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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
PARASITÁRIA
Estabelecimento de Modelo Murino para
Neurotuberculose Experimental
Camilla de Aguiar Dalan
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2015
i
Camilla de Aguiar Dalan
Estabelecimento de Modelo Murino para Neurotuberculose
Experimental
Dissertação de mestrado apresentada à pós-graduação da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza
SÃO CRISTÓVÃO-SE
2015
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
D136e
Dalan, Camilla de Aguiar Estabelecimento de modelo murino para neurotuberculose
experimental / Camilla de Aguiar Dalan ; orientador Waldecy de Lucca Junior. – São Cristovão, 2015.
56 f. : il.
Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Tuberculose. 2. Sistema nervoso central – Doenças. I. Lucca Junior, Waldecy de, orient. II. Título.
CDU 616-002.5
iii
FICHA DE APROVAÇÃO
Camilla de Aguiar Dalan
Estabelecimento de Modelo Murino para Neurotuberculose
Experimental
Dissertação de mestrado apresentada à pós-graduação da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.
Aprovada em:___/___/___
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior
(Orientador – DMO/Ufs)
Prof. Dr. Leandro Marques de Souza
(Examinador externo ao programa – DESL/Ufs)
Profa. Dra. Luciana Valente Borges
(Examinador externo ao programa – DESL/Ufs)
iv
Essa conquista dedico à minha queridíssima e
amada família e meus orientadores.
Sem o apoio de ambos seria muito
mais difícil! Gratidão pela confiança e ajuda!
v
AGRADACIMENTOS
Agradeço às pessoas e instituições que me ajudaram a desenvolver esse trabalho
e chegar até aqui!
Ao meu orientador Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior (Depto de Morfologia –
UFS) pelos meses que dispôs para o meu aprendizado, os inúmeros
ensinamentos, e além de abrir as portas do laboratório (Laboratório de
Neurociência e Molecular de Sergipe – LaNMSE) para o desenvolvimento do
trabalho, acreditando que eu era capaz.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza
(Depto de Educação em Saúde – UFS) por sempre acreditar e me motivar a
seguir em frente. Seu exemplo foi fundamental!
Ao Prof. Dr. Célio Lopes da Silva (Depto de Imunologia Pura e Aplicada –
FMRP – USP) por ceder a cepa H37Rv e o laboratório do Núcleo de Pesquisa
em Tuberculose (NPTb – FMRP - USP), sem os quais seria impossível a
realização do trabalho. A ajuda indispensável das técnicas Ana Paula (Aninha),
Wendy e Izaíra, nos procedimentos padrão.
À Profa. Dra. Simone Gusmão Ramos e a técnica Elaine Medeiros Floriano, com
os ensinamentos de Histologia e a recepção ao Laboratório de Patologia
Pulmonar (FMRP – USP). Sem a sua ajuda, Elaine, seria tudo muito mais
complicado, principalmente nos momentos difíceis!
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária (PROBP
– UFS) pelos ensinamentos depositados em nós, as amigas do Programa,
obrigada pelos cabelos caídos nas disciplinas que queimamos nossos neurônios.
Em especial à Profa. Dra. Rosilene Calazans Soares, pelo incentivo, apoio e por
acreditar desde de o início. Aos profs. coordenadores e seus secretários, que
sempre buscaram facilitar nossas vidas aos meios de tantas normas e regras,
principalmente a Profa. Dra. Karinna Conceição e Dani (secretária).
Aos muitos amigos que fiz no laboratório (LaNMSE), onde passei grande parte
desses dois últimos anos. Muitos foram alunos que passaram e deixaram sua
vi
contribuição, entre eles, há os que mais me marcaram, principalmente no
convívio e exemplo. Entre esses alunos, agradeço à Verônica, Camila, Thayana e
Priscila.
Agradeço as ajudas que os alunos de Iniciação Cientifica (IC‟s) puderam ceder,
principalmente os alunos José Gilmar da Costa e Rhamon Ribeiro da Costa, que
serão eternos IC‟s (incríveis companheiros), cuja ajuda atingiu a linha tênue,
tornando-os meus companheiros de pesquisa mais alegres, amigos e
motivadores!!! À Flavia Ellen, pelo ensino e ajuda em momentos cruciais!!!
Muita gratidão!!!
Aos membros da banca examinadora da qualificação: Profa. Dra. Luciana
Valente Borges (Depto de Educação em Saúde – UFS), Profa. Dra. Patrícia
Rodrigues Marques de Souza (Depto de Educação em Saúde – UFS) e Profa.
Dra. Tatiana Rodrigues de Moura (Depto de Morfologia – UFS), pelas valiosas
contribuições e sugestões.
Família e amigos, a minha gratidão não tem limites por tudo que me ofereceram
e em situações que eu nada podia oferecer-lhes! Amo muito vocês!!!
À Capes, por oferecer a bolsa de mestrado que ajudou, e muito, desde de o início
do programa.
Como finalizador, agradeço a Deus e seus anjos, muitos já citados anteriormente,
cuja vontade nunca me levou onde a graça de Deus pudesse me proteger!
Gratidão imensa por tudo!
vii
SUMÁRIO
Resumo ________________________________________________________xii
Abstract _______________________________________________________xiii
1. Introdução ___________________________________________________14
1.1. Histórico da Tuberculose (TB) __________________________________14
1.2. A descoberta do bacilo ________________________________________15
1.3. Epidemiologia da TB _________________________________________16
1.4. Agente patológico da TB, características e transmissão ______________18
1.5. Resposta imunológica contra o bacilo_____________________________18
1.6. TB no Sistema Nervoso Central _________________________________21
2. Objetivos ____________________________________________________24
2.1. Objetivo Geral_______________________________________________24
2.2. Objetivos Específicos _________________________________________24
3. Material e Métodos _____________________________________________25
3.1. Animais ____________________________________________________25
3.2. Delineamento Experimental ____________________________________26
3.3. Infecção Induzida por Estereotaxia com Microinjeção ________________27
3.4. Infecção Pulmonar ____________________________________________28
3.5. Coleta de Tecidos ____________________________________________29
3.6. Contagem de Colônias ________________________________________29
3.7. Processamento Tecidual para a Histologia _________________________29
3.8. Microtomia _________________________________________________30
3.9. Análise Morfológica __________________________________________30
3.10. Descartes __________________________________________________31
3.11. Aquisição e Análise das Imagens _______________________________31
3.12. Análise Estatística ___________________________________________31
4. Resultados ___________________________________________________32
viii
4.1.a. Eficácia dos controles do experimento___________________________32
4.2.b. Desenvolvimento de Neurotuberculose por infecção pulmonar________35
4.3.c. Infecção Diretamente no Sistema Nervoso Central__________________38
4.4.d. Confirmação da Presença do Bacilo Mycobacterium tuberculosis no
Cérebro ________________________________________________________41
5. Discussão ____________________________________________________ 43
6. Conclusão ____________________________________________________47
7. Referências ___________________________________________________48
8. Anexos ______________________________________________________53
A. Processamento Tecidual (cérebro) ________________________________53
B. Processamento Tecidual (pulmão) ________________________________ 54
C. Coloração Hematoxilina – eosina _________________________________55
D. Coloração Ziehl – Neelsen ______________________________________56
ix
SIGLAS
Bacilo Álcool-Ácido Resistentes – BAAR
Barreira Hemato-encefálica – BHE
Células Apresentadoras de Antígenos – APC‟s
Células Dendríticas – DCs
Células Natural Killer – NK
Coloração Ziehl-Neelsen – ZN
Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe II (em inglês Major
Histocompatibility complex) – MHCII
Fator de Necrose Tumoral tipo alfa – TNF-α
Fator de Transformação do Crescimento tipo beta (em inglês Transforming
Growth Factor Beta – TGF-β)
Hematoxilina-eosina – HE
Interferon tipo gama – INF-γ
Interleucina tipo 1 – IL-1
Interleucina tipo 4 – IL-4
Interleucina tipo 6 – IL-6
Interleucina tipo 10 – IL-10
Interleucina tipo 12 – IL-12
Interleucina tipo 18 – IL-18
Interleucina tipo 23 – IL-23
Interleucina tipo 27 – IL-27
Linfócitos T com fenótipo CD4+ – Linf TCD4
+
Linfócitos T com fenótipo CD8+ – Linf TCD8
+
Liquido cefalorraquidiano – LCR
Molécula de Ligação diferenciada 40 (em inglês Cluster of differentiation 40) –
CD40
Mycobacterium tuberculosis – Mtb
x
Neurotuberculose – Ntb
Organização mundial da saúde – OMS (em inglês World Health Organization –
WHO)
Resposta Imunológica perfil Th1 – Th1
Resposta Imunológica perfil Th2 – Th2
Síndrome da Imunodeficiência Humana – SIDA (em inglês, Acquired
Immunodoficiency syndrome– AIDS)
Sistema Imunológico – SI
Sistema Nervoso Central – SNC
Solução Salina – em inglês phosphate buffered saline – PBS
Tratamento Supervisionado – TS
Toll-like receptor 2 – TLR-2
Tuberculose – TB
Unidades formadoras de colônias (em inglês colony forming units) – CFU
xi
Lista de Figuras
Figura 1: Esquema representativo da estrutura de um granuloma_________________20
Figura 2: Esquema representativo do delineamento experimental_________________26
Figura 3: Secção cerebral mostrando os ventrículos cerebrais ocupados por corante
(Azul de Metileno) _____________________________________________________28
Figura 4: Contagem das unidades formadoras de colônias em pulmão dos grupos
controles _____________________________________________________________33
Figura 5: Caracterização morfologia de pulmão de camundongos do grupo controle
(PBS – SNC). HE______________________________________________________34
Figura 6: A caracterização morfológica de pulmão murino no grupo controle da
infecção (H37Rv-Pulmão). HE. ___________________________________________35
Figura 7: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso dos grupos
controles. ____________________________________________________________36
Figura 8: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo controle negativo
(PBS – SNC). HE. _____________________________________________________37
Figura 9: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo que recebeu
infecção intratraqueal (105 CFU/mL de M. tuberculosis) (H37Rv – Pulmão).
