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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS
JULIANO TONIATO
Dissertação apresentada à Faculdade deCiências Agronômicas da UNESP – Campus deBotucatu, para obtenção do título de Mestre emAgronomia (Energia na Agricultura)
BOTUCATU – SP
Agosto – 2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS
JULIANO TONIATO
Orientador: Prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho
Dissertação apresentada à Faculdade deCiências Agronômicas da UNESP – Campus deBotucatu, para obtenção do título de Doutor emAgronomia (Energia na Agricultura)
BOTUCATU – SP
Agosto - 2013
V
A meus pais, José Mario & Leopoldina,
pelo amor incondicional, carinho e
suporte;
À Inha (Marcela), pela infância maravilhosa
repleta de amor e brigas; pelo cunhadão
Fábio, de quem me orgulho e amo muito
e, à vocês pelo Caio;
À minha vó Alzira (in memorian),
pelo amor incondicional oferecido;
A meus amigos, pelas memórias que me
geraram e que sempre levarei comigo;
A meus desapegos, por me
lembrarem a importância de amar;
E à Deus, pelos milagres, mas acima de tudo
pela possibilidade de ter as
dedicatórias acima.
VII
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu (FCA) da Universidade Estadual
Paulista (UNESP).
À FAPESP pela bolsa concedida, apoio financeiro e técnico.
Ao coordenador da Pós-graduação em Agronomia (Energia na Agricultura) da
Faculdade de Ciências Agronômicas.
Ao professor orientador Waldemar Gastoni Venturini Filho, pela orientação e
ensinamentos transmitidos
Ao prof. Cesar Martins e prof. Pedro Novelli, pela ajuda força, amizade e
ensinamentos.
A todos amigos que me ajudaram nesse trabalho: Jamile Bassetto, Andressa Nogueira,
Fernanda Bronzatto, Bruno da Silva Jubileu, Francine Boesso e Maíra Uliana, um muito
obrigado.
Ao Quadripé, pelos dias homéricos que passamos juntos e, que ainda estão claros
como Cristal em minha memória.
Ao meu grande amigo Bruno Innocenti pela amizade e em segundo, pela ajuda na
obtenção das leveduras junto À LNF-Brasil, e à empresa por ter ajudado.
À Miriam Roberta Henrique e à Usina Açucareira São Manoel pela ajuda e suporte
com material e tempo.
À Márcia Garcia (Técnica Horticultura) por toda ajuda, paciência e conversas.
Aos amigos verdadeiros; por mesmo não tendo seus nomes aqui, ainda saberem o
quanto são importantes.
E à LASPAU, pela ajuda com os próximos passos.
VIII
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS............................................................................................... X
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... XII
LISTA DE EQUAÇÕES........................................................................................... XIII
RESUMO................................................................................................................... 1
SUMMARY............................................................................................................... 4
CAPÍTULO I............................................................................................................. 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS................................................................................. 6
1.1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 6
1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................... 7
1.2.1. Leveduras alcoólicas - Saccharomyces cerevisiae............................ 7
1.2.2. Taxonomia........................................................................................... 7
1.2.3. Metabolismo: Fermentação alcoólica e respiração.............................. 8
1.2.4. Fermentação alcoólica........................................................................ 9
1.2.5. Cinética .............................................................................................. 9
1.3. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 14
CAPÍTULO II............................................................................................................ 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURAS…………………………………..…………………………………... 16
RESUMO................................................................................................................... 16
SUMMARY............................................................................................................... 16
2.1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 17
2.2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 19
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 22
2.4. CONCLUSÕES.............................................................................................. 29
2.5. AGRADECIMENTOS................................................................................... 29
2.6. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 30
IX
CAPÍTULO III.......................................................................................................... 35
ANEXOS................................................................................................................... 36
CAPÍTULO IV.......................................................................................................... 58
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................... 59
X
LISTA DE TABELAS
Página
CAPÍTULO II............................................................................................................. 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURAS............................................................................................................. 16
Tabela 2.1: Velocidade especifica () a partir da fermentação dos três mostos..... 22
Tabela 2.2. Consumo de açúcar, produção de etanol e quociente respiratório .…… 25
Tabela 2.3. Fatores de conversão paras os mostos testados …………………..……. 27
Tabela 2.4. Caracterização da matéria prima utilizada no preparo dos mostos ......... 28
CAPÍTULO III............................................................................................................ 35
FERMENTAÇÃO DO MELAÇO.............................................................................. 36
Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto de melaço…. 36
Tabela 3.2 – Açúcar (g/L) consumido durante a fermentação do mosto de melaço 37
Tabela 3.3 – Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de
melaço......................................................................................................................... 38
Tabela 3.4 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida
durante a fermentação do mosto de melaço…………………................................. 38
Tabela 3.5 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a
fermentação do mosto de melaço................................................................................ 39
Tabela 3.6 – Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h) durante a
fermentação do mosto de melaço................................................................................ 39
Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de
etanol (цP), e biomassa (цX) ..................................................................................... 40
Tabela 3.8 – Comparação estatística entre os fatores de conversão calculados a
partir dos dados experimentais.................................................................................... 41
FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA ……….......………………………… 43
Tabela 3.9 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto caldo de cana 43
Tabela 3.10 – Açúcar consumido (g/L) durante a fermentação do caldo de cana...... 44
XI
Tabela 3.11 – Biomassa produzida (g/L) durante a fermentação caldo de cana......... 45
Tabela 3.12 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h)……………. 46
Tabela 3.13 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) ...……… 47
Tabela 3.14 – Velocidades Instantâneas de produção de biomassa substrato (g/L.h) 48
Tabela 3.15: Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de
etanol (µP), e biomassa (µX) ……….……….………..........................……….…..... 49
Tabela 3.16 – Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à
fermentação do caldo-de-cana. ……….……….……….……….……….……….… 49
FERMENTAÇÃO DO MOSTO MISTO................................................................... 51
Tabela 3.17 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto misto……... 51
Tabela 3.18 – Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto misto..... 52
Tabela 3.19 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) durante a
fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…... 53
Tabela 3.20 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a
fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…… 54
Tabela 3.21 – Velocidades Instantâneas de produção de biomassa (g/L.h) durante a
fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……………. 55
Tabela 3.22 – Valores de цMax……….……….……….……….……….……….... 56
Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à
fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…..... 56
XII
LISTA DE FIGURAS
Página
CAPÍTULO I...................................................................................................................... 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS.......................................................................................... 6
Figura 1.1. (A) representação linear das fases do crescimento e (B) representação
semilogarítmica................................................................................................................... 11
Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma
fermentação……................................................................................................................. 12
CAPÍTULO II..................................................................................................................... 15
