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1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FRANCISCO BERGSON PINHEIRO MOURA
AVALIAÇÃO CRANIOMORFOLÓGICA DO MORCEGO
HEMATÓFAGO Desmodus rotundus NO ESTADO DO CEARÁ
FORTALEZA
2015
2
FRANCISCO BERGSON PINHEIRO MOURA
AVALIAÇÃO CRANIOMORFOLÓGICA DO MORCEGO
HEMATÓFAGO Desmodus rotundus NO ESTADO DO CEARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
carnívoros, onívoros, herbívoros e aves
Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva
Teixeira
FORTALEZA
2015
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Sistema de Bibliotecas
Moura, Francisco Bergson Pinheiro.
Avaliação crânio do morcego hematófago Desmodus
rotundus no estado do Ceará [recurso eletrônico] /
Francisco Bergson Pinheiro Moura. – 2015.
1 CD-ROM: il.; 4 ¾ pol.
CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do
trabalho acadêmico com 71 folhas, acondicionado em
caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm).
Dissertação (mestrado acadêmico) – Universidade
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Fortaleza, 2015.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Prof.ª Dra. Maria Fátima da Silva
Teixeira.
1. Morcegos. 2. Crânio. 3. Fenótipo. 4. Linhagem.
5. Dimorfismo sexual. I. Título.
4
5
Aos meus pais, Maria Luisa e João Adolfo, pela
educação e orientação e por serem exemplos de
vida e dedicação, aos meus irmãos, filhos e
netos, pelo apoio e amor dedicado, à Mariza
pela amizade motivadora.
6
AGRADECIMENTOS
No decorrer dos meses de dedicação a esta pesquisa, vários amigos, familiares e instituições,
cada um a seu modo, colaboraram em todas as etapas de seu desenvolvimento. O maior dos
agradecimentos é direcionado a Deus, causa primeira de todas as coisas.
À Universidade Estadual do Ceará, por meio de seu Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, que me proporcionou a oportunidade para iniciar o presente trabalho.
Ao Laboratório de Virologia da UECE (LABOVIR), por obter muitos amigos e pela
possibilidade de execução deste projeto.
À professora Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira, pela valiosa orientação e imenso apoio
oferecido nas correções, críticas e sugestões na construção desta dissertação durante o
desenvolvimento acadêmico.
A todos professores e professoras do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos repassados
que contribuíram e enriqueceram este trabalho.
À técnica em secretariado, Adriana Maria S. Albuquerque, que no decorrer dos anos do curso
sempre prestou bons serviços, tendo estes, reflexos positivos no nosso estudo.
A todos os demais funcionários que trabalham no Curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, destacando-se João Batista e Elizangela, que sempre zelaram as salas de aulas e o
Laboratório de Virologia, respectivamente, em boas condições.
À amiga Jeane Dias Leandro, pelas importantes contribuições nas análises estatísticas na versão
final desta dissertação.
À coordenadora da 1ª Coordenadoria Regional de Saúde de Fortaleza da Secretaria de Saúde
do Estado do Ceará, Dra. Maria Verônica Sales da Silva, pelo consentimento da minha liberação
no período necessário à realização deste curso de mestrado e pelo importante apoio e
compreensão em conciliar minhas atribuições na referida unidade com minhas atividades de
pesquisa.
Ao supervisor do Núcleo de Controle de Vetores da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará,
Dr. Benedito Neilson Rolin, que colaborou ao ceder parte dos materiais permanente e de
consumo, veículos e liberação dos técnicos para realização das atividades de campo.
Aos técnicos do Núcleo de Controle de Vetores, Jorge Bezerra da Silva, Raffael Junior de
Oliveira, Eduardo Emanuel Apolônio, Luiz Gonzaga de Castro, Antônio Cláudio Braga Pereira,
Paulo Henrique da Cruz Café, na execução das capturas dos morcegos, em especial à técnica
Maria Mariza de Lima e Silva, que participou de todas as viagens com dedicação e esforços
imensuráveis em todas as atividades de campo e laboratoriais.
Ao chefe da Divisão de Biologia Médica do Laboratório Central de Saúde Pública do Ceará
(LACEN), José Napoleão Monte da Cruz, e a médica veterinária Izabel Cristina Felix Franco,
pelo apoio dado no tocante ao acondicionamento do material biológico destinado ao futuro
diagnóstico de RT-PCR.
A todos os colegas de turma do curso, pela grande amizade e carinho, ao Sanjay que me ajudou
na primeira viagem em São benedito.
Ao meu grande amigo Dr. Wilson Uieda, que no início do meu curso de pós-graduação me
orientou sobre o uso dos coleópteros Dermestes destinados à limpeza dos crânios.
7
À Dra. Fernanda A. G. Andrade do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do
Pará, pelo envio de exemplares de coleópteros Dermestes no início deste estudo.
A todos os servidores públicos de saúde dos municípios visitados durante a pesquisa, que
dedicaram horas em colaborar nas atividades de campo, destacando-se Jardel, Neidinha, José
Airton Negreiros, Cezário Vieira da Costa Neto, Carlos Eduardo de Medeiros Santana pelo
apoio total e irrestrito nos trabalhos de campo.
Aos meus pais, Maria Luisa Pinheiro Moura e João Adolfo Abreu Moura, por estarem ao meu
lado em todos os momentos desta pesquisa com valioso e irrestrito incentivo, aos meus irmãos,
em especial ao meu irmão, Olavo, pelo estímulo e incentivo de sempre.
A todos os meus filhos e netos, pelo grande carinho e admiração.
A todos os meus amigos pelo incentivo de sempre, em especial ao amigo José Hibbis Farias
Ribeiro por ter cedido sua máquina fotográfica profissional ao substituir a minha durante a
execução dessa pesquisa.
A todos os moradores das localidades onde foram realizadas as pesquisas dos abrigos dos
morcegos hematófagos, pelo excelente acolhimento de toda a equipe de campo.
À vida de todos os animais utilizados neste trabalho que certamente contribuíram para um bem
maior na ciência.
Finalmente, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram na plena efetivação
desta busca científica.
8
RESUMO
Estudos sobre a morfologia craniana dos morcegos vampiros da espécie Desmodus rotundus
(D. rotundus) correlacionada aos fatores ambientais, bem como fenótipo são escassos na
literatura científica. Este delineamento experimental correlacionou caracteres que descrevem o
crânio nessa espécie com uma base de dados com vinte medidas cranianas associada ao
fenótipo, bem como explorou circunstâncias ecológicas que afetam os caracteres cranianos.
Foram utilizadas abordagens quantitativas morfológicas para averiguar a evolução do crânio do
D. rotundus quanto à existência de linhagem. Para tanto, foram capturados 41 morcegos
vampiros adultos por meio de redes de neblina (mist-nets) em quatro municípios do Estado do
Ceará com diferentes tipos climáticos e unidades fitoecológicas. Os morcegos capturados foram
submetidos à obtenção de dados taxonômicos e coleta de sistema nervoso central nos
Laboratórios de Entomologia Médica situados nas Coordenadorias Regionais de Saúde
pertencentes à Secretaria de Saúde do Estado do Ceará. Após a limpeza dos crânios realizou-se
a análise morfológica de cada exemplar e avaliação com as circunstâncias ecológicas. O projeto
foi avaliado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará
(CEUA) sob o número 5660389/2014 e da análise e emissão de pareceres do Sistema de
Autorização e Informação Científica em Biodiversidade (SISBio) pertencente ao Instituto
Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade sob o número 46433. Uma quantidade
suficiente de exemplares foi obtida em cada município trabalhado sem causar prejuízo às
análises através de técnicas substitutivas baseada em modelos matemáticos/estatísticos, onde a
análise estatística através do Programa Epi Info7 não pôde afirmar que o tamanho do crânio do
morcego hematófago D. rotundus varia conforme o tipo climático e unidade fitoecológica onde
está inserido, levantando a hipótese de que a altitude possa influenciar no tamanho do crânio.
Porém, foi observado diferença entre as medidas externas dos machos e fêmeas para o nível de
significância considerado, verificando a existência de dimorfismo sexual. Em todos os
morcegos estudados foi possível realizar a coleta de material do sistema nervoso central
suficiente para servir nos estudos posteriores, com intuito de adquirir o conhecimento da
susceptibilidade e detecção viral da raiva nesta espécie, possibilitando obter a correlação entre
o estudo dos fatores ambientais e diagnóstico da raiva.
Palavras-chave: Morcegos. Crânio. Fenótipo. Linhagem. Dimorfismo sexual.
9
ABSTRACT
Studies on the cranial morphology of Desmodus rotundus vampire bats (D. rotundus) correlated
to environmental factors as well as phenotype are rare in the literature. This experiment
correlated characters, which describe the skull of this species with database of twenty skull
measurements of each evaluated sample associated phenotype and explore ecological
conditions affecting the cranial characters. Morphological quantitative approaches were used
to investigate skull evolution of D. rotundus regarding the existence of lineage. Thus, forty-one
adult vampire bats were captured through mist nets in four Ceará State municipalities with
different climate types and phytoecological units. Captured bats were submitted to obtain
taxonomic data and collection of central nervous system material in Medical Entomology
Laboratories set in Health Regional Coordination of Health Department of Ceará State. The
skulls were then subjected to manual cleaning with tweezers, being held morphological analysis
of each sample, comparing the data obtained from the ecological conditions. The study
underwent by assessment of the Ethics Committee for the Use of Animals of State University
of Ceará (ECUA) number 5660389/2014 and analysis and issuing opinions by the Release and
Scientific Information System Biodiversity (RSISB) belonging to Chico Mendes Institute for
Biodiversity Conservation number 46433. It was used sufficient amount of specimens in each
worked municipality without infringing the analysis through substitute technique based on
mathematical / statistical models, where the statistical analysis through Epi Info7 program could
not say that the skull size of vampire bat D. rotundus varies according to climate type and
phytoecological unit where it operates. It raises the possibility that the altitude can influence
the skull size. However, difference between the means of external measures of males and
females was observed for the considered significance level, verifying the existence of sexual
dimorphism. So, in all bats studied it was possible to collect enough central nervous system
material to serve in later studies, aiming to acquire susceptibility knowledge and viral detection
of rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of
environmental factors and rabies diagnosis.
Keywords: Bats. Skull. Phenotype. Lineage. Sexual dimorphism.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografia do morcego da Ordem Megachiroptera conhecido como raposa
voadora .........................................................................................................................
19
Figura 2 – Fotografias de espécies de morcegos da Ordem Microchiroptera.(A)
Lonchorhina aurita, (B) Trachops cirrhosus. (C) Platyrrhinus recifinus .....................
19
Figura 3 – Fotografias de espécies de morcegos hematófagos. (A) Diphylla ecaudata,
(B) Diaemus youngi e (C) Desmodus rotundus .............................................................
20
Figura 4 – Fotografia do morcego D. rotundus em seu habitat natural .......................... 21
Figura 5 – Vírus da raiva em forma de bala ...................................................................
27
Figura 6 – Patogenia da infecção pelo vírus da raiva...................................................... 30
Figura 7 – Técnica de Imunofluorescência Direta. (A) Positivo, (B) Negativo ............. 33
Figura 8 – Infiltrados perivasculares ou inflamação em torno de um vaso sanguíneo .. 34
Figura 9 – (A) Pequenos nódulos. (B) Vaso sanguíneo sem células inflamatórias
(200x). 1= Glóbulos vermelhos. 2 = Células epiteliais escamosas ................................
