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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
FACULDADE DE FARMÁCIA
Mariana de Assis Crispi
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DE HIDRAZONAS SINTÉTICAS EM
LEISHMANIA AMAZONENSIS E SEUS EFEITOS SOBRE A MITOCÔNDRIA DO
PARASITO
Juiz de Fora
2018
Mariana de Assis Crispi
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DE HIDRAZONAS SINTÉTICAS EM
LEISHMANIA AMAZONENSIS E SEUS EFEITOS SOBRE A MITOCÔNDRIA DO
PARASITO
Monografia apresentada ao Departamento de Farmácia
da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito
para conclusão do curso de Farmácia.
Orientadora: Profa Dr
a Elaine Soares Coimbra.
.
Juiz de Fora
2018
Mariana de Assis Crispi
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DE HIDRAZONAS SINTÉTICAS EM
LEISHMANIA AMAZONENSIS E SEUS EFEITOS SOBRE A MITOCÔNDRIA DO
PARASITO
Monografia apresentada ao Departamento de Farmácia
da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito
para conclusão do curso de Farmácia.
Orientadora: Profa Dr
a Elaine Soares Coimbra.
.
Aprovada em 26 de junho de 2018
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Profa Dr
a Elaine Soares Coimbra - Orientadora
Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________________
Farmacêutica Ma. Stephane Lima Calixto
Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________________
Bióloga Ma. Juliana da Trindade Granato
Universidade Federal de Juiz de Fora
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus pelo dom da vida, por ter me concedido saúde e
sabedoria para chegar até aqui.
Aos meus pais Valéria e Carlos Eduardo, e a minha avó Marly, me faltam
palavras para agradecer tudo que fizeram e fazem por mim. Obrigada pelo cuidado de toda
uma vida, devo tudo que sou a vocês, essa conquista é nossa!
Ao meu irmão Marcelo, obrigada pelo carinho e inúmeros conselhos.
Ao meu marido Renan, companheiro de todas as horas, meu grande incentivador,
minha eterna gratidão, obrigada pelas palavras de encorajamento nos momentos de desânimo
е cansaço.
Aos meus familiares, que sempre se fizeram presentes e acreditaram em mim,
meu muito obrigada.
Aos meus amigos, obrigada por tornarem essa caminhada mais fácil e prazerosa.
À minha orientadora Elaine, obrigada por todo o conhecimento transmitido.
À Patrícia, por toda ajuda e inúmeros ensinamentos. Obrigada pela paciência ao
longo desses anos.
À minha querida banca, por aceitar e me orientar nesse momento tão importante.
À toda equipe do NUPEP, pelas boas risadas e aprendizados.
À FAPEMIG e CNPq pelo apoio financeiro. E a todos que de uma forma ou outra
me ajudaram a concluir mais uma etapa da minha vida, MUITO OBRIGADA.
RESUMO
As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias não contagiosas causadas por diferentes
espécies de protozoários do gênero Leishmania. Aproximadamente vinte espécies de
Leishmania são capazes de causar a doença em humanos. A transmissão ocorre por meio da
picada de insetos vetores, genericamente denominados flebotomíneos, sendo que dois gêneros
podem transmitir a doença para humanos, Phlebotomus no “Velho Mundo” e Lutzomyia no
“Novo Mundo”. As fêmeas são as responsáveis pela transmissão dessas doenças, pois se
alimentam de sangue. Os humanos são considerados hospedeiros acidentais dos parasitos
Leishmania, entretanto esses protozoários apresentam diversos hospedeiros vertebrados
reservatórios na natureza, como raposas, cães e roedores. Os tratamentos de primeira escolha
são baseados em antimoniais pentavalentes e, anfotericina B e a pentamidina são utilizadas
como segunda escolha. Atualmente, todos os tratamentos disponíveis apresentam limitações,
incluindo toxicidade, alto custo, contra-indicações e resistência. Em decorrência dos
problemas com a quimioterapia existente, há uma necessidade urgente de descobrir e
desenvolver novos fármacos antileishmaniais. As hidrazonas sintéticas receberam atenção
particular da comunidade científica pelo fato de estarem associadas a um amplo espectro de
atividades biológicas. Assim, o presente estudo avaliou a atividade antileishmanial de cinco
hidrazonas sintéticas em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis,
bem como a citotoxicidade em macrófagos peritoneais de camundongos, além de estudar o
possível modo de ação do melhor composto, com enfoque na mitocôndria do parasito. Entre
os cinco compostos avaliados, dois mostraram atividade em promastigotas (CI50 de 17,28 e
17,36 μM). Em relação à citotoxicidade em macrófagos peritoneais, nenhum dos compostos
apresentou efeito tóxico. Em relação à atividade antiamastigota, três compostos mostraram
atividade promissora (CI50 abaixo de 20,00 μM), com destaque para o composto denominado
PNAT 20. Este composto foi selecionado para estudos sobre mecanismo de ação e observou-
se que o tratamento de promastigotas com PNAT 20 a 17,28 e 34,56 μM (correspondente ao
valor de 1 e 2 vezes CI50 de 72 horas) levou a um aumento da produção de ROS (36,18% e
44,83%, respectivamente) e redução significativa no potencial da membrana mitocondrial
(26,17% e 29,13%, respectivamente) em comparação com o controle não tratado. Esses
resultados demonstram que o PNAT20 exerce efeito nas mitocôndrias do parasito, levando a
disfunção mitocondrial, contribuindo para a morte do parasito.
Palavras-chave: Leishmania. Quimioterapia. Hidrazonas sintéticas.