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A
PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS……….................... 16
Figure 2.1: Ethanol production (g L-1) during the 10 hours of experiment……………… 23
Figure 2.2: Sugar consumption (g L-1 ) during the 10 hours of experiment……………... 24
Figure 2.3: Biomass production (g L-1 ) during the 10 hours of experiment…………….. 26
CAPÍTULO III.................................................................................................................... 35
FERMENTAÇÃO DO MELAÇO...................................................................................... 36
Figura 3.1 –Planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades específicas.......... 40
Figura 3.2 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do
melaço................................................................................................................................ 42
FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA...................................................................... 39
Figura 3.3 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do caldo
de cana................................................................................................................................ 50
FERMENTAÇÃO DO CALDO DE MOSTO MISTO...................................................... 51
Figura 3.4 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do caldo
de cana............................................................................... ................................................ 57
XIII
LISTA DE EQUAÇÕES
Página
CAPÍTULO I.............................................................................................................. 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS.................................................................................. 6
Equação 1.1: Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato,
produção de etanol e biomassa ................................................................................... 12
Equação 1.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato,
produção de etanol e biomassa ................................................................................... 12
Equação 1.3. Fator de conversão de substrato em produto……...................................... 13
Equação 1.4. Fator de conversão de substrato em Biomassa….................................. 13
Equação 1.5: Tempo de geração característico de cada cepa .................................... 13
CAPÍTULO II............................................................................................................. 16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA
COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE
LEVEDURA............................................................................................................... 16
Equação 2.1. Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato,
produção de etanol e biomassa ................................................................................... 20
Equação 2.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato,
produção de etanol e biomassa ................................................................................... 20
Equação 2.3. Cálculo dos fatores de conversão .......................................................... 21
Equação 2.4. Cálculo dos fatores de conversão .......................................................... 21
Equação 2.5. Quociente respiratório........................................................................... 21
Equação 2.6. Equação de Boltzmann.......................................................................... 21
1
RESUMO
O etanol é um combustível verde que além da influência na econômica possui grande
impacto social, político e ambiental. O objetivo deste trabalho foi descrever a cinética
fermentativa e o rendimento de quatro linhagens de leveduras na fermentação em três mostos
compostos de melaço, Caldo de cana e misto de melaço e caldo de cana. As linhagens
escolhidas foram BG-1, CAT-2 e PE-2 (de destilarias) e UNIFERM (levedura seca de
panificação. A fermentação ocorreu em triplicada e a cada hora foram medidos o teor de
açúcares redutores, etanol e massa celular. A linhagem BK foi a que apresentou maior
velocidade de produção de etanol e consumo de substrato. CAT-1 foi a que mais produziu
etanol. As duas linhagens formam o grupo das rápidas enquanto as linhagens PE-2 e BG-1
foram as que apresentaram as menores velocidades ficando no grupo das lentas. PE-2
apresentou dois dos maiores fatores de conversão YP/S enquanto a BG-2 tendeu a consumir
substrato por vias aeróbicas. Os parâmetros cinéticos não puderam descrever o rendimento,
2
uma vez que estão ligados à velocidade, eles estão fortemente associadas à formação e
densidade da espuma.
Palavras-chave: fermentacao, cinetica, etanol, sacarose.
3
SPECIFIC VELOCITY AS A TOOL TO COMPARE PERFOMANCE OF FOUR STRAINS
OF ALCOHOLIC YEAST Botucatu, 2013. 50p. Dissertacao (Mestrado em
Agronomia/Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista.
Author: JULIANO TONIATO
Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO
SUMMARY
Ethanol is a greenhouse-friendly fuel with immense social, political and environmental
impact. Our objective was to describe fermentative performance and yield for four yeast
strains from Brazilian ethanol plants during the fermentation of three types of must - molasses,
Sugar cane and mixed must (sugarcane and molasses). We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol
plant strains) e UNIFERM (dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. Each
hour we collected and analyzed samples for reducing sugars, ethanol and biomass. Yeasts
were split into two groups fast and slow fermenters. For the fast fermenter BK has shown the
4
highest speed values for both substrate consumption and ethanol production while CAT-1 had
the highest ethanol yield. For the slow fermenter PE-2 had two of the greatest YP/S factors
while BG-1 tended to use sugar through aerobic pathways. Kinetic parameters could not be
related to ethanol yielding although, they are directly connected to foam formation and its
characteristics.
Keywords: fermentation, Kinect, ethanol, sucrose
6
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1.1 INTRODUÇÃO
Atualmente o petróleo fornece aproximadamente 1/3 da energia primária consumida no
mundo, sendo considerada a principal fonte energética, desde o bem estar pessoal até o
desenvolvimento industrial, e a prestação de serviços. Assim alterações no suprimento ou no
uso do petróleo teriam desdobramentos econômicos, políticos e sociais importantes para a
maior parte das nações do mundo. Devido à combustão crescente de combustíveis fosseis
iniciada à 60 anos, nota-se uma escassez e o aumento do preço desta fonte não renovável de
energia. Portanto essas alterações que estão sendo gradualmente intensificadas exigem
mudanças nos padrões industriais e de consumo da sociedade humana, de forma a reduzir a
emissão de gases do efeito estufa. (PEREIRA et al., 2008)
Uma das opções é o bioetanol, um excelente substituto para a gasolina que é o
principal combustível renovável usado em automóveis no mundo (HISS, 2001). No Brasil, o
etanol, produzido da cana-de-açúcar, já substitui hoje metade da gasolina que seria consumida
7
e seu custo é competitivo sem os subsídios que viabilizaram o programa no seu início, o
Proálcool. Além disso, desde os tempos do Brasil colônia, a cultura da cana-de-açúcar tem
sido uma grande fonte de riqueza para a economia brasileira (SCHNEIDER. et al., 2012).
Hoje, o Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e etanol com crescente
aumento na produção. No primeiro semestre de 2012 foram exportados mais de 595 mil litros
e em 2011 foram exportados mais de 2 milhões de litros (UNICA, 2012).
1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.2.1 Leveduras alcoólicas - Saccharomyces cerevisiae
A levedura S. cerevisiae é a responsável pela produção do etanol através da fermentação
no Brasil. O processo utiliza a sacarose proveniente da cana-de-açúcar, na forma de caldo de
cana e melaço, como substrato para fermentação. Durante os processos de fermentação
industrial, as leveduras passam por diversas formas de stress (BATISTOTE et al., 2011 e
BROSNAN et al., 2000 assim as cepas de S. cerevisiae utilizadas como inóculos nas usinas
devem apresentar elevada velocidade de fermentação, bom rendimento de conversão de substrato
para etanol e células, resistência aos elevados teores alcoólicos e resistência à elevada temperatura
de fermentação.
1.2.2 Taxonomia
A levedura alcoólica Saccharomyces cerevisiae pertence ao Filo Ascomycota, Classe
Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae, gênero
Saccharomyces (SUH e BLACKWELL, 2006). Elas têm passado por inúmeras mudanças
desde a sua descoberta, há 150 anos. Quando a primeira publicação sobre taxonomia de
leveduras foi compilada por Guilliermond, em 1912, o gênero Saccharomyces compreendia 46
espécies divididas em seis grupos separados de acordo com a atividade fermentativa sobre os
açúcares. Atualmente, de acordo com a última revisão taxonômica, 14 espécies são aceitas
dentro do gênero Saccharomyces, as quais estão classificadas em três grupos previamente
estabelecidos por van der Walt. (GUIMARÃES et al., 2006)
8
1.2.3 Metabolismo: fermentação alcoólica e respiração
Os fungos, reino aos quais as leveduras pertencem, são seres que não possuem
maquinária autotrófica; produzem energia através de fontes externas (TRABULSI, 2008). As
leveduras alcoólicas metabolizam anaerobicamente o açúcar, para gerar energia (ATP) que
será empregada na realização de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e
biossíntese necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para perpetuar a
espécie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem tão somente de produtos de excreção
(TORIJA, 2003).
