UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO - UFPE · e irmãs de coração. Nós somos para sempre a “família NATA”. Entre mim e Joelma (Joba) foi amor a primeira vista, nos conhecemos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA DE SANTO ANTÃO

NÚCLEO DE NUTRIÇÃO

Janilton Rodrigues Lima

UTILIZAÇÃO DO PROBIÓTICO LACTOBACILLUS CASEI NA PRODUÇÃO

DE QUEIJO DE COALHO

VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/PE

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA DE SANTO ANTÃO

NÚCLEO DE NUTRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DO PROBIÓTICO LACTOBACILLUS CASEI NA PRODUÇÃO

DE QUEIJO DE COALHO

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Curso de Graduação

em Nutrição como requisito para

conclusão do Curso de Bacharel em

Nutrição

Estudante: Janilton Rodrigues Lima

Orientador: Profª Drª Christine

Lamenha Luna Finkler

Co-orientador: Profº Drº Leandro

Finkler

VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/PE

2011

DEDICATÓRIA

Dedico esta conquista a Ti, Senhor; és o “culpado” da minha felicidade e “réu” da

minha gratidão; quando em meio às dificuldades e lágrimas, tu acendeste em mim

alegria, esperança, força e fé.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu Deus e Pai, que desde antes da fundação do mundo, planejou

uma vida vitoriosa para mim. Agradeço ao meu Senhor Jesus, há mais de dois mil

anos atrás, garantiu-me saúde divina, vida abundante e prosperidade. Agradeço ao

Espírito Santo, meu melhor amigo, pois desde que nasci se empenhou em dar-me

ferramentas e capacitar-me para operá-las em prol da conquista dos meus desejos,

postos em meu coração segundo sua Palavra. Ainda agradeço a Deus por Ele ser

meu abrigo, minha companhia perene, por me fazer andar várias vezes sobre as

águas, por me provar que com Ele não há impossíveis e que dEle dependo

exclusivamente, por ter rompido noites tristes me dando alegria junto ao nascer do

Sol, pelo seu imenso amor imutável e pela sua fidelidade incondicional.

Agradeço a minha progenitora, Leni Rodrigues Silva Lima a mulher que mais amo

nesta Terra e que tenho a honra de chamá-la de Mãe, ela é minha amiga, minha

financiadora, minha vida. Meu coração só bate devido ao seu amor e dedicação a

mim.

Agradeço ao meu pai, José Adenilton de Lima, que sempre me disciplinou e me

ensinou a ser um homem íntegro, um homem que não tem do que se envergonhar.

Agradeço ao meu irmão, Janailton Rodrigues Lima, pois sempre me motivou a

crescer e avançar em todas as áreas da minha vida, e cada gesto de carinho, cada

olhar de preocupação, cada sorriso de comemoração junto as minhas Vitórias, me

faz hoje dizer para ele que o amo e que sou grato a Deus por me dá-lo como irmão.

Agradeço ao Fábio Costa de Vasconcelos, alguém tão especial pra mim e que apesar

de longe, sempre esteve perto. Alguém que é muito mais que um amigo, que tem

um valor inestimável e que há anos tem feito parte da minha vida. Por ter me

ensinado a ser assim como ele, um nutricionista de sucesso e um professor

exemplar.

Agradeço a Universidade Federal de Pernambuco em especial ao Centro Acadêmico

de Vitória, pela oportunidade de cursar minha graduação, sendo educado com

bastante excelência e pelas oportunidades de desenvolver atividades de monitoria,

pesquisa e extensão. E ainda sou grato pelas bolsas recebidas de auxílio moradia.

Agradeço a PROPESQ – CNPq, que financiaram e possibilitaram o desenvolvimento

dos meus projetos de iniciação científica e realização do trabalho de conclusão de

curso.

Agradeço ao IPA, e ao Laboratório de Bactérias Entomopatogênicas, onde pude

aprender a trabalhar com microbiologia e desenvolver parte das minhas pesquisas,

aqui registro: Liane Maranhão, Gilvanda Ribeiro e Valdemar.

Agradeço a empresa Natural da Vaca®, por ter cedido o soro de leite para o

desenvolvimento da pesquisa.

Agradeço a Érika Maria Freitas, pois me ajudou a dar os primeiros passos

acadêmicos, ensinando-me a ser disciplinado, ser exigente comigo mesmo e que

biologia celular e embriologia são campos fascinantes de estudo. Agradeço-a, pois a

vendo lecionar aprendi não apenas o que ensinar, mas como ensinar. Mesmo em

meio de vários conflitos e mal entendidos, ela não desistiu de mim.

Agradeço a todos que me perseguiram ou que algum dia me causaram dor, pois me

fizeram ser mais forte, forjei no fogo das lutas um caráter puro, inquestionável e

uma essência de campeão.

Agradeço a todos aqueles que foram meus professores da infância até os dias

atuais, principalmente os da UFPE-CAV. Destaco em especial aqueles que foram e

são referências de vida, ensino e pesquisa: Carolina Peixoto, Carmem Lygia Burgos,

Carol Virgínia Gois Leandro, Eduila Couto, Keila Dourado, Juliana Oliveira e René

Duarte. A didática destes e a sensibilidade no construir do meu saber foram

extremamente importantes, para estruturação dos meus sonhos após esta

graduação e capacitação profissional.

Agradeço aos técnicos do Laboratório de Bromatologia, Higiene dos alimentos,

Microbiologia e Técnica dietética: Marcela Araújo, Michelle, Silvio, Danúbia Freitas,

Rafael, Kelly, Dewson e Renato.

Agradeço as primeiras técnicas de laboratório da UFPE-CAV Edilene Maria e

Sidicléia, pois nunca esquecerei as palavras de conselho e incentivo, dos lanches

que pagaram pra mim e das caronas que ganhei indo para casa. Aquelas noites

difíceis se converteram hoje em alegria e gratidão a vocês.

Agradeço aos meus amigos de confinamento no laboratório, Elizandra, Hebe,

Elidiane, Hyrlleson, Carina, Ana Karina, Cibele Maria, Renata Soares, Viviane

Lansky, Gabriella Dias, Franciscleide, Aline, pois com eles passei a maior parte dos

meus dias nos últimos 2 anos, trocando experiências de vida e conhecimento

científico, e pude prosseguir lutando pelos meus objetivos acadêmicos e pessoais.

Cada madrugada, cada ajuda, cada acidente, cada sentimento, cada tempo ocioso

será lembrado e valorizado, sentirei saudade de todos, em especial, destaco o

Gabriel Locatelli.

Agradeço aos meus amigos Rodrigo Martins, Marcos David, José Corrêa, Carlos

Roberto e Camilo Thomazini por várias vezes terem me consolado, me aconselhado,

aumentando minha auto-estima, e sempre me relembrando que eu sou capaz. Sou

grato pelas aventuras, passeios e momentos de descontração, bem como de

resolução de problemas.

Agradeço aos meus familiares que sempre apoiaram minhas decisões, perdoaram

minha ausência devido a dias de trabalho no laboratório, em especial a minha

sobrinha Ester Pessoa, minha cunhada Giselle Ester, as minhas avós Maria Ferreira e

Júlia Isabel, meus tios Claudenir, Yolanda Rodrigues, Ideocleide Rodrigues e Maria

Eugênia, aos meus primos Iane, Iara, Daisy, Dalila e Everthon. Sou grato a todos os

investimentos em mim de ordem financeira, espiritual ou afetiva.

Agradeço a família de coração que Deus me deu. “Há amigos mais chegados que um

irmão” Provérbios 18:24. Louvo a Deus pelo presente que ele me deu, compartilhar

vidas com Elainne Cordeiro, Nízia Mayra e Joelma Pessoa, minhas melhores amigas

e irmãs de coração. Nós somos para sempre a “família NATA”. Entre mim e Joelma

(Joba) foi amor a primeira vista, nos conhecemos um dia antes de iniciar as aulas e

cheios de sonhos e expectativas nos demos as mãos, triste foi sua partida, deixou

saudade, mas também a sua presença em meu coração, ela será a melhor

biomédica do mundo! Elainne por me suportar em amor há quatro anos, tornou-se

tão essencial para mim, que não consigo imaginar meus dias sem sua companhia.

Há quem diga que eu e Nízia somos um só, desde o despertar da manhã ao fechar

os olhos à noite, amiga de sala de aula, de estágio, de laboratório, de viagem, de

quarto, nossa sintonia é intacta e é real a recíproca do desejo puro de uma vida

feliz, de um para o outro.

Agradeço aqueles que fizeram diferença na minha caminhada, amigos de república:

Juliana, Elôysa, Bárbara, Igor, Débora e João, pessoas que eu pude admirar e amar,

pois fizeram dos meus dias, dias alegres no decorrer dos últimos quatro anos.

Agradeço ao meu co-orientador, Leandro Finkler por ter aceito o desafio de

desenvolver este trabalho, por ter me ajudado a ser um aluno bolsista de iniciação

científica me apresentando a sua esposa Christine Finkler, a esta agradeço por

último, mas ela é a principal responsável pelo êxito da minha graduação. Ela,

minha orientadora, foi durante todo tempo paciente, sábia, compreensiva e

tornou-se uma amiga. Cada dia, cada momento junto a Christine era de extrema

valia, pois não apenas aprendi ciência e tecnologia, aprendi também serenidade,

humildade e que devo fazer tudo com excelência e paciência.

EPÍGRAFE

Se clamares por conhecimento, e por inteligência alçares a tua voz, se como a

prata a buscares e como a tesouros escondidos a procurares, então entenderás o

temor do Senhor, e acharás o conhecimento de Deus. Porque o Senhor dá a

sabedoria; da sua boca é que vem o conhecimento e o entendimento.

