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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
OTÁVIO AUGUSTO MAZZONI COELHO
RACTOPAMINA EM CARNE SUÍNA: VALIDAÇÃO DE
MÉTODO POR ENSAIO DE IMUNOADSORÇÃO
ENZIMÁTICA E ESTUDO DE OCORRÊNCIA
Belo Horizonte, MG 2016
OTÁVIO AUGUSTO MAZZONI COELHO
RACTOPAMINA EM CARNE SUÍNA: VALIDAÇÃO DE
MÉTODO POR ENSAIO DE IMUNOADSORÇÃO
ENZIMÁTICA E ESTUDO DE OCORRÊNCIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção de grau de Mestre em Ciência de Alimentos. Área de concentração: Ciência de Alimentos Orientadora: Scheilla Vitorino C. de Souza Ferreira
Belo Horizonte, MG 2016
Coelho, Otávio Augusto Mazzoni.
C672r
Ractopamina em carne suína: validação de método por ensaio de imunoadsorção enzimática e estudo de ocorrência / Otávio Augusto Mazzoni Coelho. – 2016.
119 f. : il.
Orientadora: Scheilla Vitorino C. de Souza Ferreira. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos.
1. Validação intralaboratorial – Teses. 2. Ractopamina –
Teses. 3. Carne suína – Teses. 4. Teste imunoenzimático – Teses. I. Ferreira, Scheilla Vitorino C. de Souza. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. III. Título.
CDD: 664.07
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos (PPGCA) da Faculdade
de Farmácia (FAFAR) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).
À Genese Produtos Diagnósticos Ltda pelo treinamento na operação do kit e pelo
fornecimento de equipamentos em comodato.
Ao Laboratório Nacional Agropecuário - Minas Gerais (LANAGRO-MG) do Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Pesquisadoras Andréa Melo
Garcia de Oliveira e Josefa Abucáter Lima, pelo fornecimento das amostras de carne
e análise confirmatória.
Ao Laboratório de Micologia e Micotoxinas do Instituto Octávio Magalhães (IOM) da
Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Pesquisadores Marize Silva de Oliveira e
Fabiano Narciso Paschoal, pelo treinamento, auxílio e empréstimo de equipamento.
Aos laboratórios de Controle de Qualidade (LCQ-BIO) e de Hematolgia Clínica da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, Profa. Isabela da
Costa César e Profa Maria das Graças Carvalho, pelo auxílio e empréstimo de
materiais e equipamento.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa de mestrado.
À Biblioteca da FAFAR, Secretaria do Departamento de Alimentos da FAFAR/UFMG
e Secretaria do PPGCA pela assistência nas pesquisas bibliográficas e resolução de
questões administrativas.
Ao Setor de Serviços Gerais/Apoio Didático da FAFAR/UFMG, Sr. Fernando e Sr.
Gilmar, pelo apoio logístico na coleta das amostras e assistência técnica durante a
execução das análises.
AGRADECIMENTOS PESSOAIS
À Profª Dra Scheilla Vitorino Carvalho de Souza, pelos seis anos de orientações,
ensinamentos e amizade. Agradeço por compartilhar comigo os valores de uma vida
acadêmica, além de tanto conhecimento científico e profissional.
Ao Prof. Dr. Roberto Gonçalves Junqueira, cuja contribuição foi essencial ao longo
destes dois anos, tanto na sala de aula como, mais ainda, fora dela.
Aos professores do PPCGA da FAFAR/UFMG, por tanta dedicação a nós, discentes.
Aos amigos do Laboratório de Bromatologia - Unidade de Pesquisa Análise de
Alimentos (BRO-UPAA) da FAFAR/UFMG, pela ajuda de cada um neste trabalho e
pelo companheirismo de sempre.
Aos membros da comissão examinadora, Dra. Andréa Melo Garcia de Oliveira, Dra.
Raquel Linhares Bello de Araújo e Dr. Roberto Gonçalves Junqueira, pelo tempo
dedicado a esta dissertação e por suas tão prezadas sugestões e contribuições.
À minha sobrinha, Íris, por sempre me lembrar que praticamos a Ciência para deixar
uma realidade melhor aos que vieram e virão depois de nós.
À minha mãe, Vânia, à minha irmã, Letícia e à minha avó, Vera, por todo o apoio,
suporte e amor, pela compreensão das minhas ausências durante a elaboração
deste trabalho. Por saberem que mesmo longe não deixei de estar com elas em
pensamento e se esforçarem para estar comigo quando eu mais precisava.
À minha namorada, Bárbara, pelo amor e por ter estado ao meu lado ao longo de
todo este processo. Por ter me estimulado e ajudado tanto a entrar nesse projeto e
também a permanecer nele e finalizá-lo. Por me completar na vida e, com isso,
possibilitar que eu vá mais longe. Agradeço também a seus pais, Almir e Celi, pelo
amor e pelo incentivo ao longo de toda esta caminhada.
Ao meu primo, Felipe, e a sua esposa, Stella, cuja hospitalidade em São Paulo foi
essencial para o início deste trabalho.
RESUMO
A carne suína é a mais produzida e consumida no mundo, sendo o Brasil o quinto
maior produtor e quarto maior exportador do produto. A ractopamina (RCT) é um
agonista ß-adrenérgico e tem seu uso permitido como promotor de crescimento em
diversos países, incluindo o Brasil. No entanto, seu uso é proibido em países como a
China e a Rússia e na União Europeia. Existem casos em que resíduos de agonistas
ß-adrenérgicos resultaram em intoxicação alimentar. Dessa forma, mesmo nos
países onde o uso da RCT é permitido existem limites máximos. Vários métodos
analíticos, com diferentes técnicas, já foram descritos para determinação de resíduo
de RCT e seus metabólitos em tecido e fluidos animais. Para propósitos regulatórios,
tanto ensaios de triagem como confirmatórios são necessários. Na literatura recente
existem relatos de estudos de desenvolvimento de kits para determinação sensível e
seletiva de multi ß-agonistas e específicos para RCT. Contudo, em nenhum trabalho
foram realizadas validações completas e apropriadas para RCT em músculo suíno.
O presente estudo teve como objetivo validar um kit comercial para triagem de
resíduos de RCT em músculo de suínos e aplicá-lo em um estudo de ocorrência
desses resíduos em carne suína disponível no mercado de Minas Gerais, Brasil.
Amostras de músculo suíno adicionadas de RCT nas concentrações de 0,029 µg/kg
a 1,948 µg/kg, mais o branco, foram analisadas, em 30 replicatas em cada nível.
Embora o kit não tenha apresentado desempenho satisfatório numa abordagem de
validação quantitativa, ele foi eficaz para a detecção de resíduos de RCT em carne
suína. Taxa de falso-positivos nula e taxas de seletividade de 100,0 % foram
estimadas para as amostras brancas. Taxas de sensibilidade variaram entre 22,2 %
e 100,0 %, sendo alcançados 100,0 % de resultados positivos para todos os níveis
acima de 0,244 µg/kg, indicando sensibilidade do kit. Os valores de acordância e
concordância indicaram padronização adequada da metodologia para o nível 0 µg/kg
e acima de 0,244 µg/kg. O limite de detecção estimado foi de 0,190 µg/kg, a 90% de
confiabilidade. O kit foi seletivo em relação ao interferente clembuterol e robusto em
relação aos fatores tempo de agitação, tempo de centrifugação e temperatura de
evaporação do extrato. A análise de amostras comerciais demonstrou a
aplicabilidade do método, além da ocorrência de resíduos de RCT em 73 % das
amostras analisadas. Palavras-chave: validação intralaboratorial; qualitativa;
quantitativa; ractopamina; carne suína; ELISA.
ABSTRACT
Pork is the most widely produced and consumed meat in the world and Brazil is the
fifth largest producer and fourth largest exporter of this product. Ractopamine (RCT)
is a beta-adrenergic agonist and is allowed as a growth promoter in several
countries, including Brazil and the United States. However, it is banned in countries
like China and Russia and in the European Union both as an additive as for
therapeutic purposes. There are cases in the literature in which residues of beta-
adrenergic agonists resulted in human food poisoning. Thus, even in countries where
the use of RCT is allowed there are regulated limits. Various analytical methods
employing different techniques have been described for determining RCT and its
metabolites residues in animal tissue and fluids. For regulatory purposes, both
confirmatory and screening tests are needed. In recent literature there are reports of
studies for the development of kits for sensitive and selective determination of multi
beta-agonists and specific to RCT. However, in none, there were complete and
appropriate validations for RCT in swine muscle. This study aimed to validate a
commercial kit for screening RCT residues in swine muscle and apply it in a study of
the occurrence of RCT residues in pork available on the market of Minas Gerais,
Brazil. RCT was added to swine muscle samples at concentrations from 0.029 µg/kg
to 1.948 µg/kg, plus blank, and were analyzed in 30 replicates at each level. Although
the kit have not had a satisfactory performance in a quantitative validation approach,
it was effective for the detection of RCT residues in pork. False positive rate of zero
and 100.0% selectivity rates were estimated for blank samples. Sensitivity rates
varied between 22.2% and 100.0%, and reached 100.0% positive results for all levels
above 0.244 µg/kg, indicating sensitivity. Calculated values of accordance and
concordance indicated adequate standardization of the method for level 0 µg/kg and
above 0.244 µg/kg. The limit of detection was estimated in 0.190 µg/kg, assuming a
90% reliability. The kit was selective in presence of clenbuterol and robust for the
head over head homogenization time, centrifugation time and extract evaporation
temperature. The analysis of commercial samples demonstrated the applicability of
the method and the occurrence of RCT residue in 73% of analyzed samples.
Keywords: in-house validation; quantitative; qualitative, ractopamine; pork; ELISA.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Países maiores importadores da carne suína brasileira, em mil toneladas,
em 2012. ....................................................................................................................... 23
Figura 2. Países maiores importadores de carne suína, em 2013, em toneladas. ....... 24
Figura 3. Países maiores exportadores de carne suína, em 2013, em toneladas. ....... 24
Figura 4. Consumo anual per capita de carne suína em uma década no Brasil, de
2005 a 2014. ................................................................................................................. 25
Figura 5. Países maiores consumidores de carne suína, em 2009, em toneladas. ...... 26
Figura 6. Projeção de consumo, produção e exportação de carne suína no Brasil até
2024. ............................................................................................................................. 27
Figura 7. Principais cortes da carcaça suína. ............................................................... 34
Figura 8. Faturamento da Indústria de Produtos para a Saúde Animal, no Brasil,
entre 2008 e 2014. ........................................................................................................ 35
Figura 9. Percentual do faturamento de produtos para saúde animal, em 2014, por
classe de produto. ......................................................................................................... 35
Figura 10. Grupos de animais aos quais foram destinados os produtos para saúde
animal comercializados no Brasil, em 2014. ................................................................. 36
Figura 11. Mecanismo de transdução de sinal de receptores ß-adrenérgicos. O
receptor ß-adrenérgico é ativado por um agonista e interage com a proteína Gs. A
proteína Gs estimula a adenilatociclase (AC) para converter adenosina trifosfato
(ATP) a adenosina monofosfato cíclico (cAMP), que age como um sinalizador
intracelular. Níveis aumentados de cAMP ativam a proteína quinase A (PKA) para
fosforilar várias enzimas e fatores regulatórios importantes na regulação metabólica. . 39
Figura 12. Fórmula estrutural da ractopamina. ............................................................. 41
Figura 13. Esquema representativo de um Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
(ELISA) competitivo para pesquisa de antígeno. .......................................................... 57
Figura 14. Representação esquemática dos poços da placa ELISA ............................ 77
Figura 15. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação dos parâmetros seletividade, recuperação, precisão e limites, na
abordagem quantitativa, e dos parâmetros taxas, região de perda de confiabilidade,
limite de detecção, acordância e concordância, na abordagem qualitativa. .................. 79
Figura 16. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação do parâmetro robustez. ............................................................................ 80
Figura 17. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação do parâmetro seletividade. ....................................................................... 81
Figura 18. Representação esquemática de ocorrência. ............................................... 84
Figura 19. Valores de acordância em função das concentrações estudadas de
ractopamina. .................................................................................................................. 91
Figura 20. Valores de concordância em função das concentrações estudadas de
ractopamina. .................................................................................................................. 92
Figura 21. Resultados experimentais (), curvas de desempenho (), equações e
coeficientes de determinação (R2) obtidos por regressão logística não linear do tipo
probito (a) e logito (b) para ractopamina (RCT). ............................................................ 93
Figura 22. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre os
cortes para avaliação da influência dos diferentes cortes na detecção de
ractopamina. .................................................................................................................. 97
Figura 23. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre os
fornecedores para avaliação da influência dos diferentes fornecedores na detecção
de ractopamina. ............................................................................................................. 98
Figura 24. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre as
estações do ano para avaliação da influência da sazonalidade na detecção de
ractopamina. .................................................................................................................. 99
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efetivo de suínos em cabeças e participações relativa e acumulada no
efetivo total, segundo as Unidades da Federação do Brasil, em 2014 .......................... 22
Tabela 2. Composição nutricional média da carne suína fresca e crua (continua) ....... 29
Tabela 3. Estudos de toxicidade aguda com ractopamina ............................................ 45
Tabela 4. Limites Máximos de Resíduos (LMR) para ractopamina no Brasil e em
outros países ................................................................................................................. 47
Tabela 5. Escopos e resultados do Programa Nacional de Resíduos (NRP) dos
Estados Unidos, nos anos de 2000 a 2015, considerando o analito ractopamina em
matrizes de suínos ........................................................................................................ 50
Tabela 6. Escopos e resultados do Plano Nacional de Controle de Resíduos em
Produtos de Origem Animal, do Brasil, nos de 2001 a 2014, considerando o analito
ractopamina em matrizes de suínos .............................................................................. 52
Tabela 7. Tabela de contingência 2 x 2 utilizada para cálculo das taxas de falsos
resultados, de seletividade, de sensibilidade e de confiabilidade .................................. 69
Tabela 8. Mapa de adição de solução padrão de ractopamina e de solvente de
extração para preparação das amostras nos diferentes níveis de concentração .......... 79
Tabela 9. Médias de recuperação e desvios padrão relativos, sob condições de
repetibilidade e precisão intermediária, obtidos na determinação de ractopamina em
músculo de suíno pelo kit 5061RACT ........................................................................... 87
Tabela 10. Taxas de falso-negativos, falso-positivos, de sensibilidade, de
seletividade e de confiabilidade obtidas na detecção de ractopamina em músculo de
suíno pelo kit 5061RACT............................................................................................... 90
Tabela 11. Acordância e concordância estimadas na detecção de ractopamina em
músculo de suíno pelo kit 5061RACT ........................................................................... 91
Tabela 12. Taxas de falso-positivos, de falso-negativos e de confiabilidade obtidas
para amostras brancas e adicionadas de ractopamina, em nível com 100 % de
confiabilidade, na presença de clembuterol .................................................................. 94
Tabela 13. Taxas de confiabilidade estimadas nos diferentes tratamentos do
experimento de robustez para amostras adicionadas de ractopamina, em nível com
100 % de confiabilidade ................................................................................................ 94
Tabela 14. Resultados do estudo de ocorrência da ractopamina nos três cortes de
carne suína avaliados ................................................................................................... 95
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
AC Adenilatociclase
ACO Acordância
AOAC Association of Official Analytical Chemists
BRO-UPAA Laboratório de Bromatologia - Unidade de Pesquisa Análise de Alimentos
cAMP Monofosfato de Adenosina Cíclico
CCα Limite de Decisão
CCß Capacidade de Detecção
CGCRE Coordenação Geral de Acreditação
CIPLA Ensaio de Ligação por Proximidade Imunomagnética Competitiva
COMT Catecolaminas O-metil Transferases
CON Concordância
CPAA Coordenação de Produtos para Alimentação Animal
CPV Coordenação de Fiscalização de Produtos Veterinários
DDA Departamento de Defesa Animal
DIPOA Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal
ECL Imunossenssores de Eletroquimioluminescência
ELISA Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
FAFAR Faculdade de Farmácia
FAO Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura
FDA Food and Drug Administration
FSIS Food Safety and Inspection Service
IDA Ingestão Diária Aceitável
IDR Ingestão Diária Recomendada
HCA Análise de Cluster Hierárquica
HPLC Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
JECFA Comitê Científico Internacional de Especialistas em Aditivos Alimentares
LANAGRO Laboratório Nacional Agropecuário
LD Limite de Detecção
LMR Limite Máximo de Resíduo
LQ Limite de Quantificação
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MRC Material de Referência Certificado
NOEL Limite de Dose Sem Efeito Observado
NRP National Residue Program
PCA Análise de Componente Principal
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PNCRC/Animal Plano Nacional de Controle de Resíduos em Produtos de Origem Animal
RCT Ractopamina
RPC Região de Perda de Confiabilidade
RSDr Desvio Padrão Relativo de Repetibilidade
RSDR Desvio Padrão Relativo de Reprodutibilidade
SINDAN Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para a Saúde Animal
SPR Ressonância Plasmônica de Superfície
TCF Taxa de Confiabilidade
TFN Taxa de Falsos Negativos
TFP Taxa de Falsos Positivos
TR-FIA Fluoroimunoensaio por Tempo Resolvido
TSB Taxa de Sensibilidade
TST Taxa de Seletividade
UPLC-MS/MS Cromatografia a Líquido de Ultra Eficiência Acoplada a Espectrometria de Massas
USDA United States Department of Agriculture
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... 9 LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... 11 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 17 2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 20 2.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 20
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 20 3. REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 21 3.1 CARNE SUÍNA ................................................................................................. 21
3.1.1 ASPECTOS ECONÔMICOS ............................................................................ 21 3.1.2 ASPECTOS NUTRICIONAIS ........................................................................... 27 3.1.3 A CADEIA PRODUTIVA DA CARNE SUÍNA NO BRASIL ............................... 31 3.2 RESÍDUOS DE MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS EM ALIMENTOS ........... 34
3.2.1 AGONISTAS BETA-ADRENÉRGICOS ............................................................ 38 3.2.2 REGULAMENTAÇÃO EM CARNE SUÍNA ...................................................... 46 3.2.3 PROGRAMAS DE MONITORAMENTO ........................................................... 48 3.3 MÉTODOS DE ANÁLISE ................................................................................. 53
3.3.1 PRINCIPAIS TÉCNICAS .................................................................................. 53 3.3.2 VALIDAÇÃO ..................................................................................................... 58
3.3.3 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DA VALIDAÇÃO INTRALABORATORIAL PARA MÉTODOS QUANTITATIVOS ..................................... 60
3.3.4 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DA VALIDAÇÃO INTRALABORATORIAL PARA MÉTODOS QUALITATIVOS ....................................... 69
4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 71 4.1 AMOSTRAS ..................................................................................................... 71 4.1.1 VALIDAÇÃO ..................................................................................................... 71
4.1.2 ESTUDO DE OCORRÊNCIA ........................................................................... 71 4.2 EQUIPAMENTOS ............................................................................................ 72
4.3 MATERIAIS ...................................................................................................... 73
4.4 REAGENTES, PADRÕES E OUTROS ............................................................ 74 4.5 SOLUÇÕES ..................................................................................................... 74 4.5.1 SOLUÇÕES FORNECIDAS PELO KIT ............................................................ 74
4.5.2 SOLUÇÕES PADRÃO DE RCT ....................................................................... 75
4.5.3 SOLUÇÕES PADRÃO DE CLEM .................................................................... 76 4.6 PROCEDIMENTO ANALÍTICO ........................................................................ 76 4.7 VALIDAÇÃO ..................................................................................................... 78
4.7.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................ 78 4.7.2 ANÁLISE DE DADOS ...................................................................................... 81
4.8 ESTUDO DE OCORRÊNCIA ........................................................................... 84 4.8.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................ 84 4.8.2 ANÁLISE DE DADOS ...................................................................................... 85
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 86 5.1 VALIDAÇÃO ..................................................................................................... 86
5.1.1 ABORDAGEM QUANTITATIVA ....................................................................... 86
5.1.2 ABORDAGEM QUALITATIVA .......................................................................... 89 5.2 ESTUDO DE OCORRÊNCIA ........................................................................... 95 6. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 100 7. PUBLICAÇÕES ....................................................................................................... 101
8. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 102
17
1. INTRODUÇÃO
A carne suína é a mais produzida e consumida no mundo, tendo China,
Estados Unidos, Alemanha, Espana e Brasil como os cinco maiores produtores
mundiais. O Brasil ocupa também a posição de quarto maior exportador de carne
suína no mundo (Faostat, 2015). No entanto, oito dos dez maiores importadores de
carne suína do mundo não figuram dentre os maiores importadores da carne
brasileira, demonstrando potencial para números ainda maiores na exportação
nacional.