A degradação do açúcar até etanol e gás carbônico envolve 12 reações em seqüência
ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica. Inicialmente, a sacarose, que é um
dissacarídeo, se hidrolisa na presença da enzima invertase, produzindo os monossacarídeos
glicose e frutose. A seguir, sob ação de outras enzimas, os monossacarídeos são fermentados,
produzindo o etanol com a liberação de gás carbônico, o que pode ser expresso
matematicamente pela equação química simplificada de Gay Lussac:
C12H22O11 + H2O 2 C6H12O6
C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 23,5 kcal
Furletti (1987) descreve um comportamento típico das leveduras alcoólicas. A
fermentação tende a acontecer em anaerobiose devido ao efeito Pasteur. Nessa situação ocorre
a inibição da fermentação alcoólica devido à presença de oxigênio, sob condições específicas
de meio. A aeração do mosto faz com que a levedura tenda a oxidar os carboidratos por
respiração. Com isso, a produção de álcool diminui e a multiplicação da levedura é favorecida.
Outro caso especial acontece em presença de altas concentrações de glicose e oxigênio.
Nessa situação a célula pode fermentar em vez de respirar. Esse comportamento metabólico é
provocado por um efeito conhecido como Crabtree ou repressão catabólica. Esse efeito se faz
presente em condições onde a concentração de glicose ultrapassa um valor limite
9
(CARVALHO et al., 2007). Thomson et al. (2005) confirma essas informações dizendo que a
alta concentração de glicose acelera a glicólise, com produção de quantidades de ATP pela
fosforização do substrato. Esse mecanismo reduz a necessidade da fosforilação oxidativa,
diminuindo no final da via a necessidade de oxigênio. O autor afirma que esse fenômeno
surgiu de mecanismos de competição derivados da natureza antisséptica do etanol.
1.2.4 Fermentação alcoólica
A fermentação alcoólica é fortemente afetada vários fatores como, por exemplo, os
químicos (açúcar, oxigênio, pH, minerais, vitaminas), físicos (temperatura, agitação) e
biológicos (bactérias contaminantes e leveduras selvagens).
Um dos fatores de maior importância é a temperatura de fermentação. Embora as
leveduras alcoólicas sejam organismos que crescem em diferentes temperaturas, a fermentação
pode ocorrer dentro de uma faixa de 10°C até 35°C. Em temperaturas maiores que 40ºC as
células começam a se tornar inviáveis (ANGELIS, 1987). Dentro deste intervalo, quanto
maior a temperatura, maior será a velocidade do processo fermentativo, sendo também maior a
formação de produtos secundários a fermentação (KLEIN, 2006).
TORIJA et al. (2003) diz que com o aumento da temperatura há maior formação de
metabólitos secundários como o glicerol, ácido acético e ácido succínico. Gutierrez (1993)
também mostrou que com o aumento de temperatura e da concentração de sacarose ocorreu
maior formação de álcool isoamílico pelas leveduras estudadas.
1.2.5 Cinética
Na fermentação alcoólica, os substratos (açúcares) são transformados em produtos
(etanol), e parte da energia (ATP) gerada é usada para a produção de biomassa (células).
Assim, as concentrações de substrato (açúcar), produto (etanol) e células (levedura) variam
com o tempo da fermentação. Hiss (2001) define a variação dessas concentrações como
cinética química do sistema.
10
Após a inoculação da levedura em um meio de cultura favorável ao seu crescimento,
observa-se um comportamento característico dos valores de concentração celular, que
didaticamente é dividida em fases (GRETSCHMANN 2009 e HISS, 2001):
- Fase 1: latência, que segue imediatamente à inoculação do meio com o microorganismo
(Saccharomyces cerevisiae). Trata-se de um período de adaptação durante o qual a
célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes do meio.
Durante esta fase não há reprodução celular;
- Fase 2: transição, onde se observa o início da reprodução microbiana propriamente dita,
havendo um aumento gradual da velocidade de crescimento;
-Fase 3: logarítmica ou exponencial, em que a velocidade de crescimento é máxima;
-Fase 4: linear de crescimento, com velocidade de reprodução constante;
-Fase 5: desaceleração, devido ao esgotamento do meio de cultura e ao acúmulo de inibidoes,
em que a velocidade de crescimento diminui até se anular;
-Fase 6: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se
mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o
número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.
-Fase 7: declínio ou lise, a taxa de morte é maior que a taxa de produção de novas células.
A Figura 1.1 representa de maneira linear e semilogarítmica as fases do crescimentodas leveduras de acordo com Hiss (2001).
11
Figura 1.1 - Parte superior (A), a representação linear das fases do crescimento e na parte inferior (B), a
representação semilogarítmica (Fonte: HISS (2001).
Para estudos cinéticos, Nascimento et al. (2009) e Hiss (2001) recomendam o
acompanhamento dos itens de acordo com os seguintes critérios. Como substrato, chamado de
“S” elege-se o composto que limita a reação; como produto, o de interesse econômico
(chamado de “P”), e finalmente X, como a concentração do microorganismo, chegando-se
assim à S=glicose, P=Etanol e X=Levedura.
A Figura 1.2 é a representação clássica da variação das concentrações de substrato,
produto e células em função do tempo de fermentação.
12
Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma fermentação, onde S, X, P,
representam substrato, levedura e produto respectivamente e S0, X0 seus valores iniciais (HISS (2001).
É possível comparar quantitativamente as diferentes condições de cultivo através da
diferença entre as concentrações finais e iniciais (denominadas dX, dP e dS).
Dividindo-se esses valores pelo tempo gasto (dt tendendo à zero) temos as velocidades
instantâneas de transformação (“r”) descritas pelas equação 1.1, abaixo. Os autores chamam de
rX, rS e rP de produtividade de produção de biomassa, de consumo de substrato e produção de
produto respectivamente (HISS, 2001).
(1.1)
Devido ao fato de X (concentração celular) variar como tempo e como conseqüência a
concentração do complexo enzimático responsável pela conversão S-P, Gaden (1955) sugeriu
a normalização pelas velocidades especificas “µ” de crescimento, consumo de substrato e de
formação de produto, descrito pelas equação (1.2) a seguir.
(1.2)
O rendimento também pode ser chamado de fator de conversão de substrato em
produto (YP/S). Os calculo foi sugerido por Ribeiro e Horii (1999) descrito na fórmula 3.
13
(1.3)
O autor também sugeriu o fator de conversão de substrato em biomassa (fórmula 4).
(1.4)
Hiss (2001) ainda descreve que a fase exponencial de crescimento também tem como
característica o tempo de geração tg, ou seja, o tempo necessário para que o valor da
concentração celular dobre (logo X = 2Xi)
Assim,
ou (1.5)
1.3 Referências bibliográficas
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Rio Claro: UNESP, 1987. p.41-62.
