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Universidade Federal de Sergipe
Pró-reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Avaliação da Ação Profilática da Vacina de DNA-hsp65 na
Neurotuberculose Experimental
José Gilmar Costa Santos
São Cristóvão – SE 2016
i
José Gilmar Costa Santos
Avaliação da Ação Profilática da Vacina de DNA-hsp65 na
Neurotuberculose Experimental
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Biologia Parasitária.
Orientadora
Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza
Co-orientador
Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior
São Cristóvão – SE 2016
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237a
Santos, José Gilmar Costa Avaliação da ação profilática da vacina de DNA-hsp65 na neurotuberculose experimental / José Gilmar Costa Santos; orientadora Patrícia Rodrigues Marques de Souza. – São Cristovão, 2016.
61 f. :il.
Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade Federal de Sergipe, 2016.
1. Tuberculose. 2. Vacinação. 3. Sistema nervoso central - Doenças. 4. Neurotuberculose I. Souza, Patrícia Rodrigues Marques de, orient. II. Título.
CDU 616-002.5:614.47
iii
iv
“O primeiro gole do copo das ciências naturais te tornará um ateu. Mas, no fundo do copo, Deus está esperando por ti.“
Werner Heisenberg
“Ele não sabia que era impossível. Foi lá e fez.“ Jean Cocteau
v
À minha família, por todo apoio e incentivo. Por
revelar a grandiosidade do amor nos momentos mais
singelos da vida.
Dedico
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida.
A minha mãe Margarida Maria Costa Santos, por todo amor, carinho e apoio sempre tão
valiosos para mim.
Aos meus familiares e irmãos por todo apoio, ajuda e compreensão.
A Universidade Federal de Sergipe e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária pela oportunidade de realizar o mestrado.
A Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza, por ter me recebido de braços abertos
como seu orientando. Por toda confiança, amizade, apoio, paciência e orientação neste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior pelas contribuições e por disponibilizar seu
Laboratório de Biologia Experimental para as atividades práticas desta pesquisa.
A Profa. Dra. Rosilene Soares Calazans, por permitir a utilização do Laboratório de
Histologia da UFS para as análises de lâminas histolóticas.
A Profa. Dra. Luciana Valente Borges, pela sua importante contribuição na análise
histopatológica.
Ao Prof. Dr. Célio Lopes Silva e aos alunos de seu laboratório, que contribuíram muito
com parte das atividades práticas deste estudo.
Aos amigos Camilla Dalan e Rhamon Ribeiro, que me ajudaram muito neste projeto e
ganharam minha enorme consideração. Agradeço imensamente por tudo que fizeram.
Aos amigos da UFS, Ícaro, Flávia, Priscila, Heitor, Thayana, Camila Barros e Verônica por
tornarem a caminhada mais tranquila durante os momentos que estiveram presentes.
Aos amigos do Mestrado, Lucas, Ivi, Jamilly, Érica, Fernanda, Silvana, Camilla e Gabriela
por todo o companheirismo ao longo das disciplinas.
A CAPES, pela bolsa concedida, permitindo minha dedicação à pesquisa.
A todos aqueles que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste
trabalho.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... xi
RESUMO ........................................................................................................ xii
ABSTRACT .................................................................................................... xiii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
1.1 Tuberculose ................................................................................................. 1
1.2 A Resposta Imunológica na Tuberculose ..................................................... 4
1.3 Tuberculose no Sistema Nervoso Central .................................................... 7
1.4 Fatores envolvidos na Resposta Imunológica contra a Tuberculose no
Sistema Nervoso Central ................................................................................... 9
1.5 Vacinas contra a Tuberculose ...................................................................... 10
1.6 Vacina de DNA-hsp65 no combate da Tuberculose ..................................... 13
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 16
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................. 16
2.2 Objetivos Específicos .................................................................................. 16
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 17
3.1 Delineamento Experimental ........................................................................ 17
3.1.1 Grupo Piloto – Determinação das coordenadas estereotáxicas................... 17
3.1.2 Grupos Experimentais .............................................................................. 17
3.2 Tipo de Estudo ............................................................................................ 19
3.3 Animais....................................................................................................... 19
3.4 Imunização dos Camundongos com a Vacina de DNA-hsp65 ...................... 19
3.5 Infecção com Mycobacterium tuberculosis por Estereotaxia ........................ 19
3.6 Coleta dos Tecidos ...................................................................................... 21
3.7 Determinação de Unidades Formadoras de Colônias ................................... 21
3.8 Processamento Tecidual para Histologia ..................................................... 21
3.9 Aquisição e Análise das Imagens ................................................................ 23
3.10 Descartes ................................................................................................... 23
3.11 Análise Estatística ..................................................................................... 23
4. RESULTADOS ........................................................................................... 24
viii
4.1 Grupo Piloto – Determinação das coordenadas esteotáxicas ........................ 24
4.2 Avaliação Histopatológica de Cérebro e Pulmão ......................................... 25
4.2.1 Cérebro .................................................................................................... 25
4.2.2 Pulmão ..................................................................................................... 28
4.3 Determinação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ....................... 31
5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 33
6. CONCLUSÕES ........................................................................................... 36
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 37
ANEXOS ......................................................................................................... 45
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS – Acquired Immune Deficiency Syndrome-Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APC – Antigen Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígenos
BAAR – Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BCG – Bacilo Calmette-Guérin
BHE – Barreira hemato-encefálica
DNA – Deoxyribonucleic acid – Ácido Desoxirribonucléico
FMRP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
g – grama
H2O2 – Peróxido de Hidrogênio
HE – Hematoxilina e Eosina
HIV – Human Immunodeficiency Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana
hsp – heat shock protein – Proteína de Choque Térmico
IFN- – Interferon-gama
Ig – Imunoglobulina
IL – Interleucina
kDa – quilo Dalton
Kg – quilograma
M – molar
mg – miligrama
MHC – Major Histocompatibility Complex – Complexo Principal de Histocompatibilidade
ml – mililitro
mm – milímetro
MTB – Meningite tuberculosa
Mtb – Mycobacterium tuberculosis
NaCl – Cloreto de Sódio
NFB – Fator de transcrição nuclear kappa B
NK – Natural killer
NO – Nitric Oxide – Óxido Nítrico
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS – Phosphate Buffered Salin – Salina Tamponada com Fosfato
x
pH – Potencial hidrogeniônico
SNC – Sistema Nervoso Central
TB – Tuberculose
TGF- – Fator de Transformação do Crescimento Beta
Th – T helper – linfócito T auxiliar
TLR – Toll-like Receptor – Receptor do Tipo Toll
TNF- – Tumoral Necrosis Factor Alpha - Fator de necrose tumoral alfa
UFC – Unidades Formadoras de Colônias
UFS – Universidade Federal de Sergipe
USA – Estados Unidos da América
USP – Universidade de São Paulo
VEGF –Vascular Endothelial Growth Factor – Fator de Crescimento Vascular endotelial
ZN – Zielh-Neelsen
g – micrograma
l – microlitro
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mycobacterium tuberculosis ou Bacilo de Koch em expectoração de
paciente com tuberculose submetida à coloração de Ziehl-Neelsen.................... 2
Figura 2 – Mycobacterium tuberculosis ou Bacilo de Koch em tecido nervoso
submetido à coloração de Ziehl-Neelsen. .......................................................... 8
Figura 3 – Mecanismo de ação das vacinas de DNA, ativando amplamente a
resposta imunológica celular e humoral após a sua administração. .................... 13
Figura 4 – Delineamento Experimental. A. Ensaio piloto para confirmação dos
ventrículos cerebrais como alvos da infecção. B. Grupos experimentais e
intervenções. ..................................................................................................... 18
Figura 5 – Esquema ilustrativo da disposição das porções do cérebro obtidas
através de corte coronal nos blocos de parafina e do tecido nas lâminas
histológicas ...................................................................................................... 22
Figura 6 – Confirmação dos ventrículos laterais do cérebro como alvos do local
da indução intracerebroventricular. ................................................................... 24
Figura 7 – Cortes histológicos de cérebro de cada grupo experimental após trinta
dias da infecção. ................................................................................................ 26
Figura 8 – Cortes histológicos de pulmão de cada grupo experimental após trinta
dias da infecção. ................................................................................................ 29
Figura 9 – Determinação do número de UFC no cérebro de animais imunizados
com PBS, pVAX e pVAX-hsp65 e desafiados com H37Rv de Mtb. .................. 31
xii
RESUMO
SANTOS, José Gilmar Costa. Avaliação da Ação Profilática da Vacina de DNA-hsp65
na Neurotuberculose Experimental. Sergipe: UFS, 2016. 47p. (Dissertação - Mestrado
em Biologia Parasitária).
A tuberculose (TB) é causada pelo Mycobacterium tuberculosis e representa um problema
de saúde pública global, sendo considerada uma das doenças transmissíveis mais mortais
do mundo. Estima-se que cerca de um terço da população mundial esteja infectada. A TB
no Sistema Nervoso Central (SNC) é uma das formas mais graves da doença, sendo mais
incidente em crianças de seis meses a cinco anos de idade e entre os indivíduos com
imunodepressão, particularmente os portadores da Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS). A Neurotuberculose (NTB) está associada a uma alta taxa de
mortalidade em crianças e permanentes sequelas neurológicas em muitos sobreviventes.
