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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
EFEITO DA INSULINEMIA SOBRE A PRODUÇÃO IN VIVO DE EMBRIÕES DE
CABRAS MOXOTÓ
Aline Lima de Souza
Fortaleza – Ceará
Dezembro, 2006
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2
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Aline Lima de Souza
EFEITO DA INSULINEMIA SOBRE A PRODUÇÃO IN VIVO DE EMBRIÕES DE
CABRAS MOXOTÓ
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Ciências Veterinárias –
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Área: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientador: Prof. Dr. Davide Rondina.
Fortaleza – Ceará
Dezembro, 2006
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S719e Souza, Aline Lima de Efeito da insulinemia sobre a produção in vivo de
embriões de cabras Moxotó / Aline Lima de Souza. Fortaleza, 2006. 84p. Orientador: Prof. Dr. Davide Rondina. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 1. Pequenos ruminantes. 2. Insulinemia. 3. Produção de embriões. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.089
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Universidade Estadual do Ceará
Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias
Título do trabalho: Efeito da insulinemia sobre a produção in vivo de embriões de cabras
Moxotó.
Autor: Aline Lima de Souza
Defesa em: 15/12/2006 Conceito obtido: Satisfatório
Nota obtida: 9,7
Banca Examinadora
___________________________________________
Prof. Dr. Davide Rondina
Orientador
___________________________________________
Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas
Co-orientador
___________________________________________
Dra. Dárcio Ítalo Alves Teixeira
(Efetivo)
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“A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da vida está no
amor que não damos, nas forças que não usamos, na prudência egoísta que
nada arrisca, e que, esquivando-se do sofrimento, perdemos também a
felicidade”.
Carlos Drummond de Andrade
“Só existem dois dias no ano em que você não pode fazer nada pela sua vida:
Ontem e Amanhã”.
Dalai Lama
“Não há progresso sem mudança. E, quem não consegue mudar a si
mesmo, acaba não mudando coisa alguma”.
George Bernard Shaw
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DEDICATÓRIA
“Dedicado a todos aqueles que me apoiaram e incentivaram nos
momentos mais difíceis deste trajeto nestes últimos dois anos em busca do
meu objetivo maior, o Mestrado”.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, primeiramente, por ter me fortalecido e me erguido todas as vezes
que me senti desmotivada pelo cansaço e pelos obstáculos impostos.
Agradeço aos meus pais, Maria das Graças Lima de Souza e Paulo Sérgio de Souza,
e ao meu irmão, Alisson Lima de Souza, por todo o amor a mim concedido, pelo apoio
emocional e pelo incentivo, por serem o meu porto seguro, pra onde sei que sempre poderei
retornar tranquila. Amo vocês.
Agradeço a minha avó, Emília Lopes Cardoso, e a Elenilda da Silva, Luisa Lopes
Matos e Solange Farias, tias queridas que tanto amo e admiro, pela alegria e momentos
engraçados que passamos juntas, pelos conselhos, e exemplo de determinação em tudo o
que fazem, simplesmente por serem mulheres empreendedoras e vitoriosas.
Agradeço ao meu namorado, Daniel Medeiros Bastos, por conseguir tão facilmente
me passar todo o seu otimismo e perseverança em tudo o que faz, e por seu carinho e
atenção.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Davide Rondina, por todos esses anos de
orientação, dedicação e apoio, acompanhando-me desde a Iniciação Científica.
Agradeço ao Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas, pela oportunidade de
ingressar no Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, LFCR, no qual aprendi
bastante e tive a possibilidade de desenvolver este Projeto de Mestrado.
Agradeço a toda a equipe do LFCR que esteve presente na execução deste trabalho,
as mestrandas Alexsandra Fernandes Pereira e Maria Luciana Lira de Andrade, aos
professores Dr. Dárcio Ítalo Alves Teixeira e Dr. Edílson Soares Lopes Jr, e aos alunos de
Medicina Veterinária e de Iniciação Científica, Deborah de Melo Magalhães, Francisco
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Carlos de Sousa, , João Davi Araújo da Silva, Karlliely de Castro Almeida, Raylene Ramos
Moura e Suely Renata Gaya Avelar.
Agradeço aos alunos de Medicina Veterinária e Iniciação Científica do Laboratório
de Nutrição e Produção de Ruminantes – LANUPRUMI, Amanda Nogueira Fernandes,
Camila Pontes Albuquerque, Célio Souza da Rocha, Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro,
Elizabeth da Silva Brito, Isadora Machado Teixeira Lima, José Moreira Lima Neto e Paulo
Rafael Cardoso Correia.
Agradeço a parceria e colaboração inestimável dos amigos Anderson Pinto
Almeida, Iracelma Julião de Arruda e Ney Rômulo de Oliveira Paula, pelas horas de
seriedade que dedicamos juntos a este trabalho, e pelos momentos de descontração.
Agradeço a todos os amigos que estiveram bastante presentes durante estes dois
anos de mestrado, tia Angelina Campos, tia Claudenir Bastos, tia Mara Grüber, Camila
Rodrigues (Milinha), Daniele e Gisele Bastos, minhas amigas-irmãs Ingrid e Izis Grüber,
Iraína Campos (Nêga) e Larissa Férrer (Lala); e aos que tive o prazer de conhecer e
conviver nestes últimos tempos, Erika Beserra de Menezes e Magda Regina Rodrigues.
Agradeço ao BNB FUNDESP e a CAPES pelo apoio financeiro durante a execução
deste Projeto e durante todo o Mestrado Acadêmico.
Agradeço aos professores e funcionários do PPGCV, em especial, as professoras
Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Lúcia Daniel Machado da Silva e Maria Fátima da Silva
Teixeira, pela disponibilidade, colaboração e ensinamentos, e aos funcionários Antônio
César Camelo e Selmar Alves da Silva.
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RESUMO
Os processos reprodutivos nos ruminantes requerem a interação entre nutrição e fêmea, e
um comprometimento nessa relação pode ocasionar falhas na produção hormonal,
ovulação, fertilização, bem como no desenvolvimento embrionário. Desta forma, o objetivo
deste trabalho foi estudar o efeito da insulinemia sobre a produção in vivo de embriões de
cabras da raça Moxotó. Para tanto, dezessete cabras adultas da raça Moxotó foram
sincronizadas através de esponjas vaginais contendo 60 mg MPA por 11 dias e 50 µg de
cloprostenol, 48 h antes da remoção da esponja, e superovuladas com 120 mg pFSH i.m.
em doses decrescentes intervaladas por 12 h por três dias consecutivos. Um grupo de sete
animais recebeu 0,2UI/kgPV/dia de insulina humana de longa ação, injetada
subcutaneamente, simultaneamente com as aplicações de pFSH, e um outro grupo de cinco
animais recebeu essa mesma dose de insulina, porém, por três dias consecutivos 24 horas
após a monta. No terceiro grupo, cinco animais foram suplementados com 80
mL/animal/dia de propilenoglicol continuamente durante o experimento. A colheita de
embriões foi realizada sete dias após a monta e os embriões foram classificados segundo
critérios da IETS. Colheitas de sangue foram realizadas a cada três dias para a análise dos
níveis de insulina. Administração de insulina elevou os níveis plamáticos da mesma nos
animais (P < 0,05), porém, no grupo tratado com propilenoglicol, essa taxa foi diferente
apenas entre o tratamento com pFSH e após a monta (P < 0,05). Os grupos foram
semelhantes (P > 0,05) quanto à taxa de recuperação total de embriões (80,05 ± 9,78%) ou
estruturas transferíveis (61,03 ± 15,13%). O tratamento não influenciou (P > 0,05) a
responsividade ao tratamento superovulatório (64%). Contudo, foi evidenciado um
aumento no número de embriões considerados de excelente qualidade em relação aos
embriões das fêmeas suplementadas com propilenoglicol. Quando a insulina foi
administrada antes da monta, foi evidenciada uma forte relação (R = 0,90) (P < 0,05) entre
o número de embriões transferíveis e ovulações nos animais. Em conclusão, cabras
superovuladas tratadas com baixas doses de insulina exógena resultaram em melhor
qualidade embrionária, que foi relacionada às mudanças nas concentrações circulantes de
insulina.
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10
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO 9
LISTA DE FIGURAS 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 13
1. INTRODUÇÃO 15
2. REVISÃO DE LITERATURA 16
3. JUSTIFICATIVA 36
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA 37
5. OBJETIVOS 38
6. CAPÍTULO 1 39
7. CONCLUSÃO GERAL 52
8. PERSPECTIVAS 53
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
10. ANEXOS 66
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11
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Fig. 1. Período de vida livre embrionária, ou período de pré-implantação, ao
longo do trajeto oviduto-útero.
17
Fig. 2. Sucessivas clivagens embrionárias. Zigoto (A); Embrião no estágio de 2
(B), 4 (C) e 16 (D) células; Embrião no estágio de Mórula compacta (E).
(Adaptado a partir de Laboratoire de Biologie de la Reproduction;
Lausanne, www.embryology.ch).
17
Fig. 3. Embrião no estágio de blastocisto, aproximadamente no Dia 5. Nessa
fase ocorre a compactação das células para formação da Massa Celular
Interna (ICM) ou embrioblasto (1) e acúmulo de fluido intercelular,
levando à formação da cavidade blastocística (4). Zona pelúcida (2) e
trofectoderma ou trofoblasto, primeiro epitélio formado durante o
desenvolvimento embrionário (3). (Adaptado a partir de Laboratoire de
Biologie de la Reproduction; Lausanne, www.embryology.ch).
19
Fig. 4. Ativação do genoma embrionário. Transição do controle materno da
síntese protéica para a autosuficiência embrionária, que em ruminantes,
ocorre por volta do estágio de 8 a 16 células, durante o período de pré-
implantação embrionário (Adaptado de Lonergan et al., 2003).
21
Fig. 5. Rompimento da Zona Pelúcida do Blastocisto por volta do Dia 8-9 do
desenvolvimento embrionário (Adaptado a partir de Laboratoire de
Biologie de la Reproduction; Lausanne, www.embryology.ch).
22
Fig. 6. Representação esquemática do modelo de localização do sistema de
transporte de glicose no Blastocisto. GLUT3 (em vermelho) está
distribuído apicalmente sobre as células do Trofectoderma, sendo
responsável pelo consumo de glicose materna, enquanto o transporte
basolateral de glicose é feito por GLUT1 (em verde) para a massa
celular interna (ICM). GLUT2 mantém as concentrações de glicose na
blastocele (Adaptado de Pantaleon & Kaye, 1998).
26
�
12
Fig. 7. Representação esquemática das interações entre o ambiente de
desenvolvimento embrionário e suas conseqüências a curto e a longo-
prazo sobre o potencial de desenvolvimento embrionário e pós-natal
(Adaptado de Fleming et al., 2004).
31
Fig. 8. Animais da raça Moxotó. (A) Fêmeas experimentais, (B) Bode
experimental, (C) Detecção do estro das fêmeas, (D) Momento da
cobertura de uma das fêmeas (Fonte: Almeida, AP).