35
Figura 10 – Neurônio sem Corpúsculo de Negri. (B) Corpúsculo de Negri no neurônio
infectado .......................................................................................................................
35
Figure 1 - State location of Ceará in Brazil ……………………………………………
55
Figure 2 - Climate Types of Ceará State ……………………………………………... 55
Figure 3 - Phytoecological Units of Ceará ……………………………………………. 56
Figure 4 - Sample points geo-referenced in the study in Ceará State municipalities…. 56
Figure 5 - Side, ventral, frontal and occipital views of D. rotundus skull with
measurements indicated ………………………………………………………………
57
Figure 6 – Photograph of phenotypic characters: (A) Mandibular earrings. (B)
Submandibular structure ...……………………………………………..……………..
57
11
LISTA DE TABELAS
Table 1. Climate types, phytoecological units, and other characteristics of Desmodus
rotundus shelters in researched Ceará municipalities, 2015 …………………………..
46
Table 2. Capture effort done in each type of habitat sampled (h.m²) during the entire
period of study in Ceará State, Cv = cave, Mn = disabled mine ………………………
47
Table 3. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
skull measurements and municipalities, Ceará, 2015 ……………………………….
48
Table 4. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
sex and total body length (Bl), Ceará, 2015 ………………………………………….
52
Table 5. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
sex and foot length (Fl), Ceará, 2015 …………………………………………….……
52
Table 6. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
sex and forearm length (Fl), Ceará, 2015 ……………………………………………
52
Table 7. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
sex and ear height (Eh), Ceará, 2015 …………………………………………………
53
Table 8. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
sex and uropatagium width (Uw), Ceará, 2015 ………………………………………
53
Table 9. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
phenotypic characters, climate type and phytoecological unit, Ceará, 2015 …………
53
12
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Classificação do Gênero Lyssavirus ........................................................... 28
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABLV – Australian Bat Lyssavirus
ADN – Ácido Desoxirribonucléico
ARN – Ácido Ribonucléico
AMC – (Minimum Alveolar Concentration) Concentração Alveolar Mínima
ANOVA – Análise de Variância
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
CEUA - Comitê de Ética para o Uso de Animais
CRES – Coordenadorias Regionais de Saúde
CV – Cave (Caverna)
D. rotundus – Desmodus rotundus
DUVV – Vírus Duvenhage
EBLU – European Bat Lyssavirus
ECUA - Ethics Committee for the Use of Animals
G – Glicoproteína
h.m² - Altura por metro quadrado
IPECE – Instituto de Pesquisa e Estratégia Econômica do Ceará
LBV - Vírus Lagos Bat
MN – (Disable mine) Mina desativada
MOKV – Vírus Mokola
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
RABV – Rabies vírus
RSISB - Release and Scientific Information System Biodiversity
RT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa
RT – Transcriptase Reversa
SESA – Secretaria de Saúde do Estado do Ceará
SISBio – Sistema de Autorização e Informação Científica em Biodiversidade
SNC –Sistema Nervoso Central
TID – Teste de Imunofluorescência Direta
14
APENDICE
APÊNDICE A - Saco de tecido de algodão numerado utilizado nas atividades de campo
para acondicionar morcego hematófago D. rotundus capturado ....................................
71
APÊNDICE B - Câmara adequadamente projetada para realização da eutanásia .........
71
APÊNDICE C - Ficha utilizada para obtenção das medidas cranianas, medidas externas
e dados inerentes aos abrigos dos morcegos hematófagos Desmodus rotundus nos
municípios trabalhados na pesquisa ................................................................................
71
APÊNDICE D - Ficha para obtenção de dados complementares da captura inerentes às
fases lunares ....................................................................................................................
72
APÊNDICE E - Ficha contendo outras espécies de morcegos capturados e soltos que
coabitam com D. rotundus nas atividades de campo .....................................................
72
APÊNDICE F - Ficha sobre as espécies agredidas por D. rotundus nos municípios
trabalhados na pesquisa no Ceará ..................................................................................
72
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 18
2.1 OS MORCEGOS...................................................................................................... 20
2.2 OS MORCEGOS HEMATÓFAGOS....................................................................... 19
2.3 O MORCEGO VAMPIRO Desmodus rotundus..................................................... 20
2.4 MORFOMETRIA CRANIANA .............................................................................. 22
2.5 ESPÉCIE E LINHAGEM......................................................................................... 23
2.6 TIPOS CLIMÁTICOS .............................................................................................. 23
2.7 UNIDADES FITOECOLÓGICAS .......................................................................... 24
2.8 A IMPORTÂNCIA DA RAIVA NO CONTEXTO DA MORFOLOGIA DO
TRANSMISSOR D. ROTUNDUS.................................................................................
26
2.8.1 Raiva .................................................................................................................... 26
2.8.2 Agente Etiológico ................................................................................................ 26
2.8.3 Epidemiologia ..................................................................................................... 28
2.8.4 Transmissão ........................................................................................................ 29
2.8.5 Patogenia ............................................................................................................. 29
2.9 MÉTODOS EFICIENTES DE DIAGNÓSTICOS ATUAIS PARA A RAIVA...... 31
2.9.1 Teste de Imunofluorescência Direta (TID) ...................................................... 32
2.9.2 Prova para isolamento do vírus rábico em camundongo (prova biológica).. 33
2.9.3 Exame Histopatológico ...................................................................................... 34
2.9.4 Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT-PCR) ...... 35
3 JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 37
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ...................................................................................... 38
5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 39
16
5.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 39
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 39
6 CAPÍTULO 1 ............................................................................................................ 40
7 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 58
8 PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 59
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60
10 APENDICE ............................................................................................................. 71
17
1 INTRODUÇÃO
Os organismos são constituídos por um arranjo complexo de estruturas anatômicas e
partes individualizadas que mantêm associações funcionais ao longo do desenvolvimento
(HALLGRÍMSSON et al., 2009). No início do século XIX, o anatomista francês George
Curvier enfatizou o “princípio da correlação das partes”, com intuito de dar a ideia de que as
partes dos organismos são coordenadas para formar um todo funcional (MAYR, 1982). Na
década de 50, cinco pesquisadores apresentaram métodos de correlação entre morfologia e
função. Everett Olson (1951) e Robert Miller (1958) apresentaram métodos quantitativos
baseados em correlação, para identificar empiricamente grupos de caracteres fenotípicos que
são mais fortemente integrados, com base em fatores compartilhados de desenvolvimento e
função. Os botânicos Jean Clausen e William Hiesey (1960) exploraram em um longo programa
de pesquisa as correlações de caracteres complexos em híbridos intraespecíficos de raças
ecológicas. Raisa Berg (1960) investigou os diferentes graus de integração entre conjuntos
específicos de caracteres, segundo as circunstâncias ecológicas, gerando hipóteses que são
usadas para orientar a pesquisa empírica (ARMBRUSTER et al., 1999) na detecção de módulos
ou modelos de correlação (BERG, 1960).
Em morcegos hematófagos Desmodus rotundus, praticamente não existem estudos
acerca das correlações das partes; compreendendo caracteres cranianos, características
fenotípicas e circunstâncias ecológicas que envolvem tipos climáticos e unidades
fitoecológicas. O crânio, objeto do presente estudo, pode ser um modelo imprescindível para
conduzir o estudo de integração morfológica (devido à complexidade do crescimento dos ossos)
com outras variáveis (caracteres fenotípicos e circunstâncias ecológicas), configurando talvez
uma coesão de seleção natural e evolução com susceptibilidade de infecção com os vírus da
raiva.
Como parte da análise morfológica quantitativa, os caracteres fenotípicos [brincos
mandibulares, estrutura submandibular e membrana femoral (uropatágio)] podem ser
considerados ferramentas mensuráveis obtidos a partir de dados coletados, permitindo
que mudanças evolutivas possam ser quantificadas e monitoradas, denotando aplicabilidade no
estudo, além de poder avaliar uma covariância nos caracteres morfológicos que podem
apresentar uma correlação entre morfologia e função, variando conjuntamente até certo ponto,
mapeados em alguns municípios do Estado do Ceará sobre os aspectos ambientais (climáticos
e fitoecológicos) diferenciados.
18
Dessa forma, com esta avaliação, pretendem-se analisar divergências
craniomorfológicas e futuramente correlacionar com a detecção de vírus da raiva na espécie de
morcego hematófago D. rotundus ao longo de sua distribuição no Estado do Ceará.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OS MORCEGOS
Os morcegos pertencem à ordem Chiroptera, palavra derivada do grego cheir (mão) e
pteron (asa), uma das maiores da classe Mammalia, com 18 famílias, 202 gêneros e 1.120
espécies (SIMMONS, 2005). Este diversificado grupo de mamíferos representa
aproximadamente 22% das espécies conhecidas de mamíferos, perfazendo 5.416 espécies
(WILSON; REEDER, 2005).
A ordem Chiroptera é subdividida em Megachiroptera e Microchiroptera
(PETTIGREW, 1986). Os Megachiroptera são representados por cento e cinquenta espécies
(FENTON, 1992) e os Microchiroptera compostos por dezessete famílias e novecentos e trinta
espécies (SIMMONS, 2005).
A ordem Megachiroptera não ocorre no Brasil e está representada pela família
Pteropodidae distribuída pelo Velho Mundo, na região tropical da África, sudeste da Ásia, Índia
e Austrália (FENTON, 1992). Seus representantes possuem faces similares com as raposas
(Figura 1), sendo conhecidos popularmente como raposas-voadoras, atingindo
aproximadamente 1,5Kg e 1,7m de envergadura. As orelhas são pequenas e desprovidas de
tragus (apêndice membranoso na base auricular) sem ornamentações faciais (com exceção de
apenas uma espécie nesta família), pois não apresentam ecolocalização. São desprovidos de
cauda e uropatágio (membrana femoral) e quando estão empoleirados, a cabeça fica virada para
a região ventral (TADDEI, 1976).
19
Figura 1. Fotografia do morcego da Ordem Megachiroptera conhecido como raposa voadora.
Fonte: journeytothejungle.com.
Os morcegos da ordem Microchiroptera (Figura 2) não ocorrem nas regiões polares
(SIMMONS, 2005) e no mundo existem 17 famílias e 930 espécies. No Brasil ocorrem 9
famílias, 64 gêneros e 167 espécies (REIS et al., 2006; TAVARES et al., 2007). Esta ordem
está representada pelas famílias, com suas respectivas espécies: Phyllostomidae (90);
Mormoopidae (4); Noctilionidae (2); Emballonuridae (15); Furipteridae (1); Thyropteridae (4);
Natalidae (1); Mollosidae (26) e Vespetilionidae (24) (PERACCHI et al., 2006). No Brasil esta
ordem habita no Cerrado, na Mata Atlântica, no Pantanal, no árido do Nordeste, nos pampas
gaúchos, na Amazônia e nas áreas urbanas.
Figura 2. Fotografias de espécies de morcegos da Ordem Microchiroptera. (A) Lonchorhina
aurita, (B) Trachops cirrhosus. (C) Platyrrhinus recifinus. Fonte: Bergson 2014.
No Brasil, o que é agravado pelo aumento da população desses morcegos é o fato de
que eles compartilham os abrigos onde vive a espécie D. rotundus (SODRÉ, 2010; CUNHA,
2005).