HE__________________________________________________________________38
Figura 10: Contagem das unidades formadoras de colônias no pulmão do grupo controle
(PBS – SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC). _____________________________39
Figura 11: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso do grupo
controle (PBS - SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC). ______________________40
Figura 12: Caracterização morfológica de cérebro infectado intracerebroventricular
(H37Rv – SNC). HE. ___________________________________________________41
Figura 13: Tecido cerebral de animal que recebeu microinjeções intracerebroventricular
de 1x105 CFU/mL da cepa H37Rv em um intervalo de 4 semanas de infecção. ZN. __42
xii
RESUMO
DALAN, Camilla de Aguiar. Estabelecimento de Modelo Murino para
Neurotuberculose Experimental. Sergipe, 2015. 56 f. Dissertação (mestrado) –
Programa de Biologia Parasitária, Universidade Federal de Sergipe, São
Cristóvão, 2015.
A ocorrência da tuberculose (TB) atinge grande parte da população
mundial e essa prevalência é acompanhada pela Organização Mundial de Saúde
(OMS) desde 1990. A mesma organização publica anualmente a situação global
da doença, assim como também a situação dos países onde a doença não está sob
controle. Além disso, nos últimos anos o número de pessoas infectadas pelo
Mycobacterium tuberculosis cresce por muitas razões, principalmente as
derivadas de desigualdade social, AIDS, migração e o surgimento de bacilo
resistente aos medicamentos. Além disso, a infecção no Sistema Nervoso Central
(SNC) pelo bacilo é uma das manifestações clínicas mais devastadoras da
doença. Esta forma extrapulmonar é denominada neurotuberculose (Ntb) e se
destaca com uma elevada taxa de mortalidade e morbidade entre as
manifestações extrapulmonares. Os fatores de risco para a Ntb incluem a idade, a
coinfecção com o HIV, desnutrição, crianças com sarampo recente, alcoolismo,
doenças malignas, o uso de imunossupressores em adultos e prevalência da
doença na comunidade. Entretanto, mecanismos fisiopatológicos da doença
precisam ser melhor compreendidos. Neste sentido mais pesquisas são
urgentemente necessárias para uma melhor compreensão da doença e para
estudar novas vacinas contra a doença. Métodos: No dia 0 camundongos
C57BL/6 foram desafiados no ventrículo lateral do SNC com técnica de micro
injeção estereotáxica contendo cepa virulenta Mycobacterium tuberculosis
(H37Rv). Após 30 dias, o cérebro e pulmão foram analisados por CFU e
histologia. Resultados: Neste estudo observou-se grande número de bacilos no
SNC determinadas pelo CFU. Além disso, a análise histológica mostrou uma
intensa atividade inflamatória no ventrículo, quando o animal foi desafiado com
H37Rv. Demonstrando assim um modelo de infecção com a cepa
H37Rvinfundida no ventrículo lateral do SNC nos camundongos machos
C57BL/6. Em conclusão, este modelo é o mais próximo com o curso normal da
doença em humanos, pois apresentou lesão tecidual com características
granulomatosa portanto uma importante estratégia para estudar a fisiopatologia
assim como mediadores envolvidos na progressão e prevenção desta doença.
Palavras-chave: Neurotuberculose; modelo experimental; desenvolvimento
xiii
ABSTRACT
DALAN, Camilla de Aguiar. Development Neurotuberculosis of
Experimental model murine. Sergipe, 2015. 56 f. Theses (Master‟s Degree) –
Program of Parasite Biology, Federal University of the Sergipe, São Cristóvão,
2015.
The occurrence of tuberculosis (TB) reaches much of the world's population and
the prevalence is accompanied by the World Health Organization (WHO) since
1990. The same organization publishes the overall situation of the disease, as well as
the situation of countries where the disease is not under control. Moreover, in recent
years the number of people infected with Mycobacterium tuberculosis grows for
many reasons, especially those derived from social inequality, AIDS, migration and
the emergence of resistant bacilli to drugs. Moreover, the infection in the central
nervous system (CNS) the bacillus is one of the most devastating clinical
manifestations of the disease. This is called extrapulmonary neurotuberculosis (Ntb)
and stands out with a high rate of mortality and morbidity among the
extrapulmonary manifestations. The risk factors include age Ntb, coinfection with
HIV, malnutrition, children with recent measles, alcoholism, malignant diseases, the
use of immunosuppressant‟s in adults and in community prevalence of the disease.
However, pathophysiological mechanisms of the disease need to be better
understood. In this respect, more research is urgently needed to better understand the
disease and to study new vaccines against the disease. Methods: On day 0 C57BL /
6 mice were challenged in the CNS of the lateral ventricle with micro stereotactic
injection technique containing virulent Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). After
30 days, the brain and lung CFU were analyzed and histology. Results: In this study,
we observed large numbers of bacilli in the CNS determined by the CFU. Moreover,
histological analysis showed an intense inflammatory activity in the ventricle while
the animal was challenged with H37Rv. Thus demonstrating a model infection with
H37Rv strain infused into the lateral ventricle of the CNS in male C57BL / 6 mice.
In conclusion, this model is the closest to the normal course of disease in humans, as
presented granulomatous tissue lesion characteristics therefore an important strategy
for studying the pathophysiology well as mediators involved in the progression, and
prevention of this disease.
Keywords: Neurotuberculosis; experimental model; development
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico da Tuberculose
O gênero Mycobacterium surgiu há 150 milhões de anos atrás e a espécie M.
tuberculosis surgiu no leste da África, por volta de 3 milhões de anos atrás. Esses
achados só foram possíveis devido a estudos de genética molecular e sequência
genômica das cepas que existem atualmente (1).
Os achados mais antigos conhecidos de tuberculose (TB) foram encontrados
no Egito, em 44 múmias de faraós e sacerdotes, datadas de 3700 a 1000 a.C. Elas
apresentaram lesões tuberculosas no pulmão, presença de sangue na traqueia e
lesões ósseas, sendo característica da forma extrapulmonar da TB quando atinge os
ossos. Além disso, em outra múmia preservada naturalmente, no Peru, foram
analisados os nódulos no pulmão, que possuíam DNA de micobactéria (1,2).
Durante a Idade Média, a TB estava espalhada por quase toda a Europa,
tanto na nobreza quanto na plebe, haviam multidões de tuberculosos que sofriam
com as formas graves de primo-infecção (2).
Com o fim do feudalismo e chegada do capitalismo (sec. XIII e XIV), a
Europa buscava novas conquistas, principalmente as conquistas territoriais por meio
das grandes navegações. Entre essas conquistas territorialistas estão as Índias e as
Américas. Nas embarcações, os tripulantes lidavam com a falta de higiene,
condições precárias de saúde, alimentação escassa e malconservada e as infestações
de ratos e baratas, durante longos períodos de tempo, então se tornava comum
doenças pulmonares, inclusive a TB. Onde os povos recém-descobertos não
possuíam imunidade capaz de deter essa doença matando grande parte da população
nativa. Esse fato ocorreu também com o território brasileiro, onde os nossos índios
sofreram bastante com a TB trazida pelos jesuítas e colonos (2).
Com a revolução industrial e, consequentemente, o aumento das massas
operárias sem o adequado desenvolvimento das condições de trabalho, saúde,
higiene e saneamento básico, novamente foram formadas as condições necessárias
para provocar uma elevação da quantidade de pessoas atingidas pela doença (1,2).
No continente brasileiro, no período colonial os padres jesuítas e os colonos
que optavam em vir para o Brasil, em sua maioria, estavam doentes, e acreditava-se
que o país recém-descoberto, era propício para a cura da doença, pois tinha clima
ameno comparado ao da Europa. Além disso, os territórios recém descobertos
15
recebiam os doentes, como uma alternativa para diminuir o contingente de doentes
na Europa. Onde os nativos não possuíam imunidade desenvolvida contra as
doenças infecciosas que assolavam a Europa, entre elas a TB, que causava milhares
de mortes em nossos nativos (2).
A Primeira Guerra Mundial contribuiu com a disseminação da doença,
principalmente dentre os soldados. Porque não haviam as mínimas condições de
saúde, higiene e saneamento básico. Esse quadro levou a um aumento das taxas de
mortalidade por TB, além de graves infecções de primo-infecção com o
comprometimento de outros órgãos e sistemas (1).
