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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E
PESQUISA
DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ENALDO VIEIRA DE MELO
CD40 LIGANTE SOLÚVEL E OUTROS
BIOMARCADORES DE EVOLUÇÃO CLÍNICA NO
TRATAMENTO ADJUVANTE DA LEISHMANIOSE
VISCERAL HUMANA COM N-ACETILCISTEÍNA
ARACAJU
2014
ENALDO VIEIRA DE MELO
CD40 LIGANTE SOLÚVEL E OUTROS
BIOMARCADORES DE EVOLUÇÃO CLÍNICA NO
TRATAMENTO ADJUVANTE DA LEISHMANIOSE
VISCERAL HUMANA COM N-ACETILCISTEÍNA
2014
ENALDO VIEIRA DE MELO
CD40 LIGANTE SOLÚVEL E OUTROS
BIOMARCADORES DE EVOLUÇÃO CLÍNICA NO
TRATAMENTO ADJUVANTE DA LEISHMANIOSE
VISCERAL HUMANA COM N-ACETILCISTEÍNA
Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde da UniversidadeFederal
de Sergipe como requisito parcial à obtenção
do grau de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Ilmo. Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida
ARACAJU- SE
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Melo, Enaldo Vieira de. CD40 ligante solúvel e outros biomarcadores de
evolução clínica no tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com n-
acetilcisteína. Aracaju, 2014.
101 f.
Orientador: Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida. –.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde - Núcleo de Pós-Graduação em
Medicina) – Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de
Sergipe, 2014..
1. Leishmaniose visceral 2. Tratamento 3. N-acetilcisteina. CD40 ligante
solúvel.
I. Título.
CDU _____________________
ENALDO VIEIRA DE MELO
CD40 LIGANTE SOLÚVEL E OUTROS
BIOMARCADORES DE EVOLUÇÃO CLÍNICA NO
TRATAMENTO ADJUVANTE DA LEISHMANIOSE
VISCERAL HUMANA COM N-ACETILCISTEÍNA
Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde da UniversidadeFederal
de Sergipe como requisito parcial à obtenção
do grau de Doutor em Ciências da Saúde.
Banca Examinadora da Defesa
Aprovada em: _______/_______/_______
______________________________________________
Orientador: Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida
________________________________________________
1° Examinador: Prof. Dra. Vanessa Carregaro – USP
_________________________________________________
2º Examinador: Prof. Dra. Cristiane Bani Correa - UFS
_________________________________________________________
3º Examinador: Prof. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza - UFS
__________________________________________________________
4º Examinador: Prof. Dra. Tatiana Moura Rodrigues – UFS
PARECER
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
AGRADECIMENTOS
A Deus, que na sua infinita bondade concedeu coragem para optar pela
realização desse sonho.
À minha mãe (in memorium) e meu pai pelo carinho e apoio para busca do
Conhecimento.
À minha família, pela compreensão e apoio nos momentos de ausência.
À Universidade Federal de Sergipe (UFS), Aracaju-SE, pela oportunidade de
uso de suas instalações e laboratórios para realização desse trabalho.
A meu orientador Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida pela amizade,
confiança, apoio, incentivo e indispensável orientação durante o desenvolvimento desse
trabalho.
A Juliana,Rose e Simone pela ajuda na digitação.
Aos professores Dra. Tatiana Rodrigues de Moura, Dr. Roque Pacheco de
Almeida e Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus, e demais membros do grupo de pesquisa pelas
orientações e sugestões valiosas e dedicação.
A todos que de qualquer forma contribuíram para realização desse trabalho.
A todos expresso minha gratidão, em especial aos pacientes portadores dessa
condição clínica em que pela importância não deveria ser denominada de negligenciada.
Muito Obrigado.
7
RESUMO
Melo, E. V. CD40 ligante solúvel e outros biomarcadores de evolução clínica no
tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com N-Acetilcisteína. Tese de
doutorado. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. UFS, 2014.