2.2 OS MORCEGOS HEMATÓFAGOS
Os morcegos hematófagos pertencem à ordem Chiroptera, família Phyllostomidae,
subfamília Desmodontinae e inclui três espécies hematófagas (Figura 3), monotípicas e
simpátricas: Desmodus rotundus, conhecido como “morcego vampiro comum” que se alimenta
do sangue de mamíferos e aves; Diphylla ecaudata, o vampiro de pernas cabeludas e Diaemus
youngi, ambos se alimentam do sangue das aves (BRASS, 1994). Essas três espécies
apresentam apêndice nasal rudimentar, de estrutura discoide em forma de ferradura ou como
A B C
20
protuberância. A membrana femoral (uropatágio) é reduzida e não possuem cauda. As pernas,
antebraços e polegares são longos, sendo esses últimos espessados e usados como pés para
andar, saltar ou escalar de forma quadrúpede (ALTENBACH, 1979; GREENHALL et al.,
1983). Igualmente aos outros morcegos, os hematófagos também emitem sinais de
ecolocalização para a orientação espacial, contudo, suas audições são adaptadas melhores para
baixas frequências, entre 100 Hz e 10 kHz (SCHMIDT et al. 1991).
Figura 3. Espécies de morcegos hematófagos. (A) Diphylla ecaudata, (B) Diaemus youngi e
(C) Desmodus rotundus. Fonte: museudezoologia.ufv.br
2.3 O MORCEGO VAMPIRO Desmodus rotundus
A espécie microquiroptera Desmodus rotundus (Figura 4), é o morcego hematófago
mais comum com ampla distribuição, ocorrendo desde o norte do México até o Chile central
no oeste e no leste toda a extensão do litoral uruguaio, incluindo a bacia amazônica, o Paraguai
e o norte da Argentina (KOOPMAN, 1988; EMMONS, 1990). Como membro da subfamília
Desmodontinae, o D. rotundus é desprovido de cauda e apresenta redução da folha nasal e da
dentição, com incisivos e caninos extremamente afiados (GREENHALL, 1988).
Diferentemente da maioria dos morcegos que apresentam pequenos incisivos superiores e
grandes caninos, o vampiro tem grandes incisivos superiores e grandes caninos superiores que
aparecem em forma de V (triangular) quando são vistos de frente ou de perfil que permitem
esta espécie cortar a pele da sua vítima de tal maneira que algum vaso sanguíneo seja alcançado
e possa, assim, alimentar-se de sangue. Os dentes laterais são muito pequenos e em número
reduzido (GREENHALL, 1972).
A pelagem é bastante macia, em geral de coloração cinza brilhante, mas pode apresentar
também tons avermelhados, dourados ou mesmo alaranjados (BERNARD, 2005), envergadura
aproximadamente de 35cm e peso variando entre 25 e 40g (GREENHALL et al. 1983), podendo
ser considerado de médio porte, comparado às outras espécies desses animais que ocorrem no
Brasil.
A B C
21
Figura 4. Fotografia do morcego D. rotundus em seu habitat natural. Fonte: Bergson 2009.
Vivem em colônias onde um harem pode variar de <10 a 300 membros (GOMES;
UIEDA, 2004); entretanto já foram registradas aglomerações com até 2000 indivíduos
(WILKINSON, 1988), permanecendo estáveis em sua composição por longos períodos e seus
indivíduos são capazes de se reconhecer (SCHMIDT, 1978). Mamífero gregário, D. rotundus
apresenta estrutura social caracterizada por hierarquia de dominância, onde um macho
dominante toma conta de um grupo de fêmeas, localizando-se no alto do abrigo, enquanto os
outros machos ficam em localizações periféricas na colônia. O macho dominante não só possui
maior acesso às fêmeas como também se alimenta em localidades mais próximas do abrigo
(WILKINSON, 1988). Estudos têm revelado a existência de dimorfismo sexual e ocorrência de
maior número de fêmeas (ALENCAR et al. 1994; NUÑEZ; VIANNA, 1997; GOMES; UIEDA,
2004).
A gestação nesta espécie tem a duração de sete meses, com o nascimento de um filhote
por vez, ocasionalmente podendo ocorrer gêmeos. Contudo, o nascimento da maioria dos
filhotes parece se concentrar na estação mais quente e chuvosa (GOMES; UIEDA, 2004),
diferentemente do que acontece no nordeste brasileiro quando o início da reprodução se inicia
após o inverno (PICCININI, 1972). Durante o segundo mês de vida o filhote já recebe alimento
regurgitado pela mãe e a acompanha até os quatro meses, tornando-se independente aos cinco
meses (LORD, 1992; TURNER, 1975). Esta espécie não tolera climas frios, não ocorrendo em
locais que possuam temperatura média inferior a 10⁰C no mês mais frio do ano (GREENHALL
et al., 1983), podendo habitar em áreas florestadas assim como regiões desérticas, abrigando-
se em ocos de árvore, cavernas, bueiros, minas abandonadas e mesmo construções civis
(BREDT et al., 1996).
A fidelidade ao abrigo desta espécie é confusa, pois não se sabe ao certo como se
formam novas colônias. Segundo Wilkinson (1984, 1985) os grupos de fêmeas vivem e
forrageiam juntas durante anos na mesma localidade. Por outro lado, o mesmo autor afirma que
apesar de todas as fêmeas permanecerem no grupo onde nasceram após atingirem a idade
22
adulta, há dispersão das mesmas e em média uma fêmea não-aparentada une-se a um grupo
distinto daquele em que nasceu a cada dois anos. Os machos possuem padrão de dispersão
muito mais indubitável, todos os machos juvenis entre 12 e 18 meses de idade deixam o abrigo
onde nasceram, expulsos pelos machos residentes ou não, e procuram um novo abrigo sempre
a uma distância mínima de 3Km de onde nasceram (WILKINSON, 1985). Machos periféricos
percorrem grandes distâncias para alimentar-se, sobrepondo sua área de forrageamento com as
de outras colônias e nunca compartilhando território com outros machos da mesma colônia (não
há sobreposição de território entre as fêmeas de diferentes abrigos). Wilkinson (1988) acredita
que esse comportamento dos machos periféricos reflete uma busca por fêmeas disponíveis em
outros abrigos enquanto o macho residente foi se alimentar, ou por um abrigo onde tenha maior
chance de copular. A espécie D. rotundus não é migratória, mas troca de abrigos dentro de sua
área de ação (de 10 a 20 Km²). Utiliza rotas estabelecidas em suas atividades noturnas, as quais
podem ser influenciadas pela claridade da lua, quando evita voar (ALENCAR et al., 1994;
FLORES-CRESPO, 2001).
De acordo com Altringham (1996), D. rotundus prefere o sangue de mamíferos de
grande porte. A introdução de animais domésticos como cavalos, bovinos e suínos têm
aumentado o número de indivíduos dessa espécie nos últimos 300 anos. Surtos de raiva humana
transmitida por esta espécie de morcego têm sido descritos no Norte e Nordeste do Brasil,
predominantemente em comunidades rurais distantes de atendimento médico, sem
abastecimento de energia elétrica, sendo as vítimas residentes de moradias precárias, muitas
das quais trabalhando em garimpos clandestinos (DA ROSA et al., 2006; MENDES et al.,
2009). No que se refere à raiva bovina, durante o ano de 2012 foram notificados oficialmente
no Brasil 1435 casos, contabilizando-se somente aqueles diagnosticados em laboratórios
oficiais e credenciados (MAPA, 2013).
2.4 MORFOMETRIA CRANIANA
Métodos de morfometria têm sido amplamente utilizados para responder questões
referentes à integração morfológica, onde a variação de características entre indivíduos também
reflete outros fatores (HALLGRIMSSON et.al, 2009; KLINGENBERG, 2003; MONTEIRO,
2005; SANTANA; LOFGREN, 2013; ZELDITCH; WOOD, 2008).
A combinação de técnicas de morfometria e métodos comparativos tem sido usada para
avaliar os processos evolutivos que estiverem por trás da diversificação do fenótipo, por
exemplo tamanho e forma da mandíbula (MONTEIRO; NOGUEIRA, 2011), podendo servir
23
como ótima ferramenta para avaliar a craniomorfologia da espécie D. rorundus proposta neste
estudo.
Além disso, hipóteses ecológicas e fatores de desenvolvimento já foram contrastados
através de investigação sobre a integração morfológica em crânios e mandíbulas de morcegos
filostomídeos (NOGUEIRA et.al, 2009).
Dados sobre dieta, morfologia do crânio e desempenho da mordida foram relacionados
com as taxas de diversificação ao longo da história evolutiva da família ecologicamente
diversificada de mamíferos da ordem Chiroptera, família Phyllostomidae, onde os resultados
mostraram que um novo fenótipo craniano desempenhou um papel importante na evolução,
aumentando a especiação dentro da família dos filostomídeos (DUMONT et. al., 2012).
Embora este estudo esteja adotando o protocolo segundo Vizzoto e Taddei (1973) na
morfometria, o diâmetro do forâmen magno está sendo incluído como uma ferramenta que
poderá investigar sobre a postura do D. rotundus, que segundo Baer e Nanda (1976) a estrutura
óssea chamada de plano do forâmen magno representa o limite entre o occipital e o eixo cervical
que influencia a postura da cabeça e reflete o grau de flexibilidade no eixo crânio-cervical.
2.5 ESPÉCIE E LINHAGEM
O conceito da palavra espécie é de fundamental importância nos estudos sobre a
evolução quando é proposto averiguar a possibilidade de um determinado táxon possuir mais
de uma espécie. Isto ocorre devido ao fato de que as espécies são vistas como a entidade
essencial do processo evolutivo (WILEY, 1978).
No universo de conceitos sobre a palavra espécie, todos possuem seus méritos e suas
falhas ao se verificar divergências sobre alguns pontos relacionados com morfologia, genética,
biologia dentre outros, contrariando a teoria de que um conceito de espécie adequado deve ser
geral, aplicável e consistente teoricamente (HULL, 1997).
Uma vez que este trabalho se propõe avaliar o critério de divergências das características
externas e craniomorfológicas na espécie D. rotundus, será utilizado o conceito puramente
nominalista de linhagem como sendo estirpe ou descendência, causando uma forte correlação
entre morfologia e genética.
2.6 TIPOS CLIMÁTICOS
Os cinco tipos climáticos existentes no Estado do Ceará têm na maioria o clima tropical
quente representado por Tropical Quente Úmido, Tropical Quente Sub-úmido, Tropical Quente
Semiárido, Tropical Quente Semiárido Brando e Tropical Subquente Sub-úmido.
24
O clima Tropical Quente Úmido é caracterizado por ter a temperatura média maior que
22°C e pluviosidade superior a 1350mm ao ano, enquanto o clima Tropical Quente Sub-úmido
a temperatura é superior a 24°C com pluviosidade em torno de 1000 e 1350mm ao ano. O clima
Tropical Quente Semiárido já apresenta a temperatura média superior a 24°C com pluviosidade
menor que 850mm anuais e o Semiárido Brando possui uma variação de temperatura que vai
de 24°C até mais que 26°C com pluviosidade entre 850 e 1000mm ao ano. O clima Tropical
Subquente Sub-úmido possui a temperatura média menor de todos os outros climas, sendo
inferior a 22°C com pluviosidade maior que todas as anteriores, sendo superior a 1350mm ao
ano (IPLANCE, 1995).