Durante toda a história da TB nos diversos países, a doença sempre esteve
ligada a uma vida boemia, misturada com o descuido e vida desregrada. Por existir
esse preconceito e a ignorância quanto às causas da TB, era comum isolar os
pacientes mais pobres em clínicas distantes, onde os mesmos não recebiam um
tratamento humanizado e viviam amontoados e distantes da população em geral.
Nesse contexto, uma enfermeira (Florence Nightingale) contraiu a doença e
trabalhou constantemente para superar a doença e a imagem que os tísicos
passavam. A enfermeira faleceu aos 90 anos após concluir seu trabalho para a
humanização dos hospitais específicos para os tísicos, tendo conseguido alcançar
seus objetivos (2).
Assim como na Europa, no cenário brasileiro, a TB também esteve
relacionada à vida de boemia. Onde muitos dos românticos, poetas, compositores e
jornalistas passam noites em bares discutindo e bebendo. Sabe-se que esse estilo de
vida é propício para o desenvolvimento e estabelecimento da TB, mas na época,
isso não estava elucidado. Porém, por serem da população nobre, os tuberculosos
dessa classe social não sofriam preconceito e não ficam distanciados da população
em geral, ao contrário, muitas pessoas sadias compartilhavam das noites boêmias
nos bares. Isso contribuiu para a disseminação da TB em diferentes classes sociais,
alertando as autoridades da saúde coletiva para a doença que não discriminava suas
vítimas fatais (2).
1.2. A descoberta do Bacilo
Em 1890, Robert Koch, no XI Congresso Médico Internacional em Berlim,
anunciou o descobrimento de uma substância que se difundia nos meios líquidos
de cultura do bacilo da tuberculose, denominada "linfa”. Tal substância possuía a
16
capacidade de "insensibilizar animais de laboratório inoculados com „bacilos
tuberculosos‟, detendo assim o processo tuberculoso nos animais já infectados”.
No ano seguinte (1891), foi publicado o artigo intitulado “Sobre um remédio para
a cura da tuberculose”. Foi um marco na história da TB no mundo, pois pôs fim a
grande diversidade de tratamentos que iam de sangrias até exercícios físicos
exaustivos, os quais não contribuíam com a melhora do paciente (1,2).
Entretanto, a substância anunciada não foi eficaz contra a TB, embora
tenha sido útil para diagnosticar a doença. Contudo, o tratamento efetivo começou
em 1944, com o descobrimento da estreptomicina, sendo seguida pela isoniazida e
demais drogas, formando o esquema terapêutico capaz de combater e eliminar a
doença (1, 3–5).
1.3. Epidemiologia da TB
A TB é um dos problemas de saúde pública mundial, sendo considerada
uma doença infecciosa oportunista (6–8). Em 1993, a World Health Organization
(WHO) a classificou como “grave doença pública emergente”, e começou a
monitorar a doença infectocontagiosa desde 1997, a qual atualmente está atrás da
Síndrome da Imunodeficiência Humana (SIDA, em inglês, Acquired
Immunodoficiency syndrome – AIDS).
Em 2013, foram registrados 9 milhões de novos casos de TB no mundo.
No mesmo ano, foram contabilizados 1.5 milhões de óbitos pela doença (7).
Contudo, esses 9 milhões não estão distribuídos de forma uniforme pelo mundo.
A TB apresenta maior incidência na Ásia e África Oriental (7). Atualmente, a TB
no Brasil não está eliminada e cresce entre os grupos de risco, como
penitenciários e usuários de drogas, os quais não possuem as mínimas condições
de vida. Entre eles há um maior desenvolvimento da doença na forma
extrapulmonar, cujas manifestações são mais intensas e de difícil
tratamento/diagnóstico (1,9,10). O Brasil está entre os 22 países que merecem
destaque nas medidas de controle da TB segundo a OMS, porque esse conjunto de
países é responsável por 82% dos casos mundiais (7). No Brasil, o estado de São
Paulo possui a maior quantidade de casos e a maior incidência ocorre no estado do
Rio de Janeiro. Com base nesses dados, o Ministério da Saúde, desde 2003 vem
aumentando os esforços no combate a TB no Brasil. Cerca de 57 milhões de
17
brasileiros estão infectados com Mtb, sendo que a ocorrência maior é no sexo
masculino e a faixa etária mais atingida é entre os 20 a 49 anos (10).
No período de 2007 a 2013 foram confirmados 4813 casos de TB com 225
óbitos por tuberculose no estado de Sergipe, sendo a maioria dos casos na capital
sergipana (53%), onde ocorre uma maior representatividade para o extrato etário
de 20 a 39 anos de idade (47%) e para o sexo masculino (68%). A forma clínica
mais frequente da TB foi a pulmonar (85%) e, dentre as extrapulmonares,
predominou a ganglionar periférica (3,4%), na qual a neurotuberculose (Ntb)
totalizou 29 casos registrados (0,6%) no estado de Sergipe (11).
Todos os dados armazenados sobre a TB e suas formas são organizados
por um programa desenvolvido pela Organização Mundial de Saúde (OMS, em
inglês World Health Organization – WHO) para o acompanhamento da TB.
Esse programa é denominado “Stop TB” e reúne um conjunto de estratégias para
o combate da TB, entre esses conjuntos existe o Directly Observed Treatment
Short Course – DOTS (7).
As estratégias são cinco elementos que, em conjunto, tem como objetivo
85% de sucesso no tratamento e 70% de detecção de novos casos. Os cincos
elementos são: 1. compromisso dos governos ao suporte financeiro das
atividades de controle da TB; 2. detecção de casos pela baciloscopia de escarro
entre pacientes sintomáticos que se apresentam espontaneamente ao serviço de
saúde; 3. suprimento regular de todos os medicamentos essenciais
antituberculose; 4. sistema padronizado de registro e notificação que permita
conclusões seguras sobre os resultados do tratamento para cada paciente e do
controle do programa de forma geral; 5. regime de tratamento padronizado de
seis a oito meses para todos os casos confirmados a partir de testes positivos de
secreção, com tratamento supervisionado (TS) pelo menos nos dois meses
iniciais (7). Esse plano foi proposto em 1993 e seus objetivos deveriam ser
atingidos em 2015, porém com o advento da AIDS, o aumento do consumo de
drogas, o surgimento de bacilos multidrogas resistentes, as imigrações de
populações, a anemia em crianças de alguns países essas metas foram passadas
para a próxima data limite, que será 2025 (7,12).
18
1.4. Agente patológico da TB, características e transmissão
A TB é causada por micobactéria do gênero Mycobacterium, a espécie
patogênica ao homem é a Mycobacterium tuberculosis (8). Os bacilos desse
gênero possuem formato de bastonete, são imóveis, não produzem toxinas, porém
são capazes de sobreviver no interior de células fagocitárias, sendo classificadas
como patógeno intracelular facultativo e aeróbico obrigatório estrito. A parede do
M. tuberculosis (Mtb) é constituída principalmente por ácidos micólicos,
formando uma barreira hidrofóbica permitindo a resistência à dessecação e à
descoloração por álcool e ácido, propriedade diagnóstica do bacilo, que é
classificado como Bacilo Álcool-Ácido Resistente (BAAR) (10).
A transmissão ocorre quando o paciente com a forma pulmonar ativa de
TB (bacilífero) tosse, espirra, ou fala lançando ao ar bacilos em partículas de
aerossóis. Essas gotículas contêm cerca de 1 a 10 bacilos que atingem os alvéolos
pulmonares (7). Grande parte das pessoas infectadas (80 a 90%) consegue
eliminar o bacilo sem manifestações clinicas da TB. Enquanto que cerca de 5 a
10% das pessoas infectadas não são capazes de impedir a infecção, resultando na
TB ativa (13,14). Os demais indivíduos infectados possuem um equilíbrio entre a
virulência do Mtb e a ativação da resposta imunológica do hospedeiro (inata e
adquirida), mantendo a TB de forma latente, na qual o patógeno é capaz de
permanecer vivo no granuloma formado (8,15,16).
1.5. Resposta imunológica contra o bacilo
A principal resposta imunológica contra o Mtb é a fagocitose (13),
promovida pela interação entre proteínas e derivados lipídicos, do Mtb, com os
receptores de superfície celular de fagócitos (principalmente Toll-Like receptor 2
– TLR2) (17,18). A resposta inicial ocorre em macrófagos, buscando a eliminação
do bacilo através da mudança de pH ácido, enzimas lesivas pela fusão do
lisossomo com o fagossoma e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (19–21).
O mecanismo de eliminação efetiva do bacilo é desencadeado pela apresentação
de antígenos, onde macrófagos ativados e infectados com Mtb ativam o início da
resposta imunológica específica. Dessa forma, desenvolve-se a imunidade celular
e também a imunidade humoral. No entanto, essa resposta pode não ser suficiente
19
para a eliminação do bacilo, pois os anticorpos específicos contra o bacilo não
conseguem entrar nas células infectadas para destruir o bacilo.