Provérbios, capítulo 2, versículos 3 a 6.

RESUMO

É crescente o número de pesquisas sobre a elaboração, aplicação e efeito dos

alimentos com alegação de propriedade funcional. Um dos mais importantes diz

respeito à inserção de probióticos devido a diversidade de benefícios clínicos e

biotecnológicos. Lactobacillus casei é um dos microrganismos que apresenta

maiores perspectivas industriais e comerciais, mas é necessário escolher

racionalmente o alimento que irá veiculá-lo. Este trabalho objetivou produzir L.

casei por fermentação e realizar a incorporação das células, livres e encapsuladas

em alginato, em queijo de coalho. Um cultivo realizado em caldo MRS mostrou que

a fase exponencial de crescimento se inicia a partir de 9 h de cultivo. Foram

realizadas fermentações no mesmo meio com diferentes concentrações de inóculo

e em cultivo agitado (50 rpm) e estacionário, tendo-se verificado que a melhor

condição para a produção de células ocorreu a uma concentração de inóculo de 5%

(v/v). Também foi realizado um ensaio fermentativo em um meio preparado à base

de soro de leite em cultivo estacionário e agitado, observando-se que não houve

diferença significativa em relação a agitação. A fermentação realizada em soro de

leite proporcionou uma concentração final de células viáveis de 3,4 x 108 UFC/mL.

Para verificação da capacidade de adesividade intestinal de L. casei, foram

realizados testes de caracterização de hidrofobicidade e características ácido-

básicas da parede celular. Foi observado que o microrganismo possui característica

ácida e alta hidrofobicidade, demonstrando que é viável sua utilização como

probiótico. Foi realizada a imobilização de células em alginato de cálcio, sendo

obtida uma concentração de células nas microcápsulas secas de 7,40 x 107 UFC/g.

Não houve diferenças significativas entre as amostras do queijo controle e dos

queijos enriquecidos com L. casei quanto a caracterização físico-química. Os

queijos apresentaram baixa umidade provavelmente devido ao período de coleta

das amostras, entretanto verificou-se um teor de lipídios de acordo com o que é

descrito na legislação. Os resultados de contagem microbiana a partir dos queijos

de coalho controle e com inserção de células livres e imobilizadas de L. casei

demonstraram uma maior concentração de bactérias láticas no queijo contendo

células livres (1,4 x 108 UFC/g) quando comparado ao queijo controle (1,9 x 107

UFC/g), o que pode ser atribuído à incorporação de L. casei e seu crescimento no

produto. Já o queijo suplementado com células imobilizadas em alginato de cálcio

apresentou um teor de células de 9,1 x 107 UFC/g, sugerindo uma liberação gradual

de células no produto.

Palavras-chave: Lactobacillus casei. Microencapsulação. Probióticos. Queijo de

coalho. Soro de leite.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1 – Imagem ilustrativa da bactéria Lactobacillus casei ..............................17

Figura 2 – L. casei, em lâmina preparada pela coloração de Gram, vista em microscopia

óptica, com aumento de 1000x ..................................................................18

Figura 3 – Formação do gel de alginato de cálcio por engaiolamento .....................21

Figura 4 - Desenho de estudo empregado no trabalho .......................................27

Figura 5 – A: Fermentação de L. casei (cultivo estacionário) em estufa com circulação

de ar. B: Fermentação de L. casei (cultivo com agitação) em shaker .....................31

Figura 6 – Análise de contaminantes microbiológicos do fermentado de L. casei em meio

de cultura a base de soro de leite ...............................................................32

Figura 7 – A: Gotejamento da suspensão celular de L. casei em alginato na solução de

cloreto de cálcio, sob leve agitação. B: microcápsulas formadas de L. casei. C: Lavagem

das microcápsulas. D: microcápsulas úmidas ..................................................34

Figura 8 – Etapas da fabricação do queijo de coalho .........................................37

Figura 9 – Variação da absorbância e do pH durante o cultivo do inóculo de L. casei em

meio caldo MRS .....................................................................................39

Figura 10 – Variação da absorbância durante o cultivo de L. casei em meio caldo MRS

nas condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com concentrações de

inóculo de 1 e 5%(v/v) .............................................................................40

C D

Figura 11 – Valores de velocidade máxima de crescimento celular de L. casei em meio

caldo MRS nas condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com

concentrações de inóculo de 1 e 5% (v/v) .....................................................40

Figura 12 – Variação do pH durante o cultivo de L. casei em meio caldo MRS nas

condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com concentrações de inóculo

de 1 e 5%(v/v) ......................................................................................41

Figura 13 – Concentração de células de L. casei em meio a base de soro de leite de

acordo com o tipo de cultivo (concentração de inóculo de 5% v/v) .......................43

Figura 14 – Porcentagem de hidrofobicidade e características ácido-básicas da parede

celular de L. casei .................................................................................44

Figura 15 – Curva de secagem das partículas de alginato contendo L. casei .............45

Figura 16 – A: microcápsulas de L. casei úmidas. B: microcápsulas de L. casei após a

secagem .............................................................................................46

Figura 17: Queijos de coalho após 7 dias de maturação refrigerada (10ºC). A: queijo

controle, sem probióticos. B: queijo enriquecido com microcápsulas de L. casei. C:

queijo enriquecido com células livres de L. casei ............................................48

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 – Composição do meio caldo MRS ................................................29

Tabela 2 – Composição do meio à base de soro de leite ................................30

Tabela 3 – Composição do leite pasteurizado tipo C padronizado Bom Leite® .....35

Tabela 4 – Concentração de células viáveis de acordo com a condição de cultivo em

meio caldo MRS (tempo de cultivo de 32 h) ..............................................42

Tabela 5 – Composição centesimal do soro de leite empregado nos cultivos

de L. casei ......................................................................................43

Tabela 6 – Concentração de células viáveis de L. casei de acordo com a amostra nos

ensaios de imobilização ......................................................................45

Tabela 7 – Dados de perda de massa percentual dos queijos ao longo do tempo ...47

Tabela 8 – Composição centesimal dos queijos realizada após 10 dias de preparo .47

Tabela 9 – Análise microbiológica dos queijos realizada após 10 dias de preparo...47

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

FAO/OMS – Food and Agriculture Organization/Organização Mundial de Saúde

CVB – Caldo Verde Brilhante

EMB – Eosina Azul de Metileno

MRS – DE MAN, ROGOSA e SHARPE

PCA – Plate Count Agar

UFC – Unidade Formadora de Colônia

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

LISTA DE SÍMBOLOS

µL – microlitros

µm - micrômetro

g – grama

h – hora

L – litro

M – molar

mg – miligrama

min - Minuto

mL – Mililitro

NaCl – Cloreto de Sódio

HCl – Ácido Clorídrico

CaCl2 - Cloreto de Cálcio

nm – nanômetro

O2 – oxigênio(forma molecular)

p/v – peso por volume

v/v – volume por volume

pH - potencial hidrogeniônico

rpm – rotação por minuto

mg/L – miligrama por litro

g/L – grama por litro

% - percentual

ºC – grau Celcius

® - marca registrada

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 14

CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA...................................................................................................................... 14

MARCO TEÓRICO .................................................................................................................................................. 15

JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................................................... 23

OBJETIVOS ............................................................................................................ 25

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................................................. 25

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................................... 25

HIPÓTESES ............................................................................................................ 26

METODOLOGIA ....................................................................................................... 27

ÁREA ...................................................................................................................................................................... 27

OBJETO DE ESTUDO E GRUPOS DE ESTUDO ..................................................................................................... 27

PERÍODO DE REFERÊNCIA ................................................................................................................................... 27

DESENHO DO ESTUDO ......................................................................................................................................... 27

DEFINIÇÃO DAS VARIÁVEIS ................................................................................................................................. 28

MÉTODO DE COLETA DE DADOS ......................................................................................................................... 29

MÉTODOS DE ANÁLISE ......................................................................................................................................... 29

ASPECTOS ÉTICOS ............................................................................................................................................... 39

RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 40

CONCLUSÕES ......................................................................................................... 51

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53

14

INTRODUÇÃO

CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA

O principal objetivo da nutrição é promover, manter e restabelecer a saúde

através da alimentação. Quando o estado nutricional de um indivíduo está

adequado, o corpo pode se desenvolver e crescer com uma manutenção ideal. Para

isto é importante ter o controle da ingestão hídrica, de macronutrientes e

micronutrientes, que consequentemente proporciona uma melhor qualidade de

vida.

Segundo a portaria nº 42 da ANVISA (BRASIL, 1998), alimento é toda

substância que se ingere no estado natural, semi-elaborada ou elaborada,

destinada ao consumo humano, incluídas as bebidas e qualquer outra substância

utilizada em sua elaboração, preparo ou tratamento, excluídos os cosméticos, o

tabaco e as substâncias utilizadas unicamente como medicamentos. Os padrões de

vida da sociedade moderna, inclusive a alimentação, muitas vezes contribuem para

o acometimento da saúde, e isso é refletido na transição epidemiológica e

nutricional (BATISTA FILHO e RISSIN, 2003; PINHEIRO, FREITAS, e CORSO, 2004).

O avanço da ciência e tecnologia dos alimentos pode garantir produtos

alimentícios que além de suprirem as necessidades nutricionais, tenham boas

características organolépticas e sejam seguros para o consumidor, integrando uma

alimentação saudável que proporcione benefícios físicos e psicológicos para os

comensais. O ideal é que a dieta de todos seja equilibrada, tenha qualidade,

esteja na quantidade correta de acordo com as necessidades nutricionais

individuais, tenha harmonia entre os nutrientes e alimentos e por fim que seja

adequada levando em consideração as características fisiológicas e/ou

fisiopatológicas.

