analysis of each DNA sequences was done.

PCR results show a prevalence of 19,3% positive strains for the integrase gene. The

phylogenetic analysis revealed clusters according to geographic region, but not according to

pathology. The results reinforce that the presence of prophage sequences in H. pylori is high.

Keywords

Helicobacter pylori, bacteriophages


Andreia Durão Timóteo iii

Abreviaturas

CDS – Coding DNA sequence

DNA - Deoxyribonucleic Acid

FCUL – Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa

FEUCP – Faculdade de Engenharia da Universidade Católica Portuguesa

g – gramas

mA – Miliamperes

MALT – Tecido Linfóide Associado a Mucosa

MHA - Mueller-Hinton Agar

mM - Milimolar

PCR – Polymerase Chain Reaction

RPM – Rotações Por Minuto

TSB - Tryptic Soy Broth


Andreia Durão Timóteo iv

Índice geral

Resumo i

Abstract ii

Abreviaturas iii

Índice Geral iv

Índice de Figuras v

Índice de Tabelas vi

Índice de Anexos vii

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2

2.1 HELICOBACTER PYLORI 2

2.1.1 Descrição de Helicobacter pylori 2

2.1.2 História 2

2.1.3 Variabilidade Genética e Evolução 3

2.1.4 Doenças associadas a H. pylori 4

2.1.5 Tratamento 4

2.2 BACTERIÓFAGOS 5

2.2.1 Descrição Morfológica 5

2.2.2 História 5

2.2.3 Mecanismos de Replicação 7

2.2.4 Morfogénese dos Bacteriófagos 8

2.2.5 Utilização de Bacteriófagos vs Utilização de Antibióticos 8

2.2.6 (Pro)fagos de Helicobacter pylori 9

3 MATERIAIS E MÉTODOS 10

3.1 ESTIRPES DE HELICOBACTER PYLORI 10

3.1.1 Extracção de DNA genómico 10

3.1.2 Pesquisa por PCR do Gene da Integrase de Fagos de H. pylori 11

3.1.2.1 Reacção de PCR 11

3.1.2.2 Electroforese em gel de agarose a 2% 13

3.1.3 Purificação e quantificação da reacção de PCR para sequenciação 13

3.1.4 Pesquisa por PCR do Gene da Primase e Fim do Fago de Fagos de H.

pylori 14

3.1.4.1 Reacção de PCR 15

3.1.5 Análise Filogenética das Sequências de H. pylori 15

3.1.6 Análise Estatistica das Sequências de H. pylori 15


Andreia Durão Timóteo v

4 RESULTADOS 16

4.1 PREVALÊNCIA DE PROFAGOS EM HELICOBACTER PYLORI 16

4.1.1 Integrase 16

4.1.2 Primase 17

4.1.3 Fim do fago 18

4.2 ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DE H. PYLORI 19

4.2.1 Teste do Qui-quadrado e teste de Fisher 19

4.2.1.1 Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da

integrase 19

4.2.1.2 Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da

primase 20

4.2.1.3 Associação estatística entre a patologia e a presença do fim do

fago 20

4.2.1.4 Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do

gene da integrase 21


gene da primase 21


fim do fago 21

4.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA DE PROFAGOS EM HELICOBACTER PYLORI 22

4.3.1 Análise Filogenética do Gene da Integrase 22

4.3.2 Análise Filogenética do Gene da Primase 23

4.3.3 Análise Filogenética do Gene da Região do Fim do fago 25

5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 26

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 29


Andreia Durão Timóteo vi

Índice de Figuras

Fig.1 Ciclo Lítico e Lisogénico de Bacteriófagos. 7

Fig. 2 Organização genómica dos fagos de H. pylori. 9

Fig. 3 Alinhamento de genomas profágicos. # Gene da Integrase, Gene Primase

e ¥ Fim do Fago (adaptado de Lehours 2011). 11

Fig. 4 A) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3:

estirpe B35, 4: estirpe negativa para o gene da integrase, 5: estirpe negativa

para o gene da integrase, 6: estirpe B44, 7: Controlo negativo (sem DNA).

Estirpes 3 e 6 positivas para o gene da integrase. B) 1: Marcador 100 bp DNA

ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe negativa para o

gene da primase, 4: estirpe B101, positiva para o gene da primase e 5:

controlo negativo (sem DNA). C) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2:

controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe negativa para a região do fim do

fago, 4: estirpe C166, positiva para a região do fim do fago e 5: controlo

negativo (sem DNA). 14

Fig. 5 Árvore filogenética do gene da integrase (1000 réplicas) neighbor-joing

method, kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com

diferentes patologias: C - Adenocarcinoma, G - Gastrite, M - Linfoma MALT

e U - Úlcera Péptica. 23

Fig. 6 Árvore filogenética do gene da primase (1000 réplicas), neighbor-joing

method, kimura two-parameter model. Estirpes isoladas de pacientes com

diferentes patologias: C – Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT

e U- Úlcera Péptica. 24

Fig.7 Árvore filogenética da região do Fim do Fago (1000 réplicas), neighbor-joing

method, kimura two-parameter model. Estirpes isoladas de pacientes com

diferentes patologias: C – Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT

e U- Úlcera Péptica. 25


Andreia Durão Timóteo vii

Índice de Tabelas

Tabela 1 Sequências dos primers degenerados integrase, primase e fim do fago

utilizados no estudo. 12

Tabela 2 Contagem de estirpes positivas para o gene da integrase de acordo com a

patologia. 16


localização geográfica. 17

Tabela 4 Contagem de estirpes positivas para o gene da primase de acordo com a

patologia. 17



Tabela 6 Contagem de estirpes positivas para o gene do fim do fago de acordo com a

patologia. 18




Andreia Durão Timóteo viii

Índice de Anexos

Tabela 1 Contagens totais das estirpes estudadas de Helicobacter pylori. 33

Tabela 2 Contagem estatística entre patologia/origem e positividade para os genes

fágicos. 34


Andreia Durão Timóteo 1

1- Introdução

A bactéria Helicobacter pylori infecta o estômago de aproximadamente metade da

população humana e está associada ao desenvolvimento de gastrite, úlcera péptica,

adenocarcinoma gástrico e linfoma MALT (Tecido Linfóide Associado a Mucosa)

gástricos30. Como principal terapêutica são utilizados dois antibióticos e uma bomba

inibidora de protões39. No entanto, a terapêutica com antibióticos é ineficaz em

aproximadamente 20 a 30% dos pacientes, devido principalmente à resistência aos

antibióticos, o que preocupa a comunidade médica e torna necessário o desenvolvimento

de novos agentes terapêuticos41, 52.

A terapêutica fágica consiste na utilização de bacteriófagos ou proteínas fágicas

líticas (lisinas) para provocar a lise celular, sendo um processo alternativo a fim de evitar a

resistência aos antibióticos8. Os bacteriófagos de H. pylori têm sido descritos de forma

muito breve na literatura24, 44. Profagos remanescentes foram descritos na estirpe francesa

B38 isolada de um paciente com linfoma MALT49, na estirpe japonesa F16 proveniente de

paciente que apresentava gastrite28, nas estirpes Gambia 94/24 (Número de acesso

CP002332), H. pylori Shi112 (Número de acesso CP003474.1) e da estirpe proveniente da

Malásia UM037 (Número de acesso NC_021217.1).