Outra falha na resposta que deve ser relatada são os vários mecanismos de
escape da resposta imunológica induzida pelo Mtb, dentre eles podemos
relacionar os seguintes: 1- inativação de enzimas lisossomais; 2- inibição da fusão
entre lisossomo e fagossoma, evitando o contato da bactéria com o ambiente
hostil do lisossomo; 3- alteração do pH ácido (19,22).
As células T CD4+ desempenham a principal função nessa resposta contra
a bactéria (23). Através do complexo principal de histocompatibilidade de classe
II (MHC II), as células apresentadoras de antígenos (APC‟s) como macrófagos e
células dendríticas apresentam antígenos do bacilo às células TCD4+, e também
produzem citocinas inflamatórias (por exemplo: TNF- IL-12, IL-6, e IL1) as
quais são capazes de recrutar neutrófilos e monócitos (16). Essa variedade de
células e citocinas são importantes para a formação do chamado granuloma ou
reação granulomatosa. A composição do granuloma (Fig. 1) é caracterizada pelo
infiltrado de macrófagos, neutrófilos e monócitos, com grande quantidade de
Linfócitos T e B que circundam o concentrado de macrófagos e células
dendríticas infectados com bacilos, além da presença de fibroblastos (17,24).
20
Figura 3: Esquema representativo da estrutura de um granuloma. Onde podemos perceber o bacilo
livre ou contido em células especilistas em apresentação de antígeno, como os macrófagos. Ao
redor existe grande quantidade de macrófagos epitelioides e linfócitos T e B, formando assim uma
reação granulomatosa. Fonte: Figura adaptada de Ramakrisnann, 2012 (24).
Em indivíduos imunossuprimidos a produção de citocinas pró
inflamatórias (principalmente IFN-γ e IL-12) é afetada por comprometimento das
funções dos Linf. T CD4+, resultando na má formação do granuloma e permitindo,
assim, que o bacilo infecte outros órgãos, tornando a TB extrapulmonar (25).
Dentre essas citocinas importantes para o combate ao bacilo, o TNF- é
primordial no controle do bacilo e manutenção do granuloma por regular
localmente a concentração de quimiocinas para o recrutamento de células, o que
impede reativação ou reinfecção da TB (17).
A IL-12 (produzida pelas APC‟s) e citocinas produzidas por linfócitos
ativados, como a IL-2, mantém a ativação e proliferação de linfócitos, induzindo a
resposta celular predominantemente pró-inflamatória. A IL-12 aumenta a
produção de INF- pelas células Natural Killer (NK) e a expansão de Th1
específicas a antígenos da micobactéria (18). Além disso, outras citocinas como
IL-23, IL-18 e IL-27 também induzem a produção de INF-γ (26,27). A produção
de IL-23 é essencial para a secreção de IL-17 (Th17), que é um potente indutor de
21
expressão de quimiocinas, que são substâncias capazes de causar a migração de
leucócitos do sangue para o local da inflamação (28).
Outro processo central para a defesa contra o Mtb é o de apresentação
cruzada, onde antígenos micobacterianos são secretados em vesículas apoptóticas,
associadas ao MHC classe I e, dessa forma, ativam células CD8+. Após a ativação,
as mesmas produzem INF- e liberam grânulos enzimáticos ricos em granulisina,
que ativam outras enzimas capazes de degradar lipídios e causar a lise celular por
apoptose (29). Além disso, na TB são também encontradas citocinas produzidas
por células Th2, como IL-4 e IL-10, que são supressoras da atividade Th1, assim
como IgE e IgG4 que tem o mesmo papel supressor (30). Além disso, existe na
TB a atuação de células T reguladoras (Treg), que regulam a resposta imunológica
do hospedeiro contra o Mtb através da produção de citocinas, como IL-4, IL-10 e
TGF-, com efeito supressor sobre a imunidade celular. Essas células podem
limitar a resposta imunológica eficaz, diminuindo a dano tecidual inflamatório,
mas por outro lado pode inibir a resposta Th1 impedindo o controle adequado da
infecção (13,16,20,31).
Os mecanismos imunológicos que ocorrem no combate da TB pulmonar
já são bem conhecidos, porém quando a doença atinge demais órgãos ainda há
uma grande interrogação, principalmente quanto as repostas imunológicas que
acontecem no Sistema Nervoso Central.
1.6. TB no Sistema Nervoso Central
As infecções bacterianas são processos dinâmicos influenciados por
múltiplas interações entre microrganismo e o sistema de defesa do hospedeiro. O
cérebro e a medula espinhal são protegidos de agentes infecciosos pelo tecido
ósseo do crânio e coluna vertebral, pelas meninges, pela barreira hemato-
encefálica (BHE) e pelas células do sistema imunológico como astrócitos e
células da micróglia (32). Além disso, quando o patógeno penetra o Sistema
Nervoso Central (SNC), mecanismos de defesa do hospedeiro são ativados para
controlar a infecção (8,32). A TB no SNC, conhecida como Neurotuberculose
(Ntb), geralmente deve-se à infecção inicial nos pulmões ou em outros órgãos, e a
disseminação para o SNC geralmente ocorre pela circulação sanguínea (6,32–35).
A Ntb é a forma mais grave de infecção pelo M. tuberculosis em humanos e, afeta
22
crianças predominantemente, levando ao óbito mais de 50% dos casos e deixando
sequelas neurológicas graves nos sobreviventes (36,37). Pacientes coinfectados
com TB-AIDS possuem grandes possibilidades de desenvolver a Ntb,
apresentando hidrocefalia e pequenos tubérculos nas meninges, no cérebro,
medula espinhal ou no plexo coroide, chamados de tuberculomas (33). Pacientes
com Ntb apresentam um quadro de cefaléias, vômitos, febre, convulsões e
sonolencia, dentre outros sintomas (14,35). A disseminação micobacteriana ocorre
através da quebra da BHE, possivelmente via plexo-coroide (38,39). Essa
disseminação pode ser facilitada com a ativação de mecanismos inflamatórios do
organismo, como a produção de TNF-α e IL-1 que parecem facilitar o transporte
de compostos para o encéfalo pela abertura da BHE (32,40). O resultado da
resposta inflamatória altera a permeabilidade da BHE, como consequência ocorre
a formação do edema cerebral, produção de exsudato inflamatório, interferindo a
dinâmica do líquido cefalorraquidiano (LCR) (32).
Vários trabalhos têm demonstrado a relação do SNC com sistema
imunológico (SI), revelando novas e valiosas descobertas. Estudos recentes vêm
desmistificando a função imunológica nesse tecido. Com grande quantidade de
APC‟s residentes mantendo a vigilância imunológica, quebrando a ideia de ser um
local imunoprivilegiado, onde os antígenos que atingissem o parênquima cerebral
não eram detectados e dificultavam uma resposta imunológica adaptativa.
Acreditava-se também que a anatomia e histologia do SNC não permitissem esse
tipo de resposta, visto que a existência da BHE restringia acesso de certas
substâncias e grandes moléculas (incluindo células do SI) da corrente sanguínea
até o encéfalo, onde o parênquima estaria protegido apenas pela micróglia (células
do SNC com atividade fagocitária) e que o LCR exerceria função similar a linfa
no organismo (41).
Nesse contexto as células da micróglia podem produzir IFNγ (42–44),
expressar moléculas acessórias (MCH II), CD 40 e outras moléculas
coestimuladoras, mas possuem baixa atividade de apresentação antigênica. Além
da micróglia parenquimal, outras células como as células dendríticas, macrófagos
meníngeos perivasculares e do plexo coroide e células epiplexas de Kolmer,
exercem funções de apresentação de antígeno, principalmente, aos linfócitos que
se encontram nos ventrículos (45–48).
23
O LCR surpreende no aspecto das células que o compõem, pois
inicialmente era considerado um líquido viscoso que mantinha o equilíbrio iônico,
porém com esses estudos tem se observado a existência de células T (90%)
havendo mais células com fenótipo TCD4+ (proporção de 3,5 para 1 TCD8
+),
células B (5%), monócitos (menor que 1%) (49–51). As células TCD4+ do SNC
têm características de memória, assim como células T efetoras (46,52), pois elas
apresentam fenótipo positivo para α4-integrina, que promove o tráfego de
linfócitos (53). Eles podem também expressar receptores, tal como CCR7 e a
molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), que promovem o recrutamento
de linfócitos para o tecido inflamado (49,53).
Apesar da gravidade da apresentação clínica, os mecanismos celulares e
moleculares envolvidos na patogênese da Ntb ainda são pouco compreendidos.
Além disso, não há modelo experimental tão próximo da infecção em humanos.
Por isso, o desenvolvimento de modelos experimentais de Ntb possibilitará o
estudo da expressão de fatores envolvidos na fisiopatologia da doença no SNC,
permitindo a avaliação de mecanismos celulares e moleculares da doença, como a
identificação de riscos para um possível modelo de tratamento para a Ntb.
24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver um modelo experimental de Meningite Tuberculosa.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.a. Verificar a viabilidade da cepa laboratorial (H37Rv) no órgão comum
de infecção do bacilo (pulmão).
2.2.b. Analisar a existência de uma ligação entre o sistema respiratório e o
sistema nervoso central.
2.2.c. Aplicar a infecção de bacilos da cepa laboratorial de Mycobacterium
tuberculosis (H37Rv) usada na indução via intracerebroventricular pelo
procedimento de estereotaxia.