2.7 UNIDADES FITOECOLÓGICAS
A cobertura vegetal do Estado do Ceará pode ser dividida em onze tipos de vegetação:
Complexo Vegetacional da Zona Litorânea; Floresta Subperenifólia Tropical Plúvio-Nebular
(Mata úmida); Floresta Subcaducifólia Tropical Pluvial (Mata seca); Floresta Caducifólia
Espinhosa (Caatinga arbórea); Caatinga Arbustiva Densa; Caatinga Arbustiva Aberta;
Carrasco; Floresta Perenifólia Paludosa Marítima; Floresta Mista Dicótilo-Palmácea (Mata
ciliar com carnaúba e dicotiledôneas); Floresta Subcaducifólia Tropical Xeromorfa (Cerradão)
e Cerrado. Vale salientar que o tipo de vegetação de maior ocorrência no Estado é a Caatinga,
ocupando cerca de 46% do território cearense.
O Complexo Vegetacional da Zona Litorânea é constituído por três tipos de vegetações:
a vegetação pioneira que está localizada na planície litorânea e muitas vezes nas dunas, servindo
como fixadora; a floresta à retaguarda das dunas que apresenta uma característica peculiar, pois
a duna além de ser um bom aquífero proporciona a proteção contra a abrasão eólica e a
vegetação dos tabuleiros litorâneos que encontra-se sobre os compartimentos geomorfológicos
de tabuleiros, mostrando-se, a priori, uma certa homogeneidade fisionômica e florística, mas
que na prática há uma certa diversificação vegetacional e florística notável. A Floresta
Subperenifólia Tropical Plúvio-Nebular (Mata Úmida) localiza-se sobre os setores mais
elevados das serras no Norte do Planalto da Ibiapaba e da Chapada do Araripe. A altitude e
exposição aos ventos úmidos são os principais determinantes da ocorrência dessa floresta,
considerando-se ainda a importância da água subterrânea cuja ressurgência nas encostas da
Chapada do Araripe contribui para a permanência da vegetação florestal. As árvores possuem
caules retilíneos, espessos, cobertos, muitas vezes, com liquens, orquídeas, samambaias e
bromeliáceas que alcançam 30 metros.
25
A Floresta Subcaducifólia Tropical Pluvial (Mata Seca) recobre relevos mais baixos,
chamados de serrotes menos favorecidos pelas chuvas. Neste tipo de unidade fitoecológica
encontram-se indivíduos da mata úmida e da caatinga arbórea cuja faixa de amplitude ecológica
permite viver neste ambiente.
A caatinga, termo indígena consagrado na literatura e no meio popular para designar a
vegetação xerófila que ocorre no domínio semiárido, apresenta-se com várias fisionomias.
Árvores altas, chegando a 20 metros, caules retilíneos e um sub-bosque constituído por árvores
menores, levaram à denominação dessa comunidade de Caatinga Arbórea que, de acordo com
a densidade maior ou menor da vegetação pode se denominar de Caatinga Arbórea Densa e
Caatinga Arbórea Aberta.
A degradação da Caatinga Arbórea determina o aparecimento da Caatinga Arbustiva
que é caracterizada por ter o porte mais baixo e os caules retorcidos e esbranquiçados e que,
também, de acordo coma densidade maior ou menor da vegetação pode se denominar de
Caatinga Arbustiva Densa e Caatinga Arbustiva Aberta.
O Carrasco possui uma vegetação xerófila com características bem peculiares. Esta
unidade fitoecológica está situada no Planalto da Ibiapaba e sul da Chapada do Araripe,
limitando-se desde o norte do Estado do Piauí até o sul Pernambucano. É uma comunidade
arbustiva densa com indivíduos de caules finos e muitas vezes cespitosos (que da mesma raiz,
lança vários troncos em forma de maranha) e alguns arbóreos. Na composição da flora estão
presentes espécies da caatinga, de cerrado e de mata.
A Floresta Perenifólia Paludosa Marítima conhecida popularmente como manguezal, é
periodicamente inundada duas vezes ao dia pela mistura da água salgada do mar com a água
doce do rio (salobra) que provoca a floculação das partículas de argila e matéria orgânica que
sedimentam sobre as margens inundadas, não permitindo o crescimento da maioria das plantas.
Restrito às regiões tropicais, o manguezal revela profundo poder de adaptação às duras
condições, essencialmente adversas, nas quais tem se estabelecido. Além da importância
econômica pelo teor em tanino existente nas plantas de mangue, o ambiente favorece a alta
proliferação de crustáceos.
No baixo curso dos rios, já com pouca declividade, os processos de sedimentação se
sobrepõem aos de erosão, formando as planícies aluviais com solos, muitas vezes, halomórficos
de drenagem imperfeita em zona semiárida, favorecidas pela composição química das rochas
trabalhadas por cursos d’água. Nas planícies aluviais encontra-se o habitat de preferência da
carnaúba (Copernicia prunifera), dominante entre as espécies arbustivas e trepadeiras,
constituindo a Floresta Mista Dicótilo-Palmácea.
26
Sobre a Chapada do Araripe, no nível entre 800 e 900m, com solos arenosos e distróficos
e precipitação pluvial em torno de 1.000mm, desenvolve-se a Floresta Subcaducifólia Tropical
Xeromorfa (Cerradão), cujas características estruturais externas das espécies vegetais possuem
cascas suberosas, folhas largas, brilhantes e persistentes, mas, principalmente, a composição
florística desta unidade fitoecológica leva a incluí-la como um tipo de cerrado. Devido à
densidade maior e ao porte de suas espécies vegetais têm particularizado a denominação
cerradão.
Em manchas esparsas tem sido registrada, para o Ceará, ocorrência de vegetação de
cerrado ilhada e invadida pela caatinga, atestando o saldo florístico de uma antiga cobertura
vegetal que ao longo do tempo sofreu modificações na dependência das alterações climáticas e
consequentemente pedológicas (IPLANCE, 1995).
2.8 A IMPORTÂNCIA DA RAIVA NO CONTEXTO DA MORFOLOGIA DO
TRANSMISSOR D. rotundus
2.8.1 Raiva
A raiva é uma doença viral do sistema nervoso central (cérebro e medula espinal) de animais
de sangue quente. A transmissão na natureza é a partir de animais infectados para os seres
humanos, cuja classificação é como doença zoonótica. A doença é quase sempre fatal em
animais ou em seres humanos que não recebem tratamento profilático pós-exposição e
apresenta três distintos estágios clínicos: prodrômico, furioso, e paralítico. Os animais
geralmente morrem alguns dias após o início da raiva. As descrições clínicas da doença podem
ser enganosas, considerando a variação existente entre as espécies e indivíduos infectados numa
mesma população. Os animais infectados podem não exibir todas as fases ou podem oscilar
entre os estágios clínicos; no entanto, o comportamento anormal é o sinal clínico mais
consistente da raiva em qualquer animal (THORNE, E.T.; MCLEAN, R.G., 1982;
RUPPRECHT et al., 2001).
2.8.2 Agente Etiológico
Os lyssavírus são um grupo diverso de vírus capazes de causar a raiva, que é uma doença
encefálica invariavelmente fatal em humanos e animais (ASHLEY et.al, 2013).
Os vírus da raiva apresentam dois antígenos principais: um de superfície, constituído por uma
glicoproteína (G), responsável pela formação de anticorpos neutralizantes e adsorção vírus-
célula, e outro interno, constituído por uma nucleoproteína, que é grupo específico (MS, 2014).
27
No entanto, as técnicas que usam os anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas
virais e as técnicas de sequenciamento do gene forneceram evidências de diferenças antigênicas
e genéticas (variantes) entre vários isolados de grandes animais selvagens e animais domésticos
hospedeiros dentro de uma determinada região geográfica.
Os vírus da raiva (Figura 5) podem permanecer viável em uma carcaça durante vários
dias a 20 °C, embora possam sobreviver muito mais tempo quando o corpo da vítima é mantido
refrigerado.
Além dos vírus da raiva, pelo menos seis outros genótipos dos lyssavírus foram
descritos, reforçando ainda mais a vigilância, principalmente entre os morcegos (GREENE;
RUPPRECHT, 2006).
Figura 5. Vírus da raiva em forma de bala. Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.
Sete genótipos de Lyssavirus são conhecidos (Quadro 1): Rabies vírus (RABV), o único
presente na América Latina e no Brasil, pode ser expresso, de acordo com o perfil, em 12
variantes antigênicas, conforme seus respectivos hospedeiros naturais (terrestres ou aéreos)
(MS, 2014), o vírus Lagos Bat (LBV), Mokola (MOKV), Duvenhage (DUVV), os dois
European Bat Lyssavirus (EBLV), e o sétimo Australian Bat Lyssavirus (ABLV) ou vírus
Ballina foi identificado em morcegos frugívoros ("raposas voadoras") na Austrália, e que tem
sido identificado em todas as espécies de animais selvagens e em alguns morcegos australianos
em cativeiros (GREENE; RUPPRECHT, 2006).
No Brasil, foram encontradas 5 variantes antigênicas: variantes 1 e 2, isoladas dos cães;
variante 3 de morcego hematófago Desmodus rotundus; e variantes 4 e 6, de morcegos
insetívoros Tadarida brasiliensis e Lasiurus cinereus. Outras duas variantes encontradas em
Cerdocyon thous (cachorro do mato) e Callithrix jacchus (sagui de tufos brancos) não são
Cadeia simples única de nucleoproteína
RNA helicoidal
Envelope
Espícula da proteína
G
28
compatíveis com o painel estabelecido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
para estudos dos vírus rábicos nas Américas (MS, 2014).
Quadro 1. Classificação do Gênero Lyssavirus
Genótipo Filogrupo Sorotipo Descrição das cepas
1 I 1 Vírus clássico da raiva, incluindo o vírus de “rua”
e variantes fixas
2 II 2 Lagos Bat 1, 2 e 3
3 II 3 Mokola 1, 2, 3 e 5
4 I 4 Duvenhage 1, 2 e 3
5 e 6 I 5 European Bat Lyssavirus tipos 1 e 2
7 I 6 Australian Bat Lyssavirus
Modificado de Woldehiwet Z. 2002. Raiva: desenvolvimentos recentes, Res Vet Sci
73: 17-25. Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.
2.8.3 Epidemiologia
O total de estimativas de casos de raiva humana mundial é aproximadamente 50.000
mortes anualmente. Os relatos sugerem que mais de 25.000 mortes por raiva humana pode
ocorrer somente na Índia. Muitas ilhas nações ou peninsulares como a Antártica, Nova
Zelândia, Taiwan, algumas das ilhas do Caribe, Irlanda, Noruega, Finlândia, Suécia, Islândia,
Havaí, e Japão são declaradamente livres da raiva. Na Europa Ocidental, países como a
Espanha, Portugal, Itália e Grécia tornaram-se livres da raiva terrestre a um custo considerável
através da vacinação oral da fauna selvagem, especialmente a raposa vermelha (Vulpes vulpes),
com um risco contínuo de importação (GREENE; RUPPRECHT, 2006). Praticamente quase
todos os casos morrem.
No Brasil, a raiva é endêmica, com grandes variações entre as regiões do país. Até 2005,
dezenas de casos de raiva humana eram registrados anualmente no país. A partir de 2006, o
número de casos caiu para um dígito e vem se mantendo nessa faixa.