82
Fig. 9. (A) Início do tratamento de sincronização do estro, momento da
inserção de esponja vaginal; (B) Coleta de sangue, (C) Laparotomia
para recuperação embrionária, (D) Exposição do trato reprodutivo de
uma das fêmeas momentos antes da colheita de embriões (Fonte:
Almeida, AP).
83
Fig. 10. (A) Lavagem do corno uterino de uma das fêmeas do experimento para
recuperação embrionária; (B) Lavado uterino contendo as estruturas
totais recuperadas; (C),(D) e (E) Embriões recuperados do lavado
uterino, e submetidos à avaliação morfológica; (F) Embriões caprinos
no estágio de Mórula. (Fonte: Laboratório de Fisiologia e Controle da
Reprodução - LFCR).
84
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13
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Abreviatura Significado
AGE Ativação do Genoma Embrionário
ATP Adenosina tri-fosfato
CAPES Comissão de Aperfeiçoamento Pessoal de Ensino Superior
CL Corpo lúteo
Cx43 Conexina 43
DNA Ácido desoxirribonucléico
EM Energia de manutenção
EPM Erro padrão médio
FSH Hormônio folículo estimulante
GLUTs Transportadores de glicose
G6PD Enzima Glicose-6-fosfato desidrogenase
ICM Massa celular interna
IETS Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
IFN� Interferon �
IGFs Fatores de crescimento semelhantes à insulina
i.m Intra muscular
kg kilograma
LH Hormônio Luteinizante
LIF Fator inibidor da leucemia
LOS Large Offspring Syndrome (Síndrome da Cria Gigante)
MAP Acetato de medroxiprogesterona
mg miligrama
mL mililitro
MnSOD Enzima manganês superóxido dismutase
mRNA RNA mensageiro
Na+/K+-ATPase Enzima sódio potássio - ATPase
pFSH Hormônio folículo estimulante de origem suína
PGF2α Prostaglandina F2α.
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PV Peso Vivo
rbGH Hormônio recombinante do crescimento bovino
RNA Ácido ribonucléico
TGF-α Fator de crescimento e de diferenciação celular
µm Micrômetro (1 x 10-6 m)
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1. INTRODUÇÃO
A adequada oferta de nutrientes é fundamental à sobrevivência das espécies,
controlando, assim, diversos processos biológicos, tais como os reprodutivos (da
maturidade à receptividade sexual, prenhez e lactação) (Cosgrove et al., 1995). Porém, uma
das maiores dificuldades na interpretação das interações entre reprodução e nutrição é
avaliar o estado nutricional. Entretanto, o estado nutricional dos animais pode ser baseado
principalmente em alguns parâmetros, como o peso vivo e as mudanças no estado corpóreo
(Scaramuzzi & Murray, 1994). Mesmo assim, algumas medidas são muito imprecisas, pois
descrevem apenas as mudanças a longo prazo, ao passo que muitos dos componentes dos
processos reprodutivos na fêmea (ovulação, fecundação e implantação) demandam períodos
relativamente breves (Haresign, 1981).
Existem situações contrastantes e consistentes, onde o acesso à dieta parece reduzir
a qualidade dos embriões, como observado em ovelhas submetidas a altos níveis de glicose
e superovuladas, que produziram embriões de qualidade reduzida (Yaakub et al., 1997). As
infusões de glicose têm sido associadas a reduções nas taxas de gestação (Rubio et al.,
1997). Portanto, o efeito de dietas extremas no desenvolvimento embrionário é evidente,
mas o ponto ao qual as mudanças ocorrem é ainda desconhecido (Boland et al., 2001).
Objetivando ressaltar a importância do papel nutricional sobre a dinâmica
reprodutiva e produção de embriões em pequenos ruminantes, em especial, na espécie
caprina, este trabalho enfocará a seguinte revisão de literatura, que abordará o modelo de
desenvolvimento embrionário no período de pré-implantação, quanto à morfofisiologia e
controle do desenvolvimento embrionário durante a pré-implantação, metabolismo e
desenvolvimento embrionário durante a pré-implantação e sinalização materna-embrionária
durante a pré-implantação; além do balanço energético materno e desenvolvimento
embrionário inicial quanto à influência do estado nutricional materno sobre o
desenvolvimento e viabilidade embrionária.
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16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. MODELO DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO NO PERÍODO DE
PRÉ-IMPLANTAÇÃO
2.1.1. Morfofisiologia e controle do desenvolvimento embrionário durante a pré-
implantação
O período de pré-implantação é o intervalo compreendido entre a fertilização até a
implantação do embrião, caracterizado como um período de vida livre do desenvolvimento
do embrião ao longo do trajeto entre o oviduto e o útero (Watson et al., 2004) (Figura 1). A
fertilização é um processo que ocorre em poucas horas após a ovulação, e em seguida
inicia-se a clivagem do zigoto, que consiste em divisões mitóticas sucessivas da célula-ovo
em pequenas células denominadas de blastômeros (Figura 2). Esse processo de divisão é
caracterizado por ser um período de intensa replicação de DNA e divisão celular na
ausência de crescimento. As clivagens iniciais são sincrônicas, depois essa sincronia é
perdida. Os blastômeros são organizados em camadas ou grupos, e cada grupo possui uma
taxa característica de clivagem. Em mamíferos, os zigotos permanecem no oviduto por
poucos dias após o início das divisões celulares. Por volta da 3ª divisão ou clivagem, o
embrião inicia o processo de compactação para a formação da mórula. Nesse estágio,
ocorre um significante aumento na síntese de RNA, proteínas e fosfolipídios. O embrião no
estágio de mórula sai do oviduto e entra no útero aproximadamente no Dia 4 após a monta
(Dia 0 = dia da monta) (Spencer et al., 2004). Sob a influência de hormônios esteróides
ovarianos, as contrações dos músculos circulares e longitudinais da tuba uterina conduzem
o zigoto em direção ao útero (Hunter, 1987). A concentração cada vez mais elevada de
progesterona, proveniente do corpo lúteo, promove o relaxamento gradual da musculatura
da tuba uterina e reduz o edema da mucosa, aumentando a luz e as contrações rítmicas que
permitirão a chegada do concepto à cavidade uterina. Decorridas 24, 48 e 72 horas após a
ovulação, o zigoto de pequenos ruminantes, caprinos e ovinos, apresenta 2, 4 e 16 células.
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17
Figura 1. Período de vida livre embrionária, ou período de pré-implantação, ao longo do
trajeto oviduto-útero.
A B C D EA B C D E
Figura 2. Sucessivas clivagens embrionárias. Zigoto (A); Embrião no estágio de 2 (B), 4
(C) e 16 (D) células; Embrião no estágio de mórula compacta (E). (Adaptado a partir de
Laboratoire de Biologie de la Reproduction; Lausanne, www.embryology.ch).
A compactação é o primeiro evento morfogenético do desenvolvimento embrionário
na fase de pré-implantação, e é caracterizada por um aumento do contato célula-a-célula
entre os blastômeros até que haja o desaparecimento do esboço individual dos mesmos
(Watson & Barcroft, 2001; Stanton et al., 2003). Nesta fase, ocorrem, ao mesmo tempo, a
diferenciação do trofectoderma e o início da polaridade do embrião nos blastômeros
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18
externos (Watson & Barcroft, 2001). O trofectoderma é o primeiro epitélio formado durante
o desenvolvimento dos embriões mamíferos, originando as estruturas extra-embrionárias.
Ele atua, inicialmente, como uma barreira seletiva que movimenta os solutos para dentro e
fora da blastocele, em particular, pela ação da enzima Na+/K+-ATPase (Biggers et al., 1988;
Watson & Barcroft, 2001). A regulação da formação de fluido na blastocele e, portanto, a
provisão de nutrientes para a massa celular interna é determinada pela atividade
transportadora do trofectoderma (Jaszczak et al., 1972; Robinson & Benos, 1991; Brison &
Lesse, 1993), sendo ele o responsável pelo contato inicial com o endométrio, promovendo a
união do embrião com o mesmo durante a implantação.
Durante a compactação, observa-se uma intensa atuação das chamadas junções de
aderência, que são essenciais para a adesão celular e precedem ao estabelecimento de
outros contatos célula-a-célula, tais como desmossomos e junções celulares apertadas
(Kemler, 1993). As junções apertadas são compostas de caderinas, que são proteínas de
membrana, que assim como as cateninas � e �, bem como a actina citoesquelética, são
expressas e armazenadas no oócito durante a oogênese, estando presentes, além disso, nos
embriões nos primeiros estágios de desenvolvimento (Vestweber et al., 1987). Porém, a
adesão celular estável mediada pelas caderinas não começa até que a compactação seja
iniciada (Sefton et al., 1996; Pauken & Capco, 1999). O rompimento da adesão celular
interfere na formação do blastocisto, resultando em letalidade ainda na fase de pré-
implantação (Larue et al., 1994; Rietchmacher et al., 1995). Uma vez que ocorre a
compactação, as células externas do embrião começam a elaborar os seus complexos
juncionais, em particular as junções apertadas, e também seu sistema de transporte de íons,
ajustando-se para a formação do blastocisto (Fleming et al., 2000). A enzima Na+/K+-
ATPase é bastante ativa na etapa da formação do blastocisto (Kaplan, 2002). Tem sido
observado, também no trofectoderma, a presença de polipeptídeos conhecidos como
aquaporinas ou canais de água, que podem ser importantes por facilitarem o movimento de
água durante a formação do blastocisto (Offenberg et al., 2000).
A principal etapa do desenvolvimento embrionário na fase da pré-implantação
envolve a formação do blastocisto, que é caracterizada por eventos morfofisiológicos nos
quais as células externas do trofectoderma circundam a blastocele (Figura 3), que contém a
massa celular interna (ICM) (Wiley, 1987; Biggers et al., 1988). O blastocisto inicial, a
�
19
princípio, não apresenta aumento de tamanho, mas se expande nos próximos 2 dias pelo
acúmulo de fluido na cavidade blastocística central, que é circundada pelo trofectoderma.
Nesta fase, eventos do desenvolvimento embrionário, tais como as sucessivas clivagens,
determinam parâmetros importantes, como o número de células da massa celular interna,
fortemente correlacionado ao normal desenvolvimento fetal (Lane & Gardner, 1997). O
estabelecimento de uma taxa adequada de ICM : células do trofectoderma é considerado
essencial para garantir a subseqüente viabilidade embrionária (Fleming, 1987). Durante a
fase de pré-implantação, existe a atuação fundamental de genes que controlam este
intervalo de desenvolvimento, incluindo famílias que codificam para a polaridade celular,
células juncionais, citoesqueleto, transporte de íons e formação de canais que transportam
água na célula (Watson & Barcroft, 2001; Stanton et al., 2003).