2.2.d. Confirmar a resposta inflamatória formada em resposta ao bacilo
Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) no parênquima cerebral de camundongos
infectados.
25
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos C57Bl/6 machos de 5 a 8 semanas de idade
e pesando entre 20 e 30 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus de
Ribeirão Preto – USP. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento
de Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP (FMRP –
USP) com regime livre de comida e água, com ciclos de claro/escuro de
12:00h/12:00h (claro das 6:00h às 18:00h) e à temperatura de 21 ± 1ºC. Os
animais tiveram uma semana de aclimatação ao biotério onde foram mantidos
durante o experimento.
26
3.2 Delineamento Experimental
Figura 4: Esquema representativo do delineamento experimental.
27
3.3. Infecção Induzida por Estereotaxia com Microinjeção
Todos os procedimentos de infecção dos camundongos com a cepa
laboratorial (H37Rv) de Mtb foram realizados no biotério, com o nível de
segurança necessário (nível 3 de biossegurança) e com capela de fluxo laminar
ligada. Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal
(1mL/100g de peso corporal) de cetamina (80mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg)
diluídas em solução salina isotônica (NaCl 0,15M). Com a intenção de reduzir os
riscos de infecção, antes do início da cirurgia, os camundongos foram submetidos
à tricotomia da região dorsal da cabeça. Posteriormente, para a realização da
cirurgia, os animais foram posicionados com a cabeça fixada pelas barras
auriculares do aparelho esterotáxico (Insight) e receberam analgésico via
subcutânea (Babamine® injetável pet – flunixina-meglumina – 1,1mg/Kg –
Schering).
Logo após a assepsia da pele com solução de álcool iodado, por via
subcutânea foi aplicada lidocaína contendo vasoconstritor (norepinefrina 2%) para
evitar sangramento durante o procedimento estereotáxico. Feito isto, foi realizada
a incisão longitudinal para expor a calota craniana. Utilizou-se peróxido de
hidrogênio (H2O2 – 10V) para melhor visualização das suturas do tecido ósseo. A
torre do aparelho estereotáxico foi posicionada no ângulo zero e tendo como
referência inicial o bregma. A partir dessas coordenadas, foi definido o ponto da
microinjeção que atingiria o ventrículo lateral direito do cérebro do animal. O
local exato da microinjeção foi obtido com o auxílio do atlas de Paxinos e Watson
(49), que definiu as seguintes subtrações a partir do ponto do bregma: -0,4mm
anteroposterior; -1,0mm latero-lateral; -2,1mm dorsoventral. Com as coordenadas
da microinjeção estabelecidas, realizou-se a trepanação da calota craniana
utilizando broca odontológica esférica acoplada a um motor. Anteriormente as
infecções, foi realizado o mesmo procedimento descrito acima, porem com a
utilização do corante com o objetivo de verificar a localização das coordenadas.
Na figura 3 percebemos que o local da aplicação da microinjeção, mostrando
a ocupação dos espaços ventriculares do Sistema Nervosos Central (SNC).
Através do orifício feito, foi micro injetada, no ventrículo lateral direito do
cérebro dos animais, solução contendo as concentrações pré-determinadas de Mtb
para cada grupo experimental. Terminada a aplicação da microinjeções, os
28
animais foram suturados com monofilamento de Nylon. Durante a recuperação da
anestesia, independentemente do grupo, os animais foram mantidos em sala do
Biotério do Departamento de Imunologia Pura e Aplicada (nível 3 de
biossegurança) da FMRP-USP com atmosfera e temperatura controladas.
A concentração de bacilos utilizada na infecção foi controlada através do
plaqueamento das soluções em Placas de Petri contendo meio de cultura 7H11, o
meio de cultura utilizado para o desenvolvimento do Mtb. Transcorridas quatro
semanas de incubação, fez-se a determinação de unidades formadoras de colônias
(CFU) nas placas.
Figura 3: Secção cerebral (controle do processo estereotáxico)
mostrando os ventrículos cerebrais ocupados por corante (Azul
de Metileno) proveniente de microinjeção
intracerebroventricular durante a cirurgia estereotáxica. Esse
procedimento foi realizado para confirmar que as coordenadas
estereotáxicas usadas para infectar os camundongos estavam
corretas
3.4. Infecção Pulmonar
A infecção pulmonar foi realizada na capela de fluxo no biotério do
Departamento de Imunologia Pura e Aplicada (nível de segurança 3) da
FMRP/USP. Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal
(1mL/100g de peso corporal) de cetamina (80mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg)
diluídas em solução salina isotônica (NaCl 0,15M), fixados com o abdômen
29
voltado para cima e a região da traqueia em evidência. Foi feita uma pequena
incisão e exposta a traqueia, onde foi inoculada a solução com o bacilo. Após esse
procedimento verificou se o animal respirava normalmente e em seguida realizada
pequena sutura com monofilamento de Nylon e o restabelecimento do animal
aconteceu no biotério.
3.5. Coleta dos Tecidos
Quatro semanas após a infecção, os animais foram anestesiados e
sacrificados. Foram coletados os órgãos (cérebro e pulmão). De maneira aleatória,
foram selecionados animais cujos tecidos destinaram-se ao processamento para
análise morfológica ou para a contagem de unidades formadoras de colônias
(CFU).
3.6. Contagem de Colônias
Após a retirada cautelosa e a seleção aleatória, os órgãos foram colocados
em Placas de Petri contendo solução de PBS. Cada órgão coletado foi separado e
colocado em placas identificadas. Os órgãos foram macerados e submetidos à
digestão com liberase. Feito este procedimento, iniciou-se o plaqueamento, onde
foram pipetados 100μL da solução formada (tecido junto solução com enzima). A
primeira diluição (1:100 ou 102) foi seguida das demais (1:1000 ou 10
3; 1:10000 ou
104; 1:100000 ou 10
5) nos compartimentos identificados da Placa de Petri contendo
o meio de cultura 7H11, próprio para as culturas com Mycobacterium tuberculosis.
Feito o plaqueamento do tecido de cada animal de maneira isolada, as placas foram
incubadas em estufa (37ºC) durante quatro semanas para o crescimento das
colônias. Passado esse período de incubação (quatro semanas), foram contadas as
unidades de colônias formadas. Para definir o valor preciso, fez-se cálculo simples
através da seguinte regra: R = a x 10b CFU/mL. Onde: R = resultado final; a = o
resultado da contagem; b = expoente da diluição mediante a qual obteve-se o
resultado de a (1:100 ou 102; 1:1000 ou 10
3; 1:10000 ou 10
4; 1:100000 ou 10
5);
CFU = Unidade Formadora de Colônias.
3.7. Processamento Tecidual para a Histologia
Após a dissecção, os tecidos determinados para análise histológica passaram
pela fixação em formol tamponado 10%. Posteriormente, os tecidos foram
desidratados em diferentes concentrações de etanol, diafanizados em xileno e
emblocados em parafina. Os cérebros e pulmões passaram por processamento com
tempos de banho diferentes (protocolos em anexo)
30
3.8. Microtomia
Os tecidos incluídos em parafina (cérebro e pulmão) foram cortados a 5μm
com auxílio do micrótomo histológico (Lupetec MRP-09). Foram realizados cortes
seriados para analisar a morfologia dos tecidos e caracterizá-los quanto à presença
ou ausência do bacilo (Mycobacterium tuberculosis) através das colorações
Hematoxilina-Eosina e Ziehl Neelsen, respectivamente. Na histologia, utilizou-se
lâminas de vidro sem a presença de gelatina ou silano.
O cérebro foi incluído dividindo-o através de um corte transversal,
separando-o em duas porções: anterior e posterior. Cada lâmina contempla dois
cortes de cérebro, tendo como primeiro corte a parte da porção anterior e o segundo
a parte da porção posterior. Esse procedimento foi realizado para possibilitar uma
melhor avaliação das regiões periventriculares, onde foi provocada a infecção
inicial pelo bacilo. O pulmão foi incluído de forma a obter-se um corte com maior
área possível para análise histológica.
3.9. Análise morfológica
As lâminas obtidas contendo os cortes histológicos (5 um) foram coradas
com hematoxilina e eosina (HE), a qual permite identificar o tipo de tecido, o
formato e a organização das células, uma vez que essa técnica cora o núcleo
(hematoxilina) e o citoplasma (eosina) celulares. Também foi realizada a técnica de
coloração conhecida como Ziehl Neelsen, específica para identificar as bactérias
classificadas como BAAR (bacilos álcool-ácido resistentes) e, neste caso, detectar
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) nos tecidos analisados. Esta técnica é realizada
através da coloração das bactérias com fucsina básica e, em seguida, descora-se o
tecido com álcool-ácido, sendo que a constituição da parede bacteriana não permite
sua descoloração, tornando perceptível a visualização da bactéria no tecido contra
corado com o azul de metileno, que é absorvido pelos constituintes celulares e por
outras estruturas.
3.10. Descartes
Após a coleta dos tecidos, as carcaças dos animais foram depositadas em
sacos plásticos apropriados e destinados ao tratamento específico para resíduos
infectantes. Esse processo ocorreu no Centro de Pesquisa em Tuberculose da
FMRP-USP.