Os últimos casos de raiva humana transmitida por cão ou gato, portadores das variantes virais
1 ou 2, ocorreram em 1981 na Região Sul, em 2001 nas Regiões Sudeste e Centro-Oeste, em
2004 na Região Norte e mais recentemente, em 2013, na Região Nordeste. No ano de 2014, foi
alcançada a meta de zero casos, uma vez que não houve registro de raiva humana causada por
cão ou gato, com as respectivas variantes citadas (MS, 2014).
29
2.8.4 Transmissão
A raiva é quase sempre causada pela mordida de um animal com a saliva infectada.
Outras fontes de transmissão são raramente envolvidas nas infecções provenientes do cão e
gato, mas podem servir para manter a infecção nos animais selvagens.
A transmissão dos vírus exalado ou excretado tem sido sugerida para disseminação
significante em grandes colônias de morcegos cavernícolas e por infecções causadas por
exposições laboratoriais. As infecções transmitidas pelo ar, provavelmente, envolvem grandes
quantidades de vírus em aerossol sob condições de ventilação insuficiente e uma série de
exposições susceptíveis (GREENE; RUPPRECHT, 2006). Um caso de raiva humana
registrado em 1956, ocorreu em um indivíduo que trabalhava em cavernas com morcegos sem
histórico de mordedura ou outro contato com algum animal suspeito. Após investigação
epidemiológica, arriscou-se a hipótese de que o indivíduo tivesse se infectado através da
inalação de partículas virais em suspensão na caverna (BRASS,1994; WARRELL, 2004).
Teoricamente a transmissão da raiva por ingestão (carne, leite e outros derivados) é
difícil, devido sua natureza gástrica ácida que inativa os vírus da raiva, havendo, portanto, uma
necessidade de uma alta carga viral e/ou ferimento em oro faringe (INSTITUTO PASTEUR,
2009).
A infecção de raiva por via transparentaria em gambás, morcegos e bovinos tem sido
registrada. A transmissão ambiental por fômites é rara, ou nunca, envolvida. A raiva humana já
ocorreu por transplante de córnea. Foram observadas infecções com secreção de saliva
contendo vírus antes mesmo que os sinais clínicos fossem evidentes, de modo que a ausência
de anormalidades neurológicas não pode ser usada para excluir absolutamente a possibilidade
de infecção por raiva (GREENE; RUPPRECHT, 2006).
2.8.5 Patogenia
A patogenia da raiva é semelhante em todas as espécies de mamíferos. Após a
inoculação, os vírus se replicam, inicialmente nas células musculares ou nas células do tecido
sub epitelial. Ao atingir a concentração suficiente alcançam as terminações nervosas, sendo este
período de replicação extra neural responsável pelo período de incubação relativamente longo
da raiva (BRASIL, 2008).
O período de incubação é extremamente variável, desde dias até anos, com uma média
de 45 dias no homem. Em crianças, o período de incubação tende a ser menor que no indivíduo
adulto. Está diretamente relacionado à localização, extensão e profundidade da mordedura,
arranhadura, lambedura ou contato com a saliva de animais infectados; distância entre o local
30
do ferimento, do cérebro e troncos nervosos; concentração de partículas virais inoculadas e cepa
viral. Para cada espécie animal, o período de incubação é diferente, variando de 15 dias a 4
meses, exceto para os quirópteros, cujo período pode ser maior (BRASIL, 2014).
Após a inoculação intramuscular, os vírus podem entrar diretamente nos nervos
periféricos ou replicar localmente em tecido que não seja nervoso. Os vírus podem entrar nas
junções neuromusculares e fusos neuromusculares após um período variável de dias, semanas
ou meses. A glicoproteína dos vírus da raiva tem homologia com certas neurotoxinas e anexa
aos axônios terminais através de receptores de lipoproteínas, incluindo a acetilcolina. Os vírus
se espalham de forma passiva por fluxo intra axonal nos nervos periféricos, a uma taxa de até
100 (gama, 10-400) mm por dia. As fibras motoras e sensoriais podem transportar os vírus.
Quanto maior o grau de inervação no local da mordedura, quanto mais curto o período de
incubação. Em casos de raiva que ocorrem naturalmente, os períodos de incubação foram
relatados de 3 a 24 semanas (média de 3 a 8 semanas) em cães, 2 a 24 semanas (média de 4 a 6
semanas) em gatos, e 3 semanas a um ano ou mais (média de 3 a 6 semanas) em pessoas
(GREENE; RUPPRECHT, 2006) (Figura 6).
Figura 6. Patogenia da infecção pelos vírus da raiva. Os vírus da raiva se replicam nos nervos
periféricos, como também nos miócitos e se espalhar nas terminações dos nervos motores (A)
propagação retrógrada intra-axonal (centrípeta) no Sistema Nervoso Central (SNC) que ocorre
nos nervos periféricos (B) vírus se replicam nos neurônios da medula espinhal e espalham-se
rapidamente por todo o sistema nervoso, provocando paralisia inferior do neurônio motor (C)
vírus de forma progressiva entram no cérebro se multiplicam, causando déficits dos nervos
cranianos e alterações comportamentais. Os vírus se espalham centrifugamente nos nervos
periféricos e cranianos, do qual eles entram nas glândulas salivares e saliva (D) e outros tecidos.
Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.
31
2.9 MÉTODOS EFICIENTES DE DIAGNÓSTICOS ATUAIS PARA A RAIVA
O diagnóstico laboratorial rápido e preciso de raiva em humanos, bem como em outros
animais é essencial para a realização oportuna da profilaxia pós-exposição. Dentro de algumas
horas, um laboratório de diagnóstico pode determinar se um animal estava ou não com raiva e
informar aos profissionais de saúde responsáveis. Os resultados laboratoriais podem evitar
traumas físico e psicológico desnecessários no paciente, além de encargos financeiros, caso o
animal não esteja raivoso.
Do mesmo modo, a identificação laboratorial de casos de raiva positivos pode ajudar na
definição de padrões epidemiológicos atuais da doença e fornecer informações adequadas para
o desenvolvimento de programas de controle da raiva.
A gravidade da doença da raiva determina que os testes laboratoriais sejam padronizados,
rápidos, sensíveis, específicos, econômicos e confiáveis (CDC, 2015).
O método padrão de diagnóstico para a detecção de antígeno viral da raiva é o Teste de
Imunofluorescência Direta (TID) (DEAN, J.; ABELSETH, M.; ATANASIU, P., 1996),
associado com a inoculação intracerebral em camundongos (KOPROWSKI, 1996), observando
os sinais clássicos da doença. O TID trata-se de uma técnica rápida e de baixo custo, usado em
amostras em decomposição em que os vírus não podem ser detectados (MESLIN, F.; KAPLAN,
M.; KOPROWSKI, H., 1996). Neste método os resultados de amostras frescas são viáveis em
95-99% dos casos (OIE, 2011). Contudo, outros estudos relataram o efeito da degradação sobre
a validade dos testes diagnósticos de Imunofluorescência Direta e Inoculação de Tecido
Nervoso em camundongos para raiva (LEWIS, V.J.; THACKER, W. L., 1974; VALENTINI et
al, 1991; HEATTON et al, 1997; ALBAS et al, 1999; DAVID et al, 2002; ARAÚJO et al, 2008;
LOPES, M. C.; VENDITTI, L. L.; QUEIROZ, L. H., 2010).
No Brasil e em outros países tropicais, o clima quente e as flutuações na temperatura
ambiente durante o transporte e armazenamento de amostras representam um grave problema
por causar decomposição das amostras, principalmente quando elas são armazenadas a baixas
temperaturas (-20°C), sem fixação (BISWAL, M.; RATHO, R.; MISHRA, B., 2007). Estas
condições podem afetar a sensibilidade do Teste de Imunofluorescência Direta (ITO et al, 2001;
DANTAS et al, 2004.), bem como do teste de inoculação em camundongos, por causa da
degradação do antígeno viral e perda da viabilidade (MARTORELLI, 2004). Esta situação pode
ser observada após 48 e 72h em amostras à temperatura ambiente, quando os resultados tornam-
se negativos (ALBAS et al., 1999). Por esta razão, amostras positivas designadas como arquivo
para futuros estudos epidemiológicos e para outros fins, devem ser armazenadas em
temperaturas muito baixas (-30 a -80°C) por longos períodos, (BISWAL, M.; RATHO, R.;
32
MISHRA, B., 2007; MIZUNO, N.; NAGAMURA, H.; IWAMOTO, K., 1998), a fim de
preservar a atividade viral por muitos anos. O armazenamento de amostras em refrigeradores
domésticos, com uma temperatura mínima de -20°C com repetidas ações de congelamento e
descongelamento, pode causar danos nos tecidos e deve ser evitada, tornando impossível a
detecção viral (GREENE; RUPPRECHT, 2006).
Técnicas de biologia molecular, como a Reação em Cadeia da Polimerase com
Transcrição Reversa (RT-PCR) têm sido utilizadas para vários estudos de diagnósticos
retrospectivos, principalmente ao se utilizar amostras armazenadas por um longo prazo,
detectando a presença do RNA independentemente de estar viável à infecção ou não (DANTAS
et al., 2004). As amostras podem ser sequenciadas através de análise filogenética no PCR, o
que leva a identificação altamente precisa dos vírus (HEATON et al., 1997). A técnica de RT-
PCR permite a detecção do RNA dos vírus da raiva em amostras armazenadas durante longos
períodos de tempo e em diferentes estágios de decomposição, quando comparado com as
técnicas tradicionais de laboratório como o teste de inoculação em camundongos que depende
da viabilidade dos vírus por ser menos sensível e o Teste de Imunofluorescência Direta que
também não tem alta sensibilidade, quando aplicado em amostras em decomposição (ALBAS
et al., 1999).
Muitos pesquisadores detectaram o RNA viral e realizaram estudos comparativos sobre
a sensibilidade da RT-PCR e o TID em amostras de cérebros infectados com os vírus da raiva,
o que demonstrou que essa técnica molecular pode ser um teste viável nas amostras de tecidos
em decomposição e pode ser utilizado em levantamentos epidemiológicos e estudos de surtos
(ERMINE et al., 1990; SACRAMENTO, D.; BOURHY, H.; TORDO, N., 1991;
KAMOLVARIN et al., 1993; MCCOLL et al., 1993; KULONEN; BOLDINA, 1993; WHITBY
et al., 1997; CREPIN et al., 1998; NEL et al., 1998; NADIN-DAVIS, 1998; HEATON et al.,
1997; KULONEN et al., 1999; SMITH et al., 2000; ITO et al., 2001; SOARES et al., 2002).
2.9.1 Teste de Imunofluorescência Direta (TID)
Várias reações imunológicas envolvem a ligação antígeno-anticorpo e que podem ser
visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes diagnósticos para o antígeno ou para o
anticorpo (CDC, 2015).
O Teste de Imunofluorescência Direta baseia-se na observação de animais infectados
pelos vírus da raiva que tenham proteínas dos vírus (antígenos) apresentadas nos seus tecidos
(Figura 7).
33
Este método é rápido, sensível e específico de diagnosticar a infecção rábica em
susceptíveis com utilização de anticorpos fluorescentes (imunoglobulinas antirrábicas
marcadas com isotiocianato de fluoresceína = conjugado antirrábico). A prova se baseia no
exame microscópico de impressões de fragmentos de tecido nervoso “tratados” com conjugado
específico e submetidos à luz ultravioleta. O antígeno rábico, reagindo com o conjugado e
iluminado com luz ultravioleta (comprimento de onda de 260 nanômetros), emite uma luz
esverdeada fluorescente (BRASIL, 2008).