Figura 3. Embrião no estágio de blastocisto, aproximadamente no Dia 5. Nessa fase ocorre
a compactação das células para formação da Massa Celular Interna (ICM) ou embrioblasto
(1) e acúmulo de fluido intercelular, levando à formação da cavidade blastocística (4). Zona
pelúcida (2) e trofectoderma ou trofoblasto, primeiro epitélio formado durante o
desenvolvimento embrionário (3) (Adaptado a partir de Laboratoire de Biologie de la
Reproduction; Lausanne, www.embryology.ch).
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O período de pré-implantação de embriões mamíferos é caracterizado por
importantes transições no desenvolvimento, e a primeira e talvez a mais importante
mudança seja a ativação do genoma embrionário (Figura 4), quando os transcritos que
começam a ser produzidos pela ativação do genoma zigótico/embrionário passam a
substituir àqueles de origem materna que orientaram o desenvolvimento inicial do embrião
(Schultz et al., 1999). Durante a oogênese, o oócito acumula grande quantidade de RNAs e
proteínas capazes de regular e manter o desenvolvimento inicial do embrião durante o
período de pré-implantação (Brevini & Gandolfi, 2001), dentre eles, fatores de transcrição
envolvidos no processo de ativação do genoma embrionário (Viuff et al., 1996).
A ativação da transcrição dentro do genoma embrionário é um processo complexo
requerido para a coordenação de uma série de eventos nucleares e citoplasmáticos. Nesta
fase, protaminas são substituídas por histonas, o genoma parental haplóide metilado passa
por demetilação e formação do zigoto diplóide e o controle materno do desenvolvimento é
gradualmente substituído pelo controle embrionário (Schultz et al., 1999; Brevini &
Gandolfi, 2001, Kanka, 2003). O exato controle da transcrição durante a ativação do
genoma embrionário é essencial para a normal embriogênese, e a regulação desse evento
depende da estrutura da cromatina e conteúdo macromolecular citoplasmático (Kanka,
2003). Em ruminantes, a ativação do genoma embrionário ocorre por volta do estágio de 8-
16 células, quando ocorrem as principais mudanças na ultra-estrutura do nucléolo do
blastômero e nos padrões de síntese protéica (Memili & First, 2000).
Acredita-se que uma das funções primárias da ativação do genoma embrionário seja
a prevenção da morte celular programada, ou apoptose, uma vez que o oócito apresenta
informações capazes de ativar esse mecanismo de morte celular quando não fertilizado
(Jurisicova, 1998; Dalbiés-Tran & Mermillod, 2003).
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21
Figura 4. Ativação do genoma embrionário (AGE). Transição do controle materno da
síntese protéica para a autosuficiência embrionária, que em ruminantes, ocorre por volta do
estágio de 8 a 16 células, durante o período de pré-implantação embrionário (Adaptado de
Lonergan et al., 2003).
Todos os eventos do desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação
dependem da atuação de fatores de crescimento e citocinas de regulação materna
(parácrina) e embrionária (autócrina), que sinalizam e ativam vias de comunicação
intracelular através de receptores de membranas (Schultz & Heyner, 1993). Células do
oviduto e de embriões na fase de pré-implantação expressam mRNAs que codificam uma
extensa lista de genes ligados a fatores de crescimento, citocinas e receptores (Watson et
al., 1992, 1994; Xia et al., 1996; Winger et al., 1997), tais como os fatores de crescimento
semelhantes à insulina (IGFs), que possuem influências anabólicas e mitogênicas, e estão
presentes no ambiente materno e em embriões durante o início da gestação (Murphy &
Barron, 1993; Kaye, 1997).
Por volta dos Dias 8 e 9 ocorre o rompimento da zona pelúcida do blastocisto, e sua
ruptura é atribuída ao crescimento do blastocisto ou a lises enzimáticas por proteases
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FFaasseess ddee ddeesseennvvoollvviimmeennttoo
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22
uterinas e/ou embrionárias (Figura 5). O blastocisto, morfologicamente, antes da ruptura, é
esférico e mede cerca de 200 µm de diâmetro, possuindo aproximadamente 300 células
(Wintenberger-Torres & Flechon, 1974).
Figura 5. Rompimento da zona pelúcida do blastocisto por volta do Dia 8-9 do
desenvolvimento embrionário (Adaptado a partir de Laboratoire de Biologie de la
Reproduction; Lausanne, www.embryology.ch).
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23
2.1.2. Metabolismo e desenvolvimento embrionário durante a pré-implantação
O embrião, na fase de pré-implantação, parece se adequar bem mais a baixas taxas
de consumo metabólico, bem mais compatível com o seu potencial de desenvolvimento e
viabilidade, do que a altas taxas de consumo, que é característico de stress metabólico
(Leese, 2003; Leese, 2002). Sendo assim, os primeiros ciclos de clivagem de embriões
bovinos no estágio de pré-implantação dependem principalmente da oxidação de nutrientes,
especificamente piruvato para o suprimento energético (Thompson et al., 1996). Como em
outras espécies (Leese, 1995), existe um aumento do consumo de glicose e produção de
lactato com a compactação embrionária (Thompson et al., 1996). Embora a taxa de
consumo de glicose aumente com o decorrer das últimas clivagens, a principal fonte de
obtenção de energia pelo blastocisto é a fosforilação oxidativa e não a glicólise (Leese,
2003; Houghton et al., 1996). Foi demonstrado recentemente que o primeiro aumento
marcante na oxidação de glicose acontece entre as fases de 12 e 16 células no embrião, mas
a incorporação de maiores níveis de glicose começa a se dar continuamente a partir de 16
células e fase de blastocisto (Khurana & Niemann, 2000). Portanto, condições de
hiperglicemia podem demonstrar a associação entre metabolismo embrionário, stress e
potencial de desenvolvimento futuro, onde uma elevação no metabolismo da glicose,
particularmente via glicólise, pode ser vista como uma resposta do embrião ao stress
(Leese, 2002; Leese, 1998).
A glicólise elevada pode ser um indicador de stress metabólico embrionário, e o
aumento do consumo de glicose, por si só, pode ser um bom indicador do desenvolvimento
embrionário após a transferência (Gardner & Leese, 1987). Assim, altas concentrações de
glicose no ambiente de desenvolvimento embrionário podem depletar a expressão de
transportadores de glicose ao nível protéico e de mRNA (Chi et al., 2001), levando à
ativação de vias apoptóticas, degradação da cromatina e fragmentação nuclear (Hinck et al.,
2003), que culminam na redução do número de células do blastocisto (Lea et al., 1996).
Esses efeitos deletérios ao embrião também podem ser derivados de perturbações na
maturação oocitária em resposta a altos níveis de glicose (Colton et al., 2002). Após
transferência, tem-se observado absorções e perdas de embriões provenientes de ambientes
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com altas concentrações de glicose, ressaltando a relação entre stress metabólico e a
capacidade de desenvolvimento embrionário (Carayannopoulos et al., 2004).
Assim, blastocistos bovinos dependem principalmente da fosforilação oxidativa
(86%) e glicólise (14%) para gerar ATP para o processo de cavitação (Rieger et al., 1992;
Donay & Leese, 1999). Gopichandran & Leese (2003) observaram, em blastocistos bovinos
in vitro, que o consumo de piruvato e a produção de lactato foram significativamente
maiores, enquanto o consumo de glicose foi significativamente menor (P<0,001). Também
foi verificado que a concentração de lactato, piruvato e glicose no fluido da blastocele foi,
respectivamente, significativamente maior para o primeiro e menor para os dois últimos,
em relação às concentrações destes no meio de cultivo SOFaaBSA. As baixas
concentrações de piruvato e glicose no fluido da blastocele de embriões bovinos pode ser
explicada pelo baixo transporte para a cavidade, devido ao sistema de transporte ou pela
utilização dos mesmos pelas células do trofectoderma e/ou da massa celular interna
(Brisson et al., 1993; Hewitson & Leese, 1993).
Lonergan et al. (2003) relataram genes relacionados a processos fisiológicos
importantes no desenvolvimento de embriões bovinos no estágio de pré-implantação, tais
como transporte e metabolismo de frutose (GLUT-5), atividade mitocondrial (MnSOD),
comunicação celular (Cx43), reconhecimento materno da gestação (IFN�), fator de
crescimento (IGF) e metabolismo e estresse oxidativo (G6PD). Métodos como a RT-PCR
têm sido utilizados para demonstrar um grande número de genes relacionados aos fatores
de crescimento, que são expressos durante o desenvolvimento de pré-implantação do
embrião, tais como mRNAs de TGF-α, IGF-I e IGF-II, e também do LIF (De Sousa,
1998). Produtos dos genes TGF-α, receptor de insulina, IGF-I e IGF-II têm apresentado um
padrão de expressão similar em embriões bovinos e ovinos em desenvolvimento (Watson et
al., 1994). A expressão precoce desses fatores de crescimento (IGF-I, IGF-II, TGF-α e LIF)
no embrião sugere que essas moléculas desempenham papéis essenciais para a manutenção
da progressão do embrião ao longo da primeira semana de desenvolvimento. Reforçando a
função desses genes, a aplicação de um único fator de crescimento ou uma associação
destes em meio de cultivo livre de soro demonstrou promover o desenvolvimento de
embriões bovinos (Schultz et al., 1996).
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Dentre esses genes importantes para o controle fisiológico, os que codificam para a
síntese e localização de transportadores de glicose (GLUTs) controlam o mecanismo
homeostático usado por embriões em estágio de pré-implantação para regular as
concentrações de substratos dentro da cavidade da blastocele. Pantaleon & Kaye (1998)
sugeriram que a distribuição apical de GLUT3 sobre a membrana do trofectoderma é
responsável pelo consumo de glicose externa, que em combinação com a expressão
basolateral de GLUT1 fornecem glicose para a massa celular interna. A localização de
GLUT2 na superfície interna da membrana da blastocele em contato com o fluido pode ser
indicativo do papel regulatório da manutenção das concentrações de glicose na cavidade,
contudo, o mecanismo preciso permanece a ser determinado (Figura 6). Quanto à expressão
de RNAm de GLUT-5, esta não foi detectada antes do estágio de 8 células em embriões
cultivados in vitro e in vivo (Lonergan et al., 2003). Esses resultados estiveram de acordo
com os achados de Augustin et al. (2001), que relacionaram o aparecimento do GLUT-5, a
partir do estágio de 8 células, com uma alta afinidade desse gene para o transporte de
frutose no embrião, tornando embriões nos estágios iniciais de desenvolvimento aptos para
o transporte desse substrato energético encontrado no fluido uterino.
A identificação das diferenças qualitativas na produção de RNAm desses genes no
embrião, em sua primeira semana de vida, é uma importante ferramenta para elucidar o
conhecimento sobre fatores genéticos moleculares essenciais para o controle materno sobre
o desenvolvimento embrionário, principalmente na fase de pré-implantação, pois os eventos
desta fase são cruciais para as posteriores etapas de desenvolvimento, diferenciação,
crescimento e implantação do embrião.