31
Os resíduos perfuro cortantes foram armazenados em caixas adequadas para
posterior descarte. Os resíduos líquidos, provenientes das etapas de processamento
tecidual e colorações, foram coletados e armazenados em vasilhames específicos e
destinados à coleta seletiva do Campus São Cristóvão da Universidade Federal de
Sergipe (UFS) onde ocorreu o processamento tecidual.
3.11. Aquisição e Análise das Imagens
Com as lâminas coradas, as imagens foram capturadas usando o
microscópio óptico acoplado a um computador com o programa de captura e
análise de imagens LAS (Leica). As fotos micrografias obtidas abrangeram todo o
tecido (cérebro e pulmão) do animal, considerando o intervalo de 50μm de
distância entre os cortes seriados. As imagens foram analisadas sem a interferência
do conhecimento de cada grupo (duplo-cego).
3.12. Análise Estatística
Os resultados dos experimentos serão expressos com média ± erro padrão da
média e submetidos ao Test T, utilizando o programa computacional GraphPad
Prism® (GraphPad Software, Inc., USA).
32
4. RESULTADOS
4.1. a. Viabilização da infecção intratraqueal
A verificação da infecção foi realizada através do procedimento de infecção
intratraqueal com a cepa H37Rv e com a mesma concentração (1x105 CFU/mL) no
órgão alvo de desenvolvimento da tuberculose (TB) e controle de infecção pelo
procedimento de estereotaxia com solução salina (PBS).
O gráfico a seguir possui no eixo das abscissas os grupos que foram feitas as
contagens de colônias, e no eixo das ordenadas está indicando a quantidade de
unidades que foram resultado da fórmula matemática que resulta em Log10 por
grama de tecido analisado.
Com resultado da análise quantitativa vemos que nos pulmões dos animais
infectados intratraquealmente (controle positivo), houve a formação de 106
Log10
CFU de colônias por grama de pulmão, enquanto que no grupo que recebeu solução
salina por meio da estereotaxia não apresentaram o desenvolvimento de colônias.
Mostrando a eficácia da cepa utilizada, sendo considerado o controle
positivo da infecção (H37Rv – Pulmão) e do controle negativo da infecção (PBS –
SNC).
33
Figura 4: Contagem das unidades formadoras de colônias em pulmão dos
grupos controles. Camundongos machos C57Bl que foram infectados com
bacilos da cepa H37Rv via intratraqueal 1x105 CFU/mL (H37Rv – Pulmão) e
solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após um intervalo de 4
semanas foi realizada a determinação das Unidades Formadoras de Colônias
(p<0,001).
Nas imagens de análise histológica dos mesmos grupos, conseguimos
visualizar a preservação do tecido funcional do pulmão, alvéolos e brônquios e
bronquíolos. Essa preservação mostra que o grupo PBS – SNC não indica sinais de
infecção no pulmão, pois o tecido não apresentou modificação significativa dos
espaços alveolares (Figura 5).
34
Figura 5: Caracterização morfologia de pulmão de camundongos do grupo controle (PBS –
SNC). A. Após quatro semanas do procedimento de estereotaxia com solução salina, a histologia
mostra a preservação do tecido. B. Na imagem é possível perceber as estruturas funcionais do
pulmão, principalmente os alvéolos pulmonares e vasos sanguíneos com células sanguíneas também
está preservado. Legenda: EA: espaços alveolares; seta: vaso sanguíneo congesto. Aumento: A.:
40x; B. 400x. HE.
Os pulmões dos animais infectados intratraqueal (H37Rv – pulmão) com a
cepa laboratorial de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) demonstraram resposta
inflamatória. Principalmente com a redução dos espaços alveolares, devido a
aglomeração de macrófagos alveolares e espessamento dos brônquios, além de
aumento da concentração de células com características inflamatórias e de células
sanguíneas dispersas no tecido (Figura 6).
35
Figura 6: A caracterização morfológica de pulmão murino no grupo controle da infecção (H37Rv-
Pulmão). A. O pulmão apresentou aumento do número de células devido ao processo inflamatório, com
as estruturas funcionais danificadas. B. A diminuição dos espaços alveolares devido ao recrutamento de
células inflamatórias para o sítio da infecção; estas células são caracterizadas com a morfologia
evidenciando grande quantidade de citoplasma e núcleo central, além de vasos sanguíneos com os
glóbulos vermelhos e células pequenas sem citoplasma e núcleo visível. Legenda: EA: espaço alveolar;
VS: vaso sanguíneo; círculos: células com características morfológicas de resposta imunológica; seta:
eritrócitos. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.
4.2.b. Desenvolvimento de Neurotuberculose por infecção pulmonar
A Figura 7, representa um gráfico de contagem de CFU, onde avaliamos a
formação de colônias nos cérebros dos animais que foram infectados via
intratraqueal (H37Rv – Pulmão) e dos animais que passaram pelo procedimento
estereotaxia com solução salina (PBS – SNC).
Concluímos que houve a formação de colônias no tecido nervoso do grupo
classificado como H37Rv – Pulmão, apesar de pouca concentração (102 CFU/g de
tecido nervoso), enquanto que no tecido nervoso dos animais do grupo controle
negativo (PBS – SNC) não apresentaram a formação de colônias.
36
Figura 7: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido nervoso
dos grupos controles. Camundongos machos C57Bl que foram infectados com
bacilos da cepa H37Rv via intratraqueal 1x105 CFU/mL (H37Rv – Pulmão) e
solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após um intervalo de 4
semanas foi realizada a determinação das Unidades Formadoras de Colônias
(p<0,001).
Nas análises morfológicas entre os tecidos dos animais dos grupos H37Rv-
Pulmão e PBS – SNC podemos comparar a preservação do tecido nervoso no grupo
com a infecção pelo procedimento de estereotaxia com a solução salina (PBS – SNC)
(Figura 8) em comparação com as imagens da Figura 9, que representa o tecido
nervoso dos animais que foram infectados pela via traqueal com solução contendo
105 CFU/mL de M. tuberculosis (H37Rv – Pulmão).
A preservação do tecido cerebral no grupo que recebeu solução salina (PBS –
SNC) é perceptível nas figuras 8 (A e B) observando os pericários (corpo celular dos
neurônios) no córtex cerebral (CC) assim como as células ependimárias (EC),
organizadas em epitélio cúbico simples, que são responsáveis por revestir os
ventrículos cerebrais (VS). Em maior aumento (Fig. 8B) é possível visualizar células
com morfologia características das células da micróglia, além dos cílios das células
ependimárias, que são responsáveis por facilitar a movimentação do líquido
cefalorraquidiano (LCR).
37
Figura 8: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo controle negativo (PBS –
SNC). A. Os animais que receberam micro injeção intracerebroventricular com PBS não apresentou
alterações morfológicas após as quatro semanas da infecção. B. Pode ser observado a preservação das
células ependimárias, pericários e células da micróglia. Em maior aumento, os cílios das células
ependimárias podem ser notados, que são características destas células. Legenda: CE: células
ependimárias; EV: espaço ventricular; CC: córtex cerebral. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.
Ao analisar morfologicamente o cérebro dos animais que receberam 105
CFU/mL do bacilo via intratraqueal, podemos perceber que no parênquima cerebral
apresentou sinais de edema, tais como o extravasamento de células sanguíneas e
líquidos pelos vasos sanguíneos, caracterizados pelos espaçamentos no parênquima,
além da presença de vasos sanguíneos sem a delimitação (Figuras 9 A e B).
38
Figura 9: A caracterização morfológica de cérebro murino do grupo que recebeu infecção
intratraqueal (105 CFU/mL de M. tuberculosis) (H37Rv – Pulmão). A. Apresentaram alterações
morfológicas após as quatro semanas da infecção como a ausência de tecido pertencente à pia-máter. B.
Pode ser observado a presença de células sanguíneas dispersas no córtex cerebral, bem como espaços
próximos a uma estrutura de vascularização destruída por edema. Legenda: ES: espaço subaracnóide;
CC: córtex cerebral; seta: eritrócitos dispersos no parênquima. Aumento: A.: 40x; B. 400x. HE.
4.3.c. Infecção diretamente no Sistema Nervoso Central
Após as verificações anteriores, as infecções com a cepa virulenta (H37Rv)
ocorreram diretamente no ventrículo lateral do cérebro, por meio do procedimento de
estereotaxia. Tendo como controle negativo a solução salina diretamente no ventrículo
lateral, com as mesmas coordenadas.
Com os procedimentos estereotáxicos realizados, com um grupo de animais
infectados diretamente no ventrículo cerebral (H37Rv – SNC) com 105CFU/mL de
M.
tuberculosis; e outro grupo, que também passou pelo mesmo procedimento, porém com
a aplicação de solução salina, foi realizada a contagem de colônias a partir do pulmão
desses animais. Onde foi confirmado mais uma vez que o grupo denominado PBS –
SNC não desenvolveu colônias, porém o grupo infectado diretamente no cérebro
desenvolveu cerca de 104Log10 por grama de pulmão (Figura 10).
39
Figura 10: Contagem das unidades formadoras de colônias no pulmão do
grupo controle (PBS – SNC) e grupo infectado (H37Rv – SNC).