O Brasil se destaca, ainda, no mercado mundial de produtos destinados à
saúde animal, com um faturamento anual crescente, que atingiu 4,42 bilhões de
reais no ano de 2014, incluindo produtos biológicos, antiparasitários,
antimicrobianos, terapêuticos, suplementos e outros (Sindan, 2015).
A ractopamina (RCT) é um agonista ß-adrenérgico e tem seu uso permitido
como promotor de crescimento, em 27 países, incluindo o Brasil e os Estados
Unidos. No entanto, seu uso é proibido em países como a China e a Rússia e na
União Europeia independente do propósito. Nessa última, o único ß-agonista com
uso permitido é o clembuterol (CLEM), desde que para fins terapêuticos e sob estrito
acompanhamento veterinário (Efsa, 2013).
A RCT foi o primeiro componente de sua classe a ter o uso aprovado pelo
Food and Drug Administration (FDA) como promotor de crescimento. A aprovação
pelo FDA para uso em suínos aconteceu em 2000, sob o nome comercial de
Paylean® (Elanco Animal Health, Greenfield, IN). Em 2003, foi aprovada para uso
em gado em terminação, sob o nome comercial de Optaflexx® (Elanco Animal
Health). No Brasil, cinco marcas de RCT têm seu uso autorizado como aditivo
alimentar para animais pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA) (Freire et al., 2009; Brasil, 2014a; 2015a).
O ganho econômico com o uso de RCT faz com que o produto seja atrativo
para suinocultores e, talvez, criadores de outras espécies para as quais a RCT não
tem o uso aprovado (Shelver, Smith e Berry, 2000).
18
Existem diversos casos bem documentados em que o uso ilegal de ß-
adrenérgicos resultou na intoxicação alimentar de humanos. Sem exceção, todos
esses incidentes foram causados pela toxicidade de um ß-agonista, o CLEM, mas
toda a classe de compostos é tratada com grande cautela pelas autoridades
regulatórias. Os sintomas ligados a essas intoxicações incluem tremores
musculares, taquicardia, nervosismo, cefaleia e mialgia durando até 40 horas
(Martínez-Navarro, 1990; Pulce et al., 1991; Salleras et al., 1995; Elliott et al., 1998).
Além de todos esses efeitos, há ainda a preocupação com a dessensibilização dos
receptores ß-adrenérgicos (Jecfa, 2004), o que é particularmente importante quando
se tratam de indivíduos asmáticos e, especialmente, em casos de crianças e idosos.
Dessa forma, mesmo nos países onde o uso da RCT é permitido existem
limites regulamentados. O limite recomendado pelo Codex Alimentarius para RCT
em músculo de suíno é de 10 µg/kg. O Brasil adota esse mesmo limite para tomada
de ação regulatória. Com a finalidade de monitoramento para exportação, o limite
estabelecido é de 0,1 µg/kg, determinado no Subprograma de Monitoramento em
Carnes (Bovina, Aves, Suína e Equina) Leite, Pescado, Mel e Ovos (Codex
Alimentarius, 2010; Brasil, 2014b).
Para propósitos regulatórios, tanto ensaios de triagem como confirmatórios
são usados visando à detecção de resíduos de substâncias permitidas e não
permitidas. Imunoensaios são ferramentas de triagem convenientes para a detecção
de analitos em diversas matrizes e têm vasta aplicação para determinação de
presença de toxinas ambientais, herbicidas, inseticidas, pesticidas e fármacos
(Shelver, Smith e Berry, 2000).
Imunoensaios são métodos recomendados para triagem por serem rápidos,
confiáveis e relativamente baratos (Shelver, Smith e Berry, 2000). Embora na
literatura existam estudos empregando ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA,
em inglês) para determinação sensível e seletiva de RCT em músculo suíno (Elliott
et al., 1998; Shelver, Smith e Berry, 2000; Shelver e Smith, 2002; Liu et al., 2014), os
processos reportados para validação destes ensaios são incompletos considerando
os parâmetros de desempenho avaliados (Thompson, Ellison e Wood, 2002; Souza,
2007; Gondim et al., 2014).
19
Independentemente da técnica utilizada, todo o trabalho para manutenção de
uma estrutura de monitoramento da qualidade de alimentos, visando à segurança
alimentar, tem como base o grau de confiabilidade dos métodos analíticos utilizados.
Assim, os laboratórios e indústrias que realizam análises de resíduos de
medicamentos veterinários devem dispor de métodos devidamente validados e
monitorados (Gondim, 2012).
Neste contexto, o presente trabalho foi fundamentado na importância tanto da
validação de kits comerciais de ELISA para triagem de resíduos de RCT em músculo
de suíno, quanto da realização de estudos de ocorrência de resíduos deste agonista
ß-adrenérgico, mesmo que abaixo do limite para tomada de ação regulatória.
20
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Realizar a validação intralaboratorial de um kit de ELISA comercial para
triagem, de resíduos de RCT em músculo de suíno, empregando abordagens
quantitativa e qualitativa, e aplicar o kit validado em um estudo de ocorrência de
resíduos deste medicamento veterinário em diferentes cortes de carne suína
comercializados no estado de Minas Gerais, Brasil.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Validar um kit de ELISA comercial para determinação de resíduos de RCT em
músculo de suínos, empregando abordagem quantitativa na validação, com
avaliação dos parâmetros: seletividade, recuperação, precisão (sob condições de
repetibilidade e precisão intermediária), limite de detecção (LD), limite de
quantificação (LQ) e incerteza de medição.
Validar um kit de ELISA comercial para detecção de resíduos de RCT em
músculo de suínos, empregando abordagem qualitativa na validação, com
avaliação dos parâmetros: taxa de falso positivo (TFP), taxa de falso negativo
(TFN), taxa de sensibilidade (TSB), taxa de seletividade (TST), taxa de
confiabilidade (TCF), LD, região de perda de confiabilidade (RPC), acordância
(ACO), concordância (CON), seletividade complementar e robustez.
Aplicar o kit comercial validado em um estudo da ocorrência de resíduos de RCT
em diferentes cortes de carne suína comercializada no estado de Minas Gerais,
Brasil.
Avaliar a relação de fatores como tipo de corte, fornecedor e sazonalidade com a
detecção da RCT.
21
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 CARNE SUÍNA
3.1.1 ASPECTOS ECONÔMICOS
A carne suína é a mais produzida e consumida no mundo, correspondendo
em 2013 a 36 % do total de carne, ou seja, dos 310 milhões de toneladas em
equivalente carcaça. Este panorama é sustentado pela China, que é responsável
pelo consumo de mais de 50 % da produção mundial de carne suína (Faostat,
2015).
A produção mundial de carne suína no ano de 2013 foi de 113 milhões de
toneladas em equivalente carcaça, sendo China, Estados Unidos, Alemanha,
Espanha e Brasil os cinco maiores produtores no cenário mundial. Em termos de
comparação, a segunda carne mais produzida no mundo, nesse mesmo ano, foi a
carne de frango, representando uma produção mundial de 96,1 milhões de
toneladas, seguida da carne bovina, com uma produção mundial de 64 milhões de
toneladas (Faostat, 2015).
Nesse mesmo ano, a produção brasileira alcançou os 3,3 milhões de
toneladas (Faostat, 2015). Em 2012, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Paraná,
Minas Gerais e Mato Grosso compreenderam os estados maiores produtores com
790, 608, 525, 468 e 207 mil toneladas, respectivamente (Abipecs, 2014b). Tais
estados estão, naturalmente, entre aqueles com maior efetivo de suínos em
cabeças, como relacionado na Tabela 1.
22
Tabela 1. Efetivo de suínos em cabeças e participações relativa e acumulada no
efetivo total, segundo as Unidades da Federação do Brasil, em 2014
Unidades da Federação Efetivo de suínos
em cabeças
Participações no efetivo total (%)
Relativa Acumulada
Paraná 6 394 330 16,9 16,9 Santa Catarina 6 178 702 16,3 33,1
Rio Grande do Sul 6 108 876 16,1 49,3 Minas Gerais 5 217 920 13,8 63,0
Goiás 2 016 940 5,3 68,3 Mato Grosso 1 840 910 4,9 73,2 São Paulo 1 404 470 3,7 76,9
Bahia 1 286 880 3,4 80,3 Maranhão 1 223 787 3,2 83,5
Mato Grosso do Sul 1 217 651 3,2 86,7 Ceará 1 188 106 3,1 89,8 Piauí 837 765 2,2 92,1 Pará 559 417 1,5 93,5
Pernambuco 514 500 1,4 94,9 Espírito Santo 307 124 0,8 95,7
Tocantins 273 703 0,7 96,4 Rio Grande do Norte 217 783 0,6 97,0
Rondônia 203 551 0,5 97,5 Distrito Federal 163 985 0,4 98,0
Alagoas 149 647 0,4 98,4 Paraíba 148 335 0,4 98,7
Acre 128 875 0,3 99,1 Rio de Janeiro 103 480 0,3 99,4
Sergipe 100 012 0,3 99,6 Amazonas 71 008 0,2 99,8
Amapá 43 594 0,1 99,9 Roraima 28 006 0,1 100,0
Brasil 37 929 357 100,0 - Fonte: adaptado de IBGE (2014).
Como demonstrado na Figura 1, o excedente exportado da produção
brasileira teve como principais destinos Ucrânia, Rússia, Hong Kong, Angola,
Cingapura, Argentina, Uruguai, Georgia, Haiti e Venezuela (Abipecs, 2014a), sendo
os três primeiros países detentores de mais de 73,5 % da importação da carne
brasileira.
23
Figura 1. Países maiores importadores da carne suína brasileira, em mil toneladas,
em 2012.
Fonte: ABIPECS (2014a).
Os dados mais recentes de importação de carne suína indicam que, em 2013,
os países que mais importaram carne suína no mundo foram o Japão seguido de
Rússia, China, Coreia do Sul, Estados Unidos, França, Itália, México, Austrália e
Reino Unido (Faostat, 2015). O total de carne suína importada por esses dez países
em 2013 ultrapassou 3 milhões de toneladas (Figura 2). O fato de somente a Rússia
figurar dentre os importadores da carne suína brasileira sinaliza um potencial de
significativo aumento nas exportações da produção nacional pela abertura de novos
mercados. Alguns desses países, como exemplo a própria Rússia, proíbem o uso de
RCT e por isso os animais destinados a estes mercados devem ser tratados de
maneira segregada ao longo da cadeia produtiva.
138.666
127.070
124.701
45.534
28.171
23.386
20.639
9.907
6.606 6.55350.244
UCRÂNIA
RÚSSIA
HONG KONG
ANGOLA
CINGAPURA
ARGENTINA
URUGUAI
GEORGIA
HAITI
VENEZUELA
OUTROS
24
Figura 2. Países maiores importadores de carne suína, em 2013, em toneladas.
Fonte: FAOSTAT (2015).
Os dados mais recentes de exportação de carne suína indicaram que, em
2013, os países que mais exportaram carne suína no mundo foram os Estados
Unidos seguidos de Alemanha, Canadá, Brasil, Espanha, Dinamarca, Holanda,
Polônia, França e Bélgica (Faostat, 2015). O total de carne suína exportada por
esses dez países em 2013 ultrapassou as 4,2 milhões de toneladas (Figura 3).
Figura 3. Países maiores exportadores de carne suína, em 2013, em toneladas.
Fonte: FAOSTAT (2015).
0
200
400
600
800
Qu
an
tid
ad
e im
po
rta
da
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10
00
t)
0
200
400
600
800
1000
1200
Qu
an
tid
ad
e e
xp
ort
ad
a (
x 1
00
0 t
)
25
No Brasil, o consumo de carne suína apresentou tendência de crescimento
entre 2005 e 2011, permanecendo estável desde então, chegando a
aproximadamente 14,6 kg/habitante, no ano de 2014 (Figura 4) (Abpa, 2016).
Figura 4. Consumo anual per capita de carne suína em uma década no Brasil, de
2005 a 2014.
Fonte: ABPA (2016).
O consumo total de carne suína no Brasil, em 2009, foi o sexto maior do
mundo, representando 2,4 milhões de toneladas. China, União Europeia, Estados
Unidos e Rússia tiveram consumo maior que o Brasileiro (Figura 5) (Aps, 2016).
11
11,5
12
12,5
13
13,5
14
14,5
15
15,5
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
Co
ns
um
o a
nu
al p
er
ca
pit
a(k
g)
Ano
Consumo (kg/hab)
26
Figura 5. Países maiores consumidores de carne suína, em 2009, em toneladas.
Fonte: APS (2016).
Segundo projeções da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento
Econômico da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura
(OECD/FAO, em inglês) (2015), o consumo mundial de carne deve crescer,
anualmente, em uma média de 1,4 % até 2024, resultando em mais 51 milhões de
toneladas. O consumo de carnes de aves deve ter o maior crescimento, numa taxa
de 2 % ao ano, enquanto o consumo de carne suína deve crescer menos que 1 %
ao ano, sendo ultrapassado pelo mercado de carnes de aves.
A produção brasileira de carne deve continuar seu rápido crescimento na
próxima década. A depreciação do Real frente ao Dólar, a diminuição do preço da
ração, o melhoramento genético dos animais, assim como de sua saúde e nutrição,
devem sustentar essa expansão. A produção de carne suína no Brasil deve chegar a
4,3 milhões de toneladas em 2024 (Figura 6). Até esse ano, o consumo per capita
anual deve crescer 2 kg (Oecd/Fao, 2015).
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Qu
an
tid
ad
e c
on
su
mid
a (
x 1
00
0 t
)
27
Figura 6. Projeção de consumo, produção e exportação de carne suína no Brasil até
2024.
Fonte: OECD/FAO (2015).
3.1.2 ASPECTOS NUTRICIONAIS
A carne suína magra fornece alta concentração de nutrientes em relação ao
seu valor energético. Uma porção de 100 g de lombo suíno aparado contribui
somente com 6 % das calorias numa dieta de 2000 kcal, sendo fonte de mais de
20 % da ingestão diária recomendada (IDR) de tiamina, vitamina B6, fósforo e
niacina, e fonte de entre 10 % e 20 % da IDR de riboflavina, potássio e zinco
(Abipecs, 2015).
A digestão de diferentes ácidos graxos tem influência marcante no
metabolismo lipídico, sendo muito importante na composição de lipoproteínas e na
produção de eicosanoides (Sant'ana, 2012). O equilíbrio entre ácidos graxos
insaturados e saturados constitui uma importante característica nutricional da carne
suína. Com um teor de ácidos graxos saturados inferior a 40 % e de ácidos
insaturados superior a 60 %, ela pode ser comparada à carne do frango. O perfil de
ácidos graxos da carne suína atende, assim, às recomendações nutricionais
relativas à diminuição de lipídios na alimentação, por meio da redução do aporte de
ácidos graxos saturados em favor dos ácidos graxos mono e poli-insaturados
(Abipecs, 2015).
0
1
2
3
4
520
00
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
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09
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10
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11
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20
21
20
22
20
23
20
24C
on
su
mo
ou
pro
du
çã
o (
x1
00
0)
t
Consumo Produção
28
A qualidade nutricional das proteínas pode ser avaliada por diferentes
procedimentos de acordo com sua capacidade de fornecer aminoácidos essenciais,
ou seja, além de presentes na estrutura polipeptídica, esses aminoácidos devem
estar biodisponíveis para o organismo. Alguns fatores podem influenciar nessa
biodisponibilidade como conformação estrutural, presença de compostos
antinutricionais, efeito das condições de processamento e complexação com outros
nutrientes. Os alimentos de origem animal possuem proteínas consideradas
completas, ou seja, são de boa qualidade e suficientes para serem consideradas
fontes de aminoácidos essenciais para o organismo humano (Tirapegui, Castro e
Rossi, 2012). As proteínas da carne suína possuem um excelente valor biológico,
pois elas têm um aporte de aminoácidos essenciais em proporções favoráveis para
permitir as sínteses proteicas do organismo (Abipecs, 2015).
Do ponto de vista vitamínico, a carne suína se distingue essencialmente por
sua riqueza em vitaminas do complexo B e, particularmente, pela vitamina B1
(tiamina), que exerce um papel essencial na assimilação dos glicídios, transmissão
de influxos nervosos e funcionamento do sistema neuromuscular (Abipecs, 2015).
A composição nutricional média da carne suína encontra-se descrita na
Tabela 2.
29
Tabela 2. Composição nutricional média da carne suína fresca e crua (continua)
Componente Teor por 100 g
Umidade (g) 49,83
Energia (kcal) 376
Energia (kJ) 1573
Proteína (g) 13,91
Lipídeos totais (g) 35,07
Cinzas (g) 0,72
Carboidratos por diferença (g) 0,00
Minerais
Cálcio (mg) 19
Ferro (mg) 0,69
Magnésio (mg) 13
Fósforo (mg) 155
Potássio (mg) 253
Sódio (mg) 42
Zinco (mg) 1,59
Cobre (mg) 0,055
Manganês (mg) 0,011
Selênio (μg) 28,4
Vitaminas
Vitamina C em ácido ascórbico total (mg)
0,4
Tiamina (B1) (mg) 0,595
Riboflavina (B2) (mg) 0,207
Niacina (B3) (mg) 3,846
Ácido pantotênico (B5) (mg) 0,526
Piridoxina (B6) (mg) 0,284
Folato total (μg) 4
30
Tabela 2. Composição nutricional média da carne suína fresca e crua (conclusão)
Cianocobalamina (B12) (µg) 0,61
Retinol (A) (µg) 2
Vitamina E (alfa tocoferol) (mg) 0,29
Lipídeos
Ácidos graxos saturados (g) 12,440
Ácidos graxos monoinsaturados (g) 15,930
Ácidos graxos poliinsaturados (g) 3,800
Colesterol (mg) 74
Aminoácidos
Triptofano (g) 0,160
Treonina (g) 0,610
Isoleucina (g) 0,616
Lisina (g) 1,230
Metionina (g) 0,347
Cistina (g) 0,169
Fenilalanina (g) 0,547
Tirosina (g) 0,454
Valina (g) 0,454
Arginina (g) 0,911
Histidina (g) 0,509
Alanina (g) 0,832
Ácido Aspártico (g) 1,249
Ácido glutâmico (g) 2,062
Glicina (g) 0,868
Prolina (g) 0,672
Serina (g) 0,574 Fonte: USDA (2014).
31
3.1.3 A CADEIA PRODUTIVA DA CARNE SUÍNA NO BRASIL
A cadeia produtiva de suínos do Brasil reúne mais de 50 mil produtores que
atuam em todos os tamanhos de granjas e nos vários sistemas de produção. Apesar
desse número, a produção de suínos em grandes unidades produtivas tem
aumentado significativamente. A estruturação da atividade em torno das
agroindústrias de abate e processamento de carne, sistema conhecido como
integração contratual ou de integração, permitiu o crescimento e a organização da
suinocultura brasileira. Nos principais sistemas, o suinocultor recebe animais,
insumos, assistência técnica e logística da agroindústria integradora e, por sua vez,
responde pelas instalações, mão de obra, água e energia elétrica, além da gestão
ambiental (Abcs, 2011).
Esse sistema responde por, aproximadamente, 65 % da produção brasileira.
O restante da produção é representado pelo mercado imediato, em que não há um
contrato de exclusividade com determinada agroindústria. Nele, o produtor é
responsável por organizar todos os elos da produção, desde o abastecimento de
matérias primas até a venda dos animais, sendo predominante em Minas Gerais,
São Paulo e no Nordeste (Abcs, 2011).