A leishmaniose visceral constitui-se um grave problema de saúde pública no mundo,
demandando medidas eficazes no seu controle e tratamento. A terapêutica atual está
longe de ser a ideal pela necessidade de tratamentos prolongados, desenvolvimento de
resistência aos medicamentos e efeitos colaterais significativos. Desse modo a busca
de novas opções terapêuticas além de avaliação da eficácia de terapêutica adjuvante é
muito importante. O objetivo deste trabalho foi avaliar biomarcadores de evolução
clínica e CD40 ligante solúvel (sCD40L) no tratamento adjuvante da leishmaniose
visceral humana com N-acetilcisteína. A partir de um estudo de intervenção, tipo
ensaio clínico, cego, aleatorizado, foram investigados 60 pacientes do Hospital
Universitário com diagnóstico positivo para leishmaniose visceral aguda. Esses
pacientes foram distribuídos em dois grupos de 30: Grupo Estudo – que fez uso do
antimônio penta valente dose padrão complementado com o N-acetil-L-cisteína e o
Grupo Controle - que fez uso apenas do antimônio dose padrão. Os níveis séricos do
sCD40L foram significativamente maiores e com elevação ao longo do tempo mais
acentuada no grupo SbV + NAC em relação ao grupo Sb
V. Além disso, a distribuição
dos valores de sCD40L aumentaram significativamente em ambos os grupos a partir
de 15 dias de tratamento, a partir de então sem variação significativa ao longo do
tempo. Do mesmo modo a dimensão de baço e níveis séricos de citocinas (TNF-α, IL-
10, IL-12p40) diminuíram ao longo do tratamento nos dois grupos enquanto o número
de neutrófilos, eosinófilos e plaquetas aumentaram.Vários estudos da literatura
assinalam a importância da interação CD40/sCD40L para uma efetiva resposta imune
e que essa interação ocorre por meio de sinalização recíproca através de fosforilação
da proteína quinase mitógeno induzida de MAPK p38 e ERK1/2. Outros estudos
mostram como uma estratégia de evasão da resposta imune e o estabelecimento de
infecção, a Leishmania inibe a sinalização p38MAPK acionada pelo CD40. E que o
sistema redox de glutationa regula produção de IL-12 induzida pela LPS através da
ativação da p38 MPAK e, além disso, o efeito de iniciação de IFN-γ e a produção de
IL-12 é em parte uma conseqüência do equilíbrio redox da glutationa. O NAC foi
capaz de aumentar as concentrações séricas de sCD40L ao longo do tratamento. O
tratamento com NAC melhorou os parâmetros clínicos dos pacientes associados com o
prognóstico dos pacientes: reduziu tamanho do baço, aumento do número de
neutrófilos/linfócitos e eosinófilos mais rapidamente. Os resultados sugerem que a
adição do NAC ao tratamento convencional melhora a resposta imunológica dos
pacientes, sobretudo na diminuição dos níveis séricos de IL-10, IL-12p40 e na
elevação da sDC40L que essa resposta ocorre já a partir de duas semanas. É provável
que o aumento dos níveis de sCD40L pelo NAC ocorra através da ativação do MAPK
p38 via o sistema redox de glutationa.
Descritores: leishmaniose visceral; tratamento; NAC; biomarcadores; CD40
ligante solúvel.
8
ABSTRACT
Melo, EV. CD40 ligante solúvel e outros biomarcadores de evolução clínica no
tratamento adjuvante da leishmaniose visceral humana com N-Acetilcisteína. Tese de
doutorado. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. PhD thesis.Graduate
Program in Health Sciences.UFS, 2014.