Na estirpe B45 de H. pylori foi encontrado um profago completo34, bem como na

estirpe 1961P37, Cuz20 (Número de acesso CP002076) e Índia 7 (Número de acesso

CP002331). Foram também identificados genomas dos fagos KHP30 e KHP4051. A

utilização de indutores de fagos52 demonstrou que o profago B45 ainda pode ser induzido.

Neste sentido os objectivos desta dissertação são continuar o screening por PCR do

gene da integrase (utilizando isolados obtidos a partir de doentes com patologias diferentes

e de origens geográficas distintas), de forma a compreender a prevalência de profagos em

H. pylori e determinar a distribuição geográfica e/ou a patologia associada a estirpes

integrase positivas. Fazer, também, o screening por PCR de outros genes fágicos, primase

e fim do fago.



2- Revisão de Literatura

2.1 - Helicobacter pylori

2.1.1 - Descrição de Helicobacter pylori

H. pylori é uma bactéria Gram-negativa de formato espiralado com 2 a 4 µm de

comprimento e 0,5 a 1 µ de largura. É uma bactéria que apresenta mobilidade por flagelos

(2 a 6) unipolares com 3µm de comprimento. Os flagelos são responsáveis pela morfologia

curvilínea da bactéria e pelo movimento polar, características que auxiliam a sua penetração

na camada de mucinas. Os mutantes de H. pylori sem flagelos não conseguem colonizar a

mucosa gástrica17. Em condições adversas apresenta forma cocóide, o formato cocóide

refere-se a bactéria morta ou forma metabolicamente activa da bactéria mas que não é

possível de cultivar in vitro, dependendo dos autores16.

Esta é uma bactéria pertencente à ordem Campylobacterales, família

Helicobacteraceae e género Helicobacter. Possui um crescimento óptimo com 2 a 5% de O2

e 5 a 10% CO2 em ambiente húmido. O crescimento óptimo ocorre a 37ºC. Apesar de poder

estar exposta brevemente a pH ácidos o seu pH óptimo é pH neutro32.

H. pylori tem como reservatório estômago humano mas também já foi isolado do

estômago de primatas, no entanto, outras espécies de Helicobacter já foram isoladas a partir

de outros animais32.

As vias de transmissão ainda não são totalmente conhecidas, sendo proposto

transmissão oral-oral, gastro-oral e fecal oral2, 32. A transmissão pode ser vertical, sendo

transmitida dos progenitores para os filhos ou através do contacto próximo entre pessoas,

ou horizontal pela ingestão de água ou comida contaminada, bem como através do contacto

com outras pessoas. A transmissão vertical é predominante em áreas mais urbanas como

acontece nos países desenvolvidos e a transmissão horizontal está associada a zonas mais

rurais como nos países em desenvolvimento53.

2.1.2 - História

Durante vários anos o estômago foi considerado um ambiente demasiado agressivo

para ser colonizado por bactérias apesar já terem sido encontrados organismos espiralados



neste ambiente nos finais do século XIX. Entre 1979 e 1984 Robin Warren e Barry Marshall

conseguiram cultivar H. pylori e posteriormente demonstrar pela coloração de Gram que

esta era uma bactéria Gram-negativa. A primeira descrição de H. pylori em associação a

gastrite e úlcera péptica foi feita em 1983 por Warren e Marshall58. Foi uma associação

polémica pois o estômago era considerado ambiente estéril, mas em 2005 ganharam o

Prémio Nobel da Fisiologia ou Medicina pela sua descoberta53.

A International Agency for Research on Cancer (organismo da Organização Mundial

de Saúde) classifica H. pylori como carcinogénio do grupo I desde 199460.

2.1.3 - Variabilidade Genética e Evolução

No final dos anos 90 foi sequenciada a primeira estirpe de H. pylori com recurso ao

método de sequenciação aleatória do genoma, a partir de um paciente com gastrite50.

H. pylori apresenta uma grande variabilidade genética, que tem sido atribuída a uma

taxa de mutação elevada no seu genoma, à deficiente reparação do DNA, à existência de

recombinação frequente e à existência de plasmídeos4. Nas estirpes sequenciadas a

maioria dos genes são comuns entre si, sendo assim a variabilidade genética pode ser

aparente e como resultado de rearranjos no genoma14. Esta variabilidade é, frequentemente,

devida a mudanças na terceira base dos codões, inversões e translocações modificando o

DNA mas sem alterar as proteínas codificadas. Apenas 7% das proteínas eram especificas

de cada estirpe aquando da comparação entre duas estirpes com DNA já sequenciado1.

Devido a inserções, delecções, alterações na estrutura geral do genoma a

variabilidade genética é bastante elevada, o que levou à teoria de que a população de H.

pylori representaria uma “quasi-espécie”11, com população panmítica e recombinação livre 18,

43, 46. Tendo em conta a definição de população panmítica, esta bactéria não parece

pertencer verdadeiramente a este tipo de população, uma vez que existem linhagens clonais

diferentes de H. pylori29.

A distribuição geográfica da bactéria sugere que ocorreu evolução conjunta com o

Homem. Durante milhares de anos as comunidades viviam isoladas havendo possibilidade

de ocorrerem diminutas trocas genéticas. A espécie humana apresenta segregação genética

que difere nas diferentes regiões do globo. Durante a evolução do Homem é possível que

tenha ocorrido co-segregação dos genes de H. pylori12. Isolados de diferentes localizações

geográficas apresentam variabilidade genética que tiveram por base as migrações

humanas7, 12. Como exemplo, no Peru as estirpes de H. pylori possuem grande homologia



com estirpes asiáticas, levando à associação de que a bactéria colonizou o hospedeiro

antes dos asiáticos terem chegado à América há cerca de 20 000 anos. As estirpes do Peru

apresentam a região Cag-PAI que, no entanto, é homologa da europeia, levando à

suposição de que esta ilha de patogenicidade apenas foi adquirida após a colonização

europeia da América, por volta do Século XVI13.

Os genes que aparecem na actualidade nas populações são derivados de

populações ancestrais. Uma vez que existe sobreposição de populações humanas com

genes distintos e de populações de H. pylori é proposta a hipótese de que a bactéria tem

como reservatório o estômago humano desde há pelo menos 100 000 anos, ou seja antes

das primeiras migrações humanas12.

As grandes populações modernas de H. pylori são hpAfrica1 e hpAfrica2 (África do

Sul), hpAsia Oriental, hpEuropa, hpAsia2 (Índia, Tailândia, Bangladesh e Filipinas) e

hpNEAfrica (Etiópia, Nigéria, Somália e Sudão) estabelecendo a saída de H. pylori de África

à 58 000 anos coincidindo com a migração humana19, 35. O afastamento migratório da África

Oriental (berço da Humanidade) leva a que seja observada diminuição da diversidade

genética, aumentando, no entanto a distância genética das estirpes35.

2.1.4 – Doenças associadas a H. pylori

Apesar da infecção por H. pylori na maioria dos indivíduos (aproximadamente 70%)

permanecer assintomática, 10 a 20% poderão vir a desenvolver úlcera péptica e 1 a 2%

cancro gástrico ao longo da vida32. Desde o aparecimento desta associação variados

aspectos da imunopatogénese têm sido estudados, as estirpes sequenciadas apresentam

ilhas de patogenicidade Cag-PAI e citotoxina A, consideradas factores de virulência e

patogenicidade associadas ao desenvolvimento de cancro gástrico42.