Figura 7. Técnica de Imunofluorescência Direta. (A) Positivo, (B) Negativo. Fonte: Centers for
Disease Control and Prevention.
2.9.2 Prova para isolamento dos vírus rábicos em camundongos (prova biológica)
O animal de eleição para o isolamento é o camundongo albino suíço, por ser um dos
mais sensíveis aos vírus rábicos. O animal utilizado deve ser de boa procedência e apresentar
bom estado sanitário, com idade e peso adequados.
Esta técnica baseia-se no preparo da suspensão a 20% para inoculação. Inicialmente é
pesado 1g dos diferentes fragmentos do SNC, macerado em gral estéril e adicionado ao preparo
de 4ml de diluente de vírus. O preparo é centrifugado de 2.000 a 3.000 rotações/minuto durante
15 minutos. Retira-se o sobrenadante, onde o mesmo é mantido em refrigeração (de 2 a 8°C)
para ser inoculado em camundongos de 8 a 10 camundongos por amostra, no mesmo dia, por
via intracerebral.
A leitura é realizada diariamente por 21 dias nos camundongos inoculados, no caso de
amostras de cães e gatos, e no mínimo 30 dias, no caso de amostras de herbívoros e animais
silvestres (BRASIL, 2008).
A B
34
2.9.3 Exame Histopatológico
O exame histológico da biópsia ou tecidos de autópsia é ocasionalmente útil no
diagnóstico de casos sem suspeita de raiva que não foram testados por métodos de rotina.
Quando o tecido cerebral oriundo de animais infectados com os vírus da raiva é marcado com
um marcador histológico, tais como hematoxilina e eosina, a evidência de encefalomielite pode
ser reconhecida por um microscopista treinado.
A evidência histopatológica da encefalomielite da raiva (inflamação) no tecido cerebral
e nas meninges inclui as seguintes mudanças:
1. infiltrado mononuclear;
2. infiltrados perivasculares de linfócitos ou células polimorfo nucleares (Figura 8);
3. focos linfocitários;
4. Pequenos nódulos constituídos por células da glia (Figura 9);
5. Corpúsculos de Negri (CDC, 2015).
Figura 8. Infiltrados perivasculares ou inflamação em torno de um vaso sanguíneo. Célula
inflamatória perivascular infiltra a hematoxilina e a eosina mancha o tecido cerebral. (A) 100x.
(B) 200x. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention.
A B
35
Figura 9. (A) Pequenos nódulos. (B) Vaso sanguíneo sem células inflamatórias (200x). 1 =
glóbulos vermelhos. 2 = células epiteliais escamosas. Fonte: Fonte: Centers for Disease Control and
Prevention.
Figura 10. (A) Neurônio sem Corpúsculos de Negri. (B) Corpúsculo de Negri no neurônio
infectado. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention.
2.9.4 Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT-PCR)
Os métodos de diagnóstico molecular, especialmente a RT-PCR, estão sendo
universalmente adotados para o diagnóstico etiológico de diversas viroses animais (BÉLAK;
BALLAGIPORDÁNY, 1993). As principais vantagens dessa técnica resumem-se na rapidez
na obtenção dos resultados, a não exigência da infecciosidade da partícula viral e as altas taxas
de sensibilidade e especificidade (McPHERSON; TAYLOR; QUIRKE, 1994; TAKIUCHI et
al., 2003, 2005).
Este método amplifica a porção de ácido nucleico dos vírus da raiva, utilizando métodos
bioquímicos. Com este procedimento, o Ácido Ribonucléico (RNA) dos vírus da raiva pode ser
amplificado enzimaticamente como cópias de Ácido Desoxirribonucléico (DNA). O RNA da
1
2
A B
A B
36
raiva pode ser copiado para uma molécula de DNA, utilizando a transcriptase reversa (RT). A
cópia de DNA da raiva pode então ser amplificado ao usar a reação em cadeia da polimerase
(PCR) (CDC, 2015).
37
3 JUSTIFICATIVA
A raiva transmitida através do morcego hematófago Desmodus rotundus continua sendo
uma das causas que prejudica a cadeia produtiva da agropecuária, além de ser um sério fator de
risco de ocorrência de raiva humana. Sua importância é confirmada pelo volume de recursos
destinados à profilaxia animal e humana através do uso de imunobiológicos e de outras ações
para o seu controle.
A falta de meios práticos de controle, monitoramento, estudo e identificação da espécie
Desmodus rotundus, compromete a população dos seres vivos com relação à doença. A
presença desta espécie hematófaga no Ceará é notadamente verificada em regiões com climas
e vegetações diferenciadas, com incidência de casos de raiva em herbívoros, sem a atuação de
um programa efetivo de vigilância e controle e com subnotificação de casos dessa zoonose.
São necessários, portanto, meios que possam permitir distinguir os caracteres
morfológicos entre as populações desmodinas correlacionados com fatores ambientais (tipos
climáticos e unidades fitoecológicas), bem como numa etapa posterior adquirir o conhecimento
da susceptibilidade e detecção viral da raiva nesta espécie para melhor compreender e rastrear
as epizootiologias, possibilitando obter a correlação entre o estudo da craniomorfologia e
diagnóstico da raiva.
38
4 HIPÓTESES CIENTÍFICA
Morcegos Desmodus rotundus distribuídos nos municípios no Estado do Ceará
apresentam diferentes formas cranianas e estruturas fenotípicas correlacionadas com diferentes
fatores ambientais.
39
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Verificar e descrever diferença craniomorfológica do morcego hematófago Desmodus
rotundus, de acordo com a distribuição deste morcego no Estado do Ceará.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar medidas cranianas do morcego Desmodus rotundus distribuídos no Estado do
Ceará;
Descrever as características fenotípicas dos espécimes;
Especificar os tipos de abrigo nos quais habitam os morcegos Desmodus rotundus;
Comparar tipos de climas e vegetações onde os abrigos estão inseridos com as
características fenotípicas e cranianas;
Obter amostras de sistema nervoso central para criopreservação em estudos futuros com
testes moleculares RT-PCR, visando o diagnóstico da raiva;
Contribuir para melhor conhecimento sobre a diversidade craniomorfológica do
morcego hematófago D. rotundus.
40
6 CAPÍTULO 1
Avaliação Crânio Morfológica do Morcego vampiro Desmodus rotundus (Chiroptera,
Phyllostomidae, Desmodontinae) no Estado do Ceará, Brasil.
Morphological skull assessment of Desmodus rotundus vampire bat (Chiroptera,
Phyllostomidae, Desmodontinae) in Ceará State, Brazil.
Periódico: American Journal of Veterinary Research (Submetido em 29 de junho de 2015)
41
Morphological skull assessment of Desmodus rotundus vampire bat (Chiroptera,
Phyllostomidae, Desmodontinae) in Ceará State, Brazil.
Francisco B. P. Moura; Maria F. S. Teixeira, Dr
From Health State Department of Ceará State, Brazil (Moura) and Post Graduation Course in
Veterinary Science, State University of Ceará, Brazil
This manuscript represents a portion of a master paper submitted by Moura to the State
University of Ceará – Post Graduation Course in Veterinary Science of the requirements for a
Master of Science degree.
The author thanks Maria Teixeira for technical assistance.
Address correspondence to Moura at [email protected]
Abstract
The correlation among characters, which describe the skull of Desmodus rotundus within a
representative database of twenty skull measurements of each evaluated sample, associated phenotypic
characteristics and ecological conditions can indicate affecting cranial characters. This study used
morphological quantitative approaches to investigate the evolution of the skull of D. rotundus in order
to confirm extant lineages. Forty-one adult vampire bats were captured through the use of mist nets in
four municipalities of Ceará State with different climate types and phytoecological units. The results
indicated by analysis of variance in block (ANOVA) through Epi Info7 program that the skull size
of vampire bat D. rotundus does not vary according to climate type and phytoecological unit
where it operates. It raises the possibility that the altitude can influence the skull size, while
external measures proved sexual dimorphism. In all bats studied it was possible to collect enough brain
material to serve in future studies, aiming to acquire knowledge of susceptibility and viral detection of
rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of environmental factors
and rabies diagnosis.
Keywords: cranial characters, phenotypic characteristics, ecological conditions.
Introduction
Organisms are made up of a complex arrangement of anatomical structures and
individual parts that maintain functional associations throughout the development, according to
Hallgrímsson et al. (2009). In the early nineteenth century, French anatomist George Curvier
emphasized the "principle of correlation of parts", aiming to give the idea that parts of the bodies
are coordinated to form a functional whole, according to Mayr (1982). In the 1950s five
researchers presented methods of correlating morphology and function. Everett Olson in 1951
and Robert Miller in 1958 showed quantitative methods based on correlation to empirically
identify groups of phenotypic traits that are more highly integrated and based on factors shared
development and function. Then, the botanist Jean Clausen and William Hiesey in 1960
investigated a long program of complex correlating characters in intraspecific hybrids of
ecological races. Raisa Berg in 1960 investigated the different degrees of integration between
specific character sets, according to the ecological conditions, generating hypotheses that are
still used to guide empirical research, according to Armbruster et al. (1999) for detecting
correlation models or modules, according to Berg (1960).
In Desmodus rotundus vampire bats (E. Geoffroy, 1810), there are very few studies
on the correlation of such aspects; comprising cranial characters, phenotypic characteristics and
42
ecological circumstances surrounding climate types and phytoecological units. Skull can be an
essential model to conduct the study of morphological integration, due to the complexity of
bone growth along with other biases (phenotypic characters and ecological circumstances).
As part of the quantitative morphological analysis phenotypic characters [mandibular
earrings, submandibular structure and femoral membrane (uropatagium)] may be considered
measurable tools obtained from collected data. They display evolutionary changes that can be
quantified, signifying applicability in this study, enabling us to evaluate a covariance, i.e.
morphological characters that may present a correlation between morphology and function with
each other, mapped in some municipalities of Ceará based on various environmental factors
(climate and phytoecological). Thus, this assessment intends to analyze skull morphology
differences in this species of blood-sucking bat D. rotundus throughout its distribution in Ceará
State.
Material and Methods
Study Area
Ceará State (Figure 1) is situated in the upper part of the Northeast. It is bordered by
the Atlantic Ocean to the north and northeast, the States of Rio Grande do Norte and Paraiba to
the east, and Pernambuco and Piauí south west. Its total area is 148.920.472 km² or 9.37% of
the Northeast area and 1.74% of Brazil. It is considered to be the fourth largest in the Northeast
and seventeenth among Brazilian states in terms of area (IPECE, 2015).
Animals
Forty-one Desmodus rotundus (Chiroptera: Phyllostomidae; Desmodontinae) adult
vampire bats were analyzed (19 males and 22 females), which were captured in four
municipalities (São Benedito, Ubajara, Tauá and Potiretama) in Ceará State. Each of these
municipalities possess climate types and phytoecological units.
Species and lineage
The concept of the word species is fundamental importance in the study of evolution
when it proposes to determine the possibility of a particular taxon has more than one species.