Visceral leishmaniasis constitutes a serious public health problem in the world,
demanding effective measures for its control and treatment. The current treatments are
far from ideal for the need for prolonged treatment, development of drug resistance
and significant side effects. Thus the search for new therapeutic options in addition to
evaluating the effectiveness of adjuvant therapy is very important. The aim of this
study was to evaluate biomarkers sCD40L and clinical outcome in the adjuvant
treatment of human visceral leishmaniasis with N-acetylcysteine. From an intervention
study, kind clinical trial, blinded, randomized, were investigated 60 patients from the
University Hospital with a positive diagnosis for acute visceral leishmaniasis. These
patients were divided into two groups of 30: Study Group - which made use of
antimony penta valent standard dose supplemented with N-acetyl-L-cysteine and the
control group - which only used the standard dose antimony. The serum levels of
soluble ligand sCD40L were significantly higher elevation and steeper over time in
SbV + NAC group compared to the Sb group. Furthermore, the distribution of values
sCD40L significantly increased in both groups after 15 days of treatment, thereafter no
significant change over time. Likewise the size of the spleen, and serum cytokine
levels (TNF-α, IL-10, IL-12p40) decreased during treatment in both groups while the
number of neutrophils, eosinophils and platelets increased. Several published studies
indicate the importance of CD40 / sCD40L interaction for an effective immune
response and that this interaction occurs via reciprocal signaling through protein
kinase-induced phosphorylation of MAPK p38 and ERK1 / 2 mitogen. Other studies
show as a strategy of evading the immune response and the establishment of infection,
Leishmania inhibits p38 MAPK signaling triggered by CD40. And the glutathione
redox system regulates the production of IL-12 induced by LPS through the activation
of p38 MPAK, and furthermore, the effect initiation of IFN-γ and IL-12 is in part a
consequence of the equilibrium glutathione redox. NAC was able to increase serum
sCD40L concentrations throughout treatment. Treatment with NAC improved the
patients' clinical parameters associated with the prognosis of the patients: reduced
spleen size increased number of neutrophils / lymphocytes and eosinophils faster. The
results suggest that the addition of NAC to conventional therapy improves the immune
response of patients, particularly in the reduction of serum IL-10, IL-12p40 and
increase in sDC40L that this response occurs as early as two weeks. It is likely that
increased levels of sCD40L the NAC occurs through the activation of p38 MAPK
pathway glutathione redox system.
Keywords: Visceral leishmaniasis; treatment; NAC; biomarkers; soluble CD40 ligand.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 O modelo proposto para a regulação recíproca de sinalização de
CD40 na infecção Leishmania por MKP-1 e de MKP-3
28
Figura 02 Glutationa (1): γ-L-glutamil-L-cisteinilglicina 35
Figura 03 Biossíntese da glutationa e enzimas envolvidas 35
Figura 04 Correlação dos níveis de ligante solúvel (sCD40L) e tamanho
do baço ao longo do tratamento
53
Figura 05 Distribuição dos níveis de ligante solúvel (SCD40L) ao longo
do tratamento, segundo os grupos SbV + NAC e Sb
V
56
Figura 06 Distribuição das medidas de baço (cm) ao longo do tempo para
o grupo SbV + NAC
57
Figura 07 Distribuição dos níveis de TNF-α ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
57
Figura 08 Distribuição dos níveis de IL-12 p40 ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
58
Figura 09 Distribuição dos níveis de IL-10 ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
58
Figura 10 Distribuição dos níveis de sCD40L ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
59
Figura 11 Distribuição do número de neutrófilos ao longo do tempo para
o grupo SbV + NAC
59
Figura 12 Distribuição do número de eosinófilos ao longo do tempo para
o grupo SbV + NAC
60
Figura 13 Distribuição do número de linfócitos ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
60
Figura 14 Distribuição do número de plaquetas ao longo do tempo para o
grupo SbV + NAC
61
Figura 15 Distribuição das medidas de baço (cm) ao longo do tempo para
o grupo SbV
62
Figura 16 Distribuição dos níveis de TNF-α ao longo do tempo para o
grupo SbV
62
Figura 17 Distribuição dos níveis de IL-12 p40 ao longo do tempo para o
grupo SbV
63
Figura 18 Distribuição dos níveis de IL-10 ao longo do tempo para o