Tem se difundido no meio cientifico o estudo de alimentos que possam estar

integrados em uma alimentação equilibrada, contribuir para reduzir o risco de

algumas patologias e até maximizar as funções fisiológicas de alguns indivíduos.

Estes alimentos são empiricamente chamados de “funcionais”, e é possível

encontrar na literatura definições como: “Alimentos funcionais são todos os

15

alimentos ou bebidas que, consumidos na alimentação cotidiana, podem trazer

benefícios fisiológicos específicos, graças à presença de ingredientes

fisiologicamente saudáveis” (CÂNDIDO e CAMPOS, 2005 apud MORAES e COLLA,

2006).

A Resolução Nº 18 da ANVISA (BRASIL, 1999), diz que alegação de

propriedade funcional é relativa ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente

ou não nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras

funções normais do organismo humano. Alimentos com alegação de propriedade

funcional e/ou de saúde devem ser seguros para consumo sem supervisão médica.

Contudo, a RDC Nº 2 (BRASIL, 2002) alerta que "Gestantes, nutrizes e crianças

somente devem consumir estes produto sob orientação de nutricionista ou médico".

Segundo a ANVISA (BRASIL, 2008), estes alimentos incluem os ácidos graxos

ômega 3, licopeno, luteína, zeaxantina, fibras alimentares, beta glucana, dextrina

resistente, frutooligosacarídeo, goma guar parcialmente hidrolisada, inulina,

lactulose, polidextrose, psillium, quitosana, fitoesteróis, manitol, xilitol, sorbitol,

proteína de soja e por fim um dos mais popularizados e bastante divulgados

atualmente na mídia, os probióticos.

A incorporação de probióticos em alimentos tem sido uma tendência no

desenvolvimento de produtos que possam apresentar efeitos benéficos sobre a

saúde e bem-estar do hospedeiro. Dentre estes, destacam-se os leites e seus

derivados, tais como os queijos. Estes apresentam certas características que os

tornam um produto adequado para incorporar bactérias probióticas, como por

exemplo a sua capacidade tamponante e o teor de gordura, que pode oferecer

proteção às células durante a passagem pelo trato gastrointestinal (STANTON et

al., 1998).

MARCO TEÓRICO

Probióticos

Probiótico é um termo derivado do grego que significa “pró-vida”

(HAVENAAR e HUIS IN’T VELD, 1992 apud COPPOLA e TURNES, 2004). São

microrganismos vivos que quando administrados em quantidade adequada conferem

efeitos benéficos à saúde do hospedeiro (FAO/OMS, 2001). O termo probiótico foi

16

utilizado pela primeira vez para designar substâncias secretadas por

microrganismos, capazes de estimular o desenvolvimento de outros microrganismos

(LILLY e STILLWELL, 1965 apud SEQUEIRA, RIBEIRO e GOMES, 2008). Fuller (1989)

descreve que os probióticos promovem o equilíbrio da flora intestinal e para

Schrezenmeir e De Vrese (2001) os probióticos devem conter microrganismos

viáveis.

Os probióticos devem ser inócuos, não patogênicos, manter-se viáveis após

processamento tecnológico, ter longa vida de prateleira, apresentar resistência ao

baixo pH do suco gástrico e à ação das secreções pancreática e biliar, não

transportar genes transmissores de resistência a antibióticos e possuir propriedades

anti-mutagênicas e anti-carcinogênicas, assim como resistir a fagos, ao oxigênio e

ter a capacidade de colonizar o cólon. O ideal é que sejam de origem humana e é

necessário conhecer as características funcionais e fisiológicas dos microrganismos,

ou seja, conhecer os mecanismos de aderência ao epitélio intestinal, antagonismo

aos patógenos, estimulação ou supressão da resposta imunológica e estimulação às

bactérias benéficas (SALMINEM, 1998 apud MORAES e COLLA, 2006; COPPOLA e

TURNES, 2004).

O mecanismo de ação dos probióticos ainda não foi totalmente elucidado.

Seus benefícios se dão por ações diretas e indiretas, havendo uma hipótese em

relação à exclusão de microrganismos patogênicos devido à competição por sítios

de ligação e nutrientes, por isso a necessidade de uma administração continuada.

Os probióticos também podem estabelecer o equilíbrio da flora intestinal pela

liberação de bacteriocinas, ácidos orgânicos voláteis e peróxido de hidrogênio.

Também há estudos que indicam a atuação dos probióticos sobre o metabolismo

celular, reduzindo a concentração de amônia no organismo e liberando enzimas

como a lactase e inibindo enzimas pro-carcinogênicas, devido à estimulação do

sistema imunológico do hospedeiro (COPPOLA e TURNES, 2004).

A necessidade do uso de probióticos está relacionada à mudança de hábitos

alimentares e estilo de vida da sociedade atual, que promove o consumo de

alimentos processados e estéreis, o que afeta a colonização intestinal por alguns

tipos de bactérias. Além disso, o consumo de produtos antibacterianos, variando do

vinagre aos fármacos antibióticos, colabora para um desequilíbrio na microflora

intestinal (GOMES e MALCATA, 1999).

17

A ANVISA (BRASIL, 2008) estabelece que a quantidade mínima de

microrganismos probióticos viáveis deve estar situada na faixa de 108 a 109

Unidades Formadoras de Colônias (UFC) na recomendação diária do produto pronto

para o consumo, conforme indicação do fabricante. Valores menores podem ser

aceitos, desde que a empresa comprove sua eficácia. Há trabalhos que propõem

que a dose mínima diária de culturas probióticas considerada terapêutica

corresponda ao consumo de 100 g de produto contendo 6 a 7 log UFC/g (BURITI e

SAAD, 2007; KOMATSU, BURITI e SAAD, 2008; CICHOSKI et al., 2008). Entretanto, a

quantidade mínima requerida para administração dos probióticos para que se

tenham efeitos benéficos à saúde depende de cada espécie de microrganismo

devido as suas peculiaridades (CICHOSKI et al., 2008).

O veículo alimentício escolhido para a incorporação de cepas probióticas

deve ser cuidadosamente estudado para a seleção conveniente do par cepa

probiótica-veículo, para não resultar em características não peculiares ou mesmo

indesejáveis ao produto (KOMATSU, BURITI e SAAD, 2008).

Tem sido desafiador para a comunidade cientifica selecionar racionalmente

os microrganismos e incorporar-lhes em produtos alimentícios (SEQUEIRA, RIBEIRO

e GOMES, 2008). Os principais microrganismos probióticos utilizados são

Lactobacillus e Bifidobacterium. O Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology

caracteriza os Lactobacillus como um grupo heterogêneo de bastonetes regulares,

Gram-positivos e não-esporulados (GARRITY, 2005). Estes microrganismos foram

isolados pela primeira vez por Moro no ano 1900 a partir das fezes de lactentes

amamentados ao seio materno (GOMES e MALCATA, 1999). Dentro do gênero

Lactobacillus destacam-se Lactobacillus casei, e fazem parte deste grupo

taxonômico as espécies L. casei, L. paracasei, L. rhamnosusi e L. zeae, que

apresentam comportamento fisiológico, necessidades nutricionais, condições de

crescimento e habitat muito similares. A Figura 1 ilustra o aspecto morfológico de

L. casei. e a Figura 2 apresenta a imagem de L. casei vista sob microscopia óptica

no aumento de mil vezes.

18

Figura 1 – Imagem ilustrativa da bactéria Lactobacillus casei (FONTE:

http://jpkc.njau.edu.cn/spwswx/cankao/ShowArticle.asp?ArticleID=314)

Figura 2 – L. casei em lâmina preparada pela coloração de Gram, vista em

microscopia óptica, com aumento de 1000x (Foto do autor)

Já é comum na indústria de alimentos a utilização dessas bactérias láticas,

sendo crescente o número de evidências dos benefícios do seu consumo regular. O

grupo L. casei tem grande valor comercial devido à grande diversidade de

alimentos que podem ser produzidos, como por exemplo, alimentos infantis, leites

fermentados, queijos, mousses, sorvetes, sucos, produtos cárneos curados e

fermentados e produtos farmacêuticos (LORENZ, 2009; BURITI e SAAD, 2007;

MACEDO et al., 2005; RASIC e KURMANN, 1983 apud GOMES e MALCATA, 1999;

SOUZA, et al., 2003 apud MORAES e COLLA, 2006). Além dos benefícios para saúde

19

dos comensais, L. casei pode acidificar, conferir aroma, sabor, textura e ainda

auxiliar na bioconservação dos alimentos.

Silveira (2009) conseguiu com êxito a incorporação de L. casei B-442 em suco

de caju clarificado. Também é demonstrado na literatura o sucesso da

incorporação de L. casei em iogurte. Fuchs et al. (2006), em seu trabalho, elaborou

um iogurte simbiótico com L. casei e testou a resistência deste microrganismo

simulando os processos de digestão do organismo humano. L. casei apresentou uma

boa resistência às condições simuladas, caracterizando o iogurte como um bom

veículo probiótico.

Faria, Benedet e Guerroue (2006) conseguiram produzir leite de búfala

fermentado e obtiveram 106 UFC/mL de L. casei, demonstrando assim a viabilidade

da aplicação de probióticos em alimentos.

Estudos mostram que em camundongos a utilização de L. casei como

probiótico induz uma resposta antitumoral mediada por células T e a ativação de

macrófagos, assim como a supressão da formação de tumores de cólon e inibição

de metástases pulmonares (COPPOLA e TURNES, 2004).