BATISTOTE, M. et al. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. Ciência e
Natura, Ufsm, v. 2, n. 32, p.83-95, 2010.
BROSNAM, M. P. et al. The estress response is repressed during fermentation in brewery
strains of yeast. Revista Analytica, United Kingdom, v. 88, n. 5, p.746-755, 2000. doi:
10.1046/j.1365-2672.2000.01006.x.
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fundamentais noprocesso cervejeiro: 2ª parte – a fermentação. Rev. Anal, n.26, p.46-54, 2007.
14
FURLETTI, M.E.M. Fatores físicos químicos que interferem na fermentação alcoólica. In:
DEANGELIS, D.F. (Org). Microbiologia da Fermentação Alcoólica. Rio Claro: UNESP,
1987, p.72-79.
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GRETSCHMANN, A.S. Ajuste de curvas na produção de etanol num processo em
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Acesso em : 22 abril. 2013.
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HISS, H. Cinética de processos fermentativos In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.;
AQUARONE, E.; BORZANI, W.R (Coord.) Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard
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KLEIN, T. Avaliação de aromas característicos produzidos por diferentes
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15
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16
VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A
PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS DURANTE A
FERMENTAÇÃO DE MOSTOS FEITO DE MELAÇO, CALDO DE CANA E MISTO.
RESUMO
Nosso objetivo foi comparar e descrever o comportamento cinético de quatro linhagens
utilizadas nas usinas durante a fermentação do mosto misto de melaço e caldo de cana. Nós
utilizamos as linhagens CAT-1, PE-2 e BG-1 (usinas) e fermento seco de panificação (marca
UNIFERM). As leveduras foram testadas em triplicatas. Amostras foram coletadas a cada
hora e analisadas quanto ao teor de açúcares redutores, etanol e biomassa. CAT-1 teve a maior
produção de etanol e fator (YP/S), entretanto a linhagem BK apresentou as maiores velocidades
(rs, rp, s and p). BG-1 apresentou os altos valores de QR, logo bom crescimento celular, PE-2
não acabou a fermentação. Apesar dos valores s and P não estarem relacionados com a
17
produção de etanol e com os fatores de conversão, os parâmetros estão diretamente
correlacionados com a formação e características da espuma formada.
ABSTRACT
Since Pasteur yeast selection is used as technique for detecting strains with certain properties.
Nowadays, some strains have been already isolated from Brazilian ethanol plants. Our
objective was to describe and compare kinetic behavior of four strains used in Brazilian
ethanol plants during the fermentation of musts made of sugar cane, molasses and mixed must
of sugarcane juice and molasses and check whether specific velocity () is a good tool to
compare yeasts’ performance. We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol plant strains) and BK
(dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. We collected samples each hour
and then, analyzed them for reducing sugars, ethanol and biomass. CAT-1 and BK are fast
fermenters, BK was the fastest fermenter with the greatest velocities (rs, rp, s and p) while
CAT-1 had the greatest ethanol yield and substrate conversion in two musts (YP/S) and the
second highest s and s. Yet, BG-1 tends to show high QR, thus good growth and PE-2 didn`t
finish the process. s and P values were not related to ethanol yielding and substrate
conversion, although these parameters seem to have a direct correlation to foam formation and
density.
2.1 INTRODUÇÃO
O etanol exerce grande influência na economia, sociedade e meio ambiente. O brasil
produziu mais de 23 bilhões de litros durante a safra 2011/2012, o que representa U$48
bilhões do BIP, injetando em média U$23 milhões na economia (UNICA, 2013 e REYNOL,
2009). O setor representa 6% de todos os empregos da agroindústria (VILAÇA; PINTO,
2011). Além disso, o etanol de cana é altamente competitivo com o milho (LEITE, 2005).
O etanol é produzido durante a fermentação, nesse processo a levedura Saccharomyces
cerevisiae assimila açúcar para produzir energia (ATP) e eliminando etanol e CO2 como
produto (BRANDÃO et al., 2007). Entretanto, sob condições especificas a levedura pode
18
oxidar o substrato na presença de oxigênio produzindo menos etanol; é o efeito Pasteur, um
importante fator nas fermentações industriais.
O processo de produção de etanol, no Brasil, se utiliza principalmente da sacarose do
caldo de cana e/ou melaço (BATISTOTE et al. 2010). Várias técnicas pode ser empregadas na
obtenção do caldo, por exemplo, esmagamento mecânico ou difusão (ALCARDE et al., 2012
e MENEGUETTI et al., 2011), enquanto melaço é o resíduo da centrifugação durante a
processo de produção do açúcar, e por essa razão mais impuro (MACHADO, 2012 e PAYNE,
1989).
A linhagem da levedura, juntamente com a composição do mosto, exercem importante
papel na produção enzimática responsável pela fermentação. Diferentes perfis podem, por
exemplo, aumentar a produção de componentes de crescimento celular (ácido nucleico e
proteínas), enquanto outros podem ser de caráter adaptativo, o que de certa maneira, interfere
na no etanol produzido. (BRANDÃO et. al., 2007; GUIMARÃES et al., 2006 e LIMA et al.,
2001). Temperatura, pH e vitaminas do mosto também desempenham papel importante na
fermentação (BRANDÃO et al., 2007 e THOMSON 2005).
Quando Pasteur (1866) notou que o tipo de levedura utilizado na produção de vinhos
eram responsáveis por determinadas características, ele iniciou a busca por linhagens que
culminariam em técnicas, em sua maioria dispendiosas, que permitem marcar linhagens e as
escolher por suas características (SUÁREZ-LEPE, MORATA, 2012 e SUÁREZ-LEPE,
IÑIGO, 2004). Recentemente, Basso et al. (2008) mostrou que as técnicas resultam em
linhagens como as CAT-1, PE-2, BG-1, SA-1 e Y904. Não coincidentemente, Batistote et al.
(2010) relatou que dentre essas linhagens, Catanduva 1 (CAT-1), Pedra 2 (PE-2), Barra
Grande 1 (BG-1) e o fermento de panificação são as mais utilizadas pelas usinas
sucoenergéticas do Brasil.
Hiss (2001) afirmou que uma ferramenta para comparar as leveduras é através da
cinética. Por tudo isso, nosso objetivo foi descrever e comparar os parâmetros cinéticos de três
linhagens comerciais de leveduras e a de panificação durante a fermentação de três diferentes
tipos de mosto.
19
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS.
Foram comparadas quarto linhagens de leveduras – uma linhagem de panificação (BK)
e três marcas comerciais utilizadas em usinas no Brasil.
As marcas comerciais foram CATANDUVA (CAT-1), BARRA GRANDE (BG-1) e
USINA DA PEDRA (PE-2), uma vez que elas são as mais utilizadas nas destilarias
(BATISTOTE et al. 2010); UNIFERM (BK) foi escolhida como a de panificação por ser
facilmente encontrada em panificadoras e estabelecimentos comerciais.