2.1.5 - Tratamento

A terapêutica utilizada, actualmente, é composta por dois antibióticos

(frequentemente amoxicilina e claritromicina) e um inibidor da bomba de protões, tendo o

tratamento uma duração de 7 dias32. No entanto, devido principalmente à existência de

bactérias multiresistentes a antibióticos, a terapêutica com antibióticos é ineficaz em

aproximadamente 20 a 30% dos pacientes41, 53. No sentido de fazer face a esta problemática

têm sido desenvolvidos esforços para encontrar terapias alternativas em caso de falha na



abordagem com antibióticos. Uma das alternativas consiste na utilização de bacteriófagos,

que são vírus que infectam e se multiplicam em bactérias, levando à lise bacteriana, e

consequentemente, a eliminação da doença infecciosa por ela causada. Esta terapêutica foi

amplamente utilizada na década de 30 por d’ Hérelle, sendo posteriormente utilizada e

desenvolvida em países do Leste Europeu e Ex-União Soviética até ao aparecimento dos

antibióticos25. Os quais retiraram a atenção dos investigadores para os bacteriófagos

estando a sua investigação “adormecida”, voltando à ribalta devido ao aumento crescente

da resistência de bactérias aos antibióticos8, 20. Actualmente já existem referências à

utilização com sucesso de bacteriófagos em determinadas bactérias5, 10, 15, 26, 36, 45, 55, 57, 59

sendo que para a Helicobacter pylori ainda não existem investigações suficientes pois não

existe uma colecção de bacteriófagos disponível.

2.2 – Bacteriófagos

2.2.1 - Descrição morfológica

Os bacteriófagos são vírus cujo hospedeiro são bactérias, tendo sido considerados

parasitas intracelulares obrigatórios, uma vez que, necessitam de uma célula hospedeira

para a formação de novos bacteriófagos. Estão descritas 14 famílias de vírus que afectam

procariotas9.

A maioria dos fagos apresentam cadeia dupla de DNA, mas podem apresentar

cadeia simples e, também simples ou dupla cadeia de RNA. Cerca de 96% dos viriões

possuem cauda com estruturas de fixação e cabeça9.

Os bacteriófagos que infectam Helicobacter pylori pertecem à ordem Caudovirales. O

seu DNA é de cadeia dupla. Pertencem à família Siphoviridae, quando apresentam cauda

longa e não contráctil34 ou à família Podoviridae, se a cauda for curta e, também, não

contráctil37. Possui cabeça icosaedrica de aproximadamente 62,5 nm (≈7,3 nm) de diâmetro

e uma cauda de cerca de 92,4 nm (± 2, 97) ou 23 (± 1) de comprimento, respectivamente

cauda longa e curta.

2.2.2 - História

A primeira descrição conhecida de bacteriófagos (= fagos) foi feita por Félix d’Herelle

e Frederick Twort, de forma independente, na década de 20 do século XX. Foram descritos



como vírus que infectam bactérias sendo causadores da lise bacteriana. Para d’Herelle

existia apenas um bacteriófago com várias espécies, Bacteriophagum intestinale9, 21.

A primeira descrição da utilização de fagos como terapêutica remonta a 1919 em

França8. Hérelle administrou preparações contendo fagos a pacientes com disenteria. O seu

laboratório produziu os primeiros cocktails fágicos comerciais. Sendo estes comercializados

em França até cerca de 197833.

Inicialmente os fagos eram utilizados para tipagem de estirpes bacterianas com

interesse médico. Na década de 40 Max Delbrück e Salvador Luria utilizavam os

bacteriófagos como elementos fundamentais de análise quantitativa em virologia. Nos anos

40 e 50 foram construídos os primeiros mapas genéticos. Os investigadores Hershey e

Chase descobriram que apenas o DNA viral era injectado em células bacterianas

permissivas à infecção21.

O estudo foi sendo abandonado com a introdução de antibióticos nos tratamentos

médicos, apesar de continuarem a ser estudados fagos em zonas com menor acesso a

antibióticos, como a União Soviética8.

Em 1962 Lwoff, Horne e Tournier propuseram que os vírus deveriam ser

classificados segundo o tipo de ácido nucleico, forma da cápside, presença ou ausência de

envelope e o número de capsomeros que possuíam. O comité de classificação de vírus foi

fundado em 1966 e classificou os vírus com base nas propriedades do virião e do seu ácido

nucleico9.

Em 1987 e 1989, respectivamente, descreveram pela primeira vez partículas

semelhantes a bacteriófagos em biópsias23, 40. Seguiu-se a observação de bacteriófagos de

H. pylori por isolamento do seu ácido nucleico24, 44 em 1990 e 1993. Apenas em 2007 surgiu

nova referência a estruturas semelhantes a fagos, após indução com mitomicina C3. A

presença de partículas semelhantes a vírus foi detectada por microscopia electrónica em

200852.

Em 2011 investigadores isolaram fagos selvagens líticos de H. pylori e testaram

contra H. pylori utilizando duas estratégias. Foi feita a adição do fago sozinho ou do fago

com uma estirpe de H. pylori previamente exposto a um suco gástrico artificial com o

objectivo de testar a sobrevivência do fago em suco gástrico. Verificou-se que era mais

eficiente a administração do fago com H. pylori, pois só assim se continua a observar a

formação de placas fágicas56.



2.2.3 - Mecanismos de Replicação

A infecção por fagos inicia-se com a adsorção a receptores da superfície bacteriana.

Os fagos tendem a ligar-se a estirpes específicas injectando os seus ácidos nucleicos no

citoplasma do hospedeiro. Após este ponto pode seguir duas vias, o ciclo lítico ou o ciclo

lisogénico [Figura 1]. No ciclo lítico ocorre a replicação e produção de proteínas virais.

O DNA viral juntamente com as proteínas virais formam novos bacteriófagos

provocando a lise da célula hospedeira e libertando os recém formados bacterófagos. No

ciclo lisogénico os ácidos nucleicos são integrados no genoma utilizando a enzima integrase

e replicam utilizando a divisão natural da célula bacteriana infectada. Quando expostos a

condições adversas (exemplo: radiação ultravioleta e mitomicina C) podem ser induzidos a

entrar no ciclo lítico38. Após a integração do genoma fágico no genoma da bactéria, o fago

passa a ser designado profago e a bactéria de bactéria lisogénica.

Quando os vírus apresentam estes dois ciclos replicativos são designados fagos

temperados, no entanto se apenas conduzirem à lise bacteriana designam-se fagos líticos21.

Fig.1 Ciclo Lítico e Lisogénico de Bacteriófagos38.



2.2.4 – Morfogénese dos Bacteriófagos

A multiplicação dos fagos é concluída com a lise da bactéria infectada e consequente

libertação, para o exterior, de novos fagos. Habitualmente esta multiplicação é mediada por

duas proteínas codificadas pelo genoma fágico, a lisina e a holina. A lisina é uma proteína

citoplasmática que está envolvida na degradação da parede celular bacteriana. Para que

ocorra saída da lisina citoplasmática para o exterior é necessário a formação de poros de

membrana na célula infectada. A formação destes poros membranares é mediada pela

holina, que é uma proteína hidrofóbica. A associação destas duas proteínas resulta no

aumento da fragilidade da parede celular da bactéria infectada tornando-se incapaz de

suster a pressão osmótica interna levando à sua lise, libertação de fagos para o exterior e

posterior infecção de novas células bacterianas21.

