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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
GUILHERME NAVARRO NILO GIUSTI
SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO PARA
QUANTIFICAÇÃO DA DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA EM
LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA
CAMPINAS
(2019)
GUILHERME NAVARRO NILO GIUSTI
SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO PARA QUANTIFICAÇÃO DA
DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA EM LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA
Orientador: José Andrés Yunes
CAMPINAS
(2019)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na Área de Genética Animal e Evolução
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GUILHERME NAVARRO NILO GIUSTI E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ ANRÉS YUNES
Campinas, 22 de Fevereiro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. José Andrés Yunes
Prof. Dr. Márcio José da Silva
Dra. Juliana Godoy Assumpção
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço à minha mãe, Viviane, por sempre ter me apoiado
e dado condições de me dedicar às minhas curiosidades e aos estudos. A estrutura e
carinho que você me proveu ao longo de toda a minha vida foram e sempre serão
essenciais a essa jornada. Você é o meu maior exemplo.
À minha namorada, Caroline, por todo amor e compreensão, mesmo nos
momentos mais turbulentos. Sem o seu apoio, esse momento teria sido infinitamente
mais complicado. Que nós possamos enfrentar muitos outros desafios lado a lado e
que eu consiga te retornar pelo menos metade do suporte que você me proveu.
A toda a minha família, que sempre estive presente quando a minha maior
necessidade era Raiz e Casa. Agradeço especialmente aos meus avós, Filadelfo e
Dalva, por terem originado essa família maravilhosa e servirem como grande fonte de
inspiração. Se eu escolhi trabalhar com pesquisa em saúde, a razão foi você, vô. Outro
agradecimento especial aos meus primos, por terem sido por uma vida toda os irmãos
que nunca tive.
Agradeço também ao meu pai, Carlos. Apesar da distância, você nunca me
faltou com amor e participação na formação do meu caráter, sendo sempre um grande
exemplo positivo a ser seguido.
Agradeço também ao meu orientador, Prof. Dr. Andrés, por acreditar em meu
potencial em desenvolver um trabalho de importância tão significativa. Aos seus
conselhos, prontidão em sempre auxiliar no desenvolvimento do projeto e apoio. Que
nossos próximos trabalhos em conjunto possam ser tão bem-sucedidos quanto essa
jornada.
A todos os amigos do Centro de Pesquisa Boldrini, seja pelos conselhos
técnicos e acadêmicos, seja pela amizade constante que faz toda diferença em criar
um ambiente prazeroso de trabalho. Em especial, agradeço à Dra. Patrícia por toda a
paciência em me auxiliar e ensinar ao longo de todo o desenvolvimento desse projeto,
além de todos os conselhos, conversas e amizade. Agradeço também especialmente
aos bagaceiros Zeni, Diego, Leo e Victor. A amizade de vocês não tem preço e se
estende para muito além dos laboratórios dessa vida acadêmica.
Agradeço a todos outros amigos verdadeiros que fizeram e fazem parte da
minha vida, ao longo de toda a minha nômade jornada por esse mundo. Dizem que
os amigos são a família que a gente escolhe, e nesse caso isso não poderia ser mais
verdadeiro. Vocês são incríveis.
Um agradecimento mais que especial a todas às crianças que cederam o
material biológico que possibilitou o desenvolvimento desse trabalho. Desse modo, a
luta de vocês é convertida em esperança e também em apoio para que cada vez
menos crianças tenham que lutar.
Agradeço às instituições que propiciaram o suporte financeiro para o
desenvolvimento desse projeto. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) pelo apoio durante o primeiro ano do mestrado. Ao Programa
Nacional de Apoio à Atenção Oncológica (PRONON, SIPAR 25000.057709/2015-01),
Instituto Ronald McDonald e Fundação Bradesco por outras verbas que permitiram a
realização desse estudo.
Por fim, agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) pelo financiamento do projeto (processo n° 2017/03942-8) por meio do
convênio com a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES)
RESUMO
Sequenciamento de alto desempenho para quantificação da Doença Residual
Mínima em Leucemia Linfóide Aguda
A leucemia linfoide aguda (LLA) é o câncer mais comum na criança. Os atuais
protocolos de tratamento da LLA pediátrica alcançam índices de sobrevida livre de
doença que se aproximam de 90%. Parte desse sucesso se deve à alocação dos
pacientes em diferentes grupos de risco, segundo fatores prognósticos obtidos ao
longo do tratamento. A resposta inicial ao tratamento, avaliada pela quantificação das
células leucêmicas residuais do paciente, ou doença residual mínima (DRM), é um
dos mais importantes fatores para a identificação desses grupos de risco. O protocolo
do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI LLA-2009), usa a
DRM dos dias 15 e 35 do tratamento, avaliada por citometria de fluxo e por PCR
quantitativo (qPCR) respectivamente, para alocação dos pacientes nos grupos para
diferentes esquemas de tratamento quimioterápico. A avaliação da DRM por
citometria de fluxo (DRM-CF) e qPCR (qPCR DRM) é cara, exige muita experiência e
demanda análise imediata (citometria) ou demorada das amostras (qPCR),
dificultando seu uso em abrangência nacional. O número de crianças que têm se
beneficiado do exame de DRM é de apenas 100 por ano (3,2%). Nesse projeto
padronizou-se o uso do sequenciamento de última geração (NGS) para a
quantificação da DRM em crianças com LLA-B derivada, método que apresenta
vantagens em termos de rapidez, custos e escalabilidade. Uma vez padronizado, o
método de análise de DRM por sequenciamento (NGS DRM) foi validado em amostras
de LLA-B derivada pediátrica retrospectivamente analisadas no Centro Infantil
Boldrini. Resultados NGS DRM foram comparados a resultados de qPCR DRM para
as mesmas amostras, obtendo uma taxa de satisfatoriedade de 88,5% e um
coeficiente de correlação de Pearson de 0,86. Como próximos passos, esperamos
continuar o aperfeiçoamento do método, elevando a sua sensibilidade e acurácia,
adicionando outros marcadores associados à LLA-B derivada pediátrica ao protocolo
e adaptando-o para outras variedades de leucemias.
ABSTRACT
Acute Lymphoblastic Leukemia Minimal Residual Disease quantification by high
throughput sequencing
Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common cancer in children. The
current childhood ALL treatment protocols achieve disease-free survival rates close to
90%. Part of this success is due to the allocation of patients in different risk groups,
according to prognostic factors assessed during the treatment. Initial treatment
response, assessed by the quantification of the patient’s residual leukemic cells, or
Minimal Residual Disease (MRD), is one of the most important factors to identify these
risk groups. The protocol of the Brazilian Group for the treatment of ALL (GBTLI LLA-
2009) uses MRD at days 15 and 35, evaluated by flow cytometry and qPCR
respectively, to allocate the patients into groups for different chemotherapy treatment
schemes. Flow cytometry and qPCR MRD assessment are expensive, require a lot of
experience from the analyst and demand immediate analysis (cytometry) or a multistep
25 days-long analysis (qPCR). These factors hamper these methods’ broad utilization
in Brazil. The number of children in the country who are able to take advantage of the
MRD exam is 100 a year (3,2% of total pediatric ALL cases in our country). In this
Project, we standardized MRD assessment in childhood ALL by Next Generation
Sequencing of IgH rearrangements. This assay is both cheaper and faster than the
conventional ones and has high scalability potential. Once standardized, this method
was validated using pediatric pre-B ALL samples previously analyzed at Centro Infantil
Boldrini. The NGS MRD results were compared to the qPCR MRD ones, achieving a
result satisfaction rate of 88,5% and a Pearson correlation coefficient of 0,86. The next
steps are to keep polishing the method, by increasing its sensitivity and accuracy,
adding additional established pediatric pre-B ALL markers to the protocol and adapting
the method for other types of leukemia.
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO 11
1. Leucemia Linfoide Aguda 11
2. Rearranjo V(D)J 12
3. Doença Residual Mínima 15
4. Detecção da DRM 16
5. DRM por Next Generation Sequencing (NGS) 19
5.1. Obtenção da Frequência do Clonotipo Leucêmico em DNA Linfocítico Total 19
5.2. Normalização da Frequência do Clonotipo Leucêmico em DRM 24
5.3. Vantagens da NGS DRM 27
II. OBJETIVOS 29
III. MÉTODOS 30
1. Clonagem das Sequências Spike-In Control 32
2. Preparo do Pool de Spike-In Control 34
3. Seleção das Amostras para Determinação de NGS DRM 35
4. Isolamento das células mononucleadas 36
5. Quantificação da DRM por NGS 37
IV. FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS 40
V. RESULTADOS 42
1. Padronização da Amplicon PCR 42
1.1. Teste de Enzimas: Phusion vs Tth 42
1.2. Touchdown PCR 44
1.3. Redução da Concentração de Primers 46
1.4. Teste da Enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase 48
2. Número de Ciclos de PCR 50
3. Teste de Concentração de PhiX 53
4. Spike-in Control 55
4.1. Teste do uso de Spike-In Controls para Determinar NGS DRM 55
4.2. Teste do uso de Spike-In Controls linearizados para Determinar NGS DRM 58
4.3. Teste de Amplificação Diferencial de Moléculas Spike-In Control 61
5. Validação do Método de NGS DRM 64
5.1. Desenho Experimental 64
5.2. Análise da Qualidade dos Dados do Sequenciamento 65
5.3. Comparação do Número de Clonotipos Leucêmicos Identificados por NGS DRM e qPCR DRM 66
5.4. Comparação entre qPCR DRM e NGS DRM 66
5.5. Determinação de Subamplificação de Sequências Spike-In Control 71
5.6. Comparação entre qPCR DRM e NGS DRM Excluindo o Terceiro Subset 73
5.7. Comparação entre qPCR DRM e Frequência dos Clonotipos Leucêmicos 75
6. Comparação de Custo entre qPCR DRM e NGS DRM 78
VI. DISCUSSÃO 79
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88
VIII. ANEXOS 92
Anexo 1 - Tabela 1S 92
Anexo 2 - Termo de Consentimento GBTLI LLA-2009, Baixo Risco 95
Anexo 3 - Termo de Consentimento GBTLI LLA-2009, Alto Risco 99
Anexo 4 - Termo de Consentimento URB/Boldrini 103
Anexo 5 - Parecer Consubstanciado CEP 105
Anexo 6 - Declaração de Direitos Autorais 111
11
I. INTRODUÇÃO
1. Leucemia Linfoide Aguda
A Leucemia Linfoide Aguda, comumente denominada LLA, é uma neoplasia
maligna cujo principal atributo é a proliferação monoclonal de células precursoras de
linfócitos cancerosas na medula óssea e no sangue periférico, ocorrendo com maior
frequência em linfócitos B (Woo et al., 2014). Essa enfermidade é altamente
prevalente em crianças, sendo responsável por cerca de 25% dos casos de câncer
nesse grupo etário (Howlader et al., 2013). Em função dos diversos esforços da
comunidade científica internacional, a taxa de sobrevida livre dessa doença em
pacientes pediátricos atualmente vem se aproximado de 90% (Pui et al., 2009;
Kansagra et al., 2018; Kato e Manabe, 2018). Apesar desse sólido avanço, outros
dados explicitam o longo caminho ainda a ser percorrido no combate à LLA infantil.
Como exemplo, crianças que apresentam recaídas após remissão clínica, têm entre
20 e 35% de probabilidade de cura (Nguyen et al., 2008; Reismüller et al., 2009).
Ao longo do ano de 2018, segundo o Instituto Nacional de Câncer, estimou-se
a ocorrência de 420.000 novos casos de neoplasias no Brasil, dos quais 12.500
correspondem a casos infantis e em adolescentes de até 19 anos (INCA, 2017).
Desses, 3125 devem ter correspondido à Leucemia Linfoide Aguda, segundo a
conjectura percentual dessa doença.
12
2. Rearranjo V(D)J
Os linfócitos das linhagens B e T, como células efetoras do sistema imune
adaptativo, devem ser capazes de reconhecer de maneira altamente específica uma
vasta gama de antígenos. O elevadíssimo grau de polimorfismos existente nas
imunoglobulinas (Ig) e receptores de células T (TCR), responsáveis pela identificação
de antígenos, deriva de um mecanismo de rearranjo somático nos loci gênicos
responsáveis pela expressão dessas moléculas. Esse processo recombina os éxons
denominados Variável (V), Diversidade (D) e Junção (J) desses genes de maneira
diferente em cada célula, além de adicionar e remover aleatoriamente alguns
nucleotídeos nas regiões de intersecção desses éxons (Figura 1). Particularmente
para o gene da cadeia pesada de imunoglobulina (IgH), relevante para esse projeto,
existem 7 famílias de éxons V (denominados VH), 7 famílias de éxons D (denominados
DH) e 6 famílias de éxons J (denominados JH). Apesar de toda a sua variabilidade,
esses segmentos possuem algumas regiões razoavelmente conservadas para cada
família de éxons, denominadas frameworks (Abbas et al., 2017)
13
Desse modo, o processo de recombinação V(D)J permite que cada linfócito
gerado possua uma molécula de reconhecimento distinta e virtualmente única
(Tonegawa S, 1983). Esse processo de rearranjo singular e em certo grau aleatório
do DNA de cada precursor de linfócito resulta, portanto, em uma população de células
B e T contendo um vasto repertório de reconhecimento de antígenos. Cada variante
de sequência gerada por um rearranjo V(D)J presente em uma população de linfócitos
é denominada um clonotipo.
Nos casos de LLA-T e LLA-B derivada, no entanto, um precursor de linfócito
(denominado linfoblasto) neoplásico passa a se reproduzir de maneira descontrolada.
Figura 1. Diagrama esquemático do rearranjo V(D)J de genes Ig e TCR. (A) esquema do gene TCRB, mostrando sequência de eventos do rearranjo V(D)J até expressão do receptor TCR. (B) A sequência do rearranjo V(D)J para cada novo linfócito gerado é virtualmente única.
14
Essa proliferação excessiva leva a população linfocítica a ser tomada por clones
desse linfoblasto canceroso, que possuem todos um mesmo clonotipo V(D)J (Levy et
al., 1977).
15
3. Doença Residual Mínima
Uma das principais ferramentas para acompanhar a resposta ao tratamento na
LLA é a avaliação da Doença Residual Mínima, ou seja, a apreciação quantitativa de
células malignas presentes na medula óssea ou no sangue periférico não detectáveis
através de análises morfológicas (Stock e Estrov, 2000). Valores de DRM são
expressos em frequência de um linfoblasto leucêmico pela quantidade de células
mononucleadas total da amostra (Cavé et al., 1998). A avaliação desse dado em
diferentes time points ao longo do tratamento possibilita uma análise altamente
sensível da redução ou do aumento da quantidade de linfócitos neoplásicos no
paciente, funcionando assim como o mais poderoso fator prognóstico individual para
seu risco de recaída. Essa informação acerca da dinâmica da população de células
cancerosas permite classificar os pacientes em diferentes grupos de risco e,
consequentemente, modular o seu tratamento, reduzindo seus efeitos colaterais e
elevando as suas taxas de sobrevida (Wasserman et al., 1992; Brisco et al., 1994;
Gajjar et al., 1995; van Dongen et al., 1998; Ryan et al., 2009; Conter, 2010).
Alguns parâmetros fundamentais para a análise da DRM são a sensibilidade
do ensaio utilizado, que deve ser capaz de detectar no mínimo um linfócito maligno
em 10.000 células saudáveis (10-4); o time point no qual o exame é realizado; e a
associação do valor percentual de células leucêmicas residuais à situação clínica do
paciente, existindo um consenso de que níveis acima de 10-3 estão associados a
maiores chances de recaída. Ainda, o valor prognóstico da DRM depende da
padronização e verificação desses parâmetros em função do protocolo de tratamento
utilizado (Jacquy et al., 1997; Cavé et al., 1998; Ryan et al., 2009; Conter, 2010).
16
4. Detecção da DRM
Antes do desenvolvimento de métodos mais sensíveis, estudos das taxas de
doença residual de pacientes com LLA eram realizados através da contagem de
linfoblastos em esfregaços de medula óssea analisados em microscópios. No entanto,
essa análise morfológica apresenta uma sensibilidade máxima de apenas 5 células
leucêmicas em 100 células normais (5 x 10-2). A partir do início da década de 1990,
essa dinâmica populacional das células leucêmicas, já denominada doença residual
mínima, passou a ser investigada por PCR convencional seguida de quantificação por
Southern Blot (Yamada et al., 1990; Cavé et al., 1998; Biondi et al., 2000).
O surgimento de técnicas modernas de biologia molecular contribuiu para o
aperfeiçoamento dos métodos de análise da DRM, sendo mais utilizados atualmente
a Citometria de Fluxo (CF), baseada no imunofenótipo distintivo das células de LLA,
e o PCR quantitativo em tempo real (qPCR) dos rearranjos de genes Ig e TCR (van
Dongen et al., 2016). Os ensaios de qPCR fazem uso do rearranjo V(D)J sofrido por
esses genes no início da diferenciação linfóide, que gera sequências diferentes e
únicas para cada um dos linfócitos gerados (Figura 2) (Verhagen et al., 2000). Já os
exames baseados na CF detectam essas células através de painéis de marcadores
de superfície presentes em populações celulares leucêmicas (Coustan-Smith et al.,
1998). A natureza majoritariamente monoclonal da LLA resulta do fato das células
malignas terem origem em apenas um linfoblasto neoplásico e, portanto, possuírem
moléculas de superfície ou genes Ig/TCR idênticos entre si, mas diferentes do restante
da população linfocítica, permitindo a sua identificação pelos experimentos
previamente citados. (Verhagen et al., 2000).
17
Enquanto esses dois procedimentos para detecção da DRM têm sido
largamente utilizados com relativo sucesso, ambos apresentam limitações-chave. Em
relação à citometria de fluxo, por exemplo, existe dificuldade na obtenção de níveis de
sensibilidade estáveis, uma vez que os linfoblastos malignos podem ser confundidos
pelo método com células normais em regeneração. Mesmo quando uma sensibilidade
estável é atingida, níveis melhores que 10-4 não costumam ser alcançados, mesmo
quando utilizando técnicas de citometria com 6 a 8 cores. Por fim, a interpretação dos
dados gerados é bastante dependente do nível de treinamento e experiência do
operador, adicionando um viés subjetivo ao resultado final (van Dongen et al., 2016).