O MAPA, por meio da Coordenação de Fiscalização de Produtos Veterinários
(CPV) fiscaliza a fabricação, o comércio e o uso de produtos veterinários,
estabelecendo normas, regras e instruções que orientam produtores (grandes e
pequenos), veterinários e consumidores. Por meio desses instrumentos, é possível
incentivar o uso correto e consciente de produtos de uso veterinário legalizados e
também denúncias de comercialização de produtos irregulares. Já o registro de
aditivos para alimentação animal é coordenado pelo MAPA, por meio da Divisão de
Fiscalização de Aditivos, da Coordenação de Produtos para Alimentação Animal
(CPAA). Os aditivos nutricionais são registrados pela Superintendência do MAPA no
estado de jurisdição da empresa e o registro dos demais aditivos é realizado pela
Divisão de Fiscalização de Aditivos (Brasil, 2013a).
Os seguintes sistemas de manejo são aplicados à suinocultura: i) manejo
aplicado à reprodução; ii) manejo aplicado à maternidade; iii) manejo aplicado à
32
creche; iv) manejo aplicado à recria e terminação; e v) manejo pré-abate dos suínos
(Abcs, 2011).
O manejo aplicado à reprodução leva em consideração, principalmente, as
condições das fêmeas (marrãs), como peso, idade, número de cios, vacinação para
doenças reprodutivas e alimentação (Abcs, 2011). O macho (cachaço) deve ser
mantido próximo às fêmeas, mas em áreas separadas, sendo a fêmea levada ao
cachaço no momento da cobrição e retirada logo após (Ferreira, Albanez e Mendes,
2012).
O manejo aplicado à maternidade abrange a fêmea depois de prenhe, em
relação a alojamento e alimentação pré-parto, cuidados e intervenções na indução e
assistência ao parto; a fêmea depois do parto, em relação à alimentação e profilaxia
de doenças relacionadas à maternidade; e os cuidados com os recém-nascidos
imediatamente no pós-parto e na primeira semana de vida, incluindo limpeza, corte
do cordão umbilical, corte de cauda, desgaste dos dentes e castração dos machos.
A alimentação é feita com o colostro nas primeiras seis horas e os leitões passam a
se alimentar de fubá de milho ou ração com dez dias de idade (Abcs, 2011; Ferreira,
Albanez e Mendes, 2012).
O manejo aplicado à creche se refere aos leitões de uma semana até 57 a 63
dias em relação à desmama e introdução de alimentação sólida, considerando os
diversos tipos de ração e as condições ambientais para essa fase (Abcs, 2011;
Ferreira, Albanez e Mendes, 2012).
O manejo aplicado à recria e terminação corresponde ao período entre a
saída da creche e o abate. A recria compreende a saída da creche até a metade do
peso de abate (50 kg a 60 kg de peso vivo) e a terminação vai deste peso até o peso
final de abate (100 kg a 120 kg de peso vivo). Na fase de terminação, a conversão
alimentar é um dos pontos mais importantes a serem monitorados, já que o custo de
alimentação pode chegar de 70 % a 80 % dos custos dessa fase. Além da
alimentação, nessa fase devem-se observar condições ambientais, fornecimento de
água e condições sanitárias (Abcs, 2011). Além disso, medicamentos profiláticos,
como vermífugos, são aplicados nessa etapa (Ferreira, Albanez e Mendes, 2012).
33
Por fim, o manejo pré-abate é crítico devido à forte interação homem-animal.
Nessa etapa, devem-se tomar cuidados no pré-embarque como organização dos
animais, tomada de providências legais, submissão dos animais ao jejum, dentre
outras. No embarque, há cuidados com iluminação e posicionamento do camião, de
rampas de embarque e tábuas de manejo. Finalmente, o transporte representa uma
situação nova para os suínos podendo provocar medo e várias condições de
estresse, devendo ser feito por cautela e por motorista treinado (Abcs, 2011).
No mercado brasileiro, a forma de comercialização mais comum entre
frigoríficos e o varejo é conhecida como meia carcaça. O animal é abatido,
escaldado e depilado, retiram-se as vísceras e o pênis (no caso dos machos),
separa-se a carcaça em duas, retirando-se a medula espinhal, normalmente
deixando o rabo na meia-carcaça à direita. Outra forma cada vez mais comum de
comercialização do suíno entre a indústria e o varejo é a divisão da carcaça em seus
grandes cortes: i) dianteiro, correspondente a paleta e sobrepaleta; ii) parte central
do corpo do animal, incluindo carré e barriga com costela; e iii) pernil traseiro (Abcs,
2010).
Porém, o que interessa ao consumidor final são os cortes gastronômicos
usados para compor os pratos domésticos, destacados na Figura 7. Os principais
cortes dos suínos são nomeados de acordo com sua similaridade com a carcaça
bovina, incluindo: i) pernil traseiro, que inclui o coxão-mole (chã de dentro), o coxão
duro (chã de fora) e a alcatra; ii) o filé mignon (lombinho), porção entre a parte
central e o pernil traseiro; iii) a paleta, principal corte do pernil dianteiro; iv) a copa-
lombo, também conhecida como sobrepaleta, por sua localização, é anterior ao
lombo; v) o lombo, corte muito conhecido e já consagrado entre os consumidores
localizado acima da coluna vertebral; vi) a fraldinha, localizada junto à barriga
(pancetta); vii) a costela; viii) a suã, porção de carne junto à coluna vertebral; ix) o
ossobuco, porção próxima de cada joelho, e os joelhos, em si; e x) os pertences,
pés, focinho, orelha, papada, rabo e máscara (Abcs, 2010).
34
Figura 7. Principais cortes da carcaça suína.
Fonte: adaptado de ABCS (2010).
3.2 RESÍDUOS DE MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS EM
ALIMENTOS
Segundo dados do Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para a Saúde
Animal (SINDAN), o continente americano detém 46 % do mercado mundial de
produtos destinados à saúde animal. Nesse contexto, o Brasil figura com um
faturamento anual crescente, que culminou em 4,42 bilhões de reais no ano de 2014
(Figura 8). Desse montante, 27 % pertencem à classe de produtos biológicos, 22 %
de antiparasitários, 17 % de antimicrobianos, 11 % de terapêuticos, 13 % de
suplementos e 10 % de outros produtos, nos quais estão incluídos os promotores de
crescimento (Figura 9). Destaca-se, ainda, que 12,6 % do montante comercializado
de produtos para a saúde animal foram destinados a suínos (Figura 10) (Sindan,
2015).
35
Figura 8. Faturamento da Indústria de Produtos para a Saúde Animal, no Brasil,
entre 2008 e 2014.
Fonte: SINDAN (2015).
Figura 9. Percentual do faturamento de produtos para saúde animal, em 2014, por
classe de produto.
Fonte: SINDAN (2015).
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
Fa
tura
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Ano
27%
22%
17%
11%
13%
10%
Biológicos Antiparasitários Antimicrobianos
Terapêuticos Suplementos Outros
36
Figura 10. Grupos de animais aos quais foram destinados os produtos para saúde
animal comercializados no Brasil, em 2014.
Fonte: SINDAN (2015).
O uso de medicamentos veterinários é de fundamental importância para a
sanidade e manejo animal e, consequentemente, na produção de alimentos de
origem animal. Medicamentos veterinários são empregados com propósitos
terapêuticos, profiláticos e como promotores de crescimento. Contudo, a
administração destes medicamentos, independente do propósito, pode acarretar a
presença de resíduos nos alimentos de origem animal, principalmente quando não
respeitadas as boas práticas. Considerando-se que um fármaco seja usado de
acordo com sua autorização de uso e que seus períodos de carência sejam
respeitados, os resíduos deixados por ele não devem ser nocivos e não devem
chegar aos alimentos em concentrações prejudiciais à saúde (Kennedy, Cannavan e
Mccracken, 2000).
Entretanto, outras vias devem ser consideradas com relação à presença de
resíduos de medicamentos em alimentos de origem animal. Durante a produção de
ração, os medicamentos podem ser carreados de preparações com fármacos para
preparações sem fármacos. É comum que bateladas que deveriam não conter
fármacos se contaminem com baixas concentrações do fármaco usado no preparo
53%
14%
14%
12%
7% 0%
Ruminantes Aves Cães e gatos Suínos Equinos Outros
37
da ração medicamentosa. Esse efeito pode ser diminuído utilizando-se formulações
do medicamento na forma granular em vez de pó. A contaminação cruzada pode
ocorrer ainda em outras etapas como em caminhões de entrega que levem ração
medicamentosa e não medicamentosa e nos sistemas de alimentação das fazendas,
quando os cochos não são adequadamente limpos entre o uso desses dois tipos de
ração. A alimentação dos animais com essa ração contaminada, independentemente
de finalidade como terapêutico ou como promotor de crescimento, pode levar a
concentrações de resíduos acima do máximo permitido pela legislação (Kennedy,
Cannavan e Mccracken, 2000).
Outra rota provável para a ocorrência de resíduos de medicamentos em
alimentos é a transferência do fármaco de animal para animal por meio da ingestão
de fezes ou urina de animais tratados. A exposição, mesmo que breve, de animais
não tratados a excrementos de animais medicados em um manejo mal feito, no
transporte ou mesmo já no matadouro pode levar a resíduos acima dos limites
permitidos. Ainda como possibilidade de transmissão de animal para animal, pode-
se considerar, por exemplo, que resíduos sejam levados ao pelo de um animal por
contaminação por urina de outro, tratado com o fármaco, sendo detectado como
positivo. Há ainda a possibilidade de contaminação vinda do meio ambiente:
fármacos usados que são mal absorvidos podem ser excretados. Como é comum
que se usem as fezes animais na forma de fertilizantes, pode-se levar o fármaco à
fonte de alimento de animais que não deveriam recebê-lo (Kennedy, Cannavan e
Mccracken, 2000).
Medidas adotadas pelo produtor, distribuidor ou fabricante para mascarar o
uso de determinados fármacos podem incluir: uso de doses individuais muito baixas
pela combinação de diferentes produtos do mesmo grupo (por exemplo, diversos
andrógenos ou estrógenos em um coquetel); uso de doses muito baixas de
componentes de diferentes grupos, tendo efeitos adicionais ou sinérgicos (por
exemplo, corticosteroides e ß-agonistas em um coquetel); uso de produtos de difícil
análise devido à extensa metabolização (por exemplo, stanozolol); aplicação de
análogos sintéticos de promotores de crescimento conhecidos; e uso de produtos
não monitorados (Courtheyn et al., 2002). Shelver e Desutter (2015) demonstraram
que vegetais usados na alimentação animal podem se contaminar com RCT por
38
meio do solo, sem efeito observado nas plantas, mas podendo chegar aos animais
em quantidades possivelmente detectáveis, dependendo da espécie vegetal.
3.2.1 AGONISTAS BETA-ADRENÉRGICOS
O desenvolvimento de agonistas ß2 é baseado em substituições na estrutura
de catecolaminas da norepinefrina e epinefrina. O anel catecol consiste em grupos
hidroxila nas posições 3 e 4 do anel de benzeno (Brunton, Chabner e Knollmann,
2010). Outros padrões de hidroxilação foram desenvolvidos para manter a atividade
no receptor ß e ainda serem muito resistentes à desativação pelas catecolaminas o-
metil transferases (COMT). Os resorcinóis, as saligeninas e os fenóis simples são ß-
agonistas que não são substratos para a COMT (Smith, 1998). Essas substâncias
fazem parte do grande grupo farmacológico das fenetanolaminas (Ferreira, 2009).
Para que um ß-agonista tenha atividade biológica, ele deve ter um anel
aromático de seis membros substituído, um grupo hidroxila ligado ao carbono ß na
conformação R, um nitrogênio carregado positivamente na cadeia lateral de
etilamina e um substituinte no nitrogênio alifático para conferir especificidade para o
receptor ß (Smith, 1998).
As fenetanolaminas compartilham características estruturais em comum, mas
nem todas elas são ß-agonistas: algumas são ß-agonistas, outras ativam receptores
α e outras são específicas para subclasses de receptores α ou ß. Mesmo dentro da
sub-família de ß-agonistas as características químicas e farmacocinéticas podem
diferir significativamente (Smith, 1998). No entanto, os efeitos das fenetanolaminas
são o aumento do ganho de peso, melhoramento da eficiência na alimentação, uma
carne mais magra e maior rendimento na produção animal (Moody, Hancock e
Anderson, 2000).
Uma resposta fisiológica é produzida quando um agonista ß-adrenérgico se
liga a um receptor ß-adrenérgico, como demonstrado na Figura 11, a ativação de
receptores ß-adrenérgicos ativa a proteína Gs e, consecutivamente, a
adenilatociclase, que converte adenosina trifosfato em monofosfato de adenosina
cíclico (AMP cíclico ou cAMP), um sinalizador intracelular. O cAMP se liga à
39
subunidade regulatória da proteína quinase A (PKA) para liberar uma subunidade
catalítica. A regulação das enzimas intracelulares é feita pela PKA por meio de
fosforilação. Dessa forma, a ativação de receptores ß-adrenérgicos e a rota de
sinalização do cAMP levam à ativação de enzimas lipolíticas e inativação de
enzimas lipogênicas envolvidas na síntese de novo de ácidos graxos e triglicerídeos
(Mersmann, 1998). Uma grande concentração glicêmica no sangue é esperada
devido ao aumento da glicogenólise (Stoffel e Meyer, 1993). O aumento da atividade
da capastatina e a inibição das calpaínas levam à diminuição da degradação
proteica (Vedovatto et al., 2014).
Figura 11. Mecanismo de transdução de sinal de receptores ß-adrenérgicos. O
receptor ß-adrenérgico é ativado por um agonista e interage com a proteína Gs. A
proteína Gs estimula a adenilatociclase (AC) para converter adenosina trifosfato
(ATP) a adenosina monofosfato cíclico (cAMP), que age como um sinalizador
intracelular. Níveis aumentados de cAMP ativam a proteína quinase A (PKA) para
fosforilar várias enzimas e fatores regulatórios importantes na regulação metabólica.
Fonte: adaptado de Anderson, Moody e Hancock (2010).
Vários fatores, incluindo dieta, dosagem e duração do tratamento, idade e
peso do animal e sua genética podem influenciar positiva ou negativamente nos
40
efeitos desejados com o uso das fenetanolaminas (Moody, Hancock e Anderson,
2000).
Outros mecanismos que podem contribuir para o aumento no ganho muscular
incluem o aumento no fluxo sanguíneo para o músculo esquelético (podendo
melhorar o processo de hipertrofia em virtude do maior aporte de nutrientes para
síntese de proteínas) e para o tecido adiposo, podendo melhorar a degradação dos
lipídeos. Além disso, há diminuição no nível plasmático da insulina e,
consequentemente, de seus efeitos (lipogênese, redução de lipólise e aumento de
glicogênio) (Vedovatto et al., 2014).
3.2.1.1 Histórico
A epinefrina foi utilizada pela primeira vez como boncodilatador no início do
século XX, enquanto a efedrina foi introduzida na medicina ocidental em 1924. O
grande progresso seguinte foi o desenvolvimento do isoproterenol, agonista seletivo
dos receptores ß, proporcionando um agente para a asma desprovido de atividade
nos receptores α (Brunton, Chabner e Knollmann, 2010).
ß-agonistas fenetanolamínicos têm um histórico de uso off-label (quando um
medicamento é utilizado para obtenção de efeitos além daqueles descritos na sua
indicação) por criadores de animais que esperam melhorar aspectos econômicos da
produção. Além disso, eles têm sido usados em grande extensão por fisiculturistas e
por criadores de animais de exposição no intuito de modificarem suas características
fenotípicas (Shelver e Smith, 2000; Shelver, Smith e Berry, 2000). O ß-agonista de
maior abuso é o CLEM (Shelver, Smith e Berry, 2000).
Doses de CLEM utilizadas como agente de reparticionamento são cinco a dez
vezes maiores que para uso terapêutico, assim como a duração do uso é mais
prolongada. No entanto, há indícios de que até doses mais baixas, inclusive na
janela terapêutica, têm influência no crescimento e na qualidade da carcaça de
bezerros e de gado (Kuiper et al., 1998).
No início dos anos 2000, o uso da RCT foi aprovado por órgãos regulatórios
de diversos países, como os Estados Unidos, Brasil, Venezuela, Colômbia,
Guatemala, República Dominicana e Filipinas (Shelver e Smith, 2002).
41
A RCT foi o primeiro componente de sua classe a ter o uso aprovado pelo
FDA como promotor de crescimento. Foi aprovada pelo FDA para uso em suínos em
2000, sob o nome comercial de Paylean® (Elanco Animal Health, Greenfield, IN).
Em 2003 foi aprovada para uso em gado em terminação, sob o nome comercial de
Optaflexx® (Elanco Animal Health). No Brasil, as marcas Paylean®, Ractosuin (Ouro
Fino Saúde Animal Ltda), Ractop (HertapeCalier S Animal SA), Transuin
(Laboratórios Duprat Ltda) e Ractomax (VansilInd Com e ReprLtda) têm seu uso
como aditivos alimentares para animais autorizado pelo MAPA (Freire et al., 2009;
Brasil, 2015a).
3.2.1.2 Ractopamina
A RCT, cloridrato de 4-hidroxi-α-[[[3-(4-hidroxifenil)-1-
metilpropil]amino]metil]benzenemetanol pela União Internacional de Química Pura e
Aplicada (IUPAC, em inglês), é uma fenetanolamina agonista ß-adrenérgica que
contém dois estereocentros sendo comercializada como uma mistura dos quatro
estereoisômeros, apresentando-se na forma de diasteroisômeros: RS, SR e RR, SS
(Figura 12). O isômero RR é um cardiotônico potente em humanos e o responsável
pelo efeito de reparticionamento em ratos (Freire et al., 2009), sendo, também, o
mais eficaz em suínos (Mills, 2002).
Figura 12. Fórmula estrutural da ractopamina.
Fonte: adaptado de Zhang et al. (2009).
Estudos indicaram que a RCT tem propriedades agonistas significativas em
receptores ß2, mas apresenta atividade submáxima em receptores ß1, e não
apresenta interações significativas com receptores α (Colbert, Williams e Williams,
1991), ou seja, em termos de atividade fisiológica, a RCT é um agonista pleno do
receptor ß2, agonista parcial ß1 e não tem atividade agonista em receptor α (Smith,
42
1998). Já em outros estudos a RCT se mostrou seletiva para os receptores ß1 em
contraste a outras fenetanolaminas que são seletivas para os receptores ß2 (Moody,
Hancock e Anderson, 2000). Essa contradição deve-se às diferentes atividades dos
diferentes isômeros da RCT. O isômero RR demonstra uma afinidade equivalente
tanto por receptores ß1 como por receptores ß2. Já os outros três isômeros têm
maior afinidade em receptores ß2 (Mills, 2002).
Ho et al. (2014), supondo que o risco em potencial de se ingerir carne
contendo RCT esteja associado com a biodisponibilidade e os resíduos em tecido,
estudaram a farmacocinética, biodisponibilidade oral e distribuição em órgãos de
ratos. Esse estudo demonstrou que a RCT tem uma farmacocinética não linear,
levando à suposição de que ela pode se acumular devido à saturação dos órgãos e
da eliminação renal. A biodisponibilidade oral foi de 2,99 %, sendo essa medida
realizada em plasma. A distribuição nos órgãos foi medida pela acumulação do
fármaco após administração intravenosa, sendo que a concentração foi decrescente
na seguinte ordem: rins, pulmões, baço, coração, fígado, músculo, plasma e cérebro,
supondo-se que a menor concentração no cérebro seja devida à barreira
hematoencefálica e a maior nos rins devida à eliminação, primariamente, renal,
graças à via de administração.
Em suínos, a eliminação de RCT ocorre de forma muito rápida, resultando
apenas em traços de resíduos nos tecidos. Após a suspensão da alimentação com
cloridrato de RCT, os resíduos sofreram depleção rapidamente em fígado, rins,
músculo, gordura, sangue e bile. Em urina, fígado e rins encontram-se os mesmos
quatro metabólitos da RCT: três monoglicuronídeos e um diglicuronídeo. Esses
mesmos metabólitos são encontrados em proporções semelhantes nos fígados e
rins de suínos, cães e ratos (Dalidowicz, Thomson e Babbitt, 1992).
Embora a metabolização da RCT seja rápida e ocorra depleção após
suspensão da dieta, no manejo de suínos, não há tempo de carência, ou seja, os
animais são alimentados com ração contendo RCT até a suspensão da alimentação
para o abate, de forma que os níveis nos tecidos ainda são detectáveis (Qiang et al.,
2007; Dong et al., 2011). Os metabólitos da RCT são detectados em urina, rins e
fígado. Shelver, Smith e Berry (2000) encontraram 1 % de reação cruzada para o
glicuronídeo A, 3,1 % para o B e 384 % para o C.
