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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM CAPRINOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR TOXOPLASMA
GONDII
FRANCILENE SILVA SANTOS
SALVADOR – BAHIA
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM CAPRINOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR TOXOPLASMA
GONDII
FRANCILENE SILVA SANTOS
SALVADOR – BAHIA
2015
FRANCILENE SILVA SANTOS
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM CAPRINOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR TOXOPLASMA
GONDII
Dissertação apresentada à Escola de Medicina
Veterinária da Universidade Federal da Bahia,
como requisito para a obtenção do título de
Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na
área de Saúde Animal.
Orientadora: Prof. Dra. Fernanda Washington de Mendonça Lima
Corientadora: Prof. Dra. Neci Matos Soares
SALVADOR-BAHIA
2015
S237 Santos, FrancileneSilva. Avaliação da resposta imune em caprinos infectados experimentalmente por Toxoplasma gondii /
Francilene Silva Santos. - 2015. 91f.: il. Inclui anexos.
Orientadora: Profª. Drª. Fernanda Washington de Mendonça Lima Co-orientador: Profª. Drª. Neci Matos Soares.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Salvador, 2015.
1. Toxoplasma gondii – Avaliação – Método comparado 2. Caprino – Infecção – Toxoplasma gondii. 3. Parasitologia veterinária. I. Lima, Fernanda Washington de Mendonça . II. Soares, Neci Matos. III. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicna Veterinária e Zootecnia. IV. Título.
CDD - 636 CDU – 636.3
AGRADECIMENTOS
Neste momento eu queria agradecer a Deus por toda a força e capacidade para realizar
todos os meus planos e objetivos.
Aos meus pais que proporcionaram as minhas realizações e deram-me a competência e
o ensinamento para seguir na vida.
Agradecer a meu esposo que sempre esteve ao meu lado, pelo amor e companheirismo,
pelas palavras e pela força para seguir em frente mesmo na hora em que o coração
apertou e as lágrimas escorreram pelos olhos.
A minha orientadora Professora Dra. Fernanda Washington de Mendonça Lima pela
confiança e oportunidade de realizar este trabalho. Por todas as orientações e correções
nessa jornada.
A professora Dra. Thereza Cristina B. S. Calmon de Bittencout e ao professor Dr.
Ricardo Riccio Oliveira pela paciência nos auxílio estatístico.
Ao Professor Dr. Eduardo Luiz Trindade Moreira, pela fundamental colaboração nas
análises histopatológicas.
A Dr. Joelma Nascimento de Souza pelo auxílio acadêmico, paciência e compreensão.
Ao professor Dr. Luiz Fernando Pita Godim, pela parceria na doação das cepas de
taquizoítos de T. gondii, e, disponibilizando o Laboratório de Diagnóstico das
Parasitoses animais da Universidade Federal da Bahia (LDPA-UFBA).
Aos alunos de pós-graduação Rogerio Fernando de Jesus, Mulle Ribeiro Andrade.
A Capes pela bolsa e auxílio financeiro concedido para a realização deste trabalho.
As minhas amigas de pós-graduação Ticianna Conceição Vasconcelos, Marta Maria
Santana, Geyanna Dolores. Lopes. Agradeço a cada um que direta ou indiretamente
participou das atividades e da minha vida.
A todos os professores, colegas e funcionários do programa de pós graduação da Escola
de Medicina Veterinária, principalmente Angélica e Katia por serem amáveis, paciente
e compreensivas.
A todos do Laboratório Serviço de Imunologia das Doenças Infecciosas
Ao Mestre Faruck Zacarias pela grande parceira nesse projeto.
A EBDA por alojarem os animais e permitiram a realização desta pesquisa.
Ao Médico Veterinário da EBDA Rodrigo Bonfim Cruz que acamphou diariamnente os
animais.
“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo
expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito,
que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem numa
penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.
Theodore Roosevelt
LISTA DE TABELA
página
Tabela 1. Comparação do desempenho entre as técnicas ELISA e IFI na sorologia para
toxoplasmose através da detecção de IgG em amostras de 49 caprinos.........45
LISTA DE GUADRO
página
Guadro 1. Testes de diluições para padronização do ELISA...................................41
LISTA DE FIGURAS
página
Figura 1. Ultraestrutura de um taquizoíto Toxoplasma gondii....................................17
CAPÍTULO I
Página
Figura 1. Níveis séricos de IgG anti- T. gondii detectados no ELISA. Reações de 49
soros diluídos 1:100 com 20 soros de animais positivos ( ) e 29 soros de
animais negativos (■).....................................................................................45
Figura 2. Curva ROC obtida na padronização da técnica de ELISA para detecção de
IgG anti-T.gondii............................................................................................46
Figura3. Níveis séricos de IgG anti-T. gondii em caprinos infectados
experimentalmente com (105) taquizoítos por via endovenosa G1 (controle);
G2 (Cepa RH); G3 (cepa TOX 31).................................................................47
Figura 4- Dosagem de INF-y em sobrenadante de cultura de sangue periférico total
através do ELISA. Nível de IFN-y no sobrenadante de sangue periférico total
de três grupos de cabras cada um com 7 animais (controle negativo, inoculado
com RH e inoculado com TOX31) estimulados com: (A) PBS (10 µl); (B)
pokweed (10 µg9ml); (C) antígeno 1 (1 µg/ml); (D) antígeno 2 (2 µg/ml); (E)
antígeno 3 (3 µg/ml)........................................................................................48
Figura 5 A. Linfonodos submandibulares de animal inoculado com a cepa RH……..49
Figura 5 B. Linfonodos submandibulares de animal inoculado com a cepa TOX31.
Folículos linfoides reativos (H-E.X)…………………………………….50
Figura 6. Pulmão. Animal inoculado com a cepa RH. Intensa hiperplasia linfocítica
focal (BALT). H-E. X……………………………………………………….50
Figura 7. Coração. Animal inoculado com a cepa TX31. Miocardite linfocitária focal
aguda. H-E. X………………………………………………………………51
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ANOVA – Analysis of Variance
Células NK – células Natural Killer
D.O – Densidade Óptica
EBDA – Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola
ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Ensaio Imunoadsorvente ligado à enzima.
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
T. GONDII – Toxoplasma gondii
IgM- Imunoglobulina M
IgG- Imunoglobulina G
IgA- Imunoglobulina A
IgE- Imunoglobulina E
IFN-ɣ - Interferon gama
VP- Vacúolo parasitófago
IMC- Imunidade Celular
IL12- Interleucina 12
IL6- Interleucina 6
IL1- Interleucina 1
TNF α- Fator de necrose tumoral alfa
APCs- Células apresentadoras de antígeno
IFI- Reação de Imunofluorescência Indireta
IHA- Hemaglutinação Indireta
PCR- Reação em cadeia de polimerase
PBS – Phoshate Buffer Saline (Tampão fosfato-salina)
pH – Potencial de hidrogênio Iônico
Pg – Picrograma
µg –Micrograma
µl – Microlitro
UFBA – Universidade Federal da Bahia
DNA- Ácido dexorribonucléico
p.i- pós inoculação
PBMC – Peripheral Blood Mononuclear Cells. Células Mononucleares de sangue
periférico.
SUMÁRIO
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM CAPRINOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR
TOXOPLASMA GONDII Página
1.INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................14
2.REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................15
2.1 A IMPORTÂNCIA DA CAPRINOCULTURA..................................................15
2.2 AGENTE ETIOLÓGICO.....................................................................................16
2.3 CEPAS DE TOXOPLASMA GONDII..................................................................18
2.4 CICLO BIOLÓGICO ..........................................................................................19
2.5 TOXOPLASMOSE EM CAPRINO ....................................................................21
2.6 FATORES DE RISCO PARA OS REBANHOS CAPRINOS............................22
2.7 EPIDEMIOLOGIA E ENQUERITOS SOROLÓGICOS....................................23
2.8 ASPECTOS CLÍNICOS.......................................................................................25
2.9 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS...........................................................................27
3.DIAGNÓSTICO.......................................................................................................29
4. PREVENÇÃO E CONTROLE...............................................................................32
5.OBJETIVO GERAL.................................................................................................33
6.OBJETIVO ESPECÍFICO........................................................................................33
6.CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................70
7.REFERÊNCIAS.......................................................................................................71
8.ANEXO....................................................................................................................86
CAPITULO I
Avaliação da resposta imune em caprinos infectados experimentalmente por
Toxoplasma gondii
ABSTRACT.................................................................................................................34
RESUMO.....................................................................................................................36
INTRODUÇÃO...........................................................................................................37
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................39
ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................................44
RESULTADOS............................................................................................................44
DISCUSSÃO................................................................................................................51
CONCLUSÃO..............................................................................................................58
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................60
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE EM CAPRINOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR TOXOPLASMA
GONDII
RESUMO
Toxoplasma gondii é considerado uma das principais causas de aborto infeccioso em
caprinos. Como coccídeo formador de cistos teciduais, constitui um problema de saúde
pública, uma vez que pode ser transmitido ao homem através do consumo de carne e
leite contaminados. O objetivo desse estudo foi investigar aspectos da resposta imune
humoral e celular em caprinos infectados experimentalmente com cepas TOX 31 e RH
de T. gondii. Comparou-se a eficiência dos métodos de ELISA indireto e
Imunofluorescência Indireta (IFI) na detecção de anticorpos IgG específicos. Para
avaliar a resposta imune celular, quantificou-se a concentração de IFN-gama nos
sobrenadantes de cultura das células do sangue periférico. Ao todo foram utilizados 21
caprinos sem raça definida divididos em três grupos: um controle e dois grupos
experimentais infectados com as cepas RH e TOX 31, respectivamente. A cinética da
resposta imune humoral à infecção experimental foi avaliada através de anticorpos
específicos. A comparação da proficiência entre o ELISA e o teste padrão ouro, IFI,
apresentou sensibilidade de 70% e uma específicidade de 96,5%, demonstrando a boa
eficiência do ELISA para detectar os verdadeiros negativos, isto é, diferenciar os
animais infectados daqueles sem infecção. Em ambos os grupos de animais infectados
observou-se uma rápida resposta imune humoral, com uma soroconversão para
anticorpos da classe IgG no 15° dia, com níveis séricos máximos de anticorpos
específicos aparecendo no sexagésimo dia após a infecção. Em relação a resposta imune
celular, a estimulação “in vitro” com os antígenos contendo diferentes concentrações de
proteína, induziram alta produção de IFN-gama nos animais infectados com ambas as
cepas. Embora o antígeno nas três concentrações tenha estimulado a síntese e secreção
dessa citocina em animais infectados, apenas as concentrações com 1 e 2 µg de antígeno
do lisado total de T. gondii produziram resultados estatisticamente significativos. As
células dos animais não infectados após estímulo antigênico frente às três diferentes
concentrações apresentaram baixa produção de IFN-gama. O estudo histopatológico dos
linfonodos submandibulares dos animais infectados com T. gondii apresentaram
hiperplasia linfóide folicular discreta e hemorragia subcapsular, que coincidiu com os
resultados sorológicos.
Palavras chave: Citocinas, Anticorpos, Infecção experimental, Toxoplasma gondii,
Caprino.
RESPONSE EVALUATION OF IMMUNE IN GOATS EXPERIMENTALLY
INFECTED WITH TOXOPLASMA GONDII
SUMMARY
Toxoplasma gondii is considered one of the main causes of infectious abortions in
goats. As coccidia forming tissue cysts, is a public health problem, since it can be
transmitted to humans through the consumption of contaminated meat and milk. The
aim of this study was to investigate aspects of the humoral and cellular immune
response in infected goats experimentally with strains 31 and TOX T. gondii RH. It
compared the efficiency of indirect ELISA and indirect immunofluorescence (IIF) on
detection of specific IgG antibodies. To evaluate the cellular immune response was
quantified the concentration of IFN-gamma in the culture supernatants of peripheral
blood cells. Altogether we used 21 goats mongrel divided into three groups: one control
and two experimental groups infected with the RH strain TOX and 31, respectively. The
kinetics of humoral immune response to experimental infection was assessed using
specific antibodies. Comparison between ELISA proficiency and gold standard test IFA
showed a sensitivity of 70% and a specificity of 96.5%, showing good efficiency
ELISA to detect true negatives, i.e., to differentiate infected animals from those without
infection. In both groups of animals infected observed rapid humoral immune response,
with seroconversion to IgG antibodies on day 15 with peak serum levels of specific
antibodies appearing on the sixtieth day after infection. Regarding the immune
response, stimulation "in vitro" with the antigens containing different protein
concentrations induced a high production of IFN-gamma in animals infected with both
strains. Although the antigen in three concentrations has stimulated the synthesis and
secretion of this cytokine in infected animals, only concentrations at 1 and 2 ug total of
antigen T. gondii lysate produced statistically significant results. The animal cells
uninfected after antigenic stimulus front at three different concentrations showed low
production of IFN-gamma. Histopathological study of the submandibular lymph nodes
of animals infected with T. gondii had mild follicular lymphoid hyperplasia and
subcapsular hemorrhage, which coincided with the serological results.
Keywords: Cytokines, Antibodies, Experimental infection, Toxoplasma gondii, Goat.
14
1. INTRODUÇÃO GERAL
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório, causador da
toxoplasmose no ser humano e em outros animais (TENTER et al., 2000; DUBEY,
2009a). T. gondii tem distribuição cosmopolita, podendo causar infecção antes ou após
o nascimento, com cerca de um terço da população mundial possivelmente infectada
(DUBEY e BEATTIE, 1988). Os felinos domésticos e selvagens são os hospedeiros
definitivos, os demais mamíferos são hospedeiros intermediários, e peixe, anfíbios,
répteis e aves também podem ser infectados. (DUBEY, 1996; DUBEY, 2009a).
Algumas espécies, incluindo cabras, podem desempenhar um papel importante
na transmissão da toxoplasmose, uma vez que cistos em carne mal cozida e taquizoítos
no leite não pasteurizado podem representar uma importante fonte de infecção por T.
gondii para a população humana, caracterizando, a transmissão zoonótica (CHIARI e
NEVES, 1984; BISSO et al., 2000). As perdas econômicas na caprinocultura devem-se
a aborto, anomalias fetais e a uma variedade de defeitos congênitos causados pelo T.
gondii (BUXTON, 1998). De acordo com Denkers e Gazzinelli (1998), o T. gondii
caracteriza-se por ativar uma marcante resposta imune celular, desta forma a
sintomatologia clínica no homem e em outros animais depende principalmente da
resposta imune notadamente celular e da virulência da cepa de T. gondii (LUFT et al.