A PCR quantitativa em tempo real, por outro lado, consegue atingir níveis de
sensibilidade mais satisfatórios, chegando à ordem de 10-5 (Ryan et al., 2009). O nível
de sensibilidade varia em função da frequência com a qual o rearranjo utilizado como
marcador ocorre em casos de LLA e em linfócitos saudáveis; da sua estabilidade, que
é determinada pela sua tendência a sofrer rearranjos secundários (quanto maior essa
frequência, menor a estabilidade); e das características de sua “cicatriz” V(D)J, como
o número e tipo de nucleotídeos N inseridos entre as regiões recombinadas. Para os
casos de Leucemia Linfoide Aguda B-derivada, o protocolo internacional europeu
AIEOP-BFM ALL 2000 considera IgH como o biomarcador mais promissor (van
Dongen et al., 2003).
No entanto, o uso da qPCR para a determinação de DRM em casos desse
câncer também enfrenta desvantagens e limitações. O principal desses empecilhos é
a natureza laboriosa, demorada e cara do método, o que dificulta a universalização
Figura 2. Princípio da análise de DRM por qPCR. A análise da DRM por qPCR tira proveito do fato da inserção de nucleotídeos N/P no processo de recombinação V(D)J ser aleatória e, por isso, com virtualmente única em cada linfócito formado. O primer paciente-específico (em vermelho) é desenhado de forma a anelar sobre a região dos nucleotídeos N/P. A qPCR é feito com primer paciente-específico forward em combinação com primer reverso consenso e sonda TaqMan que se anelam no segmento J.
18
do seu uso. Muito desse consumo de tempo e recursos está ligado à necessidade da
confecção e teste de primers específicos e individuais para o clonotipo leucêmico de
cada paciente (van Dongen et al., 2016). Em adição, na maior parte dos casos existe
a necessidade da utilização de pelo menos dois marcadores moleculares na análise
da DRM, com o intuito de evitar a obtenção de resultados falso-negativos como
consequência de oligoclonalidade gerada por evoluções subclonais (Beishuizen et al.,
1994). Cada marcador acompanhado por qPCR exige a confecção de um primer
paciente-específico próprio para a sua sequência V(D)J.
Em função dessa conjuntura de altos custos e elevado grau de expertise
necessário, a análise de casos pediátricos de LLA por DRM no Brasil ocorre de forma
rotineira apenas no Centro Infantil Boldrini e no GRAAC (Unifesp). Desse modo,
atualmente apenas cerca de 100 crianças por ano (3,2% do total de casos no país) se
beneficiam da apreciação desse importante fator prognóstico em seus tratamentos.
19
5. DRM por Next Generation Sequencing (NGS)
Esse conjunto de limitações das técnicas atuais, portanto, expõe a necessidade
do desenvolvimento de um método para análise de DRM mais sensível, específico,
automatizável e, principalmente, mais barato. Nesse contexto, o sequenciamento de
nova geração, também denominado Next Generation Sequencing (NGS), surge como
um proeminente candidato (Wu et al., 2012; Nunes et al., 2017). Nesse projeto,
buscou-se a padronização da utilização do sequenciador Illumina MiSeq para realizar
análises de DRM em casos de LLA-B derivada, utilizando como gene alvo o rearranjo
V(D)J em IgH.
Esse trabalho fez parte do projeto PRONON denominado “Sequenciamento de
alto desempenho para quantificação da Doença Residual Mínima em Leucemia
Linfoide Aguda”, de número 25000.057709/2015-01 no SIPAR, cujo Termo de
Concessão encontra-se publicado no Diário Oficial da União de 10 de dezembro de
2015.
5.1. Obtenção da Frequência do Clonotipo Leucêmico em DNA Linfocítico Total
A análise da DRM por NGS é feita com uso de amostras pareadas coletadas
no ato do diagnóstico da LLA (amostra diagnóstico) e no 35º dia da terapia de indução
(amostra seguimento). Essas amostras são coletadas da medula óssea dos pacientes,
tendo as suas células mononucleadas isoladas e seu DNA genômico extraído. As
amostras diagnóstico (denominadas D0) possuem altos índices de linfoblastos
leucêmicos, permitindo a identificação das sequências de nucleotídeos referentes a
esses clonotipos para o paciente testado. As amostras seguimento (denominadas
D35) são utilizadas para o cálculo em si da NGS DRM do paciente nesse time point.
Amostras D35 e D0 são sequenciadas em corridas separadas, para evitar
contaminação cruzada entre esses grupos.
A obtenção de NGS DRM também se fundamenta na amplificação da “cicatriz”
V(D)J do gene IgH, assim como na qPCR DRM. No entanto, o preparo das amostras
20
para sequenciamento se baseia em uma multiplex nested PCR, ao invés de uma PCR
singleplex. Nesse sistema, a primeira etapa de PCR faz uso de um conjunto de primers
consenso capazes de se anelar a uma vasta gama de rearranjos de IgH, realizando a
amplificação da sequência V(D)J em si. Já a segunda etapa adiciona os adaptadores
para o sequenciamento aos amplicons gerados na primeira PCR (Faham et al., 2012).
Esse processo encontra-se ilustrado na Figura 3.
Na primeira, denominada Amplicon PCR, utiliza-se 50 ng de gDNA para a
análise de amostras D0, quantidade suficiente para a identificação dos seus clonotipos
leucêmicos. Já para analisar amostras D35, são utilizadas 600 ng de gDNA. Desse
modo, levando em conta que uma célula diploide humana contém cerca de 6 pg de
DNA, a análise da DRM utiliza o material genético de cerca de 100.000 células
mononucleadas por amostra. A sensibilidade máxima teórica da técnica de NGS DRM
é, portanto, de uma célula leucêmica em 100.000 células mononucleadas (10-5).
O multiplex de primers utilizado nessa etapa é o FR2 Biomed2, que consiste
em um conjunto de forward primers que têm como alvo o segundo framework de
diferentes segmentos VH em par a um reverse primer consenso para anelamento em
JH (van Dongen et al., 2003). Cada oligonucleotídeo forward desse conjunto utilizado
Figura 3. Esquema do Nested Multiplex PCR de rearranjos IgH. Primeira etapa de PCR utiliza um conjunto de primers em multiplex para segmentos V(D)J. A segunda PCR adiciona os adaptadores para o sequenciamento do amplicon.
21
é específico para uma família de segmento VH, totalizando assim 7 primers. O reverse
primer consenso é capaz de reconhecer todas as famílias JH. Todos esses alvos
desses oligonucleotídeos se encontram no gene IgH. Foram adicionadas a esses
primers caudas 5’ não-complementares a rearranjos V(D)J, que funcionam como alvo
para o anelamento dos primers da segunda etapa de PCR.
Na segunda etapa, denominada Index PCR, os primers utilizados provém do
kit Nextera XT, fornecidos pela Illumina. Esse par de oligonucleotídeos consiste nos
adaptadores necessários à etapa posterior de sequenciamento no MiSeq,
denominados P5 e P7, além de conter duas sequências indexadoras de 8
nucleotídeos (um em cada primer do par). Esses index possibilitam gerar uma
combinação de sequências identificadoras de amostras única para cada paciente
analisado. Desse modo, é possível realizar a análise de amostras de diversos
pacientes em apenas uma corrida do sequenciado.
Reações de PCR multiplex, como a etapa de Amplicon PCR, podem apresentar
um viés de amplificação diferencial, amplificando certas sequências de DNA com
eficiência maior do que outras. Esse efeito pode ser gerado pela maior facilidade de
amplificação de fragmentos de DNA menores ou por diferentes porcentagens de GC
dos amplicons (Elnifro et al., 2000). O número de ciclos das duas reações de PCR
realizadas é um fator importante no controle desse viés de amplificação diferencial,
uma vez que menores números de ciclos na primeira etapa, na qual a reação multiplex
é de fato realizada, privilegiariam a restrição desse viés (D’Amore et al., 2016). Assim
sendo, o número de ciclos da primeira PCR foi um parâmetro testado, buscando
minimizar o seu viés de amplificação sem comprometer a sensibilidade e linearidade
do teste.
Após a realização das duas etapas de PCR, o material genético obtido
(denominado biblioteca) é purificado utilizando beads magnéticas, capazes de separar
fragmentos de DNA com base em seu tamanho. A plataforma MiSeq tem maior
facilidade em sequenciar amplicons quanto menores os seus tamanhos.
Considerando que primer-dimers possuem adaptadores para sequenciamento e são
menores que os amplicons alvo do método de NGS DRM, sua remoção é imperativa.
As bibliotecas preparadas são então quantificadas, diluídas para a
concentração de sequenciamento e, em casos em que amostras de mais de um
paciente forem ser analisadas em um mesmo sequenciamento, multiplexadas. Os
22
sistemas de sequenciamento Illumina possuem dificuldade em sequenciar bibliotecas
de baixa diversidade, como é o caso do um sequenciamento contendo apenas
amplicons do gene IgH (Mitra et al., 2015). Desse modo, é realizada a adição de
genomas PhiX (Illumina) à biblioteca, o que eleva a sua diversidade de amplicons,
permitindo um sequenciamento mais robusto. Buscando reduzir a concentração PhiX
adicionada e assim diminuir o volume de dados desperdiçado no sequenciamento, foi
testado o uso concomitante de quatro variedades do primer reverso JH (utilizado na
primeira etapa do nested PCR), com cada uma delas contendo entre 0 a 3
nucleotídeos N entre a sequência JH e a cauda 5’ não-complementar. Desse modo,
uma vez que o sequenciamento tem início a partir dessa extremidade do amplicon, o
uso dessas 4 variedades de primers reverso permite elevar a diversidade de
nucleotídeos sequenciados a cada ciclo do processo de sequencing by synthesis.
Após a adição de PhiX, as bibliotecas passam então por duas etapas de
desnaturação: química (NaOH) e por calor. Esse processo objetiva converter suas
moléculas de DNA em fita simples, permitindo que elas se hibridizem à flow cell,
plataforma onde o sequenciamento em si é realizado.
Nessa plataforma, os amplicons de IgH são distribuídos de maneira randômica
em sua superfície sólida, onde também são adicionados primers, DNA polimerase e
nucleotídeos marcados com fluorescência, contidos no kit de sequenciamento provido
pela Illumina. Cada amplicon é hibridizado à flow cell pela sua extremidade VH
(adaptador P7) e forma então um cluster de moléculas idênticas entre si através de
uma amplificação denominada bridge PCR. O sequenciamento de cada cluster se
inicia pela extremidade JH do amplicon (adaptador P5) e se dá por um método de
terminação cíclica reversível de quatro cores, denominado sequencing by synthesis.
Nesse sistema, cada ciclo de sequenciamento determina a identidade de um
nucleotídeo para cada cluster (Figura 4). Para NGS DRM, utilizam-se 150 ciclos de
sequenciamento. Resumidamente, o sequenciamento é realizado em três etapas (1)
utilização do primer para sequenciamento a partir de JH, obtendo a sequência JH-
N(D)N-VH (2) lavagem da fita formada e adição do primer para sequenciamento de
um dos indexadores de 8 nucleotídeos e (3) lavagem da fita formada e adição do
primer para sequenciamento do outro indexador de 8 nucleotídeos.
23
Em seguida, o software Real Time Analyzer do MiSeq demultiplexa dados de
diferentes amostras com base em sua combinação de indexes e monta, através do
cálculo da intensidade de fluorescência e posicionamento dos clusters, as sequências
para os amplicons sequenciados, denominadas reads. Uma vez que o
sequenciamento para NGS DRM dura 150 ciclos, os reads gerados têm até 150 bases
de comprimento. Pelo menos 10.000 reads são gerados por amostra D0 e 500.000
reads por amostra D35. Assim, a profundidade mínima de cobertura para amostras
D0 é de 1 vez e para amostras D35 é de 5 vezes
Cada read corresponde à sequência de um cluster, que por sua vez
corresponde a um amplicon hibridizado à flow cell. (Metzker, 2010; Liu et al., 2012).
Figura 4. Esquema do processo de Next Generation Sequencing na plataforma Illumina MiSeq. (A) Amplicons ligados à flow cell são amplificados por bridge PCR. Sequencias de adaptador P7 representada em azul e P5 em roxo. (B) Clusters gerados pela bridge PCR são sequenciados pelo processo de sequencing by synthesis. Durante cada ciclo de sequenciamento, um nucleotídeo marcado com fluorescência é incorporado ao amplicon, emitindo um sinal de fluorescência correspondente à base utilizada. Um bloqueador 5’ removível (representado em cinza), impede a incorporação de outros nucleotídeos no mesmo ciclo de sequenciamento. Fonte: Westbury, 2018.
24
Esses reads, por tanto, representam a heterogeneidade da população celular
analisada. Desse modo, é possível identificar a sequência de nucleotídeos associada
a um clonotipo leucêmico na amostra D0 de um paciente e, através dessa sequência,
observar a abundância desse mesmo clonotipo em sua amostra D35. Essa análise
permite, portanto, determinar a frequência do clonotipo leucêmico em relação ao DNA
linfocítico total presente inicialmente na amostra D35 analisada (daqui para frente
referida como frequência do clonotipo leucêmico), como demonstrado por Kotrova et
al. (2015).
5.2. Normalização da Frequência do Clonotipo Leucêmico em DRM
Os primers consenso usados para o sequenciamento de nova geração são
específicos para rearranjos V(D)J de IgH e, portanto, retornam apenas reads
correspondentes a linfoblastos e linfócitos, sejam eles neoplásicos ou saudáveis. No
entanto, a composição linfocitária da medula óssea é de apenas 18,3%, com o
restante da população celular sendo composta por 4,7% monócitos, 69,4%
granulócitos e 6,5% leucócitos imaturos (Brooimans, 2009). Desse modo, o uso
desses primers não traz como resultado a porcentagem de células cancerosas em
relação a todas as células mononucleadas da medula (linfócitos e monócitos), mas
apenas em relação à população total linfocítica. Assim sendo, este projeto propôs
testar a massa de gDNA utilizada no preparo da biblioteca para sequenciamento como
ponto de referência para o número total de células mononucleadas presentes na
amostra analisada.
Com o intuito de normalizar o número de reads associados a um clonotipo
leucêmico, experimentou-se o uso de um controle externo (spike-in control). Esse
normalizador consiste em 21 fragmentos de DNA correspondentes a rearranjos V(D)J
de IgH com sequência conhecida, clonados em plasmídeos. Os controles spike-in são
adicionados em quantidades fixas e diferentes entre si à amostra D35 antes da nested
PCR. Desse modo, eles passam pelas mesmas condições de amplificação e
sequenciamento que o restante do gDNA da amostra na qual se encontram presentes.
Assim sendo, a associação do seu número de cópias inicialmente utilizado ao seu
número de reads gerado, permite a determinação do número de cópias inicial da
25
molécula de gDNA associada ao clonotipo leucêmico. Esse parâmetro, em conjunto
ao número total de células mononucleadas, obtido conforme descrito no parágrafo
anterior, permite a determinação da DRM da amostra D35 a partir da frequência do
seu clonotipo leucêmico (Figura 5). Esse princípio já foi demonstrado por outros
estudos, como por Faham et al. (2012), Gawad et al. (2012) e Ladetto et al. (2014)
utilizando o método comercial fechado LymphoSIGHT (Sequenta).
26
Figura 5. Esquema do método de determinação da DRM utilizando o Spike-in Control. O gDNA das células da medula a ser analisado é extraído e quantificado (Ntot). São adicionados, em quantidades determinadas e diferentes entre si, 21 fragmentos de IgH clonados em plasmídeos (spike-in control), denominadas Nr (no exemplo representados apenas três fragmentos). As bibliotecas são preparadas através de dois processos de PCR, sendo então enviadas para sequenciamento. Três tipos de reads são gerados: células saudáveis com rearranjo V(D)J, linfoblastos leucêmicos (Sl) e controle spike-in (Sr). Esses parâmetros são utilizados para determinar o fator Spike-in e a DRM, como exemplificado com os valores hipotéticos acima.
27
5.3. Vantagens da NGS DRM
A análise de DRM utilizando essa tecnologia de sequenciamento possui o
potencial de superar limitações das técnicas atualmente utilizadas. Esse sistema
evade, por exemplo, a necessidade do uso de primers paciente-específicos, uma vez
que o clonotipo leucêmico poderá ser identificado em meio aos demais reads
sequenciados através da sua sequência de nucleotídeos, determinada a partir da
amostra D0. A identificação dessa sequência nessa amostra diagnóstico é simples,
uma vez que ela se encontra tomada por linfoblastos leucêmicos. Desse modo, o
clonotipo associado a essas células leucêmicas encontra-se extremamente super-
representado nos reads gerados a partir do seu sequenciamento. Esse fator torna a
técnica de NGS DRM mais rápida e menos trabalhosa quando comparada a qPCR
DRM, como apresentado na Tabela 1.
Em relação aos seus custos, a adição de tags indexadores aos primers
utilizados torna possível realizar o exame para diversos pacientes (até 20) em uma
única corrida, reduzindo assim o preço por paciente do método. Em adição, o NGS
possibilita acompanhar sem esforços adicionais a população de subclones leucêmicos
gerados por rearranjos secundários, evitando assim resultados falso-negativos
decorrentes de possível proliferação desses subclones (Gawad et al., 2012). Por fim,
após a sua padronização, o estudo da DRM através desse método pode ser adaptado
para ser utilizado em casos de LLA-T (como por exemplo através do sequenciamento
de rearranjos do TCRB e TCRG), além de em outras variantes de leucemia para as
quais a DRM também possa ser relevante, como em alguns casos de leucemia
mieloide aguda (Rubnitz et al., 2010).
28
Tabela 1. Comparação entre análise de DRM por qPCR e NGS no MiSeq. Para o
período de tempo descrito, é possível analisar dois pacientes por qPCR e vinte
pacientes por NGS.