43
Os efeitos da RCT na qualidade da carne suína estão associados à síntese
miofibrilar aumentada no ganho de carcaça e de massa magra. A RCT dietética
representa uma estratégia para maximizar os efeitos positivos da imunocastração
enquanto controla seus efeitos negativos, como o aumento de tecido adiposo. Desta
forma, a combinação de imunocastração e uso da RCT tem o potencial de aumentar
a qualidade da carne suína (Costa-Lima et al., 2014).
A diminuição de tecido adiposo na carcaça resulta em parte dos efeitos
diretos da RCT na conversão da glicose em triglicerídeos. A RCT media a resposta
celular por meio de receptores ß-adrenérgicos, ativando a adenilato-ciclase e a
proteína-quinase, afetando a atividade lipogênica por esses dois mecanismos (Wu,
Liu e Peng, 2014).
Os produtos oriundos de animais tratados com agonistas ß-adrenérgicos têm
colesterol e calorias reduzidas. A área necessária para plantar ingredientes de ração
para produção de carne é menor (Anderson, Moody e Hancock, 2010) e a retenção
de nitrogênio em tecido animal é maior, levando a menor excreção desse elemento
(Decamp et al., 2001).
3.2.1.3 Toxicidade
O CLEM foi inicialmente desenvolvido com meia-vida longa para tratamento
de doenças, principalmente, do trato respiratório. Essa condição é completamente
oposta ao desejável para uso em suplementação de ração, então, os ß-agonistas
mais recentes foram desenvolvidos com diferenças estruturais que resultam em
meia-vida mais curta e menor potência por via oral (Anderson, Moody e Hancock,
2010).
Apesar dos efeitos benéficos provados no desempenho do ganho de peso do
animal, existem diversos casos bem documentados em que o uso ilegal desses
compostos resultou na intoxicação alimentar de humanos (Martínez-Navarro, 1990;
Pulce et al., 1991; Salleras et al., 1995; Elliott et al., 1998). Tais relatos envolveram o
CLEM, embora toda a classe de compostos ß-agonistas seja vista com restrições
por órgãos regulamentadores, sendo muito improvável que algum dia seja aceita
como promotor de crescimento em países com tradição de regulamentação de
44
alimentos pelo princípio da precaução, como os integrantes da União Europeia
(Elliott et al., 1998).
A aplicação em larga escala de agentes farmacologicamente potentes como
promotores de crescimento tem sido discutida na literatura, pois seu uso incorreto
pode levar a efeitos adversos imediatos em humanos (Kuiper et al., 1998). Produtos
cárneos, obtidos de animais alimentados com ß-agonistas podem representar um
risco à saúde do consumidor, com sintomas que incluem tremores musculares,
vômito, nervosismo e palpitações (He, Zhang e Yang, 2008).
Para se avaliar cada nova substância, exames e estudos toxicológicos são
conduzidos como parte de procedimentos complexos e desgastantes, determinando-
se toxicidades aguda e crônica. São feitos cálculos que incorporam consumo médio
daquela substância, levando a resultados na forma de ingestão aceitável que,
adicionada de uma margem de segurança, representará o limite máximo de resíduo
(LMR) daquela substância de forma que cada alimento não coloque a saúde do
consumidor em risco (Gowik, 2009).
O Comitê Científico Internacional de Especialistas em Aditivos Alimentares
(JECFA, em inglês), administrado pela FAO e pela Organização das Nações Unidas
(ONU) é responsável por avaliar os riscos e a segurança de aditivos alimentares,
cuidados no processamento, resíduos de medicamentos veterinários e agrotóxicos,
contaminantes e toxinas naturais. Além disso, esse comitê trabalha com avaliação
das exposição a diferentes substâncias e desenvolvimento e normalização de
métodos (Jecfa, 2016). Uma série de estudos de toxicidade aguda da RCT
administrada via oral em camundongos, ratos, cães e macacos foi avaliada pelo
comitê a fim de se reunirem parâmetros relacionados a esse fármaco (Jecfa, 2004).
Os resultados desses estudos se encontram sumarizados na Tabela 3.
45
Tabela 3. Estudos de toxicidade aguda com ractopamina
Espécie Duração Via de
administração
Dose (mg/kg por
dia)
NOEL (mg/kg por
dia)
Camundongo (B6C3F1), 10 de cada sexo por grupo
3 meses Oral 0; 25; 125 ou
1250 Não identificada
Rato (Fisher 344), 20 de cada sexo por grupo
90 dias Oral
Machos: 0; 1,3; 13 ou 153
Machos: 1,3
Fêmeas: 0; 1,4; 14 ou 157
Fêmeas: 1,4
Macaco rhesus, dois de cada sexo por grupo
6 semanas Oral 0; 0,25; 0,5 ou 4 Não estabelecida
Macaco rhesus, três de cada sexo por grupo
90 dias Oral 0 ou 0,125 0,125
Macaco rhesus, dois de cada sexo por grupo
18 dias Inalatória
0; 0,38; 1,69 ou 23,8 de cloridrato
de ractopamina/m³
Não identificada
NOEL, em inglês: Limite de Dose Sem Efeito Observado. Fonte: (Jecfa, 2004).
Estudos de longo prazo em camundongos indicaram alterações discretas em
parâmetros hematológicos e clínicos além de leiomiomas e lesões não neoplásicas
de tecido mole no trato genital das fêmeas, dose dependentes. Nos estudos de
longo prazo com ratos, efeitos não significativos semelhantes àqueles encontrados
nos estudos com camundongos foram detectados além de cardiomiopatia, hipertrofia
de glândula salivária submandibular e hiperplasia de tecido mole uterino, sem
evidência significativa de tumores relacionados ao tratamento com a RCT. Nos
estudos com macacos, não houve efeitos toxicológicos, oftalmológicos ou
fisiológicos significativos. A avaliação da cinética de ligação da RCT aos receptores
ß levam à suspeita de que a exposição crônica aos resíduos deste fármaco em
tecidos comestíveis podem levar à dessensibilização desses receptores, diminuindo
a resposta à terapias com agonistas ß-adrenérgicos. Efeitos genotóxicos não foram
identificados (Jecfa, 2004).
Em um estudo para determinar a resposta farmacológica em humanos, a
farmacocinética da RCT foi determinada em seis voluntários adultos saudáveis do
sexo masculino por meio de 40 mg de cloridrato de RCT via oral. Por meio de
cromatografia a líquido de alta eficiência (HPLC, em inglês) com detecção
eletroquímica, a meia vida média determinada foi de 3,94 horas, não sendo
detectada após 24 horas, exceto em concentrações muito baixas em um voluntário.
46
Apenas 2 % do que foi excretado não foi metabolizado. Os metabólitos na urina
foram conjugados monoglicuronídeos e monossulfatos, sendo este último aquele em
maior quantidade. Os resultados indicaram que a RCT é extensiva e rapidamente
metabolizada com uma biodisponibilidade oral de no mínimo 45,7 %, havendo
significante metabolismo de primeira passagem. Esses dados sugerem que a
distribuição, o metabolismo e a excreção deste fármaco são condizentes com a
farmacocinética e biotransformação observados em animais para outras
fenetanolaminas ß-adrenérgicas fenólicas, catecólicas e resorcinólicas (Jecfa, 2004).
Devido às respostas cardíacas agudas em estudos com humanos (mudanças
na sístole eletroquímica, no tempo de ejeção do ventrículo esquerdo e na velocidade
de encurtamento da fibra circunferencial) e utilizando um fator de segurança de 50,
sendo dez devido a variações individuais e cinco devido à necessidade de proteção
de indivíduos sensíveis foi estabelecido uma ingestão diária aceitável (IDA) de
1 µg/kg de massa corpórea baseada num limite de dose sem efeito observado
(NOEL, em inglês) de 67 µg/kg (Jecfa, 2004).
Contudo, o Painel dos Aditivos e Produtos ou Substâncias da Autoridade
Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA, em inglês) emitiu, no entanto,
uma opinião científica considerando que o uso de um fator de segurança alto, como
o de 50, não deve compensar as incertezas associadas ao estudo que estabeleceu
o NOEL. Dessa forma, entende-se que não se pode estabelecer uma IDA e,
consequentemente, não foi recomendado o estabelecimento de um LMR na União
Europeia (Efsa, 2009).
3.2.2 REGULAMENTAÇÃO EM CARNE SUÍNA
Tanto a União Europeia como o Codex Alimentarius publicam normas, guias e
códigos de conduta que regulam a qualidade e as condições higiênicas dos
alimentos, estabelecendo limites para contaminação microbiológica, para
contaminantes e resíduos e para organismos geneticamente modificados (Gowik,
2009).
Na Tabela 4 são apresentados os limites máximos tolerados para RCT em
alguns países representativos no consumo mundial de carne suína. O Brasil, como
47
pode ser visto na tabela, adota os limites recomendados pelo Codex Alimentarius
(Codex Alimentarius, 2012).
Tabela 4. Limites Máximos de Resíduos (LMR) para ractopamina no Brasil e em
outros países
País/Órgão Matriz LMR (µg/kg) Fonte
Brasil
Bovino - Músculo
10 para ação regulatória 0,1 para monitoramento
Brasil (2014b)
Suíno - Músculo
10 para ação regulatória 0,1 para monitoramento
Codex Alimentarius
Bovino - Músculo 10
Codex Alimentarius (2012)
Bovino - Fígado 40
Bovino - Rim 90
Bovino - Tecido adiposo 10
Suíno - Músculo 10
Suíno - Fígado 40
Suíno - Rim 90
Suíno - Tecido adiposo e pele 10
Estados Unidos
Bovino - Músculo 30
FDA (2014)
Bovino - Fígado 90
Peru - Músculo 10
Peru - Fígado 45
Suíno - Músculo 50
Suíno - Fígado 150
Vietnã
Bovino - Músculo 30
USDA (2008) Bovino - Fígado 90
Suíno - Músculo 50
Suíno - Fígado 150
Na União Europeia, a comercialização de carne contendo resíduo de RCT é
proibida (Ec, 1996b) assim como na União Euroasiática, sendo estabelecido o nível
de 0,1 µg/kg como o valor máximo permitido para limites de detecção dos métodos,
então, se um laboratório detectar RCT, mesmo abaixo desse nível, ele deve reportar
a amostra como positiva (Niño et al., 2015).
Os diferentes limites regulamentados nos diversos países levam, muitas
vezes à situações de impasses comerciais entre importadores e exportadores.
48
Países que autorizam o uso da RCT acreditam que há evidência científica de que
resíduos de RCT presentes nos alimentos são seguros, dentro dos LMR. Eles
afirmam que a avaliação do JECFA (2004) aliada ao uso em mais de 25 países sem
efeitos danosos são suficientes para que haja um consenso internacional sobre a
aceitação dos limites estabelecidos pelo Codex Alimentarius (2012), sob um risco de
enfraquecimento das opiniões científicas baseadas em normas internacionais. Por
outro lado, a União Europeia e a China, na posição de maiores importadoras de
carne suína, afirmam que os estudos que existem atualmente são insuficientes para
suspenderem a proibição do uso da RCT, principalmente considerando-se hábitos
de ingestão e populações sensíveis não considerados até então (Alemanno e
Capodieci, 2012).
Em fevereiro de 2013, a Rússia proibiu a importação de carne contendo RCT,
não permitindo a entrada, naquele país, de carne suína ou bovina sem a
confirmação de o produto ser livre do fármaco (Siegner, 2013). Em março do mesmo
ano, a China passou a exigir análise de terceira parte para produtos suínos
americanos (Huffstutter e Baertlein, 2013).
Em outubro de 2013, a Rússia, o Cazaquistão e a Belarus proibiram a
importação de carne suína de dez empresas brasileiras (Efe, 2013). No entanto,
esse embargo não perdurou, sendo em que agosto de 2014 o governo russo
anunciou a proibição da importação de frutas, vegetais, carnes, peixes e laticínios
dos Estados Unidos, União Europeia, Austrália, Canadá e Noruega. Nessa mesma
ocasião, declarou que compensaria essa proibição com a importação de carne do
Brasil e de queijo da Nova Zelândia (Paulo, 2014).
Nas primeiras três semanas de setembro de 2014, a Rússia comprou 11,4 mil
toneladas de carne suína brasileira, 40 % das 24 mil toneladas exportadas pelo
Brasil (Rocha e Mendes, 2014).
3.2.3 PROGRAMAS DE MONITORAMENTO
Na União Europeia, cada Estado-Membro é obrigado a monitorar animais e
seus produtos para detecção de resíduos legais ou ilegais de medicamentos de uso
veterinário, assim como agrotóxicos e contaminantes ambientais, e a apresentar um
Plano Nacional de Monitoramento de Resíduos que leve em consideração a situação
49
de cada um. Aspectos que devem estar incluídos nesses Planos são a descrição de
organizações e laboratórios envolvidos na implementação e execução do Plano,
substâncias que serão medidas, métodos analíticos, níveis de ação, espécies de
animais e quantidade amostral (relacionada ao número de animais abatidos no ano
anterior). Em março de 1996, no âmbito da União Europeia, a proibição de uso de
hormônios como promotores de crescimento foi estendida aos ß-agonistas e, a partir
de então, controles e sanções relacionados a seu uso ilegal têm se tornado mais
severos (Kuiper et al., 1998).
Nos Estados Unidos, o Programa Nacional de Resíduos (NRP, em inglês)
para Carnes, Aves e Derivados de Ovos é administrado pelo Departamento de
Agricultura dos Estados Unidos (USDA, em inglês), sendo que o Serviço de
Inspeção e Segurança alimentar (FSIS, em inglês) tem um programa determinado a
identificar, classificar e analisar contaminantes químicos em carnes, aves e
derivados de ovos. O FSIS publica os Planos de Amostragens de Resíduos, do
NRP, também chamados de Blue Book e os Resultados de Resíduos em Amostras,
conhecidos como Red Book (Eua, 2000).
O FSIS tem publicados, em sua página da web, os escopos e resultados do
NRP desde 2000 (Eua, 2000; 2001; 2002; 2003; 2004; 2005; 2007; 2008; 2009;
2011; 2012 ; 2013; 2014; 2015a; b; c). Os dados relativos à ocorrência de RCT em
suínos nesses relatórios estão resumidos na Tabela 5.
50
Tabela 5. Escopos e resultados do Programa Nacional de Resíduos (NRP) dos
Estados Unidos, nos anos de 2000 a 2015, considerando o analito ractopamina em
matrizes de suínos
Ano Matriz Amostras analisadas
Amostras não conformes
Fonte
2000 -1 305 0 EUA (2000)
2001 -1 294 0 EUA (2001)
2002 -1 285 0 EUA (2002)
2003 Fígado 189 0 EUA (2003)
2004 -1 61 0 EUA (2004)
2005
Fígado 73 0
EUA (2005)
Músculo 1 0
2006 -1 12 0 EUA (2007)
2007 Fígado 270 15 (2,51 e 5 µg/kg) EUA (2008)
2008 -1 310 51 EUA (2008)
2009 -1 92 0 EUA (2011)
2010 -1 142 0 EUA (2012 )
2011 -1 298 11 EUA (2013)
2012 -1 333 11 EUA (2014)
2013 -1 23 31 EUA (2015a)
2014 -1 14 31 EUA (2015c)
Legenda: 1 não declarado (matriz ou resultados das amostras positivas); 2 animais de exposição. Limite detecção não reportado.
Para o ano de 2015, o plano de amostragem do NRP previu a análise de RCT
como um dos resíduos a serem pesquisados (Eua, 2015b).
No Brasil, o Plano Nacional de Controle de Resíduos em Produtos de Origem
Animal (PNCR/Animal), foi instituído pela Portaria Ministerial nº 51, de 06 de maio de
1986 e adequado pela Portaria Ministerial nº 527, de 15 de agosto de 1995. A
execução de suas atividades está a cargo do Secretário de Defesa Agropecuária
(SDA), cabendo ao Coordenador Geral gerenciar o cumprimento das metas
51
estabelecidas na operacionalização do Plano, o qual comporta ainda uma Comissão
Técnica com Representantes do Departamento de Defesa Animal (DDA) e do
Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA) e um Comitê
Consultivo, constituído por representantes de órgãos Governamentais e Privados,
reconhecidamente envolvidos no contexto do PNCRC. O Plano desenvolve suas
atividades visando: i) conhecer o potencial de exposição da população aos resíduos
nocivos à saúde do consumidor, parâmetro orientador para a adoção de políticas
nacionais de saúde animal e fiscalização sanitária; e ii) impedir o abate para
consumo de animais oriundos de criatórios onde se tenha constatado violação dos
LMR e sobretudo, o uso de drogas veterinárias proibidas no território nacional
(Brasil, 1999).
O MAPA tem publicados, em sua página da web, os escopos do
PNCRC/Animal desde 2001 e os resultados desse programa desde 2003 (Brasil,
2001; 2002; 2003; 2004a; b; 2005a; b; 2006a; b; 2007a; b; 2008b; a; 2009b; a;
2010a; b; 2011b; a; 2012a; b; 2013c; b; 2014b; c; 2015b; c). Os dados relativos à
ocorrência de RCT em suínos, no Brasil, encontram-se sumarizados na Tabela 6.
52
Tabela 6. Escopos e resultados do Plano Nacional de Controle de Resíduos em
Produtos de Origem Animal, do Brasil, nos de 2001 a 2014, considerando o analito
ractopamina em matrizes de suínos
Ano Matriz Amostras analisadas
Limite considerado
(µg/kg)
Amostras não
conformes Fonte
2002 a 2007 -1 -1 -1 -1
Brasil (Brasil, 2001; 2002;
2003; 2004a; b; 2005a; b; 2006a; b; 2007a; b; 2008a)
2008 Carne 66 10 0 Brasil (Brasil,
2008b; 2009b)
2009 Carne 62 10 0 Brasil (Brasil,
2009a; 2010a)
2010
Músculo 75 20 0
Brasil (Brasil, 2010b; 2011a) Urina 60 1 0
2011 Urina 116 -2 0 Brasil (Brasil,
2011b; 2012a)
2012 Urina 50 13 0 Brasil (Brasil,
2012b; 2013c)
2013
Urina 74 13 1 (1,47 µg/kg) Brasil (Brasil,
2013b; 2014c) Músculo 67 10 0
2014
Músculo 64 10 0
Brasil (Brasil, 2014b; 2015c) Urina 8 13 0
Legenda: 1 de 2002 a 2007 a RCT não foi incluída no escopo; 2 limite não estabelecido para o ano; 3 limite utilizado para validação do método, não sendo considerado para ação regulatória.
Para o ano de 2015, o escopo do PNCRC/Animal prevê a análise de 100
amostras de músculo suíno para ação regulatória e de 300 amostras para o
subprograma exploratório. Os limites que devem ser considerados para essas
análises são de 10 µg/kg e 0,1 µg/kg, respectivamente, conforme discriminado na
Tabela 4.
A escolha da matriz depende do objetivo do monitoramento, assim, em alguns
países são analisadas vísceras (fígado, rins, etc.) e em outros são analisados
somente músculo e urina, esta última útil no monitoramento do animal vivo. O
músculo é um tecido particularmente vantajoso para fiscalização porque é o tecido
53
mais consumido e pode ser usado para análise tanto em amostras importadas como
domésticas (Kinsella et al., 2009).
Com exceção dos resultados reportados pelo MAPA não foram encontrados
estudos na literatura que tratassem do monitoramento de resíduos de RCT na carne
suína disponível no mercado nacional (Zhang et al., 2009; Consumer Reports
Magazine, 2016).
3.3 MÉTODOS DE ANÁLISE
3.3.1 PRINCIPAIS TÉCNICAS
Mesmo com o avanço nas técnicas de separação e detecção, o preparo de
amostra é uma etapa crítica do processo analítico e um preparo efetivo é essencial
para que se consigam resultados confiáveis e que se mantenham bom desempenho
dos equipamentos (Kinsella et al., 2009).