ABSTRACT
Leishmaniasis is a non-contagious infectious-parasitic disease caused by different protozoan
species of the genus Leishmania. Approximately twenty species of Leishmania are capable of
causing the disease in humans. Transmission occurs through the bite of insect vectors,
generally called phlebotomines, and two genera can transmit the disease to humans,
Phlebotomus in the "Old World" and Lutzomyia in the "New World". Females are responsible
for the transmission of these diseases, because they feed on blood. Humans are considered
accidental hosts of Leishmania parasites, however these protozoa present several vertebrate
hosts reservoirs in the wild, such as foxes, dogs and rodents. The first choice treatments are
based on pentavalent antimonials and amphotericin B and pentamidine are used as second
choice. Currently, all available treatments have limitations, including toxicity, high cost,
contraindications and resistance. As a result of problems with existing chemotherapy, there is
an urgent need to discover and develop new antileishmanial drugs. Synthetic hydrazones have
received particular attention from the scientific community because they are associated with a
broad spectrum of biological activities. Thus, the present study evaluated the antileishmanial
activity of five synthetic hydrazones in promastigotes and amastigotes of Leishmania
amazonensis, as well as the cytotoxicity in peritoneal macrophages of mice, in addition to
studying the possible mode of action of the best compound, focusing on the mitochondria of
the parasite . Among the five evaluated compounds, two showed activity in promastigotes
(IC50 of 17.28 and 17.36 μM). In relation to cytotoxicity in peritoneal macrophages, none of
the compounds showed a toxic effect. In relation to the anti-amastigote activity, three
compounds showed promising activity (IC50 below 20.00 μM), with emphasis on the
compound called PNAT 20. This compound was selected for studies on mechanism of action
and it was observed that the treatment of promastigotes with PNAT 20 at 17.28 and 34.56 μM
(corresponding to the 1 and 2 times IC50 values of 72 hours) led to an increase in ROS
production (36.18% and 44.83%, respectively) and a significant reduction in potential of the
mitochondrial membrane (26.17% and 29.13%, respectively) compared to the untreated
control. These results demonstrate that PNAT20 exerts an effect on the mitochondria of the
parasite, leading to mitochondrial dysfunction, contributing to the death of the parasite.
Keywords: Leishmania. Chemotherapy. Synthetic hydrazones.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Formas evolutivas de Leishmania spp. (A) Promastigotas e (B) Amastigotas de
Leishmania major no interior de macrófagos. Aumento de 1000X. ........................................ 14
Figura 2: Ciclo de vida do parasito Leishmania spp. .............................................................. 15
Figura 3: Alterações no ΔΨ𝑚 induzidas pelo tratamento com PNAT 20 (17,28 e 34,56 µM)
por 24 horas e avaliadas através de marcação com Mitotracker® Red CM-H2XROS. ........... 31
Figura 4: Produção de EROs em promastigotas de L. amazonensis tratadas com PNAT 20
(17,28 e 34,56 µM) por 24 horas e posteriormente marcadas com H2DCFDA. ...................... 32
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Estrutura química dos compostos testados.............................................................18
Tabela 2 – Atividade de hidrazonas sintéticas em promastigotas de Leishmania
amazonensis..............................................................................................................................24
Tabela 3 – Citotoxicidade de hidrazonas sintéticas em macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c..............................................................................................................25
Tabela 4 – Atividade de hidrazonas sintéticas em amastigotas de Leishmania
amazonensis..............................................................................................................................26
Tabela 5 – Índice de Especificidade (InEs) e hidrazonas sintéticas para as formas evolutivas
de L. amazonensis.....................................................................................................................28
Tabela 6 – Índice de Seletividade (InSe) de hidrazonas sintéticas para as formas evolutivas de
L. amazonensis..........................................................................................................................28
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP Adenosina Trifosfato
BOD “Biochemical Oxygen Demand”, Demanda Bioquímica de Oxigênio
CBR Centro de Biologia de Reprodução
CC50 Concentração citotóxica que reduz 50% da viabilidade dos macrófagos
CEEA Comitê de Ética em Experimentação Animal
CI50 Concentração do composto que inibiu 50% do crescimento parasitário
DCF 2`,7` Diclorofluoresceína
DMSO Dimetilsulfóxido
RFP “Red Fluorescent Protein”, Proteína Fluorescente Vermelha
GFP “Green Fluorescent Protein”, Proteína Fluorescente Verde
H2DCFDA Diacetato de 2`,7`- diclorodihidrofluoresceína
InEs Índice de Especificidade
InSe Índice de Seletividade
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS “Phosphate Buffer Saline”, Salina Tampão Fosfato
EROs Espécies Reativas do Oxigênio
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute (Meio de cultura)
SBF Soro Bovino Fetal
WHO “World Health Organization”, Organização Mundial de Saúde
Δψm Potencial de Membrana Mitocondrial
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 13
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 17
2.1 GERAL ............................................................................................................................... 17
2.2 ESPECÍFICOS .................................................................................................................... 17
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 18
3.1 COMPOSTOS UTILIZADOS ............................................................................................ 18
3.2 CULTIVO DE LEISHMANIA AMAZONENSIS.................................................................. 18
3.3 ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIPROMASTIGOTA ....................................................... 19
3.4 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS COMPOSTOS EM MACRÓFAGOS
PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS BALB/C ................................................................... 20
3.5 ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIAMASTIGOTA............................................................ 20
3.6 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPECIFICIDADE (INES) E DO ÍNDICE DE
SELETIVIDADE (INSE) .......................................................................................................... 21
3.7 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL (ΔΨ𝑚) EM
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS TRATADOS COM PNAT 20 ......................... 21
3.8 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO (EROS)
EM PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS TRATADOS COM O COMPOSTO PNAT
20 .............................................................................................................................................. 22
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 22
3.10 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS .......................................................................................... 23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 24
4.1 HIDRAZONAS SINTÉTICAS INIBEM O CRESCIMENTO DE FORMAS
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS ........................................................................... 24
4.2 HIDRAZONAS SINTÉTICAS NÃO APRESENTAM EFEITO TÓXICO EM
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS BALB/C ...................................... 25
4.3 HIDRAZONAS SINTÉTICAS APRESENTAM ATIVIDADE EM FORMAS
AMASTIGOTAS INTRACELULARES DE L. AMAZONENSIS ............................................ 26
4.4 HIDRAZONAS SINTÉTICAS APRESENTAM ESPECIFICIDADE EM AMBOS
ESTÁGIOS BIOLÓGICOS, SENDO MAIS TÓXICAS PARA AS FORMAS
AMASTIGOTAS DE LEISHMANIA SP QUE PARA A CÉLULA HOSPEDEIRA ................ 27
4.5 O COMPOSTO PNAT 20 INDUZ ALTERAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA
MITOCONDRIAL (ΔΨM) E AUMENTO DA PRODUÇÃO DE ERO’S EM
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS ........................................................................... 30
5 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 33
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 34
APÊNDICE A ......................................................................................................................... 37
13
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias não contagiosas causadas por
diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, de transmissão vetorial e com
graves consequências sócio-econômicas Aproximadamente 20 espécies de Leishmania são
capazes de causar a doença em humanos. A transmissão ocorre por meio da picada de insetos
vetores, genericamente denominados flebotomíneos, sendo que dois gêneros podem transmitir
a doença para humanos, Phlebotomus no “Velho Mundo” e Lutzomyia no “Novo Mundo”. As
fêmeas são as responsáveis pela transmissão dessas doenças, pois se alimentam de sangue. Os
humanos são considerados hospedeiros acidentais dos parasitos Leishmania, entretanto esses
protozoários apresentam diversos hospedeiros vertebrados reservatórios na natureza, como
raposas, cães e roedores. (ALVARENGA et al., 2010).