Atividade qPCR DRM NGS DRM
Dia Funcionário Dia Funcionário
Separação de células MNC da amostra D0
1 A 1 A
Extração e quantificação de DNA do D0
1 B 1 B
Extração de DNA de controles (para curvas de diluição)
2
PCR rearranjos V(D)J de Ig 3 B
Homo/heteroduplex e reamplificação
3 e 4
Sequenciar rearranjos V(D)J clonais
5 a 12 C
Analisar sequências e desenhar primers paciente-específicos
13 e 14 C
Síntese de primers (serviço de terceiros)
15 a 19 -
Teste de sensibilidade dos primers
20 e 21 C, D
Separação de MNC da amostra D35
22 A, D 2 A
Extração e quantificação de DNA do D35
22 2 B
qPCR (controle e Ig) da amostra D35
23 D
PCR rearranjos VDJ de Ig de D0 e D35
3 e 4 B, C
Quantificação do DNA dos produtos de PCR (amplicon)
5 B, C
Combinar amplicon e carregar no reagent cartridge juntamente com a flow cell e rodar sequenciamento
5 B, C
Análise dos resultados 23 6 C
TOTAL 23 dias 4 6 dias 3
29
II. OBJETIVOS
Padronizar e validar método de análise de Doença Residual Mínima em Leucemia
Linfoide Aguda B-derivada pediátrica por sequenciamento massivo de rearranjos de
IgH.
Objetivos Específicos
1. Realizar testes de sensibilidade e linearidade de quantificação de rearranjos IgH
por sequenciamento de última geração.
a. Desenhar e testar primers com adaptadores Illumina, próprios para o PCR e
sequenciamento dos rearranjos IgH.
b. Testar e padronizar a DNA polimerase utilizada no preparo das bibliotecas
para sequenciamento.
c. Testar influência da variação do número de ciclos de PCR no preparo de
bibliotecas para sequenciamento.
d. Testar os efeitos da redução da concentração de genomas PhiX adicionados
às bibliotecas.
e. Testar vantagens da normalização do número de reads de clonotipos
leucêmicos através da quantificação da massa de gDNA utilizado no preparo
da biblioteca em conjunto a controles externos (spike-in control).
2. Fazer análise de DRM por sequenciamento NGS em 50 casos retrospectivos de
LLA-B derivada já analisada por qPCR.
3. Comparar resultados de DRM por NGS e qPCR.
4. Comparar custos da quantificação de DRM por NGS e qPCR.
30
III. MÉTODOS
Essa seção descreve o método final de NGS DRM, utilizado em sua validação,
bem como as amostras utilizadas nesta etapa. Detalhes específicos dos experimentos
anteriores para a padronização desse método estão discriminados em detalhe em
suas seções de resultados. Um resumo esquemático do método descrito a seguir
encontra-se na Figura 6.
31
Figura 6. Resumo esquemático do método final para determinação de NGS DRM.
32
1. Clonagem das Sequências Spike-In Control
As sequências de rearranjos V(D)J IgH clonadas para ser utilizadas como
spike-in control, suas respectivas famílias VH e nomenclaturas estão descritas na
Tabela 1S, presente nos anexos.
Vinte e uma amostras de gDNA contendo rearranjos IgH foram selecionadas
para uso como spike-in control. Elas foram quantificadas utilizando o ensaio HS
dsDNA do fluorímetro Qubit (Life Technologies). Suas sequências V(D)J foram
amplificadas para a clonagem conforme o protocolo descrito na Tabela 2. Os produtos
de PCR foram clonados conforme o protocolo para sticky end amplicons do sistema
pJET1.2/blunt Cloning Vector (ThermoFisher Scientific). Uma linhagem de E. coli DH5-
Alfa competente foi utilizada para a clonagem.
Tabela 2. Protocolo de preparo e condições de PCR para amplificação de sequências
V(D)J para clonagem.
A extração e purificação dos plasmídeos foi realizada segundo o protocolo do
kit NucleoSpin Plasmid (No Lid) (MN). A confirmação da clonagem foi realizada por
digestão (Tabela 3) e PCR (Tabela 4).
33
Tabela 3. Protocolo de preparo e condições de digestão para confirmação de
clonagem.
Tabela 4. Protocolo de preparo e condições de PCR para confirmação da clonagem.
34
2. Preparo do Pool de Spike-In Control
Os plasmídeos utilizados como spike-in control foram linearizados conforme a
Tabela 5. Os plasmídeos linearizados foram quantificados utilizando o ensaio HS
dsDNA do fluorímetro Qubit (Life Technologies). Um pool contendo todas as 21
sequências spike-in control foi preparado. A nomenclatura dos spike-in control, suas
famílias VH e seus números de cópias por microlitro de pool estão ilustrados na Figura
7.
Tabela 5. Protocolo de preparo e condições de linearização dos plasmídeos spike-in
control.
Figura 7. Composição do pool de spike-in control. Nomenclatura, em negrito, família VH e número de cópias por microlitro de cada sequência spike-in control no pool.
35
3. Seleção das Amostras para Determinação de NGS DRM
Este estudo inclui amostras de medula óssea de 45 pacientes com Leucemia
Linfoide Aguda B-derivada, analisadas no Centro Infantil Boldrini, Campinas. Para
realizar a análise de NGS DRM de cada paciente, utilizou-se amostras pareadas D0
e D35, totalizando então 90 amostras utilizadas. Amostras seguimento colhidas entre
os dias 36 a 56 foram utilizadas substituindo a amostra D35 quando necessário,
devido a recoletas na ocasião original da determinação da DRM do paciente por
qPCR. Quarenta e um pacientes e seus responsáveis atestaram participação
voluntária no protocolo GBTLI LLA-2009, que inclui estudo da DRM, através de um
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (em anexo). Os 4 pacientes restantes e
seus responsáveis atestaram participação voluntária no protocolo AIEOP-2009, que
inclui um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido acerca do armazenamento do
material biológico colhido e o seu eventual uso em projetos de pesquisa (em anexo).
O projeto foi aprovado pelo CEP Boldrini com o número CAAE 57280616.4.0000.5376
(em anexo).
As amostras de pacientes diagnosticados com LLA B-derivada foram
escolhidas de forma consecutiva a partir de um dos primeiros pacientes que a ter sua
DRM analisada por qPCR pelo Laboratório de Biologia Molecular do Centro Infantil
Boldrini (paciente com número de laboratório 1665). Foram excluídos dessa seleção
pacientes (1) que foram diagnosticados com outra neoplasia que não a LLA B-
derivada (2) que não tiveram uma DRM de amostra D35 (ou recoleta dessa) analisada
originalmente por qPCR de um clonotipo IgH; (3) cuja amostra D35 não possuísse
DNA em quantidade suficiente para a realização do método de NGS DRM (600 ng)
(4) cuja amostra D0 não possuísse DNA em quantidade suficiente para a realização
do método de NGS DRM (50 ng).
36
4. Isolamento das células mononucleadas
As amostras provenientes da medula óssea dos pacientes, que foram colhidas
em EDTA, são diluídas em solução salina, na proporção de 1:1, e em seguida
centrifugadas em um gradiente de Ficoll Hypaque Plus (GE Healthcare). As células
mononucleares obtidas através desse processo foram então aliquotadas em solução
de isotiocianato de guanidina 4M e tiveram o seu DNA extraído, seguindo o protocolo
do illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), para a utilização no
estudo de qPCR DRM. Esse mesmo DNA foi utilizado para a análise de NGS DRM.
37
5. Quantificação da DRM por NGS
As 90 amostras pareadas foram preparadas e sequenciadas em sets de até 20
amostras, sempre separando D0 e D35. As amostras foram quantificadas utilizando o
ensaio HS dsDNA no fluorímetro Qubit (Life Technologies). Vinte amostras
selecionadas foram amplificadas para sequenciamento conforme a Tabela 6. Para a
Amplicon PCR, 50 ng de gDNA foram utilizados como template em amostras D0,
enquanto 600 ng de gDNA foram utilizados para amostras D35. O pool de moléculas
spike-in control é adicionado apenas no preparo de amostras D35. Os
oligonucleotídeos utilizados nessa primeira etapa de PCR estão descritos na Tabela
7.
Tabela 6. Protocolo de preparo de bibliotecas e condições das duas etapas de PCR
para o método de DRM NGS.
38
Tabela 7. Oligonucleotídeos Biomed2 FR2 acrescidos de caudas 5’ não
complementares, utilizados no preparo das bibliotecas para NGS DRM. Caudas 5’
não-complementares destacadas em verde e em vermelho. Nucleotídeos N inseridos
para elevação artificial da diversidade de amplicons sequenciados destacados em
azul.
VH-FR2
Primer Sequência 5’→ 3’
VH1-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA
VH2-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGG
VH3-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA
VH4-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGG
VH5-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGG
VH6-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAG
VH7-FR2 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAA
JH
Primer Sequência 5’→ 3’
JH-cons R 0N TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACC
JH-cons R 1N TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCTTACCTGAGGAGACGGTGACC
JH-cons R 2N TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCTTACCTGAGGAGACGGTGACC
JH-cons R 3N TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCTTACCTGAGGAGACGGTGACC
As bibliotecas foram purificadas com Agencourt Ampure XP Beads (Beckman
Coulter) conforme a seção PCR Clean-Up 2 do protocolo 16S metagenomic library
preparation (Illumina), utilizando uma proporção de volume beads magnéticas para
volume de biblioteca de 0,7. As bibliotecas foram eluídas em 25 µL de Tris 10 mM pH
8.5.
O aferimento do tamanho dos amplicons alvo em pares de base foi realizado
por eletroforese em gel de agarose 2%. As bibliotecas foram quantificadas utilizando
o ensaio HS dsDNA no fluorímetro Qubit (Life Technologies). A concentração molar
das bibliotecas, em nM, foi determinada através da seguinte fórmula:
concentração em nM = 1000000 x (concentração em ng/µL)
(660 g/mol x tamanho da biblioteca)
39
As bibliotecas foram diluídas a 4 nM em HT1 Hybridization Buffer (Illumina) e
multiplexadas. Em seguida, 5 µL desse pool de bibliotecas é adicionado a 5 µL de 0.2
N NaOH por 5 minutos para desnaturação. O pool desnaturado foi diluído a 8 pM em
HT1. Adicionou-se 60 µL de PhiX control v3 (Illumina) 8 pM desnaturado a 540 µL do
pool desnaturado de bibliotecas. O pool resultante foi aquecido em banho seco a 96
°C por 2 minutos e em seguida resfriado em gelo por 5 minutos. Os 600 µL desse pool
foram adicionados ao Reagent Cartridge (Illumina) para sequenciamento. O
sequenciamento de amostras D0 foi realizado utilizando o MiSeq Reagent Nano Kit
v2 (300-cycles). Amostras D35 foram sequenciadas utilizando o MiSeq Reagente Kit
v3 (150-cycles). Ambos tipos de amostras foram sequenciados por 150 ciclos single-
read.
40
IV. FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os reads gerados pelo software Real Time Analyzer, do sequenciador MiSeq,
são armazenados em arquivos fastq. Um arquivo desse tipo é gerado para cada
amostra sequenciada. Esses reads possuem cerca de 150 pares de base, gerados
por 150 ciclos de sequenciamento single-read (apenas uma das extremidades da
biblioteca é sequenciada). Essa modalidade de sequenciamento foi utilizada tanto em
função do seu menor custo e tempo de execução, como por ter sido capaz de gerar
reads de alta qualidade com comprimento suficiente para identificar a cicatriz V(D)J
da grande maioria dos clonotipos analisados. A análise da qualidade dos dados
gerados foi realizada nos softwares FastQC e MultiQC.
A análise da frequência dos clonotipos presentes em cada amostra foi feita
utilizando a web application do software Vidjil (http://www.vidjil.org). Esse software foi
escolhido por ter sido capaz de identificar e classificar corretamente a maior parte dos
clonotipos leucêmicos IgH analisados, além de ser o único desse tipo a fornecer uma
versão com interface gráfica (GUI), reduzindo o grau de conhecimento e familiaridade
com linhas de comando necessário para um analista clínico determinar a NGS DRM.
Essa plataforma permite agrupar reads de clonotipos V(D)J IgH baseado na
semelhança das suas sequências, determinando suas frequências frente ao restante
da população de clonotipos (Duez et al., 2016). A partir dessa comparação, é possível
observar quais rearranjos IgH correspondem a linfoblastos B malignos, bem como a
suas presenças percentuais na composição da amostra. Em concordância com outros
trabalhos desenvolvidos na área, foi estipulado que um clonotipo IgH presente em
pelo menos 5% da amostra D0 corresponde a um rearranjo leucêmico (Faham et al.,
2012; Gawad et al., 2012; Ladetto et al., 2014; Pulsipher et al., 2015). Clonotipos com
alto grau de semelhança a uma sequência leucêmica foram agrupados a essa
(somando os números de reads) se as três condições a seguir fossem verdadeiras
concomitantemente: (a) esse clonotipo estava entre os 100 mais frequentes de sua
amostra (b) a diferença para o clonotipo leucêmico foi de até três nucleotídeos nos
segmentos VH, DH ou JH (c) a diferença para o clonotipo leucêmico foi de no máximo
um nucleotídeo na região de inserções aleatórias N. Através da identificação das
41
sequências leucêmicas a partir da amostra D0, é possível analisar também a
frequência desses clonotipos neoplásicos na amostra D35 do mesmo paciente.
O número de reads gerado por cada molécula spike-in control sequenciada foi
identificado através da sequência V(D)J conhecida associada àquela molécula. Os
dados desses controles foram então utilizados para normalizar os reads de clonotipos
leucêmicos em valores de NGS DRM, conforme previamente ilustrado na Figura 5.
Enfim, os resultados finais obtidos puderam ser comparados aos estudos
retrospectivos por qPCR da mesma amostra.
A análise estatística dos resultados finais de validação do método de NGS DRM
foi realizada utilizando um nível de significância correspondente a p < 0.05. A
comparação entre os dados de qPCR DRM e NGS DRM foi realizada de forma
pareada pelo coeficiente de correlação de Pearson no programa Google Sheets.
42
V. RESULTADOS
1. Padronização da Amplicon PCR
O processo de padronização do preparo e condições de reação de Amplicon
PCR, que resultou no método anteriormente ilustrado na Tabela 6, encontra-se
descrito a seguir. Uma vez que apenas a Amplicon PCR foi realizada nessa etapa de
padronização, utilizou-se de 25 a 35 ciclos de reação, possibilitando a avaliação de
seus resultados por eletroforese em gel 2%.
1.1. Teste de Enzimas: Phusion vs Tth
As enzimas Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) e
Tth DNA Polymerase (Sigma Aldrich) foram testadas e comparadas. Como template,
utilizou-se três pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA
de PBMC saudável (Peripheral Blood Mononucleated Cells), nas proporções 5 x 10-5,
5 x 10-4 e 10-3. Também foi utilizada uma amostra de PBMC pura e uma amostra D0
da mesma leucemia usada para preparar a diluição seriada. Foram utilizados 50 ng
de gDNA para cada amostra amplificada. O resultado obtido por eletroforese em gel
de agarose 2% está representado na Figura 8.
43
Foram observadas bandas com tamanhos correspondentes aos amplicons de
rearranjos V(D)J de IgH utilizando as duas enzimas testadas. No entanto, ambas as
condições também apresentaram alto índice de formação de primer-dimer e baixa
uniformidade entre as bandas observadas.
Figura 8. Comparação das enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).
44
1.2. Touchdown PCR
Buscando elevar a especificidade da reação para reduzir a formação de primer-
dimer previamente observada, testou-se a elevação da temperatura de anelamento
utilizada em 2 °C, juntamente ao uso de uma touchdown PCR durante os 5 primeiros
ciclos da reação. Como template, utilizou-se três pontos de uma curva-padrão de
gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável, nas proporções 5 x 10-5, 5 x
10-4 e 10-3. Também foi utilizada uma amostra de PBMC pura e uma amostra D0 da
mesma leucemia usada para preparar a diluição seriada. Foram utilizados 600 ng de
gDNA para cada amostra amplificada, excetuando D0, para qual utilizou-se 50 ng de
gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado
na Figura 9.
45
Apenas o uso de touchdown PCR foi pouco efetivo na redução da formação de
primer-dimers. A PCR utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase
continuou por apresentar baixa uniformidade entre as bandas observadas. A PCR
utilizando a enzima Tth DNA Polymerase apresentou a formação de amplicons não
identificados de cerca de 150 pares de base.
Figura 9. Efeito do uso de Touchdown PCR na comparação entre as enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).
46
1.3. Redução da Concentração de Primers
A concentração do pool de oligonucleotídeos no volume final da PCR foi
reduzida de 200 nM para 100 nM para tentar, em conjunto a touchdown PCR
previamente descrita, reduzir a formação de primer-dimer. Como template, utilizou-se
três pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC
saudável, nas proporções 5 x 10-5, 5 x 10-4 e 10-3. Também foi utilizada uma amostra
de PBMC pura e uma amostra D0 da mesma leucemia usada para preparar a diluição
seriada. Foram utilizados 600 ng de gDNA para cada amostra amplificada, excetuando
D0, para qual utilizou-se 50 ng de gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel
de agarose 2% está representado na Figura 10.
47
A redução da concentração de primers na Amplicon PCR com Phusion High-
Fidelity DNA Polymerase diminuiu fortemente a formação de primer-dimer. Observou-
se também a formação de amplicons não identificados com cerca de 550 pares de
base. Esse DNA, no entanto, não compromete a determinação da NGS DRM, uma
vez que o seu tamanho é consideravelmente maior que o do amplicon alvo da técnica.
Desse modo, as sequências de rearranjos V(D)J IgH se ligam a flow cell em taxas
muito maiores que esse amplicon maior. O mesmo efeito positivo não foi observado
Figura 10. Efeito da redução da concentração de primers na comparação entre as enzimas Phusion High Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA Polymerase. Bandas esperadas de rearranjos V(D)J de IgH destacadas em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Bandas de cerca de 120 pares de base correspondem a primer-dimer. Bandas de cerca de 60 pares de bases correspondem a resto de primer. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).
48
na Amplicon PCR com Tth DNA Polymerase, na qual a formação de primer-dimer
ainda foi bastante pronunciada.
1.4. Teste da Enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase
Considerando a natureza do método de NGS DRM, de possível integração à
rotina clínica de centros de diagnóstico de biologia molecular, buscamos substituir a
enzima Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pela GoTaq G2 Hot Start DNA
Polymerase (Promega), uma alternativa cerca de cinco vezes mais barata e com maior
disponibilidade a pronta entrega. A Amplicon PCR com essa enzima foi testada
mantendo os parâmetros anteriormente determinados (redução de concentração de
primers e uso de touchdown PCR).
Como template, utilizou-se um ponto de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B
derivada em gDNA de PBMC saudável, na proporção 10-2. Foram utilizados 600 ng
de gDNA. O resultado obtido por eletroforese em gel de agarose 2% está representado
na Figura 11.