Camundongos machos C57Bl que foram infectados com bacilos da cepa
H37Rv via intracerebroventricular com 1x105 CFU/mL (H37Rv – SNC) e
solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após um intervalo de 4
semanas foi realizada a determinação das Unidades Formadoras de Colônias
(p<0,001).
Ao avaliar a formação de colônias no tecido nervoso, após quatro semanas
da infecção, tendo como controle negativo (PBS – SNC) e grupo experimental que
passou pelo procedimento estereotáxico com a solução contendo a concentração de
105
CFU/mL de bacilos da cepa H37Rv. Com os dados plotados no gráfico,
verificou-se que houve a formação de 106
CFU Log10 por grama de tecido nervoso
dos animais que foram infectados com os bacilos, além disso o grupo controle
negativo (PBS – SNC) não houve o desenvolvimento de colônias (Figura 11).
40
Figura 11: Contagem das unidades formadoras de colônias no tecido
nervoso do grupo controle (PBS - SNC) e grupo infectado (H37Rv -
SNC). Camundongos machos C57Bl que foram infectados com bacilos da
cepa virulenta H37Rv via intracerebroventricular com 1x105 CFU/mL
(H37Rv – SNC) e solução salina nos ventrículos cerebrais (PBS - SNC), após
um intervalo de 4 semanas foi realizada a determinação das Unidades
Formadoras de Colônias (p<0,001).
O tecido nervoso que recebeu PBS, como já dito anteriormente, indica a
preservação da morfologia tecidual pelos seguintes fatos: o tecido (epitélio cúbico
simples) que reveste o plexo coroide está intacto, cílios nas células ependimárias,
no parênquima cerebral é notável a existência de micróglia além de pericários, parte
visível dos neurônios (Figura 8).
No grupo de animais infectados com o bacilo pela microinjeção
intracerebroventricular (H37Rv – SNC), mostrou alteração na morfologia do tecido
de revestimento dos ventrículos, assim como no parênquima cerebral. Próximo ao
local da infecção, o tecido de revestimento apresentou a proliferação de células de
caráter inflamatório (Figura 12A). Além de sinais clássicos de edema,
principalmente a existência de espaços no tecido e células sanguíneas dispersas no
tecido (Figura 12B).
41
Figura 12: Caracterização morfológica de cérebro murino infectados intracerebroventricular
(H37Rv – SNC). A. Os animais que receberam micro injeção intracerebroventricular (H37Rv – SNC),
que mostra a mudança morfológica no plexo coroide, (B) em destaque é percebida a presença de
células fagocitárias e células vermelhas do sangue, o que indica uma maior intensidade da inflamação.
Legenda: EV: espaço ventricular; CC: córtex cerebral; PC: plexo coroide; seta: eritrócitos dispersos
no parênquima. Aumento da Objetiva: A: 40x; B: 400x. HE.
4.4.d. Confirmação da presença do bacilo M. tuberculosis no cérebro
Os tecidos nervosos infectados via intracerebroventricular (H37Rv – SNC)
foram analisados quanto a presença do bacilo nas imagens coradas por Ziehl-
Neelsen.
As analises foram feitas em lâminas que não tinham a preservação
morfológica, e a Figura 13(A) mostra os ventrículos cerebrais e região do
parênquima. Na histologia sem inflamação, o tecido que reveste os ventrículos é
cúbico e densamente compacto, chamado de células ependimárias, o epitélio da
imagem apresenta sinais de inflamação, como a aumento das camadas do epitélio de
revestimento dos ventrículos e ligeira ocupação do espaço ventricular. Os demais
sinais de inflamação foram vistos em lâminas anteriores e posteriores do tecido
correspondente.
Em maior aumento (Figura 13B) foi analisado a região que apresentou sinais
de inflamação, pode-se encontrar os bacilos. Os mesmos foram encontrados
42
formando um aglomerado (típico do bacilo) envolto por células, mas também
percebemos alguns dispersos no tecido de células ependimárias.
Figura 13: Tecido cerebral de animal que recebeu microinjeções
intracerebroventricular de 1x105 CFU/mL da cepa H37Rv em um intervalo de 4
semanas de infecção. A. Epitélio de revestimento dos ventrículos do SNC, assim como os
espaços ventriculares e pericários. B. Em maior aumento é possível identificar aglomerados
de bacilos entre as células do tecido de revestimento do ventrículo cerebral. Legenda: EV:
espaços ventriculares; P: pericários; Círculos: Aglomerados de bacilos. Objetivas: A: 40x;
B: 1000x. Coloração: ZN.
B
A
43
5. DISCUSSÃO
O Sistema Imunológico (SI) do Sistema Nervoso Central (SNC) possui
ferramentas de defesa que são ativados quando o patógeno atinge o SNC (14,32). A
Neurotuberculose (Ntb) é o acometimento do SNC pela reação inflamatória
desencadeada nesse sistema em resposta ao Mycobacterium tuberculosis, que
compromete a funcionalidade devido ao desenvolvimento da doença que apresenta
diversos sintomas, variando de febre a convulsões (14). Quando as células do SI são
ativadas, produzem citocinas e secretam diversos fatores pró-inflamatórios e tóxicos
desencadeando uma resposta específica, voltada para a eliminação do bacilo por
meio da formação de granuloma (33).
A importância do estabelecimento de um modelo experimental mais próximo
da fisiopatologia é devido à falta de detalhamento da patologia, pois é uma doença
que apresenta sintomas diversos levando o paciente a óbito em um curto espaço de
tempo (14). Com base na literatura é sabido que pacientes com imunossupressão e
tuberculose possuem grandes possibilidades de desenvolver a forma extrapulmonar
da doença, como objetivo do estudo a Ntb. Na maioria das vezes, a doença se
desenvolve quando o bacilo consegue atravessar a barreira hemato-encefálica
(BHE) pela resposta inflamatória que produziu TNF-α e IL-1 em resposta a
interação das proteínas próprias do bacilo com os receptores das células
apresentadoras de antígenos (APC‟s), permitindo que o bacilo atinja o parênquima
cerebral, ou seja, levado até os ventrículos cerebrais pelo líquido cefalorraquidiano
(LCR) (8,14,32,33,40,48,54).
Para o delineamento desse modelo experimental, o modo de infecção, a
concentração e o intervalo de tempo entre a infecção com o bacilo e o sacrifício dos
animais desafiados foram estabelecidas seguindo o estudo de Zucchi (2007) (8),
utilizou as concentrações de 102
CFU/mL, 103
CFU/mL e 104
CFU/mL da mesma
cepa utilizada nesse trabalho (H37Rv), com intervalos de pós-infecção de 1, 2, 4 e 8
semanas para as diferentes concentrações de infecção. Onde concluiu que para o
modelo murino de TB em cerebelo, a concentração que apresentou resultado
satisfatório foi de 104
CFU/mL, após de 4 semanas. Dessa forma, optamos por
manter o procedimento de infecção, período de pós-infecção e variar a concentração
para 105
CFU/mL. Com o intuito de melhorar os resultados, a indução realizada no
presente trabalho foi diretamente nos ventrículos cerebrais (Figura 3), onde está
44
situado grande quantidade do LCR, que possui constante renovação, reveste todos
os órgãos do SNC, ocupa também os espaços aracnoide e circula pela coluna
vertebral estendendo a funcionalidade até a medula espinhal. Além de possuir
grande abrangência física, LCR apresenta grande quantidade e variedade de células
do SI, como os linfócitos T com fenótipo T CD4+, que possuem maior eficiência em
combater os antígenos do bacilo que foram fagocitados devido à ligação das
proteínas e derivados lipídicos próprios do Mtb com os receptores de superfície das
APC‟s (55).
Autores apontam que o desenvolvimento da doença no SNC está ligada a
falhas na resposta imunológica contra a TB pulmonar ativa (6,14,56). Em Tsenova
(2002) (57) indica que a resposta inflamatória no SNC é capaz de alterar a
conformação da BHE. Dados do trabalho apontam que depois de 14 dias após o
início da infecção é possível que bacilo atinja outros órgãos (pulmão e baço). Os
nossos resultados mostraram que com o intervalo de quatro semanas após a infecção
houve desenvolvimento de colônias no pulmão (Figura 4), em menor quantidade
quando comparado a quantidade de colônias que foram formadas com a indução
intratraqueal (Figura 10). As análises histológicas confirmam o resultado da CFU,
indicando que houve reação de inflamação nos pulmões (Figura 6A a 6B) dos
animais que receberam a infecção por meio de microinjeções
intracerebroventriculares. Indicando que a Ntb possa desenvolver pela falta da
integridade da BHE e que o LCR possui um papel importante no recrutamento de
células do SI para o local da infecção, devido a apresentação de antígenos solúveis
aos linfonodos cervicais (39,41,58).
A contagem de CFU no órgão alvo da fisiopatologia em questão (Figura 11)
deixa evidente que após as quatro semanas a concentração do bacilo indica que a
Ntb foi desenvolvida no grupo que recebeu a concentração de 105
CFU/mL do
bacilo Mycobacterium tuberculosis da cepa laboratorial (H37Rv), diferenciando o
grupo induzido com solução salina (PBS), onde as análises morfológicas não
apontaram reação inflamatória (Figuras 5A e 5B) e também não apresentou colônias
determinadas pela CFU (Figura 4).