São doenças de grande impacto global, uma vez que estão distribuídas em 98
países e territórios de quatro continentes, com milhões de indivíduos infectados e muitos
vivendo em área de risco, sendo a segunda maior causa de morte por doenças parasitárias no
mundo. Estima-se que 700.000 a 1 milhão de novos casos e 20.000 a 30.000 mortes ocorrem
anualmente. A maioria dos casos de leishmaniose cutânea ocorre no Afeganistão, na Argélia,
no Brasil, na Colômbia, na República Islâmica do Irã, no Paquistão, no Peru, na Arábia
Saudita e na República Árabe da Síria. As epidemias recorrentes de leishmaniose visceral na
África Oriental (Etiópia, Quênia, Sudão do Sul e Sudão), Brasil e Índia causaram alta
morbidade e mortalidade nas comunidades afetadas (WHO, 2018).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as leishmanioses são
consideradas doenças tropicais negligenciadas sobretudo porque afetam indivíduos com baixo
nível socioeconômico, estando associada à casos de desnutrição, deslocamento populacional,
condições precárias de moradia, sistema imunológico deficiente e ausência de vacina efetiva.
Apesar deste impacto, os investimentos são escassos na área e não despertam grande interesse
de indústrias farmacêuticas ou de políticas públicas em saúde (PINO, 2010).
O gênero Leishmania inclui protozoários flagelados pertencentes à ordem
Kinetoplastida e família Trypanosomatidae, os quais possuem uma organela peculiar chamada
cinetoplasto e também uma única mitocôndria (TOMÁS; CASTRO, 2013). Durante o ciclo
biológico os parasitos pertencentes ao gênero Leishmania são encontrados sob duas formas
evolutivas: os promastigotas e os amastigotas. Os promastigotas (Figura 1A) medem cerca de
10-20 µm de comprimento, possuem flagelo livre emergindo a partir da bolsa flagelar o que
14
possibilita a motilidade dessas formas. São extracelulares, habitando o trato digestivo do
inseto vetor (CARLSEN et al., 2015). As formas amastigotas (Figura 1B) medem
aproximadamente 3-7 µm de comprimento, não possuem flagelo externalizado, sendo este
internalizado e mantido na bolsa flagelar. São parasitos intracelulares obrigatórios do
hospedeiro mamífero, com corpo celular pequeno e esférico. Essas formas são encontradas no
interior de fagolisossomas de células do sistema fagocítico mononuclear, sobretudo de
macrófagos (ANTINARELLI, 2013).
Figura 1: Formas evolutivas de Leishmania spp. (A) Promastigotas e (B)
Amastigotas de Leishmania major no interior de macrófagos. Aumento de
1000X.
Fonte: MACHADO, 2013.
O ciclo biológico do parasito (Figura 2) no hospedeiro vertebrado tem início
quando a fêmea infectada pica esse hospedeiro vertebrado não-infectado e inocula formas
promastigotas metacíclicas no tecido subcutâneo desses indivíduos. No hospedeiro vertebrado
os promastigotas são fagocitados, sobretudo por macrófagos, onde irão se diferenciar em
formas amastigotas dentro do fagolisossomo. Após multiplicação intensa das formas
amastigotas por divisão binária simples, ocorre o rompimento da célula hospedeira, liberando
assim os parasitos no meio extracelular, os quais poderão infectar outras células do
hospedeiro vertebrado. O ciclo biológico se completa quando um flebótomo não-infectado
pica o hospedeiro vertebrado infectado, fazendo a ingestão de formas amastigotas que, no
intestino do inseto se diferenciam em promastigotas procíclicas que se multiplicam e
posteriormente se transformam em promastigotas metacíclicas que irão migrar para a parte
anterior do tubo digestivo do inseto. A fêmea do inseto vetor ao realizar um novo repasto
A B
15
sanguíneo transmite a infecção para o hospedeiro mamífero não-infectado e o ciclo é
reiniciado (TEIXEIRA, 2013).
Figura 2: Ciclo de vida do parasito Leishmania spp.
Fonte: STEBUT, 2015.
As leishmanioses compreendem uma série de manifestações clínicas, decorrentes
de interações complexas entre as várias espécies de Leishmania spp. e da resposta imune do
hospedeiro, entre outros fatores. Assim, estas manifestações apresentam um espectro clínico
amplo, podendo variar desde infecções assintomáticas até formas graves e desfigurantes. As
principais síndromes clínicas são a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose visceral (LV)
(HASIGUCHI et al., 2016). A leishmaniose cutânea, causada, sobretudo pela L. amazonensis,
de maior prevalência, apresenta também várias formas clínicas. A LC simples, inicialmente
caracterizada por eritema no local da picada do inseto vetor podendo evoluir para uma
ulceração. Pode ocorrer o surgimento de uma ou várias lesões o que depende do número de
picadas infectantes do inseto vetor ou disseminação do parasito na pele em regiões próximas à
picada original (RIBEIRO, 2014). Pode haver também disseminação do parasito para as
mucosas, principalmente na região orofaringeana, caracterizando a forma cutânea-mucosa, o
qual está associada à desfiguração grave desta região acarretando um grande estigma social.
16
Em relação à leishmaniose visceral, esta é caracterizada pela infecção crônica de órgãos
viscerais como fígado, baço e medula óssea, podendo ser fatal se não for tratada. A principal
espécie envolvida é a L. chagasi (WHO, 2016).