Atualmente, a forma de prevenção à TB é a vacina BCG (Bacilo Calmette-Guérin), porém,
a mesma apresenta limitações, pois protege apenas as crianças e previne somente as formas
graves de TB, além de apresentar proteção variável de 0 a 75%. Isso aponta a necessidade
do desenvolvimento de uma vacina mais efetiva para o combate da TB. Uma das
alternativas mais promissoras para o combate da TB é a vacina de DNA-hsp65, constituída
por um plasmídeo de DNA contendo o gene que codifica a proteína de choque térmico de
65 kDa de micobactéria (M. leprae). Ainda não foi estudado o efeito protetor da vacina de
DNA-hsp65 contra a TB no SNC, que é a forma mais grave da doença e compromete o
tecido neural. Dessa forma, avaliamos o efeito profilático da vacina de DNA-hsp65 na
neurotuberculose experimental. Foram utilizados camundongos C57BL/6 através de três
grupos experimentais, onde um deles foi imunizado apenas com o vetor plasmideal pVAX
(Grupo Vetor) através da administração de três doses quinzenais intramusculares, outro
grupo recebeu apenas PBS (Grupo PBS) e o terceiro grupo foi imunizado com o DNA
plasmideal pVAX-hsp65 (Grupo Vacinado). Trinta dias após a última dose, os animais de
cada grupo foram desafiados com a cepa laboratorial H37Rv de Mycobacterium
tuberculosis via intracerebroventricular através de estereotaxia. Passados trinta dias do
desafio com o bacilo, os camundongos foram sacrificados e foram removidos cérebro e
pulmão. Esses órgãos foram analisados através de cortes histológicos corados com
hematoxilina e eosina. Também foram determinadas as quantidades de unidades
formadoras de colônias (UFC) presentes nos cérebros dos animais de todos os grupos. Os
resultados demonstram que os animais do grupo vacinado apresentaram cérebro e pulmão
com lesões mais discretas do que os grupos vetor e PBS. Além disso, percebemos um
número reduzido de bacilos nos cérebros dos animais do grupo vacinado. Portanto, nossos
resultados sugerem que a vacina de DNA-hsp65 (pVAX-hsp65) é promissora na prevenção
das lesões causadas pelo bacilo no SNC.
Palavras-chave: Profilaxia; Tuberculose; Sistema Nervoso Central; Vacinação.
Orientador: Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza – Universidade Federal de
Sergipe.
Co-orientador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior – Universidade Federal de Sergipe.
xiii
ABSTRACT
SANTOS, José Gilmar Costa. Evaluation of the Prophylactic Action of the DNA-hsp65
vaccine in Neurotuberculosis Experimental. Sergipe: UFS, 2016. 47p. (Dissertation -
Master in Parasitic Biology).
Tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis and is a global public health
problem and is considered one of the deadliest infectious diseases of the world. It is
estimated that about one third of the world population is infected. TB in Central Nervous
System (CNS) is one of the most severe forms of the disease, more common in children
aged six months to five years old and among individuals with immunosuppression,
particularly those with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Neurotuberculosis
(NTB) is associated with a high rate of mortality in children and permanent neurological
sequelae in many survivors. Currently, the way to prevent TB is BCG (Bacilo Calmette-
Guérin) vaccination, however, it has limitations because it only protects children and only
prevents severe forms of TB, besides presenting variable protection of 0-75%. This shows
the need to develop a more effective vaccine to fight TB. One of the most promising
alternatives for TB is the DNA-hsp65 vaccine, made of a plasmid DNA containing the
gene encoding the heat shock protein 65 kDa of mycobacteria (M. leprae). Although, it has
not studied the protective effect of DNA-hsp65 vaccine against TB in the CNS, which is
the most severe form of the disease and compromises the neural tissue. Thus, we evaluated
the prophylactic effect of DNA-hsp65 vaccine in experimental neurotuberculosis. C57BL/6
mice were used by three experimental groups, where one of them was immunized only
with plasmideal pVAX vector (vector group) by intramuscular administration of three
doses every two weeks, another group received only PBS (PBS group) and the third group
DNA was immunized with hsp65-pVAX plasmideal (vaccinated group). Thirty days after
the last dose, the animals of each group were challenged with H37Rv laboratorial strain of
Mycobacterium tuberculosis intracerebroventricularly by stereotaxy. Thirty days after the
challenge with the bacilli, the mice were sacrificed and their brains and lungs removed.
These organs were analyzed using histological sections stained with hematoxylin and
eosin. It was also determined amounts of colony forming units (CFU) present in the brains
of animals in all groups. The results show that animals of the vaccinated group exhibited
brain and lung with discrete lesions of the vector and PBS groups. Furthermore, we noticed
a reduced number of bacilli in the brains of animals in the vaccinated group. Therefore, our
results suggest that DNA-hsp65 vaccine (pVAX-hsp65) is promising in the prevention of
injuries caused by bacillus in the CNS.
Keywords: Prevention; Tuberculosis; Central Nervous System; Vaccination.
Supervisor: Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza - Federal University of
Sergipe.
Co-supervisor: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior - Federal University of Sergipe.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Tuberculose
A tuberculose (TB) representa um problema de saúde pública global (COELHO;
MARQUES, 2006), sendo considerada uma das doenças transmissíveis mais mortais do
mundo. Em 1993, a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou a TB como
emergência mundial. Ainda, estima-se que cerca de um terço da população mundial esteja
infectada. Em 2014, estimativas da OMS revelam que 9,6 milhões de pessoas
desenvolveram TB e 1,5 milhões morreram da doença, o que inclui 400.000 mortes entre
as pessoas portadoras do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do inglês Human
Immunodeficiency Virus). Os países que apresentaram maior número de casos incidentes
em 2014 foram: Índia (2,0 milhões – 2,3 milhões), China (0,9 milhão – 1,1 milhões),
Nigéria (340.000 – 880.000), Paquistão (370.000 – 650.000), Indonésia (410.000 –
520.000) e África do Sul (410.000 – 520.000). Sozinhos, os dois países, Índia e China,
representaram 24% e 11% dos casos mundiais, respectivamente (WHO, 2015).
O Brasil ocupa a 15ª posição de uma lista de 22 países em desenvolvimento que são
responsáveis por 80% de todos os casos mundiais de TB (WHO, 2015). Além disso,
estima-se que ocorram cerca de 129.000 novos casos por ano no país, dos quais
aproximadamente 90.000 são notificados (HIJJAR; PROCÓPIO, 2006; PEREIRA;
SILVA; ANDRADE, 2010). No Brasil, existem 181 municípios considerados prioritários
para o controle da TB. A região sudeste apresenta a maior quantidade de municípios
prioritários (81), seguida da região nordeste (44). Os estados de São Paulo e Rio de Janeiro
possuem 76,5% dos municípios prioritários da Região Sudeste. No Nordeste, o estado da
Bahia possui o maior número de municípios prioritários (BRASIL, 2014). Em 2013, foram
confirmados 91.369 casos de TB no Brasil, sendo 755 de pessoas residentes no estado de
Sergipe (BRASIL, 2015).
Quanto à etiologia, a TB é uma doença infectocontagiosa causada pelo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ou bacilo de Koch, assim também chamado por ter sido
identificado pela primeira vez pelo cientista alemão Robert Koch, em 1882 (CAMPOS,
2006a). Trata-se de uma bactéria em forma de bacilo, intracelular facultativo, aeróbio
estrito que necessita de oxigênio para crescer e se multiplicar, não encapsulado, não
2
formador de esporos, imóvel e de crescimento lento. O Mtb possui uma parede celular rica
em lipídios e ácidos micólicos e se replica a cada 15-20h, o que é extremamente lento em
comparação com outras bactérias, como, por exemplo, a Escherichia coli (20 minutos)
(CAMPOS, 2006a). Esse bacilo possui uma dimensão que varia de 3 a 5µm de
comprimento e é resistente à descoloração por álcool-ácido devido ao alto teor de lipídios
em sua parede celular, formando uma barreira hidrofóbica, quando corado pelo método de
Ziehl-Neelsen (ZN). Por isso, o Mtb é também chamado de Bacilo Álcool-Ácido
Resistente (BAAR) (CAMPOS, 2006a; LAWN; ZUMLA, 2011; LINS, 2012). A Figura 1
demonstra através da coloração de ZN a presença do bacilo em expectoração de um
paciente com TB.
Figura 1 – Mycobacterium tuberculosis ou Bacilo de Koch em
expectoração de paciente com tuberculose submetida à coloração
de Ziehl-Neelsen (LAWN; ZUMLA, 2011).
A transmissão da TB acontece de forma direta de um indivíduo para outros através
de tosse, fala ou espirro, quando são eliminadas gotículas de saliva contendo o Mtb.
Apenas os indivíduos com TB pulmonar ativa são bacilíferos, ou seja, são capazes de
transmitir a doença. Após o contato com o bacilo, este pode ser eliminado, desenvolver-se
sem causar a doença ou causar a TB. Desnutrição, idade avançada, Síndrome da
3
Imunodeficiência Adquirida (AIDS, do inglês Acquired Immune Deficiency Syndrome) e
uso de medicamentos imunossupressores são alguns dos fatores que tornam o indivíduo
mais susceptível ao adoecimento por afetarem o sistema imunológico. Além disso, a carga
bacilífera e a virulência da bactéria também influenciam no aparecimento da doença em
indivíduos imunocompetentes. Geralmente a TB afeta os pulmões (TB pulmonar), mas
outros órgãos e sistemas também podem ser acometidos (TB extrapulmonar), como, por
exemplo, ossos, rins, linfonodos e meninges (LOPES; JANSEN; CAPONE, 2006; MELO
et. al., 2009).
Em 5 a 10% das pessoas infectadas a resposta imunológica é incapaz de proteger o
organismo após a primeira infecção tuberculosa e o indivíduo desenvolve a doença em
algum momento da vida, principalmente nos dois primeiros anos após a infecção
(HUSSAIN, 2007). Nesse caso, a doença é chamada de TB primária ou de primoinfecção e
pode evoluir de um foco pulmonar ou ganglionar. Uma das formas mais graves de TB
primária é a forma miliar, que é consequência da disseminação hematogênica e apresenta
lesões granulomatosas pequenas e difusas, que atingem não apenas os pulmões, mas
muitos órgãos, como laringe e rins, por exemplo (CAMPOS, 2006a). Outra forma clínica
de TB que apresenta risco de morte elevado é a meningoencefalite tuberculosa, que
acomete o Sistema Nervoso Central (SNC). A TB pós-primária ou secundária acontece
quando o indivíduo apresenta competência imunológica e consegue deter a infecção inicial,
mas a doença desenvolve-se posteriormente a partir de um foco latente (reinfecção
endógena) ou através de uma nova infecção (reinfecção exógena), onde o sistema de defesa
não é capaz de conter a sua progressão (BOMBARDA et. al., 2001; CAMPOS, 2006a;
CASTILLO et. al., 2012; DELANCE et. al., 2013; KAUFMANN; DORHOI, 2013).