O mosto, com 15ºBrix, foi obtido após a diluição em água da matéria prima. No caso
do mosto misto, o caldo de cana e o melaço foram diluídos separadamente, seguidos da
homogeneização e checagem do ºBrix. O teor de solido solúveis (ºBrix) foi checado em
refratômetro digital. Pol, pH e pureza foram analisados e calculados de acordo com
Copersucar (2001) e Brasil (2005).
Cada linhagem foi fermentada em triplicata perfazendo um total de 36 parcelas
experimentais. Cada parcela consistia em 5 litros do respectivo mosto inoculados na proporção
de 10% (m/m) – os volumes foram calculados em pré-teste de maneira que após as 11 coletas,
permanecesse um volume de no mínimo 90% do original e o processo se encerrasse dentro de
10 horas. As fermentações ocorreram em béqueres de 11 litros em temperatura ambiente.
Foram coletadas amostras horárias seguidas de congelamento com nitrogênio líquido.
A técnica permitiu o processamento de amostras simultâneas, entretanto a formação de cristais
influencia a viabilidade e possivelmente a quantificação da biomassa, Shi et al. (2013) provou
que o congelamento à -18ºC pode diminuir em 50% a viabilidade, além disso, a viabilidade
após a liofilização pode ser menor que 0,1% (BERNY; HENNEBERT, 1991).
Análises químicas
Após serem descongeladas, as amostras foram analisadas para açúcares redutores (AR), etanol
e biomassa, de acordo com os seguintes protocolos.
Açúcares redutores – Método colorimétrico através da oxidação com o ácido
dinitrosalicílico (DNS), descrito por Miller (1959) e adaptado por Lopes et al. (2010)
20
Etanol – Oxidação do etanol pelo dicromato de potássio descrito por Joslyn (1970)
Biomassa – Método gravimétrico descrito por Cooney (1981).
Parâmetros cinéticos
Velocidade instantânea.
Velocidade Instantânea “r” é a velocidade medida em um determinado instante. A
equação 1 (mostra os cálculos aonde “rS” é a velocidade instante na de consumo de
substrato; “rP” é a velocidade instantânea de produção de etanol e r é a velocidade
instantânea do crescimento celular.
(1)
Velocidade especifica “”
As velocidades instantâneas são importantes ferramentas na descrição da performance
em condições especificas entretanto, ela não é suficiente para comparar e descrever diferente
mostos e diferentes concentrações de inóculo – a quantidade de complexo enzimático
responsável pela fermentação varia, o que afeta diretamente a transformação S-P. É possível
normalizar as taxas, dividindo-se os valores de “r” pela sua biomassa correspondente. O
resultado é conhecido como velocidade especifica () descrita na fórmula 2 (GADEN, 1955).
(2)
Ribeiro e Horii (1999) relataram que os valores de são maiores na fase exponencial
do crescimento microbiano, e que em muitos estudos o parâmetro pode ser chamado de MAX
ou m.
21
Fator de conversão
Gretschmann (2009) descreve como o substrato consumido é convertido em produto e
biomassa nos chamados fatores de conversão, sendo YP/S o fator de conversão de substrato em
produto (equação 3) e YX/S o fator de conversão de substrato em biomassa (equação 4).
(3)
(4)
Coeficiente respiratório
Kocková-Kratochvílová (1990) reporta que a relação entre fermentação e respiração
pode ser expressa pelo quociente respiratório (QR) cujo valor varia com o tipo de levedura. A
equação 5 permite afirmar que quanto maiores as condições de anaerobiose maior será o valor
de QR (FERNANDES, 2008 e KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990).
No presente trabalho, o quociente respiratório foi calculado a partir dos valores
experimentais de açúcar e dos valores de CO2 e O2 obtidos a partir de cálculos
estequiométricos.
(5)
Análise estatística
Os dados foram plotados e analisados através do programa estatístico OriginPro
(versão 8, OriginLab). As curvas foram ajustadas utilizando a equação de Boltzmann para
ajustes sigmoides como descrito na equação 6.
(6)
22
2.3.RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com os parâmetros cinéticos (tabela 1) as leveduras puderam ser divididas
em dois grupos – rápidas e lentas.
Tabela 2.1: Velocidade especifica máxima para os três mostos
testados.
BG-1 PE-2 CAT-1 BK
µS – melaço 0.38 0.27 0.48 0.56
µP – melaço 0.12 0.07 0.17 0.25
µX – melaço 0.06 0.02 0.03 0.01
µS – caldo de cana 0.08 0.09 0.15 0.21
µP – caldo de cana 0.22 0.24 0.36 0.84
µX – caldo de cana 0.01 0.01 0.02 ---
S – misto 0.19 0.24 0.37 0.51
P – misto 0.07 0.07 0.16 0.22
X – misto 0.02 0.01 0.05 0.03
Velocidades especificas máximas para consume de substrato
(µS), produção de etanol (µP) e crescimento celular (µX) para os
mostos feitos de “melaço”, “caldo de cana” e “misto”, não foi
possível detectar crescimento na linhagem BK durante a
fermentação do mosto de caldo de cana.
No grupo das rápidas estão as leveduras que apresentam altos valores de S e P e
logo, os menores tempos de fermentação. BK foi a mais rápida das quatro quanto as
velocidades de consumo de substrato e produção de etanol – a fermentação havia se completou
entre as 3 primeiras horas de experimento (figura 1 e 2).
igure 1
23
Figura 1: Produção de etanol em (g L-1) durante as 10 horas de experimento.
Na figura a seguir as concentrações estão em g L-1 e o tempo em horas, as curvas como
esperados foram inversamente proporcionais ao consumo de substrato encontrado na figura 1,
sendo as maiores velocidades de produção de etanol no intervalo de hora posterior ao das
24
maiores velocidades de consumo de substrato.
1
1
Figura 2: Consumo de açúcar (g L-1) durante as 10 horas de experimento.
25
CAT-1 é a outra linhagem do grupo das rápidas sendo que a fermentação acabou por
volta da quinta hora. Mesmo estando em Segundo nos valores cinéticos de S e P, a levedura
apresentou a maior produção absoluta de etanol nos três motos testados (tabela 2).
Silva (2011) chama o grupo de Tumultuosa e mostra outra característica desse tipo de
fermentação – para o autor toda a produção e liberação de CO2 e calor estão concentradas na
fase exponencial e consequentemente na espuma. Usinas cujo tempo é um fator importante e
que estão preparadas para o calor e espuma formados podem se beneficiar das leveduras desse
grupo.
No grupo das lentas estão as linhagens BG-1 e PE-2. PE-2 apresentou a maior
quantidade de açúcar residual após as dez horas de experimento, por outro lado apresentou os
maiores valores de conversão (yP/S) em dois dos três mostos testados (tabela 3). Conclui-se que
Tabela 2.2 Consumo de açúcar (g), produção de etanol (g) e quociente respiratório dos
três mostos testados.
BG-1 PE-2 CAT-1 BK
ΔS – melaço 108.13 105.16 107.61 106.58
Etanol – melaço 39.23 46.14 46.21 44.76
QR – melaço 2.92 4.27 4.00 3.78
ΔS – caldo de cana 106.17 81.01 109.47 108.11
Etanol – caldo de
cana 36.22 31.38 40.75 38.45
QR – caldo de cana 2.22 2.77 2.37 2.66
ΔS – misto 98.17 97.11 99.44 103.92
Etanol – misto 38.03 31.38 40.75 37.70
QR – misto 2.80 2.16 3.22 2.49
TA – Etanol total em g: ΔS açúcar residual após as 10 horas de fermentação e QR
quociente respiratório.