This is due to the fact that the species are seen as essential entity of the evolutionary process,
according to Wiley (1978). In the universe of concepts about the word species, all have their
merits and their failures to be seen disagreements over some points related to morphology,
genetics, biology among others, contradicting the theory that the concept of appropriate species
should be generally applicable and consistent theoretically, Hull (1997). Since this work aims
to evaluate the criterion of differences of external and cranial morphological characteristics in
D. rotundus species, it will be used purely nominalist concept of lineage as strain or descent,
causing a strong correlation between morphology and genetics.
Climatic Types and Phytoecological Units
Climate types and phytoecological units were obtained from Instituto de Pesquisa e
Estratégia Econômica do Ceará (IPECE), an agency linked to the Department of Planning and
Ceará State management. Its mission is to provide geographic social economic information,
develop strategies and propose public policies that support the development of the state, and
present values such as ethics and transparency, scientific rigor, professional competence, inter-
institutional cooperation and commitment to society.
43
Five existing climate types in Ceará state are: Tropical Hot Semi-Arid Climate, Tropical Mild
Semi-Arid, Tropical Warm Sub-Humid areas, Tropical Warm and Humid, Tropical Hot Sub-
warm Sub-Humid areas (Figure 2), in which 3 (60%) (Tropical Hot Semi-Arid, Tropical Warm
and Humid and Tropical Hot Sub-Humid areas) were evaluated in the context of this study.
Eleven phytoecological units of Ceará are: Complex Vegetation of the Coastal Zone,
Humid Forests / Mountainous, Semi Deciduous Tropical Rain Forest (dry forest), Deciduous
Thorny Forest (arboreal Caatinga), Dense Shrubby Caatinga, Open Shrubby Caatinga,
Carrasco, Sea Swamp Evergreen Forest, Riparian Forest with Carnauba and Dicots, Tropical
Semi Deciduous Xerophitic Forest (Cerradão) and Brazilian Savanna (Cerrado) (Figure 3),
including 3 (27%) [Humid Forests / Mountainous, Semi Deciduous Tropical Rain Forest (dry
Forest) and Open Shrubby Caatinga] were evaluated in the context of this study.
Field Procedures (captures)
Field procedures started only after examination and permission from the Ethics
Committee for the Use of Animals (whose number is 5660389/2014) and stipulation for
permission for activities with scientific purpose issued by System Authorization and
Information Science Biodiversity belonging to Chico Mendes Institute for Biodiversity
Conservation (whose number is 46433). Field procedures respected principles of 3Rs of Animal
Welfare (Reduction, Refinement and Replacement) when captured few individuals in each
shelter. Capture sessions were in April and May 2015, minutes before dusk mist nets were open
for an average of six hours every night until the ground level in selected areas, with shelters and
/ or power supplies (pens, stables, pig farms, chicken coops, etc) being prioritized. There was
no standard for the number of mist nets and hour worked.
The active search for bats in shelters such as abandoned houses, caves, disabled
wells, manholes and hollow trees was also held sporadically during the period in the field, using
flashlights and dip nets in an attempt to locate and capture specimens.
Four captures were done in São Benedito, Ubajara, Tauá and Potiretama
municipalities where each sampling point was geo-referenced (Figure 4) and classified habitat
type, according to Wilson et al. (1996). It was considered climate types and phytoecological
units already recognized for Ceará State (Table 1). The capture effort was calculated by
multiplying total area of armed mist nets, which spanned 7 and 12 m long and 2.5 m high, by
the time (total number of hours after dark), according to Straube & Bianconi (2002) (Table 2).
Captured vampire bats were identified in field being kept in individual numbered
cotton fabric bags.
The major inclusion criterion of captured D. rotundus specimens was adulthood, as at
this stage there does not appear to be more bone growth to be observed, with sutures and cranial
bones being well fused. Another criterion was reproductive stage by visual check as noted in
the following categories: scrotum (adult male with obvious testicle in the scrotum) and innate
female (adult female with normal abdomen and reduced breasts). Pregnant females were not
collected (fetus detectable by palpation of abdomen), female nursing (adult female with well-
developed breasts devoid of surrounding hair, with milk secretion verified by light pressure
thereof) and post-lactating (adult female with flabby breasts, devoid of surrounding hair and no
milk secretion when pressed), according to Sekiama & Zortea (2003). These criteria aimed to
prevent environmental impact on these species populations.
44
Preparation of the samples
Forty-one D. rotundus vampire bat researched in municipalities were taken to the
Medical Entomology Laboratory located in Regional Health Coordination belonging to Health
State Department of Ceará State distributed throughout the state to subsidize activities of
obtaining taxonomic measures and collection of brain and skull.
The specimens were anesthetized with ketamine hydrochloride (Ketalar / ketamine)
intramuscularly (chest muscle), noting volume / weight ratio (1ml/kg or 100mg/kg).
Animals were weighed on a precision balance (d = 0.1g) properly calibrated and
verified external measures, such as: body length (cranial / caudal), ear height, leg length,
forearm length and uropatagium width. After external measurements were performed,
specimens were euthanized with fast action inhalational anesthetic [isoflurane = 2-chloro-2-
(difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-ethane], concentration> 1 MAC (Minimum Alveolar
Concentration ) use recommended for small mammals, as RESOLUTION No. 714, in 20 June
2002, according to Federal Council of Veterinary Medicine. Animals were placed in a chamber
properly designed so that there was uniform distribution of anesthetic and that concentration
acted quickly without leakage, causing a dose-dependent depression of central nervous system
to the animal.
The collection of nervous material (brain) was by aspiration using polypropylene
Pasteur pipette type of 170mm and tip with 3mm diameter containing 3ml of capacity through
foramen magnum, as King et al. (1998). After head dissection at the height of atlanto-occipital
joint bat, the foramen magnum was made unobstructed with the aid of a small anatomical
clamp, removing the atlas bone. The pipette tip was inserted in the foramen magnum, aspirating
the brain. Afterwards, a skin skull extraction was made.
Cleaning and conservation of skulls followed the steps: (a) removal of head leather,
stripping roughly removed the eye and brain, skull immersion in clean water during twelve
hours in order to remove the blood. (b) skulls boiled for 10 minutes. (c) withdrawal of the rest
of meat with tweezers. (d) additional cleaning baths alternated by Sodium Hypochlorite, clean
water, 20 or 30 volumes hydrogen peroxide, clean water until complete removal of the bleach
and fleshy skull waste. (e) drying at room temperature, according to Cecilio (2005). Twenty or
thirty volumes Hydrogen peroxide was necessary to remove an oily residue on the skull, which
would otherwise remain if a smaller volume (or only water) were used.
Collecting and storing material for RT-PCR
After removing the skin of the head of D. rotundus specimens for skull extraction,
brain material was collected and stored immediately in Eppendorf tubes with Trizol at -80°C in
the Central Laboratory of Ceará State for future molecular diagnostics.
Morphological Quantitative Analysis
Quantitative morphological analysis was adapted for each specimen that included 20
skull measurements commonly used in identifying bats: (1) skull length; (2) skull length plus
incisive; (3) length from alveolar edge of upper incisors to mastoid; (4) condyle-canine length;
(5) canine length to the opposite mastoid process; (6) basal length - posterior alveolar edge of
central incisors to anterior border of foramen; (7) length from posterior alveolar edge of central
incisors to the foremost point of palatal chamfer at the choanas level; (8) length from nasal to
magnum foramen; (9) mandible length; (10) external width of canines between the outer points
of upper canines; (11) interorbital width - width between the nearest points of orbital
constrictions; (12) preorbital width - width between the farthest points of orbital constrictions;
45
(13) zygomatic width - width between the outermost points of zygomatic arch; (14) width
between the side ends of skull; (15) width between mastoid processes; (16) width of tympanic
bullas at their nearest portion; (17) width of tympanic bullas at their widest portion; (18) height
of the skull - the deepest point of basi occiptal to the highest point of parietal despised sagittal
crest, ie the outermost point of foramen to the top of the skull; (19) occipital height - the leading
edge of magnum foramen to the highest point of skull; (20) diameter of magnum foramen, as
Vizzoto & Taddei (1973) (Figure 5).
Five external measurements (total length of the body, foot length, ear height, forearm
length, uropatagium width) were also analyzed, according to Taddei et.al (1998). All
measurements were taken in millimeters (mm) with the use of precision digital caliper 0-
150mm JOMARCA. The length of jaw and total length of skull have been taken, avoiding to
extend far in front of incisors, but even the most anterior region thereof.
Statistical Analysis
Analysis of Variance (ANOVA) through Epi Info7 program was used for statistical
analysis of skull measurements to compare the variances of cranial morphology and external
measures analysis. This aimed to verify existence of lineages as well as difference between the
averages of external measures of D. rotundus males and females for the significance calculated
level (α = 0,05), in order to verify the existence of sexual dimorphism.
Results and Discussion
Vampire bat D. rotundus has an emerging importance for rabies epidemiology in
Brazil, mainly in rural areas, and as carrier of rabies virus (RABV) lineages.
In this context, the results obtained in this study are valuable, because based on the existence
of this specimen in Ceará State, it is possible to affirm some unknown details concerning bat
lineages research in Brazil.
Skull measurements
After a capture effort sample of 542.5 h. m², forty-one specimens of D. rotundus have
been caught and the results indicated through Epi Info7 program that the skull size of vampire
bat D. rotundus does not vary according to climate type and phytoecological unit where it
operates. It raises the possibility that the altitude can influence the skull size as evolution way.
Potiretama municipality had the highest cranial measures than other ones (Table 3).
As Potiretama has tropical hot semi-arid climate type and open shrubby caatinga
phytoecological unit with altitude 250 m, whereas São Benedito, the second municipality with
higher values of cranial measures, has Tropical Hot Humid climate type and humid forests
phytoecological unit / mountainous completely different with very high altitude (818 m).
Perhaps altitude may differentiate skull sizes. It is expected that there was a pattern and each
climate and ecological unit presented cranial measures quite different in all municipalities,
which did not happen, because Ubajara and Tauá municipalities had very similar measures.
External measurements
However, comparisons of external measurements revealed existence of significant
differences in patterns of correlation and covariance among D. rotundus specimens, verifying
existence of sexual dimorphism, where females are bigger than males, according to Alencar et
al. (1994) (Tables 4,5,6,7,8). Therefore, in all studied bats it was possible to collect enough
46
brain material to serve in future studies, aiming to acquire susceptibility knowledge and viral
detection of rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of
environmental factors and rabies diagnosis.
Phenotypic characters (mandibular earrings and submandibular structure)
A few specimens of D. rotundus captured showed mandibular earring characteristic
(Figure 6) as a modest form with low numbers (4/41) and percentage (0-20% / 100%) in 75%
of municipalities surveyed (3/4) independently of climate type and phytoecological unit (Table
9). This phenotypic change, even though modest, may be a mutation or evolution of this species
throughout Ceará State, considering this result occurred in most researched shelters that are
distant one of each other more than 20 square kilometers [corresponding area where it occurs
exchanging species shelters within its action area, according to Alencar et al. (1994) & Flores-
Crespo (2001)].
In contrast, phenotypic submandibular structure characteristic (Figure 6) showed up in
D. rotundus specimens as a significant way in large numbers (38/41) and percentage (93% /
100%) in all municipalities, independently of climate type and phytoecological unit (Table 9).
Therefore, this structure presents almost absolutely in D. rotundus specimens, denoting an
evolution concerning this structure even though its physiological function is not mentioned in
scientific literature.