Quanto ao potencial de aderência celular de L. casei à mucosa, persistência

e multiplicação no intestino, para promoção dos seus benefícios ao hospedeiro, a

literatura demonstra que várias cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium,

utilizadas como probióticos, têm essa capacidade. O potencial de adesão depende

da hidrofobicidade, da composição da parede celular e de receptores e ligantes

como as adesinas e de elementos de fixação que impedem sua eliminação pelo

peristaltismo intestinal e pelas correntes de fluidos, impedindo sua excreção pelas

fezes (TRABULSI e SAMPAIO, 2000).

A produção de ácidos, principalmente ácido láctico, por bactérias, incluindo

L. casei, reduz a proliferação de microrganismos patogênicos, pois torna o

ambiente intestinal impróprio para as condições de crescimento destes. Um dos

prováveis benefícios da acidificação do conteúdo intestinal é a estimulação do

peristaltismo evitando a constipação, regulando assim a motilidade intestinal

(TRABULSI e SAMPAIO, 2000).

Na prática clínica a administração de probióticos na dietoterapia deve ser

realizada com cautela, levando em consideração as características fisiopatológicas

de cada paciente, os sinais e sintomas e as diretrizes dietoterápicas. Segundo

20

Baorrielo et al. (2003) a administração de probióticos não causa riscos significativos

para imunodeprimidos. Entretanto, vale salientar que há pacientes nos quais a

supressão da imunidade é parte do tratamento, como por exemplo pacientes

transplantados, então cabe ao nutricionista observar o risco-benefício para cada

paciente quanto ao consumo de probióticos

Cabe também ao nutricionista a seleção do alimento diante das

recomendações nutricionais, obedecendo as leis da alimentação e em segundo

lugar os princípios de funcionalidade dos alimentos. Podemos observar que a

maioria dos alimentos enriquecidos com probióticos são de origem láctica e

geralmente constituem-se com alto teor de gordura saturada, isso também deve ser

levado em consideração no momento da determinação do plano alimentar.

Encapsulação de microrganismos probióticos

Segundo Covizzi et al. (2007), o número de publicações em periódicos

internacionais que utilizaram células imobilizadas aumentou em mais de 200% no

período de 1995 até 2007, constatando assim a importância do uso de

microrganismos imobilizados em diversos processos biotecnológicos. As técnicas

clássicas de imobilização celular podem ser classificadas em: a) naturais, as quais

incluem a formação de biofilmes e a adesão/adsorção microbiana em suportes

sintéticos ou naturais, b) artificiais, as quais incluem a encapsulação em matrizes

como alginato de cálcio ou uso de agentes ligantes.

A microencapsulação é uma tecnologia inovadora que tem sido empregada

com êxito na indústria de cosméticos, farmacêutica e alimentícia. Dentre os

propósitos gerais da microencapsulação podemos citar: transformar um líquido em

sólido, de modo a facilitar sua manipulação; transporte e adição em formulações;

separar materiais reativos; reduzir toxicidade do material ativo; promover

liberação controlada do ativo encapsulado; reduzir volatilidade ou inflamabilidade

de líquidos; mascarar odor de determinados componentes; aumentar a vida de

prateleira e proteger contra a luz, umidade e calor (FAVARO-TRINDADE, PINHO e

ROCHA, 2008).

Aplicando esta técnica na tecnologia de alimentos, mais precisamente na

elaboração de probióticos, a microencapsulação pode ser utilizada para a

21

imobilização celular, permitindo um aumento da resistência das células à ação dos

fluidos biológicos gerados no processo de digestão, íons, calor, pressão mecânica e

outros efeitos de estresse físico e bioquímico. Outra função seria a de proteger o

probiótico contra contaminantes microbiológicos (TERRA et al., 2009; LORENZ,

2009; ROSA, 2010).

As microcápsulas de probióticos podem liberar seu conteúdo de forma lenta

e controlada. Um dos objetivos do seu desenvolvimento e administração é que

possam ultrapassar intactas pelo estômago e rompam-se apenas no intestino, para

liberação dos probióticos. A escolha do agente encapsulante deve levar em

consideração os solventes e condições de ruptura das microcápsulas,

principalmente quando administradas em seres vivos (ROSA, 2010).

A imobilização celular por engaiolamento se dá pela inclusão artificial das

células, que ficam inseridas em uma malha rígida, ou semi-rígida. Mesmo

aprisionados os microrganismos podem trocar nutrientes, metabólitos e gases com

o meio (COVIZZI et al., 2007).

Há diversos tipos de polímeros empregados para encapsulação, entretanto

na indústria de alimentos um dos mais utilizados é o biopolímero alginato de sódio,

formado por unidades de ácido manurônico e ácido gulurônico unidos por ligações

glicosídicas (1,4), podendo variar em composição e sequência. Quando em presença

de cálcio e outros íons divalentes, o alginato de sódio pode, através de um

processo de ligação cruzada, trocar o íon sódio de sua estrutura por um íon

divalente, geleificando o meio em que se encontra (LORENZ, 2009; FAVARO-

TRINDADE, PINHO e ROCHA, 2008). A Figura 3 demonstra como acontece o

engaiolamento por alginato de cálcio.

22

Figura 3 – Formação do gel de alginato de cálcio por engaiolamento

(FONTE: COVIZZI et al., 2007)

Queijos

Os queijos são produtos com características peculiares que conferem

proteção às bactérias probióticas contra a ação do oxigênio, baixo pH e sais

biliares, durante a sua passagem pelo trato gastrointestinal. Esse conjunto de

características, as quais se incluem, entre outras, pH próximo ao neutro, atividade

de água normalmente elevada, matriz sólida e concentração relativamente elevada

de gordura, indica que esses produtos sejam mais adequados como veículos para os

probióticos que leites fermentados e iogurtes (KOMATSU, BURITI e SAAD, 2008).

Um dos queijos mais apreciados na Região Nordeste do Brasil é o queijo de

coalho. Geralmente o queijo tipo coalho é produzido artesanalmente, em

numerosas unidades de produção caseira e em pequenas propriedades rurais,

tornando difícil o controle de qualidade pelos órgãos de inspeção (LEITE, 2002;

2005).

Legalmente, o queijo de coalho é obtido por coagulação do leite com coalho

ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não por ação de

bactérias láticas selecionadas, podendo ser comercializado com até dez dias de

fabricação. Por “definição” na legislação brasileira o queijo de coalho é

classificado como queijo de massa semi-cozida ou cozida, de média a alta umidade

e um teor de gordura nos sólidos totais entre 35 e 60%. Sensorialmente deverá

apresentar consistência semi-dura, elástica, textura macia, compacta ou aberta

com olhaduras mecânicas pequenas; cor branco amarelado uniforme, sabor brando,

23

ligeiramente ácido e podendo ser salgado, odor ligeiramente ácido de coalhada

fresca, casca fina, sem trinca e não bem definida, e formato e peso variáveis

(BRASIL, 2001). Esta definição não condiz com as características reais dos queijos

de coalho produzidos na região nordeste, uma vez que ele não tem características

elásticas e não é um produto de massa cozida ou semi-cozida, pois a maior

temperatura aplicada no processo tecnológico é 37º.

CICHOSKI et al. (2008), demonstra em seu trabalho a viabilidade da inserção

de probiótico (Lactobacillus rhamnosus) em queijo prato com reduzido teor de

gordura fabricado com fibras e lactato de potássio, ocorrendo melhor

desenvolvimento das bactérias ácido láticas, maiores valores de pH e lactose.

Segundo o trabalho realizado por ALEGRO (2003), o queijo minas frescal

suplementado com Lactobacillus acidophilus e/ou com Bifidobacterium lactis,

também constitui-se em um ótimo veículo para administração de probióticos. Este

estudo ainda revela que não há diferenças sensoriais dos queijo suplementados e

não suplementados com os probióticos utilizados.

JUSTIFICATIVA

O consumo de alimentos com alegação de propriedade funcional tem sido

bastante incentivado pelos nutricionistas e médicos e contribui para quebrar o

paradigma de que a recuperação e/ou manutenção da saúde só acontece com o uso

de drogas ou produtos químicos.

Há consenso quanto aos benefícios à saúde do consumidor, mas é necessário

que esses alimentos cheguem às mesas da população em geral. Com relação a

fabricação desses alimentos, o primeiro interesse deve ser promover, manter ou

restabelecer a saúde dos indivíduos, através dos nutrientes e compostos funcionais;

o segundo interesse deve ser que a indústria tenha capacidade de produzir esses

alimentos com estas propriedades funcionais, de forma econômica e

tecnologicamente viável.

Uma vez que este trabalho visa contribuir para a otimização do processo

fermentativo de L. casei utilizando o soro de leite de vaca, que é um resíduo da

produção de queijo, pode-se contribuir para a diminuição dos custos de processo. O

24

estudo de variáveis importantes, tais como a concentração do inóculo e a agitação,

pode auxiliar na obtenção de uma maior concentração final de células viáveis.

Além disso, o soro de leite utilizado na composição do meio de cultura no processo

fermentativo pode ser originado do processamento tecnológico do queijo,

integrando as cadeias produtivas de ambos os produtos.

É possível se deparar na literatura com trabalhos que descrevem a inserção

de probióticos em diversos tipos de queijo, entretanto não foi encontrado nenhum

trabalho que desenvolvesse o probiótico L. casei em queijo de coalho de leite de

vaca.

No Brasil, principalmente na Região Nordeste, o queijo de coalho é muito

popularizado e a utilização de probióticos neste produto regional é uma alternativa

para que a população tenha um maior acesso aos alimentos com alegações de

propriedades funcionais. O produto contendo L. casei poderá integrar os cardápios

de pacientes hospitalizados, fazendo parte da dietoterapia (sob orientação

nutricional), sem que haja necessidade do uso de suplementação de probióticos.