1984).
O diagnóstico da toxoplasmose aguda é difícultado pela variedade de sinais
clínicos que se assemelham a outras doenças (HURT e TAMMARO, 2007; SANTONI
et al., 1993). Alguns métodos laboratoriais imunológicos e moleculares têm sido
utilizados para o diagnóstico da infecção por T. gondii. Os métodos sorológicos, como
teste de hemaglutinação indireta, teste de aglutinação em látex, imunofluorescência
indireta, ensaio imunoenzimático (ELISA) são os imunoensaios mais comumente
usados (BEGHETTO et al., 2006; MONTOYA, 2002; REMINGTON et al, 2004).
Apesar da importância do estudo da resposta imune humoral na toxoplasmose,
há pouca informações disponíveis sobre algumas espécies domésticas, como por
exemplo, as cabras. Desta forma descobertas em uma espécie não podem ser
extrapoladas para os outras, por que a resposta humoral pode ser afetada por alguns
fatores inerentes ás características genéticas de cada espécie animal (WARE e
15
KASPER, 1987) a infecção no estágio agudo ou crônico (VERHOFSTEDE et al., 1988)
ou o estatus imunológico (LAPPIN et al., 1993).
Sendo assim o objetivo do presente trabalho foi investigar aspectos da resposta
imune humoral e celular em caprinos infectados experimentalmente com cepas TOX 31
e RH de T. gondii.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A importância da caprinocultura
A cabra foi o primeiro animal domesticado pelo homem para produzir alimentos,
leite e carne, há cerca de 9.500 anos no Oriente, desde então, espalharam-se pelo
mundo. Os caprinos são animais de característica dócil e de fácil manejo, pouco
exigentes qualitativa e quantitativamente em termos alimentares, são adaptáveis a
praticamente qualquer clima, altitude, latitude e longitude terrestres (MAZOYER et al.,
2010).
O efetivo caprino era de 8,779 milhões em 2013, com crescimento 1,5% em
relação ao ano de 2012. O Brasil é o 17º criador mundial de caprinos, em termos
regionais o Nordeste apresenta 91,4% dos rebanhos nacionais e a Bahia o estado com o
maior plantel, de 28%. (IBGE, 2013).
A caprinocultura é uma importante fonte de recurso econômico no Brasil, sendo
que no nordeste estes animais estão concentrados no semiárido, o qual abrange uma área
de 166,3 milhões de hectares (CONAB, 2006; IBGE, 2013). A criação desses animais
tem importância social e econômica para os ecossistemas desta região, dadas ás poucas
alternativas econômicas para o semiárido brasileiro. Esta espécie animal apresenta uma
grande capacidade de adaptação e resistência à seca, o que os tornou uma importante
fonte de renda para os produtores baianos (LIMA e BAIARDI, 2007).
A caprinocultura é reconhecida como uma atividade economicamente viável,
sendo responsável por geração de emprego e de renda, inserção de pequenos
produtores no mercado, redução do êxodo rural, dentre outros aspectos (LÔBO, 2003).
As condições de manejo sanitário precário das criações de caprinos, paralelo á
ausência ou uso inadequado de tecnologias de manejo dos rebanhos, constituem as
principais causas da baixa produção, da mortalidade de animais e da pequena
16
rentabilidade para os caprinovinocultores da região semiárida do Brasil (PINHEIRO et
al., 2000).
Para o pequeno produtor as perdas econômicas na caprinocultura causadas pela
toxoplasmose podem ser devastadoras, principalmente nas áreas semiáridas, pois a
caprinocultura constitui-se um instrumento gerador de emprego e renda no campo
(GRACIA-VASQUEZ et al, 1993).
2.2 Agente etiológico
T. gondii é um protozoário intracelular obrigatório de distribuição cosmopolita
que invade vários tecidos e células de animais homeotérmicos, exceto hemácias
(DUBEY et al., 1985; DUBEY e BEATTIE, 1988; DUBEY e ADAMS, 1990; WON e
REMINGTON, 1993; DUBEY, 1998; TENTER et al., 2000; DAVIDSON, 2000; HILL
et al., 2002).
Segundo Levine et al. (1980) o protozoário pertence ao Filo Apicomplexa,
Classe Sporozoea, Ordem Eucoccidiida, Família Sarcocystidae, Sub-família
Toxoplasmatinae, Gênero Toxoplasma e Espécie Toxoplasma gondii é de extrema
importância médica e veterinária (MUNDAY e MASON, 1979).
O T. gondii possui uma maquinaria celular endocitica exclusiva que permite a
entrada do parasita na célula nucleada, sua replicação e propagação. Possui estruturas
comuns às demais células animais, como mitocôndria, retículo endoplasmático e
complexo de Golgi. Na sua estrutura possui três tipos de organelas secretoras existentes
no complexo apical: micronemas, roptrias e grânulos densos, importantes para os
processos críticos e no estabelecimento de uma infecção produtiva (AJIOKA et al.,
2001). As micronemas estão envolvidas na fixação e penetração do T. gondii. Roptrias
são necessárias para a criação de uma estrutura enzimática e vacúolo parasitóforo. Os
grânulos densos secretam proteínas durante a maior parte das diferentes fases do
parasita; o processo de secreção dessas proteínas coincide com a formação de uma rede
intravacuolar. A entrada do parasita na célula leva de 15-20 segundos, figura 1
(AJIOKA et al., 2001; SAFFER e SCHWARTZMAN, 1991).
17
Figura 1. Ultraestrutura de um taquizoíto Toxoplasma gondii.
Fonte: AJIOKA et al., 2001.
Embora o parasita seja intracelular, os taquizoítos podem sobreviver por breves
períodos nos líquidos intersticiais e esxudatos, como saliva, urina e leite de cabras
(CHIARI, 1981; CHIARI e NEVES, 1984; VITOR et al., 1991).
Os taquizoítos apresentam-se em forma de arco com a parte externa posterior
arredondada e a anterior afilada, sendo a forma evolutiva do parasita menos resistente e
podendo ser destruído facilmente pelas condições ambientais adversas, bem como pela
desidratação, enzimas proteolíticas : tripsina e pepsina e variações osmóticas (JACOBS
et al., 1996).
Do ponto de vista médico, a fase de taquizoíto é importante, por que o parasito
fica vulneravél aos fármacos (ACHA e SZYFRES, 1986). VERONESI e FOCACCI
(1996) explicam que os taquizoítos são organismos de rápida proliferação conhecidos
como formas proliferativas, característica de infecção aguda (GROSS et al., 2004).
A invasão da célula pelos taquizoitos é extremamente rápida, durando de 15 a 40
segundos, sofrendo influência da concentração de íons extracelulares, da motilidade do
taquizoíto e de seus produtos secretados (SAFFER e SCHWARTZMAN, 1991;
MORISAKY et al., 1995). Espalham-se pelos diversos tecidos do hospedeiro
preferencialmente células do sistema nervoso central, olho, músculo esquelético e
músculo cardíaco. Em resposta a ação do sistema imune do hospedeiro os taquizoítos se
convertem nas formas bradizoítos e ficam confinadas no interior de cistos teciduais,
18
principalmente em tecidos do sistema nervoso central, olho e tecidos musculares
(MONTOYA e LIESENFELD, 2004).
O T. gondii tem como hospedeiros definitivos mamíferos carnívoros
pertencentes à família Felidae, nos quais ocorrem as fases sexuadas e assexuadas do seu
ciclo de vida (TENTER et al., 2000). Porém possui uma grande variedade de
hospedeiros intermediários como os animais homeotérmicos, incluindo aves e alguns
mamíferos sejam eles domésticos, silvestres, selvagens ou marinhos, além de seres
humanos (FIGUEIRÓ-FILHO et al., 2005). Já foi demonstrado em animais
pecilotérmicos, como peixes, anfíbios e répteis, embora não se conheça a viabilidade do
parasita nestes animais e a importância dos mesmos no seu ciclo de vida (DUBEY e
BEATTIE, 1988; DUBEY et al, 2003b). Moluscos pode atuar como transportadores de
oocistos T. gondii (ARKUSH et al., 2003; LINDSAY et al., 2004; MILLER et al.,
2008).
Existem inúmeros relatos de infecção pelo T. gondii em mamíferos marinhos,
incluindo golfinhos, focas, baleias (DUBEY et al., 2003c). No entanto, a forma como os
mamíferos marinhos são infectados ainda é desconhecida. Provavelmente a infecção
ocorra pela ingestão de oocistos diretamente da água do mar ou a ingestão de tecidos de
animais contendo oocistos (MILLER et al., 2002a).
2.3 Cepas de Toxoplasma gondii
As cepas de T. gondii são divididas em dois grupos, as cepas dominantes com
genótipos já identificados, e as cepas exóticas ou atípicas, cujo genótipo difere das
cepas dominantes (VILLENA et al., 2004; SU et al., 2012). A gravidade dos quadros
clínicos desenvolvidos pelas cepas de T. gondii estão associadas com fatores próprios de
virulência, e com a capacidade de interferir de diferentes formas nas sinalizações
intracelulares do hospedeiro ( HUNTER e SIBLEY, 2012). Em algumas circunstâncias,
a toxoplasmose pode ocorrer em graus variáveis de morbidade, podendo ocasionar
sequelas graves e doenças fatais, como acontece com cepas de maior virulência, uma
carga infectante maior, uma via de penetração mais favorável e um hospedeiro com suas
defesas orgânicas deficientes (DUBEY, 1987).
A capacidade de promover quadro infeccioso ou resistir à infecção tem
associação com a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos de evasão utilizados
19
pelas diferentes cepas de T. gondii (MILLER et al., 2009; MELO et al., 2011). Na
década de 80, estudos realizados utilizando diferentes técnicas biológicas, bioquímicas e
moleculares, visando a caracterização das cepas deste parasito, demonstraram evidência
de que este organismo possui linhagens clonais de cepas muito virulentas e de baixa
virulência (JONHSON, 1997).
O T. gondii é capaz de expressar diferentes antígenos de superfície (SAG)
localizados na membrana do parasito, os quais são codificados por genes de cópia única e
que têm um importante papel nos mecanismos de escape ao sistema imune do hospedeiro,
patogênicidade e de invasão do parasito (TOMAVO et al., 1991). As cepas isoladas do T.
gondii são classificadas em uma das três linhagens clonais (I, II, III) (SAEIJ et al., 2005).
A determinação da patogenia das cepas foi realizada em camundongos, as cepas tipo I
(RH, CAST e VEL) possuem alta virulência, causando infecções letais nesses animais.
As do tipo II (ME49, PDS e PLK) são consideradas de moderada virulência e as do tipo
III (CEP e VEG) são de baixa virulência, já que a infecção causada por este tipo clonal é
controlada pelo sistema imunológico dos camundongos e a infecção tende a cronificar
(BOOTHROYD e GRIGG, 2002; SAEIJ et al., 2005; STUTZ et al., 2012). As cepas
diferenciam-se genotipicamente entre si em apenas 1% ou menos (SU et al., 2006).
Linhagens de T. gondii atípica ou com nova combinação de alelos têm sido isoladas de
animais em alguns continentes como América do Sul e África (AJZENBERG et al., 2004;
LEHMANN et al., 2004).
2.4 Ciclo biológico
O ciclo biológico do T. gondii se dá com quatro formas de desenvolvimento:
taquizoítos (formas livres), merozoítos (duas a quatro gerações dentro dos enterócitos
do felino), bradizoítos (formas presentes em cistos teciduais) e esporozoítos (formas
presentes nos oocistos) (FERGUSON, 2009).
Em relação a reprodução existem duas fases distintas : assexuada e sexuada
sendo que no hospedeiro intermediário só ocorre a sexuada (GANGNEUX e DARDÉ,
2012). Os felinos são considerados hospedeiros defintitivo, mamíferos, aves e outros
animais são considerados hospedeiros intermediários (DUBEY, 2004; NEVES, 2005).
20
Material fecal de felinos com oocistos contendo esporozoítos e cistos presentes
na carne com bradizoito são ingeridos por um hospedeiro definitivo, no estômago a
parede do cisto é digerida pelas enzimas proteolíticas, levando ao seu rompimento e
liberação das formas de bradizoítos, e inicia-se a fase de reprodução assexuada rápida,
por esquizogonia, que resulta na formação dos esquizontes e liberação dos merozoítos.
Estes invadem as células epiteliais intestinais transformando-se em taquizoitos,
multiplica localmente e são disseminados no corpo através do sangue ou linfa (DUBEY,
1998).
Depois de alguns poucos ciclos de multiplicação, taquizoítos dão origem a
bradizoítos em uma variedade de tecidos (DUBEY, 1993; DUBEY et al., 1998). Os
esporozoítos desenvolvem-se nos esporocistos, dentro dos oocistos e são eliminados
pelas fezes dos felinoss (DUBEY, 1987), únicos animais capazes de eliminar oocistos
de T. gondii nas fezes (DUBEY et al., 1998).Uma infecção aguda num felino pode
eliminar aproximadamente 100 milhões de oocistos por dia. Cada oocisto em condições
de temperatura ambiente e umidade irá esporular e produzir dois esporocistos, contendo
quatro esporozoítos, que são altamente infectantes e podem permanecer no ambiente por
vários anos, podendo ser ingerido por outros animais e pelos seres humanos
(MONTOYA e LIESENFELD, 2004).
No ambiente, em condições ótimas de temperatura, umidade e oxigenação,
ocorre o processo de esporogonia, por meio dos quais os oocistos se tornam infecciosos
após 1-5 dias da eliminação, podendo permanecer viáveis no solo por períodos
indeterminados (TENTER et al., 2000).