Previamente à detecção de ß-agonistas, um pré-tratamento e concentração
são necessários e inevitáveis devido à complexidade das matrizes das amostras e à
baixa concentração dos analitos nas mesmas. Vários métodos de extração de ß-
agonistas foram propostos como a extração líquido-líquido, extração em fase sólida,
polímeros molecularmente impressos, extração por dispersão da matriz em fase
sólida, micro-extração em fase líquida, micro-extração em fase sólida e micro-
extração em fase líquida com fibra oca. No entanto, problemas comuns a tais etapas
incluem volume e toxicidade dos solventes, complexidade e baixa capacidade de
extração (Huang, Chen e Yuan, 2013).
Para propósitos regulatórios, tanto ensaios de triagem como confirmatórios
são usados na detecção de resíduos de substâncias regulamentadas e ilegais.
Vários métodos analíticos já foram descritos para determinação de resíduo de RCT e
seus metabólitos em tecido e fluidos animais (He, Zhang e Yang, 2008). Esses
métodos incluem cromatografia a líquido com detecção eletroquímica (Turberg,
Rodewald e Coleman, 1996), cromatografia a gás acoplada a espectrometria de
massas (Bocca et al., 2003) , imunoensaios com anticorpos policlonais e
54
monoclonais (Haasnoot et al., 1994; Elliott et al., 1998; Shelver e Smith, 2000;
Shelver, Smith e Berry, 2000; Shelver e Smith, 2002; 2003), imunossensores com
ressonância plasmônica de superfície e cromatografia a líquido acoplada a
espectrometria de massas (Churchwell et al., 2002; Shishani et al., 2003; Dickson et
al., 2005; Lafontaine et al., 2012). Neste contexto, os imunoensaios são ferramentas
de triagem convenientes para a detecção de analitos em diversas matrizes e têm
vasta aplicação para determinação de presença de fármacos (Shelver, Smith e
Berry, 2000), devido à sua rapidez, facilidade de uso, baixo custo, portabilidade em
campo e confiabilidade (Shelver e Smith, 2002). Para erradicar o abuso no emprego
de fármacos no manejo animal, tais métodos de detecção podem, ainda, ser
empregados em fazendas e abatedouros como ferramenta de triagem nas etapas
iniciais da cadeia produtiva (Kuiper et al., 1998).
Além dos imunoensaios clássicos, ELISA e imunoensaio de fluxo lateral,
métodos mais sensíveis baseados em anticorpos também têm sido usados para
detectar RCT, como fluoroimunoensaio por tempo resolvido (TR-FIA, em inglês),
imunossensor de eletroquimioluminescência (ECL, em inglês) e ensaio de ligação
por proximidade imunomagnética competitiva (CIPLA, em inglês) (Liu et al., 2014).
O TR-FIA emprega quelatos de lantanídeos como marcadores fluorescentes
fornecendo grande tempo de fluorescência e grande emissão quântica. Nesse
método, um sinal específico é detectado depois que sinais de ruído são extintos
(Shen et al., 2007).
O ECL se baseia em eletrodos de carbono acoplados a eletrodos de Ag/AgCl.
Os eletrodos de carbono são utilizados de forma que metade deles recebe
conjugados e a outra metade recebe somente os anticorpos de forma a funcionarem
como controles. Ao se aplicarem as amostras, mede-se o sinal elétrico proporcional
à concentração do analito (Li et al., 2013).
O CIPLA depende do reconhecimento simultâneo e próximo de partes de
sondas de proximidade. Essas sondas são conjugados de anticorpos de DNA ou
aptâmeros de nucleotídeos. Junto a um oligonucleotídeo receptor, uma molécula de
DNA se hibridiza numa estrutura que leva a DNA ligase a ligá-la covalentemente às
duas sondas mais próximas. Essas massas de moléculas podem, então, ser
55
replicadas por reação em cadeia da polimerase (PCR, em inglês) enquanto os
ligantes não específicos e sondas que não reagiram não são replicados (Cheng et
al., 2012).
A análise por biossensor óptico usando ressonância plasmônica de superfície
(SPR, em inglês) tem sido usada para resíduos. A SPR causa a redução da
quantidade de luz refletida em um determinado ângulo de uma interface condutora
de índice de refração diferente. A ligação de uma molécula ao chip da superfície
muda o ângulo de reflexão da luz do chip e isso muda a refletância detectada e
medida. Quando a amostra é introduzida no sistema que contém o analito livre, ela
compete pelo anticorpo com o analito ligado covalentemente ao sensor, mudando o
ângulo de reflexão. A mudança no sinal é inversamente proporcional à concentração
do analito na amostra. Essa técnica tem a vantagem de envolver menor efeito de
matriz na resposta do detector, representando um fator importante na análise de
alimentos e de outras matrizes biológicas complexas (Shelver e Smith, 2003).
Imunossensores eletroquímicos também têm ganhado crescente atenção, já
que eles combinam alta especificidade dos imunoensaios tradicionais com baixos
limites de detecção e baixo custo dos sistemas de medida eletroquímicos (Shen e
He, 2007).
Os métodos que empregam ELISA, no entanto, ainda são amplamente
utilizados, havendo pesquisas recentes no intuito de melhorar o seu desempenho,
por exemplo, para RCT (Wang et al., 2015). Os imunoensaios enzimáticos permitem
determinação direta da interação antígeno-anticorpo pela medida da atividade
enzimática sobre um substrato, podendo ser classificados em homogêneos e
heterogêneos. Nos ensaios homogêneos, a atividade enzimática é alterada como
parte da interação imunológica, não havendo necessidade de separação dos
reagentes marcados livres daqueles ligados, ou seja, não apresentam etapas de
rinsagem. Nos ensaios heterogêneos, ao contrário, a atividade enzimática não é
alterada, sendo necessário separar os reagentes marcados (conjugados) que se
ligam à fase sólida daqueles que ficam livres, ou seja, as etapas de lavagens que
retiram os componentes não ligados e uma fase sólida na qual vão sendo fixados os
componentes que participam da interação. As enzimas mais comumente utilizadas
são a peroxidase e a fosfatase alcalina e os substratos devem ser específicos para a
56
ação enzimática, mas, frequentemente, utilizam-se dois ou mais componentes: um
substrato propriamente dito e outro que sofre ação do produto resultante da ação
enzimática sobre o substrato (cromógeno) resultando em formação de cor (Vaz,
2007).
O ELISA baseia-se na imobilização de um do antígeno ou do anticorpo em
fase sólida, utilizando-se um conjugado (antígeno ou imunoglobulina (Ig), a
depender do que foi imobilizado em fase sólida) ligado a uma enzima (a exemplo
daquelas citadas acima), mantendo-se as atividades enzimática e imunológica. O
substrato forma um produto colorido que pode ser monitorado visualmente ou,
principalmente, por meio de espectrofotometria. Essa técnica pode ser utilizada,
portanto, para detecção ou quantificação tanto de antígenos como de anticorpos.
Para pesquisa de antígenos, os ensaios podem ser classificados em: i) competitivo
com antígeno marcado; ii) competitivo com anticorpo marcado; ou iii) captura de
antígeno (sanduíche). Na pesquisa de anticorpos, classificam-se em: i) indireto; ii)
captura de Ig classe específica; ou iii) sanduíche. As versões não competitivas são
muito empregadas tanto na detecção de antígenos quanto de anticorpos, enquanto
as competitivas são mais usadas para detecção quantitativa de antígenos. O método
de competição com antígeno marcado utiliza reagentes em quantidades limitadas e
o anticorpo utilizado deve ligar com a mesma avidez ao antígeno da amostra e ao
antígeno marcado (conjugado). O resultado positivo resulta em mínima coloração,
pois a quantidade de conjugado que se ligou ao anticorpo da fase sólida é
inversamente proporcional à quantidade de antígeno na amostra (Figura 13). Os
ensaios competitivos geralmente apresentam maior seletividade e menor
sensibilidade que os métodos não competitivos (Vaz, 2007).
57
Figura 13. Esquema representativo de um Ensaio de Imunoadsorção Enzimática
(ELISA) competitivo para pesquisa de antígeno.
Fonte: adaptado de Wicker, Turberg e Coleman (1995).
Análises confirmatórias devem ser realizadas para amostras que derem
resultado positivo em um método de triagem. A utilidade de kits de imunoensaios em
análises de triagem leva em consideração, pecando-se pelo lado conservador, que
resultados falso-positivos são mais aceitáveis que resultados falso-negativos
(Wicker, Turberg e Coleman, 1995). O mais importante para uma etapa de triagem é
um número aceitavelmente pequeno de resultados falso-negativos (Kuiper et al.,
1998), por exemplo, até 5 % (Ec, 2002).
Desta forma, o uso de imunoensaios como análise confirmatória é
questionável, ainda mais se utilizado sem ser validado e por pessoal não treinado e
sem experiência. Em alguns casos, os limites de detecção desses ensaios
encontram-se em níveis muito próximos aos limites de ação (Niño et al., 2015). No
caso de laboratórios com volume considerável de análises, em que se possa
compensar os custos fixos de um método de alta tecnologia, muitas vezes prefere-se
trabalhar com espectrometria de massas, por chegar a ter um custo menor que os
kits ELISA, que são importados e podem cobrir um menor número de analitos em
cada amostra. Isso deve ser levado em consideração na decisão de se utilizar
58
apenas o método confirmatório ou um método confirmatório aliado à realização de
uma triagem prévia (De Brabander et al., 2011; Niño et al., 2015).
3.3.2 VALIDAÇÃO
Para que se mantenha a segurança alimentar, o trabalho do laboratório deve
se basear em um alto grau de confiança nos métodos analíticos utilizados. Os
resultados dessas medidas levam a decisões sobre a comercialização do alimento e
são de alta importância em termos de políticas de saúde, além do alto impacto em
termos econômicos: fabricantes podem ter que realizar recall de produtos no varejo;
produtores rurais podem sofrer processos ou sanções administrativas e terem que
mudar seus procedimentos produtivos em casos de amostras detectadas como não
conformes. Caso os resultados que levem a essas ações sejam provados como
incorretos, o fabricante ou produtor teria direto de ressarcimento de recursos
indevidamente gastos, gerando maior morosidade ao sistema produtivo. Dessa
forma, não se pode afirmar exatamente qual o valor correto da concentração de um
analito em um produto, portanto, a questão é: quanto o resultado das medidas
realizadas pode ser visto como válido (Gowik, 2009).
Com o objetivo de confirmar que os métodos são apropriados para o uso
pretendido, o laboratório deve validar: i) métodos não normalizados; métodos ii)
criados/desenvolvidos pelo próprio laboratório; iii) métodos normalizados usados fora
dos escopos para os quais foram concebidos; e iv) ampliações e modificações de
métodos normalizados (Abnt, 2005).
A determinação de resíduos de medicamentos em matrizes de origem
biológica é sempre muito complexa. Exemplos de dificuldades observadas nas
análises são: i) alguns fármacos são extensamente metabolizados e os metabólitos
podem ser ainda desconhecidos ou não ter padrões disponíveis; ii) a recuperação
para determinados analitos pode ser muito menor que para outros do mesmo grupo
(exemplo: dentre os ß-agonistas); iii) a sensibilidade para um analito pode ser muito
menor que para outro dentro do mesmo grupo; e iv) a detecção de administração
exógena de hormônios naturais ainda é problemática (Courtheyn et al., 2002).
59
O tipo de método e seu uso determinam o desempenho analítico das suas
características a serem avaliadas (Companyó et al., 2009). O responsável pela
análise deve decidir o grau de desempenho necessário a um método a ser
executado e validado, na maioria das vezes se baseando em regulamentos ou
referências técnicas. O desenvolvimento de um método que satisfaça determinado
desempenho desejado pode ser inviável economicamente para o laboratório, sendo
que, nesse caso, deve-se decidir por flexibilizar os parâmetros exigidos ou repensar
se a análise se justifica (Magnusson e Örnemark, 2014).
A validação de métodos traz benefícios adicionais ao laboratório que a
realiza. Ela fornece um conhecimento detalhado do método e detalhes de sua
execução, incluindo o reconhecimento das etapas críticas do processo. A validação
dá ao laboratório e a seus colaboradores uma maior confiabilidade em relação aos
seus resultados (Magnusson e Örnemark, 2014).
Há duas abordagens principais para a validação de métodos: a comparação
interlaboratorial (também chamada de estudo colaborativo ou cooperativo) e a
intralaboratorial. Independentemente da abordagem, é o laboratório usuário do
método que é responsável por garantir que ele seja adequado ao propósito e, se
necessário, por realizar estudos adicionais a fim de suplementar os dados pré-
existentes de validação. Se um método está sendo desenvolvido para usos diversos
(por exemplo, para ser publicado como um método normalizado), pode ser preferível
realizar uma comparação interlaboratorial. Dessa forma, se um método é validado
por uma instituição normativa, como a ISO ou AOAC, o laboratório usuário só
precisará verificar o desempenho do método, reduzindo muito a carga de trabalho
(Magnusson e Örnemark, 2014).
No entanto, nem sempre é viável ou necessário realizar a validação
interlaboratorial, bastando realizar-se a intralaboratorial. Algumas razões para se
optar por essa alternativa são garantir a viabilidade do método antes da organização
de um estudo colaborativo de alto custo, fornecer evidências da confiabilidade do
método quando o estudo colaborativo não for praticável e garantir que métodos
“comerciais” (“off-the-shelf”) validados estão sendo usados de forma correta. De toda
forma, o custo total para a comunidade laboratorial ao se realizarem diversos
estudos intralaboratoriais pode ser maior do que a realização de uma validação
60
interlaboratorial seguida de verificações por cada laboratório que for aplicar o
método (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
A validação de métodos é um requisito importante na prática das análises
químicas. A maioria dos químicos analíticos têm consciência dessa importância,
mas, como o porquê, quando e como validar nem sempre estão claros para eles,
alguns analistas veem a validação de método como algo que só pode ser realizado
em ensaios colaborativos. Se a validação intralaboratorial será aceita ou não para
propósitos regulatórios, vai depender das diretrizes envolvendo a área relacionada
àquele ensaio (Magnusson e Örnemark, 2014). Portanto, é de extrema importância
que as condições em que a validação foi realizada, como intervalos de tempo,
calibração, operadores e equipamento, sejam registradas (Gowik, 2009).
Guias internacionais foram publicados pela IUPAC no sentido de orientar
estudos de validação por processos interlaboratoriais (Horwitz, 1995) e
intralaboratoriais (Thompson, Ellison e Wood, 2002), embora no caso de métodos
para análises de resíduos de medicamentos veterinários o documento da União
Europeia tem sido um documento de consenso (Ec, 2002).
Os parâmetros a serem validados variam de acordo com a natureza
quantitativa ou qualitativa do método. Métodos quantitativos são aqueles que
determinam a quantidade ou a concentração de uma substância de forma a poder
exprimi-la por meio de um valor numérico com as unidades apropriadas e métodos
qualitativos são aqueles que identificam uma substância com base nas suas
propriedades químicas, biológicas ou físicas (Ec, 2002).
Dessa forma, a seguir, são relacionados e definidos os principais parâmetros
de desempenho relacionados à validação de métodos quantitativos e qualitativos.
3.3.3 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DA VALIDAÇÃO
INTRALABORATORIAL PARA MÉTODOS QUANTITATIVOS
3.3.3.1 Aplicabilidade
Após a validação, a documentação deve fornecer, além das especificações de
desempenho: i) a identidade do analito, incluindo a especiação (exemplo: arsênio
61
total); ii) a faixa de concentração coberta pela validação; iii) a especificação da faixa
de matrizes do material testado coberta pela validação (exemplo: frutos do mar); iv)
um protocolo descrevendo equipamento, reagentes, procedimento (incluindo
variações permitidas, como (100 ± 5) °C), calibração e procedimentos da qualidade,
além de cuidados especiais com a segurança; e a aplicação para o método,
incluindo a incerteza dos componentes críticos (por exemplo: análise de alimentos
para triagem (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
3.3.3.2 Linearidade
A linearidade pode ser testada, informalmente, pela avaliação do gráfico de
resíduos produzidos pela regressão linear das respostas do método em diferentes
concentrações. Um padrão curvo sugere falta de ajuste devido a uma função de
calibração não linear. Um teste de significância pode ser realizado para comparar as
variâncias da falta de ajuste com aquelas devidas a erro puro. O coeficiente de
correlação é utilizado de forma errônea como indicativo de bom ajuste, sendo que
seu uso com essa finalidade não é recomendado. Após avaliar o ajuste com a
regressão linear simples, os resíduos devem ser examinados para identificação de
padrões óbvios. A heteroscedasticidade é bem comum e um padrão que a sugira
significa que outro tipo de regressão deve ser levado em consideração (Thompson,
Ellison e Wood, 2002). O procedimento proposto por Souza e Junqueira (2005)
orienta a avaliação da linearidade por meio do método dos mínimos quadrados
ordinários levando em consideração as premissas de normalidade,
homoscedasticidade e independência dos resíduos.
3.3.3.3 Efeitos da matriz
Uma amostra consiste do analito a ser medido, da matriz e de outros
componentes que podem ter algum efeito na medição, mas que não se quer detectar
ou quantificar (Souza, 2007).
A forma mais simples e fácil de montar uma curva de calibração é usando-se
padrões externos de calibração obtidos de uma série de soluções padrão do analito
em solvente. Entretanto, quando efeitos de matriz geram variações no sinal analítico,
os resultados obtidos por meio de curvas usuais preparadas com solventes
62
apresentarão tendência (Companyó et al., 2009). Desta forma, para que curvas
usuais sejam empregadas é necessário que os efeitos de matriz sejam
demonstrados como não significativos. Os estudos dos efeitos de matriz são
delineados com o preparo de curvas de calibração de solventes e curvas de analito
em matriz, preparadas por adição do analito a soluções teste obtidas após o ensaio
das amostras nas mesmas condições dos procedimentos normais, para que as
quantidades e as características dos interferentes presentes no extrato final de uma
amostra sejam reproduzidas nas curvas (por exemplo: interferentes provenientes de
materiais, reagentes e soluções utilizados no preparo de amostras) (Thompson,
Ellison e Wood, 2002; Souza, 2007).
3.3.3.4 Seletividade
Segundo Companyó et al. (2009), seletividade significa a habilidade de um
método distinguir entre o analito e outra substâncias, ou seja, garantir que o
resultado só pode se originar do analito e não de outros fatores. Já Magnusson e
Örnemark (2014) consideram a definição dada por Vessman et al. (2001): é a
extensão em que um método pode ser usado para determinar analitos individuais em
misturas ou matrizes sem interferências de outros componentes de comportamento
similar. Na abordagem de Thompson, Ellison e Wood (2002), ela é o grau em que
um método pode quantificar o analito na presença de interferentes e, idealmente,
deveria ser avaliada para qualquer interferente que possa estar presente na
amostra, tomando-se cuidado, principalmente, para se avaliarem potenciais
interferentes que tenham estrutura química semelhante à do analito estudado.
Em geral, considera-se que os métodos analíticos são constituídos pela
análise propriamente dita que pode ou não ser precedida por um estágio de
extração. No estágio de análise, a concentração de um analito, normalmente, não é
medida diretamente. Em vez disso, uma propriedade específica é medida sendo,
portanto, crucial que se estabeleça que a propriedade medida é unicamente devida
ao analito e não a algo química ou fisicamente similar ou, ainda, advinda de uma
coincidência, levando a um erro no resultado da medição. Para a análise, portanto,
pode ser necessário o estágio de extração para aumentar a seletividade do sistema
de medição (Magnusson e Örnemark, 2014).
63
3.3.3.5 Acurácia (veracidade e precisão)
A acurácia de um método (valor que expressa quão perto um único valor
medido se encontra do valor de referência) é estudada como duas componentes: a
veracidade e a precisão (Magnusson e Örnemark, 2014).
A veracidade é a expressão de quão perto a média de um número infinito de
medidas, produzidas por aquele método, está de um valor de referência. Como não
é possível realizar infinitas medições, a veracidade não pode ser expressa. Pode-se,
entretanto, realizar uma avaliação prática da veracidade em termos de tendência
que é oriunda dos erros sistemáticos inerentes ao método. Quatro abordagens estão
disponíveis para se estudar a tendência: i) análise materiais de referência
certificados (MRC); ii) análise materiais de referência; iii) estudo de recuperação
usando amostras adicionadas do analito; e iv) comparação com resultados obtidos
por outro método (Thompson, Ellison e Wood, 2002; Magnusson e Örnemark, 2014).