A inserção do microrganismo encapsulado no queijo vislumbra a manutenção

da viabilidade das células por um maior período de tempo, devido a proteção

contra agentes estressores do ambiente proporcionada pelo engaiolamento das

células pelo polímero. A escolha do alginato de sódio se dá pela eficiência do

processo de encapsulação demonstrado na literatura e por esse biopolímero não ter

características tóxicas ao organismo, podendo ser utilizado sem causar danos à

saúde do homem.

25

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Produzir Lactobacillus casei por fermentação e realizar a incorporação das

células, livres e encapsuladas em alginato, em queijo de coalho.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudar a melhor condição de fermentação de L. casei em cultivos

estacionário e agitado, a diferentes concentrações de inóculo, utilizando

meio de cultivo padrão para bactérias láticas (caldo MRS);

Produzir L. casei utilizando como substrato soro de leite a partir das

melhores condições de cultivo da etapa anterior;

Realizar a caracterização físico-química do soro de leite;

Realizar o acompanhamento cinético dos cultivos (absorbância, pH e células

viáveis);

Avaliar as características de hidrofobicidade de L. casei;

Imobilizar as células utilizando alginato como agente encapsulante;

Preparar queijo tipo coalho contendo células probióticas livres e

imobilizadas;

Avaliar as características físico-químicas e microbiológicas dos queijos de

coalho obtidos.

26

HIPÓTESES

É viável a produção de células de L. casei por fermentação utilizando como

substrato o soro de leite, de forma a ser obtido um meio de cultivo de baixo custo

e numa concentração de microrganismos adequada para a sua incorporação no

queijo coalho.

O acompanhamento cinético do cultivo fornece dados para se conhecer as

condições mais favoráveis de produção de L. casei.

As células obtidas são inócuas e o produto formulado apresenta condições

ideais para a incorporação ao queijo de coalho.

O microrganismo em estudo tem alta hidrofobicidade e potencial de

adesividade para colonização do epitélio intestinal.

Quanto à incorporação de probiótico no queijo, a presença de L. casei não

interfere negativamente nas características deste produto, e as células

permanecem viáveis e numa concentração adequada durante o tempo de prateleira

investigado (7 dias de maturação).

O queijo suplementado com células de L. casei imobilizadas em alginato de

cálcio apresenta uma maior concentração de células viáveis deste microrganismo

quando comparado aos queijos controle (sem adição de probiótico) e suplementado

com células livres de L. casei.

O queijo de coalho suplementado com probiótico é seguro para o consumo,

diante das avaliações físico-químicas e microbiológicas.

27

METODOLOGIA

ÁREA

O presente trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Bromatologia,

Microbiologia dos Alimentos e Técnica Dietética da Universidade Federal de

Pernambuco – Centro Acadêmico de Vitória, Vitória de Santo Antão – PE.

OBJETO DE ESTUDO E GRUPOS DE ESTUDO

O objeto de estudo foi avaliar a produção de Lactobacillus casei por

fermentação e verificar sua aplicabilidade em queijo de coalho. Foram elaborados

três queijos: controle, queijo suplementado com microcápsulas de alginato de

cálcio contendo L. casei e queijo suplementado com células livres de L. casei.

PERÍODO DE REFERÊNCIA

Para estruturação e desenvolvimento do presente trabalho foi realizada uma

revisão bibliográfica de trabalhos publicados até o ano de 2010 nas bases de dados

Scielo, Periodicos Capes e Google Acadêmico, com o emprego das seguintes

palavras-chave: Lactobacillus casei, probiótico, alimentos funcionais, soro de leite,

queijo de coalho e microencapsulação. A pesquisa foi realizada de maio de 2010 a

junho de 2011.

DESENHO DO ESTUDO

Foi utilizado um desenho de estudo do tipo analítico experimental, que pode

ser ilustrado na Figura 4.

28

Figura 4 - Desenho de estudo empregado no trabalho

DEFINIÇÃO DAS VARIÁVEIS

De acordo com cada etapa experimental, as variáveis estudadas no presente

trabalho estão descritas abaixo:

Ensaios de fermentação

29

a) Variáveis investigadas: concentração de inóculo, cultivo agitado ou estacionário,

composição do meio de cultivo.

b) Variável resposta: concentração de células viáveis.

Ensaios de hidrofobicidade e características ácido-básicas de L. casei

a) Variáveis investigadas: tipos de solvente

b) Variáveis resposta: grau de hidrofobicidade e características ácida ou básica da

parede celular de L. casei.

Ensaios de imobilização das células

a) Variáveis investigadas: concentração de células viáveis.

b) Variável resposta: eficiência de imobilização.

Ensaios de fabricação do queijo coalho

a) Variáveis investigadas: queijos contendo células probióticas livres ou

imobilizadas.

b) Variáveis resposta: características físico-químicas e microbiológicas dos queijos.

MÉTODO DE COLETA DE DADOS

A coleta de dados foi realizada a partir dos resultados experimentais obtidos

nos ensaios laboratoriais, sendo os dados registrados em caderno de laboratório e

em computador.

MÉTODOS DE ANÁLISE

Manutenção do microrganismo

Foi adquirida uma cepa de Lactobacillus casei proveniente da coleção de

culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.

As células foram armazenadas em tubos inclinados com meio MRS Ágar

suplementado com 2% de glicose. A cultura foi armazenada sob refrigeração a 10ºC

e repiques periódicos eram realizados a cada 15 dias para manutenção das células.

30

Pré-inóculo e inóculo

Foi preparado um pré-inóculo por meio da inoculação de alçadas da cultura

original em tubo contendo 5 mL de solução salina estéril (0,85% p/v) até obtenção

de turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland.

Posteriormente, o inóculo foi preparado utilizando-se frasco tipo Erlenmeyer

de 250 mL de capacidade contendo 45 mL de meio caldo MRS suplementado com 2%

(p/v) de glicose. A composição do meio caldo MRS está apresentada na Tabela 1.

Ao inóculo foi adicionado o volume de 5 mL do pré-inoculo (concentração de

10% v/v), sendo o cultivo realizado na condição estacionária e incubação em estufa

a 37ºC por 12 horas. Neste período, foi avaliada a cinética de crescimento celular

por análise da absorbância e do pH ao longo do tempo.

Tabela 1 – Composição do meio caldo MRS

Composto Concentração (g/L)

Peptona 10 Extrato de carne 10

Extrato de levedura 5 Dextrose 20

Polisorbato 80 1 Citrato de amônio 2 Acetato de sódio 5

Sulfato de magnésio 0,10 Sulfato de manganês Fosfato dipotássio

Agar

0,05 2 12

Cultivo de L. casei em meio caldo MRS

Foram testadas as seguintes condições de cultivo em meio caldo MRS: cultivo

agitado (50 rpm) em agitador tipo shaker (Marconi®) e estacionário (estufa com

circulação de ar, marca Marconi®) e concentrações de inóculo de 1 e 5 % (v/v). Os

cultivos foram realizados em frascos tipo Erlenmeyer de 500 mL de capacidade

contendo 200 mL de meio. Em todos os casos o inóculo foi adicionado quando este

atingiu a fase exponencial de crescimento celular, o que correspondeu a 10 h de

cultivo. A temperatura de incubação em todos os ensaios foi de 37oC e os cultivos

foram acompanhados em termos da variação da absorbância e do pH durante 32 h.

Amostras foram retiradas no final do período para análise da concentração final de

células viáveis.

31

Cultivo de L. casei em meio à base de soro de leite

Foi formulado um meio de cultura à base de soro de leite, conforme mostra

a Tabela 2. O soro foi gentilmente cedido pela empresa Natural da Vaca®,

localizada em Gravatá-PE.

Tabela 2 – Composição do meio à base de soro de leite

Composto Concentração (g/L)

MnSO4.H2O 0,05 MgSO4.7H2O 0,10

Citrato de sódio 2,00 Acetato de sódio 5,00

K2HPO4 2,00 Glicose 40,00

Tween 80 1,00 Extrato de levedura 25,00

Soro de leite Volume de 100mL

A fermentação em soro de leite foi realizada empregando-se as melhores

condições de crescimento celular observadas no ensaio anterior para o meio caldo

MRS, ou seja, utilizando uma concentração de inóculo de 5% (v/v) para as

condições em estado estacionário e frascos agitados a 50 rpm, respectivamente

(Figura 5). Os ensaios foram realizados empregando-se frascos tipo Erlenmeyer de

500 mL de capacidade contendo 200 mL de meio, tempo de inóculo de 10 h a 37oC.

Os cultivos foram acompanhados em termos da concentração de células viáveis

durante 50 h de fermentação.

Avaliação físico-química do soro de leite

A caracterização físico-química do soro de leite utilizado na formulação do

meio de cultura para a fermentação de L. casei foi realizada por meio da

determinação de pH, umidade, proteínas e lipídios de acordo com os Métodos

Analíticos Oficiais (Instituto Adolpho Lutz, 1985).

32

Figura 5 – A: Fermentação de L. casei (cultivo estacionário) em estufa com

circulação de ar. B: Fermentação de L. casei (cultivo com agitação) em shaker

(Foto do autor)

Métodos analíticos para os ensaios de fermentação

a) Contagem de células viáveis: a partir de diluições decimais seriadas em tubos de

ensaio contendo solução salina (0,85% p/v de NaCl), um volume de 10µL das

amostras foi inoculado em placas de Petri contendo meio MRS Ágar suplementado

com 2% de glicose pela técnica de “pour plate”. As placas foram incubadas em

estufa com circulação de ar por 72 horas, a 37ºC.

b) Determinação do pH: foram retiradas amostras de 3mL para leitura do pH por

meio de potenciômetro (Marconi®).

c) Crescimento celular: foi avaliado de maneira indireta por meio de medidas de

absorbância ao longo do tempo em espectrofotômetro (Spectrum®), a 600nm.

d) Pesquisa de contaminantes (Figura 6):

- Análise microscópica a fresco e pela técnica de Gram;

- Meio MRS Ágar: empregado para verificar a pureza do caldo fermentado;

- Meio Sabouraud com Cloranfenicol: utilizado para pesquisar possíveis

contaminações por fungos e leveduras. A presença do antibiótico de amplo-espectro

cloranfenicol inibe a presença de bactérias, sendo adicionado assepticamente após

a esterilização do meio a uma concentração de 100mg/L. As amostras foram

inoculadas na forma de estrias sobre a superfície de placas de Petri contendo o

meio, e incubadas a 30oC durante 48h.