MILLER et al., (1972) provaram que os únicos mamíferos capazes de suportar o
ciclo sexuado intestinal do T. gondii e excretar os oocistos são os felinos, tanto
domésticos quanto selvagens. Gatos liberam oocistos após a ingestão de qualquer um
dos três estágios infecciosos de T. gondii, isto é, taquizoítos, bradizoítos e esporozoítos
(FRENKEL et al., 1970), FRENKEL, (1979) elucida que os oocistos representam a
fase sexuada do agente.
Os hospedeiros intermediários como homem e animais, adquire infecção através
da ingestão de oocistos eliminados pelos felinos que iram contaminar o solo, manciais
de água e alimentos a exemplo de frutas e verduras. Outra meio de infecção é a ingestão
de cistos teciduais presente em carnes cruas ou mal cozidas, os líquidos biológicos
21
como saliva, leite, esperma, infecções transplacentarias e transplante de órgãos
(FERREIRA e ÁVILA, 2001; MONTOYA e LIESENFELD, 2004).
Após infecção do hospedeiro intermediário com qualquer forma infectante de T.
gondii, ocorre a multiplicação dos taquizoitos que contínua persistente dentro da célula
hospedeira até que ocorra sua ruptura e liberação invadindo outras células, e este ciclo
continua até o desenvolvimento da imunidade contra o parasito (TENTER et al., 2000).
Os mecanismos imunológicos irá diminuir a quantidade de parasitos circulante
no organismos; taquizoítos remanescentes evoluem para bradizoítos com formação de
cistos teciduais caracterizando a fase crônica se estendendo por toda vida em
hospedeiros imucompetente (MONTOYA e LIESENFELD, 2004; NEVES, 2005).
2.5 Toxoplasmose em caprino
Os felinos são os hospedeiros definitivos e algumas outras espécies são
hospedeiros intermediários, incluindo caprinos que podem desempenhar um papel
importante na toxoplasmose humana uma vez que cistos teciduais presentes na carne
mal cozida ou possivelmente taquizoítos no leite não pasteurizado facilitam a
transmissão zoonótica (CHIARI e NEVES, 1984; SACKS et al., 1982).
FELDMAN e MILLER (1956) descreveram uma das primeiras evidências da
ocorrência de toxoplasmose em rebanhos caprinos no estado de Nova York, E.U.A.
Os australianos foram os primeiros a demonstrar a toxoplasmose como uma
importante causa para os problemas reprodutivos em caprinos. Casos confirmados de
perdas reprodutivas após a infecção com T. gondii em caprinos tem sido relatadas em
várias partes do mundo. Entre os animais domésticos, os caprinos são mais suscetíveis
(DUBEY e BEALTTIE, 1988).
A alta soroprevalência para anticorpos anti-T. gondii no Brasil destacou a
necessidade de incluir o protozoário entre as causas de perdas reprodutivas em
rebanhos caprinos (PESCADOR et al., 2007).
A toxoplasmose em caprinos pode levar a perdas através da esterilidade, aborto,
natimorto, nascimento de crias fracas e mortalidade, entretanto a presença de anticorpos
anti-T.gondii sem associação com problemas clínicos é achado comum em qualquer
22
espécie (DUBEY et al., 1980; CALAMEL e GIAUFFRET, 1975; RUPPANNER et al.,
1978). Os animais podem morrer de enterite e encefalite, e os órgãos onde são
comumente encontrados os cistos nestes animais naturalmente infectados são:
músculo esquelético, cerebro, coração, diafragma, fígado, rins, (DUBEY, 1987;
KANETO et al., 1997).
A toxoplasmose congênita nos seres humanos, ovelhas, cabras pode levar a
morte do feto, a aborto, mal formações congênitas com manisfestações precoce ou
tardia (DUBEY, 1993; DUBEY et al., 1998).
2.6 Fatores de risco para os rebanhos caprinos
Os principais fatores de risco para infecção pelo T. gondii em caprinos são:
idade, o índice pluviométrico, alta umidade e a temperaturas amenas nas regiões onde
os rebanhos são mantidos. (PUIJE et al., 2000; JITTAPALAPONG et al., 2005). As
temperaturas amenas e a umidade favorecem a esporulação e a sobrevivência de
oocistos e coccidios (DUBEY et al., 2007). As condições clímaticas, em particular
chuvas, muitas vezes são responsáveis pelas diferenças na prevalência da infecção pelo
T. gondii, uma vez que os oocistos sobrevivem mais tempo em local fresco e em
condições úmidas (BISSON et al., 2000).
As cabras são animais muito susceptíveis à infecção com T. gondii em relação
aos outros animais de abate (DUBEY e BEATTIE, 1988). A prevalência de
toxoplasmose em caprinos é maior em animais mais velhos, atingindo igualmente
machos e fêmeas, com maior frequência nos rebanhos leiteiros em relação ao de
exploração mista, sendo este parasito mais patogênico para animais jovens do que para
animais adultos (DUBEY et al., 1985; DUBEY, 1987; DUBEY, 1989; DUBEY, 1990;
DUBEY e ADMS, 1990; OPEL et al., 1991; PANDEY e VAN KNAPEN, 1992).
Os oocistos eliminados nas fezes de felídeos são infectantes por até 18 meses,
quando protegidos da dessecação e luz solar (BUXTON, 1998). A falta de
suplementação mineral dos animais, provavelmente é um fator de risco para infecção
por T. gondii, pois está relacionada com a queda das defesas orgânicas animais
suplementados apresentam maior imunocompetência do que os não suplementados
(ASHBURN et al., 1992).
23
Fatores de estresse, incluindo superpopulação, tempo frio, antibióticos,
imunossupressores e dieta contendo micotoxinas podem reativar a forma subclínica da
infecção por T. gondii em cordeiros (DUBEY, 2009, 2010). Taquizoítos já foram
isolados da mucosa vaginal, saliva, secreção nasal e urina de caprinos
experimentalmente infectados via mucosa vaginal, oral e intramuscular (GALUSO et
al., 1970).
Oocistos de Toxoplasma gondii pode sobreviver por anos no solo, e até 54 meses
em água fria (DUBEY, 1998), de modo que a água não filtrada pode estar contaminada
com T. gondii. A água contaminada com T. gondii tem o potencial de propagar a
infecção para um grande número de pessoas, como ilustrado por focos no Canadá
(BOWIE et al., 1997) e Brasil (MOURA et al., 2007).
2.7 Epidemiologia e Inqueritos Sorológicos
A infecção por T. gondii foi identificado pela primeira vez em coelhos no
Instituto Biológico São Paulo, Brasil (SPLENDORE, 1908; ACHA e SZZYFRES, 1986)
e, no mesmo ano na Tunísia no roedor Ctenodactylus gondii (NICOLLE e MANCEAUX,
1909).
FELDMAN e MILLER (1956), estudando rebanhos caprinos nos Estados
Unidos, encontraram a primeira ocorrência nesta espécie. A associação sexo e idade
para T. gondii tem sido objeto de estudo, porém os resultados variam entre autores
(RUPPANNER et al., 1978; CHHABRA e MAHAJAN, 1982).
A prevalência do T. gondii em produtos derivados de animais é mais
significativa nos suínos, ovinos e caprinos, respectivamente (GARCIA et al., 1999). A
toxoplasmose nos pequenos ruminantes encontra-se distribuída mundialmente sendo a
espécie caprina como hospedeira mais sensível do parasita. No Brasil sua distribuição
abrange todos território nacional, e variações observadas na soroprevalência podem
estar relacionadas a fatores epidemiológicos regionais, climáticos, a aspectos sócios
econômicos e nutricionais, a idade, sexo, manejo do rebanho, contato com os animais
domésticos em especial o gato, e a acurácia dos testes aplicados na sua determinação
(TENTER et al., 2000; DUBEY, 1990; SILVA et al., 2003ª).
24
Apresentando grande impacto no setor pecuário caprino e de agronegócios, a
toxoplasmose está associada a perdas econômicas, além do risco para saúde humana
(DUBEY e THULLIEZ, 1989; BUXTON, 1990).
Dubey et al., (1981) relataram um surto de toxoplasmose congênita em
caprinos nos Estados Unidos as matrizes apresentavam títulos de 1:2048 dois dias
após o aborto. A maioria dos dados epidemiológicos sobre infecções por T. gondii em
cabras são produzidos com testes sorológicos, como IFI e ELISA. Estudos
moleculares também estão disponíveis, geralmente para investigação de causa de
natimortos ou fetos abortados (TENTER et al., 2000; DUBEY e SCHARES, 2006;
DUBEY et al., 2007).
Diversos inquéritos sorológicos já foram realizados no Brasil, com variação na
soropositividade de 28,9% a 92,4% nos rebanhos, mostrando uma alta prevalência
(CHIARI e NEVES 1984; MACHADO e LIMA 1987; SELLA et al., 1994). Assim, os
testes de imunodiagnóstico laboratorial adquirem uma grande importância em estudos
epidemiológicos (TENTER et al., 2000; DUBEY e SCHARES, 2006; DUBEY et al.,
2007).
De acordo com Tenter et al. (2000), em 1990-1999 a soroprevalência para
toxoplasmose caprina variou de 0% no Paquistão a 77% na França. Recentemente, uma
prevalência de 12,3% foi observada na Sardenha, Itália (MASALA et al., 2003), 30% no
Irã (SHARIF et al., 2007) e 74,8%, na Etiópia (TESHALE et al., 2006). No Irã,
estudando-se 638 caprinos, 19,25% eram positivos para anticorpos anti-T. gondii,
(HASHEMI-FSEHARKI, 1996). A grande prevalência para toxoplasmose caprina pode
ser constatada nos locais onde a cabra representa a maior fonte de alimento de origem
animal, a exemplo da Índia, já que a ingestão de carne ou leite contaminados com o T.
gondii é uma das principais fontes de infecção para o homem (SHARMA e GAUTAN,
1972).
No Brasil, inquéritos sorológicos mostram soroprevalência que variam entre
10% e 92,14% (AMARAL et al., 1978). Em Porto Alegre, RS inquéritos
epidemiologicos relataram a presença de anticorpos anti-T. gondii em 16,1% dos
caprinos estudados (CHIARI et. al., 1987).
Através da técnica de Hemaglutinação Indireta (HAI), verificou-se uma
frequência de 19,4% de soropositividade (70 animais) e pela IFI, de 30% (108)
25
(MACIEL e ARAÚJO, 2004). Gondim et al. (1999) encontraram prevalência de
28,93% de anticorpos anti-Toxoplasma gondii utilizando o teste de aglutinação ao látex
(LAT), em soros de 439 caprinos procedentes de duas regiões de características
climáticas distintas, na Bahia.
Pescador et al. (2007) associaram a infecção por Toxoplasma gondii com perdas
reprodutivas em rebanho caprino no Rio Grande do Sul, identificando abortamento,
fetos natimortos ou que morriam logo após o parto.
No que diz respeito à região sudeste, em Minas Gerais, Machado e Lima (1987)
apontam 36,8% de caprinos soros positivos em 46 propriedades estudadas, com taxa de
36,1% entre os rebanhos leiteiros e 11,4% nos animais de corte, enquanto no estado do
Rio de Janeiro foi descrita uma prevalência de 15,85% para toxoplasmose em caprinos
(FREIRE et al., 1994). Alves et al. (1997) testaram amostras de soros caprinos
provenientes de diferentes regiões da Paraíba verificando uma variação na frequência de
anticorpos anti-T. gondii oscilando de zero a 26,0% Mainardi et al. (2000)
demonstraram a presença de anticorpos anti-toxoplasma gondii por meio de IFI nos
animais de todas as propriedades leiteiras de sete diferentes municípios do estado de
São Paulo (14,47% dos 442 caprinos estudados). Mais recentemente, Cavalcante (2004)
observou, através da IFI e ELISA, que 25,1% e 25,7% dos caprinos do Ceará eram
positivos para a infecção por T. gondii.
2.8 Aspectos clínicos
Hospedeiros, incluindo felinos e humanos podem adquirir infecção por T. gondii
por diversos meios, tais como pela ingestão acidental de oocistos infectantes presentes
nos alimentos, ou na água contaminada com fezes de gato, por ingestão de carne crua ou
mal cozida contendo cistos com bradizoítos, leite não pasteurizado, transplante de
órgãos, transfusão de sangue, pois, nesse caso os parasitas estão no interior de
leucócitos e pela placenta na transmissão vertical ou contato direto com fezes de gatos
infectados ou ainda pela ingestão de oocistos esporulados na água ou nos alimentos
(CHU, 1999; MASCHKE et al., 1999; MARTINO et al., 2000).
26
A Toxoplasmose é uma zoonose capaz de causar danos graves em fetos
humanos ou animais e em indivíduos imunodeficientes, levando a manifestações
sistêmicas extremamente graves (DUBEY, 2009).
A transmissão congênita é importante, tanto para a saúde pública quanto para a
sanidade animal, e pode ocorrer quando fêmeas não infectadas contraem a
toxoplasmose durante a prenhez (HILL e DUBEY, 2002) sendo observados os
mesmos sinais sintomas clínicos em animais e humanos (JACOBS, 1963).
Em humanos geralmente a doença é assintomática ou está associada com
sintomas clínicos leves, inespecíficos. Porém em indivíduos imunocompetentes a
patogênese da toxoplasmose é resultado direto do efeito citopático, que incluem:
capacidade de invadir células, habilidade de utilizar substratos da célula hospedeira para
sobrevivência, multiplicação e persistência proliferativa ou cística infectante
(FRENKEL, 1961).
A patogenia da toxoplasmose em caprinos adultos está relacionada com sistema
reprodutor, podendo ocasionar esterilidade, abortos, morte embrionária precoce ou
mortalidade neonatal (DUBEY e BEATTIE, 1988) reabsorção fetal, fetos mumificados
ou macerados, nascimento de filhotes prematuros e fracos, podendo causar a morte de
cabras jovens e adultas devido às complicações recorrentes (DUBEY, 1987; DUBEY e
ADAMS, 1990), contudo a presença de anticorpos anti-T. gondii sem associação com
problemas clínicos é um achado muito comum (BAHIA, 1993; MACHADO e LIMA,
1987).