Atualmente, a forma de prevenção utilizada para a TB é a vacina BCG (Bacilo
Calmette-Guérin). Esta vacina foi desenvolvida em 1921 pelos pesquisadores Calmétte e
Guérin no Instituto Pasteur através da atenuação do Mycobacterium bovis (SEGER, 2007).
No entanto, o BCG apresenta limitações, pois protege apenas as crianças e previne
somente as formas graves de TB, além de apresentar proteção variável de 0 a 75%
(LOWRIE; SILVA, 2000; GÓMEZ; CONDINO NETO, 2006). Além disso, estudos
realizados com a intenção de utilizar uma segunda dose de BCG para conferir proteção à
população adulta contra a TB verificaram que essa estratégia não apresenta viabilidade
(RODRIGUES et. al., 2005; DANTAS et. al., 2006). Isso aponta a necessidade do
4
desenvolvimento de uma vacina mais efetiva para o combate da TB, que ainda não possui
prevenção segura e eficaz (RODRIGUES JÚNIOR et. al., 2004).
O tratamento da TB é realizado através de quimioterapia, sendo utilizados
diferentes antibióticos e com duração mínima de seis meses. Isso contribui para o alto
número de casos de abandono do tratamento. Quatro fármacos principais são considerados
de primeira linha no tratamento da TB: isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol.
São drogas com importante atividade bactericida, pois apresentam a capacidade de reduzir
rapidamente o número de bacilos viáveis e tornar os pacientes não infectantes. Pelo menor
grau de eficácia e maior possibilidade de toxicidade, seis classes de fármacos de segunda
linha (aminoglicosídios injetáveis, estreptomicina, canamicina e amicacina; o polipeptídeo
injetável capreomicina; os agentes orais etionamida, ciclosserida e ácido
paraaminossalicílico – PAS; e os antibióticos da fluorquinolona) costumam ser apenas
usadas no tratamento de pacientes com TB resistente aos fármacos de primeira linha
(LONGO et. al., 2013). Existe ainda uma grande preocupação quanto à eficácia desses
medicamentos contra a doença pelo aumento da quantidade de indivíduos portadores de
cepas multi-drogas resistentes (ZHU et. al, 2005). Pode ocorrer a resistência a uma droga
(monorresistência) ou a duas drogas, exceto a combinação de rifampicina e isoniazida
(polirresistência). A multirresistência (MDR) consiste na resistência para pelo menos as
drogas rifampicina e isoniazida, enquanto que a super-resistência (XDR) ocorre quando
existe MDR associada à resistência a pelo menos uma das seguintes drogas injetáveis:
amicacina, canamicina ou capreomicina, e a uma fluorquinolona (ARAUJO FILHO, 2008).
1.2 A Resposta Imunológica na Tuberculose
Após ultrapassar o trato respiratório superior e chegar aos alvéolos, para se instalar
no organismo, o Mtb interage com receptores celulares para iniciar a infecção (LOPES;
JANSEN; CAPONE, 2006). Assim, a lipoproteína de 19kDa e outros derivados lipídicos
interagem com o TLR2 (Toll-like receptor 2), que é um receptor de superfície celular dos
fagócitos, sendo capaz de ativá-lo. O controle da infecção pelo Mtb também acontece
através da interação do bacilo com os receptores TLR4. São justamente essas interações
que induzem uma resposta predominantemente inflamatória verificada na TB (ABEL et.
al., 2002; SALGAME, 2005). Os macrófagos fagocitam os bacilos e buscam eliminá-los
5
através do pH ácido, enzimas lesivas pela fusão do lisossoma com o fagossoma e
consequente produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (RUSSEL, 2003;
KAUFMANN; DORHOI, 2013; YUK; JO, 2014).
Através da apresentação de antígenos, macrófagos ativados e infectados com Mtb
ativam o início da resposta imunológica-específica, desencadeando assim mecanismos de
eliminação efetiva do bacilo. Desenvolvem-se a resposta imunológica celular e também a
humoral. No entanto, essa resposta humoral pode não ser suficiente para eliminar o bacilo.
Isso acontece porque apesar da produção de anticorpos específicos contra antígenos do
Mtb, estes não são capazes de penetrar nas células infectadas e destruir o bacilo (LOPES;
JANSEN; CAPONE, 2006; FLYNN; CHAN; LIN, 2011).
As células T CD4+ desempenham a principal função na resposta contra a bactéria
(TEIXEIRA; ABRAMO; MUNK, 2007). Através do complexo principal de
histocompatibilidade de classe II (MHC II), as células apresentadoras de antígenos (APCs)
como macrófagos e células dendríticas apresentam antígenos do bacilo às células T CD4+
no tecido linfóide associado aos brônquios, e também produzem citocinas inflamatórias,
tais como as interleucinas (IL): IL-12, IL-6 e IL-1 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-
), que são capazes de recrutar neutrófilos e monócitos (BOMBARDA et.al., 2001;
ABBAS; LICHTMAN, 2007). Essas células e citocinas são importantes para a formação
do granuloma, que é caracterizado pelo infiltrado de neutrófilos e monócitos, com grande
quantidade de Linfócitos T e B que circundam o concentrado de macrófagos e células
dendríticas infectados com bacilos (ULRICHS; KAUFMANN, 2006). Indivíduos com
imunossupressão apresentam comprometimento funcional dos linfócitos T CD4+, o que
afeta a produção de citocinas pró-inflamatórias, principalmente interferon gama (IFN-) e
IL-12, resultando na má formação do granuloma e permitindo, assim, que o bacilo infecte
outros órgãos (ALGOOD; CHAN; FLYNN, 2003).
Nesse contexto, o TNF- é a citocina primordial no controle e manutenção do
granuloma por regular localmente a concentração de quimiocinas para o recrutamento de
células, o que impede reativação da TB (SALGAME, 2005). A IL-12 (produzida pelas
APCs) e citocinas produzidas por linfócitos ativados, como a IL-2, mantêm a ativação e
proliferação de linfócitos, induzindo a resposta celular predominantemente pró-
inflamatória (Th1 – T helper 1). IL-12 aumenta a produção de IFN- em células NK
6
(natural killer) e a expansão de Th1 específicas a antígenos da micobactéria. Também
produzido pelas células Th1, o acúmulo de IFN- no pulmão é responsável pela parada do
crescimento bacteriano (ALGOOD; CHAN; FLYNN, 2003). Trata-se de uma citocina
ativadora de macrófagos, tornando o mesmo capaz de produzir óxido nítrico e outros
radicais intermediários do nitrogênio, que são bactericidas e importantes no combate ao
Mtb (ALMEIDA et. al., 2005). Além disso, outras citocinas como IL-23, IL-18 e IL-27
também induzem a produção de IFN- (TEIXEIRA; ABRAMO; MUNK, 2007). A
produção de IL-23 é essencial para a secreção de IL-17 (Th17), que é um potente indutor
de expressão de quimiocinas, as quais irão promover a migração de leucócitos do sangue
para o local da inflamação (KHADER et. al., 2007).
Outro mecanismo fundamental para o combate ao bacilo é a apresentação cruzada,
onde antígenos micobacterianos são secretados em vesículas apoptóticas, associadas ao
MHC de classe I, e assim ativam células T CD8+. Quando ativadas, essas células produzem
IFN- e liberam grânulos enzimáticos ricos em granulisina, que ativam outras enzimas
capazes de degradar lipídios e causar a lise celular por apoptose (WINAU et. al., 2006). Na
TB também são encontradas citocinas produzidas por células Th2, como IL-4 e IL-10, e
que são supressoras da atividade Th1, assim como imunoglobulina (Ig) E e IgG4, que
possuem o mesmo papel supressor (FERRAZ et. al., 2006). Ainda, existe na TB a atuação
de células T reguladoras (Treg), que regulam a resposta imunológica do hospedeiro contra
o Mtb através da produção de citocinas, como IL-4, IL-10 e o fator de transformação do
crescimento beta (TGF-), com efeito supressor sobre a imunidade celular. Essas células
podem limitar a resposta imunológica eficaz, diminuindo a dano tecidual inflamatório, mas
com consequente inibição da resposta Th1 impedindo o controle adequado da infecção
(RIBEIRO-RODRIGUES et. al., 2006; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008; CASTILLO
et. al., 2012; YUK; JO, 2014). Além disso, o Mtb apresenta diversos mecanismos de
escape da resposta imunológica, que incluem a inativação de enzimas lisossomais, inibição
da fusão entre lisossoma e fagossoma, o que impede que a bactéria tenha contato com o
ambiente hostil do lisossoma, como pH ácido e enzimas lesivas (RUSSELL, 2003).
Dessa forma, percebe-se a complexidade da resposta imunológica desenvolvida
para combater o Mtb. No entanto, essa resposta pode não ser eficiente e permitir a
disseminação do bacilo a partir de um foco pulmonar para outros órgãos, como é o caso da
infecção no Sistema Nervoso Central.
7
1.3 Tuberculose no Sistema Nervoso Central
A TB no Sistema Nervoso Central (SNC) é uma das formas mais graves da doença.