2.2.5 - Utilização de bacteriófagos vs Utilização de antibióticos

Quando a aplicação de vírus (bacteriófagos) específicos para determinada bactéria é

aplicada com o objectivo de reduzir ou eliminar o microorganismo designa-se por terapia

fágica33.

Os bacteriófagos são específicos para determinada bactéria diminuindo alterações

na flora natural do corpo humano, causada pela administração de antibióticos. Os fagos são

naturalmente estimuladores do sistema imunitário e conseguem atravessar barreiras

fisiológicas como a membrana hematoencefálica8. Têm a capacidade de desaparecer total

ou quase totalmente quando o agente patogénico já não está presente e vão aumentando o

seu número no decorrer do tratamento6, 33.

O grau de toxicidade é muito mais baixo em comparação com a toxicidade existente

nos antibióticos. Quando uma bactéria é infectada com um profago não consegue readquirir

a sua viabilidade, no caso da utilização de antibióticos a bactéria pode sobreviver ao

contacto e evoluir obtendo resistência6. No entanto, pode haver resistência de bactérias a

fagos (por exemplo alteração de receptores de ligação devido a uma delecção) o

bacteriófago deixa de conseguir detectar a bactéria como seu hospedeiro mas como os

fagos também evoluem, podem conseguir adaptar-se e superar a alteração; os antibióticos

possuem uma estrutura estática e imutável naturalmente não se podendo adaptar a

alterações na bactéria.



2.2.6 – (Pro)fagos de Helicobacter pylori

O número de (pro)fagos em H. pylori é pequeno, no entanto, tem vindo a crescer

com o avançar das investigações.

Lehours em 2011 descreveu profago completo da família Siphoviridae na estirpe

francesa B45, retirada de um paciente com linfoma MALT, após um estudo de indução34 e

Lou descreveu o profago completo da família Podoviridae na estirpe 1961P de Taiwan, que ,

também poderia apresentar um ciclo lítico37 [Figura 2]. São profagos completos pois apesar

de estarem integrados no genoma da bactéria os autores demonstraram que poderia haver

a produção de um fago lítico. Por analogia, também a estirpe Cuz20 proveniente do Perú

(Número de acesso CP002076), a estirpe índia 7 proveniente da Índia (Número de acesso

CP002331) foram identificados como profagos completos. Foram também identificados

genomas profágicos nas estirpes KHP30 e KHP4051.

Profagos remanescentes foram descritos na estirpe francesa B38 isolada de um

paciente com linfoma MALT49, na estirpe japonesa F16 proveniente de paciente que

apresentava gastrite28, nas estirpes Gambia 94/24 (Número de acesso CP002332), H. pylori

Shi112 (Número de acesso CP003474.1) e da estirpe proveniente da Malásia UM037

(Número de acesso NC_021217.1), estes profagos são incompletos pois não apresentam a

sequência completa logo não serão capazes de entrar no ciclo lítico.

Fig. 2 Organização genómica dos fagos de H. pylori37.



3 - Materiais e métodos

3.1 - Estirpes de Helicobacter pylori

Foram utilizadas 866 estirpes de H. pylori para pesquisa do gene da integrase de

fagos de H. pylori. As estirpes pertencem às colecções do Laboratório Nacional das

Infecções Gastrointestinais do Departamento de Doenças Infecciosas do Instituto Nacional

de Saúde Dr. Ricardo Jorge, da Université Bordeaux Segalen (França) e do Rabin Medical

Center do Beilinson Hospital (Israel).

A cultura inicial de H. pylori foi efectuada descongelando as estirpes que estavam

armazenadas a -80ºC em glicerol e TSB (Tryptic Soy Broth) a 20%. Foram utilizados meios

selectivos e não selectivo MHA (Mueller-Hinton Agar) com 5% de sangue (Biogerm,

Portugal) e incubadas em condições de microaerofilia 24h ou 48h dependendo do

crescimento bacteriano observado. A biomassa obtida foi suspensa em água destilada e

armazenada a -20ºC.

Na pesquisa por PCR do gene da integrase de fagos de H. pylori das 866 estirpes

isoladas de doentes de origem geográfica diferente, 686 eram de origem europeia, 60 de

origem africana, 119 de origem asiática e 1 de origem americana. Em relação à patologia

associada 218 provieram de doentes com úlcera péptica, 415 com gastrite, 76 com

adenocarcinoma gástrico, 63 linfoma MALT e em 94 não foi possível aceder à informação de

qual a patologia associada.

3.1.1 - Extracção de DNA genómico

Para a extracção de DNA genómico de H. pylori foi utilizado o mini kit QIAmp DNA

modificado (Qiagen). Após centrifugar a suspenção a 13 000 rpm durante 3 minutos foi

descartado o sobrenadante. Foi ressuspendido o pellet no vórtex. Seguindo-se, depois, com

o protocolo do kit, a recolha de DNA foi feita adicionando água destilada ultra pura aquecida

a 70ºC à coluna, deixando incubar 5 minutos à temperatura ambiente e centrifugando a

8000 rpm durante 1 minuto. Repetiu-se o passo anterior mas centrifugando durante 2

minutos, seguindo de uma nova centrifugação a 12000 rpm durante 1 minuto.

Foi feita uma diluição padrão de 1:10 do DNA obtido e armazenado a -20ºC.



3.1.2 - Pesquisa por PCR do Gene da Integrase de Fagos de H. pylori

3.1.2.1 - Reacção de PCR

Os primers utilizados para a Integrase, primase e para a região do fim do fago foram

desenhados com base no alinhamento dos genomas de uma estirpe de Helicobacter

acinonychis, de H. pylori B45 e H. pylori B38. [Figura 3] Os genes pesquisados por PCR

foram os # para o gene da Integrase, para o gene Primase e ¥ para a região do Fim do

Fago. Na reacção de PCR foram utilizadas primers degenerados (Invitrogene) descritos na

[Tabela 1].

Fig. 3 Alinhamento de genomas profágicos. # Gene da Integrase, Gene Primase e ¥ Fim

do Fago (adaptado de Lehours 2011).

Na reacção de PCR para a pesquisa do gene da integrase foi utilizado tampão 5X

(Promega), dNTPs a 10μM (New England BioLabs), cloreto de magnésio a 1,5 mM

(Promega), primers a 3,2 μM (Invitrogene), Taq polimerase a 5U/μl (Promega), 1 μL de DNA

de H. pylori e a mesma mix mas sem adição de DNA como controlo negativo.



Tabela 1 Sequências dos primers degenerados integrase, primase e fim do fago utilizados

no estudo.

Primers Sequência

Fragmento

(pb)

Integrase

(529 pb)34

Forward AAG-YTT-TTT-AGM-GTT-TTG-YG

529

Reverse CGC-CCT-GGC-TTA-GCA-TC

Primase

(327 pb)

Forward GCG-ATT-ACC-AAA-AAG-CCA-AC

327

Reverse WGG-SGW-YAA-AYA-ACG-CCT-TG

Fim do Fago

(487 pb)

Forward AAA-CGC-TRG-GCA-TGA-GCA-TC

487

Reverse TCT-TTG-CCA-AAC-AAG-CTM-AC

A desnaturação aconteceu durante 4 min a 94ºC, cada reacção foi amplificada em 35

ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos de hibridização a 58ºC e 60 segundos a 72ºC. A

extensão continuou por 7 minutos, também, a 72ºC.