49
O amplicon de rearranjo V(D)J de IgH foi observado através de uma banda
nítida correspondente a cerca de 300 pares de base, enquanto a taxa de formação de
primer-dimer foi baixa, representada através de uma banda quase inexistente
correspondente a cerca de 120 pares de base. Por fim, a banda não identificada de
cerca de 550 pares de base continua presente, mas em níveis menores que os
observados utilizando as enzimas Phusion High-Fidelity DNA Polymerase e Tth DNA
Polymerase. Desse modo, padronizou-se o preparo de bibliotecas para DRM NGS
com a enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase.
Figura 11. Teste da Amplicon PCR utilizando a enzima GoTaq G2 Hot Start DNA Polymerase. Banda esperada de rearranjos V(D)J de IgH destacada em vermelho (cerca de 300 pares de base). Controle negativo representado por NC. Ladder 1 Kb plus (ThermoFisher Scientific).
50
2. Número de Ciclos de PCR
Esse ensaio foi realizado utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA
Polymerase, uma vez que ela ainda não havia sido substituída pela GoTaq G2 Hot
Start DNA Polymerase.
Os valores 17, 20, 23 e 25 foram testados como o número de ciclos a ser
utilizado na primeira PCR do preparo das bibliotecas para sequenciamento, com o
intuito de reduzir um possível viés de amplificação ocasionado pela reação multiplex.
A segunda PCR foi realizada de modo a completar 40 ciclos totais para as duas
reações. O ensaio utilizou como template, para cada condição testada, dois pontos de
uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável nas
proporções 10-4, 10-3, além de uma amostra D0 da mesma leucemia usada para
preparar a diluição seriada. Foram utilizados 600 ng de gDNA para cada amostra
amplificada, excetuando D0, para qual se utilizou 50 ng de gDNA. A qualidade dos
dados gerados pelo sequenciamento foi analisada utilizando os softwares FastQC e
MultiQC (Figura 12) enquanto a análise dos dados em si utilizou o software Vidjil
(Figura 13).
P
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d S
co
re
Position (bp)
Figura 12. Controle de qualidade no software MultiQC do sequenciamento do ensaio para análise do número de ciclos de PCR. Cada linha representa o Phred score médio por base dos reads de uma das amostras sequenciadas. Scores acima de 30 (Q30), representados na porção verde do gráfico, são considerados como apresentando boa qualidade.
51
As porcentagens equivalentes à frequência do clonotipo leucêmico de cada
amostra sequenciada estão representadas nas Tabela 8 abaixo.
Tabela 8. Resumo da frequência do clonotipo leucêmico por amostra. A amostra D0
amplificada na primeira PCR por 17 ciclos apresentou problemas no seu preparo de
biblioteca, impedindo o prosseguimento da sua análise.
Número de Ciclos / Curva-Padrão
10-4 10-3 D0
17 0.036% 0.176% -
20 0.078% 0.230% 86.20%
23 0.012% 0.265% 83.13%
25 0.024% 0.217% 74.63%
Através da análise dos dados gerados, determinou-se 25 ciclos de reação na
primeira etapa do preparo das bibliotecas para sequenciamento como o valor ideal,
uma vez que a diferença esperada de dez vezes da frequência do clonotipo leucêmico
entre os pontos 10-4 e 10-3 da diluição foi observada apenas nas amostras preparadas
dessa maneira. No mais, através da análise do controle de qualidade dos dados
gerados, é possível observar que amostras preparadas com números maiores de
ciclos de PCR tendem a apresentar maiores Phred scores. Os valores abaixo de Q30
Figura 13. Análise do sequenciamento no software Vidjil para análise do número de ciclos de PCR. Cada linha no gráfico representa a frequência de um clonotipo V(D)J ao longo das amostras da curva-padrão. O clonotipo correspondente à célula leucêmica está representado em vermelho. A análise exemplificada acima correspondente às amostras preparadas com 25 ciclos de PCR, com um gráfico similar havendo sido gerado para cada condição testada (17, 20 e 23 ciclos).
52
observados para algumas amostras estiveram majoritariamente associados às
amostras preparadas utilizando 17 ciclos de PCR na primeira etapa e às amostras D0,
possivelmente pelo uso de menores quantidades de DNA em relação à curva-padrão.
53
3. Teste de Concentração de PhiX
Esse ensaio foi realizado utilizando a enzima Phusion High-Fidelity DNA
Polymerase, uma vez que ela ainda não havia sido substituída pela GoTaq G2 Hot
Start DNA Polymerase.
A concentração mínima de PhiX usualmente recomendada pela Illumina para
NGS de amplicons é de 20% da quantidade total de moléculas no pool da biblioteca
sequenciada. Isso corresponde a 20% de seu volume quando o pool de PhiX utilizado
tem a mesma concentração molar do pool de bibliotecas em questão. No entanto, em
função da elevação artificial da diversidade de amplicons causada pelos nucleotídeos
N adicionados às variantes do primer Biomed2 JH consenso utilizadas na Amplicon
PCR, a concentração mínima de PhiX acionada ao pool de bibliotecas pode ser
reduzida.
Foram testadas então diferentes concentrações de PhiX para o
sequenciamento de bibliotecas para NGS DRM. Para isso, utilizou-se como template
um ponto de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC
saudável, na proporção 10-3. Essa amostra foi sequenciada 3 vezes, em corridas de
sequenciamento distinta. Foram utilizados 600 ng de gDNA da amostra no preparo de
sua biblioteca. A cada corrida realizada, diferentes volumes de PhiX 8pM foram
adicionados ao pool de bibliotecas 8pM para sequenciamento. Os valores testados
foram: 10% do volume do pool de bibliotecas (60 µL de PhiX e 540 µL de pool), 7,5%
(45 µL de PhiX e 555 µL de pool) e 5% (30 µL de PhiX e 570 µL de pool).
As amostras contendo 10% e 7,5% de PhiX não apresentaram problemas em
suas corridas, com altas taxas de clusters aprovados pelo filtro de qualidade do
aparelho (%PF) e boas médias de nucleotídeos sequenciados que atingiram níveis de
qualidade Q30 (Avg %Q30). Já a amostra contendo 5% de PhiX teve a sua corrida
interrompida em função da baixa qualidade de clusters observada (Figura 14). A
frequência do clonotipo leucêmico observada para ambas as amostras de fato
sequenciadas foi bastante semelhante, sendo de 0,803% para a amostra contendo
10% de PhiX e de 0,809% para 7,5% de PhiX. Ambas as condições, portanto,
mostraram-se apropriadas para o método de DRM NGS. No entanto, padronizou-se
10% de PhiX como o volume padrão adicionado ao pool de bibliotecas, mantendo-se
54
esse fator mais distante do seu threshold de falha, reduzindo a chance de ocorrerem
erros no sequenciamento ligados a baixa diversidade de amplicons.
Figura 14. Resumo dos parâmetros de qualidade para corridas com diferentes
concentrações de PhiX. Taxa de clusters aprovados pelo filtro de qualidade do MiSeq representada por %PF. Média de nucleotídeos sequenciados que atingiram níveis de qualidade Q30 representada por Avg %Q30.
55
4. Spike-in Control
Os ensaios para testar o uso de moléculas spike-in control utilizaram apenas 9
das 21 sequências de rearranjo V(D)J de IgH clonadas descritas na Tabela 1S. As
sequências spike-in control utilizadas, o seu número de cópias adicionado às
amostras sequenciadas, bem como suas famílias VH, estão representadas na Figura
15.
4.1. Teste do uso de Spike-In Controls para Determinar NGS DRM
O ensaio foi realizado utilizando três pontos de uma curva-padrão de gDNA de
LLA-B derivada em gDNA de PBMC saudável, nas proporções 5 x 10-5, 5 x 10-4 e 5 x
10-3. O rearranjo V(D)J de IgH da LLA-B derivada utilizada possuía seu segmento VH
pertencente à família 6. Foram utilizados 600 ng de gDNA para cada amostra
amplificada. A qualidade dos dados gerados pelo sequenciamento foi analisada
utilizando os softwares FastQC e MultiQC (Figura 16) enquanto a análise dos dados
em si utilizou o software Vidjil (Figura 17).
Figura 15. Número de cópias de cada spike-in control adicionado às amostras para determinação de NGS DRM. Nome, família VH e número de cópias de cada spike-in control utilizado. O rearranjos V(D)J de IgH dos controles apresentavam segmentos VH das famílias 1 (vermelho), 2 (azul) ou 3 (verde). Escala considerando 100 (100%) como 200.000 genomas (100.000 células), ou 600 ng de DNA.
56
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d S
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re
Position (bp)
Figura 16 Controle de qualidade no software MultiQC do sequenciamento do ensaio para análise do spike-in control. Cada linha representa o Phred score médio por par de base dos reads de uma das amostras sequenciadas. Scores acima de Q30 (porção verde do gráfico) são considerados como apresentando boa qualidade.
Figura 17. Análise do sequenciamento no software Vidjil para determinação de NGS DRM. Cada linha no gráfico representa a frequência de um clonotipo V(D)J ao longo das amostras da curva-padrão. O clonotipo correspondente à célula leucêmica está representado em vermelho. Os clonotipos provenientes de um spike-in control contendo um rearranjo VH1 estão representados em azul, contendo VH2 em rosa e contendo VH3 em verde. As porcentagens representadas na legenda correspondem ao ponto 5 x 10-3 da curva-padrão sequenciada.
57
Tanto o clonotipo correspondente ao linfoblasto leucêmico, quanto os
clonotipos correspondentes a sete dos nove spike-in control adicionados, foram
identificados utilizando a web application do software Vidjil. No entanto, dois clonotipos
de spike-in control (2047 e 2227, das famílias VH2 e VH3 respectivamente) não foram
observados nessa versão do software. No entanto, através da execução desse
programa em sua versão CLI, foi possível identificar esses dois clonotipos restantes
através da modificação dos parâmetros de número máximo de clones computados
contendo uma sequência consenso (de 100 para 1000) e de número máximo de
clones a serem analisados com uma designação V(D)J completa (de 100 para 1000).
O comando utilizado para a execução do algoritmo encontra-se a seguir:
<path_to_vidjil> -c clones -g <path_to_germline> -2 -3 -y 1000 -z 1000 -l
<file_containing_the_sequences_of_interest> -F <fastq_file>
Os valores de NGS DRM para as três amostras sequenciadas foram
determinados através do uso das nove sequências de spike-in control, conforme o
método explanado previamente na Figura 5. Para análises de regressão linear,
valores de DRM são convertidos para uma escala logarítmica em base 10, em função
da vasta gama de valores que os números absolutos de DRM abrangem. Um resumo
desses valores de NGS DRM obtidos estão representados na Figura 18.
58
Através da análise dos dados de NGS DRM obtidos, é possível observar que
todos os valores corrigidos através do uso do spike-in control se encontram bastante
elevados, apresentando erros de fold change mais de uma ordem de grandeza acima
do esperado. Esse resultado evidencia uma possível subamplificação dos spike-in
control em relação ao restante do DNA presente na biblioteca para sequenciamento.
4.2. Teste do uso de Spike-In Controls linearizados para Determinar NGS DRM
Partindo da subamplificação observada das moléculas spike-in control durante
o preparo das bibliotecas para sequenciamento, hipotetizou-se que a estrutura
supercoiled dos plasmídeos no qual esses controles se encontram poderia estar
prejudicando a ocorrência da PCR em condições ótimas nessas moléculas. Assim
sendo, realizou-se um experimento comparando a NGS DRM de amostras contendo
supercoiled spike-in controls a amostras contendo spike-in controls linearizados.
Figura 18. Comparação da NGS DRM determinada através do uso de diferentes conjuntos de spike-in control. Representação dos valores de -log10 de NGS DRM para as três amostras sequenciadas (5 x 10-5, 5 x 10-4 e 5 x 10-3) calculados através do uso do spike-in control utilizados (azul). Os valores esperados de DRM para as amostras estão representados em vermelho. Valores de DRM em unidade arbitrária.
59
O ensaio foi realizado utilizando, para ambas as condições testadas, três
pontos de uma curva-padrão de gDNA de LLA-B derivada em gDNA de PBMC
saudável, nas proporções 5 x 10-5, 5 x 10-4 e 5 x 10-3. O rearranjo V(D)J da LLA-B
derivada utilizada possuía seu segmento VH pertencente a família 6. Foram utilizados
600 ng de gDNA para cada amostra amplificada. A qualidade dos dados gerados pelo
sequenciamento foi analisada utilizando os softwares FastQC e MultiQC (Figura 19)
enquanto a análise dos dados em si utilizou o software Vidjil (Figura 20).
P
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Position (bp)
Figura 19. Controle de qualidade no software MultiQC do sequenciamento do ensaio para comparação do supercoiled spike-in control ao spike-in control linear. Cada linha representa o Phred score médio por par de base dos reads de uma das amostras sequenciadas. Scores acima de Q30 (porção verde do gráfico) são considerados como apresentando uma boa qualidade.
60
A NGS DRM para todas as seis amostras sequenciadas foi determinada,
novamente utilizando o método descrito anteriormente. Desse modo, comparou-se os
valores de NGS DRM obtidos através da normalização por spike-in controls
linearizados ou por supercoiled spike-in controls aos valores de DRM esperados para
essas amostras (Figura 21).
Figura 20. Análise do sequenciamento no software Vidjil para comparação de valores de NGS DRM determinados por supercoiled spike-in control ou por spike-in control linear. Cada linha no gráfico representa a frequência de um clonotipo V(D)J ao longo das amostras da curva-padrão. O clonotipo correspondente à célula leucêmica está representado em vermelho. Os clonotipos provenientes de um spike-in control contendo um rearranjo VH1 estão representados em azul, contendo VH2 em rosa e contendo VH3 em verde. O gráfico apresentado corresponde às amostras contendo o spike-in control linearizado, com um gráfico semelhante havendo sido gerado para as amostras contendo o controle supercoiled. As porcentagens representadas na legenda correspondem ao ponto 5 x 10-3 da curva-padrão contendo spike-in controls linearizados.
61
Através dessa análise, é possível observar que a linearização dos plasmídeos
contendo os spike-in control evitou a sua subamplificação, permitindo a determinação
de valores de NGS DRM muito mais próximos ao esperado, quando comparado aos
plasmídeos não-linearizados. Desse modo, padronizou-se o uso de moléculas spike-
in controls linearizadas no método de NGS DRM. Todos os experimentos descritos a
partir desse teste foram realizados com plasmídeos spike-in control linearizados.
4.3. Teste de Amplificação Diferencial de Moléculas Spike-In Control
Rearranjos V(D)J de IgH com famílias VH distintas são amplificadas por
diferentes forward primers na etapa de Amplicon PCR do método de NGS DRM.
Desse modo, foi testado se a determinação da NGS DRM é afetada ao se utilizar
nesse cálculo todos os spike-in controls adicionados à amostra (General NGS MRD),
ou apenas as moléculas com famílias VH1 (VH1 NGS MRD), VH2 (VH2 NGS MRD)
Figura 21. Comparação da NGS DRM determinada através do uso de spike-in control linearizado ou supercoiled. Representação dos valores de -log10 NGS DRM para as amostras sequenciadas, que receberam supercoiled spike-in control (em azul) ou spike-in control linearizado (em verde). A DRM esperada para as amostras está representada em vermelho. Valores de DRM em unidade arbitrária.
62
ou VH3 (VH3 NGS MRD) (Figura 22). Essa análise foi realizada a partir dos dados
obtidos para as amostras contendo controles linearizados do experimento descrito na
seção anterior.
Observou-se que valores de NGS DRM normalizados a partir de sequências
contendo segmentos VH3 tendem a serem mais altos do que os normalizados
utilizando sequências de família VH1 ou VH2. Isso indica um possível efeito de
amplificação diferencial entre os controles contendo segmentos VH de diferentes
famílias. Esse efeito pode se estender às sequências de rearranjo V(D)J da amostra
na qual se determina a NGS DRM. Desse modo, notou-se a necessidade de um
estudo mais profundo sobre melhor forma de utilização dos spike-in controls para a
normalização dos reads obtidos durante o sequenciamento em dados de NGS DRM.
Portanto, para a etapa de validação do método de NGS DRM, comparamos os valores
Figura 22. Comparação da NGS DRM determinada através do uso de diferentes conjuntos de spike-in control linearizado. Representação dos valores de -log10 NGS DRM das amostras sequenciadas, calculados através do uso de todos os spike-in control utilizados (General NGS MRD, em marrom), ou utilizando apenas os controles contendo sequências com família VH1 (VH1 NGS MRD, em azul), VH2 (VH2 NGS MRD, em rosa) ou VH3 (VH3 NGS MRD, em verde). A DRM esperada para as amostras está representada em vermelho. Valores de DRM em unidade arbitrária.
63
de NGS DRM obtidos ao normalizar os reads dos clonotipos leucêmicos das amostras
por todos os spike-in controls nela adicionados ou apenas pelos spike-in controls com
segmento VH de mesma família que a de cada clonotipo leucêmico de cada amostra.
64
5. Validação do Método de NGS DRM
5.1. Desenho Experimental
A metodologia completa para essa etapa de validação está descrita nas seções
anteriores “Métodos” e “Forma de Análise dos Resultados”.
A etapa de validação do método de NGS DRM utilizou todas as 21 moléculas
de spike-in control clonadas, na forma do pool descrito na Figura 6. O número de
cópias de cada molécula controle adicionada às amostras foi alterado em relação à
seção anterior. Essa alteração visa permitir a adição de mais tipos de spike-in control
a cada amostra, sem elevar a quantidade total de moléculas controle utilizadas. O
número de moléculas de cada spike-in control adicionado às amostras, bem como os
seus nomes e famílias, estão representados na Figura 23.
Foram sequenciadas 90 amostras pareadas D0 e D35 de 45 pacientes com
Leucemia Linfoide Aguda B-derivada. No total, 58 clonotipos IgH leucêmicos haviam
sido analisados por qPCR para essas amostras, uma vez que alguns pacientes podem
apresentar mais de um marcador IgH associado a linfoblastos leucêmicos. Três
desses clonotipos IgH leucêmicos analisados por qPCR não foram identificados pelo
método de NGS DRM, sendo excluídos das análises. Desse modo, 55 clonotipos
leucêmicos foram analisados por NGS DRM.