- Meio CVB - Caldo Verde Brilhante: utilizado para realização do teste presuntivo

para coliformes. Em um tubo de ensaio estéril contendo o meio de cultivo e um

tubo de Durhan, o material a ser testado foi inoculado com duas alçadas e incubado

A B

33

a 35oC ± 0,5oC por 24 a 48h. A presença de gás retido no tubo de Durhan indicaria a

presença de bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes totais;

- Meio EMB - Eosina Azul de Metileno: utilizado com o objetivo de verificar possíveis

contaminações por bactérias Gram-negativas e diferenciar o aparecimento de

colônias do tipo coliforme. Estas apresentam uma característica morfológica típica,

com colônias com centro escuro e brilho metálico;

- Meio Específico para Staphylococcus aureus (Baird-Parker suplementado com

gema de ovo): utilizado para detectar eventual contaminação por Staphylococcus

aureus. As placas foram incubadas a 35oC durante 48h;

- Meio Caldo Listeria: o material a ser testado foi inoculado com duas alçadas e

incubado a 35oC ± 0,5oC por 24 a 48h. A turvação do meio indicaria a presença de

bactérias do tipo Listeria sp.

Figura 6 – Análise de contaminantes microbiológicos do fermentado de L. casei em

meio de cultura a base de soro de leite (Foto do autor)

Ensaios de adesividade de L. casei

A partir da cultura mantida em tubo contendo MRS Ágar, foi preparada uma

suspensão de L. casei em 35 mL de tampão KH2PO4-Na2HPO4 (50 mM, pH 7,0) até

atingir o tubo no 2 da escala de Mcfarland. Em seguida, a amostra foi centrifugada

a 3000 rpm por 15 min, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas

por duas vezes pela adição de 35 mL do tampão. Este procedimento é necessário

para retirada de componentes do meio de cultura. Por fim, o centrifugado foi

ressuspenso em 50mL de KNO3.

34

As análises foram realizadas em triplicata, de acordo com Barbosa et al.

(2005). A partir de um tubo de vidro rosqueável, foi adicionado 1 mL de solvente

(xilol – caráter apolar, clorofórmio – caráter ácido, e acetato de etila – caráter

básico) e 4 mL de suspensão celular. Após a mistura célula-solvente, as amostras

ficaram em repouso por 5 minutos e mesclou-se as fases por agitação em vórtex por

2 min. Após repouso de 60 min, foi realizada a leitura de absorbância da fase

aquosa a 600 nm em espectrofotômetro (Spectrum®).

O percentual de adesão de células de L. casei foi determinado de acordo

com a Equação 1:

(1)

Onde:

DOA ⇒ Branco – 5 mL de solução de KNO3

Amostra – 5 mL de solução de KNO3 + Células

DOB ⇒ Branco – 4 mL de solução de KNO3 + 1 mL dos solventes em cada tubo

Amostra – 4 mL de suspensão celular em solução de KNO3 + 1 mL dos

solventes em cada tubo

Ensaios de imobilização das células em alginato

As células obtidas nos ensaios de fermentação em soro de leite foram

centrifugadas sob refrigeração (Hermle®, modelo Z36HK), a 4000 rpm, 10oC por 60

segundos.

Visando o controle microbiológico da etapa de imobilização celular, uma

amostra do alginato foi submetida a diluições seriadas (10-1 a 10-3), inoculada em

meio Agar Nutritivo e incubada a 35ºC por 48 h.

As microcápsulas foram preparadas a partir de uma solução de alginato de

sódio (Danisco®) a uma concentração de 1% (p/v) em tampão fosfato 1M (pH 7)

previamente esterilizado. Após a adição do alginato ao tampão estéril, a

solubilização do biopolímero foi realizada em banho maria a 50 ºC, sob constante

agitação.

Como ilustrado na Figura 7, uma suspensão de células/alginato na proporção

de 1:4 (v/v) foi então gotejada com uma seringa de 20mL em um volume de 100mL

35

de uma solução de CaCl2 a 0,1M sob leve agitação. As microcápsulas formadas

foram mantidas sob refrigeração (10ºC) por 2 horas, sendo posteriormente lavadas

duas vezes com solução salina (NaCl) a 0,85% (p/v). Após pesagem das partículas

úmidas, estas foram submetidas à secagem em estufa com circulação de ar a 35ºC

até peso constante. O armazenamento das microcápsulas após a secagem foi

realizado em um frasco hermeticamente fechado mantido sob refrigeração (10ºC).

Amostras da suspensão de células centrifugadas, da suspensão células/alginato e

das partículas secas foram retiradas para determinação da concentração de células

viáveis.

Figura 7 – A: Gotejamento da suspensão celular de L. casei em alginato na solução

de cloreto de cálcio, sob leve agitação. B: microcápsulas formadas de L. casei. C:

Lavagem das microcápsulas. D: microcápsulas úmidas (Fotos do autor)

C D

36

Produção do queijo de coalho e incorporação de células livres e imobilizadas

Inicialmente, foi realizada uma caracterização físico-química e

microbiológica do leite empregado na fabricação do queijo. O produto utilizado foi

o leite pasteurizado tipo C padronizado, industrializado e comercializado em

Pernambuco. As embalagens (volume de 1L) foram adquiridas em um supermercado

da cidade de Vitória de Santo Antão –PE, e apresentavam data de fabricação em 31

de maio de 2011, com validade até 04 de junho de 2011. As análises do leite e a

manufatura do queijo foram realizadas no dia 01 de junho de 2011. A Tabela 3

mostra a composição do leite conforme o rótulo do fabricante.

Após a higienização de 6 (seis) embalagens (100 ppm de cloro por 10

minutos), estas foram abertas de forma estéril utilizando uma tesoura flambada e

depositadas em um recipiente previamente higienizado com álcool a 70% (v/v). O

volume de leite foi homogeneizado e, em seguida, uma amostra de 150 mL (2,5% do

volume total) foi retirada para a realização das análises microbiológicas e físico-

químicas.

Tabela 3 – Composição do leite pasteurizado tipo C padronizado

Valor nutricional em 100 mL do leite

Valor energético 55 Kcal

Carboidratos 4,5g

Proteínas 3g

Gorduras Totais 3g

Gorduras Saturadas 1,75g

Gorduras Trans 0g

Fibra Alimentar 0g

Sódio 52,5 mg

As avaliações microbiológicas consistiram no plaqueamento de um volume de

500 µL das diluições (10-1 a 10-4) nos seguintes meios de cultura: EMB (isolamento e

diferenciação de bactérias entéricas Gram-negativas; colônias pretas-azuladas com

reflexo verde metalizado indicam a presença de coliformes), PCA (meio de

enriquecimento para contagem total de microorganismos) e MRS Agar (bactérias

láticas mesófilas). As análises físico-químicas compreenderam as leituras do índice

de refração (Refratômetro Unoterm®) para análise dos sólidos solúveis, e pH.

37

O processo de fabricação do queijo coalho foi realizado como descrito por

Cavalcante et al., (2007), Laguna e Egito (2008) e Laguna et al., (2009) com

algumas modificações, de acordo com as seguintes etapas (Figura 8):

Aquecimento do leite a 37ºC;

1. Adição lenta de CaCl2 (0,05% p/v) previamente diluído em 10mL de água;

2. Adição lenta do coalho a uma concentração de 0,0625 g/L, previamente

diluído em 10mL de água;

3. Repouso por 50 minutos;

4. Corte da coalhada com o auxílio de liras horizontais e verticais;

5. Mexedura da coalhada por 3 minutos com colher estéril, aguardar 5 minutos

e mexer novamente por 5 minutos;

6. Realização da dessoragem: passar o material por uma peneira de plástico

desinfetada em água fervente por 5 minutos, até retirar o excesso de soro;

7. Salga da massa (concentração de sal de 0,4% p/v);

8. Enformagem e adição do probiótico: para o preparo do queijo tipo controle,

uma quantidade de 200 g de massa foi disposta em uma forma. Para os

queijos contendo o probiótico (células livres e encapsuladas), o preparo foi

realizado de acordo com a seguinte sequência: adição de uma camada de

massa de cerca de 100g, adição do probiótico (0,022g de microcápsulas ou

um volume de 10 µL de suspensão celular centrifugada diluída em 1 mL de

soro de leite) e adição de 100 g massa;

9. Prensagem por um período de 14 h a temperatura ambiente;

10. Desenformagem: os queijos foram retirados das formas, pesados novamente,

embalados em um tecido estéril e colocados em refrigerador a 10ºC;

11. Maturação: 7 dias a 10ºC;

12. Pesagem;

13. Retirada de amostras para análise físico-química e microbiológica.

38

V

Figura 8 – Etapas da fabricação do queijo de coalho. A- Aquecimento a 37 ºC. B-

Adição do cloreto de cálcio. C- adição do coalho. D- corte com lira vertical. E-

corte com lira horizontal. F- mexedura. G- dessoragem. H- pesagem. I- salga. J-

enformagem. K- microcápsulas de L. casei . L- células livres de L. casei. M-

prensagem. N- desenformagem. O- armazenamento. P- queijo de coalho controle

(Foto do autor)

A B C

D E F G

H I J

K L M

N O P

39

Avaliação físico-química e microbiológica dos queijos

As análises físico-químicas foram realizadas de acordo com os seguintes

métodos: Cinzas; Gordura, pela metodologia do butirômetro de Gerber; Umidade;

Nitrogênio total (Kjeldahl); pH (BRASIL, 1981).