Após a reacção de PCR e para permitir a visualização dos resultados foi feita

electroforese em gel de agarose (Sigma Life Science) a 2%. Usando como controlo positivo

a estirpe B45, que é positiva para a integrasse, primase e fim do fago, e como controlo

negativo a mix de PCR mas sem a adição de DNA.



3.1.2.2 Electroforese em gel de agarose a 2%

Para a electroforese em gel de agarose a 2% (Sigma Life Science) com tampão TBE

1x (Applichem) procedeu-se ao aquecimento da solução no microondas a 850W durante 1

minuto e 30 segundos. Após o gel solidificar foi feita a electroforese (Electrophoresis Power

Supply – EPS 601, GE Healthcare) durante 40 minutos, a 140 volts, 85 mA e 10 watts.

Os poços foram preenchidos colocando no primeiro poço o marcador 1kb DNA

ladder NEB ou 100 bp DNA ladder NEB (New England BioLabs), o controlo positivo seguido

das amostra e por fim o controlo negativo. A todas as soluções foi misturado Green GoTaq

Flexi Buffer (Promega) como tampão de amostra.

Após a electroforese, o gel foi colocado em banho com agitação com uma solução de

10 l de Gel Red (Biotium) e tampão TBE 1x (Applichem), seguido de banho com agitação

em água destilada, ambos com a duração de 10 minutos. Foi tirada uma fotografia utilizando

lâmpada de luz ultravioleta (Gel Logic 100 Imaging System, Kodak) [Figura 4].

Quando para a mesma estirpe resultava uma fotografia que apresentava várias

bandas, foi excisada a banda com a dimensão aproximada às que pesquisamos. Era

pesado o eppendorf e registado o seu peso. Com a lâmpada de luz ultravioleta ligada e um

bisturi estéril a banda com a dimensão aproximada foi excisada e colocada no eppendorf.

Foi pesado o eppendorf com a banda no seu interior. Foi feita a diferença entre os 2 pesos e

usado esse valor para a medida de volume para a purificação do DNA.

3.1.3 – Purificação e quantificação da reacção de PCR para sequenciação

As estirpes positivas para o gene da integrase foram purificadas e sequenciadas

(Stabvida, Portugal) em ambas as cadeias [Figura 4]. Para a purificação do produto de PCR

foi utilizada a resina (Spharyl S400 High Resolution, GE Healthcare), a preparação da resina

iniciou-se com a sua homogeneização, retirada de 20 mL para um tubo Falcon e adição de

água destilada ultra pura. Precedeu-se à sua centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos.

Foi decantado o sobrenadante e adicionado igual volume de água destilada. Repetindo as

lavagens 6 vezes.



Fig. 4 A) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe B35,

4: estirpe negativa para o gene da integrase, 5: estirpe negativa para o gene da integrase, 6:

estirpe B44, 7: Controlo negativo (sem DNA). Estirpes 3 e 6 positivas para o gene da

integrase. B) 1: Marcador 100 bp DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3:

estirpe negativa para o gene da primase, 4: estirpe B101, positiva para o gene da primase e

5: controlo negativo (sem DNA). C) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo

estirpe B45, 3: estirpe negativa para a região do fim do fago, 4: estirpe C166, positiva para a

região do fim do fago e 5: controlo negativo (sem DNA).

A purificação da amostra foi efectuada homogeneizando a resina e adicionando à

coluna (IllustraTM MicrospinTM columns, GE Healthcare) vazia, fez-se uma centrifugação de

3000 rpm durante 3 minutos. Todo o volume da reacção de PCR foi colocado na coluna.

Centrifugou-se a coluna durante 2 minutos a 3000 rpm.

Após a purificação procedeu-se ao controlo positivo da purificação fazendo uma

electroforese para confirmar a presença de DNA e enviar para sequenciação (Stabvida,

Portugal).

Foi feita a quantificação da concentração do DNA com o Qubit dsDNA HS Assay Kit

(Invitrogene).

Os resultados obtidos na sequenciação foram utilizados para análise filogenética de

das sequências de integrase obtidas.

3.1.4 Pesquisa por PCR do Gene da Primase e Fim do Fago de Fagos de H.

pylori

Todas as estirpes com a sequência de integrase positiva foram, também, testadas

quanto à presença de outros genes fágicos, primase e fim do fago.



3.1.4.1 - Reacção de PCR

Na reacção de PCR para a pesquisa do gene da primase e da região do fim do fago

foi utilizado tampão 5X (Promega), dNTPs a 10 μM (New England BioLabs), cloreto de

magnésio a 1 mM (Promega), primers a 3,2 μM (Invitrogene), Taq polimerase a 5 U/μl

(Promega) e 1 μL de DNA de H. pylori.

A desnaturação aconteceu durante 4 min a 94ºC, cada reacção foi amplificada em 35

ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos de hibridização a 63ºC e 60 segundos a 72ºC. A

extensão continuou por 7 minutos, também, a 72ºC.

Após a reacção de PCR e para permitir a visualização dos resultados foi feita

electroforese em gel de agarose (Sigma Life Science) a 2%. Usando como controlo positivo

a estirpe B45, que é positiva para a integrasse, primase e fim do fago, e como controlo

negativo a mix de PCR mas sem a adição de DNA. A fase seguinte foi fazer a purificação

dos produtos de PCR que eram positivos para os genes pesquisados, fazer a sua

quantificação, sequenciação e análise filogenética como descritos nos pontos 2.1.2.2 e

2.1.3.

3.1.5 Análise Filogenética das Sequências de H. pylori

Análise filogenética das sequências de integrase foi obtida utilizando o MEGA 5.05

software48, neighbor-joining method, on the basis of distances estimated using the Kimura

two-parameter model31.

3.1.6 Análise Estatística das Sequências de H. pylori

A análise estatística das estirpes estudadas foi feita utilizando o teste do Qui-

quadrado (disponível online em VassarStats: Website for Statistical Computation,

http://www.vassarstats.net/newcs.html) e o teste de Fisher (disponível online em Quantitative

Skills Consultancy for Research and Statistic,wednklewfnflkjrf jd v md fvj kd vjdjd f dj df

http://www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/fiveby2.htm) este último quando os valores

esperados eram menores que 5.



4 – Resultados

4.1 - Prevalência de Profagos em Helicobacter pylori

A pesquisa por PCR do gene da integrase do fago, mostrou uma prevalência de

19,3%. Nos resultados globais da amplificação por PCR, das 866 estirpes analisadas, 3,5%

foram positivas para a presença do gene da integrase e da primase, 2,9% foram positivas

para presença do gene da integrase e do fim do fago. Apenas 0,8% das estirpes foram,

simultaneamente, positivas para a presença dos 3 genes estudados, integrase, primase e

fim do fago

4.1.1 Integrase

Genes fágicos, em particular o gene da integrase, estão presentes em ≈ 20%

isolados clínicos de H. pylori34. Com o objectivo de estudar a prevalência de profagos em

genomas de H. pylori foram testadas 866 estirpes com diferentes origens geográficas e

patologias associadas diversas, utilizando primers degenerados. Verificou-se que 19,3%

(167/866) dos isolados eram positivos para o gene da integrase, uma percentagem

ligeiramente abaixo do anterior estudo que se situava nos 21,4% (73/341)34.