Figura 23. Número de cópias de cada spike-in control adicionado às amostras para sequenciamento. Nomenclatura, família e número de cópias de cada spike-in control utilizado. Escala considerando 100 (100%) como 200.000 genomas (100.000 células), ou 600 ng de DNA.
65
Dois valores de NGS DRM foram estimados para cada um dos 55 clonotipos
analisados: um normalizando as frequências dos clonotipos leucêmicos através do
uso de todas as 21 sequências spike-in control e um utilizando apenas as três
sequências spike-in control específicas à família VH de cada clonotipo leucêmico.
Esses valores foram denominados, respectivamente, NGS DRM Geral e NGS DRM
Família. Desse modo, totalizou-se 110 valores de NGS DRM calculados, consistindo
em 55 NGS DRM Geral e 55 NGS DRM Família. Esses resultados foram então
comparados à qPCR DRM e entre si.
5.2. Análise da Qualidade dos Dados do Sequenciamento
A qualidade dos dados gerados pelo sequenciamento foi analisada utilizando
os softwares FastQC e MultiQC (Figura 24) enquanto a análise dos dados em si
utilizou o software Vidjil.
Figura 24. Controle de qualidade no software MultiQC do sequenciamento do ensaio de validação do método de DRM por NGS. Cada linha representa o Phred score médio por par de base dos reads de uma das amostras sequenciadas. Scores acima de Q30 (porção verde do gráfico) são considerados como apresentando boa qualidade.
66
5.3. Comparação do Número de Clonotipos Leucêmicos Identificados por NGS DRM
e qPCR DRM
Como anteriormente mencionado, 58 clonotipos leucêmicos haviam sido
analisados por qPCR DRM para os 45 pacientes selecionados para essa validação de
método. Pacientes que possuíam 2 sequências de rearranjo V(D)J de IgH exploradas
por esse método requereram a síntese de 2 primers paciente-específicos. Desses 58
clonotipos, a NGS DRM foi capaz de identificar e acompanhar 55.
Já a NGS DRM foi capaz de identificar 87 clonotipos leucêmicos para esses 45
pacientes, sem requerer nenhum esforço adicional para acompanhá-los.
5.4. Comparação entre qPCR DRM e NGS DRM
Inicialmente, foram definidos quais critérios seriam utilizados para avaliar o
resultado de NGS DRM em comparação ao qPCR DRM, não de um ponto de vista
matemático, mas considerando a sua relevância clínica. Consideraram-se
satisfatórios resultados de NGS DRM com fold change menor que 5 em relação a
qPCR DRM. Uma vez que o ponto de corte para o ajuste de terapia no GBTLI LLA
2009 é de 1 x 10-3, resultados de NGS DRM com diferença absoluta igual ou menor a
1 x 10-4 em relação à qPCR DRM também foram considerados satisfatórios,
independentemente do valor do fold change. O resumo dos valores de NGS DRM
obtidos, bem como o resultado dessa categorização encontram-se na Tabela 9.
67
Tabela 9. Resumo dos valores de qPCR DRM, NGS DRM Geral e NGS DRM Família
para os 55 clonotipos leucêmicos analisados. Valores de NGS DRM em verde indicam
resultados considerados satisfatórios pelo critério adotado (Diferença Absoluta ≤ 1 x
10-4 ou Fold Change ≤ 5). Valores em vermelho indicam resultados considerados
insatisfatórios por esse mesmo critério (Diferença Absoluta > 1 x 10-4 e Fold Change
> 5). As demarcações entre as linhas agrupam amostras D35 sequenciadas em uma
mesma Flow Cell.
68
69
Tendo como base essa análise, a determinação das NGS DRM Geral para
cada clonotipo leucêmico observado resultou em 51 dos 55 (92,7%) resultados para
esses marcadores serem considerados satisfatórios. Já a determinação das NGS
DRM Família de cada clonotipo leucêmico resultou em 50 de 55 (90,9%) valores
satisfatórios.
O índice de correlação entre as de qPCR DRM e NGS DRM foi determinado
através do coeficiente de Pearson. Clonotipos leucêmicos que possuem alguma das
suas DRM (esperada, geral ou família) com valor 0 e cujos demais valores de DRM
também são 0 ou são menores que 1 x 10-4 foram excluídos dessa análise, uma vez
que se tratam de grandezas muitos pequenas e próximas que, no entanto, introduzem
erros à avaliação, uma vez que valores decimais pequenos se tornam mais distantes
de 0 quando convertidos a escala logarítmica. A representação visual da correlação
obtida através de regressão linear entre os valores de qPCR DRM e NGS DRM e,
bem como o seu coeficiente de correlação de Pearson, estão representados na Figura
25.
Um clonotipo leucêmico incluído na análise da NGS DRM Geral não pode ser
incluída na análise de NGS DRM Família, uma vez que a sua DRM calculada por esse
método teve um valor menor que 0. Valores negativos não podem ser convertidos a
uma escala log10, além de não possuírem significado biológico.
70
Figura 25. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson entre qPCR DRM e NGS DRM Geral e entre qPCR DRM e NGS DRM Família. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson (R) determinado através da conversão dos valores de DRM para uma escala -log10. Valores de DRM representados em unidade arbitrária. Valores de R acima de 0,7 indicam correlação forte entre ambas as variáveis (qPCR DRM e NGS DRM). Ambas correlações são estatisticamente significativas tendo p < 0.05.
71
5.5. Determinação de Subamplificação de Sequências Spike-In Control
As 50 amostras D35 analisadas por NGS descritas nessa dissertação podem
ser divididas em três subsets em relação ao preparo de suas bibliotecas, uma vez que
o seu sequenciamento se deu em três levas, conforme previamente evidenciado na
Tabela 9. Com base nessa divisão, é possível observar que o índice de valores de
NGS DRM determinados insatisfatórios encontra-se mais elevado no terceiro subset
de sequenciamento em relação aos dois primeiros, tanto levando-se em consideração
a NGS DRM Geral (14,3% contra 4,5% e 5,2%) e a NGS DRM Família (14,3% contra
4,5% e 10,5%). É também possível observar que esse terceiro subset apresenta uma
média de fold change entre a NGS DRM e qPCR DRM bastante elevada em relação
aos outros dois subsets, conforme ilustrado na Figura 26.
Uma possível explicação para esse fenômeno consiste em uma produção de
reads associados a spike-in controls menor que a esperada no sequenciamento. Para
avaliar essa hipótese, calculou-se, para cada amostra, a razão do total de reads
analisado pelo total de reads correspondente a moléculas spike-in control,
Figura 26. Comparação da fold change média entre subsets de amostras. Subsets definidos como amostras cujas bibliotecas foram preparadas juntas e sequenciadas em uma mesma flow cell. Barras azuis representam médias de fold changes correspondentes a NGS DRM Geral. Barras vermelhas representam médias de fold changes correspondentes a NGS DRM Família. Fold change representada em unidade arbitrária.
72
denominado coeficiente de amplificação spike-in. Desse modo, maiores valores desse
coeficiente para uma amostra indicam uma menor frequência relativa de reads
associados a sequências spike-in control. Assim sendo, a média e a mediana do
coeficiente de amplificação spike-in para o terceiro subset e para as demais amostras
foi determinado, como ilustrado na Figura 27.
Observou-se diferença entre o coeficiente de amplificação spike-in médio do
terceiro subset em relação às demais amostras. O mesmo efeito foi verificado para a
mediana desse coeficiente. Essa diferença confirma a menor frequência relativa de
reads relacionados a moléculas spike-in control nesse subset. Hipotetiza-se que esse
processo possa decorrer tanto de uma subamplificação das sequências spike-in
control adicionadas às amostras D35, em função de algum grau de degradação do
pool dessas moléculas, como também de erros na adição desse pool a essas
amostras.
No entanto, é importante notar, independente da fonte de erro, que o
coeficiente de amplificação spike-in permite identificar casos de NGS DRM com taxas
de reads de spike-in controls alteradas. Desse modo, através de futuras comparações
entre NGS DRM e qPCR DRM, será possível confirmar se corridas de
Figura 27. Comparação entre a média e mediana dos coeficientes de amplificação spike-in do terceiro subset e as demais amostras sequenciadas. Coeficiente de amplificação spike-in médio representado em azul. Mediana do coeficiente de amplificação spike-in representada em vermelho. Coeficiente de amplificação spike-in representado em unidade arbitrária.
73
sequenciamento com essas taxas alteradas estão de fato associadas a maiores níveis
de erro de fold change em relação às DRM esperadas. Caso essa correlação se
confirme, esse coeficiente de amplificação spike-in pode ser estabelecido como um
identificador de corridas de sequenciamento com possíveis erros em relação ao total
de amplicons spike-in control sequenciados.
5.6. Comparação entre qPCR DRM e NGS DRM Excluindo o Terceiro Subset
Em função do erro identificado no sequenciamento do terceiro subset de
amostras sequenciadas em uma mesma flow cell, análises e comparações realizadas
anteriormente entre os valores de qPCR DRM e NGS DRM das amostras
sequenciadas para validação do método foram realizadas novamente, à exclusão
desse terceiro subset.
Nesse contexto, 39 dos 41 (95,1%) valores de NGS DRM Geral determinados
para os clonotipos leucêmicos analisados foram considerados satisfatórios pelo
critério previamente determinado. Já para os valores de NGS DRM Família para esses
mesmos clonotipos, a taxa de amostras satisfatórias correspondeu a 38 de 41
(92,7%). O cálculo do coeficiente de correlação de Pearson para esse conjunto de
resultados de NGS DRM Geral e NGS DRM Família seguiu os mesmos critérios de
exclusão de clonotipos e conversão logarítmica utilizados anteriormente. A correlação
por regressão linear bem como o coeficiente de correlação de Pearson entre os
valores de qPCR DRM e NGS DRM estão representados na Figura 28.
74
Figura 28. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson entre qPCR DRM e NGS DRM Geral e entre qPCR DRM e NGS DRM Família, à exclusão do terceiro subset de amostras sequenciadas em uma mesma Flow Cell. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson (R) determinado através da conversão dos valores de DRM para uma escala -log10. Valores de DRM representados em unidade arbitrária. Valores de R acima de 0,7 indicam correlação forte entre ambas as variáveis (qPCR DRM e NGS DRM). Ambas correlações são estatisticamente significativas tendo p < 0.05.
75
5.7. Comparação entre qPCR DRM e Frequência dos Clonotipos Leucêmicos
Para efeito de comparação à NGS DRM, foi determinada a correlação entre a
frequência dos clonotipos leucêmicos e os resultados esperados de qPCR DRM. A
frequência de um clonotipo leucêmico pode ser determinada através da fórmula a
seguir:
frequência = reads clonotipo leucêmico/(total de reads - reads spike-in)
Uma vez que a frequência de um clonotipo leucêmico não consiste em uma
DRM, não é possível avaliar a relevância clínica desses resultados em relação a qPCR
DRM. Desse modo, apenas o grau de correlação entre essas variáveis foi
determinado, através do coeficiente de correlação de Pearson. Fez-se o uso do
mesmo critério de exclusão de clonotipos previamente utilizado na determinação do
índice de correlação entre NGS DRM e qPCR DRM. A análise foi realizada tanto
considerando o conjunto total de clonotipos não excluídos por esse critério, bem como
realizando também a exclusão dos clonotipos referentes ao terceiro subset de
amostras sequenciadas (Figura 29).
76
Figura 29. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson entre qPCR DRM e frequência dos clonotipos leucêmicos. Análise realizada considerando (acima) e excluindo (abaixo) o terceiro subset de amostras. Regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson (R) determinado através da conversão dos valores de DRM para uma escala -log10. Valores de DRM e Frequência de Clonotipo representados em unidade arbitrária. Valores de R acima de 0,7 indicam correlação forte entre ambas as variáveis (qPCR DRM e NGS DRM). Ambas correlações são estatisticamente significativas tendo p < 0.05.
77
Foi possível observar um grau de correlação entre a frequência dos clonotipos
leucêmicos e as suas qPCR DRM. No entanto, esse grau de correlação foi inferior aos
índices obtidos através da normalização das frequências pelo sistema de spike-in
control. Além do mais, a não correção da frequência dos clonotipos leucêmicos em
valores de DRM resultou em fold changes entre uma e duas ordens de grandeza
maiores que a qPCR DRM. Esse fator dificulta a correlação dessas frequências a
prognósticos clínicos dentro dos parâmetros já estabelecidos e padronizados para
DRM.
78
6. Comparação de Custo entre qPCR DRM e NGS DRM
Os custos dos métodos para a quantificação de DRM por qPCR e NGS foram
comparados (Tabela 10). Nessa análise, determinou-se o custo por paciente da
determinação da DRM por análise de marcadores IgH. Para a determinação de DRM
por qPCR, é aconselhável o acompanhamento de pelo menos menos dois marcadores
moleculares por paciente. Desse modo, considerou-se o custo do acompanhamento
de dois marcadores IgH por paciente. Já para a quantificação de DRM por NGS, levou-
se em consideração o custo por paciente da corrida de duas flow cells (uma para a
análise de amostras D0 e uma para D35) contendo amostras de 20 pacientes cada.
Os preços dos reagentes consumíveis utilizados nessa análise financeira foram
embasados em cotações obtidas durante o ano de 2018. Os valores de mão de obra
considerados foram baseados no valor de uma bolsa de Treinamento Técnico V a
partir de setembro de 2018 (R$ 7372,40).
Através dessa análise financeira, constatou-se um custo de R$ 1162,18 por
paciente para a quantificação de DRM através no método de qPCR DRM e de R$
520,32 através da NGS DRM.
Tabela 10. Comparação dos custos da quantificação de DRM por paciente através
dos métodos de qPCR DRM e NGS DRM. Valores monetários expressos em Reais.
79
VI. DISCUSSÃO
A LLA é o câncer mais prevalente em crianças, correspondendo a cerca de
25% das neoplasias malignas nessa faixa etária. Apesar dos altos índices de
sobrevida livre atingidos pelos protocolos de tratamento atuais (cerca de 90%), ainda
existe muito espaço para melhorias, uma vez que apenas entre 20% a 35% das
crianças que apresentam relapso após remissão clínica sobrevivem, por exemplo.
Nesse contexto, a determinação da DRM desses pacientes em diferentes time
points ao longo do seu tratamento se caracteriza como um dos mais importantes
fatores prognósticos para essa doença. Essa avaliação permite estratificar essas
crianças em diferentes grupos de risco, ajustando seus protocolos de tratamento de
modo a elevar suas taxas de sobrevida e reduzir efeitos colaterais relacionados aos
fármacos utilizados no combate a LLA. Como exemplo, valores de DRM maiores que
10-3 são geralmente associados à maiores taxas de recaídas.
Atualmente, o protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil
(GBTLE LLA-2009), avalia a DRM no 15° dia após o início da terapia de indução por
citometria de fluxo e no 35° dia por qPCR. Enquanto essas técnicas, em particular a
qPCR, são ainda consideradas gold standards para esse exame, elas apresentam
limitações-chave que devem ser consideradas na avaliação do panorama da DRM
para o futuro. A citometria de fluxo requer análise imediata da amostra, exige alto
grau de experiência do analista e tem dificuldade em atingir níveis de sensibilidade
maiores que 10-4. Já a qPCR demanda a confecção de primers paciente-específicos
para cada marcador analisado para um paciente. Essa necessidade torna a detecção
de DRM por qPCR cara e demorada. Devido a essa conjuntura, apenas cerca de 3,2%
das crianças diagnosticadas com LLA no Brasil tem acesso ao exame de DRM.
Esse contexto demonstra a necessidade do desenvolvimento de novas
técnicas para acompanhar a DRM nesses pacientes. O sequenciamento de nova
geração tem sido sugerido como um possível candidato para substituir as técnicas
atualmente em uso, prometendo uma análise mais rápida, de menor custo e com a
possibilidade de acompanhar diversos clonotipos leucêmicos presentes em uma
mesma amostra sem requerer nenhum esforço adicional. A título de comparação, a
determinação da DRM de um paciente por qPCR leva cerca de 23 dias, enquanto
80
essa mesma determinação por NGS pode ser realizada em cerca de 6 dias. Nesse
projeto, buscamos padronizar e validar um método para a determinação de NGS DRM
em pacientes pediátricos com LLA-B derivada, a variedade mais comum de LLA na
criança. A plataforma de sequenciamento utilizada foi o Illumina MiSeq.
Sequências de rearranjo V(D)J no gene IgH são consideradas os melhores
marcadores moleculares para esse tipo de LLA, devido ao seu alto grau de
polimorfismo e estabilidade nos linfoblastos leucêmicos. Assim como esse marcador
é utilizado para a identificação e quantificação de linfoblastos leucêmicos na medula
óssea pela qPCR DRM, nós exploramos o uso do seu sequenciamento para a
determinação da NGS DRM. A conversão dos reads gerados pelo sequenciamento
em valores de DRM exige a normalização da frequência do clonotipo leucêmico por
spike-in controls e a determinação do número de células mononucleadas totais
referentes à amostra sequenciada. Princípios semelhantes foram explorados por
Faham et al. (2012) e Ladetto et al. (2014), através do método comercial fechado
LymphoSIGHT (Sequenta).
O preparo das bibliotecas para determinação de NGS DRM envolve duas
etapas de amplificação da região de rearranjo V(D)J do gene IgH. A primeira etapa,
denominada Amplicon PCR, é particularmente complexa, por se tratar de uma reação
em multiplex. Desse modo, buscamos padronizar essa reação de modo a obter
bandas bem definidas para o amplicon alvo, de cerca de 300 pares de base, e
minimizar a formação de primer-dimer. Para isso, nós ajustamos a concentração de
primer utilizada no preparo da reação e a temperatura de anelamento dos primeiros
ciclos da PCR, através de uma touchdown PCR. Além disso, três enzimas (Tth DNA
Polymerase, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase e GoTaq G2 Hot Start DNA
Polymerase) foram testadas para o protocolo estabelecido para a Amplicon PCR. As
enzimas Phusion e GoTaq apresentaram bons resultados, com baixos índices de
formação de primer-dimer observados. Dentre elas, enzima GoTaq G2 Hot Start DNA
Polymerase foi definida como a padrão para o método de NGS DRM, em função do
seu menor custo e maior facilidade de acesso a pronta entrega, fatores relevantes no
contexto de uma técnica que se pretende utilizar para realizar diagnósticos clínicos.