grupo SbV
63
Figura 19 Distribuição dos níveis de sCD40L ao longo do tempo para o
grupo SbV
64
Figura 20 Distribuição do número de neutrófilos ao longo do tempo para
o grupo SbV
64
Figura 21 Distribuição do número de linfócitosao longo do tempo para o
grupo SbV
65
Figura 22 Distribuição do número de eosinófilos ao longo do tempo para
o grupo SbV + NAC
66
Figura 23 Distribuição do número de plaquetas ao longo do tempo para o
grupo SbV
66
10
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida
anti-K39 Teste rápido para calazar, antígeno recombinante K39
APCs Células apresentadora de antígenos
B7/CD28 Protéina de membrana B7/proteína expressa em células T
BALB/c linhagem de camundongos albinos
Ca²+ Íon cálcio
CD40 Proteína receptora de membrana da família do fator de
necrose tumoral
CXCR2 Quimiocinas com cisteína
CMSP Células mononucleares do sangue periférico
ELISA Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima
DCs Células dendríticas
Delta-like 1 Proteína humana codificada pelo gen DLL1
DTN Doença tropical negligenciável
ERK 1/2 Proteína cinase regulada por sinais extracelulares
GGT Gama glutamil transferase
GSH Glutationa ≡ γ-glutamil-cisteinil-glicina
GSSG Glutationa oxidada
HO-1 Hemeoxigenase
Hmox1 Gene humano que codifica a enzima heme oxigenase 1
H2O2 Peróxido de hidrogênio
iNOS Enzima sintase indutora de oxido nítrico
IFN-λ Interferon gama
IP3 Fosfatidil-3- inositol
JNK1-3 Janus quinases 1-3
LPS Lipopolissacarídeo
LV Leishmaniose visceral
MAPKs Proteína sintase mitógeno ativada
p38 MAPK Proteína sintase mitógeno ativada p38
NAC N-acetilcisteína
NADPH Complexo enzimático da NADPH oxidase
NF-kB Fator de transcrição nuclear kappa B
NK Natural killer
NO Óxido nítrico
PI3K Fosfatidil inositol-3-cinase
PKC Proteína cinase C
RNS Radicais livres de nitrogênio
ROS Radicais livres de oxigênio
SbV Antimônio pentavalente
Th1 T "helper" tipo 1
Th2 T "helper" tipo 2
sCD40 Forma solúvel de CD40
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 13
2 REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS DA PESQUISA 19
2.1 Leishmaniose visceral: considerações gerais e epidemiologia 19
2.2 O ciclo de vida da leishmania 20
2.3 Diagnóstico 21
2.4 Quadro clínico 23
2.5 Resposta imune e biomarcadores de evolução clínica na LV 24
2.6 Tratamento 32
2.7 Limitações do tratamento 33
2.8 Tratamento adjuvante: Glutationa e Análogos 35
3 OBJETIVOS 43
3.1 Objetivo geral 43
3.2 Objetivos específicos
4 PACIENTES E MÉTODOS 46
Desenho do estudo
Área do estudo
Definição diagnóstica
Seleção dos pacientes
Tratamento e seguimento
Procedimentos realizados antes da entrada dos pacientes no estudo
Procedimentos realizados durante o tratamento
Critérios de cura
Dosagens de citocinas
Análise estatística
Considerações éticas
Consentimento livre e esclarecido
Contribuições do projeto
Riscos e cuidados instituidos
5 RESULTADOS DO ENSAIO CLÍNICO 52
5.1 Caracterização basal do grupo teste e grupo controle 52
5.2 Resposta clínica e laboratorial ao tratamento e comparação entre os 53
12
grupos
5.3 Avaliação de biomarcadores ao longo do tratamento para os grupos
teste e controle
55
5.3.1 Biomarcadores e sSCD40L, comparação entre os grupos no antes
do tratamento
55
5.3.2 Biomarcadores e sSCD40L, comparação entre os grupos durante o
tratamento
56
5.3.3 Biomarcadores e sSCD40L, características clínicas e laboratoriais,
evolução com o tratamento para o grupo SbV + NAC
57
5.3.4 Biomarcadores e sSCD40L, características clínicas e laboratoriais,
evolução com o tratamento para o grupo SbV
62
5.4 Correlação dos níveis de citocinas entre si e tamanho de baço e
fígado
68
5.5 Resumo dos resultados 69
6 DISCUSSÃO 71
7 CONCLUSÕES 75
8 PERSPECTIVAS: QUESTÕES A SEREM REPONDIDAS 76
9 REFERÊNCIAS
10 ANEXO A 96
13
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença tropical causada por
protozoários do gênero Leishmania e transmitida por um vetor flebotomíneo,
constituindo significativo problema de saúde pública e considerada endêmica em 65
países (distribuídos na Ásia, Europa, Oriente Médio, África e Américas) com 90% dos
casos relatados a partir de Bangladesh, Índia, Brasil, Nepal, Etiópia e Sudão (WHO,
2010).
A LV é um crescente problema de saúde pública no Brasil, com altos índices de
letalidade, ampla distribuição geográfica, diferenças regionais consideráveis e crescente
disseminação para áreas não endêmicas. O diagnóstico precoce e a instituição de
medidas terapêuticas eficazes são estratégias fundamentais para reduzir a letalidade de
pacientes portadores dessa condição clínica (MARTINS-MELO et al., 2014).