Outros substratos, tais como os aminoácidos, no estágio inicial de desenvolvimento,
servem a uma variedade de funções fisiológicas que incluem: síntese protéica (Epstein &
Smith, 1973), provisão energética (Partidge & Leese, 1996; Jung et al., 1998),
osmorregulação (Baltz, 2001) regulação do pH (Edwards et al., 1998), proteção contra o
estresse oxidativo (Lindenbaum, 1973) e remoção de amônio (Leese, 1991; Partridge &
Leese, 1996; Donay & Leese, 1999). Tem-se observado que um aminoácido, em particular,
a leucina, atua como uma molécula sinalizadora que é capaz de regular a expressão de
genes, a síntese de proteínas e crescimento do blastocisto (Fox et al., 1998; Martin &
Sutherland, 2001; Van Winkle, 2001). Similarmente, a arginina pode ser requerida para a
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26
produção de óxido nítrico, que regula o crescimento embrionário (Gouge et al., 1998). Van
Winkle (2001) sugeriu que a arginina e a leucina podem promover o crescimento do
blastocisto pelo aumento do suprimento energético e capacidade de síntese protéica via
aumento da sinalização. Além disso, o consumo consistente desses aminoácidos podem
indicar seus requerimentos nas células do blastocisto para a regulação de genes, sinalização
celular e síntese de proteínas.
Figura 6. Representação esquemática do modelo de localização do sistema de transporte de
glicose no blastocisto. GLUT3 (em vermelho) está distribuído apicalmente sobre as células
do trofectoderma, sendo responsável pelo consumo de glicose materna, enquanto o
transporte basolateral de glicose é feito por GLUT1 (em verde) para a massa celular interna
(ICM). GLUT2 mantém as concentrações de glicose na blastocele (Adaptado de Pantaleon
& Kaye, 1998).
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27
A exigência dietética para micronutrientes durante o desenvolvimento é pequena;
porém, adequadas quantidades são essenciais para ambos o imediato e a longo prazo bem-
estar do embrião, feto e neonato. Micronutrientes estão envolvidos em todas as fases de
crescimento celular e diferenciação, incluindo sinalização celular e tradução de proteína,
além de serem elementos fundamentais de muitos sítios de enzimas catalíticas e estruturas
celulares (Ashworth & Antipatis, 2001). Muitas vitaminas também regulam a expressão de
genes fundamentais envolvidos no desenvolvimento de linhagens celulares específicas, e de
genes envolvidos no crescimento, proliferação e no funcionamento de órgãos específicos.
Micronutrientes também afetam o desenvolvimento por causarem mudanças na composição
de hormônios, fatores de crescimento e vias de sinalização celular, que afetam ambos o
consumo de nutrientes pelo concepto e o ambiente no qual ocorrerá o desenvolvimento pré-
natal. Deficiências severas de micronutrientes durante a gestação levam a altas taxas de
aborto espontâneo, má formação fetal e morte fetal precoce. Dentre os micronutrientes
importantes em embriões no estágio de pré-implantação podemos citar Fe, Cu, Zn, Cd, Ca,
Ni, Pb, e dentre as vitaminas, Co A, E, B12, colina, ácido fólico, pantotenato, riboflavin e
inositol (Ashworth & Antipatis, 2001).
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28
2.1.3. Sinalização materna-embrionária durante a pré-implantação
Durante o período de pré-implantação, as interações entre ovário, endométrio e
embrião são complexas e necessárias para a estabilidade da gestação. O ovário produz
progesterona e estradiol, que agem sobre o endométrio para produzir várias proteínas e
prostaglandinas. As proteínas nutrem o embrião e as prostaglandinas agem sobre o CL e
induzem a luteólise se o animal não tiver um embrião viável. O concepto, dependendo da
espécie, secreta fatores de crescimento, esteróides, prostaglandinas e citocinas que agem
sobre o endométrio para evitar a secreção de prostaglandina e estimulam a secreção
protéica, ou agem diretamente sobre o ovário para estimular a secreção de progesterona
(Goff, 2002).
O embrião, para se desenvolver completamente, deve ser capaz de executar seu
programa de desenvolvimento dentro de um ambiente variável estabelecido pela mãe.
Possíveis causas de mortalidade embrionária podem estar relacionadas a defeitos
embrionários resultantes de um ambiente materno inadequado, assincronia entre mãe e
embrião, ou incapacidade materna em responder adequadamente aos sinais de
anormalidades. Dentre as programações errôneas durante a gestação, as anormalidades
cromossômicas podem ser as primeiras a ocorrer, podendo ser causadas por gametas
incompetentes e / ou por genes recessivos homozigóticos, exacerbados por cruzamentos,
que representam tipos adicionais de falhas responsáveis por perdas embrionárias.
Alterações no ambiente materno, tais como as causadas por estresse térmico e/ou por dietas
alimentares ricas em proteínas degradáveis podem causar mortalidade embrionária, e o
embrião, no início de seu desenvolvimento, é muito susceptível para certos tipos de
estresses, pois o seu genoma ainda não está ativado (Hansen & Rivera, 2001).
Uma importante função do desenvolvimento do concepto é evitar a luteólise, e
assim manter a produção de progesterona pelo CL, essencial para a sobrevivência
embrionária (Goff, 2002). O embrião atenua a secreção pulsátil de PGF2α. O fator
responsável por evitar a luteólise é uma proteína, membro da família multigene-α
interferon, chamada interferon τ (IFNτ), que se liga a receptores específicos no endométrio
(Guillomot et al., 1993). O interferon τ é secretado pelo blastocisto bovino próximo ao Dia
8 de gestação, produzindo pico nos Dias 17-19, declinando rapidamente. A principal ação
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do IFNτ é evitar o aumento no número de receptores de ocitocina no endométrio,
diminuindo, assim, a síntese da PGF 2α . O IFNτ também afeta a síntese protéica do
endométrio, a proliferação celular e, além disso, possui propriedades imunossupressivas
que podem ser importantes para manter uma gestação normal (Guillomot et al., 1993).
Roberts et al. (1992) observaram, em espécies domésticas, que o trofectoderma de
embriões ovinos e caprinos secreta algumas outras proteínas fundamentais, tais como as
proteínas trofoblásticas ovina-1 e caprina-2 (oTP-1 e cTP-2) entre os dias 10-21 e 16-21,
respectivamente. Essas proteínas são potentes interferons designados, em sua estrutura,
como interferons � (IFN�), que atuam no endométrio uterino para evitar a liberação pulsátil
do luteolítico PGF2� , e assim, garantir a manutenção de um corpo lúteo funcional. Mais
recentemente, uma combinação de fatores de crescimento I e II semelhantes à insulia (IGF-
I e IGF-II) tem demonstrado estimular a produção in vitro de IFN� em ovinos (Ko et al.,
1991).
Uma outra proteína, a proteína ligada ao retinol, secretada ainda durante a fase de
pré-implantação, é o principal produto secretado pelo embrião ovino (Trout et al., 1991) e o
endométrio (Dore et al., 1992), possuindo importante função no transporte de vitamina A
lipossolúvel (retinol), fundamental ao desenvolvimento e diferenciação das membranas
extra-embrionárias. A secreção desta proteína também foi observada em vacas (Thomas et
al., 1992), e assim como nos ovinos (Ashworth & Bazer, 1989), pôde ser estimulada e
aumentada pela administração de progesterona.
Portanto, o embrião é bastante dependente de proteínas e de hormônios de produção
materna, havendo a necessidade da oferta de satisfatórios níveis energéticos para a
manutenção materna dos níveis hormonais, como os de progesterona, para que haja uma
produção normal de proteínas pelo endométrio e pelo feto, garantindo, assim, uma boa e
eficiente sinalização materno-embrionária que efetive a implantação endometrial do
embrião, para que este dê seqüência ao seu processo de desenvolvimento.
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30
2.2. BALANÇO ENERGÉTICO MATERNO E DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO INICIAL
Influência do estado nutricional materno sobre o desenvolvimento e viabilidade
embrionários
Embriões de várias espécies de mamíferos, principalmente na fase de pré-
implantação, são bastante sensíveis ao ambiente no qual se desenvolvem, sendo bastante
susceptíveis às condições de cultivo, se produzidos in vitro,bem como às condições da dieta
materna, quando produzidos in vivo (Figura 7). A dieta materna tem um grande impacto
tanto sobre o fenótipo embrionário durante a pré-implantação quanto ao longo de seu
desenvolvimento posterior. Dietas muito ricas em proteínas, quando fornecidas a ovelhas,
próximo ao período de concepção, mostraram estar associadas a baixa viabilidade do
desenvolvimento embrionário, resultando em crias apresentando um alto peso ao nascer,
característico de animais que apresentam a Síndrome da Cria Gigante, ou Large Offspring
Syndrome (LOS) (McEvoy et al., 2001). Por outro lado, a subnutrição neste mesmo
período pode levar a uma série de distúrbios no desenvolvimento e fisiologia fetal, que
também se estendem à vida pós-natal, tais como problemas cardiovasculares, osteoporose e
diabetes do tipo II (Edwards & McMillen, 2002).
Embriões de ruminantes, que possuem uma implantação não-invasiva, são
dependentes de substâncias nutritivas presentes no útero, decorrentes de adequada nutrição
materna para o seu desenvolvimento e sobrevivência (Ashworth, 1995). A disponibilidade
de substratos energéticos, especialmente a de glicose e oxigênio, tem sido apontada por sua
capacidade em alterar o desenvolvimento embrionário (Lim et al., 1999; Kim et al., 1993).
O cultivo de embriões em ambientes que não mantêm essas condições preferenciais do
metabolismo estágio-específico oferece menos que o necessário para um desenvolvimento
ideal (Matsuyama et al., 1993). Embora alguns fatores tais como estresse térmico e pouca
idade materna tenham sido relacionados com baixa viabilidade embrionária, outros fatores
podem reduzir a sobrevivência embrionária ao atuarem no rompimento da relação entre o
ambiente uterino materno e o embrião. Tem sido relatada, em ovelhas, a relação inversa
entre estado nutricional após a cobertura e as concentrações periféricas de progesterona
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31
(Williams & Cumming, 1982), na qual baixas concentrações de progesterona após planos
alimentares altamente energéticos têm sido associadas a perdas embrionárias.
Cultivo in vitroSuplementação protéica
Composição do meio
Ambiente in vivoDieta
Composição corporal
Ambiente embrionárioGlicose e substratos energéticos
Aminoácidos Fatores de crescimento Hormônios esteróides
CitocinasReguladores metabólicos
Consequências a curto-prazosobre o desenvolvimento embrionário
Modificações epigenéticasSinalização intracelular alterada
Estresse metabólico Mudanças na expressão gênica
Apoptose Distúrbios na proliferação celular
Consequências a longo-prazosobre o desenvolvimento embrionárioRedução da capacidade implantacional
Placentação alterada Crescimento fetal anormal
Alterações do eixo neuroendócrinoPeso ao nascer alterado
Síndromes metabólicas e cardiovasculares
Cultivo in vitroSuplementação protéica
Composição do meio
Ambiente in vivoDieta
Composição corporal
Ambiente embrionárioGlicose e substratos energéticos
Aminoácidos Fatores de crescimento Hormônios esteróides
CitocinasReguladores metabólicos
Consequências a curto-prazosobre o desenvolvimento embrionário
Modificações epigenéticasSinalização intracelular alterada
Estresse metabólico Mudanças na expressão gênica
Apoptose Distúrbios na proliferação celular
Consequências a longo-prazosobre o desenvolvimento embrionárioRedução da capacidade implantacional
Placentação alterada Crescimento fetal anormal
Alterações do eixo neuroendócrinoPeso ao nascer alterado
Síndromes metabólicas e cardiovasculares
Figura 7. Representação esquemática das interações entre o ambiente de desenvolvimento
embrionário e suas conseqüências a curto e a longo-prazo sobre o potencial de
desenvolvimento embrionário e pós-natal (Adaptado de Fleming et al., 2004).