Table 1. Climate types, phytoecological units, and other characteristics of Desmodus rotundus
shelters in researched Ceará municipalities, 2015.
Municipalities
Shelter /
Location
Estimated
Population (n)
Estimated
Area (m²)
Phytoecological
Unit
Climate
Type
São Benedito
Cave /
São Vicente
30
24
Humid Forests /
Mountainous
Tropical Hot
Humid
Ubajara
Cave /
Araticum
30
50
Semideciduous
Tropical Rain
Forest (Dry
Forest)
Tropical Hot
Sub-Humid
Tauá
Mine /
Quinámuiu
350>
**
Open Shrubby
Caatinga
Tropical Hot
Semi-Arid
Potiretama
Cave /
Potiretama
200>
30
Open Shrubby
Caatinga
Tropical Hot
Semi-Arid
** No condition of estimation, due to the size of the mine.
47
Table 2. Capture effort done in each type of habitat sampled (h.m²) during the entire period of
study in Ceará State, Cv = cave, Mn = disabled mine.
Researched
Municipalities
Habitat Effort (h.m²)
São Benedito Cv 87,5
Ubajara Cv 105
Tauá Mn 140
Potiretama Cv 210
Total effort ----- 542,5
48
Table 3. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to skull measurements and municipalities, Ceará, 2015.
Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama
Skull length
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0 9 22,0 0 0 15 36,6
Skull length plus incisive
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
2 4,9 8 19,5 0 0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 0 0 15 36,6
Length from alveolar edge
of upper incisors to mastoid
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0 10 24,4 4 9,8 3 7,3 3 7,3 6 14,6 4 9,8 11 26,8
Condyle-canine length
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
10 24,4 0 0,0 7 17,1 0 0,0 6 14,6 3 7,3 14 34,1 1 2,4
Canine length to the
opposite mastoid process
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
4 9,8 6 14,6 5 12,2 2 4,9 6 14,6 3 7,3 3 7,3 12 29,3
Basal length
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0,0 10 24,4 6 14,6 1 2,4 3 7,3 6 14,6 4 9,8 11 26,8
49
Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama
Length from posterior
alveolar edge of central
incisors to the foremost
point of palatal chamfer
at the choanas level
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
10 24,4 0 0,0 4 9,8 3 7,3 9 22,0 0 0,0 15 36,6 0 0,0
Length from nasal to
magnum foramen
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
6 14,6 4 9,8 6 14,6 1 2,4 8 19,5 1 2,4 12 29,3 3 7,3
Mandible length
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0,0 10 24,4 0 0,0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 1 2,4 14 34,1
External width of canines
between the outer points of
upper canines
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
9 22,0 1 2,4 2 4,9 5 12,2 5 12,2 4 9,8 4 9,8 11 26,8
Interorbital width
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 1 2,4 8 19,5 0 0,0 15 36,6
Preorbital width
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
5 12,2 5 12,2 3 7,3 4 9,8 1 2,4 8 19,5 0 0,0 15 36,6
50
Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama
Zygomatic width
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
3 7,3 7 17,1 2 4,9 5 12,2 9 22,0 0 0,0 5 12,2 10 24,4
Width between the side
ends of skull
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0,0 9 22,0 0 0,0 15 36,6
Width between
mastoid processes
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0,0 9 22,0 0 0,0 15 36,6
Width of tympanic bullas
at their nearest portion
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
10 24,4 0 0,0 1 2,4 6 14,6 9 22,0 0 0,0 12 29,3 3 7,3
Width of tympanic bullas
at their widest portion
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
2 4,9 8 19,5 5 12,2 2 4,9 4 9,8 5 12,2 4 9,8 11 26,8
51
Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama
Height of the skull
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
8 19,5 2 4,9 0 0,0 7 17,1 5 12,2 4 9,8 12 29,3 3 7,3
Occipital height
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
4 9,8 6 14,6 0 0,0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 4 9,8 11 26,8
Diameter of magnum
foramen
Parameters Parameters Parameters Parameters
< 4 mm < 4 mm < 4 mm < 4 mm
Nº % Nº % Nº % Nº %
10 24,4 7 17,1 9 22,0 15 36,6
52
Table 4. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and
total body length (Bl), Ceará, 2015.
Sex
Total body length - Bl
< 70 mm 70 mm - 79 mm 80 mm +
Nº % Nº % Nº %
Female 2 28,6 17 56,7 3 75,0
Male 5 71,4 13 43,3 1 25,0
Both sex 7 100 30 100 4 100
Table 5. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and
foot length (Fl), Ceará, 2015.
Sex
Foot length - Fl
< 15 mm 16 mm - 18 mm 19 mm +
Nº % Nº % Nº %
Female 0 0 22 59,5 0 0
Male 3 100 15 40,5 1 100
Both sex 3 100 37 100 1 100
Table 6. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and
forearm length (Fl), Ceará, 2015.
Sex
Forearm length - Fl
< 60 mm 60 mm - 65 mm 66 mm +
Nº % Nº % Nº %
Female 1 14,3 16 61,5 5 62,5
Male 6 85,7 10 38,5 3 37,5
Both sex 7 100 26 100 8 100
53
Table 7. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and
ear height (Eh), Ceará, 2015.
Sex
Ear height - Eh
< 60 mm 60 mm - 65 mm 66 mm +
Nº % Nº % Nº %
Female 1 14,3 16 61,5 5 62,5
Male 6 85,7 10 38,5 3 37,5
Both sex 7 100 26 100 8 100
Table 8. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and
uropatagium width (Uw), Ceará, 2015.
Sex
Uropatagium width (Uw)
< 10 mm 10 mm - 14 mm 15 mm +
Nº % Nº % Nº %
Female 0 0 14 60,9 8 66,7
Male 6 100 9 39,1 4 33,3
Both sex 6 100 23 100 12 100
Table 9. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to
phenotypic characters, climate type and phytoecological unit, Ceará, 2015.
Municipalities
Number
of bats
(N=41)
Phenotypic characters
Climate
type
Phytoecological
Unit
Mandibular
earrings
Submandibular
structure
N.º % N.º % N.º %
São Benedito 10 24,4 2 20,0 8 80,0 Tropical
Warm and
Humid
Humid Forest /
Mountainous
Ubajara
7
17,1
0
0
7
100
Tropical
Warm
Sub-humid
Semi Deciduous
Tropical Rain
Forest / Dry
Forest
Tauá 9 22,0 1 11,1 9 100 Tropical Hot
Semi-Arid
Open Shrubby
Caatinga
Potiretama 15 36,6 1 6,7 14 93,3 Tropical Hot
Semi-Arid
Open Shrubby
Caatinga
54
Conflict of interest
All authors declare to have no conflict of interest.
Acknowledgements
I am greatly indebted to Dr. Maria Fátima da Silva Teixeira, who was advisor in my
Postgraduate Course in Veterinary Science. I thank the following who were kind enough to
help me in field procedures catching bats, Raffael Junior de Oliveira Braga, Jorge Bezerra da
Silva, Eduardo Emanuel Apolônio, Paulo Henrique da Cruz Café, Antônio Cláudio Braga
Pereira, Luiz Gonzaga de Castro, especially Maria Mariza de Lima e Silva, who collaborated
catching and dissecting the specimens. All individuals, who contributed substantially to the
process directly and indirectly of generating this article.
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Figure 1: State location of Ceará in Brazil. Source: sopassagenteaviao.com.
Figure 2: Climate Types of Ceará State. Source: IPECE.
ClimateTypes
56
Figure 3: Phytoecological Units of Ceará. Source: IPECE.
Figure 4. Sample points geo-referenced in the study in Ceará State municipalities. (1) São
Benedito S 03° 99' 655 " WO 40° 83' 346 ' 810 m. (2) Ubajara S 03° 80' 316" WO 40° 87'
882” 230 m. (3) Tauá S 06° 02' 050" WO 40° 30' 854" 546 m and (4) Potiretama S 05° 77'
047" WO 38° 18' 306" 250 m. Source: Coordinates Track Maker Software.
Phytoecological Units
57
Figure 5. Side, ventral, frontal and occipital views of D. rotundus skull with measurements
indicated. (1) skull length. (2) skull length plus incisive. (3) length from alveolar edge of upper
incisors to mastoid. (4) condyle-canine length. (5) canine length to the opposite mastoid
process. (6) Basal length. (7) length from posterior alveolar edge of central incisors to the
foremost point palatal chamfer at choanas level. (8) length from nasal to magnum foramen.
(9) mandible length. (10) external width of canines. (11) interorbital width (12). preorbital
width. (13) zygomatic width. (14) width between the side ends of skull. (15) width between
mastoid process. (16) width of tympanic bullas at their nearest portion. (17) width of tympanic
bullas at their widest portion. (18) height of the skull. (19) occipital height. (20) diameter of
magnum foramen. Source: Biosciences Institute at the University of São Paulo.
Figure 6. Photograph of phenotypic characters: (A) Mandibular earrings. (B) Submandibular
structure. Source: Bergson 2015.
20
A B
58
7 CONCLUSÕES
Não houve modificações cranianas significativas da espécie D. rotundus, conforme
tipo climático e unidade fitoecológica onde a espécie está inserida;
A altitude foi a característica que influenciou o tamanho do crânio na espécie D.
rotundus;
Foi confirmado o dimorfismo sexual na espécie estudada;
Brinco mandibular foi uma característica recessiva, independentemente do tipo
climático e unidade fitoecológica;
Estrutura mandibular foi uma característica dominante, independentemente do tipo
climático e unidade fitoecológica.
59
8 PERSPECTIVAS
A análise e a interpretação das medidas externas e cranianas da espécie Desmodus
rotundus servirão como subsídios para estudos futuros, na perspectiva de possibilitar a
correlação entre os fatores ambientais e diagnóstico da raiva, utilizando material cerebral
obtido dos espécimes capturados.
60
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71
10 APENDICE
APÊNDICE A - Saco de tecido de algodão numerado utilizado nas atividades de campo para
acondicionar morcego hematófago D. rotundus capturado.
APÊNDICE B - Câmara adequadamente projetada para realização da eutanásia e sem fuga
dos morcegos com distribuição uniforme do anestésico inalatório de rápida ação [isoflurano
= 2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano], concentração > 1 CAM (Concentração
Alveolar Mínima) de uso recomendado para pequenos mamíferos, conforme RESOLUÇÃO
Nº 714, DE 20 DE JUNHO DE 2002 do Conselho Federal de Medicina Veterinária, com
intuito de atingir rapidamente a concentração desejada, causando depressão dose-dependente
do SNC dos espécimes.
APÊNDICE C - Ficha (exemplo) utilizada para obtenção das medidas cranianas, medidas
externas e dados inerentes aos abrigos dos morcegos hematófagos Desmodus rotundus nos
municípios trabalhados na pesquisa.
72
APÊNDICE D - Ficha para obtenção de dados complementares da captura inerentes às fases
lunares, hora do primeiro espécime capturado, tamanho das redes utilizadas, sexo do primeiro
exemplar capturado, horas de trabalho, localização do abrigo em relação às coordenadas
geográficas, data da captura e participantes das atividades.
APÊNDICE E - Ficha contendo outras espécies de morcegos capturados e soltos que coabitam
com D. rotundus nos abrigos verificados nas atividades de campo.
APÊNDICE F - Ficha sobre as espécies agredidas por D. rotundus nos municípios trabalhados
na pesquisa no Ceará, 2015.