Para realização das análises microbiológicas, amostras de 25 g dos queijos

foram coletadas com o auxílio de uma faca estéril, homogeneizadas por 30 s em

liquidificador previamente desinfetado com álcool a 70% (v/v) e dispostas em

frascos tipo Erlenmeyer de 500 mL de capacidade contendo 225 mL de água

peptonada (0,1% p/v). As amostras foram agitadas por 3 min e em seguida um

volume de 500 µL foi retirado para realização de diluições decimais em tubos

contendo solução salina a 0,85% (p/v). As amostras foram plaqueadas nos meios

PCA e MRS Ágar e incubadas a 37oC por 72h para avaliação da microbiota dos

queijos.

ASPECTOS ÉTICOS

Não foi necessária a submissão do trabalho à aprovação pelo comitê de ética

da Universidade Federal de Pernambuco pelo fato de que a pesquisa não foi

realizada com seres humanos ou animais.

40

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 9 mostra a variação da absorbância e do pH durante o cultivo do

inóculo de L. casei em meio caldo MRS. Observou-se que a partir de 9 h de cultivo o

microrganismo inicia a fase exponencial de crescimento celular, com velocidade

máxima de crescimento equivalente a 0,4 h-1. Foi escolhido um tempo de cultivo de

10 h para inoculação das células nos ensaios subseqüentes.

Figura 9 – Variação da absorbância e do pH durante o cultivo do inóculo de L. casei

em meio caldo MRS

A Figura 10 mostra a variação da absorbância durante o cultivo de L. casei

em meio caldo MRS nas condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com

concentrações de inóculo de 1 e 5%(v/v). As velocidades máximas de crescimento

celular estão apresentadas na Figura 11.

0 2 4 6 8 10 12 14

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Ab

so

rbâ

ncia

(6

00

nm

)

Tempo (h)

Absorbância

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

= 0,4 h-1

pH

pH

41

Figura 10 – Variação da absorbância durante o cultivo de L. casei em meio caldo

MRS nas condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com concentrações

de inóculo de 1 e 5%(v/v)

Figura 11 – Valores de velocidade máxima de crescimento celular de L. casei em

meio caldo MRS nas condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com

concentrações de inóculo de 1 e 5%(v/v)

Pode-se observar que a maior velocidade máxima de crescimento é atingida

na condição estacionária com 5% de inóculo (0,48 h-1), seguindo-se da condição

estacionária a 1% de inóculo (0,37 h-1). Nestas condições, não foi observada uma

0 5 10 15 20 25 30 35

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

Absorb

ância

(60

0 n

m)

Tempo (h)

Estacionário - Inóculo 5%

Estacionário - Inóculo 1%

50 rpm - inóculo 5%


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-5,6

-5,4

-5,2

-5,0

-4,8

-4,6

-4,4

-4,2

-4,0

-3,8

-3,6

-3,4

-3,2

= 0,27 h-1

= 0,26 h-1

= 0,37 h-1

= 0,48h-1

Ln

(a

bs)

Tempo (h)

Estacionário - inóculo 5%




42

fase lag de crescimento celular. Os menores valores de velocidade máxima de

crescimento foram obtidos para os cultivos agitados, independentemente da

concentração de inóculo (0,26 e 0,27 h-1).

Analisando os resultados em termos da absorbância final atingida após o

término da fermentação, os resultados indicam que os maiores valores foram

observados para as condições de maior concentração de inóculo. Vale salientar que

em ambos os cultivos agitados foi observada uma fase lag de crescimento, sendo

esta mais acentuada no cultivo agitado com 1% de inóculo (2 h).

Os valores de pH durante os cultivos (Figura 12) mostram uma leve tendência

à acidificação. Hujanem e Linko (2001) demonstram que a temperatura ótima para

crescimento celular e produção de ácido lático, por L. casei, é 37ºC. Tais condições

de cultivo explicam uma leve acidificação do fermentado. As bactérias ácido

láticas crescem bem em pH inicial neutro ou próximo da neutralidade variando

entre 7,5 e 5,5, sendo 6,5 pH ótimo.

Figura 12 – Variação do pH durante o cultivo de L. casei em meio caldo MRS nas

condições de cultivo estacionário e agitado a 50 rpm e com concentrações de

inóculo de 1 e 5%(v/v)

0 5 10 15 20 25 30 35

5,00

5,25

5,50

5,75

6,00

6,25

6,50

6,75

7,00

pH

Tempo (h)





43

O estudo de Faria, Benedet e Guerroue (2006) subsidia dados para acreditar

que L. casei quando administrado em alimentos apresenta pós-acidificação lenta,

característica desejável para garantir viabilidade no produto e conservação do

alimento durante a estocagem.

Silveira (2009) realizou fermentações de L. casei em um meio sintético

contendo 50 g/L de açúcares redutores e 6 g/L de extrato de levedura em pH 6,5 a

37ºC, com a finalidade de obtenção de ácido lático. Os autores obtiveram uma taxa

específica de crescimento de 0,61 h-1, maior que as encontradas no presente

trabalho. No entanto, este estudo foi realizado com um meio de cultura contendo

fonte de carbono a uma concentração superior a aplicada neste trabalho, que foi

de 20 g/L de glicose.

Os resultados de concentração de células viáveis ao final das 32 h de cultivo

para os quatro ensaios realizados são mostrados na Tabela 4. Percebe-se que em

termos de números absolutos os resultados são similares (em torno de 107

UFC/mL), exceto para a condição do cultivo agitado com 1% de inóculo.

Tabela 4 – Concentração de células viáveis de acordo com a condição de cultivo em

meio caldo MRS (tempo de cultivo de 32 h)

Condição Células viáveis (UFC/mL)

Estacionário – inóculo 5% 1,10 x 107 ± 0,09 x 107

Estacionário – inóculo 1% 1,60 x 107 ± 0,26 x 107

Agitado a 50 rpm – 5% 1,60 x 107 ± 0,27 x 107

Agitado a 50 rpm – 1% 3,50 x 106 ± 1,00 x 106

Com base nos resultados apresentados acima, buscou-se formular um meio

de cultivo à base do soro de leite, fornecido por uma indústria láctea do Estado de

Pernambuco e que tem interesse em realizar uma melhor disposição do seu

efluente de processo. O soro representa um subproduto rico em nutrientes e que

pode ser reaproveitado na produção de probióticos, reduzindo os custos destinados

ao tratamento deste efluente e a poluição ambiental associada ao seu descarte

inadequado (ALVES FILHO, 2002; SÁ et al., 2009; TERRA et al., 2009).

O soro apresentou os seguintes resultados em relação à sua composição

centesimal (Tabela 5):

44

Tabela 5 – Composição centesimal do soro de leite empregado nos cultivos

de L. casei

Componente Concentração média1 ± dp2 (%)

Proteínas 0,14 ± 0,00 Lipídios 0,10 ± 0,00 Umidade 95,23 ± 0,06 Cinzas 0,50 ± 0,10

Carboidratos 4,03 (por diferença) 1 – Média de três valores; 2 – Desvio padrão

Desta forma, um novo cultivo foi realizado na melhor condição obtida

(cultivo estacionário; concentração de inóculo de 5% (v/v)). Visando um melhor

entendimento da influência da agitação no crescimento do microrganismo, também

foi realizado um cultivo com a mesma concentração de inóculo com agitação a 50

rpm. Os resultados estão apresentados na Figura 13.

Figura 13 – Concentração de células de L. casei em meio a base de soro de leite de

acordo com o tipo de cultivo (concentração de inóculo de 5% v/v)

Observa-se que não houve diferença significativa na cinética dos cultivos

estacionário e agitado. Foi obtida uma concentração final de células viáveis de 3,4

x 108 UFC/mL, adequada para o uso do caldo fermentado como inoculante em

alimentos com características probióticas. O comportamento observado justifica-se

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

103

104

105

106

107

108

109

Co

nce

ntr

açã

o d

e c

élu

las (

UF

C/m

L)

Tempo (h)

Cultivo estacionário

Cultivo agitado

45

pelo fato de que Lactobacillus sp. são microaerófilos facultativos, se adaptando

bem as duas condições de cultivo.

Os resultados de pesquisa de contaminantes nas amostras dos caldos

fermentados demonstraram a pureza dos cultivos, sem ocorrência de

contaminação.

A Figura 14 mostra os resultados dos ensaios de adesividade e características

ácido-básicas da parede celular de L. casei. Os experimentos realizados com o

solvente xilol (apolar) indicam que as células possuem um grau elevado de

hidrofobicidade (86%), enquanto que os resultados a partir dos experimentos com

clorofórmio (solvente ácido) e acetato de etila (solvente básico) mostram que o

microrganismo apresenta uma superfície celular mais ácida. Segundo Pelletier et

al. (1997), estudos físico-químicos de superfícies celulares microbianas têm

demonstrado relações entre cargas superficiais, hidrofobicidade e a composição

elementar da superfície celular. No caso de L. casei, cultivado em MRS Agar, ficou

constatado que este microrganismo possui uma parede celular mais hidrofóbica e

ácida, sugerindo que esta cepa possui grande tendência à adesão ao epitélio

intestinal, e desta forma sendo adequada para uso como probiótico.