A melhor abordagem é a análise de um MRC contendo os analitos de
interesse na matriz do escopo em validação, mas a falta desse tipo de material na
área de resíduos de medicamentos veterinários torna essa situação inviável em
muitos casos. Assume-se, então, que o analito adicionado e o “naturalmente”
presente na matriz se comportam da mesma forma. Como esse procedimento é
questionável e não pode ser verificado de forma definitiva, deve-se reportar sempre
qual o tipo de abordagem usada nos estudos de veracidade para que isso possa ser
levado em consideração ao se compararem taxas de recuperação (Companyó et al.,
2009).
A proporção entre a quantidade de analito na porção original da amostra e
após seu tratamento é a recuperação (Companyó et al., 2009). Outras definições de
recuperação são dadas por Thompson, Ellison e Wood (2002): “diferença entre o
resultado da análise de um material adicionado de concentração conhecida do
analito e em seu estado original” e pela EC (2002): “percentagem da concentração
real de uma substância recuperada durante o processo analítico”.
A extração a ser realizada em uma amostra e as separações envolvidas
nesse processo, além de quaisquer outros passos no procedimento analítico para
matrizes complexas, podem levar às perdas de analito e, como consequência, a
64
quantidade de analito presente na solução a ser medida é, normalmente, menor que
na amostra original (Companyó et al., 2009). Dessa forma, métodos analíticos nem
sempre medem todo o analito de interesse presente na amostra. O método deve ser
deliberadamente desenvolvido para determinar somente uma forma do analito. No
entanto, uma falha para determinar todo o analito presente pode levar a um
problema inerente ao método. De todo jeito, é necessário julgar a eficiência do
método em detectar todo o analito presente (Eurachem, 1998). Uma boa
recuperação não é garantia de veracidade, mas uma recuperação ruim indica falta
de veracidade (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
Replicatas são essenciais para que se obtenham estimativas confiáveis das
características de desempenho de um método como precisão e tendência. O
planejamento envolvendo análise de replicatas deve levar em consideração todas as
variações possíveis na rotina de uso do método, devendo levar à determinação da
variabilidade típica e não da variabilidade mínima (Magnusson e Örnemark, 2014).
A precisão é o grau de concordância entre resultados de ensaios
independentes obtidos em condições específicas pré-estabelecidas. O valor da
precisão é geralmente expresso em termos de imprecisão e normalmente calcula-se
sob a forma de um desvio padrão do resultado do ensaio. Uma menor precisão é
indicada por meio de um elevado desvio padrão (Ec, 2002). Para estimativa da
precisão, devem ser consideradas as condições da menor e da maior variação
possíveis de se estudar para o método, repectivamente: i) a repetibilidade; e ii) a
reprodutibilidade (Magnusson e Örnemark, 2014).
A repetibilidade é a precisão de medição sob um conjunto de condições que
incluem o mesmo procedimento de medição, os mesmos operadores, o mesmo
sistema de medição, as mesmas condições de operação e o mesmo local, assim
como medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares durante um
curto período de tempo (Inmetro, 2012).
A reprodutibilidade é a precisão de medição sob um conjunto de condições
que incluem diferentes locais, diferentes operadores, diferentes sistemas de medição
e medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares (Inmetro, 2012).
65
A precisão, então, depende da concentração do analito. Ela deve ser
determinada em pontos dentro da faixa de interesse, incluindo seus extremos
(Magnusson e Örnemark, 2014). A precisão pode ser obtida em uma enorme
variedade de condições, podendo levar à necessidade de se obterem dados
adicionais em que se variam as condições em que o método foi executado
(Thompson, Ellison e Wood, 2002).
Entre os dois extremos citados acima (repetibilidade e reprodutibilidade), está
a precisão intermediária, uma estimativa da variação nos resultados quando são
feitas medidas em um único laboratório, mas sob condições que variam mais que as
de repetibilidade. O objetivo é obter uma estimativa da precisão que reflita todas as
fontes de variação que ocorrerão em um laboratório em sua rotina normal (diferentes
analistas, longos períodos de tempo, peças diferentes de um equipamento, etc.)
(Magnusson e Örnemark, 2014)
3.3.3.6 Faixa de trabalho
A faixa de trabalho é o intervalo em que o método fornece resultados com
incerteza aceitável. O valor do limite inferior dessa faixa é o limite de quantificação.
Na extremidade superior, o limite é definido pela concentração em que
comportamento anômalo na sensibilidade analítica passa a ser observado
(Magnusson e Örnemark, 2014).
A faixa de trabalho do método, presente em seu escopo, relaciona-se com a
concentração do analito na amostra original e não no extrato. Ela é expressa, por
exemplo, em mg/kg para uma amostra sólida, mesmo que o equipamento dê uma
resposta em mg/L no extrato (Magnusson e Örnemark, 2014).
Dentro da faixa de trabalho pode existir uma faixa de resposta linear, onde há
uma relação linear entre a concentração do analito com o sinal de resposta. A
extensão dessa faixa deve ser determinada durante a avaliação da faixa de trabalho.
Somente a regressão linear é insuficiente para estabelecer essa faixa, devendo-se
aplicar testes mais objetivos como “goodness-of-fit” (Eurachem, 1998).
66
3.3.3.7 Incerteza de medição
A incerteza de medição é um parâmetro que expressa uma faixa de valores
possíveis para um resultado de medição. A estimação da incerteza de medição leva
em consideração todos os componentes que interferem no resultado. Incertezas
associadas a cada componente devem ser combinadas de acordo com
procedimentos bem estabelecidos (Magnusson e Örnemark, 2014).
A abordagem formal para calcular a incerteza da medição é sua estimativa
por meio de uma equação ou modelo matemático. Os procedimentos descritos como
validação de métodos são planejados para garantir que a equação utilizada para
estimar um resultado, considerando erros aleatórios de todo tipo, é uma expressão
válida que engloba todos os erros conhecidos e que tenham efeitos significativos
naquele resultado (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
3.3.3.8 Limites
Para analitos em concentrações baixas é importante saber qual é a menor
concentração do analito que pode ser detectada com confiança pelo método. A
importância dessa determinação vem do fato de que a probabilidade de detecção
não muda, de repente e imediatamente, de zero para um determinado valor
(Eurachem, 1998).
Existem vários experimentos possíveis para determinar os limites, incluindo
aqueles baseados na inspeção visual, na relação sinal/ruído, na média e desvio
padrão de leituras de amostras brancas, no desvio padrão, intercepto ou inclinação
da curva de calibração (Souza, 2007).
Para propósitos de validação, normalmente é suficiente fornecer o valor
aproximado do LD, sendo assim, sua expressão em três vezes o desvio padrão da
média das leituras da concentração zero é, em geral, bem aceita (Magnusson e
Örnemark, 2014). Em termos gerais, o LD é, portanto, a menor quantidade ou
concentração de um analito na amostra que pode ser distinguido de zero. Para
sistemas analíticos em que a faixa de validação não o inclua ou aborde, o LD não
deve ser parte da validação. É recomendável que, para a validação do
procedimento, a estimativa da precisão utilizada seja baseada em, pelo menos, seis
67
determinações independentes do analito em concentração zero ou muito baixa
(Thompson, Ellison e Wood, 2002).
O LQ é a menor concentração em que um analito pode ser determinada com
desempenho aceitável, por exemplo, a concentração abaixo da qual o método não
opera com precisão aceitável (Thompson, Ellison e Wood, 2002). Na prática, o LQ é
calculado convencionalmente pela multiplicação do desvio padrão da média das
leituras da concentração zero por um fator kQ, sendo 10 o valor do kQ padrão
estabelecido pela IUPAC (Magnusson e Örnemark, 2014).
Dados obtidos entre o LD e o LQ, no entanto, têm o seu valor, não sendo
recomendável, muitas vezes, trabalhar-se com limites, sendo preferível que se
exprima a incerteza da medição como função da concentração e compará-la com
critérios de adequação do método (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
O limite de decisão (CCα) e a capacidade de detecção (CCβ) são dois limites
analíticos. O CCα é o limite acima do qual a amostra é considerada não conforme
com uma probabilidade de erro α (5 %), crucial para métodos confirmatórios (Ec,
2002; Companyó et al., 2009).
O CCβ é a menor quantidade da substância que pode ser detectada,
identificada ou quantificada numa amostra com uma probabilidade de erro β, sendo
uma característica importante para métodos de triagem (Ec, 1996a; Companyó et al.,
2009). Quando não há limite permitido estabelecido para a substância, o CCß é a
concentração mais baixa a que o método é capaz de detectar amostras realmente
contaminadas. Quando existe esse limite estabelecido, o CCß é a concentração em
que o método é capaz de detectar concentrações no limite permitido. Em ambos os
casos, leva-se em consideração uma certeza estatística de 1-β (Ec, 2002).
3.3.3.9 Robustez
Todo método tem etapas em que, se não houver cuidado suficiente, haverá
um efeito significativo no desempenho do método, podendo levar à não adequação
ao seu propósito. Essas etapas devem ser identificadas, geralmente na etapa de
desenvolvimento do método e, se possível, sua influência no desempenho do
68
método deve ser avaliada na forma de um teste de robustez (Magnusson e
Örnemark, 2014).
Estudar a robustez é avaliar a susceptibilidade de um método analítico a
alterações das condições experimentais com a introdução deliberada de pequenas
variações razoáveis e a observação das suas consequências, em relação às
condições experimentais que possam estar sujeitas a variações (por exemplo:
estabilidade dos reagentes, composição da amostra, pH, temperatura) (Ec, 2002).
Dessa forma, é possível identificar as variáveis responsáveis por efeitos
significativos e garantir que, durante a execução da análise, elas sejam controladas.
Essas variáveis podem, ainda, constituir pontos de melhoria do método (Magnusson
e Örnemark, 2014).
A maioria das mudanças não deve ter efeito no desempenho do método,
sendo possível variar várias de uma vez. Um experimento econômico é possível ao
se trabalhar com o fatorial fracionado de Youden. Exemplos de fatores que podem
ser abrangidos num teste de robustez são: concentração do reagente, pH de uma
solução, temperatura de uma reação, tempo de espera, etc. (Thompson, Ellison e
Wood, 2002).
3.3.3.10 Sensibilidade
Magnusson e Örnemark (2014) utilizam o termo “sensibilidade analítica”
definindo-o como a mudança na resposta intrumental correspondente à mudança na
quantidade medida, ou seja, está relacionada à inclinação da curva de resposta.
Esses autores, no entanto, ressaltam que a medida deste parâmetro não tem grande
importância.
De fato, a sensibilidade é uma medida arbitrária. Ela pode ser utilizada em
procedimentos de garantia da qualidade, por exemplo, mas não tem utilidade para
validação (Thompson, Ellison e Wood, 2002).
69
3.3.4 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DA VALIDAÇÃO
INTRALABORATORIAL PARA MÉTODOS QUALITATIVOS
É importante incluir um número significativo de amostras para se avaliar os
parâmetros de ensaios qualitativos. O planejamento desse tipo de validação, devido
a esse tipo de análise fornecer muito menos informações que os métodos
quantitativos, requer um grande número de medidas para se obterem resultados
com a mesma significância e certeza que os resultados de métodos quantitativos
(Gondim et al., 2014).
3.3.4.1 Taxas (falsos resultados, sensibilidade, seletividade e
confiabilidade)
Há dois tipos de resultados possíveis no teste qualitativo (positivo ou
negativo) e duas possíveis situações reais, pode-se construir uma tablela de
contingência 2x2 (Tabela 7) passível de ser utilizada na determinação das taxas de
falsos resultados, TST, TSB e TCF, podendo ser utilizada em diversos tipos de
bioensaios, incluindo imunológicos (Gondim, 2012).
Tabela 7. Tabela de contingência 2 x 2 utilizada para cálculo das taxas de falsos
resultados, de seletividade, de sensibilidade e de confiabilidade
Resultado do teste Analito Presente Analito Ausente Total
Positivo TP FP TP + FP
Negativo FN TN FN + TN
Total FN + TP FP + TN N Legenda: FP: quantidade de resultados falso-positivos; FN: quantidade de resultados falso-negativos; TP: quantidade de resultados positivos corretos; TN: quantidade de resultados negativos corretos; N: TP+FP+FN+TN. Fonte: Gondim (2012).
TFP é a percentagem de número de resultados falso-positivos (FP) em
relação aos total de negativos esperados. De maneira análoga, TFN é a
percentagem de número de resultados falso-negativos (FN) em relação ao total de
positivos esperados. A TSB se dá como a percentagem de TP em relação ao total de
positivos esperados enquanto a TST é a percentagem de TN em relação ao total de
negativos esperados. A TCF é calculada como o total de resultados (100%)
subtraído das taxas de falso-resultados (Gondim, 2012).
70
3.3.4.2 Limite de detecção e região de perda de confiabilidade
O conceito de incerteza para análises qualitativas não pode ser expresso da
mesma forma que análises quantitativas. No primeiro caso, o termo perda de
confiança é proposto considerando as probabilidades de obtenção de falsos
resultados, portanto, uma RPC pode ser estimada por meio de um gráfico de
resultados positivos versus concentração do analito. O LD porde ser calculado como
o limite inferior ou superior da RPC dependendo do tipo de erro, α ou ß, considerado
(Gondim et al., 2014).
3.3.4.3 Acordância e concordância
A ACO representa a repetibilidade de uma análise qualitativa. Já a CON,
nesses mesmos termos, é a representação da reprodutibilidade. A ACO e a CON
podem diferir para o branco ou para amostras positivas dependendo da
concentração do analito, desssa forma, assim como a repetibilidade e a
reprodutibilidade, a ACO e a CON não medem a correlação da reposta com o valor
verdadeiro, mas sim se um determinado procedimento está suficientemente
padronizado (Gondim et al., 2014).
3.3.4.4 Robustez
Da mesma maneira que nos métodos quantitativos, a robustez envolve um
delineamento fatorial que avalia a influência de diferentes fatores ou variáveis. Esse
parâmetro deve ser estabelecido levando em consideração diferentes níveis do
analito por ser dependente da concentração (Gondim et al., 2014). O objetivo da
determinação da robustez é definir a fraqueza experimental do método qualitativo,
definindo-se quais os fatores que são críticos para se garantir a confiança na
resposta (Cárdenas e Valcárcel, 2005).
71
4. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos descritos no presente trabalho foram realizados no
Laboratório de Bromatologia - Unidade de Pesquisa Análise de Alimentos (BRO-
UPAA) da Faculdade de Farmácia (FAFAR) da UFMG.
As análises confirmatórias por cromatografia a líquido de ultra eficiência
acoplada a espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) foram realizadas no
Laboratório Nacional Agropecuário em Minas Gerais (LANAGRO-MG) do MAPA com
LD de 0,1 µg/kg.
4.1 AMOSTRAS
4.1.1 Validação
Duas amostras de músculo suíno congeladas, totalizando aproximadamente
1,6 kg, armazenadas em sacos plásticos e provenientes de diferentes cortes, foram
recebidas na BRO-UPAA, fornecidas pelo LANAGRO-MG. No laboratório de origem,
foram obtidos resultados não detectados para RCT, por meio de método UPLC-
MS/MS validado.
As amostras foram descongeladas, limpas, com auxílio de faca, sobre tábuas
de corte de plástico, retirando-se películas, fáscia muscular, vasos sanguíneos e
gordura. Em seguida, as amostras foram cortadas nessas mesmas tábuas em
pequenos cubos e homogeneizadas em processadores até a formação de uma
massa homogênea que foi acondicionada em porções de 100 g em 11 embalagens
plásticas primárias do tipo ziplock, devidamente identificadas. Tais embalagens
foram lacradas e armazenadas sob congelamento entre -18 C e -24 C, em uma
embalagem secundária, também do tipo ziplock, até o momento das análises de
validação.
4.1.2 Estudo de Ocorrência
Amostras de músculo suíno, congeladas ou refrigeradas, variando de 1,2 kg a
3,5 kg, aproximadamente, provenientes de três diferentes cortes (costela, lombo e
pernil traseiro) foram obtidas no mercado de Minas Gerais, Brasil, no decorrer do
72
ano de 2015 (com datas de fabricação que cobriram diferentes sazonalidades -
outono, inverno e primavera). Foram coletadas dez amostras de cada corte, de 18
diferentes fornecedores, totalizando 30 amostras. Em cada corte, cada uma das dez
amostras foi representativa de um fornecedor diferente, ou seja, os fornecedores não
se repetiram em um mesmo tipo de corte.
As amostras do estudo de ocorrência foram processadas, embaladas e
armazenadas como descrito em 4.1.1, até o momento das análises pelo kit validado.
4.2 EQUIPAMENTOS
- Agitador de tubo tipo Vortex (IkaMinishaker MS2 e Phoenix AP56).
- Agitador orbital (Phoenix, modelo AP22).
- Balança analítica com resolução 0,0001 g e capacidade máxima de 220,0000
g, calibrada por laboratório acreditado pela Coordenação Geral de
Acreditação (CGCRE) de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob
número 0045 (Shimadzu AUX 220).
- Balança analítica com resolução 0,001 g e capacidade máxima de 310,000 g,
calibrada por laboratório acreditado pela CGCRE de acordo com a ABNT
NBR ISO/IEC 17025, sob número 0045 (Gehaka BK 300).
- Balões volumétricos de 50 mL e 100 mL, calibrados por laboratório acreditado
pela CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob número 0383.
- Centrífuga (Jouan, modelo BR4i).
- Concentrador de amostras (Tecnal, modelo Tecvap TE0194).
- Congelador ajustado em temperaturas entre -18 C e -24 C (Eletrolux FE 22).
- Cronômetro.
- Impressora matricial (EPSON ELX300).
- Leitora de placas ELISA com faixa 450 nm. (Biotek ELX800).
- Macropipeta de 1000 μL a 10000 μL, calibrada por laboratório acreditado pela
CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob número 0422 (HTL
LabSolutions LM10000).
- Micropipeta de 100 μL a 1000 μL, calibrada por laboratório acreditado pela
CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob número 0383
(Thermo Scientific Finnpipette® F3).
73
- Micropipeta de 20 μL a 200 μL, calibrada por laboratório acreditado pela
CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob número 0486
(Thermo electron Corporation Finnpipette®).
- Micropipeta multicanal de 30 μL a 300 μL, calibrada por laboratório acreditado
pela CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC 17025, sob número 0486
(Eppendorf).
- Processador de amostras Cutter Sire.
- Processador de amostras Liquidificador Arno WWBC.
- Refrigerador ajustado em temperaturas entre 2 °C e 8 °C (Eletrolux DFF37
Premium).
- Termômetro digital tipo cabo sensor, com memória de máxima e mínima,
calibrado por laboratório acreditado pela CGCRE de acordo com a ABNT
NBR ISO/IEC 17025, sob número 0338 (Incotherm 7665.02.0.00).
- Termômetro digital tipo espeto, com memória de máxima e mínima, calibrado
por laboratório acreditado pela CGCRE de acordo com a ABNT NBR ISO/IEC
17025, sob número 0338 (Incotherm).
4.3 MATERIAIS
Todo material utilizado foi de primeiro uso e previamente lavado com detergente
neutro, rinsado com acetonitrila grau HPLC e seco.
- Béquer de vidro de 50 mL, 100 mL e 250 mL.
- Etiqueta para identificação de amostras e soluções.
- Faca de aço inox.
- Frasco de vidro âmbar com tampa de rosca para armazenamento de soluções
(25 mL e 250 mL).
- Funil de vidro.
- Garrafa lavadeira de teflon com capacidade para 500 mL.
- Luvas de nitrila descartáveis.
- Ponteira sem filtro de polipropileno translúcido descartável para micro e
macropipetas.
- Proveta de vidro de 25 mL e 500 mL (Laborglass)
- Tábua de corte de plástico.
- Tubo cônico de polipropileno de 15 mL com tampa de rosca tipo Falcon.
74
4.4 REAGENTES, PADRÕES E OUTROS
- Acetato de etila grau HPLC (Sigma-Aldrich).
- Acetonitrila grau HPLC gradiente (Scharlab e Sigma Aldrich).
- Detergente neutro Extran (Merck).
- Kit Europroxima 5061RACT (insumos e planilha Europroxima Simplefit II).
- N-hexano grau HPLC (Sigma-Aldrich e Tedia).