Concordando com os achados de Williams & Cumming (1982), Ashworth (1995)
observou que ovelhas superalimentadas durante o início da gestação apresentaram uma
redução na proporção de embriões produzidos. Acredita-se que isso seja resultante do
aumento do metabolismo da progesterona, em conseqüência de uma elevação na atividade
de oxidação hepática devido ao maior fluxo sanguíneo porta-hepático em animais bem
alimentados. O fígado é o principal local de metabolismo de esteróides, metabolizando
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32
aproximadamente 95% da progesterona circulante durante uma única passagem, resultando
em uma redução das concentrações plasmáticas periféricas de progesterona. Parr et al., em
1987, também haviam evidenciado o papel das concentrações plasmáticas periféricas de
progesterona em decorrência dos efeitos nutricionais sobre a sobrevivência embrionária,
demonstrando, claramente uma redução de 25-30% na sobrevivência embrionária em
animais submetidos a 200% dos requerimentos de manutenção a partir do Dia 2 pós
cobertura. Eles demonstraram também, em um outro grupo tratamento, que essas perdas
puderam ser evitadas após uma administração de progesterona nos Dias 8-14 após a
cobertura.
Assim, mudanças no consumo de nutrientes podem influenciar o metabolismo da
progesterona, e a manutenção de concentrações adequadas da mesma garante que os
mecanismos luteolíticos sejam superados ou suprimidos entre o concepto e o endométrio.
Portanto, mudanças na concentração de progesterona modificam a magnitude e a
composição dos polipeptídeos secretados pelo endométrio, que são proteínas essenciais
para o crescimento e desenvolvimento do concepto, e algumas possuem papel importante
no transporte de nutrientes insolúveis em água através da placenta (Ashworth, 1995).
A mortalidade embrionária precoce é uma causa significativa de falha reprodutiva
em ruminantes e parte disso pode estar relacionada à influência nutricional próximo ao
período de monta. A manifestação final do efeito nutricional inadequado sobre a fertilidade
é a morte embrionária, e sabe-se que a nutrição afeta a qualidade embrionária desde
mudanças no ambiente folicular, capacidade de desenvolvimento do oócito ou mudanças ao
longo do desenvolvimento embrionário inicial (Boland et al., 2001). O momento, duração e
possíveis causas de mortalidade embrionária têm sido alvo de estudos e, Bolet (1986)
relatou, em cabras, que aproximadamente 40% dos oócitos disponíveis no momento da
cobertura não foram representados por crias viáveis ao nascimento. Em 1996, Quinlivan et
al. observaram que a maioria das mortes pré-natal em ovelhas ocorreu entre os Dias 2 e 30
da gestação. Em ovinos e caprinos, existem evidências de que há uma relação inversa do
número de oócitos liberados durante a ovulação e a probabilidade de sobrevivência
embrionária individual (Hanrahan & Piper, 1982; Moore, 1982).
Efeitos deletérios de uma nutrição excessiva próxima ao período de cobertura sobre
o desenvolvimento embrionário têm ficado evidentes em rebanhos bovinos superovulados
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33
(Mantovani et al., 1993; Nolan et al., 1998) e não superovulados (Dunne et al., 1997). A
redução na fertilidade é particularmente observada em vacas onde a produção de leite é
demasiadamente alta por lactação, ou seja, em animais com alta demanda energética
(Macmillan et al., 1996). Dietas muito ricas em proteínas, resultando em altas
concentrações de uréia no plasma e leite (>190 mg/L) têm sido associadas com decréscimo
da fertilidade em gado de leite (Butler et al., 1996; Erold & Butler, 1993). Isso pode alterar
as condições do ambiente embrionário (Erold & Butler, 1993). Em ovinos, Fahey et al.
(1998) relataram que apesar de dietas ricas em uréia e concentrações da mesma no sangue,
não houve efeito destas sobre a taxa de ovulação em doadoras ou receptoras ovinas.
Contudo, a qualidade dos embriões das doadoras foi reduzida, sendo colhidos, no Dia 4,
poucos embriões com mais de oito células. Já a dieta oferecida às receptoras não teve efeito
sobre a sobrevivência embrionária. Assim, isso sugere que os efeitos da uréia sobre a
qualidade embrionária estão possivelmente ligados a alterações no ambiente do oviduto ou
mudanças deletérias no folículo, ao contrário de mudanças no ambiente uterino. Este fato
pode ser ressaltado por dados em bovinos (Gath et al., 1999), mostrando que não houve
diferenças nas taxas de gestação ao Dia 35 após transferência de embriões de boa qualidade
produzidos in vitro para receptoras submetidas a diferentes níveis de dieta à base de uréia.
Restrições alimentares por um curto período de tempo demonstraram aumentar
subseqüentemente a taxa de gestação em bovinos (Dunne et al., 1997). Mantovani et al.
(1993) informaram que o rendimento de embriões transferíveis depois que novilhas de corte
foram superovuladas diminuiu significativamente quando as novilhas tiveram livre acesso
ao concentrado comparado a animais submetidos a níveis restritos de energia. Além disso,
o tipo e a quantidade de concentrado mostrou afetar o rendimento posterior dos embriões
transferíveis depois da superovulação em novilhas de corte (Yaakub et al., 1996). As
novilhas que foram submetidas a uma dieta restrita, onde o suplemento concentrado
predominante era polpa cítrica de beterraba, produziram embriões transferíveis melhores
quando comparadas àquelas que receberam concentrado à base de cevada ou que receberam
esses concentrados ad libitum. Restrições alimentares severas (aproximadamente 66% de
exigências energéticas de manutenção) demonstraram ter efeitos benéficos sobre a taxa de
desenvolvimento embrionário quando novilhas foram superovuladas. Nesses animais, os
embriões foram coletados no Dia 7 e depois submetidos ao cultivo in vitro durante 24 horas
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(Nolan et al., 1998). A restrição de nutrientes resultou em um aumento no número de
blastocistos depois do cultivo de embriões por 24 h, aumentando também o número de
células totais por blastocistos.
Lozano et al., em 2000, utilizaram ovelhas como modelos experimentais para se
determinar o efeito da nutrição sobre a qualidade embrionária, e a superovulação foi usada
para aumentar o rendimento de embriões. Uma baixa porcentagem de embriões de boa
qualidade foi recuperada no Dia 4 a partir de ovelhas submetidas a uma baixa dieta
energética (0,5 EM) e a uma dieta ad libitum, quando comparada com animais sob uma
dieta de controle (1,5 EM). Porém, os embriões do grupo alimentado ad libitum se
mostraram atrasados quanto ao seu desenvolvimento, comparado àqueles de ovelhas
submetidas a baixas dietas. Além disso, oócitos desse último grupo (0,5 EM) obtiveram
baixas taxas de fertilização. Devido a menor resposta para o tratamento superovulatório
(em termos do número de animais que mostraram estro e baixa taxa de ovulação), o
rendimento dos embriões foi mais baixo dentro do grupo ad libitum quando comparado ao
controle (1,5 EM) e o grupo baixa dieta energética (0,5 EM) (Lozano et al., 2000).
Mantovani et al. (1993) relataram uma redução significativa da transferência
embrionária em vacas alimentadas ad libitum quando comparadas com vacas mantidas sob
níveis controlados de concentrado. Vacas sob dietas quantitativamente controladas e
suplementadas com sub-produtos industriais produziram um número de embriões superior
em relação a animais sob dieta à base de cevada e concentrado ad libitum (Yaakub et al.,
1996). Nolan et al., (1998) também observaram que restrições alimentares também foram
positivas sobre a taxa de desenvolvimento de embriões produzidos in vivo e sucessivamente
cultivados por 24 horas in vitro.
A insulina tem sido apontada como uma importante moduladora das funções
reprodutivas em rebanhos, e sua aplicação direta é uma metodologia ainda recente e em
desenvolvimento. Além da insulina, outros hormônios metabólicos e fatores de
crescimento, incluindo a somatotrofina e fatores de crescimento ligados à insulina (IGFs)
têm sido relacionados como reguladores da função ovariana (Gong et al., 1993, 1994;
Simpson et al., 1994; Totey et al., 1996). Pré-tratamentos com um outro hormônio, o
hormônio recombinante do crescimento bovino (rbGH), demonstram aumentar as taxas de
ovulação e a colheita de embriões de boa qualidade em novilhas (Gong et al., 1997). Esses
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tratamentos com rbGH estimulam o desenvolvimento folicular e maturação através do
aumento das concentrações periféricas de insulina e IGF-I (Gong et al., 1993). Estudos in
vitro revelaram que a insulina e o IGF-I são importantes mediadores do desenvolvimento
folicular, esteroidogênese, maturação de oócitos e subseqüente desenvolvimento
embrionário (Gong et al., 1993, 1994, Totey et al., 1996). Administração exógena de
insulina afeta a dinâmica folicular pelo aumento do recrutamento de folículos e redução da
atresia folicular (Matamoros et al., 1991; Majumdar et al., 1997). Correlações positivas
entre o número de folículos que são dependentes de gonadotrofinas e a concentração
periférica de insulina em cabras têm sido relatadas por Armstrong et al. (1983). A insulina
atua sinergicamente com o FSH e com o LH através de seus receptores, estimulando a
mitose nas células da granulosa (Gong et al., 1994, Matamoros et al., 1991).
O propilenoglicol, um precursor gliconeogênico, foi utilizado por Hidalgo et al., em
2004, buscando-se uma melhoria das taxas de gestação e perfil metabólico em bovinos.
Nesse experimento, as fêmeas que receberam uma dose oral diária de 250 mL de
Propilenoglicol durante 20 dias antes de serem submetidas à Transferência de embriões
apresentaram melhores taxas de gestação e parição, além de maiores níveis plasmáticos de
progesterona e insulina quando comparadas às fêmeas do grupo controle. As concentrações
plasmáticas de insulina aumentam em resposta à administração de Propilenoglicol (Studer
et al., 1993; Formigoni et al., 1996), garantindo assim a manutenção da síntese de
progesterona pelo CL durante a gestação (Haq, 1992; Poff et al., 1998).