A presença do gene da integrase em diferentes patologias apresentou valores

semelhantes [Tabela 2], na ordem dos 20%, sendo que as úlceras pépticas apresentaram

uma percentagem ligeiramente maior (26,6%) e os linfomas MALT uma percentage menor

(15,9%).

A prevalência do gene da integrase em estirpes com origem geográfica diversa

também se manteve semelhante na ordem dos 20%, sendo que a proveniência de África

apresentou uma percentagem ligeiramente mais elevada (25%). [Tabela 3]




patologia.

Integrase Positiva

Patologia Estirpes de H. pylori

positivas

% Positivas

Úlcera Péptica 58 26,6% (58/218)

Gastrite

74 17,8% (74/415)

Adenocarcinoma

15 19,7% (15/76)

Linfoma MALT

10 15,9% (10/63)

Sem dados

10 10,6% (10/63)


localização geográfica.

Integrase Positiva

Origem Estirpes de H. pylori

positivas

% Positivas

Europa 131 19,1% (131/686)

África 15 25,0% (15/60)

Ásia 21 17,6% (21/119)

América 0 0,0% (0/1)

4.1.2 Primase

As estirpes que apresentaram resultados positivos para o gene da integrase e que

foram testadas posteriormente para o gene da primase, verificou-se que 30% das estirpes

isoladas de paciente com úlcera péptica foram igualmente positivas para o gene da primase,



tal como se verificou para 25% das estirpes isoladas de linfoma MALT, 20% de estirpes

isoladas de gastrite e 10% de estirpes isoladas de adenocarcinoma, também positivas para

o gene da primase [Tabela 4].


patologia.

Primase Positiva


positivas

% Positivas

Úlcera Péptica 15 30% (15/50)

Gastrite 14 20% (14/70)

Adenocarcinoma 1 10% (1/10)

Linfoma MALT 1 25% (1/4)

A presença do gene da primase em estirpes com origem geográfica diversa

apresentou valores elevados nas estirpes de proveniência asiática (38%), de 23% para

estirpes europeias e 10% para estirpes africanas [Tabela 5].



Primase Positiva


positivas

% Positivas

Europa 25 23% (25/111)

África 1 10% (1/10)

Ásia 5 38% (5/13)



4.1.3 Fim do Fago

As estirpes que apresentaram resultados positivos para o gene da integrase e que

foram testadas posteriormente para a região do fim do fago verificou-se que existiam 30%

de estirpes isoladas de úlcera péptica, 20% de estirpes isoladas de adenocarcinoma, 11%

de estirpes isoladas de gastrite e 10% de estirpes isoladas de gastrite foram igualmente

positivas para a região do fim do fago [Tabela 6].


patologia.

Fim Fago Positiva


positivas

% Positivas

Úlcera Péptica 15 30% (15/50)

Gastrite 8 11% (8/70)

Adenocarcinoma 2 20% (2/10)

Linfoma MALT 0 0% (0/4)

A percentagem mais elevada, correspondente à origem da estirpe, pertence a

estirpes de origem africana com 40%, já o valor mais baixo corresponde a estirpes

europeias. [Tabela 7]



Fim do fago Positiva


positivas

% Positivas

Europa 17 15% (17/111)

África 4 40% (4/10)

Ásia 4 31% (4/13)



4.2 - Análise Estatística das Sequências de H. pylori

4.2.1– Teste do Qui-quadrado e teste de Fisher

O teste do qui-quadrado é um teste não paramétrico que analisa o grau de

associação entre variáveis. No presente estudo este teste foi utilizado para tentar

compreender se existe associação entre a patologia e/ou origem e a positividade para o

gene da integrase, primase e fim do fago.

O teste de Fisher é utilizado quando os valores das variáveis são inferiores a 5.

4.2.1.1 – Associação estatística entre a patologia e a presença do gene

da integrase

No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre patologia

associada às estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da integrasse [Tabela 2]

obteve-se um valor p=0,0479. Este resultado sugere que existe associação estatística entre

a úlcera péptica e a presença do gene da integrase.

A análise dos standardized residuals observa-se que o valor que mais parece

contribuir para esta associação é úlcera péptica (standardized residuals +2,06). A

percentage deviation e os standardized residuals são medidas dos graus que os valores de

qui-quadrado observados diferem dos valores esperados com base numa hipótese nula.

Quando os standardized residuals resultam em valores menores ou maiores que |1,96|,

como é um teste de independência, significa que não passou no teste logo existe

associação entre os dois factoresPestana, D. D. e Velosa, S.F. (2006) Introdução à Probabilidade e à Estatística, Vol. 1, Lisboa, Fundação Calouste Gulbenkian..

4.2.1.2 – Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da

primase


associada às estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da primase [Tabela 4]

obteve-se um valor p= 0,4419, que é maior que 0,05 o que significa que não existe

associação estatística entre a patologia e a presença do gene da primase.



4.2.1.3 – Associação estatística entre a patologia e a presença do fim do fago


associada às estirpes de H. pylori testadas e presença da região do fim do fago [Tabela 6]

obteve-se um valor p= 0,0555 é maior que 0,05, no entanto é um valor muito próximo, o que

significa que com os dados que temos não existe associação estatística entre a patologia e

a presença da região do fim do fago. Nos standardized residuals o valor que mais parece

contribuir para esta aproximação ao valor limite de associação é úlcera péptica (+1,86).

Como existem valores esperados menores que 5 foi necessário fazer teste de Fisher (p= 0,

5475).

4.2.1.4 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do gene

da integrase

No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre a origem

geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da integrase [Tabela 3]

obteve-se um valor p= 0,6325, significa que não existe associação estatística entre a origem

e a presença do gene da integrase.

4.2.1.5 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do gene

da primase


geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da primase [Tabela 5]

obteve-se um valor p= 0,2579, significa que não existe associação estatística entre a origem

e a presença do gene da primase.

4.2.1.6 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do fim

do fago


geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença da região do fim do fago [Tabela 7]

obteve-se um valor p= 0,0789, este resultado significa que apesar de estar próximo do

limite, com os dados que temos não existe associação estatística entre a patologia e a

presença da região do fim do fago. Nos standardized residuals o valor que mais parece



contribuir para esta aproximação ao valor limite para associação são as estirpes africanas

(+1,56).

Como existem valores esperados menores que 5 foi necessário fazer teste de Fisher

(p= 0,05312).

4.3 - Análise Filogenética de Profagos em Helicobacter pylori

4.3.1 – Análise Filogenética do Gene da Integrase

A análise filogenética das sequências dos produtos de PCR do gene da integrase

originou uma árvore filogenética de 4 clusters (grupos de sequências com semelhança entre

si) [Figura 5].

Foi feita comparação com sequências do gene da integrase presentes noutras

espécies de Helicobacter, como H. cetorum (mamíferos marinhos), que se encontram

situadas em posições mais extremas da árvore filogenética [Figura 5].

No cluster A encontram-se estirpes de origem europeia e africana. Neste cluster

existem 3 subgrupos designados A1 que corresponde a 100% de estirpes com origem no

Norte da Europa sendo que destas 72% são de origem Sueca, A2 mais de metade (56%)

das estirpes incluídas neste subgrupo são de origem senegalesa e 31% de origem

portuguesa, A3 50% das estirpes são senegalesas e 38% francesas. É neste cluster que se

localizam a maioria das estirpes de origem africana.