A escolha do tratamento adequado no combate às leishmanioses deve ser feita
com cuidado e levando-se em consideração a espécie de Leishmania spp. envolvida, bem
como a forma clínica, características das lesões presentes e estado imunológico do paciente
(STEBUT, 2015). O tratamento de primeira escolha em muitos países para a maioria das
manifestações clínicas das leishmanioses é baseado na administração parenteral (intravenosa
ou intramuscular) dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®)
(FUMAGALLI, 2015). Quando o uso dos antimoniais não é efetivo, pentamidina e
anfotericina B são utilizadas como segunda escolha, porém ambas são muito tóxicas,
demonstrando nefro e cardiotoxicidade (PINHEIRO, 2013). A miltefosina tem sido
apresentada como o mais novo fármaco alternativo por via oral para o tratamento da
leishmaniose visceral, utilizado com sucesso em pacientes imunocompetentes e
imunossuprimidos apesar de ter apresentado efeitos adversos digestivos e risco de
teratogenicidade (RICHARD; WERBOVETZ, 2010).
Nesse contexto, podemos concluir que o tratamento das leishmanioses exige
atenção, apresentando limitações no que se refere à segurança, toxicidade e eficácia. Assim, o
desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos com segurança terapêutica significativa,
baixa toxicidade e mais conforto para o paciente constitui uma prioridade no controle das
leishmanioses (BASTOS, et al., 2012).
Neste sentido, um grande número de compostos sintéticos vem sendo testados em
ensaios de atividade antileishmanial, dentre eles os derivados de hidrazonas. Um estudo
anterior demonstrou que os heterociclos aromáticos de seis membros contendo nitrogênio,
como pirazina, receberam atenção da comunidade científica, uma vez que estão associados a
um amplo espectro de atividades biológicas, atuando como antineoplásicos, antibacterianos,
antifúngicos, anticonvulsivantes, antivirais e anti-agentes inflamatórios (ASIF, 2017;
FERREIRA, et al., 2012).
No presente estudo, inicialmente foi proposta a avaliação da atividade in vitro de
cinco hidrazonas sintéticas em L. amazonensis e em macrófagos. Posteriormente, o melhor
composto foi selecionado e buscou-se avaliar possíveis efeitos do composto na mitocôndria
do parasito.
17
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Avaliar a atividade antileishmanial in vitro de hidrazonas sintéticas e a
citotoxicidade em células de mamíferos. Além disso, selecionar o composto mais ativo no
intuito de avaliar seu efeito na mitocôndria do parasito.
2.2 ESPECÍFICOS
Avaliar a atividade de cinco hidrazonas sintéticas em promastigotas de L.
amazonensis;
Avaliar a citotoxicidade dos compostos acima citados, em macrófagos peritoneais
de camundongos BALB/c;
Avaliar a atividade em amastigotas intracelulares de L. amazonensis;
Avaliar o InEs e o InSe das cinco hidrazonas sintéticas;
Avaliar se o efeito antileishmanial do melhor composto pode estar relacionado às
alterações mitocondriais, através da produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) e da
análise do potencial de membrana mitocondrial (Δψm).
18
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 COMPOSTOS UTILIZADOS
As hidrazonas sintéticas foram fornecidas pelo grupo do Prof. Dr. Marcus
Vinícius Nora de Souza (Fundação Oswaldo Cruz, Instituto de Tecnologia em Fármacos-Far
Manguinhos).
Neste trabalho, as mesmas foram identificadas na forma de código, sendo elas:
PNAT 11; PNAT 13; PNAT 20; PROM 34 e PROM 36.
Tabela 1: Estrutura química dos compostos testados
Composto Estrutura Química
PNAT 11
PNAT 13
PNAT 20
PROM 34
PROM 36
3.2 CULTIVO DE LEISHMANIA AMAZONENSIS
Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa IFLA/Br/67/PH8)
foram cultivadas em meio Warren e L. amazonensis transfectada com o gene da proteína
vermelha (“Red Fluorescent Protein”- RFP) em meio 199. Os meios foram suplementados
com 10% de soro bovino fetal (SBF), e mantidos em estufa BOD à 25 °C por meio de
repiques realizados em intervalo de quatro dias, duas vezes na semana, sendo coletadas em
fase logarítmica de crescimento (COIMBRA et al., 2016).
19
3.3 ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIPROMASTIGOTA
A partir da fase exponencial de crescimento foram obtidas formas promastigotas
de Leishmania amazonensis (cepa IFLA/Br/67/PH8) cultivadas em meio Warren
suplementado com 10% de SBF. A atividade antipromastigota foi baseada no método
colorimétrico do MTT (método do 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio), de acordo
com Mossman (1983), após pequenas modificações (ANTINARELLI et al., 2015).
O ensaio de MTT baseia-se na redução celular de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol, 2-
yl)- 2,5-diphenyl-212 tetrazolium bromide de acordo com (Mosman, 1983). A quantificação
da redução de MTT constitui um método colorimétrico simples para avaliar a viabilidade
celular. Após redução, o MTT forma cristais de formazan, de cor azul, que ao serem
dissolvidos absorvem na região do visível, podendo desta forma ser quantificados por
espectrofotometria. A redução do MTT é feita através de desidrogenases celulares, portanto
pode-se avaliar a capacidade redutora da célula através deste método.
Os parasitos foram contados em câmara de Neubauer e lançados à concentração
de 2x106 células/mL em uma placa de 96 poços e incubados a 25 °C. Posteriormente, os
compostos foram adicionados, em concentrações variadas (100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM
e 6,25 µM) por meio de diluição seriada. Os testes foram realizados em duplicatas, em três
experimentos independentes, e poços sem adição do composto foram utilizados como controle
negativo. Após três dias (72 horas) a 25 °C, adicionou-se 10 µL da solução MTT a 5 mg/mL
em cada poço para verificar a viabilidade celular, uma vez que se trata de um método
quantitativo colorimétrico, que após incubação por quatro horas, verifica-se a mudança da
coloração de amarelo para roxo, quando houver parasitos viáveis. A reação foi interrompida
pela adição de 100 µL de isopropanol/ácido (HCl a 0,7%) e a leitura foi realizada em um
espectrofotômetro à 570 nm (Multiskan EX- Thermo Electron Corporation, Vantaa,
Finlândia). Os resultados foram demonstrados na forma de CI50 – concentração molar que
inibe 50% do crescimento dos parasitos. Miltefosina foi utilizada como controle positivo.