Os sinais clínicos da toxoplasmose caprina incluem febre, diarréia, dispnéia,
apatia, edema, icterícia, congestão pulmonar, infarto renal, anorexia, encefalite, nefrite,
hepatite, abomasite necrosante, enterite, cistite e pneumonia (MEDHI et al., 1983;
DUBEY, 1987; DUBEY e LAPIN, 1998), porém, pode assumir quadros clínicos
facilmente confundidos com uma gama de outras enfermidades, dificultando a tomada
de medidas específicas de tratamento e controle (VIDOTTO, 1992). A morte está
associada a lesões fibro-necróticas, necrose focal de linfonodos mesentéricos, sendo a
gravidade do quadro proporcional ao tamanho do inoculo utilizado experimentalmente
(DUBEY, 1989).
27
2.9 Aspectos imunológicos
A imunidade protetora contra o T. gondii é composta por mecanismos inatos,
humorais e celulares.
As células do sistema imune que controlam o parasita num primeiro momento
são monócitos e macrófagos, com o auxílio de anticorpos específicos da classe IgM e
IgA, caracterizando a fase aguda da doença seguida a produção de IgG que pode
persistir por longo tempo. Os linfócitos T efetores e auxiliares completam o conjunto de
mecanismos imunes da resposta ao T. gondii (CAMARGO, 1995). Embora as células da
imunidade inata ativadas por IFN-gama sejam importantes para o controle da infecção
as células imunes inatas, incluindo neutrófilos, monócitos e células dendríticas, também
podem servir como veículos para a disseminação sistémica do parasita no início da
infecção (WALWYN at al., 2015).
Os macrófagos são normalmente capazes de fagocitar e matar micróbios, mas,
no caso da toxoplasmose, taquizoítos são capazes de invadir os macrófagos e
multiplicar-se (DENKERS, 2003). A multiplicação de taquizoítos no interior de
macrófagos pode ser inibida por ambos os mecanismos dependentes e independentes de
oxigênio, incluindo um mecanismo ativado pelo Interferon Gama (IFN-) (McCABE e
REMINGTON, 1986; MAUEL, 1984; MURRAY et al., 1985), experimentos in vivo
confirmam o papel crucial do IFN- na inibição da proliferação de parasitas (SUZUKY
et al., 1988).
A fase aguda da doença caracteriza-se pela produção de imunoglobulinas de
isotipos M e A, seguida da produção de IgG de baixa avidez e em baixa concentração. O
aumento dos títulos de IgM é de curta duração com IgA desaparecendo antes dos
anticorpos IgM. A IgG aparece cerca de oito dias após a infecção, podendo ser
detectada nos testes sorológicos enquanto durar a infecção, ou seja, durante toda vida do
animal (KAWAZOE, 2005). As IgG podem persistir com altos títulos e com alta
afinidade por longo tempo caracterizando a fase crônica da doença (CAMARGO, 1995;
CHEMELLO et al., 1998).
Na infecção humana apesar da IgM anti-T. gondii ser considerada o principal
marcador sorológico para diagnósticos de infecções recentes, a literatura relata níveis
persistentes dessa imunoglobulina por meses após a primoinfecção (FERREIRA e
CAMARGO, 2002). Uma vez que o T. gondii é um parasito intracelular obrigatório, o
28
principal mecanismo de defesa contra esse patógeno é mediado pela resposta imune
celular (MAUBON et al., 2008).
Os linfócitos T são os principais mediadores da imunidade adquirida, sendo o
padrão Th1 estabelecido na resposta ao T. gondii quando há controle da infecção
(GAZZINELLI et al., 1992).
Com o ínicio da resposta imune do hospedeiro há o estabelecimento de uma
infecção crônica pela conversão de taquizoítas em bradizoitas, induzindo uma forte e
duradoura proteção imunológica para o hospedeiro (DENKER e GAZINELLI, 1998;
ROBERT-GANGNEUX e DARÉ, 2012)
Entre a população de células T, as células TCD8+ são consideradas as principais
células efetoras responsáveis pela proteção contra T. gondii. As TCD4+ do tipo Th1
exercem seu efeito protetor por meio da produção de IFN- e IL-12, por outro lado, as
do tipo Th2, como IL-4, IL-5 e IL-10, estão associadas à baixa regulação mediada por
células, portanto estas citocinas ajudam as células B na produção de anticorpos
(BHOPALE, 2003. GAZZINELLI et al., 1991).
As células natural killer (NK) também desempenham um papel importante no
controle da infecção. Macrófagos em animais imunes, possivelmente ativados por
citocinas derivadas de células T auxiliares respondem a antígenos de T. gondii,
aumentando a produção de citocinas pró-inflamatorias como Interleucina-12 e
Inteferon- Gama por essas células do sistema imuni inato (MILLER et al., 2009).
Linfocitos T e IFN- em ação conjunta são as principais ferramenta
imunológicas contra T. gondii (MOSMANN e COFFMAN, 1987; INNES et al., 1995;
INNES e WASTLING, 1995).
Assim o controle da infecção aguda causada pelo Toxoplasma, inicialmente,
deflagra resposta inata, seguida por resposta adquirida antígeno-especifica após as
células apresentadoras de antigenos (APCs) apresentarem antigenos para as células T
durante a fase indutora e efetora das respostas imune mediada por células que é
particularmente crítica para resolução da infecção por taquizoitos (VERHELST et al.,
2014).
Algumas espécies, tais como ratos e galinhas, exibem um alto grau de resistência
natural, a idade também se constitui em um fator importante para a resistência natural,
29
sendo que os animais jovens, nas diferentes espécies, apresentam-se mais susceptíveis
ao T. gondii (DUBEY, 1993).
3. DIAGNÓSTICO
O diagnóstico clínico da toxoplasmose é dificultado pelas características
assintomáticas da patologia que em muitos casos pode assemelhar-se a outras doenças
(DEROUIN e GARIN, 1992). Os sinais clínicos da toxoplasmose nem sempre são
evidentes, segundo Lappin et al. (1993) existe uma combinação entre as informações
clínicas e dados laboratoriais para diagnosticar a enfermidade FRENKEL (1997).
Grande parte das infecções pelo toxoplasma são sub-clínicas e o diagnóstico é
usualmente baseado no critério imunológico (HURT e TAMMARO, 2007; SANTONI e
SANTONI-WILLIAMS, 1993).
A Toxoplasmose possui diagnósticos diretos, que por serem dificeis necessitam
da confirmação de provas diretas como inoculação em animais de laboratório ou cultura
celular, sendo assim faz-se necessário a utilização de técnicas sorológicas (DEROUIN e
GARIN, 1992). O diagnóstico pode ser realizado pela demonstração direta, busca e
isolamento do coccídio. O método parasitológico só pode ser realizado nos hospedeiros
definitivos os felinos. Oocistos de amostras ambientais como a água, podem ser vistos
pelos métodos de flutuação e confirmados com inoculação em camundongos (ISAAC
RENTON et al.,1998; DUMÈTRE e DARDE, 2005, 2007).
As técnicas sorológicas habitualmente utilizadas para o diagnóstico da
toxoplasmose são: Dye test, Imunofluorescência Indireta (IFI), Aglutinação Direta e
Enzime-Linked Imunosorbent Assay (ELISA indireta clássica) (DESMONTS et al.,
1981, 1985; CHOI et al., 1992). estas técnicas utilizadas complementarmente
aumentam a sensibilidade dos resultados, chegando até 89,5% (SAVVA et al., 1990;
GROVER et al., 1990; PRATLONG, 1996).
A detecção de taquizoítos na corrente sanguínea por métodos parasitológicos
convencionais, como o exame microscópio diretos ou cultura é inviável, pelas
características do ciclo biológico de T. gondii, dificultando o conhecimento da sua
cinética na corrente sanguínea in vivo (SILVA e CHIOCCOLA, 2010).
O emprego de técnicas diagnósticas de elevadas especificidade e sensibilidade é
fundamental para o diagnóstico da toxoplasmose, assim como a adoção de medidas que
30
visem o controle dessas enfermidades em animais de produção. Diversas técnicas têm
sido desenvolvidas nas últimas décadas com o objetivo de facilitar um diagnóstico
etiológico da infecção e a determinação da fase da infecção do indivíduo. O ELISA e a
Imunofluorescência Indireta são os métodos sorológicos mais empregados para a
detecção de anticorpos anti-T. gondii (CAMARGO, 1974).
Os ensaios imunoenzimáticos (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)
são atualmente os mais utilizados em sorologia para vários agentes infecciosos,
incluindo o T. gondii, em humanos, sendo a sensibilidade alta e sua realização pode ser
através de automação (SUKTHANA, 2006).
Por meio dos ensaios imunoenzimáticos, podem ser detectados anticorpos
específicos de diferentes isotipos (IgG, IgM, IgA e IgE) no soro ou em outras amostras
biológicas, como saliva, leite (colostro), líquor e líquido amniótico (REMINGTON et
al., 2004). Casos de toxoplasmose aguda podem ser identificados usando anticorpos
secundários específicos para o isotipo da cadeia pesada das diferentes classes de
imunoglobulina (IgM, IgA) que indicam infecção recente (DECOSTER, 1997).
Os métodos sorológicos ainda representam a base do diagnóstico e do controle
da toxoplasmose (MORRIS e CROXSON, 2004). A sorologia pode ser útil, mas sua
interpretação pode ser difícil, pois são baseados, na detecção de anticorpos do isotipo
IgG, o que indica somente o contato prévio ou a exposição ao parasita. Caso ocorra a
necessidade de confirmar uma infecção recente ou ativa por sorológia, é necessário a
demonstração de altos e crescentes títulos de anticorpos IgG específicos em amostras
pareadas de soro com intervalos de 2-4 semanas (DUBEY, 1987) ou demonstração de
anticorpos IgM específicos em uma única amostra de soro (CAMARGO et al., 1978).
A inoculação em camundongos para isolamento de T. gondii é considerada mais
sensível quando comparada com a cultura celular, porém necessita de um maior cuidado
com a dose inoculada, via de administração e virulência do parasito (DEROUIN et al.,
1987).
As técnicas moleculares têm grande utilidade para a identificação de agentes
infecciosos em tecidos e secreções de animais, possibilitando, em particular, a
identificação de RNA ou DNA específicos de organismos, informações estas que não
podem ser obtidas por meio dos testes imunológicos ou morfológicos (SINGH, 1997).
31
A PCR tem sido uma importante ferramenta para a detecção e diferenciação de
parasitos. Tem sido amplamente difundida, pela sua alta sensibilidade e especificidade,
e por ter a capacidade de detectar o DNA dos parasitos em diferentes tecidos, em fezes e
fluidos corpóreos (SINGH, 1997; SLAPETA et al., 2002a; SLAPETA et al., 2002b;
SREEKUMAR et al., 2003b; SERRANO-MARTINEZ et al., 2007). A técnica de
biologia molecular, PCR, pode demonstrar a presença do parasito em tecidos e liquidos
corporaís como: liquido amniótico, liquor, sangue cordão umbilical, LCR, saliva, leite,
escarro, medula óssea, cortes de placenta, baço, fígado, músculo e linfonodos (GOMES,
2004)
O teste da Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) tem sido utilizado
amplamente para detecção de anticorpos anti-T. gondii em humanos e animais
utilizando um anticorpo espécie-especifico, microscópio para fluorescência e
treinamento técnico para leitura das lâminas (TETI et.al., 1981; VIDOTTO et al., 1990;
GARCIA et. al., 1999). O IFI é considerado padrão ouro mundialmente para o
diagnóstico da toxoplasmose animal (VIDOTTO et al., 1990; GARCIA et al., 1999).
A aglutinação modificada (MAT) é um teste que apresenta elevadas sensibilidade
e especificidade com grande praticidade, pois não necessita de equipamentos
sofisticados e não requer o emprego de um conjugado espécie-específico, podendo ser
utilizado em qualquer espécie animal. Ele tem sido utilizado para o diagnóstico
sorológico de T. gondii em diversas espécies animais e humanos (FENAUX et al., 2005;
SILVA et al., 2007; FORNAZARI et al., 2009; OKSANEN et al., 2009).
Outro teste é o Western blotting com elevadas sensibilidade e especificidade,
sendo particularmente útil na pesquisa de antígenos específicos de T. gondii e
N.caninum, podendo ser utilizado como exame diagnóstico, teste de imunização ou para
a identificação de proteínas dos agentes para a utilização em outros testes diagnósticos,
como os diferentes tipos de ELISAs (AGUADO-MARTINEZ et al., 2005; SILVA et
al., 2007; ANDREOTTI et al., 2009).
32
4. PREVENÇÃO E CONTROLE
É de extrema importância à redução de oocistos T. gondii no ambiente, assim
risco de toxoplasmose pode ser reduzido (DUBEY, 2006). O controle desta parasitose
inclui medidas profiláticas que impeçam a disseminação de oocistos esporulados para
tanto deve ser proíbido acesso de gatos aos alimentos para animais, pois, a
contaminação de qualquer ingrediente contendo fezes de felinos com T. gondii
misturada a ração tem o potencial para disseminar rapidamente a infecção dentro de um
rebanho. Atenção também deve ser dada para garantir que a água não seja contaminada
com fezes dos felinos, evitando o acesso desses animais, principalmente filhotes em
propriedades. A água deve ser filtrada normalmente por sistemas municipais que
operam filtragem de água. Em países desenvolvidos utiliza-se a coagulação, floculação,
sedimentação antes da filtração (BETANCOURT e ROSE, 2004; HILL e DUBEY
(2002), recomendam que para o consumo de carne de qualquer animal um cozimento
por no mínimo oito minutos a 67ºC, e que as facas e mãos devem ser imediatamente
lavadas com sabão e água após manusear carne crua. Os cistos teciduais em carne
podem ser mortos por congelamento a uma temperatura de 13ºC por ao menos por oito
minutos. A infecção de animais de produção com T. gondii também tem implicações
para a saúde pública, pois o consumo de carne mal cozida infectada com o parasita pode
facilitar a transmissão zoonótica (BISSON et al., 2000; BUXTON et al., 2007; DUBEY,
2009a,b). O controle da eliminação de oocistos por gatos domésticos reduziria a
transmissão da infecção para seres humanos e animais, porém acabar com o ciclo
natural, mantido por felinos, é impraticável (FRENKEL, 1990).