Quanto aos resultados da análise histológica, no cérebro podemos perceber
que houve a formação de exsudato inflamatório pela presença de espaços entre os
elementos teciduais, antes ocupado pelo líquido extravasado dos vasos sanguíneos,
com alto teor de água, além de características de necrose caseosa que altera a
45
organização morfológica do tecido inflamado (Figuras 12A e 12B) quando
comparado ao tecido não inflamado (Figuras 8A e 8B) (59). Nos pulmões de
animais infectados intratraquealmente (Figuras 6A e 6B) o tecido apresenta aspecto
de inflamação, pois analisando encontra-se granulomas com macrófagos rodeado
por camadas distintas de tecido conjuntivo englobados por linfócitos. Esses dados
da histologia da TB pulmonar também foram verificados no trabalho de Cyktor
(2013) (59) onde o mesmo acrescenta dizendo que a interleucina-10 (IL-10) é de
fundamental importância para a formação e manutenção do granuloma, resposta que
mantem o bacilo vivo, porém preso entre linfócitos T e B, macrófagos (59).
Os animais que foram desafiados diretamente no SNC com o bacilo (105
CFU/mL) apresentaram lesão tecidual intensa no cérebro, bem como resposta
inflamatória. Isso foi observado infiltrado linfocitário presente nas figuras 12A e
12B, além dos sinais de edema serem mais presentes quando comparado ao cérebro
dos animais que foram infectados via traqueia (Figuras 9A e 9B). O pulmão
também apresentou a resposta inflamatória condizente com o local da indução, pois
as figuras 6A e 6B (H37Rv – Pulmão) mostraram comprometimento dos espaços
alveolares devido a resposta inflamatória quando comparado as figuras 5A e 5B
(PBS – SNC), já que na resposta inflamatória típica da TB, esses espaços alveolares
apresentariam mais células do SI (macrófagos alveolares, neutrófilos), a lesão
tecidual com a troca do tecido funcional pelo tecido conjuntivo como o de
calcificação e de necrose, essa formação é característica de granuloma. Vale
ressaltar que em modelos murino a estrutura do granuloma é diferente da estrutura
do granuloma em humanos (Figura 1). O estudo de Yoshida (2010) (60) afirma que
a formação do granuloma é dependente de citocinas inflamatórias, além da IL-10
(59) e que o recrutamento de células T para a formação do granuloma é dependente
da IL-17, que induz a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e LFA-1)
aumentando ainda mais a concentração de células T para o sítio de infecção (60).
Mantendo o bacilo envolto por esses linfócitos que foram recrutados e produzem e
liberam citocinas que tem como função recrutar outros linfócitos e modular a
resposta com as citocinas do perfil Th17 (60).
Porém, é evidente que para compreender melhor a fisiopatologia da Ntb é
necessário restringir a infecção no SNC. Mesmo que resultados similares ao
presente trabalho tenham sido observados em outros trabalhos com objetivos
similares, como o citado anteriormente (57), o detalhamento pode ser atingindo com
46
a determinação de citocinas e células do SI envolvidas na fisiopatologia, pois nos
resultados podemos perceber que a quantidade de células nos tecidos infectados
aumentou significativamente, porém ainda não se pode determinar o tipo celular
presente no infiltrado inflamatório observado nas figuras. A TB pulmonar ainda
apresenta muitas falhas no diagnóstico, tratamento e controle da doença. Quando
tratamos da Ntb, esse quadro é agravado em diversos fatores, sendo um grande
passo o desenvolvimento de modelos experimentais mais próximos dos sinais e
sintomas da doença em humanos, para que haja elucidação dos mecanismos
fisiopatológicos da Ntb e eventos moleculares envolvidos nas lesões, permitindo
que no futuro haja o estabelecimento de esquemas terapêuticos, drogas e vacinas
voltados a essa patologia que atinge paciente com imunossupressão ou com fatores
sociais que levam a complicações da TB pulmonar em TB miliar, classe da Ntb.
Com os resultados apresentados, é possível afirmar que no presente trabalho
desenvolvemos um modelo experimental de Neurotuberculose (Ntb). A infecção foi
realizada utilizando o método de estereotaxia com a cepa laboratorial (H37Rv) do
bacilo Mycobacterium tuberculosis. As análises quantitativas ocorreram por
determinação da contagem de colônias (CFU), sendo que a contagem aconteceu
após quatro semanas do tempo de infecção.
47
6. CONCLUSÃO
a. Eficácia do controle negativo (PBS – SNC), do controle positivo (H37Rv –
Pulmão);
b. Em modelo murino é possível desenvolver a neurotuberculose após uma infecção
intratraqueal;
c. O tecido nervoso apresentou características de infecção causada pelo bacilo,
quando infectado diretamente no SNC;
d. Após o intervalo da infecção (4 semanas), confirmando o resultado quantitativo,
foram encontrados M. tuberculosis no tecido nervoso central.
Com os resultados apresentados, é possível afirmar que no presente trabalho
desenvolvemos um modelo experimental de Neurotuberculose (Ntb). A infecção foi
realizada utilizando o método de estereotaxia com a cepa laboratorial (H37Rv) do
bacilo Mycobacterium tuberculosis. As análises quantitativas ocorreram por
determinação da contagem de colônias (CFU), sendo que a contagem aconteceu após
quatro semanas do tempo de infecção, juntamente com as análises qualitativas, por
comparação morfológica dos tecidos.
48
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53
8. ANEXOS
A. Processamento do cérebro
Tirar os cérebros do formol e um de cada vez deve ser feito os procedimentos a seguir:
1. Desprezar a parte da coluna vertebral;
2. Cortar os cérebros de forma transversa (em cada corte vai ficar com os dois
lóbulos);
3. Colocar os cortes em cassetes separados e identificados com lápis (tipo HB) em
papel (escrever de forma firme até marcar o papel);
4. Identificar na parte apropriada no próprio cassete;
5. Organizar os cassetes de uma forma e reproduzir essa forma em um papel a parte
(sugestão: da esquerda para a direita, de baixo para cima);
6. Quando todos estiverem devidamente identificados começa a rodar a bateria.
Álcool 70% - 30‟
Álcool 80% - 30‟
Álcool 90% - 30‟
Álcool 100% I - 40‟
Álcool 100% II - 40‟
Álcool-Xilol (1:1) - 15‟
Deve tirar o excesso de álcool antes de seguir para os Xilol‟s
Xilol I - 60‟
Xilol II - 60‟
Xilol III - 60‟
Tira, novamente o excesso do xilol para ir para a parafina
Parafina infiltração - 60‟
Inclusão da peça
54
B. Processamento do pulmão
Os pulmões devem ser identificados em papel escrito com lápis HB e nos cassetes.
Álcool 90% = 90‟
Álcool 95% = 90‟
Álcool 100%= 60‟
Álcool 100%= 30‟
Álcool-Xilol = 60‟
Xilol = 30‟
Xilol = 12‟ (nessa etapa o pulmão deve ficar até diafanizar)
Xilol = 13‟
Parafina 1 = 45‟
A peça anatômica fica com o ápice voltado para cima.
55
C. Hematoxilina Eosina
Colocar as laminas em estufa a 60°C por 5 minutos
Xilol I – 2‟
Xilol II – 2‟
Xilol III – 2‟
Álcool Absoluto – 2‟
Álcool Absoluto – 2‟
Álcool 95% - 2‟
Álcool 80% - 2‟
Álcool 70% - 2‟
Agua destilada I – 2‟
Agua destilada II – 2‟
Hematoxilina – 3‟
3 Lavagens em agua destilada
Agua destilada III – 2‟
Eosina 1% - 30‟‟
Álcool 80% - 2‟
Álcool 95% - 2‟
Álcool absoluto – 2‟
Xilol I – 2‟
Xilol II – 2‟
Xilol III – 2‟
Montagem em Entellan ® e lamínula
56
D. Ziehl Neelsen
Xilol I – 15‟
Xilol II – 15‟
Xilol III – 15‟
Álcool Absoluto – 2‟
Álcool 90% - 2‟
Álcool 80% - 2‟
Água corrente – 5‟
Fucsina – 60‟
Água – 10‟ a 30‟ (até ver a agua límpida)
Diferenciador (até tirar o excesso do tecido)
Azul de metileno – 5‟
Agua destilada (até o tecido ficar azulado)
Álcool 70% - 2 mergulhos
Álcool 80% - 2 mergulhos
Álcool 90% - 2 mergulhos
Álcool absoluto – 2 mergulhos
Álcool absoluto – 2 mergulhos
Xilol I – 2 mergulhos
Xilol II – 2 mergulhos
Montagem em Entellan ® e lamínula
o Solução de fucsina básica
0,5g de fucsina básica
5 mL de álcool absoluto
1g de fenol cristal
50 mL de agua destilada
o Diferenciador
990 mL de álcool 70%
10 mL de ácido clorídrico
o Solução Estoque azul de metileno
1,4g de azul de metileno
100 mL de álcool 95%
o Solução Uso de azul de metileno
10 mL da solução estoque
90 mL de água destilada