Apresenta maior incidência em crianças de seis meses a cinco anos de idade e entre os
indivíduos com imunodepressão, particularmente os portadores de AIDS. Na ausência de
tratamento medicamentoso a TB no SNC evolui para óbito em 100% dos casos (BACHA;
LEITE, 2009; GUPTA; KUMAR, 2011). Em indivíduos imunocompetentes, ela é
responsável por cerca de 3% dos casos de TB. Em casos de coinfecção com HIV/AIDS, a
incidência de TB no SNC corresponde a aproximadamente 10% de todos os casos de TB
(ARAÚJO FILHO, 2008; BRASIL, 2010). Além da pandemia do HIV/AIDS, a resistência
aos medicamentos antituberculose, a imunossupressão secundária ao tratamento do câncer,
doenças autoimunes e transplantes também constituem fatores de risco para o
desenvolvimento da TB no SNC (BACHA; LEITE, 2009).
O Mtb pode atingir o SNC após a infecção pulmonar primária por disseminação
hematogênica (SINNER; TUNKEL, 2002; FLIER et. al., 2004). O comprometimento do
SNC acontece basicamente sob duas formas: meningoencefalite e tuberculoma
intracraniano. Assim como nas outras formas de TB, os sinais e sintomas da
meningoencefalite ocorrem pelo processo inflamatório desenvolvido contra o Mtb. Quando
a carga bacteriana é baixa, a resposta é pouco intensa e, na maioria das vezes, não causa
sintomas. Porém, mesmo quando a resposta imunológica do hospedeiro consegue conter a
primoinfecção, é possível que granulomas com bacilos viáveis, no córtex ou nas meninges,
sejam reativados. Assim, ocorre multiplicação dos bacilos e início da TB no SNC,
geralmente nas meninges, com posterior comprometimento cerebral (CAMPOS, 2006b).
O processo inflamatório na TB do SNC causa aumento da permeabilidade capilar,
acúmulo de células no local da lesão, produção de exsudato, edema e fibrose. Além disso,
pode ocorrer lesão vascular com trombose e consequentes infartos, obstrução da livre
circulação do líquor, muitas vezes com hidrocefalia e hipertensão intracraniana. Os
sintomas dependem do local e da intensidade da inflamação. A meningoencefalite tem iní-
cio insidioso na maioria dos casos, com exceção das crianças, onde a doença pode ser
aguda e letal (KILANI et. al., 2003; CAMPOS, 2006b; BACHA; LEITE, 2009).
8
Febre, anorexia e adinamia são sintomas gerais da meningoencefalite. Os sintomas
específicos são variáveis, sendo mais frequentes aqueles associados ao comprometimento
inflamatório das meninges, como cefaléia, alterações de comportamento, diminuição do
nível de consciência e confusão mental. Além disso, o processo inflamatório cerebral
determina o aparecimento de convulsões, de vômitos e de alterações visuais e da fala. O
tuberculoma intracerebral se apresenta como uma massa com crescimento lento e a
manifestação clínica depende da sua localização (CAMPOS, 2006b; BRASIL, 2010). A
Figura 2 mostra o bacilo da TB em tecido nervoso corado pelo método de ZN.
Figura 2 – Mycobacterium tuberculosis ou Bacilo de Koch em tecido
nervoso submetido à coloração de Ziehl-Neelsen. Adaptado de Dalan
(2015).
9
1.4 Fatores envolvidos na Resposta Imunológica contra a Tuberculose no Sistema
Nervoso Central
A medula espinhal e o cérebro são protegidos de agentes infecciosos pela coluna
vertebral e tecido ósseo do crânio, pelas meninges e barreira hemato-encefálica (BHE).
Além dessas estruturas anatômicas, as células do sistema imunológico, como, por exemplo,
astrócitos e micróglia também defendem o SNC de infecções. A TB no SNC acontece
através da abertura da BHE, possivelmente via plexo coróide. A perda da integridade da
BHE é favorecida pela ativação de mecanismos inflamatórios, que incluem a produção de
citocinas inflamatórias como TNF- e IL-1, facilitando, assim, o transporte de compostos
para o encéfalo (FARIA; FARHAT, 1999; TSENOVA et. al., 1999).
A ativação de células gliais e a subsequente produção de proteínas estão associadas
com a indução do processo inflamatório, que acontece em infecções como a TB no SNC.
As células microgliais são residentes no SNC, atuando como células do sistema
imunológico (GAO et. al., 2002; ZUCCHI, 2007). Sensível a mudanças em seu
microambiente, a micróglia torna-se ativada em infecções e lesões. Dessa forma, ela regula
receptores de superfície celular, que incluem o MHC e receptores do complemento
(KREUTZBERG, 1996; CRONK; KIPNIS, 2013). O bacilo de Koch infecta
preferencialmente as células microgliais comparado com a infecção de astrócitos
(macróglia) ativados. Ainda, nas mesmas condições a micróglia produz mais citocinas e
quimiocinas do que os astrócitos ativados (ROCK et. al., 2005).
Durante a infecção pelo Mtb, a participação da micróglia como células da resposta
imunológica no SNC tem importante papel na produção de mediadores inflamatórios. Esta
participação deve estar relacionada à fisiopatologia da doença, contribuindo para a
contenção do patógeno pela produção de óxido nítrico (NO) e pela modulação da resposta
inflamatória pela ativação de NFB, com consequente produção de citocinas pró-
inflamatórias e neurotóxicas. Demonstrou-se que monócitos de indivíduos tuberculosos
possuem uma degradação constitutiva de IB (maior inibidor da ativação do NFB), o
que não foi verificado em pacientes não tuberculosos (TOOSI et. al., 1997). A ativação do
NFB regula a expressão de mediadores inflamatórios, os quais também podem induzir a
atividade do NFB, constituindo-se um processo de retroalimentação positiva favorecendo
10
a perpetuação de um processo patológico (ZUCCHI, 2007). Outro mediador produzido
durante a infecção é o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), que induz o
aumento da permeabilidade da BHE e o processo mitótico nas células endoteliais (FLIER
et. al., 2004; ZUCCHI, 2007). Assim, o VEGF constitui um mediador da resposta
imunológica na TB do SNC e parece desempenhar um papel importante na fisiopatologia
desta doença.
1.5 Vacinas contra a Tuberculose
A vacinação é um processo que consiste em induzir a resposta de forma rápida e
específica do sistema imunológico do indivíduo contra algum microorganismo ou elemento
por ele produzido. Atualmente, o aumento do conhecimento na área da imunologia tem
contribuído para o desenvolvimento de novas vacinas, buscando a estimulação de uma
resposta imunológica específica, protetora e de longa duração. Para tanto, procura-se
identificar o alvo para o qual se deseja induzir uma resposta imunológica, como, por
exemplo, um patógeno ou uma toxina, em seguida, investiga-se quais os elementos dessa
resposta que são importantes para eliminar o alvo e desenvolver as estratégias necessárias
para combater esse alvo (SANTOS JUNIOR, 2006).
Introduzidas a partir do século XX, as vacinas de primeira geração são constituídas
por microorganismos vivos e atenuados, como a BCG, usada contra a TB, ou mortos e
inativados, como a vacina contra a Bordetella pertussis. A profilaxia da TB através da
imunização com BCG ainda consiste na melhor alternativa para a proteção dos indivíduos
contra a doença, pois protege contra as formas mais graves de TB durante a infância, TB
extrapulmonar e meningite tuberculosa, e também contra a hanseníase (MARTIN, 2005).
O desenvolvimento da BCG foi iniciado em 1921 e acreditava-se que esta vacina
controlaria e até mesmo erradicaria a TB (HASHIMOTO, 1997). Mesmo sendo
amplamente utilizada, esta vacina é ineficaz em algumas populações e interfere no teste de
hipersensibilidade cutânea (PPD), usado para diagnóstico de TB e para fins
epidemiológicos (FINE et al., 1999; ORME; KAUFMANN 2006). Esta vacina foi
originalmente obtida de um isolado de Mycobacterium bovis, atenuado através 230
passagens seriadas por meio de cultura durante 13 anos (1908 – 1921). Uma possível
explicação para a variabilidade da eficácia desta vacina é a diversidade de cepas do BCG.
11
Depois de anos de crescimento e repiques em diversos laboratórios, várias cepas da vacina
foram geradas através de deleções, duplicações ou mudanças no número de sequências
gênicas de uma região conhecida como RD1 (MARTIN, 2005). Além de reversão da
virulência, existe grande preocupação também quanto à segurança da BCG pela
possibilidade de indução da patologia em indivíduos imunocomprometidos (FREY, 2006),
principalmente quando considera-se que no caso da TB, a co-infecção pelo HIV tem se
tornado cada vez mais comum. Assim, existe a necessidade de uma alternativa de
imunização mais segura e eficaz para combater a TB, o que tem levado a muitos
pesquisadores investirem no desenvolvimento de novas vacinas (SANTOS JUNIOR,
2006).
O desenvolvimento de vacinas evoluiu muito com a introdução de novas estratégias
para a obtenção e produção de antígenos, assim como a otimização das vias de
administração e apresentação desses antígenos às células do sistema imunológico. Isso
permitiu o desenvolvimento de vacinas mais seguras e eficazes. Consideradas de segunda
geração, as vacinas de subunidades são constituídas de antígenos purificados e
provenientes de fontes naturais, sintéticas ou mesmo recombinantes (SANTOS JUNIOR,
2006). Elas consistem no uso de um ou mais componentes da micobactéria, como
elementos da parede do bacilo ou moléculas secretadas, como proteínas, carboidratos,
lipoglicoproteínas e glicolipídeos (FONSECA et al., 2007). São consideradas seguras, mas
exigem alto custo de produção e também se mostram pouco imunogênicas (SABLE et al.,
2007). Um exemplo de vacina de subunidade é a Mtb72F, que é uma proteína obtida
através da fusão dos antígenos Mtb39 e Mtb32. Ela já foi estudada como vacina de
subunidade (SKEIKY et al., 2004) e na estratégia de prime-boost como o reforço para a
vacina de BCG (BRANDT et al., 2004) apresentando resultados promissores. Outra
proteína de fusão baseada nos antígenos Ag85B e ESAT6 também é alvo de estudos
(LANGERMANS et. al., 2005).