20
3.4 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS COMPOSTOS EM MACRÓFAGOS
PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS BALB/C
Para a avaliação da citotoxicidade, utilizou-se macrófagos peritoneais obtidos
por meio de lavados peritoneais de camundongos BALB/c, estimulados com 2 mL de
tioglicolato 3%. Sendo assim, as células colhidas foram centrifugadas a 1000 rpm por 10
minutos e, em seguida, os macrófagos foram resuspendidos com meio RPMI para serem
contados na câmara de Neubauer. Adicionou-se 2x106
células/mL, em uma placa de 96 poços.
Após 24 horas de incubação na estufa com 5% de CO2 a 37ºC, as placas foram
lavadas com uma solução estéril de PBS para retirar as células não aderidas. Os compostos
foram adicionados em diversas concentrações (150 µM, 75 µM, 37,5 µM, 18,75 µM e 9,375
µM) por meio de diluições seriadas, utilizando a miltefosina como controle positivo. Os testes
foram realizados em duplicatas, em três experimentos independentes, e poços sem adição do
composto foram utilizados como controle negativo. As placas foram levadas novamente para
a estufa com 5% de CO2 a 37ºC. 72 horas após o experimento, a viabilidade dos macrófagos
foi determinada pelo MTT e a leitura foi realizada em um espectrofotômetro de microplacas a
570 nm. Os resultados foram calculados como porcentagem de morte dos macrófagos em
relação ao controle. Determinou-se o CC50 de cada molécula, ou seja, a concentração citotóxica
que reduz 50% da viabilidade celular.
3.5 ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIAMASTIGOTA
O ensaio antiamastigota foi realizado em macrófagos de camundongos BALB/c
infectados com L. amazonensis-RFP. Os macrófagos foram obtidos assim como para a
avaliação da citotoxicidade descrita anteriormente. Placas de 24 poços foram utilizadas para a
realização do teste. A partir da contagem na câmara de Neubauer, ajustou-se a concentração
para 2x106 células/mL, em seguida, as placas permaneceram em estufa com 5% de CO2 a 37
ºC para a adesão dos macrófagos. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS estéril
para a retirada das células não aderidas e foram infectadas com os promastigotas de L.
amazonensis-RFP em fase estacionária na relação de um macrófago para 10 leishmanias,
durante 4 horas, em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de
antibiótico. Os promastigotas que não foram fagocitados foram retirados através de lavagem
dos poços com PBS e, posteriormente, foram adicionados os compostos a serem testados em
diferentes concentrações (100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM, 6,25 µM e 3,125 µM). Após 72
horas, os macrófagos foram lisados com água deionizada a fim de liberar os amastigotas
21
intracelulares. Foi feita a raspagem das placas e todo o seu conteúdo foi transferido para uma
microplaca negra de fundo transparente de 96 poços para que a leitura fosse realizada. A
intensidade de fluorescência das culturas foi medida em fluorímetro de placas (Bio-Tek) no
comprimento de onda de excitação de 540 nm e 600 nm de emissão. A leitura do lisado do
controle de macrófagos não-infectados foi utilizada como valor de autofluorescência (branco)
e descontada dos valores dos macrófagos infectados não-tratados e tratados com os
compostos, sendo os resultados expressos em porcentagem de inibição e CI50 em relação ao
controle de macrófagos infectados e não tratados. Cada concentração foi testada em duplicata.
Miltefosina foi utilizada como controle positivo.
3.6 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ESPECIFICIDADE (InEs) E DO ÍNDICE DE
SELETIVIDADE (InSe)
O índice de especificidade (InEs) tem como objetivo determinar a especificidade
dos compostos para as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. O InEs é
calculado pela razão entre o CI50 em formas promastigotas de Leishmania spp. e o CI50 em
amastigotas de Leishmania spp (MUYLDER et al, 2011).
O índice de seletividade (InSe) tem como objetivo determinar a relação entre
citotoxicidade dos compostos para células de mamíferos (macrófagos peritoneais) e sua
atividade leishmanicida (promastigotas e amastigotas). É calculado a partir da razão entre a
citotoxicidade para macrófagos (CC50) e a atividade contra amastigotas (CI50) (MUYLDER et
al, 2011).
3.7 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL (ΔΨ𝑚) EM
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS TRATADOS COM PNAT 20
Para avaliar o potencial de membrana mitocondrial (Δψm), foi utilizado o
Mitotracker® Red CM-H2XROS. Este é uma substância não fluorescente, que ao penetrar em
células vivas, sofre um processo de oxidação e passa a emitir uma fluorescência vermelha. O
corante se difunde por meio da membrana plasmática das células e se acumula nas
mitocôndrias ativas, sendo que, este acúmulo é dependente do ΔΨ𝑚 (MESQUITA, 2013).
Para a avaliação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ𝑚) selecionou-se o
composto que apresentou melhor atividade antileishmanial: PNAT20.
As formas promastigotas de L. amazonensis, em fase exponencial de crescimento,
foram tratadas ou não com 17,28 e 34,56 µM de PNAT20, o que corresponde
22
respectivamente, a uma e duas vezes o CI50 do composto, por 24 horas, a 25ºC.
Posteriormente, as células foram lavadas com PBS e ajustou-se a concentração para 5x106
células/mL em microtubos cônicos. Os promastigotas foram incubados com 500 nM de
Mitotracker a 25°C, no escuro, por 40 minutos. Após este período, os promastigotas foram
lavados por duas vezes com PBS e ressuspendidos em 1mL desta mesma solução. 200 µl da
solução contendo os parasitos foram transferidos para placas negras de 96 poços. A
intensidade de fluorescência foi medida usando um espectrofluorímetro (FLx800), a 540 nm
de excitação e 600 nm de emissão. Miltefosina e FCCP foram utilizados como controle
positivo.