A ação direta da glicose também tem sido testada, e Rubio et al. (1997) observaram
reduções das taxas de gestação em ovelhas submetidas à infusão de glicose. Este método,
em ovelhas, pode aumentar a taxa de ovulação (Downing et al., 1995), mas a qualidade do
embrião pode ser reduzida drasticamente (Furnus et al., 1996, Yaakub et al., 1997). Altas
concentrações de glicose são danosas ao desenvolvimento in vitro de embriões (Furnus et
al, 1996). Embora a razão para tal efeito da glicose sobre o desenvolvimento embrionário
ainda não esteja clara, pode estar relacionada ao fato de que altas concentrações da mesma
no protoplasma interfiram na sinalização celular durante o crescimento de folículos pré-
ovulatórios, o desenvolvimento de oócitos ou desenvolvimento inicial do embrião (Boland
et al., 2001). Também há indícios de que a hiperglicemia em ovelhas esteja associada à
embriopatologias (Martin et al., 1998).
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36
3. JUSTIFICATIVA
O crescimento folicular e a produção de embriões, em ruminantes, podem ser
influenciados por fatores nutricionais, tais como a condição corporal do animal e os níveis
de energia na dieta (Boland et al., 2001). Os níveis de insulina plasmática são
positivamente correlacionados com a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário
(Yassen et al., 2001).
Portanto, este trabalho justifica-se pela necessidade de se avaliar os efeitos da
insulina e do propilenoglicol sobre o aumento da insulinemia, e consequentemente, sobre a
quantidade e qualidade de embriões caprinos produzidos em programas de superovulação.
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4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
Em cabras da raça Moxotó superovuladas, a elevação controlada da insulinemia
imediatamente antes ou depois da fecundação, ou de forma continuada, influenciam a
qualidade e a quantidade de embriões produzidos.
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5. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Estudar o efeito da elevação da insulinemia sobre a produção in vivo de embriões de
cabras da raça Moxotó.
Objetivos Específicos
• Avaliar os níveis de insulina nos grupos de animais submetidos a aplicações de
insulina e propilenoglicol;
• Avaliar a quantidade de embriões produzida;
• Avaliar a qualidade embrionária.
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6. CAPÍTULO 1
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES DE CABRAS SUPEROVULADAS TRATADAS COM
INSULINA ANTES OU APÓS A MONTA OU POR SUPLEMENTAÇÃO
CONTINUADA ATRAVÉS DE PROPILENOGLICOL
(Embryo Production in Superovulated Goats Treated with Insulin Before or After
Mating or By Continuous Propylene Glycol Supplementation)
Reproduction in Domestic Animals
(submetido em Dezembro de 2006)
(aceito em Fevereiro de 2007)
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Produção de Embriões em Cabras Superovuladas Tratadas com Insulina Antes e após
a Monta ou por Suplementação Contínua com Propilenoglicol
Souza, A.L. 1, Galeati G.2, Almeida, A.P. 1, Arruda I.J.1, Govoni N.2, Freitas V.J.F.1,
Rondina D.1a
1* Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil; 2 Facoltà di Veterinaria, Università di Bologna, Ozzano dell’Emilia, Bologna, Italy
* Instituto onde o trabalho foi conduzido.
Resumo
Dezessete cabras adultas da raça Moxotó foram sincronizadas através de esponjas vaginais
contendo 60 mg MPA por 11 dias e 50 µg de cloprostenol, 48 h antes da remoção da
esponja, e superovuladas com 120 mg pFSH i.m. em doses decrescentes intervaladas por 12
h por três dias consecutivos. Um grupo de sete animais recebeu 0,2UI/kgPV/dia de insulina
humana de longa ação injetada subcutaneamente simultaneamente com as aplicações de
pFSH, e um outro grupo de cinco animais receberam essa mesma dose de insulina, porém,
por três dias consecutivos 24 horas após a monta. No terceiro grupo, cinco animais foram
suplementados com 80 mL/animal/dia de propilenoglicol continuamente durante o
experimento. A colheita de embriões foi realizada sete dias após a monta e os embriões
foram classificados segundo critérios da IETS. Colheitas de sangue foram realizadas a cada
três dias para a análise dos níveis de insulina. Administração de insulina elevou os níveis
plamáticos da mesma nos animais (P < 0,05), porém, no grupo tratado com propilenoglicol,
essa taxa foi diferente apenas entre o tratamento com pFSH e após a monta (P < 0,05). Os
grupos foram semelhantes (P > 0,05) quanto à taxa de recuperação total de embriões (80,05
± 9,78%) ou estruturas transferíveis (61,03 ± 15,13%). O tratamento não influenciou (P >
0,05) a responsividade ao tratamento superovulatório (64%). Contudo, foi evidenciado um
aumento no número de embriões considerados de excelente qualidade em relação aos
embriões das fêmeas suplementadas com propilenoglicol. Nos animais nos quais a insulina
foi dada antes da monta, foi observada uma alta relação (R = 0,90) (P < 0,05) entre o
número de embriões transferíveis e ovulações. Em conclusão, cabras superovuladas tratadas
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com baixas doses de insulina exógena resultaram em melhor qualidade embrionária, que foi
relacionada às mudanças nas concentrações circulantes de insulina.
Introdução
Nos ruminantes, a insulina é um importante mediador a nível ovariano. Estudos anteriores
têm mostrado que um aumento na resposta superovulatória através da manipulação da
insulinemia próxima à monta pode modificar significativamente o número e qualidade de
embriões produzidos in vivo (Gong 2002). Contudo, sabe-se a competência de
desenvolvimento dos embriões na pré-implantação está subordinada ao ambiente
energético. Além disso, a glicose é um substrato energético essencial para o
desenvolvimento in vitro de blastocistos, e suplementações com insulina no meio de cultivo
melhoram a capacidade de desenvolvimento de embriões após a fertilização (Thompson
2006). A insulina in vivo tem sido bastante associada com a viabilidade embrionária em
vacas receptoras em programas de MOET (Velazquez et al. 2005). Baseado nesses
achados, o objetivo deste estudo foi investigar, em cabras superovuladas, o efeito sobre a
produção embrionária da manipulação de insulina imediatamente antes ou após a monta, ou
continuamente.
Material e Métodos
O experimento utilizou dezessete cabras da raça Moxotó, adultas e cíclicas, e foi conduzido
na Universidade Estadual do Ceará, localizada a 3°43’ S e 38°30’ O. Todos os animais
foram mantidos em condições de manejo e alimentação similares. As cabras foram
sincronizadas com 60 mg de MPA (Progespon, Syntex, Argentina) contido em esponjas
vaginais por 11 dias e 50 µg de cloprostenol (Ciosin, Coopers, Brazil), 48 h antes da
remoção da esponja, e superovuladas com 120 mg de pFSH (Folltropin, Vetrepharm,
Canada) i.m. administrado em intervalos de 12 h (30/30, 15/15 and 15/15 mg) dos dias 9
a11, até a remoção das esponjas. As fêmeas foram cobertas 24 e 48 horas após o início do
estro. Doze cabras foram tratadas com insulina humana de longa ação, na dose de
2UI/kgPV/dia aplicada subcutaneamente, e divididas em grupo Insulina antes da Monta (n
= 7), quando a insulina foi administrada em correspondência com o tratamento com pFSH,
e grupo Insulina após a Monta (n = 5), no qual a insulina foi injetada por três dias
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consecutivos 24 horas a partir da última monta. Os outros cinco animais (grupo
Propilenoglicol) foram suplementados com uma dose oral de propilenolicol (80 mL) uma
vez ao dia, 1 h após a alimentação, ao longo do experimento. A dose de propilenoglicol foi
determinada baseada no valor da LD50 (18g/kg PV0.75; Nielsen & Ingvartsen 2004), sendo
equivalente a 470,91 kcal energia total/day suplementação (Miyoshi et al. 2001). Os
embriões foram colhidos sete dias após a monta, de acordo com Baril et al. (1995). Apenas
doadoras com cinco ou mais corpos lúteos foram consideradas responsivas ao tratamento
superovulatório e foram submetidas à colheita. Os embriões foram classificados de acordo
com os critérios da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS).
Estruturas sem sinais de clivagem foram classificadas como não fecundadas. A cada três
dias, a partir da inserção das esponjas, e antes da alimentação e suplementação com
propilenoglicol, foram colhidas amostras de sangue em tubos heparinizados, através de
venopunção da jugular. A insulina plasmática foi analisada través de um kit de RIA
(Medical Systems, Genova) (Rondina et al. 2005). Os dados da insulina foram analisados
através do SAS, procedimento GLM (SAS, Inc., USA). As diferenças entre os intervalos
das amostras foram avaliadas pelo teste t. Para comparação entre grupos foi usado o teste
de Duncan. Diferenças entre as proporções dos números foram analisadas pelo Qui-
quadrado. As correlações foram verificadas pelo teste de Spearman. Os valores foram
expressos sob a forma de média ± EPM.
Resultados
As cabras dos grupos tratados com insulina mostraram um aumento significativo da
insulinemia (P < 0,05) (Figura 1), correspondente à aplicação de insulina. No grupo
propilenoglicol, o nível de insulina foi diferente apenas entre o tratamento com FSH e após
a monta (P < 0,05). Os grupos Propilenoglicol e Insulina antes da Monta exibiram valores
similares de insulina (P > 0,05), e maiores concentrações da mesma (P < 0,05) em relação
ao grupo Insulina após a Monta, da inserção da esponja até a monta. O número médio de
animais que responderam ao tratamento superovulatório foi de 64% (11/17) e não diferiu
entre os grupos (P > 0,05). Em todos os grupos foram observadas taxas análogas de colheita
de embriões (P > 0,05). As médias foram de 80,05 ± 9,78% (145/181) para colheita de
estruturas totais (N embriões + estruturas não fecundadas / N ovulações), e de 61,03 ±
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15,13% (114/181) para colheita de estruturas transferíveis (N embriões transferíveis / N
ovulações), respectivamente. Embora o tratamento não tenha afetado o número de embriões
degenerados, nos grupos insulina, a frequência de embriões excelentes (Tabela 1) teve uma
tendência a aumentar (P < 0,05), assim como o número de embriões transferíveis/doadora
foi quase duas vezes maior que nas cabras suplementadas com propilenoglicol (12,07 ±
1,27 vs. 6,67 ± 0,94, P > 0,05). Entretanto, apenas o grupo Insulina antes da Monta mostrou
uma maior relação entre o número de embriões transferíveis e ovulações (R = 0,90) (P <
0,05).
Discussão
Os resultados deste experimento demonstram que, em cabras superovuladas, injeções de
insulina imediatamente antes ou após a monta, promovem o aumento da insulinemia,
resultando na melhoria da produção embrionária. Isso é consistente com a grande diferença
entre o número de embriões de excelente qualidade e o aumento de embriões transferíveis
com as ovulações observadas nas doadoras dos grupos Insulina. Nossos dados estão de
acordo com Selvaraju et al. (2003), que não observaram nenhuma diferença entre o número
e qualidade dos embriões produzidos em fêmeas caprinas tratadas com doses similares de
insulina antes e durante o tratamento superovulatório antes da fecundação. O estágio de
desenvolvimento e o grau de qualidade do embrião no momento da transferência são
conhecidos há muito tempo por influenciar o resultado da transferência de embriões
(Looney et al. 2006). Embriões classificados como excelentes ou bons resultam em altas
taxas de gestação quando transferidos, ao contrário de embriões de baixa qualidade (Hasler
2001). No útero, a taxa de desenvolvimento embrionária é considerda, normalmente, em
função da qualidade embrionária, associada com a adequada produção de progesterona
materna (Bo et al. 2002; Baruselli et al. 2001). Contudo, recentes achados (Mann et al.