Recentemente, surgiram as vacinas gênicas ou de terceira geração, onde os genes
ou fragmentos de genes que codificam antígenos potencialmente imunogênicos são
carreados por DNA plasmideal. A vacina de DNA é uma ferramenta para o combate de
doenças infecciosas que ainda não possuem prevenção segura e eficaz (por exemplo:
herpes, malária, AIDS e TB) (RODRIGUES JÚNIOR et. al., 2004).
12
Uma grande quantidade de antígenos tem sido estudada sob a forma de vacina de
DNA. As vacinas gênicas que codificam proteínas da família de Ag85 (HUYGEN et al.,
1996), ESAT-6, hsp70, proteína de 36kDa e MPT83 (LOWRIE et al., 1997a), Pho S (ZHU
et al., 1997), PLCa (GONÇALVES, 2001) e HSP65 (LOWRIE et al., 1994) ou uma
combinação das mesmas têm sido alvo de muitas investigações. O Antígeno 85 (Ag85) e a
proteína de choque térmico de 65kDa (hsp65) foram os antígenos mais estudados (SILVA;
LOWRIE, 1994; LOWRIE et al., 1999; SANTOS JUNIOR, 2006). Os plasmídeos usados
apresentam sequências de DNA necessárias para seleção e replicação em bactérias,
promotores especiais para processos de transcrição e tradução, genes que conferem
resistência a antibióticos para a seleção das bactérias transformadas e, sequências
específicas que permitem a expressão gênica em células eucarióticas e procarióticas
(PRAZERES et al., 2001). Quando o DNA é administrado, o organismo passa a produzir o
antígeno por meios próprios, sem os efeitos indesejáveis da introdução de um agente
infeccioso patogênico ou de vacinas contendo subunidades protéicas e adjuvantes (SPIER,
1996). Assim, o gene inserido no plasmídeo codifica a proteína imunogênica nas células do
indivíduo e ativa a sua memória imunológica (SILVA et. al., 1999; RODRIGUES JÚNIOR
et. al., 2004). Ainda, as vacinas de DNA mimetizam os efeitos das vacinas vivas por
possibilitarem a geração de antígenos endógenos e, consequentemente, a ativação de
linfócitos T CD8+. Outra possibilidade de otimização desse tipo de vacina é a sua
utilização em associação com adjuvantes como as sequências de nucleotídeos CpGs
(citosina-fosfato-guanina) não metilados. Os CpGs têm capacidade imunoestimulatória
ativando receptores TLR9 e TLR3, dando início à resposta imunológica inata, com um
direcionamento para uma padrão Th1 (KRIEG, 2002).
Essas vacinas são capazes de modular a imunidade celular e humoral, estimulando
linfócitos T CD4+ e T CD8
+ (Figura 3). Após a introdução do DNA plasmideal na célula
do indivíduo, ocorre a produção da proteína de interesse. A proteína sintetizada é clivada
pelo proteossoma e gera peptídeos, os quais se associam às moléculas do MHC de classe I
e ativam as células T CD8+. Já as proteínas produzidas e liberadas pelas células são
fagocitadas pelos macrófagos e clivadas, gerando peptídeos que são apresentados pelas
moléculas do MHC de classe II e ativam os linfócitos T CD4+. Dessa forma, esse padrão
de ativação da resposta gera memória imunológica permanente em indivíduos que recebem
a vacina de DNA (RIBEIRO, 2008).
13
Figura 3 – Mecanismo de ação das vacinas de DNA, ativando amplamente a
resposta imunológica celular e humoral após a sua administração. Ribeiro
(2008).
1.6 Vacina de DNA-hsp65 no combate da Tuberculose
Desenvolvida pelo pesquisador Doutor Célio Lopes Silva da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) da Universidade de São Paulo (USP), uma das
vacinas estudadas para o combate da TB é a vacina de DNA-hsp65. Trata-se de uma vacina
gênica constituída por um plasmídeo de DNA contendo o gene que codifica a proteína de
choque térmico de 65kDa (HSP65) de micobactéria (Mycobacterium leprae) (SILVA;
LOWRIE, 1994; LOWRIE et al., 1999; RODRIGUES JUNIOR et. al., 2004; RIBEIRO,
2008). Tem sido demonstrado que a proteína hsp65 sozinha é capaz de induzir proteção
contra o desafio com cepa virulenta de Mtb em modelo experimental murino (SILVA;
LOWRIE, 1994). Esta proteína pertence ao grupo das proteínas de choque térmico, que se
caracterizam por serem altamente conservadas. Proteínas homólogas foram encontradas em
uma grande variedade de procariotos e eucariotos, funcionando como chaperonas na
14
conformação pós-traducional de proteínas. Os genes hsp65 de Mtb e M. bovis (BCG) são
idênticos e tem uma identidade de 90% com o gene de M. leprae. A proteína HSP65 é um
dos antígenos encontrados no filtrado de cultura de Mtb e é produzida em grande
quantidade pelo bacilo intracelular (LEE; HORWITZ, 1995). Além disso, a infecção de
camundongos com Mtb mostra que, entre 10 a 20% de todas as células T que respondem
ao patógeno são específicas para hsp65 (KAUFMANN et al., 1987). Isso tem tornado esse
antígeno um candidato em potencial para a proteção contra a TB (SANTOS JUNIOR,
2006).
Uma característica fundamental da vacina de DNA-hsp65 é a capacidade de
produzir antígenos endógenos nas células transfectadas dos animais. Isso favorece o
desenvolvimento de linfócitos T citotóxicos específicos para o antígeno, os quais
produzem IFN- e lisam os macrófagos infectados pelo Mtb (LOWRIE et. al., 1997b;
RODRIGUES JUNIOR et. al., 2004). Dessa forma, a vacina de DNA-hsp65 torna-se um
excelente modo de gerar estas células e pode ser capaz de promover uma proteção
duradoura (LOWRIE et. al., 1997a).
O uso desta vacina tanto para prevenir como para tratar a TB induz uma mudança
no padrão de resposta imunológica, promovendo a ativação de células apresentadoras de
antígenos (macrófagos e células dendríticas), linfócitos T CD4+ e T CD8
+ de memória,
bem como de células T gama/delta e células natural killer (NK), e secreção de mediadores
inflamatórios (citocinas e quimiocinas) do padrão Th1 (BONATO et. al., 1998;
RODRIGUES JUNIOR et. al., 2004). Trabalhos realizados pelo grupo de pesquisa do
professor Dr. Célio Lopes Silva usando a vacina gênica com a proteína antigênica hsp65 da
micobactéria indicam que a eficiência da vacina de DNA-hsp65 está na indução de uma
população de células T específicas, com predominância de linfócitos T citotóxicos, CD8+
com produção de IFN- (LOWRIE; SILVA, 2000). A maioria das células T CD4+ e CD8
+
específicas para o antígeno usado na vacinação ou terapia gênica apresentam alta expressão
do marcador de superfície celular CD44hi, que é uma molécula presente nas células de
memória (SILVA et. al., 1999).
A vacina de DNA-hsp65 também impede a reativação da TB em animais
imunossuprimidos e, associada à quimioterapia, reduz o tempo de tratamento dos animais
(SILVA et. al., 2005). Em 1999, a revista Nature publicou resultados dessa vacina, que foi
15
capaz de curar casos crônicos de TB e casos de TB latente (LOWRIE et. al., 1999). Além
disso, a imunização com a vacina de DNA-hsp65 foi altamente efetiva para proteger
animais contra posterior infecção com Mtb (LOWRIE; TASCON; SILVA, 1995).
A vacina de DNA-hsp65 não se integra ao genoma do hospedeiro (COELHO-
CASTELO et. al., 2006), o que é vantajoso, pois a integração do plasmídeo ao genoma do
hospedeiro de maneira danosa pode gerar patogenias, principalmente se acontecer em
células somáticas, gerando mutagênese por inserção. Além disso, essa vacina apresenta
outras vantagens quando comparado ao uso das vacinas clássicas, como, por exemplo,
produção em larga escala mais barata e a comercialização não necessita de uma rede de
refrigeração, já que elas são estáveis à temperatura ambiente (RIBEIRO, 2008).
Existem evidências de que a vacina de DNA-hsp65 não induz auto-agressão
tecidual, o que poderia levar ao desenvolvimento de doenças auto-imunes através de
reatividade cruzada com as proteínas de choque término do hospedeiro. Através da análise
histológica de 18 órgãos, incluindo cérebro e pulmão, de camundongos vacinados com a
vacina de DNA-hsp65 e de animais vacinados e infectados com Mtb, foi verificado que
esta vacina não leva à auto-agressão tecidual (LIMA, 2006).
Entretanto, pouco se sabe sobre o efeito protetor da vacina de DNA-hsp65 contra a
TB no SNC. Trabalho recentemente publicado pelo grupo de pesquisa do Dr. Célio Lopes
Silva demonstrou que a vacina de DNA-hsp65 foi capaz de induzir a diminuição do VEGF
no SNC. No entanto, a prevenção com análise tecidual e de UFC ainda não foi avaliada
(ZUCCHI et. al., 2013). Portanto, a avaliação da eficácia protetora dessa vacina no modelo
que mimetize melhor a infecção no SNC se faz necessária.
16
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito profilático da vacina de DNA-hsp65 na Neurotuberculose
Experimental.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar a presença de lesões teciduais inflamatórias no parênquima
cerebral e pulmonar de camundongos imunizados e não imunizados com a
vacina de DNA-hsp65;
Analisar a presença de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) no
parênquima cerebral de camundongos imunizados e não imunizados com a
vacina de DNA-hsp65;
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento Experimental
3.1.1 Grupo Piloto – Determinação das coordenadas estereotáxicas
Para garantir como alvo da infecção o ventrículo lateral direito do cérebro dos
camundongos durante a microinjeção de Mtb, foi realizado um ensaio piloto utilizando 04
(quatro) animais para estereotaxia com o corante Azul de Evans. O procedimento de
estereotaxia está descrito no tópico 3.5.