26
a fermentação não havia acabado e que respeitado sua velocidade, ela poderia produziria
quantidades satisfatórias de etanol. No gráfico isso é verificado pela baixa inclinação da curva.
Figura 3: Produção de células (biomassa em g L-1) durante as 10 horas de experimento.
27
Tabela 2.3: Fatores de conversão após as 10 horas de fermentação.
BG-1 foi a quarta levedura testada e a que apresentou os menores valores de S e P,
até três vezes menor que os de BK. Os valores de QR e de etanol produzidos indicam que a
levedura foi quem mais utilizou substrato por vias aeróbicas, o que explica os fatores de
crescimento YX/S e o crescimento celular (figura 3). Leveduras secas são utilizadas na
alimentação animal há mais de seis décadas. Thrune et al. (2009) observaram que o uso da
levedura triplicou nos últimos 10 anos nos Estados Unidos, passando de 16,9 para 50,8% o
número de produtores que utilizam a levedura como fonte de aditivo alimentar no rebanho
leiteiro. Além disso, os processos tradicionais de propagação de leveduras requerem entre 8 e
15 dias, chegando a 30 dias em alguns casos. Esses fatores reforçam a importância da
linhagem para as empresas que comercializem a levedura seca.
Batistote et al. (2010) encontraram o mesmo desempenho em três linhagens de
destilarias durante a fermentação do caldo de cana. Entretanto, em seu experimento BK foi a
de menor desempenho cinético e em produção de etanol – a marca comercial de levedura de
panificação pode ser uma possível explicação.
Pavlak et al. (2011) por outro lado achou maiores valores de YP/S, entretanto o autor
usou hidrolisado de batata doce como mosto – Muitos fatores podem influenciar a cinética dos
hidrolisados fazendo a diferir da do mosto de cana de açúcar. Dentre as diferenças que
podemos citar estão pH, a presença de inibidores como ácidos fracos (ácido acético), furfural,
BG-1 PE-2 CAT-1 BK
Y P/S – Melaço 0.36 0.44 0.43 0.42
Y X/S – Melaço 0.12 0.05 0.05 0.04
Y P/S – Caldo de
cana 0.34 0.39 0.37 0.36
Y X/S – Caldo de
cana 0.04 0.06 0.04 -
Y P/S - Misto 0.39 0.32 0.41 0.36
Y X/S - Misto 0.08 0.04 0.08 0.05
28
hidroximetil furfural e componentes fenólicos (ANDRADE et al., 2013; LI et al., 2011 e
ALMEIDA et al., 2009).
Alcarde et al. (2012) mostrou outro fator que pode explicar essas diferenças, o autor
afirma que a microbiologia é um importante fator e que juntamente com as características
físico-químicas do mosto podem afetar fortemente a formação de metabolitos secundários. A
tabela 3 está de acordo com essas informações - o melaço apresenta baixa pureza, o que
representa menos açúcares e mais componentes solubilizados, além disso, a maturação da cana
no experimento 2 (15,6 ºBrix) pode ter influenciado a capacidade fermentativa do
mosto(ALCARDE et al. 2012 e Rodrigues 1995).
Tabela 2.4: Caracterização da matéria prima usada no prepare
dos mostos.
ºBrix pol pureza pH
Melaço 79.13 11.40 69.00 6.06
Caldo de cana 15.60 11.50 74.00 5.43
Misto – Caldo de cana 20.1 17.8 88.50 5.54
Misto - Melaço 86.00 4.60 53.20 6.26
ºBrix (ºBrix), pol (g L-1), pureza (%) e pH da material prima
empregada no prepare do mosto.
As curvas ajustadas de nosso experimento (figuras 1 e 2) seguem o padrão sigmoide de
crescimento microbiano (HISS, 2001). Nesta curva, a fase exponencial representa a taxa mais
rápida de metabolismo que a levedura pode apresentar, o que pode ser numericamente
representado pelos valores de “”. Além disso, o metabolismo consiste em fermentar a fonte
de carbono em etanol, calor e crescendo com a energia necessária. Durante nosso experimento
BK e CAT-1 apresentaram os maiores valores S e P e consequentemente, a maior produção
de CO2; em consonância, BK e CAT-1 apresentou as maiores quantidade desde espuma
formada, sendo esta espessa e resistente à quebra mecânica. Adicionalmente, BG-1 e PE-2
produziram muito menos espuma sendo essa menos espessa e menos resistente à quebra. Por
29
tudo isso é possível concluir que as velocidades especificas máximas estão diretamente
associadas à espuma e suas características.
2.4.CONCLUSÃO
As leveduras puderam ser divididas em dois grupos de acordo com a velocidade e
tempo de fermentação.
CAT-1 e BK estão no grupo das rápidas – usinas que o tempo é um importante fator e
que estão preparadas para a espuma e o calor formado, associados à altos valores de ,
podem se beneficiar das linhagens
Além disso, BK foi a linhagem que apresentou a maior velocidade especifica de
consume de substrato e produção de etanol em todos os mostos testados enquanto CAT-1 foi a
que apresentou a maior produção de etanol
BG-1 e PE-2 são fermentadoras lentas por apresentarem valores de até três vezes
menores que os de BK. A espuma e o calor formados seguiram a tendência.
Ainda, PE-2 apresentou dois dos três maiores fatores de conversão de substrato em
etanol, mesmo a fermentação não tendo se completado após as dez horas.
BG-1 apresentou as menores velocidades de consume de substrato e produção de
etanol, entretanto ela apresentou altos valores de coeficiente respiratório o que pode ser um
indicativo para usinas que vendam levedura seca para a alimentação animal.
Pela análise dos dados, as velocidades instantâneas e especificas não puderam ser
relacionadas com a produção de etanol, entretanto elas foram diretamente proporcionais à
espuma e suas características.
2.5. AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP – processo nº 2010/14318-7) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES).
30
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36
3.1 - Tabelas da fermentação do Melaço
Tabela 3.1 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do
mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das
curvas pelo programa Origin
Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 4,46 4,81 8,78 16,25
2 9,12 8,84 20,12 30,73
3 16,71 13,02 30,48 39,03
4 25,72 17,37 37,71 42,64
5 33,13 21,87 41,84 44,02
6 37,59 26,55 43,94 44,52
7 39,79 31,40 44,95 44,69
8 40,77 36,44 45,42 44,76
9 41,19 41,65 45,63 44,78
10 41,36 47,06 45,73 44,79
37
Tabela 3.2 – Açúcar (g/L) consumido durante a fermentação do
mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das
curvas pelo programa Origin.
Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 113,03 113,78 113,14 114,10
1 34,41 28,60 33,06 22,55
2 13,76 14,19 11,98 4,12
3 8,34 11,76 6,43 2,00
4 6,91 11,34 4,97 1,78
5 6,54 11,28 4,59 1,75
6 6,44 11,26 4,49 1,75
7 6,41 11,26 4,46 1,75
8 6,41 11,26 4,45 1,75
9 6,40 11,26 4,45 1,75
10 6,40 11,26 4,45 1,75
38
Tabela 3.3 – Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de melaço. Osvalores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.
Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 65,05 65,03 65,00 65,97
1 65,25 65,08 65,01 66,70
2 66,23 65,21 65,17 67,66
3 69,65 65,57 67,01 68,66
4 74,78 66,36 70,21 69,47
5 77,35 67,58 70,73 69,99
6 77,99 68,74 70,76 70,30
7 78,12 69,42 70,76 70,45
8 78,15 69,72 70,76 70,53
9 78,15 69,83 70,76 70,57
10 78,15 69,87 70,76 70,59
Tabela 3.4 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida
durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores
foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 2,33 3,88 9,25 16,22
2 4,66 4,03 11,34 14,48
3 7,59 4,18 10,37 8,30
4 9,01 4,34 7,22 3,61
5 7,40 4,51 4,13 1,38
6 4,46 4,68 2,10 0,50
7 2,20 4,85 1,01 0,18
8 0,98 5,03 0,47 0,06
9 0,42 5,22 0,21 0,02
10 0,17 5,41 0,10 0,01
39
Tabela 3.5 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)
durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os
valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 78,61 85,18 80,08 91,55
2 20,65 14,41 21,08 18,43
3 5,42 2,44 5,55 2,12
4 1,42 0,41 1,46 0,22
5 0,37 0,07 0,38 0,02
6 0,10 0,01 0,10 0,00
7 0,03 0,00 0,03 0,00
8 0,01 0,00 0,01 0,00
9 0,00 0,00 0,00 0,00
10 0,00 0,00 0,00 0,00
Tabela 3.6 – Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h)
durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os
valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 0,20 0,05 0,01 0,73
2 0,98 0,14 0,16 0,96
3 3,42 0,36 1,84 1,00
4 5,13 0,79 3,20 0,81
5 2,57 1,22 0,52 0,53
6 0,65 1,16 0,03 0,30
7 0,13 0,68 0,00 0,16
8 0,02 0,30 0,00 0,08
9 0,00 0,11 0,00 0,04
10 0,00 0,04 0,00 0,02
40
Figura 3.1 – Exemplo de planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades
específicas. Ela foi construída de acordo com o proposto por Hiss (2001). X(g/L) é a
concentração horária da Biomassa, M(g/L) é a concentração do componente que se prentende
calcular o ц, dM/dt é o a velocidade instanea “r” e цm é a velocidade específica.
Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol
(цP), e biomassa (цX)
цS rS цP rP цX
BG-1 1.17a 86,70a 0.11b 13.86a 0,050b
PE-2 1.38a 88,90a 0.13ab 13.00a 0,013a
CAT-1 1.39a 90,97a 0.14ab 20.29a 0,08ab
BK 1.41a 91,54a 0.23 a 20.63a 0,11a
Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e
biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de
substrato (rS), produção de etanol (rP) durante a fermentação do melaço. Letras
diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados são referentes à fermentação do
melaço. Os valores foram calculados a partir dos dados experimentais.
41
Tabela 3.8 – Comparação estatística entre os
fatores de conversão calculados a partir dos dados
experimentais, os dados são referentes à
fermentação do melaço. Letras diferentes indicam
valores diferentes (p>5).
Fator de conversão
BG-1 0.35 a
PE-2 0.37 a
CAT-1 0.41 a
Controle 0.56 a
42
Figura 3.2 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do
melaço. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a fermentação do melaço c)
Representação gráfica da biomassa produzida durante a fermentação do melaço
43
3.2 - Tabelas da fermentação do caldo de cana
Siglas
BG-1 - Usina Barra Grande,
CAT-1 - Usina Catanduva
PE-2 - Usina da Pedra
BK – Levedura de Panificação, marca UNIFERFM
Tabela 3.9 – Etanol produzido (g/L) durante a
fermentação do mosto de melaço. Os valores foram
calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin
Tempo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 0,96 1,47 -0,53 0,00
1 3,02 3,00 5,52 12,02
2 6,22 5,17 15,36 38,02
3 10,78 8,07 26,07 38,45
4 16,44 11,71 33,64 38,45
5 22,41 15,90 37,52 38,45
6 27,72 20,28 39,18 38,45
7 31,76 24,41 39,84 38,45
8 34,49 27,96 40,09 38,45
9 36,18 30,77 40,19 38,45
10 37,19 32,85 40,22 38,45
44
Tabela 3.10 – Açúcar consumido (g/L) durante a
fermentação do mosto de melaço. Os valores foram
calculados após o ajuste das curvas pelo programa
Origin
Tempo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 111,1 111,1 111,1 111,1
1 104,09 101,12 108,49 111,16
2 97,87 99,99 87,40 52,82
3 88,54 97,55 62,19 20,78
4 75,69 92,58 38,73 8,66
5 59,96 83,41 21,48 4,75
6 43,25 69,24 10,87 3,55
7 27,98 52,45 5,04 3,19
8 15,82 37,81 2,03 3,09
9 7,15 28,09 0,54 3,05
10 1,46 22,75 -0,20 3,05
45
Tabela 3.11 – Biomassa produzida (g/L) durante a
fermentação do mosto de melaço. Os valores foram
calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.
Pelo tratamento estatístico e pela a variabilidade próprio
da metodologia a levedura BK aparentemente não
cresceu.
Tempo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 72,68 66,18 65,50 69,16
1 72,75 66,18 65,56 69,16
2 72,94 66,18 66,53 69,16
3 73,41 66,18 68,89 69,16
4 74,32 66,18 69,28 69,16
5 75,49 66,18 69,30 69,16
6 76,42 66,69 69,30 69,16
7 76,91 71,77 69,30 69,16
8 77,11 72,61 69,30 69,16
9 77,18 72,62 69,30 69,16
10 77,21 72,62 69,30 69,16
46
Tabela 3.12 – Velocidades Instantâneas de produção de
etanol (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a
cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o
ajuste das curvas pelo programa Origin.
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 2,05 1,53 6,05 12,02
2 3,21 2,16 9,84 26,00
3 4,56 2,90 10,71 0,43
4 5,66 3,64 7,57 0,00
5 5,97 4,19 3,88 0,00
6 5,30 4,38 1,66 0,00
7 4,04 4,14 0,66 0,00
8 2,73 3,55 0,25 0,00
9 1,70 2,81 0,10 0,00
10 1,00 2,08 0,04 0,00
47
Tabela 3.13 – Velocidades Instantâneas de consumo de
substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a
cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o
ajuste das curvas pelo programa Origin.