2003) demonstraram, em novilhas de corte, que elevados níveis de insulina oriundos da
dieta parecem ser mais importantes para o desenvolvimento embrionário do que as
concentrações plasmáticas de progesterona. Sabe-se que a insulina desempenha um
importante papel sobre o controle do desenvolvimento folicular (Webb et al. 1999). A
insulina possui uma ação positiva sobre a expressão e atuação de genes de fatores de
crescimento, tais como o IGF-I, e a taxa de insulina plasmática é positivamente
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correlacionada a taxa de IGF-I (Gong 2002). Além disso, o IGF-I é um importante
mediador do desenvolvimento folicular, esteroidogênese, maturação oocitária e
desnvolvimento embrionário (Yassen et al. 2001). Receptores de IGF-1 são expressos ao
longo do desenvolvimento de pré-implantação de embriões bovinos (Lonergan et al. 2000).
O IGF-1, bem como a insulina, quando adicionados in vitro melhoram o desnvolvimento
embrionário por diminuírem o número de células apoptóticas e aumentar o número de
células embrionárias totais (Mihalik et al. 2000).
As taxas de insulina geradas neste experimento a partir da administração do propilenoglicol
estimularam continuamente a insulinemia, induzindo a baixas respostas de produção
embrionária. Geralmente, o propilenoglicol induz um aumento na glicose e insulina
plasmáticas, entretanto, a magnitude dessa resposta pode variar de acordo com a dose,
maneira e momento da administração (Nielsen & Ingvartsen 2004). Hidalgo et al. (2004),
ralataram um aumento nas taxas de gestação em novilhas receptoras de embriões tratadas
por 20 dias com uma única dose oral diária de propilenoglicol, associadas com aumento nas
taxas de insulina. Chiofalo et al. (2005), usando 80g e 160g de propilenoglicol diariamente
em ovelhas de leite durante o pré- e o pós-parto, relataram alta produção de leite e
crescimento dos cordeiros lactantes tratados com altos níveis de propilenoglicol, embora
concentrações similares de glicose tenham sido induzidas. Os parâmetros reprodutivos são
normalmente dependentes da manutenção dos efeitos da insulina (Hidalgo et al. 2004). Os
picos de glicose e insulina em animais tratados com propilenoglicol ocorrem dentro dos
primeiros 90 minutos após administração oral do mesmo (Nielsen & Ingvartsen, 2004). Por
essa razão, as colheitas de sangue neste trabalho foram planejadas de forma a não registrar
efeitos agudos da administração de propilenoglicol (24 h após a administração). A
suplementação energética através da administração de propilenoglicol aumentou os níveis
plasmáticos de insulina e IGF-I (Grummer et al. 1994), que, em associação, afetaram a
função ovariana e o desenvolvimento embrionário inicial atarvés da estimulação das células
da granulosa e proliferação das células da teca (Alvarez et al. 2000), levando o folículo a
produzir níveis adequados de estradiol, promovendo o seu crescimento até que esteja apto a
estimular o pico de LH e a ovulação (Beam & Butler 1999). Embora a estimulação
excessiva do IGF-1 intraovariano estimule o crescimento folicular, este fato pode prejudicar
a maturação do oócito (Armstrong et al. 2001). McCaffery et al (2000) relataram, em
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folículos pré-antrais tratados com altas concentrações de IGF-1, uma redução significativa
do tamanho dos oócitos. Wathes et al. (2003) tem sugerido que a maioria do IGF-1
encontrado em folículos bovinos é derivado da circulação sanguínea. O desenvolvimento
embrionário não depende apenas do ambiente do trato genital da fêmea, mas também da
qualidade do oócito (O’Callaghan and Boland 1999). A ação direta da glicose também tem
sido testada, e Rubio et al. (1997) observaram reduções nas taxas de gestação em ovelhas
submetidas a infusões de glicose. Esse método, em ovelhas, pode aumentar a taxa de
ovulação (Downing et al. 1995), mas a qualidade do embrião pode ser limitada
drasticamente (Yaakub et al. 1999). Boland et al. (2001) sugeriram que o efeito da glicose
sobre o desenvolvimento embrionário pode estar relacionado ao fato de que altas
concentrações de glicose no protoplasma interfiram na sinalização celular durante o
crescimento de folículos pré-ovulatórios, desenvolvimento de oócitos, ou desenvolvimento
inicial embrionário.
Em conclusão, o aumento da insulina circulante imediatamente antes ou após a monta foi
associado à alta proporção de embriões viáveis por doadora. A manipulação contínua da
insulinemia pela administração oral de propilenoglicol aumentou os níveis plasmáticos de
insulina e progesterona, mas não a qualidade embrionária. Assim, os hormônios metabólico
insulina pode ser o fator chave envolvido nos mecanismos de desenvolvimento
embrionário, melhorando os resultados da produção de embriões caprinos. Contudo,
sugerimos o desenvolvimento de pesquisas adicionais a fim de se encontrar uma dosagem
ótima e um protocolo de administração adequado antes da aplicação de seu uso prático.
Agradecimentos
A.L. Souza foi bolsista de mestrado da CAPES/Brazil. Os autores agradecem a Embrapa
Caprinos pela cessão dos animais utilizados neste experimento. O trabalho foi financiado
pelo FUNDECI-BNB (Brazil). V.J.F. Freitas é pesquisador do CNPq/Brazil
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MPA Sponja pFSH Monta Laparotomia
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MPA Sponja pFSH Monta Laparotomia
Insu
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L)Insulina Antes MontaPropilenoglicolInsulina Após Monta
Insulina Antes MontaPropilenoglicolInsulina Após Monta
Figura 1: Níveis de insulina em cabras responsivas aos tratamentos de sincronização e
superovulação. a,b,c p < 0,05 comparação entre grupos; A,B,C … p < 0,05 comparação entre
intervalos de colheitas de sangue. Valores expressos como média ± EPM.
�
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Tabela 1. Número de embriões/doadora classificados de acordo com a IETS. Valores
expressos como média ± EPM.
Transferíveis Não Transferíveis Grupo N
Excelente Regular Pobre Degenerado
Insulina antes Monta 5 7.80 ± 0.88a 2.00 ± 0.60ab 1.00 ± 0.32b 1.00 ± 0,54b
Propilenoglicol 3 5.00 ± 1.85 1.00 ± 0.48 0.67 ± 0.47 1.33 ± 0.94
Insulina após Monta 3 11.33 ± 2.89a 1.67 ± 1.18b 0.33 ± 0.24b 1.67 ± 0.67b
a,b,c,d P < 0,05, comparação entre classes embrionárias.
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7. CONCLUSÃO GERAL
Cabras da raça Moxotó superovuladas e tratadas com baixas doses de insulina
exógena resultaram em embriões de melhor qualidade, relacionados às mudanças nas
concentrações de insulina circulantes.
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8. PERSPECTIVAS
Nossos resultados deixam a perspectiva de que pesquisas adicionais devem ser
desenvolvidas a fim de se estabelecer doses adequadas e protocolos de administração de
insulina e propilenoglicol antes de serem adotados para uso prático.
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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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preimplantation bovine embryos derived from different in vitro systems. Reproduction, v.
122, p.601-610, 2001.
10. ANEXOS
ANEXO 1
Embryo Production in Superovulated Goats Treated with Insulin Before or After
Mating or By Continuous Propylene Glycol Supplementation
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67
Reproduction in Domestic Animals
(acepted)
Souza, A.L. 1, Galeati G.2, Almeida, A.P. 1, Arruda I.J.1, Govoni N.2, Freitas V.J.F.1,
Rondina D.1a
1* Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil;
2 Facoltà di Veterinaria, Università di Bologna, Ozzano dell’Emilia, Bologna, Italy
* Institute where the work was conducted.
Author’s address (for correspondence): Prof. Davide Rondina
Universidade Estadual do Ceará – Faculdade de Veterinária.
�
68
Av. Paranjana, 1700. Campus do Itaperi, 60740-000, Fortaleza, Ceará, Brazil
Tel: +55-85-31019858 Fax: +55-85-31019840.
E-mail: [email protected]
Contents
Seventeen adult and cyclic Moxoto goats were synchronized using 60 mg MPA vaginal
sponge for 11 days and 50 µg cloprostenol, 48 h before sponge removal, and superovulated
with 120 mg pFSH i.m. in decreasing doses at 12 h intervals for three consecutive days. In
seven goats, 0.2UI/kgBW/day of long acting insulin was subcutaneously injected at same
time as pFSH, and in the other five goats, for three consecutive days starting 24 hours after
mating. Finally, five goats were supplemented with an oral dose of 80 mL/goat/day of
propylene glycol continuously during the experiment. The animals were flushed at seven
days after mating and the embryos were classified based on IETS criteria. Blood samples
were collected every three days for insulin assay. Administration of insulin raised the
insulin levels of the goats (P < 0.05), whereas in the group treated with propylene glycol,
insulin rate was different only between FSH treatment and after mating (P < 0.05). Similar
rates of recovery for total (80.05 ± 9.78%) or transferable structures (61.03 ± 15.13%) were
obtained. Treatment was not influenced (P > 0.05) by responsiveness to superovulation,
which averaged 64%. By contrast, insulin treatments were shown to increase the number of
embryos considered excellent with respect to goats supplemented with propylene glycol (P
> 0.05). When insulin was given before mating, a strong relationship (R = 90) (P < 0.05)
between number of transferable embryo and ovulations was observed in the animals. In
conclusion, superovulated goats treated with low doses of exogenous insulin resulted in an
�
69
enhancement in embryo quality, which was related to changes in circulating insulin
concentrations.
Introduction
In ruminants, insulin is a very important mediator at the ovary level. Previous studies have
shown that an increase in the superovulatory response through manipulation of
insulineamia prior to mating can significantly modify the number and quality of embryo
produced in vivo (Gong 2002). However, it is known that development of competence in
preimplantation embryos is subordinate to energetic environment. Therefore glucose is an
essential energy substrate for development of blastocyst in vitro, and supplementation of
culture media with insulin improves developmental capacity in the embryo after
fertilization (Thompson 2006). In vivo insulin was usefully associated with embryo
viability in cow recipients of the MOET program (Velazquez et al. 2005). Based on those
findings, the aim of this study was to investigate, in superovulated goats, the effect on
embryo production of insulin manipulation immediately before or after mating, or
continuous.