3.8 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO (EROs)
EM PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS TRATADOS COM O COMPOSTO
PNAT 20
Os níveis de Espécies Reativas do Oxigênio (EROs) foram determinados
utilizando-se o corante não fluorescente 2',7'- diacetato dediclorodihidrofluoresceína
(H2DCFDA), que após sofrer um processo de oxidação e clivagem por esterases
intracelulares, se converte em diclorofluoresceína, um composto altamente fluorescente
(MESQUITA, 2013).
Para a avaliação da produção EROs selecionou-se o composto que apresentou
melhor atividade antileishmanial: PNAT20.
As formas promastigotas de L. amazonensis, em fase exponencial de crescimento,
foram tratadas ou não com 17,28 e 34,56 µM de PNAT20, o que corresponde
respectivamente, a uma e duas vezes o CI50 composto, por 24 horas, a 25ºC. Posteriormente,
as células foram lavadas com PBS e a concentração dos parasitos foi ajustada para 20x106
células em 200 µl de PBS, em placas negras de 96 poços. Em seguida, adicionou-se 4 µL do
corante H2DCFDA em cada poço, na concentração final de 20 µM e incubou-se em estufa a
37 °C por 30 minutos no escuro, pois o corante é fotossensível. A intensidade de
fluorescência foi medida usando um espectrofluorímetro (FLx800), a 485 nm de excitação e
528 nm de emissão. Miltefosina foi utilizada como controle positivo.
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores do CI50 obtidos nos experimentos de atividades antipromastigota e
antiamastigota e de citotoxicidade em macrófagos peritoneais (CC50) foram obtidos por
análise através do programa estatístico Grafit versão 5.0, em que tais valores foram
23
determinados graficamente a partir de uma curva de regressão não linear, com intervalo de
confiança de 95%. Para a construção de gráficos expressando as possíveis alterações
provocadas pelo composto PNAT20 em formas promastigotas de L. amazonensis as análises
estatísticas dos resultados foram realizadas no programa GraphPad Prism 5.0 (Graph Prism
Inc., San Diego, CA).
3.10 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Os camundongos da linhagem BALB/c foram provenientes do Centro de
Biologia de Reprodução (CBR) da Universidade Federal de Juiz de Fora. Durante o período
experimental, os mesmos foram mantidos no Laboratório de Parasitologia da Universidade
Federal de Juiz de Fora (NUPEP/UFJF), em estante ventilada. Os animais foram utilizados
com idade próxima entre 6-8 semanas. Todos os ensaios envolvendo animais foram
previamente aprovados pela Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da
Universidade Federal de Juiz de Fora (Protocolos Nº 054/2013, 055/2013, 056/2013).
24
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados já foram parcialmente publicados (aceito para publicação no
ChemMedChem- APÊNDICE A).
4.1 HIDRAZONAS SINTÉTICAS INIBEM O CRESCIMENTO DE FORMAS
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS
Inicialmente, todos os compostos foram avaliados em formas promastigotas de
L. amazonensis nas concentrações de 100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM e 6,25 µM. Após 72
horas de tratamento, a viabilidade celular foi mensurada pelo método colorimétrico do MTT e
calculou-se a média da porcentagem de inibição correspondente a cada concentração testada
dos experimentos feitos em triplicata. Os resultados foram expressos como CI50 de cada
composto (Tabela 2).
Tabela 2: Atividade de hidrazonas sintéticas em promastigotas de Leishmania
amazonensis
Compostos CI50 (µM)*
Promastigota L. amazonensis
PNAT 11 >100,00
PNAT 13 >100,00
PNAT 20 17,28 ± 1,80
PROM 34 17,36 ± 1,31
PROM 36 >100,00
Miltefosina* 21,39 ± 1,18
*CI50 de cada composto corresponde à média de 3 experimentos ± erro padrão. Calculado pelo
programa Grafit.
Como mostrado na Tabela 2, dos 5 compostos sintéticos avaliados, apenas dois
apresentaram potencial atividade em L. amazonensis, sendo eles o PNAT 20 e PROM 34. Os
demais compostos não apresentaram atividade significativa nas formas promastigotas de L.
amazonensis, apresentando CI50 superiores a 100,00 µM, a qual foi a máxima concentração
testada.
25
Em relação às hidrazonas com aldeídos heteroaromáticos, observamos que o
composto PNAT 20 demonstra atividade antileishmanial em formas promastigotas de L.
amazonensis, com CI50 = 17,28 µM, indicando que a posição do nitrogênio é essencial para a
atividade biológica.
No caso dos aldeídos de anel de cinco membros, representados pelos
compostos PROM 34 e PROM 36, podemos observar que o grupo nitrofuranil é crucial para
a atividade nas formas promastigotas de L. amazonensis (PROM 34, CI50 = 17,36 µM contra
PROM 36, CI50 > 100,00 µM - inativo), demonstrando que o oxigênio é crítico para a
atividade biológica do composto.
4.2 HIDRAZONAS SINTÉTICAS NÃO APRESENTAM EFEITO TÓXICO EM
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS BALB/C
Para avaliar o efeito tóxico das hidrazonas sintéticas em células de mamíferos,
utilizou-se macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Após 72 horas de tratamento, o
efeito dos compostos sobre as células de mamíferos foi mensurado pelo método colorimétrico
do MTT e os resultados foram expressos como CC50 de cada composto, que são mostrados na
Tabela 3.
Tabela 3: Citotoxicidade de hidrazonas sintéticas em macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c
Compostos CC50 (µM)*
Macrófagos peritoneais
PNAT 11 >150,00
PNAT 13 >150,00
PNAT 20 >150,00
PROM 34 >150,00
PROM 36 >150,00
Miltefosina* 131,99 ± 3,95
*CC50 de cada composto corresponde à média de 3 experimentos ± erro padrão. Calculado pelo
programa Grafit.
A partir da análise da Tabela 3, os resultados revelaram que todos os
compostos testados não apresentaram toxicidade em macrófagos, até a máxima concentração
26
testada, que foi de 100 µM, demonstrando um bom perfil quanto a possibilidade de toxidez
em células de mamíferos desta classe de hidrazonas.
4.3 HIDRAZONAS SINTÉTICAS APRESENTAM ATIVIDADE EM FORMAS
AMASTIGOTAS INTRACELULARES DE L. AMAZONENSIS
Para a avaliação da atividade antiamastigota, macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas de L. amazonensis-RFP e
tratados com os compostos em diferentes concentrações (100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM,
6,25 µM e 3,125 µM) por 72 horas. O efeito antiamastigota foi avaliado pela contagem dos
parasitos intracelulares e em seguida foi calculado o CI50 de cada composto (Tabela 4).