- Padrão de CLEM Dr. Ehrenstorfer LOTE 20222 validade 02/2016.
- Padrão de RCT Dr. Ehrenstorfer LOTE 41001 validade 10/2018.
4.5 SOLUÇÕES
4.5.1 SOLUÇÕES FORNECIDAS PELO KIT
Para cada lote do kit foram preparadas novas soluções tampão de diluição,
conjugado e tampão de rinsagem, as quais foram utilizadas imediatamente após o
preparo.
4.5.1.1 Solução tampão de diluição
O tampão de diluição concentrado fornecido com o kit foi retirado da
refrigeração. Após atingir temperatura ambiente, foi agitado manualmente, de forma
vigorosa, até não apresentar precipitação do conteúdo. Foram medidos 20 000 µL
desse tampão e solubilizados em 60 000 µL de água ultrapura.
4.5.1.2 Solução de conjugado
O frasco de conjugado fornecido com o kit foi retirado da refrigeração. Após
atingir temperatura ambiente, teve todo o seu conteúdo reconstituído com 6 000 µL
de solução tampão de diluição e foi agitado, manualmente, até completa dissolução.
A solução foi protegida da luz até o momento de seu uso.
4.5.1.3 Solução tampão de rinsagem
O tampão de rinsagem concentrado fornecido com o kit foi retirado da
refrigeração. Após atingir temperatura ambiente, foram medidos 24 mL e
solubilizados em 456 mL de água ultrapura.
75
4.5.2 SOLUÇÕES PADRÃO DE RCT
A solução padrão estoque de RCT foi preparada uma única vez. A partir dela
foram preparadas as soluções padrão intermediária e de trabalho A e B, a cada
bateria analítica.
4.5.2.1 Solução estoque - 100 µg/mL
Foram pesados 11,3 mg de cloridrato de RCT e transferidos para um balão
volumétrico de 100 mL. O volume foi completado com acetonitrila, seguido de
homogeneização manual. A solução foi transferida para frasco de vidro âmbar, com
tampa de rosca, devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -
24 C.
4.5.2.2 Solução intermediária - 1 µg/mL
Foram pipetados 1 000 µL da Solução Estoque para um balão volumétrico de
100 mL. O volume foi completado com acetonitrila, seguido de homogeneização
manual. A solução foi transferida para frasco de vidro âmbar, com tampa de rosca,
devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -24 C.
4.5.2.3 Solução de trabalho A - 1,25 ng/mL
Foram pipetados 62,5 µL da Solução Intermediária para um balão volumétrico
de 50 mL. O volume foi completado com acetonitrila, seguido de homogeneização
manual. A solução foi transferida para frasco de vidro âmbar, com tampa de rosca,
devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -24 C.
4.5.2.4 Solução de trabalho B - 10 ng/mL
Foram pipetados 500 µL da Solução Intermediária para um balão volumétrico
de 50 mL. O volume foi completado com acetonitrila, seguido de homogeneização
manual. A solução foi transferida para frasco de vidro âmbar, com tampa de rosca,
devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -24 C.
76
4.5.3 SOLUÇÕES PADRÃO DE CLEM
As soluções padrão de CLEM foram preparadas uma única vez para a bateria
analítica dos estudos complementares de seletividade.
4.5.3.1 Solução estoque - 92,1 µg/mL
Foram pesados 10,59 mg de cloridrato de CLEM e transferidos para um balão
volumétrico de 100 mL. O volume foi completado com metanol, seguido de
homogeneização manual. A solução foi transferida para tubo do tipo Falcon, com
tampa de rosca, devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -
24 C.
4.5.3.2 Solução intermediária - 9,21 µg/mL
Foram pipetados 1 000 µL da Solução Estoque para um balão volumétrico de
10 mL. O volume foi completado com metanol, seguido de homogeneização manual.
A solução foi transferida para tubo do tipo Falcon, com tampa de rosca, devidamente
identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -24 C.
4.5.3.3 Solução de trabalho - 20 ng/mL
Foram pipetados 109 µL da Solução Intermediária para um balão volumétrico
de 50 mL. O volume foi completado com acetonitrila, seguido de homogeneização
manual. A solução foi transferida para frasco de vidro âmbar, com tampa de rosca,
devidamente identificado, e mantida sob temperatura de -18 C a -24 C.
4.6 PROCEDIMENTO ANALÍTICO
Uma alíquota de 1 g da amostra processada foi transferida para tubo cônico
tipo Falcon e adicionada de 4 000 µL de acetonitrila e de 500 µL de acetato de etila,
seguido de agitação em agitador de tubos tipo vortex por 1 min. Foi realizada
inversão em agitador orbital por 30 min, seguindo-se de centrifugação a 2 000 xg por
77
10 min a (22,5 ± 2,5) °C. Foram transferidos 2 000 µL do sobrenadante para um
novo tubo cônico do tipo Falcon. O tubo foi levado à evaporação sob fluxo de ar
comprimido a, aproximadamente, 5 psi, em concentrador de amostras, com
temperatura do banho termostático ajustada para 50 °C. Após a evaporação
completa, o resíduo foi retomado em 500 µL de n-hexano e 500 µL de tampão de
diluição, seguido de homogeneização em agitador de tubos tipo vortex por 30 s. O
tubo foi levado à centrifugação a 2 000 xg por 10 min a (22,5 ± 2,5) °C.
As soluções padrão fornecidas com o kit foram retiradas da refrigeração. Após
atingirem temperatura ambiente, procedeu-se a aplicação de padrões e extratos de
amostras na placa de ELISA, conforme descrito a seguir. Foram pipetados 100 µL
do padrão zero, em duplicata, para os poços A1 e A2, para o branco (Figura 14).
Foram pipetados 50 µL do padrão zero, em duplicata, para os poços B1 e B2, para o
zero. Foram pipetados 50 µL de cada solução padrão da curva fornecida pelo
fabricante para os poços de C1 e C2 até H1 e H2. Foram pipetados 50 µL da
camada líquida inferior dos extratos de amostras para os poços restantes da placa,
de maneira aleatória.
Figura 14. Representação esquemática dos poços da placa ELISA
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12
Foram adicionados 50 µL de conjugado em todos os poços, exceto A1 e A2
(Figura 14). A placa foi tampada e agitada com movimentos em oito por 10 s, sendo,
em seguida, incubada por 30 min em local escuro a (22,5 ± 2,5) °C. A placa foi
destampada e o conteúdo dos poços foi descartado. Em seguida, foi realizada a
78
rinsagem da placa com 300 µL da solução tampão de rinsagem, descarte desta
solução e secagem, batendo-se a placa invertida sobre papel toalha absorvente até
completa secagem. Este procedimento foi repetido por três vezes. Foram pipetados
100 µL da solução de substrato para cada poço. A placa foi incubada por 15 min em
local escuro a (22,5 ± 2,5) °C. Foram pipetados 100 µL de solução stop para cada
poço e a leitura das absorbâncias foi realizada, imediatamente após, em leitora de
microplaca no comprimento de onda de 450 nm.
As leituras de absorbância medidas para soluções padrão e extratos de
amostras foram lançadas na planilha Europroxima Simplefit II para cálculo das
concentrações de RCT em µg/kg. Concentrações finais reportadas com o sinal ! na
referida planilha foram interpretadas como não detectadas. O critério do fabricante
foi considerar como não detectada toda amostra para a qual a leitura de absorbância
foi superior a maior leitura reportada para as replicatas da solução padrão de menor
concentração fornecida com o kit (0,0625 µg/kg) somada de 10 % (Europroxima,
2012).
4.7 VALIDAÇÃO
4.7.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
4.7.1.1 Seletividade, acurácia, incerteza e limites
Devido à indisponibilidade de MRC, amostras (alíquotas de 1 g da amostra
branca preparada para a validação) foram adicionadas de solução padrão de RCT,
em sete níveis de concentração, na faixa de trabalho declarada pelo fabricante do
kit, além do branco, conforme relacionado na Tabela 8. Cada nível de concentração
foi avaliado em 30 replicatas independentes, totalizando 240 ensaios, que foram
divididas em três baterias analíticas distintas, com dez replicatas cada, envolvendo
diferentes tempos e analistas, e empregando insumos de diferentes lotes. (Figura
15) (Ec, 2002; Souza, 2007; Souza, Pinto e Junqueira, 2007; Gondim et al., 2014).
Por motivos de capacidade operacional de alguns equipamentos, em cada
bateria analítica, as replicatas dos diferentes níveis de concentração foram
79
separadas em quatro grupos de 20, sendo que todos os níveis estavam
representados de forma equilibrada nos diferentes grupos.
Tabela 8. Mapa de adição de solução padrão de ractopamina e de solvente de extração para preparação das amostras nos diferentes níveis de concentração
Concentração final de ractopamina
(µg/kg de tecido)
Concentração da solução de trabalho adicionada (ng/mL)
Volume da solução de trabalho
adicionado (µL)
Volume de acetonitrila na extração (µL)
0,0 - - 4 000 0,029 1,25 24 3 976 0,061 1,25 50 3 950 0,122 10 100 3 900 0,244 10 25 3 975 0,487 10 50 3 950 0,974 10 100 3 900 1,948 10 200 3 800
Figura 15. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação dos parâmetros seletividade, recuperação, precisão e limites, na
abordagem quantitativa, e dos parâmetros taxas, região de perda de confiabilidade,
limite de detecção, acordância e concordância, na abordagem qualitativa.
Legenda: N: nível de concentração de ractopamina; B: bateria analítica; N1: 0,029 µg/kg; N2: 0,061 µg/kg; N3: 0,122 µg/kg; N4: 0,244 µg/kg; N5: 0,487 µg/kg; N6: 0,974 µg/kg; N7: 1,948 µg/kg; R: replicata; E: ensaio.
4.7.1.2 Robustez
Para estudo da robustez, foi realizado delineamento fatorial envolvendo dois
níveis de três diferentes fatores, resultando em oito tratamentos, os quais foram
avaliados em oito replicatas cada, totalizando 64 ensaios. Todos os fatores
considerados foram da etapa de extração, incluindo: i) tempo de inversão em
80
agitador orbital (25 min ou 35 min); ii) tempo das centrifugações (5 min ou 15 min); e
iii) temperatura do banho termostático na etapa de evaporação do solvente (45 °C
ou 55°C) (Figura 16). As replicatas de amostras submetidas aos diferentes
tratamentos foram adicionadas de solução padrão de RCT, no nível de concentração
0,244 µg/kg, por representar o LD do método na abordagem quantitativa e o menor
nível com 100 % de TCF na abordagem qualitativa da validação (Gondim et al.,
2014)
Figura 16. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação do parâmetro robustez.
Legenda - os tratamentos foram discriminados em função do tempo de inversão em agitador orbital, tempo de centrifugação e temperatura do banho, repectivamente, tratamento 1: 25 min, 5 min e 45 oC; tratamento 2: 25 min, 5 min e 55 oC; tratamento 3: 25 min, 15 min e 45 oC; tratamento 4: 25 min, 15 min e 55 oC; tratamento 5: 35 min, 15 min e 45 oC; tratamento 6: 35 min, 15 min e 55 oC; tratamento 7: 35 min, 5 min e 45 oC; e tratamento 8: 35 min, 5 min e 55 oC; B: bateria analítica; T: tratamento; R: replicata; E: ensaio.
4.7.1.3 Seletividade (complementar)
O estudo de seletividade complementar, por adição deliberada de interferente
em potencial, neste caso o CLEM, foi conduzido com amostras brancas e
adicionadas de RCT em 0,244 µg/kg (por representar o LD do método na
abordagem quantitativa e o menor nível com 100 % de TCF na abordagem
qualitativa da validação), sendo 10 replicatas por nível, totalizando 20 ensaios O
nível de concentração do provável interferente foi definido como o dobro daquele
81
adicionado de analito, ou seja, 0,487 µg/kg (Figura 17) (Ec, 2002; Souza, 2007;
Gondim et al., 2014).
Figura 17. Representação esquemática do delineamento experimental para a etapa
de avaliação do parâmetro seletividade.
Legenda: B: bateria analítica; CLEM: clembuterol; RCT: ractopamina; R: replicata; E: ensaio.
4.7.2 ANÁLISE DE DADOS
4.7.2.1 Abordagem quantitativa
Após estimativa das concentrações de RCT nas amostras, as porcentagens
de recuperação foram calculadas, para as replicatas de cada nível de concentração
estudado. As porcentagens de recuperação médias de cada nível (n = 30) foram
estimadas após tratamento de outliers pelo teste de Grubbs (Souza, Pinto e
Junqueira, 2007). Os resultados foram considerados satisfatórios quando se
apresentaram entre 50 % e 120 % para amostras com teores menores ou iguais a
1 µg/kg e entre 70 % e 110 % para amostras entre 1 µg/kg e 10 µg/kg (Ec, 2002).
Os desvios padrão relativos de repetibilidade (RSDr) e de precisão
intermediária (RSDR) foram estimados, para esses mesmos níveis, por análise de
variância (n = 30). Foi realizada a verificação das premissas relativas aos resíduos
de recuperações: i) normalidade, pelo teste de Ryan-Joiner; e ii)
82
homoscedasticidade, pelo teste de Brown-Forsythe (Souza, Pinto e Junqueira,
2007). O RSDr foi considerado aceitável quando menor ou igual a um terço do
desvios obtidos pelos modelos de Horwitz e Thompson e o RSDR foi aceitável
quando menor ou igual aos desvios estimados pelos modelos citados (Ec, 2002).
Os resultados obtidos para amostras brancas (n = 30) e para amostras
brancas (n = 10) e adicionadas de RCT (n = 10) na presença de CLEM foram
empregados para avaliação da seletividade, sendo considerados aspectos como
falsa identificação ou supressão do analito. O LD teórico foi calculado como sendo
igual à média das leituras das amostras brancas somada de três vezes o desvio
padrão da média, enquanto o LQ teórico foi definido como sendo igual à média das
determinações das amostras brancas somada de dez vezes o desvio padrão desta
média. Os limites do método foram estabelecidos como a menor concentração na
qual a RCT foi detectada em todas as replicatas de amostras adicionadas (LD) e a
menor concentração na qual a RCT foi determinada com precisão aceitável (LQ) (Ec,
2002; Souza, 2007).
Para estimativa da incerteza em cada nível de concentração, empregando
uma abordagem top-down, foi considerado como componente a incerteza-padrão
devida à precisão intermediária. Essa estimativa foi multiplicada pelo fator de
abrangência (k=2, para um nível de confiança aproximado de 95 %) para obtenção
da incerteza expandida associada aos resultados de medição (Ellison e Williams,
2012). As incertezas estimadas foram avaliadas frente aos critérios descritos pela
União Europeia para análises de contaminantes (Ec, 2006; 2011), devendo ser
inferiores à incerteza de medição máxima estimada (uf) estimada pela Equação 1:
𝑢𝑓 = √(𝐿𝐷/2)2 + (𝛼𝐶)2 (Eq. 1)
Sendo, LD: limite de detecção do método, C: concentração, α: fator numérico
dependente de C (0,2 para valores de C menores ou iguais a 50 µg/kg).
83
4.7.2.2 Abordagem qualitativa
A validação segundo abordagem quantitativa do kit foi conduzida conforme
descrito por Gondim et al. (2014), envolvendo amostras positivas e negativas para
estimar TFP, TFN, TSB, TST, TCF, LD, RPC, ACO e CON e amostras na menor
concentração em que se obtiveram 100 % de resultados positivos, ou seja,
0,244 µg/kg.
4.7.2.3 Taxas, RPC, LD, ACO e CON
Para a abordagem qualitativa, foram considerados positivas as amostras
cujas concentrações finais foram reportadas na planilha Europroxima SimpleFit II e
negativas as amostras cujas concentrações finais foram indicadas com o sinal !.
Para cada nível de concentração, as taxas de falsos resultados, bem como
TST, TSB e TCF, foram calculadas por meio de tabelas de contingência (Gondim et
al., 2014).
Curvas de desempenho (porcentagem de resultados positivos versus
concentração de RCT em µg/kg) foram plotadas para estudo da RPC e do LD,
empregando modelos não lineares logito (Equação 2) e probito (Equação 3), sendo
considerados o perfil não tendencioso do gráfico de resíduos e o coeficiente de
determinação como critérios para escolha do modelo. A RPC foi representada pela
região entre 5 % e 95 % de resultados positivos (Ec, 2002), sendo o LD definido
como o extremo superior da RPC. Os parâmetros RPC e LD foram considerados
satisfatórios, quando abaixo do nível regulamentado para o analito (Gondim et al.,
2014) no Brasil.
𝑌 =100∙𝑎
1+𝑏∙𝑒−𝑐𝑥 (Eq. 2)
𝑌 =100∙𝑒𝑎+𝑏𝑥
1+𝑒𝑎+𝑏𝑥 (Eq. 3)
ACO e CON foram estimados por análise combinatória, para cada nível de
concentração estudado, e o método foi considerado suficientemente padronizado
84
quando obtidos resultados de ACO maiores ou iguais a 0,8 fora da RPC
(possibilidade de um falso resultado em cada bateria analítica de 10 replicatas)
(Gondim et al., 2014).
4.7.2.4 Seletividade e robustez
A seletividade do método na presença do CLEM foi avaliada pela alteração na
TCF no menor nível de concentração para o qual tenha sido obtida TCF de 100 %,
sendo tolerado uma taxa de no mínimo 95 % na presença do potencial interferente.
De maneira similar, no estudo da robustez, foram consideradas robustos aqueles
tratamentos nos quais foram alcançadas TCF maiores ou iguais a 95 % (Gondim et
al., 2014).
4.8 ESTUDO DE OCORRÊNCIA
4.8.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O kit validado foi empregado no monitoramento de resíduos de RCT em
amostras de carne suína coletadas no estado de Minas Gerais, Brasil, cobrindo
diferentes cortes, fornecedores e sazonalidades. As análises foram conduzidas em
duplicata dentro do prazo de validade definido pelos fabricantes (Figura 18).
Divergências entre resultados de duplicatas analíticas seriam resolvidas pela
repetição da análise, em replicata única, como contra-prova.
Figura 18. Representação esquemática de ocorrência.
Legenda: F: fornecedor; A: amostra; R: replicata analítica.
85
4.8.2 ANÁLISE DE DADOS
A prevalência de RCT em carne suína foi avaliada. A influência dos cortes,
fornecedores e sazonalidade no resultado de RCT foi avaliada por meio de análise
de cluster hierárquica (HCA, em inglês) pelo critério de Ward (Ward, 1963) utilizando
análise de componente principal (PCA, em inglês) e distância de Mahalanobis.
86
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 VALIDAÇÃO
5.1.1 ABORDAGEM QUANTITATIVA
A linearidade (ajuste ao modelo) e efeitos de matriz não foram estudados na
abordagem quantitativa de validação do presente trabalho, com a finalidade de
avaliar o desempenho do kit quando seguidas, de forma estrita, as orientações de
uso fornecidas pelo fabricante/fornecedor do kit. Isto porque tais condições
representariam a rotina de aplicação do kit por diferentes usuários. Dessa forma, não
haveria sentido em estudar tais parâmetros, uma vez que os usuários são orientados
a utilizarem as soluções padrão da curva de calibração e a planilha de cálculos,
contendo modelo para estimativa dos resultados, que são fornecidos junto ao kit.
Na Tabela 9, estão representados os valores estimados de porcentagem de
recuperação média e de desvios padrão relativos, após tratamento de outliers pelo
teste de Grubbs, para as amostras adicionadas de padrão de RCT, segundo a
abordagem quantitativa da validação.
Pelo teste de Grubbs foram detectados dois outliers apenas no nível de
concentração 0,122 µg/kg (p < 0,05).
Para os dois níveis de menores concentrações estudados (0,029 µg/kg e
0,061 µg/kg), não foi possível calcular a recuperação, pois os resultados obtidos
para todas as replicatas nestes níveis, empregando a planilha Europroxima Simplefit
II, foram não detectados.
No nível de concentração 0,122 µg/kg, a recuperação média foi de 30,3 %, ou
seja, menor que o critério mínimo de 50 % estabelecido pela CE. Nos níveis de
concentração de 0,244 µg/kg a 0,974 µg/kg, as recuperações médias estavam
compreendidas entre 50 % e 120 %, com média global de 62,60 %. O nível
1,948 µg/kg não atendeu ao critério preconizado de, no mínimo, 70 % (Ec, 2002).