33
5. OBJETIVO GERAL
Investigação da resposta imune humoral e celular em caprinos infectados
experimentalmente com T. gondii, através da titulação de IgG espécifica e da dosagem de
IFN-gama em cultura de células com e sem estímulo antigênico respectivamente.
6. OBJETIVO ESPECÍFICO
1. Avaliar a cinética da resposta imune humoral através de títulos de IgG específica
para T. gondii.
2. Investigar a resposta imune celular através da dosagem de Interferon-gama em
sobrenadante de cultura de células de caprinos infectados e não infectados e de
demais animais controle com duas cepas do parasito.
3. Comparar as técnicas de ELISA e IFI na detecção de anticorpos IgG anti T. gondii
em caprinos.
34
CAPITULO I
Avaliação da resposta imune em caprinos infectados experimentalmente por
Toxoplasma gondii
Francilene Silva Santos.1, Fernanda Washington de Mendonça Lima4 Geyana Dolores Nunes.1,
Joelma Nascimento de Souza.2, Neci Matos Soares3, , Luis Fernando Pita Gondim5, Ticianna
Conceição de Vasconcelos6, Eduardo Luiz Trindade Moreira7
ABSTRACT- Santos F.S., Nunes G.D., Souza J.N, Soares N.M., Mendonça – Lima
F.W., Gondim L.F.P, Vasconcelos T.C., Moreira L.T. [Response evaluation of
immune in goats experimentally infected with Toxoplasma gondii.] Avaliação da
resposta imune em caprinos infectados experimentalmente por Toxoplasma gondii.
pesquisa veterinária brasileira 00(0):00-00. setor de serviço de imunológia das doenças
infecciosas, universidade federal da bahia, campus de fármacia, Rua Barão de
Jeremoabo n.147, Ondina, Salvador-Bahia 40.170-115Brasil email:
Abstract - The present study aimed to investigate the immune response in goats
experimentally infected with two strains of T. gondii evaluating the kinetics of humoral
and cellular immune responses by dosagen specific serum IgG and IFN- concentration
in culture supernatant mononuclear cells of goats, respectively. Initially compared the
efficiency of indirect ELISA and indirect immunofluorescence (IIF) for the detection of
IgG antibodies against T. gondii in goats. Were tested 49 serum samples from young
goats, SRD, males and females, the pillar district Jaguarari-BA, to standardize ELISA.
By ELISA, they were found 30.6% (15/49) of seropositive goats, and 68% (34/49)
negative. Compared to the IFI, it found 40.8% (20/49) of positive animals and 58%
(29/49) negative. Considering the IFI as a reference test, the ELISA showed 70%
sensitivity and 96.5% specificity. Titrated by ELISA the levels of specific IgG
antibodies in sheep experimentally infected with two strains. 21 SRD goats were used,
an average of a year old, seronegative for toxoplasmosis, allocated in EBDA the
experimental station in Pilar, Jaguarari -BA. Divided in three groups, G1 (PBS); G2
(RH strain); G3 (TOX31 strain) at 0, 15, 30, 60, 90, 120 and 150 days after infection.
35
Experimentally infected groups seroconverted on the 15th and specific IgG titers
continued to grow in the other assessments, reducing only on 120. The G1 did not
change significantly over time, while remaining negative throughout the experiment, the
G2 ( RH) strain had an increase in IgG levels greater than G3 (TOX31 strain). The RH
strain showed to be more immunogenic, inducing a response with the highest
concentration of IgG that TOX31. ELISA-IgG, standardized in this study, proved to be
efficient for the diagnosis of toxoplasmosis with a moderate positive correlation with
IFI-IgG test. The total lysate antigen of T. gondii 1 and 2, concentrations of 1 ug and 2
ug respectively induced a high production of IFN- in infected animals, the antigen
being statistically significant 1 and 2, both antigens induced more production of this
low- cytokine in uninfected animals. The animals infected with the RH strain produced
a cell response with higher concentrations of IFN- that TOX31 directly proportional to
the serum IgG levels obtained in the immune response against the HR strain and
TOX31, respectively. Histopathological study of the submandibular lymph nodes of
animals infected with T. gondii had mild follicular lymphoid hyperplasia and
subcapsular hemorrhage, which coincided with the serological results.
Keywords: Cytokines, Antibodies, Experimental infectiou, Toxoplasma gondii, Goat.
36
Resumo - O presente trabalho visou a investigação da resposta imune em caprinos
infectados experimentalmente com duas cepas de T. gondii, avaliando a cinética das
respostas imunes humoral e celular através da dosagen de IgG específica no soro e da
concentração de INF- em sobrenadante de cultura de células mononucleares de
caprinos, respectivamente. Inicialmente comparou-se a eficiência dos métodos de
ELISA indireto e Imunofluorescência Indireta (IFI) para detecção de anticorpos IgG
contra T. gondii em caprinos. Testaram-se amostras de soros de 49 caprinos jovens,
SRD, machos e fêmeas, no distrito de Pilar, Jaguarari-BA, para a padronização do
ELISA. Através do ELISA, foram encontrados 30,6% (15/49) de caprinos
soropositivos, e 68% (34/49) de negativos. Na comparação com o IFI, foi encontrado
40,8% (20/49) de animais soropositivos e 58% (29/49) negativos. Considerando a IFI
como teste de referência, o ELISA apresentou 70% de sensibilidade e 96,5% de
especificidade. Através do ELISA titulou-se os níveis de anticorpos IgG específica em
caprinos infectados experimentalmente com duas cepas do parasita. Foram utilizados 21
caprinos SRD, média de um ano de idade, soronegativos para toxoplasmose, alocados
na estação experimental da EBDA em Pilar, Jaguarari –BA. Divididos em três grupos,
G1 (PBS); G2 (cepa RH); G3 (cepa TOX31) nos tempos 0, 15, 30, 60, 90, 120 e 150
dias após a infecção. Os grupos infectados experimentalmente apresentaram
soroconversão no dia 15 e os títulos de IgG específica continuaram crescendo nas
demais avaliações, reduzindo somente no dia 120. O G1 não apresentou alterações
significativas ao longo do tempo, mantendo-se negativo durante todo o experimento, o
G2 (cepa RH) obteve aumento nos níveis de IgG maior que o G3 (cepa TOX31). A cepa
RH apresentou-se mais imunogênica, induzindo uma resposta com maior concentração
de IgG que a TOX31. ELISA-IgG, padronizado neste trabalho, mostrou-se eficiente
para diagnóstico de toxoplasmose apresentando forte correlação com o teste de IFI-IgG.
O antígeno do lisado total de T. gondii 1 e 2, concentrações 1 μg e 2 μg
respectivamente, induziram uma produção elevada de IFN- em animais infectados,
sendo estatisticamente significante o antigeno 1 e 2, mais ambos os antigenos induziram
baixa produção dessa citocina em animais não infectados. Os animais infectados com a
cepa RH produziram uma resposta celular com maiores concentrações de IFN- que a
TOX31 diretamente proporcionais aos níveis séricos de IgG obtidos da resposta
imunológica frente as cepas RH e TOX31, respectivamente. O estudo histopatológico
37
dos linfonodos submandibulares dos animais infectados com T. gondii apresentaram
hiperplasia linfóide folicular discreta e hemorragia subcapsular, que coincidiu com os
resultados sorológicos.
Palavras-Chave: Citocinas, Anticorpos, Infecção experimental, Toxoplasma gondii,
Caprino.
INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma zoonose importante tanto para medicina humana quanto
veterinária (BUXTON, 1990). A doença é causada por um protozoário coccídio
intracelular obrigatório, T. gondii que infecta seres humanos e muitos animais de sangue
quente, induzindo ao aborto e mortalidade neonatal em caprinos e ovinos (DUBEY e
BEATTIE, 1988).
O protozoário coccídeo Toxoplasma gondii constitui uma das principais causas
de aborto por infecção em caprinos. Além disso, a ingestão de carne e leite de animais
infectados é uma forma de transmissão de toxoplasmose para o homem (TENTER et al.,
2000; DAVIDSON, 2000).
O T. gondii é dividido em dois grupos de cepas, as dominantes, exemplo, cepa
RH com genótipos já identificados e as exóticas ou atípicas entre elas a cepa TOX31
com genótipo diferente das cepas dominantes (VILLENA et al., 2004; SU et al., 2012;
GONÇALVES et al., 2012). Frenkel et al. (1969) descrevem que a cepa RH é mais
utilizada em laboratórios de pesquisa no mundo. É conhecida pela sua alta virulência e
incapacidade de produzir cistos e oocistos em felinos (KAUFFMAN et al., 1958;
SABIN, 1941 ).
A cepa TOX31 é uma cepa ainda não genotipada encontrada em tecidos de
galinhas soropositivas para T.gondii. As amostras foram processadas e inoculadas
camundongos que soroconverteram e foram sacrificados para o isolamento “in vitro”
confirmando ser T. gondii por PCR espécie específico (GONÇALVES et al., 2012).
Métodos de diagnóstico imunológicos e moleculares tem sido utilizados para a
detecção da infecção por T. gondii; deles, os métodos sorológicos como teste de
hemoaglutinação indireta (HAI), teste de aglutinação em látex, imunofluorescência
38
indireta (IFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) são mais comumente usados (
BEGHETTO et. al., 2006; MONTOYA et. al., 2002; REMINGTON et al., 2004). Van
der Puije et. al. (2000) analisaram e relatou que as técnicas sorológicas IFI e ELISA tem
sido amplamente utilizada para detectar rebanhos contaminados por toxoplasma,
incluindo suínos e ovelhas.
Os casos de toxoplasmose aguda podem ser identificados usando marcadores
sorológicos (IgM, IgA) que indicam uma infecção recente (DECOSTER, 1997). Tanto
em humanos como em caprinos, a ferramenta mais utilizada para estabelecer o
diagnóstico sorológico da infecção recente é através da avaliação da avidez de IgG
específica. Recentemente, Medeiros e colaboradores no estudo realizado com rebanhos
caprinos leiteiros de diferentes regiões do Rio Grande do Norte, descreveram que cerca
de 15% dos animais tinham infecção aguda, sendo os demais portadores da infecção
crônica (MEDEIROS, et. al., 2014). Um diagnóstico sorológico adequado da
toxoplasmose é uma ferramenta importante para adoção de medidas sanitárias nos
rebanhos (CONDE et al., 2001).
Há poucas informações disponíveis sobre a resposta imune de algumas espécies
domésticas à infecção por T. gondii, como por exemplo em cabras. As descobertas dos
mecanismos imunes realizadas em uma espécie não podem, necessariamente ser
extrapoladas para outras, por que tanto a resposta humoral quanto a celular podem ser
afetadas por alguns fatores inerentes à espécie (CONDE et al., 2001; DUBEY E
JONES, 2008)
Nos anos 80, o IFN-γ foi identificado como o principal mediador de proteção
contra a infecção pelo T. Gondii, produzido por células T CD4 + e pelas células T CD8
+. Os linfócitos citotóxico CD8+ quando ativadas matam as células hospedeiras
infectadas com o parasita, ao passo que células CD4+ regulam a resposta imune ao T.
gondii (GADDI e YAP, 2007). Embora as células da imunidade inata mediada por IFN-
ɤ seja importante para o controle da infecção, essas células incluindo neutrófilos,
monócitos e células dendríticas, também podem servir como veículos para a
disseminação sistêmica do parasito no início da infecção (WALWYN et al., 2015).
Experimentos “in vivo “ confirmam o papel crucial do IFN- na inibição da proliferação
de parasitas (SUZUKY et al., 1988).
39
Investigar a resposta imune contra o T. gondii é importante para compreensão da
fisiopatogenia da doença e também para o desenvolvimento de estratégias de controle
imunoprofilático. Assim como também para fornecer subsídios para a formulação de
propostas em investigação farmacológicas, como o desenvolvimento de vacinas e
medicamentos, tanto no uso profilático quanto terapêutica.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e protocolo experimental
Foram selecionados 21 animais, todos sadios e com sorologia negativa em
duplicata no ELISA para T. gondii. A ausência de anticorpos contra T. gondii foi
avaliada através de ELISA Indireto padronizado e confirmada através de Imuno
fluorescência indireta (IFI), considerada padrão ouro para o diagnóstico sorológico da
toxoplasmose (DUBEY, 1990; FRENKEL, 1997).
Todos os animais foram examinados clinicamente antes e após a solução do
inóculo administrado por via intravenosa de 1mL (105 de taquizoítos) para infecção
experimental. Coletaram-se amostras de 6mL sangue periférico através da punção da
veia jugular dos caprinos no momento zero (antes da inoculação de T. gondii) e aos 15,
30, 60, 90, 120 e 150 dias pós-inoculação (p.i). De cada animal coletou-se sangue em
dois tubos: um sem anticoagulante para obtenção do soro e outro tubo contendo
heparina para sangue total. O soro foi utilizado para a dosagem de anticorpos e o sangue
heparinizado para a cultura de células mononucleares do sangue periferico e posterior
dosagem de IFN-gama no sobrenadante de cultura (MEYER et. a., 2005). Após a última
coleta, de sangue dois animais foram eutanasiados para obtenção de amostras
biológicas. Foram coletados fragmentos de pulmão, língua, coração, músculo
esquelético, linfonodo, fígado, baço, cérebro, cerebelo e medula espinhal e enviadas
para pesquisa de histopatológico, conforme literatura (DUBEY, 1987; KANETO et al.,
1997).
Todos os procedimentos experimentais com os animais foram aprovados pelo
Comitê de Ética e Cuidados da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal da Bahia sob o protocolo n 26/2003.
40
Cultivo de taquizoitos em celulas Vero para preparação do antigeno solúvel.
Os taquizoítos de Toxoplasma gondii, cepa RH, foram cultivados em
monocamadas de células Vero em meio RPMI com L-glutamina contendo 5% de soro
equino e antibiótico (penicilina e estreptomicina), em incubadora com 5% de CO2 a
37°C. Quando aproximadamente 80% das células estavam infectadas, os taquizoítos
foram removidos dos frascos, lavados com PBS e purificados através da passagem em
filtrosde 5µm. Os Taquizoítos inteiros foram utilizados na Reação de
Imunofluorescência Indireta. Para uso no ELISA, após a purificação mencionada
anteriormente, os taquizoítos foram lisados por meio de aparelho de ultra-som. Utilizou-
se freqüência de 40 Hertz, sendo cinco ciclos de um minuto cada, com pausa de um
minuto entre os ciclos, sempre em banho de gelo. A suspensão antigênica foi
centrifugada a 4.000 rpm, durante 30 minutos, à 4°C. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi coletado, dosado a concentração proteica (LOWRY, 1951), e
armazenado a - 20°C, até o momento do uso. Cada solução com aproximadamente
25.000 taquizoítos por microlitro, rendeu 2mL de suspensão antigênica, contendo
200µg/mL de proteína total.
Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI).
Lâminas de imunofluorescência foram previamente preparadas com taquizoítos
de T. gondii fixados. As amostras de soro foram diluídas em PBS na proporção 1:16,
sendo adicionados 10 µl da diluição em cada área da lâmina. Como controle negativo
utilizou-se soro de caprino antes da ingestão de colostro e como controle positivo o soro
de um caprino com título IFI (título 1:256).
Em seguida as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 30 minutos, a 37
ºC. Transcorrido este tempo, foram lavadas duas vezes com PBS e secadas em estufa a
37ºC por cerca de cinco minutos. Diluiu-se o anticorpo de anti-IgG caprina conjugado
com FITC (isotiocianato de fluoresceína) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO-USA) na
proporção 1:50 e colocaram-se 10 µl em cada área de reação. Após nova incubação por
30 minutos seguiu-se a lavagem e secagem conforme descrito anteriormente.
Adicionou-se glicerina e a lâmina foi coberta com lamínula para leitura do resultado em
objetiva de 40x no microscópio de fluorescência. Foi considerada como reação positiva
41
aquela onde mais de 50% dos taquizoitos apresentaram fluorescência esverdeada
periférica total. As amostras positivas foram posteriormente tituladas 1:16, 1:32, 1:64,
1:128 e 1:256. Também foi realizado paralelamente o teste de IFI com o parasito
Neospora caninum, para avaliar a possibilidade de reação cruzada com esta espécie.
Ensaio imunoenzimático (ELISA) para determinação do título de anticorpos IgG
anti-T. gondii.
Este ensaio foi baseado na metodologia de Carneiro (2006) com algumas
modificações realizadas após o seguinte ensaio piloto, sendo escolhidas as diluições
destacadas em negrito.
Quadro 1. Teste de diluições para confecção do ELISA.
Em seguida, foram utilizadas amostras de soro de 49 caprinos adultos e sem raça
definida, provenientes das cidades da Bahia de Curaçá, Sento Sé e Jaguarari. O
resultado deste ELISA foi comparado à IFI, para determinação do ponto de corte, da
sensibilidade e especificidade do teste. Placas de poliestireno com 96 poços foram
sensibilizadas com a solução antigênica (lisado total) de T. gondii na diluição de 10
µg/mL de proteína total (ou seja, foi colocado 1 µg por poço, diluído em 100 µL de
Antígeno 5μg/ml Antígeno 10μg/ml Descrição das amostras
Diluição 1:100
A 0,036 0,029 0,048 0,039
Branco
(só diluente = PBS+Tween+leite)
B 0,078 0,063 0,087 0,068
Controle Negativo
(Soro caprino pré-colostro)
C 0,727 0,402 1,110 0,608
Controle Positivo
(IFI positivo, título 1:256)
D 0,764 0,381 1,028 0,547
Controle Positivo
(IFI positivo, título 1:256)
E 0,457 0,281 0,645 0,299
Amostra C02
(IFI positivo 1:64)
F 0,522 0,193 0,689 0,347
Amostra C02
(IFI positivo 1:64)
G 0,085 0,071 0,108 0,083
Amostra G14
(IFI negativo)
H 0,076 0,068 0,098 0,084
Amostra G14
( IFI negativo)
Conjugado
1:5.000
Conjugado
1:10.000 Conjugado
1:5.000
Conjugado
1:10.000 Diluição do conjugado
42
solução tamponada carbonato-bicarbonato Ph 9,6), durante 18 à 20 horas, em câmara
úmida e com temperatura entre 4 e 8ºC. Transcorrido este tempo, os poços foram
lavados cinco vezes com solução de PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween).
O soro de cada caprino foi diluído na proporção de 1:100 em solução de PBS-
Tween contendo 0,25% de leite desnatado (PBS-Tween-Leite) e em seguida adicionou-
se 100 µL por poço dos soros diluídos. Cada amostra foi testada em duplicata na mesma
placa. Foram utilizados dois controles negativos, soro de caprino antes da ingestão de
colostro e soro de caprino negativo na IFI. Como controle positivo foi usada amostra de
caprino com sorologia positiva confirmada por IFI (título de 1:256), cedida pelo prof
Luís Fernando pita Gondim do Laboratório de Doenças Parasitariárias dos Animais-
UFBA. Realizou-se incubação durante uma hora em estufa a 37ºC, seguida de nova
lavagem com PBS-Tween.
Para revelar a reação antígeno anticorpo usou-se anticorpo de anti-Fc de
IgG caprina conjugado à peroxidase (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX-
USA) diluído 1:5000 em solução de PBS-Tween-Leite. Foram adicionados 100 µL do
conjugado diluido em cada poço. Após 45 minutos a 37ºC, os poços foram lavados
cinco vezes, desta vez com molho de 30 segundos em cada lavagem. Acrescentaram-se
100 µL por poço da solução de cromógeno e substrato enzimático (0,02g de orto-
fenilenodiamina - OPD em 20mL de tampão citrato-fosfato pH 5,6 e 20 µL de H2O2).
Após 30 minutos em temperatura ambiente, ao abrigo da luz e, foram adicionado 50 µL
em cada poço de H2SO4 para finalizar a reação. A densidade óptica (D.O.) foi medida
em aparelho leitor de ELISA 492nm.
Infecção experimental
Preparação das cepas de T. gondii para inoculação.
Taquizoítos de T. gondii da cepas RH, denominada de incompleta, pois, não
produz cistos e oocistos (Frenkel et al., 1969) e cepa TOX 31 ainda não genotipada e
isolada em galinhas no laboratório das Parasitoses dos Animais (LDPA) da
Universidade Federal da Bahia (UFBA) foram cultivados em monocamadas de células
Vero em meio RPMI com L-glutamina contendo 5% de soro equino e antibióticos
(penicilina e estreptomicina), em estufa com 5% de CO2 a 37°C. Quando
aproximadamente 80% das células apresentavam-se infectadas, os taquizoítos eram
removidos dos frascos, lavados com PBS e semi-purificados através da passagem em
filtros de 5µm. Realizou-se a contagem do número de taquizoítos em câmara de
43
Neubauer. Em seguida a suspensão de taquizoítos de cada cepa foi diluída de forma que
cada mililitro de PBS filtrado contivesse aproximadamente 100.000 (105) taquizoítos
(FRENKEL et al., 1969)
Inoculação de T. gondii em caprinos.
Foram selecionados 21 animais, todos sadios e com sorologia negativa para T.
gondii. Os 21 animais selecionados foram distribuídos em três grupos de sete animais
cada: G1 no qual foi administrado apenas 0,85% PBS, G2 onde cada animal recebeu
aplicação endovenosa de 105 taquizoítos de T. gondii da cepa RH e G3 que recebeu 105
taquizoítos da cepa isolada TOX31. Os animais foram avaliados utilizando o ELISA
padronizado, em 7 momentos diferentes (0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 dias após inoculo).
Determinação da concentração de IFN- γ em sobrenadante de cultura de células do
sangue periférico.
Esse ensaio foi realizado de acordo com a técnica desenvolvida por MEYER et
al. ( 2005) plaqueando sangue heparinizado dos animais de cada grupo em poços de
placas de cultivo celular (Costar®) de 24 poços. Um mililitro de sangue heparinizado de
cada animal foi colocado em cinco poços de placas de cultivo de 24 poços. No primeiro
poço, adicionou-se 10 µl PBS como controle negativo, no segundo utilizou-se do
mitógeno 10 µg Pokeweed como controle positivo, e nos poços seguintes três
concentrações do antígeno solúvel de T. gondii obtido conforme descrição anterior,
contendo 1, 2 e 3 µg de proteína / poço.
As placas foram incubadas por 48hs em estufa de CO² à 37°. Após este tempo, o
conteúdo de cada poço foi homogeneizado, colocado em microtubos e centrifugado. O
sobrenadante foi coletado, aliquotado e congelado à -20 °C até o momento da dosagem.
Os níveis de IFN-γ foram medidos através de Kit de ELISA comercial, desenvolvido
para caprinos (Catalogo E0049g - USCNLIFE), conforme orientações do fabricante.
44
Exame histopatológico
No final do experimento, após a avaliação dos níveis de anticorpos anti T.
gondii, um animal do grupo G2 e do G3, foram eutanasiado para pesquisa do paraisto
nos tecidos. Após avaliação macroscópica foram colhidos fragmentos de pulmão,
língua, coração, musculo esquelético, linfonodo, fígado, baço, cerebro, cerebelo, medula
espinhal e enviados para avaliação microscópica. Para análise histopatológica os tecidos
foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% à temperatura ambiente. Após
fixadas as amostras foram desidratadas através de soluções de alcool com diferentes
graduações antes de ser incorporadas em cera de parafina (PROPHET et al., 1992).
Secções de 4µm de espessura coradas pela técnica de Hematoxilina-Eosina (Luna,
1968), foram retiradas para análise posterior sendo examinadas por microscópio óptico
para detecção do parasita. (MORENO et al., 2012).
Análise estatística
Para a análise estatística da padronização do ELISA, dosagem de anticorpo IgG,
e de IFN-gama, os dados foram armazenados e calculados utilizando o programa
GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software, Inc, San Diego, Califórnia, EUA), As
comparações entre os grupos foi realizada utilizando one-way ANOVA e teste não-
parametrico KruskalWallis (GraphPad Prism 6.01). Foram consideradas diferenças
estatisticamente significantes quando o valor de p foi menor que 0,05. Todas as
probabilidades dos testes foram feitas para um nível de significância de 95%. A curva
ROC foi utilizada para avaliar a sensibilidade e especificidade do ELISA anti-T. gondii.
Resultados
Nas amostras avaliadas para padronização do ELISA Indireto neste trabalho
foram encontrados anticorpos para T. gondii em 30,6% (15/49) de caprinos
soropositivos, e 68% (34/49) de negativos. Na comparação com o IFI, foi encontrado
40,8% (20/49) de animais soropositivos e 58% (29/49) de negativos (tabela 1).
45
Tabela 1. Comparação do desempenho entre as técnicas ELISA e IFI na sorologia para
toxoplasmose através da detecção de IgG em amostras de 49 caprinos.
ELISA para
IgG
IFI Total
Positivo Negativo
Positivo 14 1 15
Negativo 6 28 34
Total 20 29 49
Na Tabela 1 e Figura 1, vemos que 6 animais apresentam resultados abaixo do
ponto de corte do ELISA. Já as amostras negativas pela IFI dos 29 pontos (cada ponto é
representado por um animal testado). Só um ponto está acima da linha. Já o valor da
sensibilidade não foi tão alto, pois, o ELISA falhou em identificar os seis pontos (seis
animais) com positivos. Significa que o ELISA só falhou em uma amostra, que deveria
ser negativa. Sendo uma falha pequena, por isso a especificidade deu elevada.
Figura 1- Níveis séricos de IgG anti- T. gondii detectados no ELISA. Reações de 49
soros diluídos 1:100 com 20 soros de animais positivos ( ) e 29 soros de animais
negativos (■).
Para calcular a sensibilidade e a especificidade para o teste de ELISA
padronizado, foi considerado como ponto de corte DO= 0,1495. Utilizando a IFI como
teste de referência, o ELISA apresentou 70% de sensibilidade e 96,5% de especificidade
46
(Figura 1 e 2). A definição do ponto de corte foi feita através da curva ROC obtida na
padronização do ELISA. A área calculada sob a curva (AUC) foi de 0, 90 (Figura 2).
Figura 2- Curva ROC obtida na padronização da técnica de ELISA para detecção de
IgG anti-T.gondii.
Os pontos destacados representam os pontos de corte utilizados para o cálculo da
sensibilidade e da especificidade. O ponto de corte para o ELISA foi definido
considerando a melhor otimização possível dos valores de sensibilidade e especificidade
do teste. Os cálculos da sensibilidade e especificidade foram feitos usando-se os
resultados do ELISA obtidos a partir dos 49 soros testados utilizando a IFI como padrão
ouro. No teste ELISA padronizado para o ponto de corte (0,1495) apresentou 70% de
sensibilidade e 96,5% de especificidade.
Foi realizado o teste de IFI para Neospora, para descartar a possibilidade de
reação cruzada com T. gondii, não sendo encontrando animal positivo no experimento.
Após a padronização da técnica foi avaliado o desenvolvimento da resposta
imune através dos títulos de IgG em caprinos infectados experimentalmente com duas
cepas distintas do T. gondii (Figura 3).
47
Figura 3- Níveis séricos de IgG anti-T. gondii em caprinos infectados
experimentalmente com (105) taquizoítos por via endovenosa . G1 (controle); G2 (Cepa
RH); G3 (cepa TOX 31).
DO
(4
92
- 6
30
nm
)
D0
D15
D30
D60
D90
D120
D150
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
C N
RH
T O X 31
*
*
**
#
* D ife re n ç a s ig n if ic a t iv a e m re la ç ã o a D 0 (p < 0 ,0 5 )
# D ife re n ç a s ig n if ic a t iv a e n tre D 1 5 e D 6 0 (p < 0 ,0 5 )
D ife re n ç a s ig n if ic a t iv a e n tre g ru p o s C N e R H (p < 0 ,0 5 )
*
*
As concentrações de INF- gama obtida nos diferentes momentos após a infecção
está descritas na Figura 4. A figura (4 A) representa o controle negativo, onde a
estimulação foi feita utlizando apenas o PBS. Observa-se uma variação do valor da
concentração ao longo dos dias pós-infecção, sendo que o valor máximo ocorre no dia
15, onde o grupo inoculado com TOX31 apresentou uma média de 85,9 pg/ml.