Intervalo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE
1 6,22 1,13 21,09 58,33
2 9,33 2,43 25,21 32,05
3 12,85 4,97 23,46 12,12
4 15,73 9,18 17,25 3,91
5 16,71 14,17 10,61 1,20
6 15,27 16,79 5,83 0,36
7 12,16 14,64 3,01 0,11
8 8,66 9,72 1,50 0,03
9 5,69 5,34 0,73 0,01
10 3,54 2,64 0,36 0,00
48
Tabela 3.14 – Velocidades Instantâneas de produção de
biomassa substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de
melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados
após o ajuste das curvas pelo programa Origin. As
velocidades da linhagem BK é zero pois devido ao tratamento
estatístico e à metodologia, a levedura aparentemente não
cresceu.
Intervalo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE
1 0,07 0,00 0,06 0,00
2 0,19 0,00 0,97 0,00
3 0,47 0,00 2,36 0,00
4 0,91 0,00 0,39 0,00
5 1,17 0,01 0,02 0,00
6 0,93 0,51 0,00 0,00
7 0,49 5,07 0,00 0,00
8 0,20 0,84 0,00 0,00
9 0,08 0,01 0,00 0,00
10 0,03 0,00 0,00 0,00
49
Tabela 3.15 - Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de
etanol (µP), e biomassa (µX), bem como as velocidades instantâneas máximas
para o consumo de substrato (rS), produção de etanol (rP) e o intervalo de tempo.
Letras diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados são referentes à
fermentação do mosto de cana-de-açúcar.
µS rS µP rP цX
BG-1 0,27b 36.16b 0,08bc 16,49a 0,47a
PE-2 0,29b 30.09b 0,07c 13,51a 0,37a
CAT-1 0,56ab 42.75ab 0,16ab 19,35a 0,33a
Controle 0,82a 57.01a 0,21a 19,34a 0,50a
Tabela 3.16 – Comparação estatística entre os
fatores de conversão referentes à fermentação do
caldo-de-cana. Letras diferentes indicam valores
estatisticamente diferentes (p>5).
Fator de conversão
BG-1 0.35 a
PE-2 0.34 a
CAT-1 0.36 a
Controle 0.35 a
50
Figura 3.3 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do
mosto de caldo de cana. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a
fermentação do mosto de caldo de cana. c) Representação gráfica da biomassa
produzida durante a fermentação do mosto de caldo de cana
51
3.3 - Tabelas da fermentação do mosto misto
Siglas
BG-1 - Usina Barra Grande,
CAT-1 - Usina Catanduva
PE-2 - Usina da Pedra
BK – Levedura de Panificação, marca UNIFERFM
Tabela 3.17 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto
misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o
ajuste das curvas pelo programa Origin
Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 0,24 1,47 -0,53 0,00
1 2,13 3,00 5,52 12,02
2 4,51 5,17 15,36 37,70
3 7,45 8,07 26,07 37,70
4 10,98 11,71 33,64 37,70
5 15,05 15,90 37,52 37,70
6 19,58 20,28 39,18 37,70
7 24,38 24,41 39,84 37,70
8 29,25 27,96 40,09 37,70
9 33,94 30,77 40,19 37,70
10 38,26 32,85 40,22 37,70
52
Tabela 3.18 – Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto
misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o
ajuste das curvas pelo programa Origin
Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
0 103,82 107,94 102,00 107,74
1 99,91 106,05 97,76 88,62
2 94,61 103,07 86,26 47,40
3 87,60 98,49 62,83 16,27
4 78,70 91,67 34,25 6,48
5 67,89 82,06 15,08 4,35
6 55,51 69,48 6,79 3,92
7 42,22 54,50 3,88 3,84
8 28,92 38,56 2,95 3,82
9 16,50 23,52 2,65 3,82
10 5,65 10,83 2,56 3,82
53
Tabela 3.19 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h)
durante a fermentação do mosto misto de melaço e cada-de- açúcar a cada
intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo
programa Origin
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 1,89 1,53 6,05 12,02
2 2,39 2,16 9,84 25,68
3 2,94 2,90 10,71 0,00
4 3,52 3,64 7,57 0,00
5 4,07 4,19 3,88 0,00
6 4,53 4,38 1,66 0,00
7 4,80 4,14 0,66 0,00
8 4,86 3,55 0,25 0,00
9 4,69 2,81 0,10 0,00
10 4,32 2,08 0,04 0,00
54
Tabela 3.20 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)
durante a fermentação do mosto misto de melaço e cana-de-açúcar a cada
intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo
programa Origin
Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 3,91 1,89 4,24 19,11
2 5,31 2,98 11,50 41,22
3 7,00 4,59 23,43 31,13
4 8,91 6,82 28,58 9,79
5 10,81 9,61 19,16 2,14
6 12,38 12,58 8,30 0,43
7 13,29 14,98 2,90 0,08
8 13,30 15,93 0,94 0,02
9 12,42 15,04 0,29 0,00
10 10,86 12,69 0,09 0,00
55
Tabela 3.21 – Velocidades Instantâneas de produção de
biomassa (g/L.h) durante a fermentação do mosto misto de
melaço e cana-de-açúcar a cada intervalo de hora. Os valores
foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin
Intervalo
(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK
1 1,11 0,64 0,91 0,30
2 1,54 0,66 2,86 0,30
3 1,67 0,63 3,05 2,98
4 1,38 0,55 1,06 1,41
5 0,91 0,44 0,21 0,06
6 0,51 0,33 0,04 0,00
7 0,27 0,24 0,01 0,00
8 0,13 0,16 0,00 0,00
9 0,06 0,11 0,00 0,00
10 0,03 0,07 0,00 0,00
56
Tabela 3.22 – Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e
biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de substrato
(rS), produção de etanol (rP) e o intervalo de tempo. Letras diferentes indicam valores
diferentes (p>5). Os dados são referentes aos dados experimentais do mosto misto de melaço
e cana-de-açúcar.
Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os
fatores de conversão referentes à fermentação do
mosto misto de melaço e caldo de cana. Letras
diferentes indicam valores estatisticamente
diferentes (p>5).
Fator de conversão
BG-1 0.35 b
PE-2 0.27 c
CAT-1 0.39 ab
Controle 0.40 a
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Figura 3.4 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação
do mosto de caldo de cana. b) Representação gráfica do etanol produzido durante a
fermentação do mosto de caldo de cana. c) Representação gráfica da biomassa
produzida durante a fermentação do mosto de caldo de cana
59
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As quatro linhagens de leveduras testadas apresentaram comportamento cinético e
características produtivas diferentes - tais características permitem a indicação das diferentes
linhagens para diferentes finalidades.
Durante o experimento foi constatado que os parâmetros cinéticos estão associados
com a produção de espuma e calor; uma vez que esses fatores em grande impacto na indústria,
conhecer o perfil da levedura empregada no sistema pode reduzir gastos e diminuir perdas.
Foi verificado que para estudos cinéticos com amostragem horaria é necessário o
congelamento das amostras em nitrogênio líquido - o que compromete a viabilidade celular e
dificulta a mensuração da biomassa celular, uma possível saída seria emprego de técnicas
como a espectrofotometria.
Os protocolos químicos que medem a variação da concentração de substrato e etanol
possuem baixa sensibilidade para medir pequenas variações, o que dificultou quantificar os
compostos nos momentos em que as concentrações eram baixas ou com pequena variação.
Sugere-se o emprego de técnicas mais sofisticadas e com maior sensibilidade como a