A evolução clínica da leishmaniose visceral resulta da interação vetor, parasita e
hospedeiro, segundo Mccall (2012), sendo os fatores inerentes ao parasita e ao
hospedeiro determinantes chaves na expressão da doença.
A resposta imune contra a Leishmania é modulada por vários fatores inerentes
ao hospedeiro, como o estado nutricional, idade e a herança genética, assim como
fatores intrínsecos do parasita, por exemplo: a espécie e a cepa. A infecção é geralmente
auto-limitada e assintomática, mas eventualmente evolui para a forma mais grave,
caracterizada por febre, caquexia profunda, hepatoesplenomegalia, sangramentos graves
e até morte se o tratamento adequado não for instituído (CALDAS et al. 2005).
A atividade antileishmania é mediada através de ambas: imunidade inata
(macrófagos, neutrófilos) e adaptativa (células B, células T e células dendríticas≡ DCs),
com os macrófagos desempenhando papel crucial na infecção por Leishmania. Um
tratamento bem sucedido de qualquer forma de leishmaniose depende da eliminação
eficiente de parasitas por macrófagos ativados. Assim, os macrófagos atuam com dupla
atividade: células hospedeiras e células efetoras que matam os parasitas. A
internalização da Leishmania por macrófagos leva à produção de citocinas pró-
inflamatórias e morte do parasita (KEDZIERSKI, 2010).
A sinalização celular pode ser regulada por duas classes principais de enzimas,
proteínas cinases e fosfatases fosfoproteínas (SUN e TONKS, 1994; HUNTER , 1995),
14
e uma vez que os sinais são transduzidos em cascatas de quinases (proteína
quinase≡PKC, MAPKs≡proteína quinase ativada por mitógeno e fosfatidilinositol-3-
cinase≡PI3K) e fosfatases (proteína tirosina fosfatase 1 ≡SHP 1) por meio de ciclos de
fosforilação e desfosforilação, a interferência parasitária freqüentemente tem como alvo
esses intermediários de sinalização celular (OLIVIER, GREGORY, FORGET, 2005).
Segundo Bhardwaj e col. (2010), a Leishmania modula a responsividade de
receptores em macrófagos: proteínas co-estimuladoras CD40/sCD40L (proteína CD40 e
seu ligante solúvel sCD40L), as MAPKs, receptores Toll-Like (TLRs), receptores de
interferon gama (IFN-γ) e receptor de interleucina 10 (IL-10). Dessa forma, o parasita
interfere com o sistema de sinalização da célula de tal modo que as funções efetoras
desencadeadas por vários receptores de superfície celular ou são ativamente reprimidas
ou são alteradas para provocar uma resposta imune favorável à sobrevivência do
parasita (BHARDWAJ et al., 2010).
Estudos de Kamanaka e col. (1996) mostraram como a comunicação celular
através de moléculas co-estimuladoras, tais como B7/CD28 e CD40/sCD40L, foi capaz
de modular a apresentação de antígeno, e sugerem ainda que a inibição da ligação
CD40/sCD40L foi responsável pela ausência da enzima óxido nítrico sintase (iNOS) e
atividade microbicida do macrófago. Segundo Campbell e col. (1996), uma resposta
clínica efetiva contra a infecção por L. major depende da ativação da ligação
CD40/sCD40L. Verificou-se ainda que a sinalização dependente de MAPK p38
desencadeada pela interação com o receptor CD40 foi alterada em macrófagos
infectados, foi associada a diminuição da expressão de iNOS (AWASTHI e al., 2003).
As citocinas são os principais orquestradores no processo de defesa celular, com
papel central na modulação da resposta imune do hospedeiro contra a infecção por
Leishmania, e determinam a prevenção ou progressão da doença de acordo com
Bhattacharjee e Bhattacharya (2010). Desse modo, o estudo da evolução dos níveis
desses biomarcadores ao longo do tratamento é importante para monitorizar o sucesso
terapêutico e predizer a evolução favorável da LV (Oliveira et al., 2013). Além disso,
postula-se que a avalição dos níveis de biomarcadores de evolução clínica durante o
tratamento da LV possibilita o estudo das diferentes vias de sinalização celular ativadas.