Na Figura (4 B) está demonstrado o controle positivo, onde as células foram
estimuladas com Pokeweed, similarmente observa-se um pico no dia 15, no entanto não
observou-se uma diferença entre os grupos.
Nas figuras 4C, 4D e 4E está demonstradas as células estimuladas com o
Antígeno lisado total de T. gondii (Ag) 1, Ag 2 e Ag 3µg/ml respectivamente. Foi
demonstrado que em todos os casos houve um pico de produção de INF-gama no dia
15, sendo que houve uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos
inoculados com as cepas RH e TOX 31 utilizando os antígenos 1 e 2 µg.
48
Figura 4- Dosagem de INF-gama (pg/mL ± desvio padrão) em sobrenadante de cultura
de sangue periférico total através do ELISA. Nível de IFN-y no sobrenadante de sangue
periférico total de três grupos de cabras cada um com 7 animais (controle negativo,
inoculado com RH e inoculado com TOX31) estimulados com: (A) PBS (10 µl); (B)
pokweed (10 µg/ml); (C) antígeno 1 (1 µg/ml); (D) antígeno 2 (2 µg/ml); (E) antígeno
3 (3 µg/ml).
No antígeno 1, no grupo inoculado com RH a média foi de 386,1 (SD 319,6)
pg/ml, já no grupo inoculado com TOX 31 e o controle negativo foi observado uma
concentração de 107,8 (SD 97,6) pg/mL e 100,4 (SD 135) pg/m, respectivamente. Esta
diferença foi estatisticamente significante (p<0,05).
O mesmo foi observado quando o mesmo grupo foi estimulado com o antigeno 2
(Figura 4). No entanto, não foi observada diferenças significativas nas concentrações de
IFN-gama dos grupos utilizando como estimulante o antígeno 3. Ademais foi observado
49
que ao longo dos dias, independentemete do antígeno usado para estimulação, houve
uma queda na produção de INF-gama. Essa queda foi acentuada, em todos os casos,
sendo que entre os dias 30 e 60, houve diferença estatisticamente significante (p<0,05).
A análise histopatológica de tecidos de dois animais eutanásiados, positivos no
ELISA com D.Os 1,467 e 1,859 não apresentaram alterações aparentes, exceto os
linfonodos submandibulares, os quais mostraram discreto aumento de volume.
A análise microscópica revelou, em ambos os animais, discreta a moderada
hiperplasia linfocítica folicular linfonodal (Fig.5 A e B) e intensa hiperplasia do tecido
linfoide peribronquial focal (BALT) com invasão da lâmina própria da mucosa
bronquial, naquele exposto à cepa RH (Fig.6). O animal inoculado com a cepa TOX31
apresentou discreto infiltrado inflamatório linfocítico focal na musculatura cardíaca com
dissociação de fibrocélulas (Fig. 7).
O exame histopatológico dos demais órgãos, não evidenciou processos reativos ou
alterações significativas
Figura 5A -Linfonodo submandibular de animal inoculado com a cepa RH. Moderada
hiperplasia linfoide folicular com centros germinativos ativos (setas). H-E. 10x.
50
Figura 5B -Linfonodo submandibular de animal inoculado com a cepa TOX31.
Discreta hiperplasia linfoide folicular com centros germinativos ativos (setas). H-E.
10x.
Figura 6. Pulmão. Animal inoculado com a cepa RH. Intensa hiperplasia linfocítica
focal (BALT) com invasão da lâmina própria. H-E. 10x.
51
Figura 7. Coração. Animal inoculado com a cepa TX31. Miocardite linfocitária focal
aguda. H-E. 40x.
Discussão
O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose ainda é realizado com base na
identificação e semi-quantificação de anticorpos específicos através da sorologia
(CARNEIRO, 1996). Segundo DUBEY (1990) e FRENKEL, (1997) o teste de IFI é
altamente específico e sensível, é quantitativo, pode ser automatizado e tem baixo custo
(DUBEY et al., 1995). Sendo assim, no trabalho foi possível padronizar uma técnica de
ELISA que apresentou uma sensibilidade relativa de 70%, porém uma especificidade
maior de 96%, podendo detectar os verdadeiramente negativos.
Foi encontrado maior número de animais soropositivos através da IFI do que
pelo ELISA. Ao compará-los, a especificidade do ELISA foi elevada, significando que
este teste apresenta boa capacidade para detectar os verdadeiros negativos, isto é, para
diagnosticar corretamente os sadios. Já a sensibilidade capacidade do teste em detectar
os animais verdadeiramente positivos - não foi tão alta, mostrando que o ELISA foi
mais propenso a fornecer resultados falso-negativos. Sendo sua utilização como um
método de triagem.
Desta forma o ensaio imunoenzimático, ELISA indireto, padronizado para
detectar IgG específica para T. gondii pode demonstrar que quanto maior a
especificidade de um teste, maior a capacidade do animal positivo indicar a doença, pois
52
diminui a probabilidade de falso positivo (GREINER e GARDNER, 2000). Este
resultado se mostra o inverso apresentado por Uchôa et al (1999) padronizaram um
ensaio imunoenzimático para pesquisa de anticorpos das classes IgM e IgG anti-
Toxoplasma gondii e compararam com a técnica de IFI em humanos. O ELISA
apresentou sensibilidade de 96,7% e especificidade de 75%.
Santos (2013) testando ovinos padronizou dois ensaios imunoenzimáticos,
utilizando a cepa RH e tendo como padrão ouro a IFI. Para o ELISA utilizou
glicoconjugados (GlyC) da superfície parasita (ELISA-LA) o qual apresentou
sensibilidade de 30% e especificidade de 94%. A técnica de ELISA utilizando lisado
antigênico total (ELISA-LA) apresentou sensibilidade100% e 96% de especificidade.
Verhelst et al., (2014), examinaram 3.170 amostras de soro de ovelhas para o anti-IgG
de Toxoplasma utilizando lisado total de antígeno para o ensaio adsorvente ligado à
enzima (ELISA) e compararam com outra técnica sorologia IFI, embora não tenhamos
encontrado 100% de concordância entre os dois testes, a literatura menciona estimativa
entre 90,1% e 97,8% para a sensibilidade e entre 85,9% e 96,4% para a especificidade
do ELISA (OPSTEEGH et al., 2010; SHAAPAN et al., 2008). A diferença entre os
resultados obtidos pela técnica de ELISA não é absoluta e sugere que estas diferenças
sejam devidas ao uso de diferentes antígenos utilizado. (VAN KNAPEN, 1984).
Significando que as diferenças entre os resultados obtidos pela técnica de ELISA
para sensibilidade e especificidade variam entre as diversas metodologias utilizadas,
assim como procedência do antígeno empregado no ensaio podendo ser de primeira,
segunda ou de terceira geração (SHAAPAN et al., 2008). Diversos estudos têm
comparado técnicas sorológicas de IFI e ELISA empregadas no diagnóstico da
toxoplasmose com grande eficiência (CAMARGO, 1995; SÁNCHEZ et al., 1985).
A definição do ponto corte foi feita através da curva ROC (receiver operator
characteristic) ou curva operacional relativa. A analise da curva ROC pode ser usada
tanto para examinar o desempenho de um teste diagnóstico quanto os possíveis valores
de ponto de corte, como para comparar diferentes testes diagnósticos a fim de escolher o
melhor. De acordo com gráfico descrito pela curva ROC, quanto maior a área definida
pela curva, ou seja, quanto mais próximo de 1 melhor será o teste (GREINER et al.,
1995 e KABA et al., 2001). No experimento o ponto de corte foi de 0,1495 e a área
sobre a curva UAC=0,90 demonstrando a validade do teste.
53
A soropositividade em caprinos e ovinos, com altos ou baixos títulos de
anticorpos anti-T. gondii foram registradas em vários países do mundo, e a variabilidade
entre os estudos pode ser explicada pela variação na sensibilidade e especificidade entre
as técnicas utilizadas (GHONEIM et al., 2010; SHAHIDUZZAMAN et al., 2011;
TZANIDAKIS et al., 2012).
Sendo assim, a técnica ficou padronizada em 1µg proteína total de antígeno para
sensibilização do poço, soro na diluição de 1:100 e conjugado em 1:5000, por estes
valores permitira melhor discriminação entre os resultados dos soros positivos e
negativos.
É importante contar com mais de um modelo para testar imunógenos, pois
diferentes espécies animais têm respostas imunes divergentes ao mesmo imunógeno
(GUPTA e SIBER, 1995). Poucos países no mundo monitoram regularmente
toxoplasmose em hospedeiros diferentes, incluindo seres humanos e em particular
animais, há poucas informações disponíveis sobre algumas espécies domesticas como
caprinos (TENTER et al., 2000).
Conde et al (2001) analisaram por ELISA Indireto e Western-blot (WB) a
resposta de IgG em caprinos experimentalmente infectados com taquizoítos por via
cutânea da cepa RH. Verificaram que anticorpos IgG foram detectados 14º dias p.i,
atingindo um pico no dia 35° p.i. mostram pequenas flutuações até o final do
experimento com 91 dias p.i.
Em outro trabalho, Vitor et al. (1999) estudaram soro de cinco cabras inoculadas
com a cepa C4 via subcutâneo de T. gondii pelas técnicas de Hemaglutinação Indireta,
Western blot, anticorpos foram detectados pelos ELISA 12° dia p.i, atingindo seu pico
entre os dias 19º e 62º persistindo durante o experimento.
Os resultados deste estudo corroboraram com os descritos por outros autores que
demonstraram que anticorpos IgG aparecem de 1 a 2 semanas após a infecção e
alcançam títulos altos 1:1000 em 6 a 8 semanas e depois caem lentamente e
permanecem baixos por toda a vida (LARSSON, 1989; MACEDO, 1994). Em ovinos
após infecção oral com oocistos foi verificada no 14° dia p.i (BLEWETT et al., 1983;
McCOLGAN et al., 1988; ESTEBAN-REDONDO e INNES, 1998).
D' ANGELINO e ISHIZUKA (1986) Através da técnica de IFI para IgG
específica, demonstrou anticorpos para os antígenos de superfície do T. gondii mais
54
precocemente que pela HAI. Observaram que quando testados por IFI os títulos
aumentam ao redor do 8° a 10° dia após a infecção e pela HAI, pós o 14° dia.
Santana et al., (2010) estudaram caprinos machos, em idade reprodutiva,
sorologicamente negativos para Toxoplasma gondii foram distribuídos em três grupos
de animais: GI (n = 2) controle (placebo), GII (n = 2) - infectado com 1 × 106
taquizoítos (cepa RH) e GIII (n = 2) infectado com 2 × 105 oocistos (cepa P). A
infecção por Toxoplasma induziu uma resposta imunitária rápida em cabras com
anticorpo anti-IgG detectado por IFI desde o dia 11 pi. Um início de resposta humoral
também foi detectado por Nishi et al. (2001) sobre dia 10 pi, demonstrada através de IFI
(anti-IgG) como teste.
Verhelst et al., (2014) observaram que em ovelhas infecdas com T. gondii por
via oral, os níveis de anticorpos IgG específicos aumentarem nos primeiros dias pós-
infecção (7, 8, 10 e 15 dpi). Este resultado está de acordo ao encontrado por McColgan
et al., 1987. Desta forma, pode-se observar que animais da mesma espécie e idade,
infectados com o mesmo parasito e com a mesma quantidade de inoculo, apresentaram
um aumento do nível de anticorpos IgG anti-T. gondii nos primeiros dpi, no entanto, em
tempos diferentes. Neste trabalho, o aumento ds níveis de anticorpos específicos
ocorreu no 15º dpi.
Este estudo analisou a síntese de interferon-gama, em caprinos infectados
experimentalmente com taquizoítos de T. gondii da cepa RH e TOX31 por via
intravenosa Na dosagem de INF-gama o controle negativo demonstrou uma variação no
valor da concentração ao longo dos dias pós-infecção, sendo que o valor máximo
ocorreu no dia 15 no grupo inoculado com RH e TOX31. No controle positivo
similarmente observou-se um pico no dia 15, no entanto não observou-se uma diferença
entre os grupos.
Nas células estimuladas com o Antígeno Ag 1, Ag 2 e Ag 3 demonstrou um pico
de produção de INF-gama no dia 15, sendo que houve uma diferença estatisticamente
significativa entre os grupos inoculados com as cepas RH e TOX 31 utilizando os
antígenos 1 e 2. Ademais foi observado que ao longo dos dias, independentemete do
antígeno usado para estimulação, houve uma queda na produção de INF-y. Essa queda
foi acentuada, em todos os casos, sendo que entre os dias 30 e 60, houve diferença
estatisticamente significante (p<0,05).
55
A importância econômica da doença e pela falta de conhecimento sobre sua
patogenia imune levou-nos a realizar pesquisas para entender melhor a relação
patógeno-hospedeiro. Miller et al., 2009 relata a importância da produção de IFN-gama
no controle da infecção aguda e crônica pelo T. gondi enfatiza que IFN-gama é
necessário para o controle de ambas infecção aguda e crônica com T. gondii. (Aliberti,
2005) observou que camundongos infectados com T. gondii, que não produz de IFN-
gama leva ao aumento da susceptibilidade à infecção aguda com mortes dos
camundongos devido proliferação esmagadora de taquizoítos do parasita (Gazzinelli et
al., 1994). O IFN-gama desempenha um papel na condução da fase de taquizoítos
encontrado em infecção aguda e para bradizoítos fase encontrado em infecção crônica
(Bohne et al., 1993). Além disso, o IFN-gama suprime conversão de bradizoítos em
taquizoítos durante a infecção crônica (JONES et al., 1986). Estudos anteriores em
camundongos demonstraram que a IL-12 é essencial para induzir a produção de IFN-
gama e proteção contra T. gondii. De fato, em IL-12p35 / p40 em camundongos
knockout, altera os níveis de IFN-gama estes foram severamente diminuídas e
Toxoplasmas gondii na fase de taquizoítos replicaram descontroladamente
desencadeando morte precoce dos camundongos causada por deficiência da IL-12
(SCHARTON-KERSTEN et al., 1996; VOSSENKAMPER et al., 2004). Por outro lado,
a administração de anticorpos anti-IFN-gama aos camundongos crônicamente
infectados observa uma rápida reativação da infecção e mortalidade subseqüente de
hospedeiros infectados (YAP E SHER, 1999). A infecção com Toxoplasma gondii
provoca a indução de uma imunidade mediada por células forte caracterizada por uma
resposta Th1 altamente polarizada, o que pode proteger contra a alergia (DHGONSKA),
2014.