Metade das estirpes pertencentes ao cluster B são provenientes de Portugal e 30%

são francesas. No cluster C estão representadas estirpes maioritariamente (88%) de origem

asiática (Este Asiático) enquanto que o cluster D apresenta origem europeia diversa, sendo

que 44% são estirpes de origem portuguesa e 24% de origem francesa.

Na árvore filogenética o nome das estirpes termina com uma letra que designa a

patologia associada a essa estirpe. A análise filogenética do gene da integrase demonstrou

haverem clusters de estirpes de acordo com a região geográfica, não ocorrendo, a mesma

situação em relação às patologias.



Fig. 5 Árvore filogenética do gene da integrase (1000 réplicas) neighbor-joing method,

kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C -

Adenocarcinoma, G - Gastrite, M - Linfoma MALT e U - Úlcera Péptica.

4.3.2 – Análise Filogenética do Gene da Primase

Tal como acontece para a região da integrase, também, no gene da primase seria

espectável encontrar maior número de estirpes, pois obtiveram-se 31 estirpes positivas para

a presença do gene da primase, isso não se verificou, uma vez que, houve alguma

dificuldade em obter sequências de DNA provenientes da sequenciação dos produtos de

PCR [Figura 6].

Foi estudado em que clusters estas estirpes, positivas para o gene da primase, se

localizam e se se localizavam nos mesmos clusters da árvore filogenética da integrase, ou

seja, se analisando um gene diferente os clusters se mantinham. Por exemplo,

relativamente às sequências de origem asiática KHP30, 1961 e KHP40 que estavam no

cluster C da árvore filogenética para análise do gene da integrase, também, na árvore

filogenética para a análise do gene da primase aparecem juntas, daí que nesta figura tenha

sido adoptada a mesma identificação de cluster C.



De um modo semelhante as estirpes que nesta figura aparecem agrupadas e

identificadas com um B, significa que, também, estavam juntas na árvore filogenética para

análise do gene da integrase e pertenciam ao cluster B. O cluster B apresenta 3 estirpes

estudadas, duas delas de origem portuguesa e uma de origem sueca.

Fig. 6 Árvore filogenética do gene da primase (1000 réplicas), neighbor-joing method,

kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C

– Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT e U- Úlcera Péptica.



4.3.3 – Análise Filogenética da região do Fim do Fago

De um modo análogo também na região do fim do fago seria espectável encontrar

maior número de estirpes, pois obtiveram-se 8 estirpes positivas para a presença da região

do fim do fago, isso não se verificou, uma vez que, houve alguma dificuldade em obter

sequências legíveis provenientes da sequenciação dos produtos de PCR [Figura 7].

Foi, também, estudado em que clusters estas estirpes, positivas para a região do fim

do fago, se localizam e se se localizavam nos mesmos clusters da árvore filogenética da

integrase, ou seja se analisando um gene difererente os clusters se mantinham. Esta

verificou-se ser uma hipótese verdadeira. Sendo utilizado o mesmo esquema de anotação.

Fig.7 Árvore filogenética da região do Fim do Fago (1000 réplicas), neighbor-joing method,

kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C

– Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT e U- Úlcera Péptica.



5 – Discussão e Conclusão

Os resultados reforçam a informação, contida em estudos anteriores, da abundância

de sequências profágicas em H. pylori34. A maioria das sequências parece pertencer a

profagos remanescentes integrados no genoma bacteriano, uma vez que na maioria dos

casos as estirpes são positivas para um gene mas não o são para os restantes genes

fágicos. Apenas 0,8% das estirpes são, simultaneamente, positivas para a presença dos

genes da integrase, primase e fim do fago.

Na pesquisa por PCR pesquisou-se um gene do início, um gene do meio e a região

do fim do fago para que fosse possível ter uma ideia se o fago seria completo ou não. A

pesquisa destas 3 zonas do genoma é uma estratégia de selecção de estirpes que para

estudos posteriores. A certeza absoluta de que o profago é completo requer a sequenciação

completa do genoma.

Considera-se que um profago é completo quando é capaz de apresentar um ciclo

lítico, profagos completos descritos na literatura existem 2, no genoma da estirpe B45 onde

após um estudo de indução mostrou-se existir um profago designado phiHP33 da família

Siphoviridae34 e no genoma da estirpe 1691 onde o autor demonstrou que este profago

também poderia apresentar um ciclo lítico e era um fago da família Podoviridae37, como

descritos em 2.2.6. São profagos completos porque estão integrados mas os autores

demonstraram que poderia haver a produção de um fago lítico. Por analogia dos genomas

verifica-se que existem outros fagos completos por exemplo o Cuz20, India 7, KHP30 e

KHP4051.

Na literatura também há descrição de profagos incompletos tais como, descritos no

capítulo 2.2.6, estes profagos incompletos não têm a sequência completa, já não vão ser

capazes de ter um ciclo lítico, sendo designados profagos remanescentes. Como exemplo o

profago presente na estirpe B3849.

As sequências dos fagos são, tipicamente, pouco conservadas entre si, e dai que

seja muito difícil desenhar um par de primers que consiga detectar correctamente as

sequências a pesquisar. Existe uma diversidade muito grande, assim esse par ideal não

existe, e como tal para algumas das estirpes que foram classificadas como não tendo o

gene da primase só se pode ter certeza absoluta se for feita a sequenciação completa do

genoma. Sendo assim podem existir alguns resultados falsos negativos, uma vez que, existe

muita variabilidade e os primers não conseguem detectar a sequência. Da mesma forma

podem haver falsos positivos pois em alguns casos se no gel havia várias bandas e era



necessário excisar-se a banda que tinha a dimensão aproximada e enviá-la para

sequenciar, se o resultado da sequenciação não correspondia ao gene da primase (ou fim

do fago), a sequência foi eliminada.

A análise filogenética mostrou existirem clusters de acordo com a origem geográfica

das estirpes, uma vez que nos clusters [Figura 5] pode-se observar que as estirpes de

origem asiática estão todas agrupadas e o mesmo se passa com as restantes diversas

origens geográficas.

As estirpes foram isoladas de doentes com diferentes patologias mas as diferentes

patologias aparecem distribuídas em todos os clusters, ou seja não existe agrupamento por

patologia. Apesar de filogeneticamente não se encontrar nenhuma discriminação de acordo

com a patologia, as estirpes que são provenientes de doentes que tinham úlcera péptica têm

mais frequentemente profagos integrados do que as estirpes provenientes de pacientes que

outras patologias. O que pode sugerir uma associação entre a presença do profago e o

desenvolvimento da úlcera péptica. Este aspecto é importante porque existem espécies de

bactérias em que a existência de profagos está associada à virulência (difteria, toxinas da

cólera e escarlatina), pois os fagos codificam factores de virulência que aumentam a

amplitude do hospedeiro e provem a invasão do sistema imunitário22.

A análise estatística mostrou haver associação entre o gene da integrase e úlcera

péptica. A associação entre região do fim do fago e úlcera péptica apresenta um valor p

limite, tal como acontece entre esta região e as estirpes de origem africana. Pode ser

esclarecida esta possível associação aumentando o número de estirpes testadas.

Houve conservação de clusters nos diferentes genes analisados. As sequências

obtidas estavam razoavelmente conservadas nas estirpes H. pylori das árvores da primase

e do fim do fago, as estirpes Helicobacter não-pylori encontravam-se nas posições mais

externas das árvores filogenéticas.