Vieses de amplificação diferencial entre os amplicons gerados podem ocorrer
em reações de PCR multiplex, como a Amplicon PCR. Desse modo, número mínimo
de ciclos de amplificação realizados nessa etapa do preparo das bibliotecas foi
81
testado, uma vez que a redução desse valor privilegia a restrição desses vieses. Os
valores testados para esse parâmetro foram 17, 20, 23 e 25 ciclos de amplificação.
Nós determinamos 25 como o número de ciclos a ser utilizado na Amplicon PCR no
preparo das bibliotecas para NGS DRM, uma vez que esse valor foi o único a não
ocasionar em uma redução da linearidade da técnica, quando testada nos pontos 10-
3 e 10-4 de uma curva padrão de DNA leucêmico em DNA de PBMCs. Além do mais,
valores menores de ciclos de amplificação estiveram associados a queda na
qualidade dos reads gerados pelo sequenciamento de suas bibliotecas.
A plataforma de sequenciamento Illumina MiSeq apresenta dificuldade em
sequenciar bibliotecas com baixos níveis de diversidade, como no caso do
sequenciamento de bibliotecas de um amplicon. Nesses casos, a Illumina recomenda
a adição de pelo menos 20% de genomas PhiX às bibliotecas para elevar
artificialmente a sua diversidade. Outra estratégia para realizar essa elevação de
diversidade consiste no uso de diferentes variedades do reverse primer na etapa de
Amplicon PCR, com a adição de entre 0 a 3 nucleotídeos N na região onde o início do
sequenciamento em si ocorre. Desse modo, amplicons gerados por diferentes primers
não estarão em fase durante os ciclos de sequenciamento.
Utilizando essa estratégia, nós buscamos reduzir a quantidade de genomas
PhiX adicionada às bibliotecas, uma vez que esses controles ocupam espaço na flow
cell, diminuindo o número de dados relacionados à amostra gerado por
sequenciamento. Nós testamos o sequenciamento de uma mesma amostra utilizando
10%, 7,5% ou 5% de PhiX na concentração final da sua biblioteca. Enquanto o
sequenciamento ocorreu sem maiores problemas para as bibliotecas com 10% e 7,5%
de PhiX, a corrida da biblioteca com 5% desse controle falhou pela baixa qualidade
dos clusters gerados. Para as bibliotecas com 10% e 7,5% de PhiX, os níveis de
clusters aprovados pelo filtro de qualidade do sequenciador (89,88% contra 89,52%),
de nucleotídeos sequenciados que atingiram níveis de qualidade Q30 (90,22% contra
90,22%) e a frequência do clonotipo leucêmico (0,803% contra 0,809%) foram
bastante semelhantes. No entanto, nós decidimos padronizar a adição de PhiX a
biblioteca em 10% de sua concentração, mantendo o método mais distante do
threshold de falha desse parâmetro, uma vez que a ocorrência desse tipo de falha
ocasiona a perda total da corrida do sequenciamento.
82
O uso dos spike-in controls para determinar a NGS DRM ao longo de uma curva
padrão de DNA leucêmico em DNA de PBMCs resultou, inicialmente, em valores de
NGS DRM cerca de uma ordem de grandeza acima dos esperados. A estrutura
supercoiled de plasmídeos pode levar a uma redução da sua eficiência de
amplificação (Chen et al., 2007), o que explicaria a obtenção de valores de NGS DRM
mais elevados que o esperado. Em concordância a essa hipótese, a linearização das
moléculas de spike-in control permitiu a redução das NGS DRM observadas,
trazendo-as para níveis bastante similares aos esperados.
Clonotipos com segmentos VH pertencentes a diferentes famílias são
amplificados por diferentes primers durante a etapa de Amplicon PCR. Desse modo,
uma diferença de eficiência desses oligonucleotídeos pode levar a uma amplificação
diferencial desses clonotipos. Assim sendo, a utilização de apenas controles spike-in
contendo segmentos VH da mesma família do clonotipo leucêmico analisado no
cálculo de sua NGS DRM pode ser necessária, dependendo dos níveis dessa
amplificação diferencial.
Nós realizamos um experimento que comparou, para uma curva-padrão de
DNA leucêmico em DNA de PBMCs, os níveis de NGS DRM determinados utilizando
apenas controles spike-in de uma mesma família VH. Os valores de NGS DRM foram
normalizados por controles de família VH1, VH2 ou VH3. Através desse ensaio,
observamos diferenças principalmente nos valores de NGS DRM determinados a
partir de moléculas spike-in com rearranjos VH3, quando comparados aos valores
determinado através de controles VH1 e VH2. Esse resultado demonstrou que o uso
de apenas spike-in controls com segmento VH da mesma família que a do clonotipo
leucêmico analisado pode ser necessária. Esse princípio foi levado em consideração
em todas as etapas de análise da validação do método de NGS DRM, com valores de
NGS DRM Geral e NGS DRM Família sendo determinados para todos os clonotipos
analisados e a eficiência de ambas as abordagens sendo comparadas.
A validação do método de NGS DRM se deu através da análise de amostras
de 45 pacientes pediátricos diagnosticados com LLA-B derivada. Dos 58 clonotipos
leucêmicos analisados nessas amostras por qPCR DRM, 55 foram identificados
também pela NGS DRM, sendo então utilizados para a comparação dos dois métodos.
A NGS DRM, no entanto, foi capaz de identificar 32 clonotipos leucêmicos além dos
55 já mencionados, totalizando 87 clonotipos leucêmicos identificados para as 45
83
amostras analisadas. A análise de mais de um marcador IgH por qPCR para um
paciente requer a síntese de mais de um primer paciente-específico, tantos quanto
forem os marcadores utilizados. Em contraste, a NGS DRM é capaz de identificar e
acompanhar diversos clonotipos leucêmicos por paciente sem a necessidade de
esforços adicionais.
A comparação entre os resultados de NGS DRM e qPCR DRM foi realizada
não só através de correlações matemáticas (coeficiente de correlação de Pearson),
mas também a partir da sua relevância clínica. Para essa segunda análise, valores de
NGS DRM com diferença absoluta menores que 1 x 10-4 em relação a qPCR DRM ou
fold changes menores que 5 foram considerados satisfatórios. Desse modo, a
frequência de amostras com DRM satisfatórias foi de 92,7% quando levando em
consideração a NGS DRM Geral e de 90,9% quando utilizando a NGS DRM Família.
No entanto, uma presença aquém da esperada de reads relacionados a
sequências de spike-in controls foi observada para o último subset de pacientes
sequenciados em uma mesma corrida (as amostras D35 para essa etapa de validação
final foram sequenciadas em três corridas do sequenciador MiSeq). Essa sub-
representação de reads de spike-in control levou a valores de NGS DRM com erros
de fold change mais elevados para esse terceiro subset de amostras (média de 6,04
vezes) em relação ao primeiro (média de 1,8 vez) e ao segundo (média de 2,00 vezes).
Assim sendo, nós repetimos as análises dos índices de NGS DRM
considerados satisfatórios em relação a qPCR quando comparados de um ponto de
vista clínico, dessa vez excluindo o terceiro subset de amostras previamente
mencionado. Nesse contexto, a frequência de amostras com DRM satisfatórias foi de
95,1% quando levando em consideração a NGS DRM Geral e de 92,7% quando
utilizando a NGS DRM Família.
A correlação matemática entre os valores de NGS DRM observados e os
valores de qPCR esperados foi realizada convertendo esses valores para uma escala
log10 e determinando o seu coeficiente de correlação de Pearson. Em função da
conversão de escala, clonotipos leucêmicos que tiveram uma de suas DRM (seja ela
a DRM esperada, geral ou família) com valor 0 foram excluídos da análise, contanto
que nenhum dos seus outros valores de DRM fosse superior a 1 x 10-4. Essa exclusão
se deu em função da correlação entre um valor muito pequeno e 0, quando realizada
84
em escala logarítmica na base 10, introduzir altos níveis de erro na análise, uma vez
que a conversão de valores decimais a essa escala os afasta cada vez mais de 0
quanto menor for esse valor.
Os valores de NGS DRM dos clonotipos analisados apresentaram forte
correlação aos valores de qPCR DRM esperados, com um coeficiente de Pearson de
0,88 para as NGS DRM Geral e de 0,91 para as NGS DRM Família. Essa análise
também foi realizada novamente à exclusão dos clonotipos do terceiro subset de
amostras sequenciadas, atingindo um coeficiente de correlação de Pearson de 0,88
para a NGS DRM geral e de 0,92 para a NGS DRM Família.
A frequência desses clonotipos leucêmicos, sem normalização a valores de
DRM, também foi comparada e correlacionada aos valores esperados de qPCR.
Observamos um coeficiente de correlação de Pearson de 0,78 para essas variáveis
incluindo o terceiro subset de amostras e de 0.81 quando excluindo esse subset da
análise. Esse grau de correlação, portanto, mostrou-se inferior aos obtidos utilizando
o sistema de spike-in control para a normalização do número de reads de um clonotipo
leucêmico em DRM. No mais, a relevância clínica das frequências de clonotipos
leucêmicos não pode ser facilmente estabelecida pelos parâmetros padronizados para
DRM, uma vez que os seus valores são, no geral, entre uma a duas ordens de
grandeza maiores que suas contrapartes em DRM.
Através dessas análises, concluímos que o método de NGS DRM é capaz de
gerar resultados satisfatórios quando comparados a qPCR DRM, seja de um ponto de
vista de relevância clínica dos resultados quanto em relação à correlação matemática
entre esses valores. Adicionalmente, os níveis de correlação entre essas variáveis
atingidos pelo nosso método são comparáveis aos obtidos em estudos baseados no
sistema comercial fechado LymphoSIGHT, como por Faham et al. (2012) e Ladetto et
al. (2014). Além disso, a sua taxa de correlação foi superior quando comparada a
sistemas que não utilizam controles para normalizar a frequência do clonotipo
leucêmico a um valor de DRM, como nesse próprio projeto e em um estudo por
Kotrova et al. (2015). Desse modo, consideramos que o principal objetivo do projeto
foi atingido.
Não foi possível, no entanto, determinar se um dos métodos de normalização
dos reads de um clonotipo leucêmico em DRM é significativamente superior. Por um
85
lado, os valores de NGS DRM calculados utilizando apenas spike-in controls com a
mesma família VH do clonotipo leucêmico analisado apresentaram coeficientes de
correlação de Pearson levemente superiores. No entanto, o número de reads de
apenas três spike-in controls é levado em consideração nessa análise, uma vez que
cada família VH possui apenas 3 representantes nas 21 sequências controle. Desse
modo, o cálculo da NGS DRM a partir desse conjunto se torna altamente sensível a
comportamentos erráticos acentuados dos reads dessas sequências. Em casos raros,
por exemplo, é possível que o fator spike-in para um clonotipo leucêmico seja
negativo, resultando em uma NGS DRM menor que 0, que não possui nenhum sentido
biológico.
Já os valores de NGS DRM calculados a partir do uso de todas as 21
sequências spike-in utilizadas são bem menos sensíveis a problemas na amplificação
de uma ou duas moléculas de controle, uma vez que o maior número de sequências
utilizadas nesse cálculo o torna mais robusto a resistir a influência de outliers. Assim
sendo, a análise de um maior volume de dados de NGS DRM é necessária para
compreender melhor as limitações de cada abordagem de determinação de DRM.
Apenas assim poderemos determinar com confiança se há de fato uma opção superior
entre a NGS DRM Geral e a NGS DRM Família.
As taxas anormais de fold change entre NGS DRM e qPCR DRM observadas
para o terceiro subset de amostras sequenciadas estiveram majoritariamente
relacionadas a uma sub-representação de reads relacionados aos spike-in controls
nessas bibliotecas, como anteriormente mencionado. Nós hipotetizamos que esse
erro possa estar vinculado a uma subamplificação das sequências spike-in control
adicionadas às bibliotecas. Essa subamplificação poderia ter sido ocasionada, por
exemplo, por um maior grau de degradação do pool de spike-in controls em
decorrência do maior tempo desde o seu preparo, uma vez que esse foi o último grupo
de amostras a ser sequenciado. Outra hipótese que pode explicar esse erro é uma
simples falha operacional na adição do pool de spike-in controls a essas bibliotecas.
Considerando a utilização do método de NGS DRM em situações de
diagnósticos clínicos reais, não haverá resultados de qPCR para servir de parâmetro
na identificação desses erros. Pacientes com níveis de DRM reais baixos poderiam
então vir a ser enquadrados como apresentando taxas de DRM mais elevadas, com
a possibilidade até do seu caso ser classificado erroneamente como de alto risco,
86
gerando então um falso-positivo. Desse modo, é importante que existam ferramentas
que permitam a identificação de corridas de sequenciamento que apresentam esse
tipo de de erro, independentemente de sua origem. Nesse contexto, nós observamos
que a média ou a mediana dos coeficientes de amplificação spike-in (definido para
uma amostra como a razão entre o seu total de reads contendo rearranjos V(D)J e o
seu total de reads relacionados a sequências spike-in control) das amostras de um
sequenciamento pode ser uma dessas ferramentas. Para o nosso caso em particular,
a média e mediana desses coeficientes de amplificação spike-in foi de 7,12 e 5,24
respectivamente para o terceiro subset de amostras e de 4,92 e 3,20 para as demais
amostras. A consolidação definitiva desses coeficientes de amplificação spike-in como
um parâmetro para avaliar a sub-representação de reads de controles em corridas de
sequenciamento, no entanto, ainda depende da sua padronização e de estudos em
um maior número de casos.
Apesar do método para a quantificação de DRM por NGS proposto neste
projeto ter sido padronizado e validado com sucesso, atingindo resultados satisfatórios
tanto de um ponto de vista de sua relevância clínica quanto de um ponto de vista
matemático, ainda há muita margem para aperfeiçoamentos e desenvolvimentos
futuros.
O conjunto de sequências V(D)J spike-in control utilizado para normalizar o
número de reads de clonotipos leucêmicos em valores de DRM ainda pode, por
exemplo, ser otimizado. Nesse estudo, utilizamos 21 sequências de rearranjos IgH
para realizar essa normalização, buscando representar uniformemente as 7 famílias
de segmentos VH possíveis para esses rearranjos. É razoável, no entanto, que seja
possível quantificar a NGS DRM com níveis de sensibilidade e linearidade
semelhantes ou até mesmo superiores aos aqui obtidos partindo de um conjunto
menor de controles. Já no caso de acabarmos optando pela utilização da NGS DRM
família-específica, pode ser que a adição de mais controles externos de cada família
VH ao ensaio seja necessária, para reduzir o quanto o valor final de NGS DRM
estimado é afetado por problemas na amplificação de algum desses spike-in controls.
Desse modo, o número ótimo de sequências spike-in controls que deve utilizado na
NGS DRM só poderá ser determinado através de uma exploração mais a fundo dos
dados já gerados nesse projeto e dos que ainda virão a ser gerados por esse método.
87
Enquanto rearranjos completos do gene IgH se configuram como o melhor
marcador para avaliar DRM em LLA-B derivada, eles nem sempre estão presentes ou
permitem alcançar sensibilidades satisfatórias em todos os casos dessa variedade de
LLA. Desse modo, outros marcadores, como rearranjos incompletos IgH, rearranjos
IgK, TCRD e TRCG, podem ser utilizados para essa avaliação em certos casos de
LLA-B derivada. Em adição, os genes TCRD, TRCB, IgH incompleto e TCRG são,
nessa ordem, os melhores marcadores contendo rearranjos V(D)J para acompanhar
DRM em casos de LLA-T (Flohr et al., 2008). Todos esses marcadores mencionados
para LLA-B e LLA-T possuem rearranjos V(D)J e, portanto, podem ser utilizados para
determinar NGS DRM através da adaptação dos primers utilizados na Amplicon PCR
e dos controles externos utilizados. Desse modo, o método de NGS DRM pode ser
facilmente adaptado não só para um maior número de casos de LLA-B derivada, mas
também para pacientes diagnosticados com LLA-T.
A NGS DRM também pode ser adaptada para uso na Leucemia Mieloide Aguda
(LMA). Os genes IgH, IgK e TCRD encontram-se rearranjados em cerca de 10,4%,
3,2% e 9,3% dos casos de LMA respectivamente, segundo Boeckx et al. (2002). No
entanto, a NGS DRM não precisa se restringir ao uso de genes com rearranjos V(D)J,
podendo utilizar também mutações associadas a células de LMA para identificá-las e
acompanhar sua dinâmica populacional ao longo do tratamento da doença.
Aproximadamente 58% dos casos de LMA apresentam mutações em pelo menos um
dos seguintes genes, que poderão ser explorados então para a determinação da NGS
DRM: NRAS, KRAS, PTPN11, FLT3, KIT, RUNX1, CEBPA, ETV6, NPM1, TP53,
CDKN2A/B, GATA1 e MLL (Radtke et al., 2009).
Concluindo, esperamos que os resultados obtidos nesse projeto não só reflitam
em benefícios a curto prazo para as crianças brasileiras sofrendo de LLA-B derivada,
mas que os seus frutos futuramente se estendam para também para pacientes
acometidos por outras variedades de leucemia.
88
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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92
VIII. ANEXOS
Anexo 1 - Tabela 1S
Tabela 1S. Nomenclatura, família VH e sequência dos rearranjos V(D)J de IgH
utilizados como spike-in control. Sequências do plasmídeo pJET1.2 representadas
em vermelho. Regiões de anelamento dos primers Biomed2 destacadas em rosa.
Porção final do segmento VH destacada em amarelo. Segmento DH destacado em
verde. Porção inicial do segmento JH representada em azul. Inserções N
representadas por nucleotídeos sublinhados. Nucleotídeos em negrito correspondem
a porção da sequência utilizada para identificar o clonotipo no software Vidjil.