Em indivíduos com a forma ativa da leishmaniose visceral observa-se um
balanço nas respostas inflamatórias e reguladoras (Th1/Th2), com altos níveis
plasmáticos de citocinas IL-8, IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-12 e IL-10. (BARRAL-NETTO
et al. 1998; PERUHYPE-MAGALHÃES et al. 2006).
15
Caldas et al. (2005) sugerem que o IFN-γ e IL-10 são as citocinas mais
associadas à progressão para a doença e, após o tratamento, a recuperação do perfil
imunológico a seus níveis normais demanda longo tempo, o que impede a utilização dos
níveis de citocinas plasmáticas como critério de cura.
Por outro lado, os resultados apresentados por Duthie et al. (2013) indicaram
que os níveis de citocinas inflamatórias e regulatórias (IFN-y, TNF-α, IL-10, IL-17)
foram elevadas no soro de portadores de LV do Brasil e Bangladesh. E em pacientes
brasileiros com LV tratados com antimoniato de meglumina foi observado várias
citocinas que revertem para níveis comparáveis aos de indivíduos controles endêmicos
saudáveis.
A resposta imunológica inata ou adaptativa de pacientes com leishmaniose
visceral também pode ser modulada pela glutationa e enzimas relacionadas. Esse
complexo enzimático é importante fator na regulação da vida celular, desempenhando
as funções antioxidante, pró-oxidante, modulação através do estado redox de
grupamentos tióis de proteínas (resíduos de cisteína), além de proteção celular contra
toxinas endógenas e xenobióticos (MORRIS et al., 2013;POMPELLA et AL., 2003).
A ação antioxidante da GSH (e/ou, em casos selecionados, a sua ação "pró-
oxidante" mediada pela gama glutamil transferase ≡ GGT) é capaz de afetar o estado
redox de tióis críticos em proteínas, o que faz da GSH um fator de modulação celular
crucial para um número cada vez maior de proteínas (canais e transportadores de
membrana, receptores, quinases protéicas e fosfatases, transdutores, etc). Interações
desse tipo também foram documentadas com fatores de transcrição, o que indica para o
GSH mais um papel fisiológico na modulação da expressão gênica (SEN, 1998;
ARRIGO, 1999).
Segundo Kidd (1997), a glutationa em sua forma reduzida (GSH) é o mais
importante sistema antioxidante para proteção e regulação da homeostase celular;
enquanto Hayes e McLellan (1999) afirmam que o sistema de peroxidase de GSH é
crítico como um mecanismo de defesa contra peróxido de hidrogênio potencialmente
tóxico e outros peróxidos, incluindo hidroperóxidos lipídicos.
Peterson, Herzenberg e colaboradores (1998) mostraram em seus estudos com
camundongos que a depleção da glutationa de células apresentadoras de antígenos
(APCs) in vivo resultou em baixa atividade Th1 e maior atividade Th2, assim como a
reposição de GSH teve exatamente o efeito oposto. Além disso os macrófagos
apresentam a maior parte de sua glutationa na forma reduzida (macrófagos reduzidos ≡
16
M R) e são efetivos em polarizar a resposta imune para Th1. Já os macrófagos com a
glutationa oxidada (principalmente macrófagos oxidados≡ MO) são capazes de
polarizar a resposta Th2. Assim, parece que a atividade imunológica para Th1 ou Th2
depende da capacidade antioxidante relativa das células que dirigem o processo.
(MURATA; SHIMAMURA; HAMURO, 2002; MURATA et al., 2002).
Uma das formas de alterar o estado de oxidação do macrófago é através dos
níveis de GSH, porém para a sua síntese o fator limitante é a disponibilidade de cisteína.
Além disso, segundo Kidd (1997), o composto N-acetilcisteína (NAC) é um precursor
de cisteína com boa disponibilidade, configurando-se assim como uma opção atraente
para reposição dos níveis de GSH celular.
Monteiro et al. (2008) avaliou os efeitos do NAC, como suplemento GSH, no
curso da infecção por Leishmania amazonensis em camundongos BALB/c sensíveis. O
tratamento com NAC (200 mg/kg/dia) mostrou-se eficaz em aumentar os níveis de GSH
nos linfonodos e baço. Este tratamento causou uma diminuição significativa no número
de parasitas retirados das lesões e drenados dos linfonodos. Tais dados sugerem que a
morte intracelular das leishmanias in vivo foi aumentada com a elevação dos níveis de
GSH através da administração de NAC.