A utilização das cepas de L. amazonensis transfectada com RFP permite a semi-
automatização dos ensaios, tornando-os mais rápidos e reprodutíveis. Além disso, a RFP
apresenta vantagens em relação à GFP (“Green Fluorescent Protein”), como menor
interferência da autofluorescência celular e do espectro do comprimento de onda de
fluorescência característica de diversos compostos químicos (ROCHA, 2013).
Tabela 4: Atividade de hidrazonas sintéticas em amastigotas de Leishmania
amazonensis
Compostos CI50 (µM)*
Amastigota L. amazonensis
PNAT 11 >100,00
PNAT 13 11,09 ± 0,05
PNAT 20 15,25 ± 2,16
PROM 34 16,10 ± 0,59
PROM 36 >100,00
Miltefosina* 4,15 ± 1,25
*CI50 de cada composto corresponde à média de 3 experimentos ± erro padrão. Calculado pelo
programa Grafit.
Analisando a Tabela 4, percebemos que os compostos PNAT 13, PNAT 20 e
PROM 34 apresentam efeito tóxico significativo sobre as formas amastigotas de L.
amazonensis - RFP quando comparado com o controle positivo (miltefosina CI50 = 4,15 ±
1,25 µM). A forma amastigota do parasito Leishmania spp. é o estágio evolutivo de
27
importância clínica, uma vez que é a forma encontrada no homem (VERMEERSCH, et al,
2009). Assim, tais compostos se apresentaram como potenciais fármacos para o tratamento
das leishmanioses. Entretanto, os demais compostos, PNAT 11 e PROM 36 não
demonstraram atividade até na máxima concentração testada, apresentando valores de CI50
maiores que 100,00 µM.
No caso das hidrazonas com aldeídos heteroaromáticos é possível estabelecer
relação estrutura-atividade (SER) para essas classes. O composto PNAT 20 possuí atividade
antileishmanial contra formas amastigotas de L. amazonensis (CI50 = 15,25 µM) indicando
que a posição do nitrogênio é crítica para a atividade biológica.
No caso dos aldeídos de anel de cinco membros, o grupo nitrofuranil é crítico para
a atividade antileishmanial contra formas amastigotas (L. amazonensis) (PROM 34, CI50 =
16,10 µM contra PROM 36, CI50 = inativo), indicando que o oxigênio é crítico para a
atividade biológica.
4.4 HIDRAZONAS SINTÉTICAS APRESENTAM ESPECIFICIDADE EM AMBOS
ESTÁGIOS BIOLÓGICOS, SENDO MAIS TÓXICAS PARA AS FORMAS
AMASTIGOTAS DE LEISHMANIA SP QUE PARA A CÉLULA HOSPEDEIRA
A especificidade dos compostos testados neste estudo foi determinada através do
cálculo do índice de especificidade (InEs), que tem como objetivo avaliar em qual estágio
evolutivo do parasito o composto é mais ativo. Para valores do InEs acima de 2,0 indicam
compostos mais ativos em amastigotas intracelulares, valores abaixo de 0,4 sugerem que o
composto foi mais efetivo em formas promastigotas, e compostos com valores de InEs entre
0,4 e 2,0 é considerado ativo para ambos os estágios (MUYLDER et al., 2011)
Analisando a Tabela 5, percebe-se que para alguns compostos (PNAT 11 e
PROM 36) não foi possível fazer o cálculo do InEs, pois não apresentaram efeito em
nenhuma das formas evolutivas de Leishmania spp., enquanto que para o PNAT 13, em
virtude de não possuir efeito em uma das duas formas evolutivas (promastigotas), não se
obteve um valor exato, mas sim uma estimativa do InEs (9,03). Os compostos PNAT 20 e
PROM 34 apresentaram efeito semelhantes em promastigotas e amastigotas.
28
Tabela 5: Índice de Especificidade (InEs) e hidrazonas sintéticas para as formas
evolutivas de L. amazonensis
Compostos InEs
PNAT 11 -
PNAT 13 9,03
PNAT 20 1,13
PROM 34 1,08
PROM 36 -
Miltefosina 5,15
*InEs = Índice de Especificidade foi calculado pela razão entre CI50 de promastigotas e CI50 para
amastigotas.
A seletividade dos compostos testados neste estudo foi determinada através do
cálculo do índice de seletividade (InSe), que tem como objetivo avaliar a seletividade do
composto entre a célula hospedeira (macrófagos) e as formas amastigotas do parasito. Assim,
para que um composto tenha maior efeito antileishmanial do que toxicidade para macrófagos,
é preciso que o valor do InSe seja maior do que um (MUYLDER et al., 2011).
A partir da análise da Tabela 6, percebemos que para os compostos PNAT 11 e
PROM 36 não foi possível calcular o InSe dos mesmos, uma vez que eles não apresentaram
efeito antileishmanial em formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis. Para os
demais compostos testados, o InSe foi maior do que um, evidenciando assim a seletividade
dos compostos pelo estágio intracelular do parasito. Este fato é de extrema importância, uma
vez que o amastigota é a forma biológica do parasito que está relacionada às manifestações
clínicas das leishmanioses.
Tabela 6: Índice de Seletividade (InSe) de hidrazonas sintéticas para as formas
evolutivas de L. amazonensis
Compostos InSe
PNAT 11 -
PNAT 13 13,52
PNAT 20 9,84
29
Continuação Tabela 6: Índice de Seletividade (InSe) de hidrazonas sintéticas para as
formas evolutivas de L. amazonensis
Compostos InSe
PROM 34 9,32
PROM 36 -
Miltefosina 31,80
*InSe = Índice de Seletividade foi calculado pela razão entre CC50 para macrófagos e CI50 para
amastigotas.