Materials and Methods
The experiment was conducted with seventeen adult and cyclic Moxoto goats at the State
University of Ceará, located at 3°43’ S and 38°30’ W. All animals were maintained in
similar feeding and management conditions. Goats were synchronized using 60 mg MPA
(Progespon, Syntex, Argentina) vaginal sponge for 11 days and 50 µg cloprostenol
(Ciosin, Coopers, Brazil), 48 h before sponge removal, and superovulated with 120 mg
pFSH (Folltropin, Vetrepharm, Canada) i.m. administrated at 12 h intervals (30/30, 15/15
�
70
and 15/15 mg) from days 9 to 11, when sponges were removed. Does were mated 24 and
48 hours after onset of estrus. Twelve goats were treated with human long acting insulin,
0.2UI/kgBW/day subcutaneously and divided in InsulinBMat group (n = 7) when insulin
was administrated in correspondence with pFSH treatment, and InsulinAMat group (n = 5)
when insulin was injected on three consecutive days from 24 hours after last mating. The
other five goats (Propylene Group) were supplemented with an oral dose of propylene
glycol (80 mL) once daily at 1 hr after feeding, throughout the experiment. Dose of
propylene glycol was determined based on LD50 value (18g/kg BW0.75; Nielsen and
Ingvartsen 2004), and was equivalent to 470.91 kcal of gross energy/day supply (Miyoshi
et al. 2001). Embryos were collected seven days after mating in accordance with Baril et al.
(1995). Only donors with five or more corpus luteum were considered responsive to
superovulation and flushed. Embryos were classified in agreement with International
Embryo Transfer Society (IETS) statements. Ova with no signs of cleavage were classified
as unfertilized. From sponge insertion every three days, before feeding and propylene
glycol administration, blood samples were collected in heparinized tubes by venipuncture.
From plasma, insulin was assessed by RIA kit (Medical Systems, Genova) (Rondina et al.
2005). Insulin data was analyzed by SAS GLM procedures (SAS, Inc., USA). Differences
between sampling intervals were performed by paired t test. For the comparison between
groups, the Duncan test was used. Differences among proportions or numbers were
analyzed by Chi Square. Correlation test was assessed using the Spearman test. Values
were expressed as mean ± SEM.
Results
�
71
Goats from groups treated with insulin showed a significant increase of insulineamia (P <
0.05) (Figure 1) in correspondence with administration. In the Propylene group, insulin
level was different only between FSH treatment and after mating (P < 0.05). Propylene and
InsulinBMat exhibited similar means insulin values (P > 0.05), and greater concentrations
(P < 0.05) than the InsulinAMat goats from sponge insertion to mating. The number of
animals responding to the superovulation treatment averaged 64% (11/17) and was not
different between groups (P > 0.05). In all groups, an analogous success rate (P < 0.05) of
recovery was achieved. Means were 80.05 ± 9.78% (145/181) for total recovery (N embryo
+ unfertilized ova / N ovulations), and 61.03 ± 15.13% (114/181) for transferable structures
recovery (N embryo transferable / N ovulations) respectively. Although treatment did not
affect the number of degenerated embryos, in the insulin groups the frequency of excellent
embryos (Table 1) tended to increase (P < 0.05), as well as the number of transferable
embryos/donor that achieve twice than the goats supplemented with propylene glycol
(12.07 ± 1.27 vs. 6.67 ± 0.94, P > 0.05). Nevertheless, only the InsulinBMat group showed
a relationship between the number of transferable embryos and ovulations (R = 0.90) (P <
0.05).
Discussion
The results of the present experiment demonstrate that, in superovulated goats, insulin
injection immediately before or after mating, in order to promote increased insulineamia,
resulted in an enhancement of embryo production. This is consistent with the greater
differences of the number of excellent embryos and the increase of transferable embryos
with ovulations observed in donors of insulin groups. These data are according to Selvaraju
et al. (2003), who did not observe any differences regarding the number and the quality of
�
72
embryos produced in goat does treated with similar doses of insulin before and during
superovulation treatment prior to fecundation. The developmental stage and quality grade
of the embryo at transfer has long been known to influence the outcome of embryo transfer
(Looney et al. 2006). Embryos classified as excellent or good result in higher pregnancy
rates than transfer of lower quality embryos (Hasler 2001). In uterus, the development rate
of embryos is usually considered a function of embryo quality, associated with the
adequacy of maternal progesterone production (Bo et al. 2002; Baruselli et al. 2001).
However recent findings (Mann et al. 2003) demonstrated in beef heifers that high insulin
from diet appears to be more important for embryo development than plasma progesterone
concentrations. Insulin is known to have an important role in the control of follicle
development (Webb et al. 1999). The insulin possesses a positive action on the expression
and action of growth factor genes, such as IGF-I, and the plasma insulin rate is positively
correlated to the rate of IGF-I (Gong 2002). In turn, IGF-I is an important mediator of
follicular development, steroidogenesis, oocyte maturation and embryonic development
(Yassen et al. 2001). The IGF-1 receptor is expressed throughout the bovine pre-
implantation embryo (Lonergan et al. 2000) and IGF-1 as insulin added in vitro improves
embryo development by decreasing the number of apoptotic cells and increasing the total
cell number of the embryo (Mihalik et al. 2000).
As shown in the insulin rates generated in this experiment from the administration of
propylene glycol, continuous stimulation of insulineamia induced a lower response of
embryo production. Generally, the propylene glycol induces an increase in plasma glucose
and plasma insulin, however the magnitude of this response can vary according to the
dosage as well as the manner and time of administration. (Nielsen & Ingvartsen, 2004).
Hidalgo et al. (2004), reported an increase of pregnancy rates in heifer embryo recipients
�
73
treated for 20 days with a single oral dose of propylene glycol, associated with augment of
insulin rates. Chiofalo et al. (2005), using 80g and 160g propylene glycol daily in dairy
ewes during pre and postpartum, reported a higher milk yield and growth in suckling lambs
treated with high level of propylene glycol, even though similar glucose concentrations
were induced. The reproductive parameters are normally dependent upon maintaining the
effects of the insulin (Hidalgo et al. 2004). The glucose and insulin peaks in animals with
treated propylene glycol occur within the first 90 minutes following oral administration of
propylene glycol (Nielsen & Ingvartsen, 2004). For this reason, the blood collections in this
work were planned in a way so as not to record the sharp effects of propylene glycol
administration (24 h after administration). Energy supplementation through administration
of propylene glycol increased the plasma levels of insulin and IGF-I (Grummer et al. 1994),
which in association affect ovarian function and initial embryonic development through the
stimulation of the granulosa cells and proliferation of the theca cells (Alvarez et al. 2000),
leading the follicle to produce adequate levels of estradiol, promoting its growth until it is
apt to stimulate the LH peak and ovulation peak (Beam and Butler 1999). Although over-
stimulation of intraovarian IGF-1 stimulate the follicular growth, it may be detrimental to
the maturation of the oocyte (Armstrong et al, 2001). McCaffery et al (2000) reported in
preantral follicles treated with high concentrations of IGF-1 significantly reduction of
oocytes size. Wathes et al. (2003) has been suggested that most of the IGF-1 found in the
bovine follicle is derived from circulation. Embryonic developmental not only depends on
the genital tract environment but also to oocyte quality (O’Callaghan and Boland 1999).
The direct action of glucose has also been tested, and Rubio et al. (1997) observed
reductions of the gestation rates in sheep submitted to glucose infusion. This method, in
sheep, may increase the rate of ovulation (Downing et al. 1995), but the quality of the
�
74
embryo may be limited drastically (Yaakub et al. 1999). Boland et al. (2001) suggests that
effect of glucose upon embryonic development may be related to the fact that high glucose
concentrations in the protoplasm interfere with cellular signaling during preovulatory
follicle growth, the development of oocytes, or initial development of the embryo.
In conclusion, enhancement of circulating insulin immediately before or after mating was
associated with high proportion of viable embryos in donors. Continuous manipulation of
insulinemia by oral administration of propylene glycol increases serum insulin progesterone
levels, but not embryo quality. Thus metabolic hormone as insulin is a key factor involved
in the mechanisms of embryo development and improves the results of embryo production
in goats. However, we suggest that further research be developed in order to find the
optimal dosage and administration protocol before practically used.
Acknowledgements
A.L. Souza was the recipient of a scholarship from CAPES/Brazil. The authors would like
to thank Embrapa Caprinos for the session of animals used in this study. The work was
financed by FUNDECI-BNB (Brazil). V.J.F. Freitas is senior investigator at CNPq/Brazil
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�
79
List of Figures
Fig. 1:
Insulin levels according to the synchronization and superovulation treatment in responsive
goats. a,b,c p < 0.05 comparison between groups; A,B,C … p < 0.05 comparison between blood
sampling intervals. Values are given in means ± SEM.
List of Tables
Table 1.
Number of embryos/donor classified according to IETS. Values are given in means ± SEM.
�
80
aA
aA
aA
aB
aAB aB
aAB
abA
bA
bB
bAbA
0
5
10
15
20
25
MPA Sponge pFSH Mating Laparotomy
Insu
lin (�
U/m
L)Insulin BMatPropyleneInsulin AMat
Figure 1: Insulin levels according to the synchronization and superovulation treatment in
responsive goats. a,b,c p < 0.05 comparison between groups; A,B,C … p < 0.05 comparison
between blood sampling intervals. Values are given in means ± SEM.
�
81
Table 1. Number of embryos/donor classified according to IETS. Values are given in
means ± SEM.
Transferable Not Transferable Group N
Excellent Regular Poor Degenerate
Insulin BMat 5 7.80 ± 0.88a 2.00 ± 0.60ab 1.00 ± 0.32b 1.00 ± 0,54b
Propylene 3 5.00 ± 1.85 1.00 ± 0.48 0.67 ± 0.47 1.33 ± 0.94
Insulin AMat 3 11.33 ± 2.89a 1.67 ± 1.18b 0.33 ± 0.24b 1.67 ± 0.67b
a,b,c,d P < 0.05, comparison between embryo classes.
�
82
ANEXO 2
FOTOS DO EXPERIMENTO
Figura 8. Animais da raça Moxotó. (A) Fêmeas experimentais, (B) Bode experimental, (C)
Detecção do estro das fêmeas, (D) Momento da cobertura de uma das fêmeas (Fonte:
Almeida, AP).
�
83
Figura 9. (A) Início do tratamento de sincronização do estro, momento da inserção de
esponja vaginal; (B) Colheita de sangue, (C) Laparotomia para recuperação embrionária,
(D) Exposição do trato reprodutivo de uma das fêmeas, momentos antes da colheita de
embriões (Fonte: Almeida, AP).
�
84
Figura 10. (A) Lavagem do corno uterino de uma das fêmeas do experimento para
recuperação embrionária; (B) Lavado uterino contendo as estruturas totais recuperadas;
(C),(D) e (E) Embriões recuperados do lavado uterino, e submetidos à avaliação
morfológica; (F) Embriões caprinos no estádio de mórula. (Fonte: Laboratório de Fisiologia
e Controle da Reprodução - LFCR).