3.1.2 Grupos Experimentais
Os grupos experimentais foram constituídos de camundongos que receberam as
seguintes preparações:
Grupo PBS – animais que foram injetados apenas com PBS (n=6);
Grupo Vetor – animais imunizados apenas com o plasmídeo pVAX (n=6);
Grupo Vacinado – animais imunizados com a vacina pVAX-hsp65 (DNA-hsp65)
(n=6).
Os procedimentos experimentais desde a imunização com pVAX (Grupo Vetor),
pVAX-hsp65 (Grupo Vacinado) ou injeção de PBS (Grupo PBS) até o sacrifício e remoção
de cérebro e pulmão dos animais foram realizados na Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (FMRP) da Universidade de São Paulo (USP), assim como a determinação das
unidades formadoras de colônias (UFC). As demais etapas (processamento e análise
morfológicas dos tecidos) foram realizadas no Laboratório de Biologia Experimental do
Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Sergipe (UFS), Campus de São
Cristóvão.
18
Injeção com PBS
(3 doses quinzenais Via IM)
Camundongos C57BL/6
6 Camundongos Grupo Vetor
6 Camundongos Grupo Vacinado
Imunização
100g de pVAX (3 doses quinzenais
Via IM)
Imunização
100g de pVAX-hsp65 (3 doses quinzenais
Via IM)
Estereotaxia com microinjeção Intracerebroventricular de
1x105 bacilos
Sacrifício e remoção de cérebro e pulmão
UFC
(n=4)
Trinta dias
Morfologia (n=6): Hematoxilina-Eosina.
6 Camundongos Grupo PBS
04 Camundongos C57BL/6
Estereotaxia com corante
Azul de Evans
Análise histológica com confirmação da
microinjeção no ventrículo lateral do
cérebro
A
B
Figura 4 – Delineamento Experimental. A. Grupo piloto para a determinação das coordenadas
estereotáxicas. B. Grupos experimentais e intervenções. IM: Intramuscular.
Trinta dias
19
3.2 Tipo de Estudo
Trata-se de um estudo analítico experimental, que se caracteriza pelo
estabelecimento de grupos experimentais e de controle para determinada intervenção.
3.3 Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos de 5 a 8 semanas de idade e
pesando entre 20 e 30 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão
Preto da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto na Universidade de São Paulo (FMRP-
USP). Esses animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Imunologia Básica e
Aplicada com regime livre a ração e água, com ciclos de claro/escuro de 12:00h/12:00h
(claro das 6:00h às 18:00h) e à temperatura de 21 ± 1ºC.
3.4 Imunização dos Camundongos com a Vacina de DNA-hsp65
Os animais dos grupos Vetor e Vacinado foram imunizados com 100μg/dose de
DNA plasmideal pVAX (Vetor) ou DNA-hsp65 (Vacinado) purificado administrado em
solução salina (2g/l de NaCl a 0,9%) contendo 25% de sacarose para promover um
influxo celular. Cada animal recebeu 3 (três) doses através de injeção intramuscular no
músculo quadríceps femoral, sendo 50μg em cada músculo, direito e esquerdo. As injeções
foram aplicadas com intervalos quinzenais, totalizando 300μg de DNA. Trinta dias após a
última dose de DNA (Grupos Vetor e Vacinado) ou PBS (Grupo PBS), os animais foram
desafiados com a cepa virulenta de Mtb H37Rv por via intracerebroventricular.
3.5 Infecção com Mycobacterium tuberculosis por Estereotaxia
Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitonial (1mL/100g de peso
corporal) de cetamina (80mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg) diluídas em solução salina
isotônica (NaCl 0,15M). Com a intenção de reduzir os riscos de infecção, antes do início
da cirurgia, os camundongos foram submetidos à tricotomia da região dorsal da cabeça.
20
Posteriormente, para a realização da cirurgia, os animais foram posicionados com a cabeça
fixada pelas barras auriculares do aparelho estereotáxico (Insight) e receberam analgésico
via subcutânea (Babamine® injetável pet – flunixina-meglumina – 1,1mg/Kg – Schering).
Logo após a assepsia da pele com solução de álcool iodado, por via subcutânea foi
aplicada lidocaína (anestésico local) contendo vasoconstritor (norepinefrina 2%) para
evitar sagramento durante o procedimento estereotáxico. Feito isto, procedeu-se com a
realização de incisão longitudinal para expor a calota craniana. Utilizou-se peróxido de
hidrogênio (H2O2) para melhor visualização das suturas do tecido ósseo. A torre do
aparelho estereotáxico foi posicionada no ângulo zero e tendo como referência inicial o
bregma. A partir dessas coordenadas, foi definido o ponto da microinjeção, obtido com o
auxílio do atlas de Paxinos e Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). O ponto para a
realização das microinjeções foi o seguinte: -0,4mm ântero-posterior; -1,0mm latero-
lateral; -2,1mm dorso-ventral.
Com as coordenadas da microinjeção estabelecidas, realizou-se a trepanação da
calota craniana utilizando broca odontológica esférica acoplada a um motor. Através do
orifício feito, foi microinjetada no ventrículo lateral direito do cérebro de cada animal
100L de solução contendo 1x105
bacilos da cepa virulenta H37Rv de Mycobacterium
tuberculosis. Terminada a aplicação das microinjeções, colocou-se no local da abertura
pequena quantidade de resina e procedeu-se com a realização de sutura. Durante a
recuperação da anestesia, independentemente do grupo, os animais foram mantidos em sala
do Biotério do Departamento de Imunologia Básica e Aplicada (laboratório de nível III de
biossegurança) da FMRP – USP com atmosfera e temperatura controladas.
A concentração de bacilos utilizada na infecção foi controlada através do
plaqueamento das soluções em Placas de Petri contendo meio de cultura adequado para o
desenvolvimento do Mtb (7H11) e, transcorridas 4 semanas, fez-se a contagem de unidades
formadoras de colônias (UFC) nas placas.
21
3.6 Coleta dos Tecidos
Quatro semanas após a infecção, os animais foram sacrificados e os órgãos cérebro
e pulmão foram coletados. De maneira aleatória, foram selecionados animais cujos tecidos
destinaram-se ao processamento para análise morfológica ou para a determinação de UFC.
3.7 Determinação de Unidades Formadoras de Colônias
Após a retirada cautelosa, os órgãos foram colocados em Placas de Petri contendo
solução de PBS, evitando impurezas. Cada órgão coletado foi separado e colocado em
placas identificadas. Os órgãos foram macerados e submetidos à digestão com liberase.
Feito este procedimento, iniciou-se o plaqueamento, onde foram pipetados 100µL da
solução formada (tecido + solução com enzima). A primeira diluição (1:100 ou 102) foi
seguida das demais (1:1000 ou 103; 1:10000 ou 10
4; 1:100000 ou 10
5) nos compartimentos
identificados da Placa de Petri contendo o meio de cultura 7H11.
Após o plaqueamento do tecido de cada animal de maneira isolada, as placas foram
incubadas em estufa (37ºC) durante quatro semanas para o crescimento das colônias.
Passado esse período de incubação (quatro semanas), foram contadas as colônias formadas.
Para definir o valor preciso, fez-se cálculo simples através da seguinte regra: R = a x 10b
UFC/mL. Onde: R = resultado final; a = o resultado da contagem; b = expoente da diluição
mediante a qual se obteve o resultado de a (1:100 ou 102; 1:1000 ou 10
3; 1:10000 ou 10
4;
1:100000 ou 105); UFC = Unidade Formadora de Colônias.
3.8 Processamento Tecidual para Histologia
Após a dissecção, os tecidos determinados para análise histológica foram
submetidos à pós-fixação em formol tamponado 10% durante 6 horas. Posteriormente, os
tecidos foram submetidos ao processo de desidratação em diferentes concentrações de
etanol e clarificação em xilol. Os tecidos foram inclusos em blocos de parafina para serem
submetidos à microtomia.
22
Os tecidos inclusos em parafina (cérebro e pulmão) foram cortados a 5µm de
espessura com auxílio de um micrótomo histológico (Lupetec MRP-09). Foram realizados
cortes seriados (4 cortes de 5m utilizados e desprezados os 10 cortes subsequentes) para
analisar a morfologia dos tecidos através da coloração com Hematoxilina-Eosina (HE). Na
histologia, utilizou-se lâminas de vidro sem a presença de gelatina ou silano.
O cérebro foi incluso dividindo-o através de um corte coronal, separando-o em duas
porções: anterior e posterior. Cada lâmina contempla dois cortes de cérebro, sendo os
primeiros cortes da parte mais central do órgão e os últimos da parte mais afastada do
centro (Figura 5). Isso com o objetivo de observar os espaços ventriculares, ou seja, que os
cortes iniciais já contemplassem a região dos ventrículos laterais, onde foi provocada a
infecção inicial pelo bacilo. Enquanto o pulmão foi incluso de forma a obter um corte com
maior área para análise histológica.
Figura 5 - Esquema ilustrativo da disposição das porções do cérebro obtidas através de
corte coronal nos blocos de parafina e do tecido nas lâminas histológicas.
As lâminas obtidas contendo os cortes histológicos (5m) foram coradas com HE,
que permitem identificar o tipo de tecido, o formato e a organização das células, uma vez
que esta técnica cora o núcleo (Hematoxilina) e o citoplasma (Eosina) celulares. Para isso,
os cortes dispostos nas lâminas foram lavados em xilol para retirar o excesso de parafina e
reidratados com concentrações decrescentes de álcool (do absoluto ao 70%). Depois de
23
reidratados, os cortes foram corados com HE, desidratados em concentrações crescentes de
álcool (80% ao absoluto), lavados com xilol e cobertos com lamínulas para posterior
análise.