A atividade estágio específica em Leishmania tem sido relatada para diversas
drogas antileishmaniais. Diferenças entre os dois estágios do parasito, como por exemplo,
taxa de divisão, metabolismos da droga, alvos enzimáticos e alvos bioquímicos podem
contribuir para as variações de sensibilidade entre promastigotas e amastigotas. Além disto,
deve-se levar em consideração que os amastigotas são parasitos intracelulares obrigatórios,
sobrevivendo dentro de um fagolisossomo, portanto, fatores relacionados a ineficácia de
alguns compostos sobre a forma intracelular do parasito podem estar relacionados à
inativação/metabolização dos compostos dentro dos macrófagos, bem como baixa
absorção/penetração do composto pela célula hospedeira (ANTINARELLI, et. al., 2016).
Em resumo, os resultados apresentados até o momento destacam o potencial
antileishmanial in vitro da classe das hidrazonas. Assim, visando a compreensão do modo de
ação desses compostos, o composto PNAT 20 que apresentou forte efeito em promastigotas e
amastigotas intracelulares de L. amazonensis e nenhuma toxicidade contra macrófagos
murinos foi selecionado para a avaliação dos possíveis efeitos desta classe de derivados de
hidrazona envolvidos na morte de Leishmania spp.
Os estudos sobre as ações desencadeadas pelo composto PNAT 20 foram
direcionados para a mitocôndria, uma vez que, como falado anteriormente, o fato destes
protozoários apresentarem esta organela como única, a torna um alvo importante e
diferenciado para a ação de drogas, uma vez que apresentam alterações em sua estrutura e
função em comparação às mitocôndrias dos mamíferos (MENNA-BARRETO e DE
CASTRO, 2014).
30
4.5 O COMPOSTO PNAT 20 INDUZ ALTERAÇÃO DO POTENCIAL DE MEMBRANA
MITOCONDRIAL (ΔΨM) E AUMENTO DA PRODUÇÃO DE ERO’S EM
PROMASTIGOTAS DE L. AMAZONENSIS
O Δψm é um importante parâmetro de avaliação da função mitocondrial, sendo
usado não apenas como um indicador de viabilidade celular, mas também de apoptose
(MORAES, 2014).
Na avaliação do ΔΨ𝑚, os promastigotas foram tratados, por 24 horas, com PNAT
20 a 17,28 e 34,56 µM, o que corresponde respectivamente, a uma e duas vezes o CI50 do
composto em 72 horas. Posteriormente, foram incubados com Mitotracker® Red CM-
H2XRO.
A Figura 4 mostra que o tratamento com 17,28 e 34,56 µM do composto induziu
uma redução da intensidade de fluorescência do Mitotracker® Red CMH2XROS, de 26,17%
e 29,13%, respectivamente, comparado ao controle sem tratamento. O tratamento de
promastigotas de L. amazonensis com FCCP (20 µM) e Miltefosina (21 µM), por 24 horas,
utilizados como controle positivo deste experimento e induziu redução da intensidade de
fluorescência de 20,73% e de 19,32%, respectivamente, quando comparados ao controle não
tratado (Figura 4).
31
Figura 3: Alterações no ΔΨ𝑚 induzidas pelo tratamento com PNAT 20 (17,28 e 34,56 µM)
por 24 horas e avaliadas através de marcação com Mitotracker® Red CM-H2XROS.
Análises estatísticas foram obtidas no GraphPad Prism versão 5.0 usando análise de variância (One-
way ANOVA), no qual diferenças estatisticamente significantes quando comparado ao grupo controle
foram analisadas pelo pós-teste de Dunnett: p < 0,001 (***); p < 0,01 (**). Os dados foram obtidos a
partir de 3 experimentos independentes.
A despolarização do ΔΨ𝑚 na maioria das vezes está relacionada à ocorrência de
estresse oxidativo, com aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), uma
vez que a mitocôndria é uma das principais fontes intracelulares dessas espécies reativas
(MACHADO, 2013). Com base nesta evidência, avaliamos o possível dano oxidativo
mitocondrial em promastigotas de L. amazonensis causado pelo composto PNAT 20, por
meio da marcação com H2DCFDA. De fato, o composto PNAT 20 induziu um aumento da
produção de EROs em todas as concentrações testadas (17,28 e 34,56 µM) em comparação
com o grupo controle, em aproximadamente 36,18 e 44,83%, respectivamente (Figura 5).
Promastigotas de L. amazonensis tratadas com miltefosina (21 µM), por 24 horas, foram
utilizadas como controle positivo e este tratamento aumentou a intensidade da fluorescência
em 21,89% (Figura 5), quando comparado ao controle negativo.
32
Figura 4: Produção de EROs em promastigotas de L. amazonensis tratadas com PNAT 20
(17,28 e 34,56 µM) por 24 horas e posteriormente marcadas com H2DCFDA.
Análises estatísticas foram obtidas no GraphPad Prism versão 5.0 usando análise de variância (One-
way ANOVA), no qual diferenças estatisticamente significantes quando comparado ao grupo controle
foram analisadas pelo pós-teste de Dunnett: p < 0,001 (***). Os dados foram obtidos a partir de 3
experimentos independentes.
Os resultados demonstram que os parasitos tratados com o composto PNAT 20,
além de terem apresentado despolarização do ΔΨ𝑚 (Figura 4), apresentam também estresse
oxidativo, com o aumento da produção de EROs (Figura 5). Estes fatores podem favorecer a
morte do parasito, visto a mitocôndria ser uma organela importante na sobrevida de
Leishmania spp. e a disfunção da mesma pode levar a danos irreversíveis.
33
5 CONCLUSÕES
Compostos sintéticos derivados das hidrazonas, apresentaram efeito significativo
em formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis e foram mais tóxicos para os
parasitos do que para os macrófagos hospedeiros.
Estudos em promastigotas L. amazonensis com o melhor composto selecionado
(PNAT 20) demonstraram que o efeito antileishmanial do composto está associado a danos
mitocondriais, como evidenciado pela despolarização do Δψm e aumento na produção de
EROs.
Assim, em resumo, os resultados obtidos neste trabalho destacam o potencial
antileishmanial in vitro do composto PNAT 20, o que abre perspectivas para o estudo in vivo
do mesmo, além da síntese de novos compostos com esta classe de moléculas.
34
REFERÊNCIAS
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APÊNDICE A
Synthesis, biological activity, and mechanism of action of 2- pyrazyl and
pyridylhydrazone derivatives, new classes of antileishmanial agents
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