No presente estudo, a produção de interferon-gama foi utilizado para avaliar a
resposta celular. Os grupos infectados experimentalmente apresentaram aumento dos
níveis de IFN-gama no dia 15º p.i, coincidindo com o aumento dos títulos de IgG
específica, porém após o décimo 15 dia suas concentrações declinaram ao contrário do
níveis séricos de IgG que continuaram crescendo nas demais avaliações, reduzindo
somente no dia 120° p.i. O G1 não apresentou alterações significativas ao longo do
tempo, e G2 (cepa RH) obteve aumento nos níveis de IFN-gama maior que o G3 (cepa
TOX31). Comparando o desenvolvimento da resposta imune de IgG podemos observar
56
que a cepa TOX 31 estimula menos a resposta imune do hospedeiro, ou seja, a cepa RH
deste parasita é mais imunogênica, induzindo a produção de maior concentração de
IFN-gama do que a cepa TOX31 em concordância com níveis de IgG.
Os resultados demonstram uma diferença significativa na capacidade entre duas
concentrações de antígeno para induzir uma resposta celular “in vitro”. Isto é, a
produção de IFN-gama foi elevada com células provenientes de animais infectados em
resposta ao antígeno com 1 e 2 µg, mostrado uma diferença significativa nas respostas
entre as duas concentrações de antígenos. O IFN-gama foi maior nos animais
infectados em resposta para o antígeno com 1 e 2, e baixa nos animais não infectados ou
seja, a diferença entre os resultados obtidos com diferentes concentrações de antígeno
revela padrões diferentes de capacidade de resposta imunológica. Verhelst et al.,( 2015)
estudaram ovelhas infectadas oralmente com 3000 cistos de tecido de T. gondii,
avaliando a resposta celular, observou que o aumento de IFN-gama ocorreu nas duas
semanas p.i. Estes experimentos são justificados por (Verhelst et al., 2014), relatando
que as respostas celulares ocorrer primeiro com interferão-gama (IFN-gama) atingindo
o pico em linfonodos mesentéricos e esplenocitos 4 dias após a infecção. Um segundo
pico ocorre 1-3 semanas mais tarde e é provavelmente devido a resposta de células T.
Em ovelhas, durante a fase aguda da infecção (4 dias pi), estudou-se as
quantidades de IFN-gama nos sobrenadantes produzidos seguintes reestimulação de
células mononucleares a partir de sangue, do baço, do duodeno, do jejuno e nódulos
linfáticos mesentéricos ileal, gânglios linfáticos poplíteos e a partir do duodeno, jejuno e
íleo remendos de Peyer com diferentes antigénios de T. gondii. Observou-se um
aumento precoce em IFN-gama, especialmente nos linfócitos dos nódulos linfáticos
mesentéricos, seguido por uma diminuição e um segundo aumento de 2-3 semanas pi
(Verhelst et ai., 2014).
A vacina viva (Toxovax1) é uma vacina desenvolvida para ovelhas, após a
inoculação subcutânea, taquizoítos S48 de T. gondii, vivos crescidas de cultura de
células realizadas passagem repetida em camundongos, durante muitos anos, a cepa
acabou perdendo sua capacidade de formar cistos teciduais (O'Connell et al, 1988;.
Wilkins et al., 1988;. Wilkins e O'Connell, 1992. Os taquizoítos são controlados pela
resposta imune do hospedeiro em 10 dias p.i (WILKINS e O'CONNELL, 1992,
BUXTON et al., 1991, 1993b, 1994). Corroborando com o presente trabalho que utiliza
57
taquizoítos vivo em caprinos da cepa RH e TOX31 por via intravenosa são controlados
pelo sistema imune. IFN-gama produzido no ínicio da infecção é provavelmente crucial
para induzir resistência contra o parasita (BHOPALE, 2003; GAZZINELLI et al.,
1994).
Sabe-se que o sistema imunológico humoral e celular trabalham suas respostas
juntas contra T. gondii. Sustentando que a imunidade mediada T helper 1 (Th1),
caracterizada por a produção de IFN-gama por linfócitos T CD4 + e CD8 +, é crucial na
prevenção contra o T. gondii (DENKERS, 1999; GAZZINELLI et al., 1993). Ovelhas
infectadas experimentalmente após a inoculação por via oral com 500 oocistos
esporulados de T. gondii da cepa M4, teve produção de IFN-gama analisados no
sobrenadante de polimorfonucleares e encontram-se aumentados, porém as ovelhas que
abortaram teve aumento significativo no dia 5 p.i.comparando com o grupo controle.
CASTAÑO et al., (2014). No entanto, o IFN-gama dosado no sobrenadante de
poliformonucleares de ovelhas infectadas com oocistos de T. gondii foi observado uma
resposta cerca de 10 dias p.i, corroborando com o presente estudo, apesar da diferença
de espécies relacionadas ou devido à infecção com diferentes cepas. No entanto, ambas
as espécies ovelhas e caprinos mostraram uma resposta de IFN-gama nas primeiras
semanas de infecção (VERHELST et al., 2015). O sucesso da infecção ou do combate
ao parasito está entre a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos de evasão
utilizados pelas diferentes cepas de T. gondii (MILLER et al., 2009; MELO et al.,
2011).
Em concordância com nosso trabalho, Berengo et al. (1969) e Cremers et al.
(1991) não encontraram Toxoplasma em esfregaços tecidos de ovinos e suínos,
enquanto Esteban-Redondo et al. (1999) relataram a dificuldade na detecção do parasita
em secções de tecido a partir de animais de produção, devido à baixa densidade de
microrganismos.
Conde et al. (2001) inocularam 2 x 106 taquizoítos de T. gondii cepa RH por via
subcutânea em 7 caprinos e após 91 dias quando foi realizado o exame histopatológico
foi observada processo inflamatório em linfonodos pré-escapulares e mesentéricos dos
animais infectado. Em um trabalho Dubey (1989) associou a morte a lesões fibro-
necróticas, necrose focal de linfonodos mesentéricos, sendo a gravidade do quadro
58
proporcional ao tamanho do inoculo utilizado experimentalmente, não visto durante o
experimento.
Em trabalhos com cordeiros infectados naturalmente com T. gondii, os exames
histopatológicos demonstraram miosite não-purulenta com cistos teciduais de T. gondii
no coração e na musculatura esquelética, vasculite necrótica grave e necrose multifocal
no cérebro, fígado e pulmões (ATMACA et al., 2012). Durante o experimento não
foram encontrados cistos teciduais nos animais necropsiados, o que pode ser justificado
pelo pequeno número de animais eutanasiados (2 animais), sendo que um destes foi
inoculado com a cepa RH. Segundo Frenkel et al., (1969) a cepa RH é a mais
comumente utilizada em vários laboratórios de pesquisa no mundo. É conhecida pela
sua alta virulência (Kaufman et al., 1958), (Sabin, 1941) e incapacidade de produzir
cistos e oocistos. Em experimentos os órgãos onde são comumente encontrados cistos
em animais naturalmente infectados são: músculo esquelético, cérebro, coração,
diafragma, fígado, rins (DUBEY, 1987; KANETO et al., 1997). Os animais do
experimento mesmo quantificando alta DO não apresentavam sintomatologia clínica
corroborando com a literatura que já descreve que a presença de anticorpos anti-T.
gondii sem associação com problemas clínicos é um achado comum (BAHIA, 1993;
MACHADO e LIMA, 1987). Em experimento com tecidos de 522 ovelhas positivas
testadas sorologimaente pelo IFI foi realizada a comparação entre as técnicas de
citologia, histopatologia, bioensaio em camundongos e a reacção em cadeia da
polimerase (PCR) para detecção de Toxoplasma gondii, apresentaram no
histopatológico de ambos tecidos de cérebros e diafragmas resultado negativo para
presença de cisto, bem como neste experimento (LANGONI e SILVA, 2001) .
Conclusões
- O teste de ELISA-IgG, padronizado neste trabalho, mostrou-se eficiente para a
triagem sorológica de animais para o diagnóstico da toxoplasmose, apresentando forte
correlação moderada com o teste de IFI-IgG.
- A especificidade do ELISA foi elevada, significando que este teste apresenta
boa capacidade para detectar os verdadeiros negativos, isto é, para diagnosticar os
59
sadios. Já a sensibilidade do teste em detectar os animais verdadeiramente positivos não
foi tão alta, mostrando que o ELISA foi mais propenso do que a IFI a fornecer
resultados falso-negativos.
- Todos animais infectados experimentalmente apresentaram resposta imune
humoral específica, evidenciada através de anticorpos anti-T. gondii, cuja soroconversão
observou-se no décimo quinto dia, com pico em torno da sexta a oitava semana
apresentando queda lenta até o final do experimento.
- A cepa RH deste parasita parece ser mais imunogênica, induzindo uma
resposta com maior produção de IgG do que a cepa TOXO31.
- O antígeno 1 e 2 induziram alta produção de IFN-gama nos animais infectados
com ambas as cepas, porém o antígeno1 e 2 e 3 induziram uma produção elevada de
IFN-gama em animais infectados, sendo estatisticamente significante os antígenos 1 e 2,
mas ambos os antígenos induziram síntese de baixas concentrações da citocina em
animais não-infectados.
- Dos picos de produção IFN-gama encontrados nos grupos de caprinos
infectados com T. gondii da cepa RH foram mais expressivos que os obtidos com a cepa
TOX31.
60
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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Embora exista uma vasta literatura sobre a sorologia de ruminantes sobre
toxoplasmose, a nossa compreensão sobre a imunidade de ruminantes ao parasita seja
limitada. O fato de Toxoplasma provocar aborto e infecção crônica ao longo da vida em
ovinos e caprinos, mas não em bovinos e veados (Dubey e Buxton, 1988), é uma
indicação de que existe diferenças na resposta imune e, é ainda fundamental que seja
definida a diferença imunológica, entre essas espécies. No entanto, em termos gerais, é
provável que a imunidade para ruminantes T. gondii será semelhante à de outras
espécies. Porém, ainda precisa ser feito, estas observações, pois a resposta imune em
caprinos é compatível com o encontrado em outras espécies. Onde T. gondii podem
estimular tanto a imunidade humoral e celular, concordando que anticorpos por si só
não é insuficiente para matar os organismos e que para controlar a infecção por
Toxoplasma gondii, linfócitos T efetores e auxiliares completam o conjunto de
mecanismos imunes da resposta ao T. gondii (Camargo, 1995), com produção de
citocinas, dentres estas, o IFN-gama desempenha uo papel crucial na inibição e controle
da infecção e proliferação de parasitas (SUZUKY et al., 1988). Os linfócitos T são os
principais mediadores da imunidade adquirida, sendo o padrão Th1 elegido na resposta
ao T. gondii (GAZZINELLI et al., 1992).
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86
ANEXO
Dias
pós-
infecção
Grupos Estimulador - média (SD)
Conrole
negativo
PW Ag1 AG2 Ag3
D0 Controle 15
(37,1)
455,74 (165,92)
4,97 (4,55)
21,03 (34,89)
13,96 (19,69)
RH 42,1 (47,6)
472,17 (131,17)
6,06 (9,17)
30,49 (34,26)
52,84 (64,45)
TOX31 17,4 (33,8)
418,32 (243,30)
15,63 (24,35)
50,77 (82,12)
74,60 (104,60)
D15 Controle 43,2
(8,1)
1146,22 (5,51)
100,45 (134,97)
105,77 (127,97)
231,93 (216,92)
RH 47,05 (8,1)
1146,71 (6,45)
386,11 (319,64)
452,03 (369,94)
432,27 (324,48)
TOX31 85,9 (112,7)
1133,85 (20,63)
107,89 (97,63)
171,13 (155,87)
273,51 (320,41)
D30 Controle 2,0 (3,6)
304,93 (49,43)
1,00 (2,66)
2,58 (5,17)
45,81 (79,13)
RH 0,87
(0,87)
286,21 (51,88)
2,16 (3,71)
93,23 (91,20)
64,01 (87,34)
TOX31 0,75 (2,01)
314,52 (56,25)
2,24 (3,83)
3,62 (4,39)
66,56 (110,79)
D60 Controle 0,68 (1,81)
219,77 (152,54)
0,000 (0,000)
7,03 (18,59)
3,99 (10,57)
87
RH 51,01
(70,63)
398,25 (242,57)
40,80 (54,71)
36,97 (51,90)
44,51 (44,25)
TOX31 31,84 (51,91)
56,25 (133,41)
20,77 (54,65)
31,97 (37,22)
22,11 (40,63)
D90 Controle 25,09 (38,46)
575,25 (119,74)
31,54 (43,80)
53,85 (65,90)
103,50 (134,31)
RH 7,09 (8,11)
528,68 (136,49)
73,920 (39,79013)
75,50571 (59,39876)
129,54 (96,68)
TOX31 14,60 (20,29)
462,14 (151,89
31,06 (45,67)
24,90 (26,56)
43,19 (60,51)
D120 Controle 11,46 (14,06)
611,38 (272,14)
31,53 (50,64)
19,72 (12,44)
96,18 (124,54)
RH 20,43
(31,46)
507,16 (346,54)
23,13 (31,93)
85,25 (75,87)
186,24 (164,93)
TOX31 10,11 (1,97)
666,46 (124,82)
16,96 (12,26)
38,71 (30,78)
37,55 (42,26)
Dias pós
infecção
Infecção experimental
Controle negativo Cepa RH Cepa TOX31
D0 0,069 0,071 0,068
D15 0,231 0,888 0,546
D30 0,109 1,179 0,599
D60 0,155 2,063 0,846
D90 0,097 1,197 0,490
D120 0,127 1,752 0,477
D150 0,135 1,625 0,526
![7 17 Ifi] bbl' UCH 17 17 Ifi] bbl' UCH 1](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5e3e165587e5c433c82c4919/-7-17-ifi-bbl-uch-1-7-17-ifi-bbl-uch-1.jpg)