3.9 Aquisição e Análise das Imagens
Com as lâminas coradas, as imagens foram capturadas usando o microscópio óptico
acoplado a um computador com o programa de captura e análise de imagens LAS (Leica).
As fotomicrografias obtidas abrangeram todo o tecido do animal (cérebro e pulmão),
considerando o intervalo de 50µm de distância entre os cortes seriados (4 cortes de 5m
utilizados e desprezados os 10 cortes subsequentes). As lâminas histológicas foram
analisadas sem a interferência do conhecimento de cada grupo. As imagens foram
avaliadas pela Profa. Dra. Luciana Valente Borges, que é doutora em Patologia
Investigativa pela Universidade Federal Fluminense e professora do Departamento de
Educação em Saúde da Universidade Federal de Sergipe (UFS, Campus de Lagarto).
3.10 Descartes
Após a coleta dos tecidos, as carcaças dos animais foram depositadas em sacos
plásticos apropriados e destinadas ao tratamento específico para resíduos infectantes. Esse
processo ocorreu no Centro de Pesquisa em Tuberculose da FMRP-USP.
Os resíduos perfurocortantes foram armazenados em caixas adequadas para
posterior descarte. Os resíduos líquidos provenientes das etapas de processamento tecidual
e colorações foram coletados e armazenados em vasilhames específicos e destinados à
coleta seletiva do Campus São Cristóvão da Universidade Federal de Sergipe (UFS).
3.11 Análise Estatística
Os resultados dos experimentos foram expressos com média ± erro padrão da média
e submetidos a ANOVA, onde foram consideradas estatisticamente significativas as
diferenças com p < 0,05. Foi utilizado o programa computacional GraphPad Prism® versão
6.0 (GraphPad Software, Inc., USA).
24
4. RESULTADOS
4.1 Grupo Piloto - Determinação das coordenadas estereotáxicas
Os animais do grupo piloto apresentaram os ventrículos laterais do cérebro
ocupados pelo corante Azul de Evans, que se distribuiu nos espaços ventriculares cerebrais
logo após a microinjeção dessa substância, como pode ser observado na Figura 6.
Figura 6 – Confirmação dos ventrículos laterais do cérebro
como alvos do local da indução intracerebroventricular.
Observa-se a distribuição do corante Azul de Evans nos espaços
ventriculares do cérebro de camundongo, comprovando que o
local da aplicação da microinjeção realmente atinge o ventrículo
lateral do cérebro de acordo com as coordenadas estereotáxicas.
Objetiva de 4x.
25
4.2 Avaliação Histopatológica de Cérebro e Pulmão
Para verificar o comprometimento dos tecidos cerebral e pulmonar, os cortes
histológicos de todos os grupos foram analisados através da coloração com Hematoxilina-
Eosina.
4.2.1 Cérebro
Nos animais que receberam apenas PBS (Grupo PBS) por via intramuscular e
submetidos à infecção, observou-se a presença de intenso infiltrado inflamatório em
meninges, com presença de edema em tecido subjacente, bem como acometimento do
parênquima e congestão em plexo coróide.
O Grupo Vetor, que recebeu somente o vetor pVAX por via intramuscular na
imunização e foi infectado trinta após a última dose com Mtb H37Rv por via
intracerebroventricular, também apresentou comprometimento do tecido nervoso.
Verificou-se neste grupo um intenso infiltrado inflamatório, envolvendo as regiões do
parênquima cerebral, principalmente nas proximidades dos ventrículos laterais do cérebro
e com desprendimento do tecido, plexo coróide e meninges. Já os animais que foram
imunizados com DNA-hsp65 e posteriormente desafiados com Mtb H37Rv revelaram um
comprometimento tissular atenuado quando comparado com os outros dois grupos (Grupo
PBS e Grupo Vetor), onde foi possível constatar áreas bem preservadas do cérebro,
incluindo plexos coróides e ventrículos, além de infiltrado inflamatório bem mais
focalizado e discreto em meninges (Figura 7).
26
27
Figura 7 – Cortes histológicos de cérebro de cada grupo experimental após trinta dias da infecção. Grupo PBS – A. Plexo
coróide com vasos congestos (setas). D. Intenso infiltrado inflamatório (setas) e edema (ponta de seta) acometendo as meninges.
G. Observa-se comprometimento do parênquima cerebral com infiltrado inflamatório e foco hemorrágico (seta). Grupo Vetor – B.
Presença de infiltrado celular em plexo coróide inflamado (setas). E. Intenso infiltrado inflamatório acometendo as meninges;
meningite desenvolvida pela infecção com a cepa H37Rv de Mtb. H. Extensa inflamação acometendo o parênquima cerebral com
grande infiltrado celular (setas). Grupo Vacinado – C. Plexos coróides e região ventricular preservados sem inflamação (setas). F.
Inflamação discreta acometendo as meninges (seta). I. Presença de infiltrado inflamatório em parênquima cerebral organizado de
forma focalizada (seta). Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina (HE) e observados em microscópio óptico com uma
objetiva de 10x.
28
4.2.2 Pulmão
Os três grupos, assim como os cortes de cérebro, tiveram os pulmões analisados
morfologicamente através de Hematoxilina-Eosina. Nos pulmões dos animais do Grupo
PBS e infectados, observou-se a presença de intenso infiltrado inflamatório no parênquima
do pulmão, evidenciando-se congestão, hiperplasia de septos alveolares, intenso infiltrado
inflamatório peribronquiolar e perivascular, além de hemorragia e presença de macrófagos
com hemossiderina.
Assim como os animais do Grupo PBS, os camundongos imunizados apenas com o
pVAX e infectados com Mtb H37Rv trinta dias após a última dose ser administrada
também apresentaram importante comprometimento do tecido pulmonar, porém, menos
intenso do que o observado no Grupo PBS. Foi possível verificar a presença hemorragia,
septos alveolares espessados, bem como um infiltrado inflamatório nas regiões
perivascular e peribronquiolar. Os pulmões dos animais do Grupo Vacinado, que foram
imunizados com DNA-hsp65 e posteriormente desafiados com Mtb H37Rv após trinta dias
da última dose ter sido administrada, apresentaram, assim como nos demais grupos, com
presença de infiltrado perivascular e peribronquiolar, porém, com comprometimento mais
discreto quando comparados aos pulmões dos animais dos grupos PBS e Vetor (Figura 8).
29
30
Figura 8 – Cortes histológicos de pulmão de cada grupo experimental após trinta dias da infecção. Grupo PBS – É
evidente o intenso infiltrado inflamatório em grande área do tecido pulmonar, podendo-se observar: A. hiperplasia de septos
alveolares (seta preta), inflamação peribronquiolar e perivascular (seta vermelha) e D. vasos congestos (seta amarela) e
infiltrado celular inflamatório acometendo as regiões perivasculares e peribronquiolares (seta vermelha). Grupo Vetor – As
imagens revelam a área tissular do pulmão comprometida, sendo evidenciado: B. hiperplasia de septos alveolares (seta preta),
infiltrado celular peribronquiolar (seta vermelha) e E. infiltrado inflamatório perivascular (seta vermelha) e congestão (seta
amarela). Grupo Vacinado – Verifica-se um tecido pulmonar com menor acometimento inflamatório, tendo C. vasos
congestos (seta amarela) e F. infiltrado perivascular e peribronquiolar mais brando (seta vermelha). Os cortes foram corados
por hematoxilina e eosina (HE) e observados em microscópio óptico com uma objetiva de 10x.
31
*
4.3 Determinação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Trinta dias após o desafio com a cepa H37Rv de Mtb, os camundongos foram
sacrificados e os bacilos presentes nos cérebros foram quantificados através da contagem
de unidades formadoras de colônias (UFC).
Através da Figura 9 observa-se a quantidade de UFC verificada nos cérebros dos
animais de cada grupo. Nota-se que os animais previamente imunizados com o DNA-
hsp65 (Grupo Vacinado) e infectados com a cepa H37Rv de Mtb apresentaram uma
redução significativa no número de bacilos nos cérebros quando comparados aos grupos
PBS (p<0,05) e Vetor (p<0,001).
PB
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Vacin
ad
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Veto
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0
1
2
3
4
5
6
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* * *
* * *
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)
Figura 9 – Determinação do número de UFC no cérebro de
animais imunizados com PBS, pVAX e DNA-hsp65 e desafiados
com H37Rv de Mtb. Camundongos C57BL/6 foram imunizados
com pVAX e DNA-hsp65 ou injetados com PBS e receberam,
trinta dias após a última administração, 105 bacilos H37Rv por via
intracerebroventricular e trinta dias após o desafio os animais
foram sacrificados, os cérebros coletados e homogeneizados. As
amostras foram diluídas e cultivadas em meio 7H11. Quatro
semanas depois, o número de UFC foi analisado e os resultados
foram expressos pela média em escala logarítmica. Observa-se uma
redução no número de bacilos H37Rv de Mtb no cérebro dos
*
32
animais imunizados com o DNA-hsp65. Os resultados foram
obtidos através de ANOVA e estão representados pela média+ erro
padrão da média das 4 amostras analisadas em cada grupo, onde
PBS: camundongos injetados com solução salina e infectados com
M. tuberculosis H37Rv; Vacinado: camundongos vacinados com
DNA-hsp65 e infectados com M. tuberculosis H37Rv ; e Vetor:
camundongos imunizados com o vetor vazio (pVAX) e infectados
com M. tuberculosis H37Rv. * p<0,05 comparando-se o grupo
Vacinado com o grupo PBS; *** p<0,001 comparando o grupo
Vacinado com o grupo Vetor.