Nomenclatura Família VH Sequência 5’→ 3’
2234 VH1
TTTAGCAAGATCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAAGGSSTTKGAGTGGWGGGTGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGGGGGAGGGTTCGGGGAGTTTTCCCCCGCCCATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2224 VH1
TTTAGCAAGATCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGTTTGAATGGATGGTAGGGAGCTACTCTGGCAATGGTAACACAGGCTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGTCAGAGATCTGAGGACATAGATGTGTACTACTGTGCGAGACATTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2233 VH1
TTTAGCAAGATCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGSTTGCRGKGGSTGGGTGGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCYAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTTTGAAGGATGGTAGCTGCTAACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2168 VH2
TTTAGCAAGATTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGKGGCTTGACTCATTGATTGGGATGATGATAAATACTACAGCACATCTCTGAAGACCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACGTATTACTGCCCCTTGGCCTCCTCAATTACGATATTTTGACTGGTTATCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2065 VH2
TTTAGCAAGATTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGSCTTGCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGGAAGGGACCTTTACGATTTTTGGAGTGGTTATTAGGCCCTCTTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2047 VH2
TTTAGCAAGATTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTTTCGAAKGASGAWWAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATAAAGGGGATTTAGAGGGCGGGGGGCCCCCAATAAACTTATTGTAGTAGTACCAGCTGCTACCCCAACCCAGACCCCGTCTTTTCCTGGTCCGTTCGTATTCTACTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2231 VH3 TTTAGCAAGATGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGG
93
CCGTACTAGAAACAAAGCTAACAGTTACACCACAGAATACGCCGCGTCTGTG
AAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAGAACTCACTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGAG
GTGAGATCGGGGTATTATGATTACGTTTTGGGGAGCGTTAGCCCCATCTAC
GTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCAC
CGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2227 VH3
TTTAGCAAGATGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGSTGGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTAGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTAATAGCAGCTCGCTCACAGATTACTACTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2170 VH3
TTTAGCAAGATGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTC
AGTTATTTATAGCGGTGGTAGCASATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG
ATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTCCTCCCGAACGAAC
CCCTCCGAACCCCCTATAGCAGCTCGGAGTATGGGTGTCAAACTACTACG
GTATGGACGTCYGGGRCCAAMRGGCCAACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAA
GATCTTTCTAG
1809 VH4
TTTAGCAAGATTGGATCCGCCAGCCCCCARGGRAARGGGCATKGGGAGTG
GATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAG
AGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTRAAGC
TGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCMGTGTATTACTGTGCGAGGGGA
TTTTGACTGGTTATTGAAGGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1974 VH4
TTTAGCAAGATTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG
GGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCG
AGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC
TCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGTAT
AGCAGCAGCTGGTGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA
CCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2353 VH4
TTTAGCAAGATGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTG
GGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTACTMCAACCCGTCCCTCAAGAGTC
GAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAG
CTCTGWACWSCGMGGAACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGaGcGGGGATGG
TCAGTGGGCAGTGGCTGGTAGGGACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1989 VH5
TTTAGCAAGATGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGAGGATTGATCCTAGTGACTCTTATACCAACTACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACCATCTCAGCTGACAAGTCCATCAGCACTGCCTACCTGCAGTGGAGCMRSCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGACCCTCCGCCACCCTGAGAGCCCACCTGGGGGAGGTTTGAACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2023 VH5
TTTAGCAAGATGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGASMRSCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGCCAAAACGGGGATAGCTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGSCMCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2387 VHR
TTTAGCAAGATGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCMRSCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACGGGGCCCGTACCGCTATGGTATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1691 VH6
TTTAGCAAGATTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCGCTTGAGTGGCTGGGAAGGMATACTACAGGTCCRAGTKRWATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGTCTGGAACATTATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1743 VH6
TTTAGCAAGATTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAG
94
CTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATGGGTAGGTATAGCAGCAGGTCCGCGCGTCTTGGACTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1816 VH6
TTTAGCAAGATTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGTCCCAGGCCCCAACGTATTACGATTTTTGGAGTGGCCCCCAAGAGCGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
1620 VH7
TTTAGCAAGATTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAACGTATGCCCAGGSCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCTGCAGCCTAAAGGCKGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGAAAAGATCCTTAAAGAGTAGAGCGGCATTACTATGGTTCGGGGAGTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2104 VH7
TTTAGCAAGATTTGGGTGCGACAGGCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGACCAACGTATGCCAGGGCTCACAGGACGGTTTGTCTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCMRSARGCTAAAGGCTGRGRCAMTGCCGTGTATTACTGTGCGAGMGCCCTCCCCTCGAGGGGTCTTTTTTGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
2130 VH7
TTTAGCAAGATTKGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACMCCAACACTGGGAACCCAMCGTATSCCCAGGSCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGMACCTAAAGGCTGAGGAATGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCGGTGGTCCCCCCTGGCGGGCGTCCATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGATCTTTCTAG
95
Anexo 2 - Termo de Consentimento GBTLI LLA-2009, Baixo Risco
VI.1. Termo de Consentimento Para Participação no Estudo GBTLI LLA-2009 de tratamento da Leucemia
Linfóide Aguda B-derivada Baixo Risco de Recaída
Seu(sua) filho(a) tem um câncer no sangue chamado leucemia linfóide aguda. Os linfoblastos são as
células brancas muito jovens, que se proliferam pelo câncer. Pelo fato destas células em seu(sua) filho(a)
apresentarem no exame de imunofenotipagem a B-derivação, a leucemia será assim denominada. Pelo fato da
contagem dos glóbulos brancos do seu(sua) filho(a) estar abaixo de 50000/mm3 quando foi descoberta a leucemia,
ou pelo fato da sua criança ter idade entre 1 a 9 anos ou pelo fato de não apresentar achados citogenéticos de mau
prognóstico (cromossomo filadélfia positivo, rearranjo do gene MLL ou hipodiploidia), a leucemia dele é chamada
de “Baixo Risco de Recaída”. Para continuar neste grupo, os doentes necessitam apresentar boa resposta à terapia
inicial, apresentando menos de 1000 blastos/mm3 no exame de sangue do dia 8 e medula óssea classificada como
em remissão (menos de 5% de blastos) e com Doença Residual Mínima negativa no dia 15 do tratamento e
adicionalmente, deverão obrigatoriamente entrar em remissão no 35º dia do tratamento, apresentando a remissão
medular e a pesquisa da Doença Residual negativa. Incluiremos também neste grupo, os doentes de baixo risco,
mas com resposta parcial ao tratamento inicial, que mostram menos de 25% de blastos leucêmicos na medula
óssea ou Doença Residual Mínima positiva (igual ou acima de 0,01% e inferior a 10%) no dia 15. Estes pacientes
serão classificados como de Baixo Risco Intermediário (Subgrupo BRI) à terapia. Aqueles que apresentarem
mais de 1000 blastos/mm3 no sangue periférico do dia 8 e/ou mais que 25% de blastos leucêmicos na medula
óssea ou Doença Residual Mínima positiva no dia 15 da terapia, serão transferidos para o Grupo de Alto Risco –
Respondedor Lento (RL), assim como, aqueles que não alcançarem a remissão no dia 35, com positividade de
Doença Residual Mínima (igual ou acima de 10-3)
Os pacientes com excelente e resposta no D8 (inferior a 1000 blastos/mm³ no sangue periférico) e
medula óssea com menos de 5% de blastos e com Doença Residual Mínima negativa (inferior a 0,01%) no D15 e,
adicionalmente, medula óssea com menos de 5% de blastos com Doença Residual Mínima negativa (inferior a 10-
3) no D35 serão alocados como Baixo Risco Verdadeiro (Subgrupo BRV), com o objetivo da redução da dose
de Daunoblastina, de Ciclofosfamida, em virtude dos efeitos secundários destas drogas.
Estamos nos dirigindo a você(s) para solicitar autorização de que seu (sua) filho (a) participe de um
estudo de pesquisa para o tratamento de leucemia linfóide aguda de baixo risco de recaída. Este estudo foi
delineado pelo Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia da Infância (GBTLI) vinculado à Sociedade
Brasileira de Oncologia Pediátrica. Neste estudo cooperativo participam vários hospitais no Brasil que cuidam de
crianças com câncer. Há mais de 20 anos, esta tem sido uma prática médica em Centros especializados para tratar
crianças com leucemia, com protocolos terapêuticos de abrangência nacional, como este estudo, objetivando
introduzir os recentes avanços diagnósticos e terapêuticos alcançados internacionalmente. O planejamento básico
do tratamento da leucemia linfóide aguda de baixo risco de recaída, está alicerçado nos bons resultados do estudo
anterior (GBTLI LLA-99) onde a sobrevida livre de recidiva em 7 anos é da ordem de 76,3% para os doentes de
melhor prognóstico que são classificados no grupo de baixo risco de recaída. Resultados semelhantes são relatados
na literatura internacional.
São três as finalidades terapêuticas do estudo atual para a leucemia linfóide aguda B-derivada de Baixo Risco:
1) Identificar precocemente as crianças que apresentam boa resposta à terapia inicial das duas
primeiras semanas, pacientes do Subgrupo BRV, com objetivo de reduzir a dose do
antracíclico (Daunoblastina) e retirada de Ciclofosfamida, em virtude dos efeitos secundários.
2) Identificar precocemente aquelas crianças que não respondem satisfatoriamente na 1ª ou na 2ª
semana de tratamento, transferindo-as para o Grupo de Alto Risco.
3) Tentar diminuir as recidivas, fazendo um esquema da quimioterapia da manutenção, com
doses mais elevadas do Metotrexate, empregado de maneira intermitente com a
Mercaptopurina. Mediante alocação casual, para efeitos de comparação, teremos outro grupo
tratado de maneira já utilizada no estudo anterior GBTLI LLA-99, onde o methotrexate e a
mercaptopurina são administrados de maneira intermitente, mas com dose fixa do
Methotrexate.
A única maneira de descobrir se um tratamento é melhor do que outro, é compará-los diretamente,
dando para uns doentes um esquema (GRUPO 1) e, para outros o esquema de estudo (GRUPO 2). Como não
sabemos qual dos dois esquemas é o melhor, a alocação será casual, realizada centralmente por meio eletrônico,
nos dois grupos de estudo, garantindo-se que cada grupo seja muito semelhante ao outro.
96
Se você(s) concordar(em) que seu(sua) filho(a) participe do estudo, ele(a) fará uma fase inicial da
Prefase, seguida da Indução (4 semanas), fase de Consolidação (4 semanas), fase de Intensificação (8 semanas),
fase de Consolidação Tardia (8 semanas) e a fase final da Manutenção (1 ano e meio). Antes do início da fase de
Manutenção haverá a alocação casual para o GRUPO 1 (terapia com dose fixa do MTX/6-MP administrados em
regime intermitente a cada 3 semanas) ou para o GRUPO 2 (terapia do estudo com doses escalonadas do
Methotrexate a cada 3 semanas acrescido do 6MP). A alocação será feita eletronicamente pela Central de
Processamentos de Dados do GBTLI.
Após 7 dias da Prefase e após uma semana da terapia da Indução, se seu(sua) filho(a) tiver no
resultado do exame de sangue periférico igual ou acima de 1000 /mm3 blastos no dia 8 ou a medula óssea com
mais de 25% de blastos no Dia 15 e Doença Residual Mínima (DRM) positiva, ele(ela) não continuará no plano
terapêutico proposto, sendo transferido(a) para o Grupo de Alto Risco de recidiva. Isso significa que ele(ela)
receberá um regime terapêutico mais intensivo. O(a) médico(a) da sua criança lhe(s) explicará o novo tratamento.
Por outro lado, se seu(sua) filho(a) apresentar excelente resposta nas três primeiras avaliaçõe do dia 8, no dia 15 e
dia 35, serão classicados como de
Baixo Risco Verdadeiro (Subgrupo BRV) sendo preconizada redução do esquema de quimioterapia.
Se alterações cromossômicas das células leucêmicas da sua criança identificadas ao diagnóstico
forem consideradas desfavoráveis, ou se a medula óssea obtida no dia 35 da indução mostrar mais de 5% de blastos
leucêmicos ou Doença Residual Mínima positiva, ele(ela) receberá também, uma quimioterapia mais agressiva e,
será considerada a possibilidade da realização do transplante de medula óssea. É esperado que cerca de 10% dos
pacientes com LLA inicialmente classificados como de baixo risco, necessitarão de um tratamento mais intensivo
(Grupo de Alto Risco).
Riscos e desconfortos
É importante que você(s) entenda(m) os riscos, possíveis problemas, e desconfortos que fazem parte
deste plano terapêutico. Além de destruir as células malignas, a quimioterapia pode danificar os tecidos normais e
causar efeitos colaterais. Entretanto, há muitos anos estas drogas têm sido usadas em crianças. Cuidadosamente
ajustando as quantidades e o tempo de uso das medicações, podem-se evitar problemas sérios. A maioria destes
efeitos colaterais, se ocorrerem, cessam quando a medicação é suspensa ou, se menor quantidade for administrada
na próxima vez. Ocasionalmente, um efeito colateral pode continuar, podendo causar complicações mais sérias. É
por isso que exames que avaliam a função renal e hepática, assim como hemogramas, são freqüentemente feitos.
Quanto aos possíveis efeitos colaterais de cada medicação, o(a) médico(a) do seu(sua) filho(a) lhe(s) informará a
cada etapa do tratamento.
Estudos Investigacionais
Outra finalidade deste estudo é quantificar pequenos números de células leucêmicas que possam ter
ficado na medula óssea do seu(sua) filho(a) durante o tratamento. Chamamos isto de Doença Residual Mínima.
Realizaremos este exame através de 3 técnicas (citometria de fluxo, Polimerização em cadeia em tempo real e com
técnica simplificada). O objetivo é avaliar a sensibilidade e exatidão de cada técnica. As amostras colhidas de
aspirados da medula óssea serão enviadas aos Laboratórios de Referência, para estes estudos especializados. Estes
exames serão realizados sem custos financeiros a você(s).
Benefícios
Não há nenhum benefício direto para a sua criança participar do estudo. A chance de cura para
crianças tratadas com quaisquer desses regimes é esperada de ser no mínimo de 75%. O regime experimental
(GRUPO 2) poderá ou não melhorar a chance de cura.
Tratamentos Alternativos
Caso você(s) decida(m) não autorizar a participação da sua criança neste estudo, a terapia padrão
será oferecida de acordo com o protocolo anterior GBTLI LLA-99, com o uso intermitente do par
Mercaptopurina/Methotrexate, com dose fixa do Methotrexate. Caso desejem retirar seu consentimento, em
qualquer fase da pesquisa, esta poderá ser feita sem penalização alguma e sem prejuízo algum no cuidado do
seu(sua) filho(a).
Confidencialidade
A identidade da sua criança não será revelada em publicações. Os registros do prontuário também
são confidenciais e, sob a responsabilidade do Hospital.
97
A Central de Processamento de Dados do GBTLI tem o direito de consulta/revisão de todos os dados
do prontuário, em qualquer necessidade.
Participação Voluntária
A participação da sua criança neste estudo é voluntária. A recusa na participação não leva a
nenhum prejuízo para sua criança, assim como, não comprometerá o cuidado médico com a mesma.
Aproximadamente 800 crianças serão tratadas neste estudo.
Esclarecimento de dúvidas
A qualquer momento, em caso de dúvidas, solicite(m) ao médico(a) do seu(sua) filho(a) os
esclarecimentos necessários. Você(s) poderá(ão) também contatar o(s) Coordenador(es) do Estudo.
Nome: Dra. Maria Lúcia Martino Lee
RG:26864157-2 / CPF: 355809090-04
Endereço: Rua Botucatu, 743 – Vl. Clementino
CEP: 04023-062 / São Paulo – SP
Telefone(s): (11) 5080 8475
Fax: (11) 5080 8480
e-mail: [email protected] / [email protected]
Nome: Dra. Silvia Regina Brandalise
RG: 2.837.167 / CPF: 052306328-87
Endereço: Rua Dr. Gabriel Porto, 1270 - Barão Geraldo
CEP: 13083-210 / Campinas - SP
Telefone(s): (19) 3787 5016
Fax: (19) 3289 3571
e-mail: [email protected]
Autorização
Eu li este documento a respeito do estudo GBTLI LLA-2009 ou ele foi lido para mim. Eu fui
informado sobre os riscos e benefícios. Decidi que meu (minha) filho (a) participe desta pesquisa. Eu sei, também,
que tenho a liberdade de recusar o tratamento proposto e, assim mesmo, minha criança continuará a receber o
tratamento médico usual. Eu receberei uma cópia deste consentimento.
Eu dei permissão para minha criança _________________________________________
________________________________________________fazer o protocolo de tratamento GBTLI LLA-2009
para
Baixo Risco em _______/________/__________
______/_____/_____
Assin. Pai paciente Data
98
______/_____/_____
Assin. Mãe paciente Data
______/_____/_____
Testemunha Data
Eu expliquei aos familiares/criança este estudo e, considero que eles tiveram suficiente informação
com respeito aos riscos e benefícios, fazendo uma decisão embasada. Eu informarei aos mesmos, no momento
oportuno, quaisquer modificações no procedimento.
______/_____/_____
Assin. Médico Data
99
Anexo 3 - Termo de Consentimento GBTLI LLA-2009, Alto Risco
VI.2. Termo de Consentimento Para Participação no Estudo GBTLI LLA-2009 de tratamento de leucemia
linfóide aguda B-derivada de Alto Risco de Recaída
Seu(sua) filho(a) tem um câncer do sangue chamado leucemia linfóide aguda. Os linfoblastos são
as células brancas muito jovens, que se proliferam pelo câncer. Pelo fato dessas células em seu(sua) filho(a)
apresentarem no exame de imunofenotipagem a B-derivação a leucemia será assim denominada. Pelo fato da
contagem dos glóbulos brancos do seu(sua) filho(a) estar muito alta acima de 50000/mm3 quando foi descoberta a
leucemia, ou pelo fato da sua criança ter idade de risco (maior de 9 anos) ou pelo fato de apresentar achados
citogenéticos de mau prognóstico (cromossomo filadélfia positivo ou rearranjo do gene MLL ou hipodiploidia), a
leucemia dela é chamada de “Alto Risco de Recaída”. Incluiremos neste grupo também, os doentes de Baixo Risco,
mas maus respondedores ao tratamento inicial, que mostrem igual ou acima de 1000 blastos/mm3 no exame de
sangue do dia 8 e/ou medula óssea com mais de 25% de blastos no dia 15 e/ou com Doença Residual Mínima igual
ou acima de 10% no dia 15. Adicionalmente, serão incluídos neste grupo aqueles pacientes que não alcançarem a
remissão medular no 35º dia do tratamento e com a Doença Residual positiva (igual ou acima de 10-3).