87
Para nenhum dos níveis avaliados foi observada precisão satisfatória, ou seja,
em todos os casos os DPRr e DPRR foram maiores que os limites máximos de
14,7 % e 22 %, respectivamente (Ec, 2002).
Tabela 9. Médias de recuperação e desvios padrão relativos, sob condições de
repetibilidade e precisão intermediária, obtidos na determinação de ractopamina em
músculo de suíno pelo kit 5061RACT
Concentração (μg/kg)
n Rm (%)
DPRr
(%) DPRR (%)
0,029 30 ND - -
0,061 30 ND - -
0,122 28 30,3 74,1 104,6
0,244 30 64,0 21,4 30,3
0,487 30 65,1 21,0 23,9
0,974 30 58,8 21,4 24,5
1,948 30 68,7 19,4 25,3
Legenda: n: número de observações após tratamento de outliers pelo teste de Grubbs; Rm: porcentagem de recuperação
média, com critério de aceitabilidade de 50 % a 120 % para amostras com teores menores ou iguais a 1 µg/kg e de 70 % a 110 % para amostras entre 1 µg/kg e 10 µg/kg (Ec, 2002); DPRr: desvio padrão relativo de repetibilidade, com critério de aceitabilidade máximo de 14,7 % (Ec, 2002); DPRR: desvio padrão relativo de precisão intermediária, com critério de aceitabilidade máximo de 22 % (Ec, 2002); ND: não detectado; Destacados em cinza os valores que se encontraram fora dos critérios de aceitabilidade.
Todas as 30 replicatas de amostras brancas, ou seja, sem adição de padrão
de RCT, apresentaram resultados não detectados. No estudo de seletividade
complementar, resultados não detectados também foram observados para todas as
dez replicatas de amostras brancas adicionadas de CLEM, indicando que o referido
composto não conferiu efeito potencializador na determinação de RCT. No caso das
outras dez replicatas de amostras, adicionadas de RCT e CLEM, 100 %
apresentaram resultados detectados para o referido analito, sugerindo que o CLEM
também não interferiu de maneira supressora em relação à RCT. Dessa forma, a
seletividade do kit foi demonstrada tanto pela ausência de resultados detectados nas
amostras brancas como pela não interferência do CLEM no estudo de seletividade
complementar.
88
Os limites teóricos não puderam ser estimados, visto que respostas não
detectadas foram reportadas para todas as replicatas de amostras brancas.
Contudo, o LD do método foi definido como 0,244 µg/kg, menor nível no qual a RCT
foi detectada em todas as replicatas de amostras adicionadas. LQ do método
também não foi estabelecido, visto que os critérios de aceitabilidade para precisão
não foram alcançados pelo kit em nenhum nível de concentração avaliado.
Os valores estimados para as incertezas de medição pela abordagem top-
down incluíram incertezas expandidas de 60,6 %; 47,7 %; 48,9 % e 50,5 % para os
níveis 0,244 µg/kg; 0,487 µg/kg; 0,974 µg/kg; e 1,948 µg/kg, respectivamente. Tais
resultados encontraram-se acima dos valores de incerteza máxima estimados como
aceitáveis (53,9 %; 32,1 %; 23,6 % e 21,0 %, respectivamente) (Ec, 2006; 2011), o
que já seria esperado, dado que a precisão já se mostrara acima dos valores
máximos estabelecidos.
Zhang et al. (2009) desenvolveram um método ELISA para determinação
rápida de resíduos de RCT em produtos de origem animal e investigaram o efeito de
matriz. A matriz músculo suíno foi fortificada em três níveis (0,5 µg/kg; 2,0 µg/kg e
8,0 µg/kg), em triplicata, resultando em recuperações de 70,6 % a 76,7 % e DPR de
4,6 % a 10,2 %. Foi encontrado efeito de matriz quando o extrato em solvente
orgânico da amostra foi diluído até cinco vezes em tampão fosfato, sendo que o
aumento da diluição não diminuiu o efeito de matriz. As curvas de calibração
preparadas em extrato livre de RCT e somente em tampão fosfato foram
superpostas sem evidência de efeitos de matriz.
Zhang et al. (2012) desenvolveram e compararam dois ensaios ELISA
competitivos indiretos: o tradicional e outro utilizando amplificação por biotina-
estreptavidina (BA-ELISA). Para ambos, músculo suíno foi fortificado nas
concentrações de 0,16 µg/kg; 0,8 µg/kg e 4 µg/kg. Para o BA-ELISA, foram obtidas
recuperações de 75,0 % a 82,8 % com DPR de 3,5 % a 9,0 %, enquanto para o
ELISA tradicional, foram obtidas recuperações de 75,0 % a 83,5 % com DPR de
3,6 % a 8,1 %.
Dong et al. (2012) desenvolveram e avaliaram o desempenho de um
imunoensaio enzimático por quimioluminescência por meio da recuperação em
89
carne suína de três níveis e triplicatas. As recuperações variaram de 94,7 % a
104,4 %, com DPR de 10 % a 15 %.
Pleadin et al. (2012) usaram um kit ELISA comercial (Ridascreen) para avaliar
a presença de RCT após retirada desse fármaco da alimentação de suínos. A
validação do método foi realizada para músculo em quatro níveis (2 µg/kg, 5 µg/kg,
10 µg/kg e 20 µg/kg), sendo seis replicatas por nível em três dias diferentes,
totalizando 72 ensaios. A recuperação variou de 79,2 % a 92,7 % com DPRr de
4,9 % a 8,3 % DPRR de 7,5 % a 11,5 %. O LD e o LQ foram estabelecidos em
0,4 µg/kg e 0,5 µg/kg, respectivamente.
Comparando-se os dados do presente estudo com aqueles reportados na
literatura para métodos de escopo similar, percebeu-se um pior desempenho
quantitativo do kit aqui analisado. Observou-se, contudo, que maioria dos trabalhos
referiu-se à validação de imunoensaios desenvolvidos pelos próprios autores e que,
em todos os casos, os delineamentos para a validação foram mais restritos. De
qualquer forma, para uma triagem quantitativa, a aplicação do kit seria questionável,
visto que não houve evidências de recuperação, precisão, limites e incertezas
aceitáveis nessa abordagem. Tais resultados indicaram uma provável aplicação do
kit em triagens qualitativas, conforme resultados a seguir.
5.1.2 ABORDAGEM QUALITATIVA
Conforme demonstrado na Tabela 10, houve uma tendência de aumento na
confiabilidade dos resultados em função do aumento nos níveis de RCT. Resultados
não detectados foram observados para todas as replicatas de amostras brancas,
levando a uma TST de 100,0 % e 0,0 % de TFN, ou seja, a uma taxa de
confiabilidade de 100,0 %. Nos níveis 0,029 µg/kg, 0,0614 µg/kg e 0,122 µg/kg,
foram obtidos valores de TFN de 75,0 %, 77,8 % e 40,0 %, respectivamente. Assim,
TSB e TCF tiveram variação de 22,2 % a 60,0 %. TFN de 0,0 % foram estimadas
nos níveis acima de 0,244 µg/kg, resultando em 100 % de TSB e TCF.
90
Tabela 10. Taxas de falso-negativos, falso-positivos, de sensibilidade, de
seletividade e de confiabilidade obtidas na detecção de ractopamina em músculo de
suíno pelo kit 5061RACT
Concentração (μg/kg)
Parâmetro da Validação (%)
TFN/TFP TSB/TST TCF
0 0,0 100,0 100,0
0,029 75,0 25,0 25,0
0,061 77,8 22,2 22,2
0,122 40,0 60,0 60,0
0,244 0,0 100,0 100,0
0,487 0,0 100,0 100,0
0,974 0,0 100,0 100,0
1,948 0,0 100,0 100,0
Legenda: TFN = taxa de falso-negativos, para amostras positivas; TFP = taxa de falso-positivos, para amostras negativas; TSB = taxa de sensibilidade, para amostras positivas; TST = taxa de seletividade, para amostras negativas; TCF = taxa de confiabilidade. Destacados em cinza os valores que se encontraram fora da região de perda de confiabilidade.
O desempenho do kit pode ser considerado satisfatório, levando-se em
consideração os LMR para RCT no Brasil e em outros países (Tabela 4). No
entanto, confiabilidade de 60 % foi alcançada no nível 0,1 µg/kg, relativo ao limite de
monitoramento brasileiro e ao limite de detecção máximo estabelecido para controle
em países nos quais o uso da RCT é proibido.
Na Tabela 11 encontram-se relacionados os valores de ACO e CON
estimados para os oito níveis de concentração estudados. A ACO variou entre 0,5 e
1,0 e COM entre 0,4 e 1,0, com valores máximos (iguais a 1,0) no nível 0 µg/kg e a
partir do nível 0,244 µg/kg, indicando padronização adequado do método nesta
faixa.
91
Tabela 11. Acordância e concordância estimadas na detecção de ractopamina em
músculo de suíno pelo kit 5061RACT
Concentração (μg/kg)
ACO
CON Bateria
analítica 1 Bateria
analítica 2 Bateria
analítica 3
0 1,0 1,0 1,0 1,0
0,029 0,5 0,8 1,0 0,6
0,061 0,5 1,0 1,0 0,6
0,122 1,0 0,5 0,6 0,4
0,244 1,0 1,0 1,0 1,0
0,487 1,0 1,0 1,0 1,0
0,974 1,0 1,0 1,0 1,0
1,948 1,0 1,0 1,0 1,0
Legenda: ACO = acordância; CON: concordância. Destacados em cinza os valores que se encontraram fora da região de perda de confiabilidade.
Nas Figuras 19 e 20, encontram-se apresentadas representações gráficas
dos valores de ACO e CON estimados em função da concentração de RCT.
Figura 19. Valores de acordância em função das concentrações estudadas de
ractopamina.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 0,5 1 1,5 2Va
lor
de
ac
ord
ân
cia
RCT (µg/kg)
Bateria 1
Bateria 2
Bateria 3
92
Figura 20. Valores de concordância em função das concentrações estudadas de
ractopamina.
Curvas de desempenho foram construídas, por regressão logística não linear,
empregando os modelos sigmoides logito e probito. Em ambos os casos o perfil do
gráfico de resíduos não foi tendencioso, sendo escolhido o modelo logito, por
apresentar maior coeficiente de determinação (Figura 21). Desta forma, a RPC foi
calculada entre 0,000 µg/kg e 0,218 µg/kg, considerando TCF entre 5 % e 95 %,
respectivamente, sendo o LD definido como o extremo superior da RPC, ou seja,
0,218 µg/kg. Tal limite cumpre com o LMR estabelecido no Brasil para RCT, embora
não cubra o limite adotado para programas de monitoramento. O limite estimado no
presente trabalho foi inferior ao LD de 0,4 µg/kg reportado por Pleadin et al. (2012)
na validação quantitativa de um kit ELISA comercial (Ridascreen).
Como o parâmetro LD é arbitrário, ou seja, dependente da probabilidade de
erro considerada para sua definição, foi realizada uma estimativa de qual seria a
probabilidade de resultados falso-negativos no nível regulamentado para
monitoramentos (0,1 µg/kg), resultando em aproximadamente 50 %. O fabricante
declara um LD de 0,1 µg/kg, embora não apresente o critério adotado para
determinação do referido limite (Europroxima, 2012).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 0,5 1 1,5 2
Va
lor
de
co
nco
rdâ
nc
ia
RCT (µg/kg)
93
Figura 21. Resultados experimentais (), curvas de desempenho (), equações e
coeficientes de determinação (R2) obtidos por regressão logística não linear do tipo
probito (a) e logito (b) para ractopamina (RCT).
Y=100×e-2,53+24,64x
1+e-2,53+24,64x; R²=0,9846
(a)
Y=100×1,01
1+12,42e-24,42x; R²=0,9848
(b)
No estudo de seletividade, 100 % das amostras adicionadas somente de CLEM
apresentaram resultados negativos, bem como 100 % daquelas adicionadas de RCT
e CLEM apresentaram resultados positivos. Dessa forma, não houve evidência de
que o CLEM interferiu nos resultados da análise (Tabela 12).
0
20
40
60
80
100
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Res
ult
ad
os
po
sit
ivo
s (
%)
RCT (µg/kg)
0
20
40
60
80
100
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0Res
ult
ad
os
po
sit
ivo
s (
%)
RCT (µg/kg)
94
Tabela 12. Taxas de falso-positivos, de falso-negativos e de confiabilidade obtidas
para amostras brancas e adicionadas de ractopamina, em nível com 100 % de
confiabilidade, na presença de clembuterol
Concentração TFP (%) TFN (%) TCF (%)
CLEM (0,487 µg/kg) 0 - 100
CLEM (0,487 µg/kg) RCT (0,244 µg/kg)
- 0 100
Legenda: CLEM: clembuterol, RCT: ractopamina. TFP: taxa de falso-positivos, TFN: taxa de falso-negativos, TCF: taxa de confiabilidade. Critério de aceitabilidade: TCF maior ou igual a 90 %.
No estudo de robustez, não foi observada alteração na TCF em função dos
fatores e níveis estudados. Uma TCF de 100 % foi evidenciada para todos os
tratamentos de forma que tempos de agitação entre 25 min e 35 min, tempos de
centrifugação entre 5 min e 15 min e temperaturas de entre 45 °C e 55 °C na etapa
de concentração dos extratos poderiam ser praticados na execução das análises
sem comprometimento dos resultados (Tabela 13).
Tabela 13. Taxas de confiabilidade estimadas nos diferentes tratamentos do
experimento de robustez para amostras adicionadas de ractopamina, em nível com
100 % de confiabilidade
Tratamento Tempo de agitação
(min)
Tempo de centrifugações
(min)
Temperatura de
concentração (°C)
Resultados positivos
TCF (%)
Resultado
1 25 5 45 7 100 Robusto
2 25 5 55 8 100 Robusto
3 25 15 45 7 100 Robusto
4 25 15 55 8 100 Robusto
5 35 15 45 8 100 Robusto
6 35 15 55 8 100 Robusto
7 35 5 45 8 100 Robusto
8 35 5 55 8 100 Robusto
Legenda: TCF: taxa de Confiabilidade. Critério de aceitabilidade: TCF maior ou igual a 95 %. Nos tratamentos 1 e 3, foram obtidos 100% de TCF, mesmo com apenas 7 resultados positivos, devido a uma perda analítica em cada um desses níveis.
95
5.2 ESTUDO DE OCORRÊNCIA
Não houve divergências entre resultados das duplicatas analíticas no estudo
de ocorrência. Dentre as 30 amostras de mercado analisadas, 22 (73 %)
apresentaram resultados positivos. Considerando os cortes, foram encontradas sete
amostras positivas para costela e pernil traseiro e oito amostras positivas para
lombo, representando 70 %, 70 % e 80 % de resultados positivos, por tipo de corte,
respectivamente (Tabela 14). Tais resultados indicaram uma prevalência
significativa de resíduos de RCT na carne disponibilizada no mercado de Minas
Gerais, Brasil.
Tabela 14. Resultados do estudo de ocorrência da ractopamina nos três cortes de
carne suína avaliados
Corte Amostras positivas
Número Percentual (%)
Costela 7 70
Lombo 8 80
Pernil traseiro 7 70
Total 22 73 Legenda: Número de observações: 10 por corte, 30 no total.
Tais resultados não podem ser comparados com aqueles publicados pelo
MAPA (Tabela 6), uma vez que no PNCRC não foram reportados resultados não
conformes para RCT em músculo suíno ao longo dos anos de monitoramento, pois o
critério do MAPA é declarar como não conformes os casos de violações ao limite de
10 µg/kg. No escopo de 2015, o MAPA incluiu a previsão de amostragem e análise
de 300 amostras de músculo suíno no Subprograma Exploratório para RCT, onde
esperam-se resultados próximos aos encontrados no presente estudo (Brasil,
2015b).
Numa pesquisa feita pela revista Consumer Reports Magazine foram
analisadas 240 amostras de carne suína do mercado dos Estados Unidos, sendo
96
relatado 20 % de amostras positivas. No entanto, nenhuma amostra apresentou
resultado acima de 5 µg/kg (Consumer Reports Magazine, 2016). Essa prevalência é
menor do que os 73 % de resultados positivos encontrados no presente estudo de
ocorrência. A revista, entretanto, não declarou o método utilizado e seu LD ou as
condições de amostragem, além do fato que o estudo representa condições de um
país com indústria e hábitos de consumos diferentes dos brasileiros.
Zhang et al. (2009) analisaram sete amostras de músculo suíno, fornecidas
pelo Bureau de Inspeção e Quarentena de Importação e Exportação Tianjin, em
triplicata, e encontraram seis amostras negativas (abaixo do LD de 0,2 µg/kg) e uma
positiva (1,8 ± 0,13) µg/kg. Esse estudo foi realizado, entretanto, na China, onde o
uso de RCT é proibido, ou seja, naturalmente se espera menor prevalência desse
analito.
Como demonstrado nas Figura 22, 23 e 24, o estudo da influência dos
diferentes cortes nos resultados de detecção de RCT indicou que não houve
formação de agrupamentos que indicassem tendência maior de se encontrar RCT
em um determinado corte em detrimento de outro. Mesmo separando-se o
dendrograma em três clusters, os diferentes tipos de cortes aparecem distribuídos
entre eles. O mesmo acontece quando se tentam formar clusters considerando-se a
sazonalidade. Fica evidente que não há influência da estação do ano, já que as três
estações do ano estudadas estão presentes nos três clusters formados. Perfil
diferente foi evidenciado quando os resultados foram avaliados em função dos
diferentes fornecedores. Sete dos 18 fornecedores analisados, que apresentaram
resultados não detectados para RCT, foram agrupadas em um único cluster (verde)
e os demais clusters (azul e vermelho) foram representados por fornecedores que
tiveram amostras positivas para RCT. De fato a influência do fornecedor na
ocorrência de resíduos de RCT parece mais provável que do corte, visto que
diferentes cortes podem ser provenientes de um mesmo animal ou frigorífico
enquanto diferentes frigoríficos (fornecedores) podem ter políticas de manejo
distintas para seus fornecedores, especialmente nos casos de integração contratual.
97
Figura 22. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre os
cortes para avaliação da influência dos diferentes cortes na detecção de
ractopamina.
Cores diferentes indicam classes diferentes; C: costela, P: pernil; L: lombo;
98
Figura 23. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre os
fornecedores para avaliação da influência dos diferentes fornecedores na detecção
de ractopamina.
Cores diferentes indicam classes diferentes. A a R: letras indicativas dos 18 diferentes fornecedores.
99
Figura 24. Análise de cluster hierárquica - dendrograma com distâncias entre as
estações do ano para avaliação da influência da sazonalidade na detecção de
ractopamina.
Cores diferentes indicam classes diferentes. O: outono; I: inverno; P: primavera.
100
6. CONCLUSÕES
A validação do kit de ELISA comercial (RACTOPAMINE ELISA 5061RACT
EUROPROXIMA) para determinação de resíduos de RCT, empregando abordagem
quantitativa, indicou que o referido kit não foi adequado aos propósitos de uso pela
avaliação dos parâmetros de desempenho característicos de ensaios quantitativos
(recuperação, repetibilidade, precisão intermediária, limites e incerteza). Mesmo nos
níveis em que o método apresentou porcentagens médias de recuperação dentro
dos critérios de aceitabilidade preconizados por guias internacionais, os DPR se
mostraram muito acima dos limites estabelecidos, evidenciando precisão
inadequada.
A aplicabilidade do kit na detecção de resíduos de RCT em músculo de suíno
foi confirmada por meio da avaliação dos parâmetros de desempenho característicos
de ensaios qualitativos (taxas de falsos resultados, TSB, TST, TCF, RPC, LD, ACO,
CON e robustez).
Uma prevalência de 73 % foi observada pela análise de amostras de carne
suína coletadas no Estado de Minas Gerais, indicando que a RCT tem sido utilizada
no Brasil e que há exposição da população brasileira a esse fármaco. Não foram
evidenciadas tendências na detecção de RCT em função dos cortes e sazonalidade,
embora a detecção da RCT tenha sido influenciada pelos diferentes fornecedores.
101
7. PUBLICAÇÕES
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