33
5. DISCUSSÃO
Existe a necessidade do desenvolvimento de novas alternativas para prevenção da
TB. A BCG é a única vacina usada para prevenir esta doença, mas apresenta características
negativas, como a variabilidade entre as vacinas usadas e ausência de um efeito duradouro
(GÓMEZ; CONDINO NETO, 2006). Com o sequenciamento do genoma da Mtb e o
aprofundamento nos estudos da expressão gênica, existe grande procura por antígenos
protetores. A imunização com plasmídeos de DNA consiste em estratégia promissora para
o desenvolvimento de uma nova vacina contra a TB (TIGHE et. al., 1998; VON REY;
VUOLA, 2002), apresentando muitos motivos de CpG que funcionam como adjuvantes e
induzindo uma resposta imunológica pró-inflamatória, sendo um potente indutor do padrão
de resposta Th1 (KRIEG, 2002).
A forma mais grave de TB é a neuro-TB, podendo apresentar diversos sintomas,
desde febre a convulsões e com alta letalidade (GUPTA; KUMAR, 2011), sendo a falha da
resposta imunológica contra a TB pulmonar responsável pelo acometimento do SNC
(OROZCOE et. al., 1996; DELANCE et. al., 2013). A imunização com DNA-hsp65
apresentou resultados promissores em modelos animais desafiados com Mtb (HUYGEN et.
al., 1996; TASCON et. al., 1996; LOWRIE et. al., 1994; LOWRIE et. al., 1997b), sendo
capaz de curar casos crônicos, TB disseminada, TB latente e TB-MDR (LOWRIE et. al.,
1999; SILVA et. al., 2005). Porém, apesar de muitas pesquisas envolvendo o estudo de
alternativas para o combate da TB pulmonar, a literatura apresenta poucos trabalhos que
investigam alternativas para a prevenção da Neurotuberculose.
Neste estudo, avaliamos o efeito da vacina de DNA-hsp65 na prevenção de lesões
teciduais inflamatórias em um modelo murino de Neurotuberculose Experimental, bem
como a quantidade de unidades formadoras de colônias (UFC) nos cérebros dos animais
imunizados. Utilizamos o modelo experimental de Neurotuberculose desenvolvido em
camundongos C57BL/6 pela pesquisadora Camilla de Aguiar Dalan (2015), seguindo o
modo de infecção, a concentração de bacilos e o intervalo de tempo entre a infecção com o
bacilo e o sacrifício dos animais desafiados. Esse modelo experimental de TB no SNC é de
fundamental importância para a compreensão dos eventos envolvidos na fisiopatologia
dessa doença relacionados ao desenvolvimento e manutenção de lesões tuberculosas no
SNC, pois é semelhante ao curso natural que envolve o acometimento do SNC pelo Mtb.
34
Na maioria das vezes, a doença se desenvolve quando o bacilo consegue atravessar a BHE
pela resposta inflamatória, permitindo que o mesmo atinja o parênquima cerebral depois de
ter sido levado até os ventrículos cerebrais pelo líquido cefalorraquidiano (LCR)
(ZUCCHI, 2007; PASHENKOV et. al., 2002; GAUBA; VARMA, 2005).
Outro modelo murino de TB no SNC utilizado pelo grupo de pesquisa do Dr. Célio
Lopes foi desenvolvido através da inoculação intra-cerebelar de BCG (ZUCCHI, 2007).
Através desse modelo, foi possível verificar uma modulação da expressão de VEGF, um
potente ativador da permeabilidade vascular que participa da quebra da BHE. Nesse
estudo, camundongos vacinados com DNA-hsp65 e posteriormente infectados com BCG
apresentaram expressão reduzida de VEGF em lesões tuberculosas, quando comparados
aos camundongos não vacinados (ZUCCHI et. al., 2013).
Neste estudo, uma das etapas prévias aos tratamentos dos grupos experimentais foi
a utilização de um grupo piloto para realização de estereotaxia com microinjeção do
corante Azul de Evans, que possibilitou a confirmação dos ventrículos laterais do cérebro
dos camundongos como alvos das coordenadas estereotáxicas pela distribuição desse
corante nos espaços ventriculares. Isso foi de fundamental importância, pois permitiu o
prosseguimento do estudo com a realização das etapas subsequentes.
O estudo histopatológico é fundamental para investigar lesões teciduais decorrentes
de processos inflamatórios. Foi realizada análise cega das amostras para a caracterização
morfológica de cérebro e pulmão dos camundongos independente do grupo. Desta forma, a
análise qualitativa permitiu avaliar o comprometimento dos tecidos quanto à presença de
lesões inflamatórias. Os animais do grupo Vacinado apresentaram cérebro com lesões mais
discretas do que os grupos Vetor e PBS. Foram lesões encontradas no tecido nervoso como
desprendimento tissular, meningite, edema, infiltrado inflamatório em parênquima cerebral
e plexo coróide. A presença de regiões bem preservadas do cérebro, inclusive em plexos
coróides e ventrículos, e a observação de um infiltrado inflamatório bem mais focalizado
no parênquima cerebral e discreto nas meninges dos camundongos imunizados com vacina
de DNA-hsp65 sugerem uma tentativa de contenção dos danos teciduais causados pela
infecção com a cepa virulenta H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.
Os pulmões dos animais também foram investigados histopatologicamente. As
alterações teciduais incluem a presença de infiltrado celular, principalmente perivascular e
35
peribronquiolar, hiperplasia de septos, congestão e hemorragia. A presença de
acometimento pulmonar reforça a possibilidade de disseminação da TB através de um foco
latente presente no SNC. Além disso, o grupo de animais que receberam a vacina gênica
apresentou lesões que se restringiram ao infiltrado celular inflamatório perivascular e
peribronquiolar, sem acometimento importante do parênquima pulmonar. Assim,
provavelmente a vacina de DNA-hsp65 também contribui para controlar a disseminação da
doença.
Existe a estimativa de que um terço de toda a população mundial esteja infectado
pelo bacilo da TB. Mas a grande maioria dessas pessoas, mesmo com a presença do Mtb
em seu organismo, não desenvolve a doença pela integridade do sistema imunológico.
Assim, no caso da TB a resposta imunológica eficaz controla a carga bacilar ao ponto de
evitar que o agente se dissemine e provoque a TB. Isso porque existe a formação e
manutenção de granulomas, resposta que mantém o bacilo vivo, porém preso entre
linfócitos T e B e macrófagos (CYKTOR et al., 2013). Então, mesmo sem eliminar
totalmente os bacilos do organismo é possível impedir a doença. Neste estudo, foram
determinadas as unidades formadoras de colônias nos cérebros dos camundongos.
Verificamos uma redução significativa na quantidade de bacilos nos cérebros dos animais
do grupo Vacinado (imunizados com pVAX-hsp65) quando comparada à quantidade de
UFC nos cérebros dos camundongos do grupo Vetor (***p<0,001) e PBS (*p<0,05).
Dessa forma, nossos resultados sugerem que a vacina de DNA-hsp65 é capaz de
diminuir significativamente os danos causados pela infecção da micobactéria da TB no
SNC, reduzindo lesões teciduais inflamatórias no cérebro e pulmão, assim como reduz a
carga bacilar no cérebro de animais com Neurotuberculose e, assim, controlando a doença.
Os mecanismos fisiopatológicos da Neurotuberculose ainda necessitam de
elucidação. É preciso investigar os fatores possivelmente responsáveis pelo
desenvolvimento e manutenção das lesões da TB no SNC, testar drogas e vacinas. Para a
compreensão da fisiopatologia e da modulação da resposta imunológica na TB do SNC é
importante o estudo de mediadores inflamatórios nos animais submetidos à intervenção
profilática ou imunoterapêutica com a vacina de DNA-hsp65, como, por exemplo, a
produção de citocinas e níveis de imunoglobulinas, além do estudo dos tipos celulares
presentes. Assim, novos estudos são necessários para melhor entendimento do papel dessa
vacina na TB do SNC.
36
6. CONCLUSÕES
Camundongos C57BL/6 imunizados com a vacina de DNA-hsp65 e desafiados com a
cepa H37Rv de Mtb apresentaram inflamação reduzida em cérebro e pulmão;
Camundongos C57BL/6 imunizados com DNA-hsp65 e infectados com a cepa H37Rv
de Mtb apresentaram menor quantidade de bacilos no cérebro.
Portanto, a utilização da vacina de DNA-hsp65 mostra-se promissora como agente
profilático no combate a neuro-TB.
37
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45
ANEXOS
ANEXO A – PROCESSAMENTO DE CÉREBRO
Álcool 70% - 30’
Álcool 80% - 30’
Álcool 90% - 30’
Álcool 100% I - 40’
Álcool 100% II - 40’
Álcool-Xilol (1:1) - 15’
Deve-se retirar o excesso de álcool antes de seguir para o Xilol
Xilol I - 60’
Xilol II - 60’
Xilol III - 60’
Novamente retira-se o excesso do xilol para ir para a parafina
Parafina infiltração - 60’
Inclusão da peça
46
ANEXO B – PROCESSAMENTO DE PULMÃO
Álcool 90% = 90’
Álcool 95% = 90’
Álcool 100%= 60’
Álcool 100%= 30’
Álcool-Xilol = 60’
Xilol = 30’
Xilol = 12’ (nessa etapa o pulmão deve ficar até diafanizar)
Xilol = 13’
Parafina 1 = 45’
47
ANEXO C – HEMATOXILINA E EOSINA
Colocar as lâminas em estufa a 60°C por 5 minutos
Xilol I – 2’
Xilol II – 2’
Xilol III – 2’
Álcool Absoluto – 2’
Álcool Absoluto – 2’
Álcool 95% - 2’
Álcool 80% - 2’
Álcool 70% - 2’
Água destilada I – 2’
Água destilada II – 2’
Hematoxilina – 3’
3 Lavagens em água destilada
Água destilada III – 2’
Eosina 1% - 30’’
Álcool 80% - 2’
Álcool 95% - 2’
Álcool absoluto – 2’
Xilol I – 2’
Xilol II – 2’
Xilol III – 2’
Montagem em Entellan®
e lamínula