A falta de homologia entre os genes fágicos, principalmente entre a primase e o fim

do fago dificulta a amplificação e a sequenciação dos produtos de PCR esta ocorrência

explica o motivo pelo qual as árvores filogenéticas não apresentam tantas estirpes como

aquelas que foram testadas e consideradas positivas.

Foram sequenciadas 132 estirpes integrase positivas de um total de 167 estirpes

consideradas positivas por PCR para o gene da integrase, 3 positivas para o gene da

primase em 31 estirpes e 8 estirpes que possuíam a região do fim do fago num total de 25

estirpes, apenas as referidas foram incluídas na análise filogenética, as restantes



sequências ou apresentaram qualidade insuficiente ou eram sequências demasiado

pequenas e não foram incluídas na análise filogenética.

Ainda assim parece existir uma grande conservação das sequências e isso

demonstra-se porque as estirpes que estão nestas árvores filogenéticas e que são comuns

às 3 árvores, tendem a aparecer em clusters idênticos, estando sempre na mesma posição

demonstrando que existe aqui alguma conservação, uma vez que usamos diferentes genes

mas chegamos à conclusão que as mesmas estirpes localizam-se nos mesmos clusters em

árvores diferentes.

Estudos futuros impõe a sequenciação completa de estirpes que foram positivas para

a presença do gene da integrase, primase e fim do fago numa tentativa de encontrar mais

profagos completos integrados no genoma de H. pylori, outro estudo possível será a

pesquisa de outros genes de origem fágica que apresentem uma conservação maior e seja

mais especifico o desenho de primers ou procurar genes que apresentem uma acção

terapêutica importante como por exemplo os genes das lisinas fágicas que podem ser

utilizados na terapia fágica.



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Anexos

Tabela 1 Contagens totais das estirpes estudadas de Helicobacter pylori.

PCR Integrase % Primase % Fim de Fago % Primase + Fim Fago %

Positivos: 167 19,3% 31 23,1% 25 18,7% 8 6,0%

Negativos: 699 80,7% 103 76,9% 109 81,3% 86 64,2%

Total Testadas: 866 100,0% 134 80,2% 134 80,2% 134 80,2%

Falta Testar: 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0%

Total Amostras: 866

64 25,8%

78 17,3%

15 19,7%

10 15,9%0 0,0%

UP: 248 184 74,2%

DNU: 450 372 82,7%

Adenocarcinoma: 76 61 80,3%

MALT: 63 53 84,1%Desconhecido: 29 29 100,0%

TOTAL: 866

15 30,0%

14 20,0%

1 10,0%

1 25,0%

0 #DIV/0!

UP: 50 35 70,0%

DNU: 70 56 80,0%


MALT: 4 3 75,0%

Desconhecido: 0 0 #DIV/0!

TOTAL: 134

15 30,0%

8 11,4%

2 20,0%

0 0,0%

0 #DIV/0!

UP: 50 35 70,0%

DNU: 70 62 88,6%


MALT: 4 4 100,0%

Desconhecido: 0 0 #DIV/0!

TOTAL: 134

131 19,1%

15 25,0%

21 17,6%

0 0,0%

0 0,0%

Europa 686 555 80,9%

África 60 45 75,0%

Ásia 119 98 82,4%

América 1 1 100,0%

Oceania 0 0 0,0%

TOTAL: 866

25 22,5%

1 10,0%

5 38,5%

0 0,0%

0 0,0%

Europa 111 86 77,5%

África 10 9 90,0%

Ásia 13 8 61,5%

América 0 0 0,0%

Oceania 0 0 0,0%

TOTAL: 134

17 15,3%

4 40,0%

4 30,8%

0 0,0%

0 0,0%

Europa 111 94 84,7%

África 10 6 60,0%

Ásia 13 9 69,2%

América 0 0 0,0%

Oceania 0 0 0,0%

TOTAL: 134

Integrase Positiva (DNU):

109

31

Primase Negativa (Europa):

TOTAL (Fim Fago Negativo):

167

Integrase Positiva (Ásia):

Integrase Positiva (Oceania):

25

TOTAL (Integrase Positiva):

TOTAL (Integrase Positiva):

Integrase Positiva (Europa):

Integrase Positiva (África):

Fim Fago Negativo (Desconhecido):

167

Contagens

Integrase Positiva (UP):

Integrase Positiva (América):

Integrase Positiva (Adenocarcinoma):

Integrase Positiva (MALT):Integrase Positiva (Desconhecido):

Fim Fago Negativo (UP):

Fim Fago Negativo (DNU):

Fim Fago Negativo (Adenocarcinoma):

Fim Fago Negativo (MALT):

Integrase Negativa (Europa):

Integrase Negativa (África):

Integrase Negativa (Ásia):

Integrase Negativa (América):

Testadas para Fim de Fago

Fim Fago Positivo (UP):

Fim Fago Positivo (DNU):

Fim Fago Positivo (Adenocarcinoma):

Fim Fago Positivo (MALT):

Fim Fago Positivo (Desconhecido):

TOTAL (Fim Fago Positivo):

Primase Negativa (DNU):

Primase Negativa (Adenocarcinoma):

Primase Negativa (MALT):

Primase Negativa (Desconhecido):

TOTAL (Primase Negativa): 103

Integrase Negativa (Oceania):

TOTAL (Integrase Negativa): 699

Integrase Negativa (UP):

Integrase Negativa (DNU):

Integrase Negativa (Adenocarcinoma):

Integrase Negativa (MALT):Integrase Negativa (Desconhecido):

TOTAL (Integrase Negativa): 699

31

Primase Negativa (UP):

Testadas para Primase

Primase Positiva (UP):

Primase Positiva (DNU):

Primase Positiva (Adenocarcinoma):

Primase Positiva (MALT):

Primase Positiva (Desconhecido):

TOTAL (Primase Positiva):Patologia

Testadas para Integrase

Testadas para Primase

Primase Positiva (Europa):

Primase Positiva (África):

Primase Positiva (Ásia):

Primase Positiva (América):

Primase Positiva (Oceania):

TOTAL (Primase Positiva):

Testadas para Integrase

Primase Negativa (África):

Primase Negativa (Ásia):

Primase Negativa (América):

Primase Negativa (Oceania):

TOTAL (Primase Negativa): 103

Fim Fago Negativo (América):

Fim Fago Negativo (Oceania):

Testadas para Fim de Fago

Fim Fago Positivo (Europa):

Fim Fago Positivo (África):

Fim Fago Positivo (Ásia):

Fim Fago Positivo (América):

Fim Fago Positivo (Oceania):

TOTAL (Fim Fago Positivo):

TOTAL (Fim Fago Negativo): 109

Origem

25

Fim Fago Negativo (Europa):

Fim Fago Negativo (África):

Fim Fago Negativo (Ásia):



Tabela 2 Contagem estatística entre patologia/origem e positividade para os genes fágicos.

Integrase Positiva Integrase Negativa Primase Positiva Primase Negativa Fim Fago Positivo Fim Fago Negativo

UP 64 184 15 35 15 35

DNU 78 372 14 56 8 62

Adenocarcinoma 15 61 1 9 2 8

MALT 10 53 1 3 0 4

Europa 131 555 25 86 17 94

África 15 45 1 9 4 6

Ásia 21 98 5 8 4 9

América 0 1 0 0 0 0

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