Figura 14 – Porcentagem de hidrofobicidade e características ácido-básicas da

parede celular de L. casei

Os ensaios de imobilização evidenciaram que a partir de 20 mL de suspensão

alginato/células foi obtida uma massa de 7,3 g de partículas úmidas. Os testes

46

microbiológicos realizados na amostra de alginato evidenciaram a pureza do

biopolímero utilizado.

Os resultados de concentração de células viáveis nas amostras de caldo

fermentado, suspensão de células centrifugada, suspensão de células/alginato e

nas partículas secas são mostrados na Tabela 6. Pode-se notar que ocorre uma

perda de células viáveis no processo de imobilização celular.

Tabela 6 – Concentração de células viáveis de L. casei de acordo com a amostra nos

ensaios de imobilização

Amostra Concentração de células viáveis

Caldo fermentado 6,90 x 108 UFC/g Centrifugado 1,65 x 1010 UFC/g

Suspensão células/alginato 4,15 x 109 UFC/g Microcápsulas 7,40 x 107 UFC/g

A secagem das partículas imobilizadas foi realizada por um período de 3 h,

sendo observada uma umidade residual constante já a partir de 30 minutos de

secagem (Figura 15). A massa seca (Figura 16) de partículas obtida após a secagem

foi de 0,44 g.

Figura 15 – Curva de secagem das partículas de alginato contendo L. casei

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

0

20

40

60

80

100

Pe

rda

de

um

ida

de

(%

)

Tempo (h)

47

Figura 16 – A: microcápsulas de L. casei úmidas. B: microcápsulas de L. casei após a

secagem (Fotos do autor)

Os resultados da análise físico-química do leite pasteurizado tipo C

padronizado, utilizado no presente estudo, foram os seguintes: pH 7,0 e índice de

refração do leite de 10º (medido a 20oC). Em relação à análise microbiológica, foi

obtida uma concentração de células totais por contagem padrão em placas

equivalente a 2,2 x 103 UFC/mL. Este valor está de acordo com o que é permitido

pela legislação brasileira (Instrução Normativa Nº 51 de 18/09/2002), que

estabelece uma tolerância de 2 entre 5 amostras coletadas com valores entre 1 x

105 e 3 x 105 UFC/mL para o leite pasteurizado tipo C (BRASIL, 2002). Em se

tratando da contagem de células em meio MRS Ágar (seletivo para bactérias

láticas), foi observada uma concentração de 4 x 102 UFC/mL, enquanto que não foi

observado crescimento de microrganismos no meio EMB.

Os dados de rendimento da produção dos queijos indicaram que a partir de

5,85 L de leite foram obtidas massas de queijo na etapa de pós-enformagem

equivalentes a 580g, sendo 200 g para produção do queijo controle, 200g para o

queijo suplementado com células livres e 180 g para o queijo suplementado com

células encapsuladas, o que equivale a um rendimento total de aproximadamente

48

10%. Os dados de perda de massa dos queijos ao longo do tempo podem ser

observados na Tabela 7.

Os resultados relativos à composição centesimal dos queijos e à análise

microbiológica estão apresentados nas Tabelas 8 e 9, respectivamente.

Tabela 7 – Dados de perda de massa percentual dos queijos ao longo do tempo

Período

AMOSTRA

Queijo controle Queijo suplementado com

células livres

Queijo suplementado com células

encapsuladas

Após 14 h de prensagem

38,0 37,8 37,5

Após 7 dias de maturação

46,5 46,7 46,5

Tabela 8 – Composição centesimal dos queijos realizada após 10 dias de preparo

Componente

(%)

AMOSTRA

Queijo controle Queijo suplementado com

células livres

Queijo suplementado com

células encapsuladas

Proteínas 25,7 25,3 26,0

Carboidratos (por diferença)

3,9 5,0 12,3

Lipídios 38,0 38,0 38,0

Umidade 29,7 28,9 20,7

Cinzas 2,6 2,8 3,0

Tabela 9 – Análise microbiológica dos queijos realizada após 10 dias de preparo

Meio

AMOSTRA

Queijo controle

(UFC/g)


células livres

(UFC/g)


células encapsuladas

(UFC/g)

PCA 5,4 x 108 4,5 x 108 4,3 x 108

MRS 1,9 x 107 1,4 x 108 9,1 x 107

Na Figura 17, pode-se observar os queijos produzidos (controle, com células

livres e com células encapsuladas).

49

Figura 17: Queijos de coalho após 7 dias de maturação refrigerada (10ºC). A: queijo

controle, sem probióticos. B: queijo enriquecido com microcápsulas de L. casei. C:

queijo enriquecido com células livres de L. casei

A legislação elaborada para o queijo de coalho não define bem este produto

A Instrução Normativa nº 30, de 26 de junho de 2001, aprova os

regulamentos técnicos de identidade e qualidade do queijo de coalho (BRASIL,

2001). De acordo com a resolução, o queijo de coalho é um queijo de média a alta

umidade, que apresenta um teor de gordura nos sólidos totais variável entre 35,0%

e 60,0%.

De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Queijos

(BRASIL, 2001), são considerados queijos de média umidade os que possuem

umidade entre 36,0 e 45,9%, enquanto que os queijos de alta umidade possuem

entre 46,0 e 54,9% de umidade. O baixo teor de umidade observado nos queijos

obtidos neste estudo pode ser explicado pelo fato de que a análise físico-química

foi realizada após 10 dias de sua fabricação, havendo uma perda de umidade neste

período. O teor de gordura observado (38%) encontra-se de acordo com a

legislação.

Em relação à análise microbiológica, pode-se observar um maior teor de

bactérias láticas no queijo suplementado com células livres (1,4 x 108 UFC/mL)

quando comparado ao queijo controle (1,9 x 107 UFC/mL), o que pode ser atribuído

à incorporação de L. casei e seu crescimento no produto. Para o queijo contendo o

50

microrganismo encapsulado, foi observada uma concentração de células maior que

a observada no queijo controle e menor que a do queijo contendo células livres

(9,1 x 107 UFC/mL), sugerindo uma liberação gradual do microrganismo no produto

ao longo do tempo. Estes resultados, juntamente com a observação de quantidades

semelhantes de contagem total de microrganismos em meio PCA para os três

queijos, podem sugerir que o aumento no teor de L. casei nos queijos

suplementados pode ter inibido o crescimento de outros microrganismos no

produto.

51

CONCLUSÕES

Os ensaios de fermentação de L. casei demonstraram que não houve

diferenças significativas entre o cultivo estacionário e agitado (50 rpm). Quanto à

concentração do inóculo observa-se que a 5% (v/v) houve maior crescimento celular

e uma menor fase lag. A diminuição lenta do pH ocorre provavelmente devido a

liberação de ácido lático, sendo uma característica que promove a bioconservação

de alimentos suplementados com este microrganismo.

A utilização de meio de cultura a base de soro de leite de vaca constitui-se

numa alternativa viável, uma vez que demonstrou uma concentração de biomassa

maior em relação ao meio MRS, e o reaproveitamento deste subproduto da

indústria de laticínios é economicamente interessante, inclusive pelo uso do soro

gerado no processo de fabricação do queijo de coalho. Estes resultados fornecem

dados para o desenvolvimento de trabalhos posteriores para elaboração de um

meio que otimize a produção de L. casei.

Para que um microrganismo seja probiótico ele deve ter a capacidade de

aderir-se na mucosa e no epitélio intestinal. L. casei demonstra alta

hidrofobicidade e características ácidas em sua parede celular, sendo estas

indispensáveis para a adesão intestinal de microrganismos, qualificando-o como

probiótico, entretanto, é interessante que sejam realizados estudos experimentais

em animais.

A imobilização celular de L. casei em alginato de cálcio constitui-se numa

alternativa viável, embora tenha ocorrido uma diminuição do número de células

viáveis nas microcápsulas. Também se observou que a secagem das microcápsulas é

uma etapa rápida e que não necessita de alta temperatura.

O queijo de coalho é um alimento que contém nutrientes, teor de umidade e

condições de processamento que possibilitam a sua utilização como veículo

probiótico. O maior número de bactérias láticas nos queijos enriquecidos com L.

casei indica que houve uma proliferação de L. casei. Quanto à diferença entre

inserção de células livres e microencapsuladas são necessários mais estudos;

entretanto, acredita-se que o maior número de células viáveis no queijo

suplementado com células livres ocorreu devido à liberação lenta de células das

microcápsulas.

52

Este trabalho contribuiu imensamente para os objetivos da nutrição uma vez

que tenta desenvolver um produto alimentício de qualidade com funcionalidade.

Com relação a conclusão do curso de graduação, esta pesquisa foi essencial para

formação de pensamentos críticos sobre as ciências da nutrição e alimentação,

além de possibilitar a prática na elaboração de trabalhos científicos, desde a

pesquisa bibliográfica até como trabalhar em uma bancada de laboratório, escrever

e discutir resultados.

As perspectivas futuras para esta pesquisa são a otimização do processo

fermentativo, com controle sobre variáveis como por exemplo pH, concentração de

substrato, temperatura, testes experimentais de adesão intestinal e efeitos da

administração de L. casei, e posteriormente, ensaios clínicos. Também é desejável

a identificação do crescimento de L. casei no queijo, visando melhorar os processos

tecnológicos na fabricação desse alimento e investigar a diferença entre inserção

de células livres e células encapsuladas em alginato. Por último, é de interesse

testar outras formas de encapsulação para comparar a viabilidade financeira e

biotecnológica com a microencapsulação com alginato de cálcio que é um polímero

de baixo custo.

53

REFERÊNCIAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO - UFPE · e irmãs de coração. Nós somos para sempre a “família NATA”. Entre mim e Joelma (Joba) foi amor a primeira vista, nos conhecemos