Estamos nos dirigindo a você(s) para solicitar autorização de que seu(sua) filho(a) participe de um
estudo de pesquisa para o tratamento de leucemia linfóide aguda de Alto Risco. Este estudo foi delineado pelo
Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia da Infância (GBTLI) vinculado à Sociedade Brasileira de Oncologia
Pediátrica. Neste estudo cooperativo participam vários hospitais no Brasil que cuidam de crianças com câncer. Há
mais 20 anos, esta tem sido uma prática médica em Centros especializados para tratar crianças com leucemia, com
protocolos terapêuticos de abrangência nacional, com este estudo, objetivando introduzir os recentes avanços
diagnósticos e terapêuticos alcançados internacionalmente. Os modernos protocolos de tratamento para as
leucemias de alto risco, proporcionam taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos, da ordem de 50-60%. Os
resultados nacionais do estudo GBTLI LLA-99 mostram taxas de sobrevida em 7 anos de 59,8%. O problema
nestas crianças de alto risco de recidiva é que em cerca de 80% delas, todos os sinais da leucemia desaparecem
por certo período de tempo, entretanto, as células leucêmicas podem voltar e a maioria destes doentes recidivados
são refratários a outros tratamentos mais intensivos.
O estudo atual GBTLI LLA-2009 procura melhorar os índices de cura, intensificando precocemente
a terapia com a introdução da Ciclofosfamida e duas doses de Daunoblastina, já na 3ª semana do tratamento (fase
da indução). Desejamos saber se a introdução da Ciclofosfamida proporcionará maior taxa de remissão da doença
no dia 35 da terapia, quando comparamos com o tratamento previamente utilizado no protocolo GBTLI LLA-99.
São quatro as finalidades terapêuticas do estudo atual para a Leucemia Linfóide Aguda de alto risco:
1) Identificar precocemente aquelas crianças que apesar de classificadas inicialmente no grupo
de Alto Risco, apresentam boa resposta à terapia inicial (menos de 1000 blastos/mm3 no exame
de sangue no dia 8 e medula óssea com menos de 25% de blastos e Doença Residual Mínima
inferior a 10% no dia 15 e, adicionalmente, que alcancem a remissão medular no dia 35 da
terapia com Doença Residual negativa (inferior a 10-3), com o objetivo de redução da dose de
Daunoblastina, da Ciclofosfamida e do Methotrexate, em virtude dos efeitos secundários
destas drogas.
2) Tentar diminuir as taxas de recidiva naqueles doentes já classificados de alto risco ao
diagnóstico
(igual ou acima de 50000 glóbulos brancos/mm3 de início ou idade acima de 9 anos ou
acometimento leucêmico em Sistema Nervoso Central) ou aqueles maus respondedores à
terapia inicial da indução (igual ou acima de 1000 blastos/mm3 no dia 8 e/ou medula óssea
com menos de 25% de blastos no dia 15 e/ou DRM inferior a 10% no dia 15), acrescentando-
se duas doses da Ciclofosfamida na 3ª semana da indução e duas doses adicionais de
Daunoblastina.
3) Tentar diminuir as recidivas, fazendo um esquema da quimioterapia da manutenção, com
doses mais elevadas do Metotrexato, empregado de maneira intermitente com a
Mercaptopurina. Mediante alocação casual, para efeitos de comparação, teremos outro grupo
tratado de maneira já utilizada no estudo anterior LLA-99, onde o Methotrexate e a
Mercaptopurina são administrados de maneira intermitente, mas com dose fixa do
Methotrexate.
100
4) Em virtude da maior taxa de recidiva em Sistema Nervoso Central no estudo GBTLI LLA-
99, reintroduzir a radioterapia profilática para aqueles pacientes que apresentarem mais de
100000 leucócitos/mm3 ao diagnóstico e/ou que forem respondedores lentos à terapia inicial
(2 primeiras semanas). Estes doentes de alto risco têm maior chance de recidivas leucêmicas
em Sistema Nervoso Central, fato que reduz as chances de cura.
A única maneira de descobrir se um esquema de tratamento é melhor do que o outro, é compará-los
diretamente, dando para uns doentes um esquema (GRUPO 1) e, para outros o esquema do estudo (GRUPO 2).
Como não sabemos qual dos dois esquemas é o melhor, a alocação será realizada centralmente por meio eletrônico,
nos dois grupos de estudo, garantindo-se que cada grupo seja muito semelhante ao outro.
Se você(s) concordar(em) que seu(sua) filho(a) participe do estudo, ele(a) fará uma fase inicial
Prefase, seguida da Indução (4 semanas), uma fase de Consolidação de 8 semanas (Grupo dos Respondedores
Rápidos) ou com 3 blocos intensivos de quimioterapia para os pacientes Respondedores Lentos (Subgrupo RL)
à terapia inicial. Prossegue-se com uma fase de Intensificação (8 semanas), uma Interfase (8 semanas), uma fase
de Consolidação Tardia (8 semanas) e a terapia de Manutenção (1 ano e meio). Antes do início da fase de
Manutenção, haverá a alocação casual para o GRUPO1 (terapia com dose fixa do Methotrexate/Mercaptopurina
administrados em regime intermitente a cada 3 semanas) ou para o GRUPO 2 (terapia do estudo, com doses
escalonadas do Methotrexate a cada 3 semanas acrescidas da Mercaptopurina). A alocação será feita
eletronicamente pela Central de Processamento de Dados.
No caso do(a) seu(sua) filho(a) ser inicialmente classificado de baixo risco mas, posteriormente foi
classificado como mau respondedor ao tratamento da indução (Dia 8 ou Dia 15), ele(a) também será alocado(a)
casualmente, para o GRUPO 1 ou GRUPO 2. Se, eventualmente, sua criança apresentar alterações cromossômicas
consideradas desfavoráveis nas células leucêmicas iniciais e, adicionalmente for Respondedor Lento (Subgrupo
RL) nos dias 8 e/ou 15 e/ou 35 da indução, o transplante de medula óssea será cogitado como alternativa
terapêutica.
Com relação à realização da radioterapia craniana, como tratamento dirigido ao Sistema Nervoso
Central, ela será preconizada para os pacientes com mais de 100000 glóbulos brancos /mm3 ao diagnóstico e maus
respondedores à terapia. Estes, felizmente, correspondem à minoria dos pacientes. A comparação das taxas de
recidiva em Sistema Nervoso Central será feita com controles históricos do grupo de alto risco do protocolo
GBTLI- LLA-93, onde foi realizada a irradiação craniana para todos os pacientes de alto risco, além da comparação
com o estudo GBTLI LLA-99 para o Grupo de Alto Risco onde não se recomendou esta modalidade de terapia,
em virtude de publicações de alguns estudos internacionais.
Riscos e desconfortos
A introdução de mais um medicamento, a Ciclofosfamida no esquema da indução pode aumentar as
toxicidades já observadas nesta fase. As principais complicações vinculadas a Ciclofosfamida são as renais,
gastrointestinais (mucosites severas, enterites), hepáticas (icterícia) e fertilidade.
É importante que você(s) entenda(m) os riscos, possíveis problemas, e desconfortos que fazem parte
deste plano terapêutico. Além de destruir as células malignas, a quimioterapia pode danificar os tecidos normais e
causar efeitos colaterais. Entretanto, estas drogas têm sido usadas em crianças, há muitos anos. Cuidadosamente
ajustando as quantidades e o tempo de uso das medicações, podem-se evitar problemas sérios. A maioria destes
efeitos colaterais, se ocorrerem, cessa quando a medicação é suspensa ou, se menor quantidade for administrada
na próxima vez. Ocasionalmente, um efeito colateral pode continuar podendo causar complicações mais sérias. É
por isso que exames que avaliam a função renal e hepática, assim como hemogramas, são freqüentemente feitos.
Quanto aos possíveis efeitos colaterais de cada medicação, o(a) médico(a) do seu(sua) filho(a) lhe(s) informará a
cada etapa do tratamento.
Estudos Investigacionais
Outra finalidade deste estudo é quantificar pequenos números de células leucêmicas que possam ter
ficado na medula óssea do seu(sua) filho(a) durante o tratamento. Chamamos isto de Doença Residual Mínima.
Realizaremos este exame através de 3 técnicas (Citometria de fluxo, Polimerização em cadeia em tempo real com
técnica simplificada). O objetivo é avaliar a sensibilidade e a exatidão de cada técnica. As amostras colhidas de
aspirados da Medula Óssea serão enviadas aos Laboratórios de Referência, para estes estudos especializados. Estes
exames serão realizados sem custo financeiro a você(s).
Benefícios
Não há nenhum benefício direto para a sua criança participar do estudo. A chance de cura para
crianças tratadas com quaisquer desses regimes é esperada de ser no mínimo de 50%. O regime experimental
(GRUPO 2) poderá ou não melhorar a chance de cura.
101
Tratamentos Alternativos
Caso você(s) decida(m) não autorizar a participação da sua criança neste estudo, a terapia padrão
será oferecida de acordo com o protocolo anterior GBTLI LLA-99, com o uso intermitente do par
Mercaptopurina/Methotrexate com dose fixa do Methotrexate. Caso desejem retirar seu consentimento, em
qualquer fase da pesquisa, está poderá ser feita sem penalização alguma e sem prejuízo no cuidado do seu(sua)
filho(a).
Confidencialidade
A identidade da sua criança não será revelada em publicações. Os registros do prontuário também
são confidenciais e, sob a responsabilidade do Hospital.
A Central de Processamento de Dados do GBTLI tem o direito de consulta/revisão de todos os dados
do prontuário, em qualquer necessidade.
Participação Voluntária
A participação da sua criança neste estudo é voluntária. A recusa na participação não leva a nenhum
prejuízo para sua criança, assim como, não comprometerá o cuidado médico com a mesma. Aproximadamente
880 crianças serão tratadas neste estudo.
Esclarecimento de dúvidas
A qualquer momento, em caso de dúvidas, solicite (m) ao médico (a) do seu (sua) filho (a) os
esclarecimentos necessários. Você poderá também contactar o(s) Coordenador (es) do Estudo.
Nome: Dra. Vitória Régia Pereira Pinheiro
RG: 1077971 / CPF: 175171335-00
Rua Dr. Gabriel Porto, 1270.
CEP: 13083-210 - Barão Geraldo
Campinas - SP
Telefone (s): (19) 3787 5016
Fax: (19) 3289 3571
e-mail: [email protected]
Autorização
Eu li este documento a respeito do estudo GBTLI LLA-2009 para Alto Risco de Recidiva ou ele foi
lido para mim. Eu fui informado sobre os riscos e benefícios. Decidi que meu (minha) filho (a) participe desta
pesquisa. Eu sei, também, que tenho a liberdade de recusar o tratamento proposto e, assim mesmo, minha criança
continuará a receber o tratamento médico usual. Eu receberei uma cópia deste consentimento.
Eu dei permissão para minha criança
_______________________________________________________
________________________________________________fazer o protocolo de tratamento GBTLI LLA-2009
para Alto
Risco em _______/________/__________
______/_____/_____
Assin. Pai paciente Data
______/_____/_____
Assin. Mãe paciente Data
______/_____/_____
Testemunha Data
Nome: Dra. Silvia Regina Brandalise RG: 2.837.167 / CPF: 052306328-87 Endereço: Rua Dr. Gabriel Porto, 1270. CEP: 13083-210 - Barão Geraldo Campinas - SP Telefone (s): (19) 3787 5016 Fax: (19) 3289 3571 e-mail: [email protected]
102
Eu expliquei aos familiares/criança este estudo e, considero que eles tiveram suficiente informação
com respeito aos riscos e benefícios, fazendo uma decisão embasada. Eu informarei aos mesmos, no momento
oportuno, quaisquer modificações no procedimento.
______/_____/_____
Assin. Médico Data
103
Anexo 4 - Termo de Consentimento URB/Boldrini
104
105
Anexo 5 - Parecer Consubstanciado CEP
CENTRO INFANTIL DE INVESTIGAÇÕES HEMATOLÓGICAS DR.
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
DADOS DO PROJETO DE PESQUISA
Título da Pesquisa:
Seqüenciamento de alto desempenho para quantificação da Doença Residual Mínima em Leucemia Linfóide
Aguda Pesquisador:
Jose Andres Yunes Área Temática:
Genética Humana:
(Trata-se de pesquisa envolvendo Genética Humana que não necessita de análise ética por parte da CONEP;);
Versão:
1 CAAE:
57280616.4.0000.5376 Instituição Proponente:
Centro Infantil de Investigações Hematológicas Dr.Domingos A Boldrini Patrocinador Principal: Ministério
da Saúde DADOS DO PARECER
Número do Parecer: 1.622.112
Apresentação do Projeto: O projeto de pesquisa se dispõe a estabelecer um novo método de detecção de
Doença Residual Mínima, isto é, detectar por meio de técnicas de Biologia Molecular, pequenas quantidades de
células malignas residuais que podem ser detectadas no organismo do paciente em tratamento quimioterápico. A
detecção da DRM é extremamente importante, pois permite saber como é que o paciente está respondendo ao
tratamento, podendo desta maneira determinar uma outra abordagem terapêutica, passando assim a ter melhores
chances de sucesso no tratamento. Por outro lado, os pacientes que apresentam excelente resposta terapêutica nas
primeiras semanas da terapia, podem passam a receber uma quimioterapia menos intensiva, sem comprometer os
índices de cura e com diminuição dos efeitos colaterais da quimioterapia. O exame padrão de análise da DRM,
implantado desde 2010 pelo Centro Boldrini, demanda muita experiência técnica em biologia molecular, é
demorado e oneroso, razões que tem dificultado sua implantação em outras instituições ou centralização em
abrangência nacional. Apenas 2% (aproximadamente 60) das crianças diagnosticadas anualmente com leucemia
linfóide aguda no Brasil recebem tratamento ajustado pela DRM. Este projeto PRONON pretende padronizar um
método novo de detecção da Endereço: Bairro: CEP:
13.083-210
Telefone:
(19)3787-5001 E-mail: [email protected]
Rua Dr. Gabriel Porto, 1270 Cidade Universitária Barão Geraldo UF: SP Município: CAMPINAS
Fax: (19)3289-3571 Página 01 de 03
CENTRO INFANTIL DE INVESTIGAÇÕES HEMATOLÓGICAS DR. Continuação do Parecer: 1.622.112
DRM, baseado nos últimos equipamentos e técnicas da genômica, o assim chamado sequenciamento de DNA de
última geração” ou “Next Generation Sequencing (NGS)”. Este novo método de análise da DRM tem vantagens
em termos de sensibilidade, custo, escalabilidade e possibilidade de automação. A expectativa é implementar um
método que permita oferecer este valioso exame laboratorial a todas as crianças brasileiras acometidas pela
leucemia.
Objetivo da Pesquisa: Padronizar a análise da Doença Residual Mínima por sequenciamento massivo,
comparando os resultados obtidos pelo método de PCR quantitativo, visando aumento de sensibilidade de
detecção e diminuição de custo deste exame.
Avaliação dos Riscos e Benefícios: Não há risco para os pacientes, uma vez que o material que será utilizado na
pesquisa será colido para os exames de rotina. Os benefícios possíveis são: diminuir o custo e o tempo de
resposta do exame (6 dias versus 23 dias para DRM por RQ-PCR).A expectativa é de que a quantificação da
DRM por NGS permitirá oferecer o exame para todas as crianças com LLA do Brasil.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa: O projeto se propõe a estabelecer uma metodologia inovadora
106
que poderá ser de altíssima importância para o país, uma vez que poderá atender todos os pacientes pediátricos
com LLA, o que hoje não é possível.
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória: O projeto apresenta o TCLE referente a outro
projeto de pesquisa que fará a coleta das amostras que serão utilizada também neste projeto e pede dispensa de
apresentar TCLE.
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações: Acredito que seja cabível a dispensa do TCLE para este
projeto específico.
Considerações Finais a critério do CEP: Projeto Aprovado, apresentar relatório parcial em 6 meses.
Este parecer foi elaborado baseado nos documentos abaixo relacionados:
Tipo Documento Arquivo Postagem Autor Situação Informações Básicas do Projeto
PB_INFORMAÇÕES_BÁSICAS_DO_P ROJETO_226681.pdf
20/06/2016 16:15:21
Aceito Endereço:
Rua Dr. Gabriel Porto, 1270 Cidade Universitária Bairro: Barão Geraldo
CEP:
13.083-210 UF: SP Município: CAMPINAS Telefone:
(19)3787-5001 Fax: (19)3289-3571
E-mail: [email protected] Página 02 de 03
CENTRO INFANTIL DE INVESTIGAÇÕES HEMATOLÓGICAS DR. Continuação do Parecer: 1.622.112
Folha de Rosto folha_de_Rosto_DRMseq_assinado.pdf 20/06/2016
16:12:35
CAMPINAS, 05 de Julho de 2016
Assinado por: Maristela Amaral Palazzi (Coordenador)
Jose Andres Yunes Aceito
Outros Parecer_2_Fapesp_proj_DRM_por_NG
S.pdf
20/06/2016 11:35:21
Jose Andres Yunes Aceito
Outros Parecer_1_Fapesp_proj_DRM_por_NG
S.pdf
20/06/2016 11:34:57
Jose Andres Yunes Aceito
Declaração do Patrocinador
Termo_Acordo_MinisterioSaude_e_Bold rini_proj_PRONON_DRM_NGSseq.pdf
20/06/2016 11:29:39
Jose Andres Yunes Aceito
Declaração do Patrocinador
Aprova_Readequacao_MinisterioSaude _proj_PRONON_DRM_NGSseq.pdf
20/06/2016 11:28:58
Jose Andres Yunes Aceito
TCLE / Termos de Assentimento / Justificativa de Ausência
TCLEs_protocolo_de_tratamento_da_LL A_GBTLI2009.pdf
20/06/2016 11:28:01
Jose Andres Yunes Aceito
Brochura Pesquisa Proj_PRONON_DRMseq_260814_resu
mo_e_sinopse.docx
20/06/2016 11:26:58
Jose Andres Yunes Aceito
Projeto Detalhado / Brochura Investigador
Proj_PRONON_DRMseq_140415_com_ indice_FINAL_p_PlataformaBrasil.docx
20/06/2016 11:26:07
107
Jose Andres Yunes Aceito
Situação do Parecer: Aprovado
Necessita Apreciação da CONEP: Não Endereço:
Rua Dr. Gabriel Porto, 1270 Cidade Universitária Bairro: Barão Geraldo
CEP:
13.083-210 UF: SP Município: CAMPINAS Telefone:
(19)3787-5001 Fax: (19)3289-3571
E-mail: [email protected] Página 03 de 03
108
109
110
111
Anexo 6 - Declaração de Direitos Autorais