Estudo de Utsugi e cols. (2002) sugere que a produção de IL-12, induzida por
LPS e a partir de monócitos humanos, é regulada pelo redox da glutationa,
especificamente a razão GSH/GSSG intracelular, sob a mediação de p38 MAPK
quinase, e que IFN-γ, originado de monócitos, conduz a um aumento intracelular de
GSH/GSSG, que provavelmente também aumenta a produção de IL-12 induzida por
lipopolisscaride (LPS) via p38 MAP quinase.
Também tem sido mostrado que a ativação da proteína quinase ativada por
mitógeno (MAPKs) desempenha um papel central na indução da expressão gênica de
HO-1 (COULTHARD et al., 2009; KYRIAKIS e AVRUCH, 2001). A comunicação
intracelular entre receptores de membrana e os seus alvos nucleares ou citoplasmáticos
após estimulação é mediada por um grande número de vias de sinalização, incluindo
cascatas do grupo MAPK. Este grupo inclui quatro cascatas distintas, que são nomeadas
após o estágio das MAPKs: 1)-por sinal extracelular regulador quinase 1 e 2 (ERK1/2);
2) c-Jun N-terminal quinase 1 a 3 (JNK1-3); 3) p38 MAPK e 4) ERK5 (Big MAPK)
(WORTZEL e SEGER, 2011).
A depleção de glutationa aumenta os marcadores de estresse oxidativo,
incluindo hemeoxigenase (HO-1), uma enzima chave desencadeada por estresse celular.
17
Os pacientes com LV apresentam concentrações sistêmicas mais elevadas de HO-1 do
que os indivíduos saudáveis, e esse aumento de HO-1 foi reduzido após o tratamento
leishmanicida, sugerindo que a HO-1 também está associada com a susceptibilidade à
doença. A infecção por L. chagasi ou lipofosfoglicano (LPG), isolado a partir de
promastigotas, desencadeia a produção de HO-1 em macrófagos de camundongos (LUZ
et al., 2012).
Um fator crítico para a resposta protetora precoce contra Leishmania
(MURRAY E NATHAN, 1999) são as espécies reativas de oxigênio, ativadas pelo
complexo nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase (DE LEO et
al., 1996) e, segundo Shadab e Ali (2011), essa função efetora fazdos macrófagos
potencialmente microbicidas.
O gene HO-1 também é induzido por agentes e produtos químicos que
produzem estresse oxidativo celular e envolve a geração de radicais livres de oxigênio
(ROS). A este respeito, HO-1 tem sido reconhecido como uma resposta geral ao estresse
oxidativo, incluindo várias vias de sinalização celular (IMMENSCHUH e
RAMADORI, 2000; WAGENER et al., 2003).
Acumulam-se evidências de que muitos indutores da HO-1 ativam cascatas de
sinalização proteína-dependente de fosforilação e convergem para os fatores de
transcrição que regulam o gene da HO-1 (RYTER; ALAM; CHOI, 2006). Estudos
recentes têm mostrado o papel importante para as MAPKs na ativação da HO-1, embora
outras quinases, incluindo tirosina quinases, PI3K e proteína quinases A, G, C também
se configuram como potenciais mecanismos de contribuição (ELBIRT e
BONKOVSKY, 1999; IMMENSCHUH e RAMADORI, 2000).
Segundo Guerrin et al. (2002), o arsenal terapêutico contra a leishmaniose
visceral é limitado, os agentes disponíveis de eficácia comprovada são injetáveis eos
antimoniais penta valentes, a base do tratamento, não podem mais ser usados no
nordeste da Índia, onde a incidência de leishmaniose visceral é maior por conta da
resistência. Os medicamentos de segunda linha tradicionais (pentamidina e anfotericina
B) são mais tóxicos e de difícil administração, assim como as novas formulações de
anfotericina B não são acessíveis em países menos desenvolvidos.
Segundo Wu e Batist (2013), a modulação dos níveis de GSH e a atividade de
enzimas relacionadas configuram-se como uma promessa em uma variedade de
contextos terapêuticos e constituem uma meta de atividade de pesquisa: o
18
desenvolvimento de uma variedade de precursores ou análogos quimicamente
modificados para mimetizar vários efeitos fisiológicos ou farmacológicos da glutationa.
Considerando a capacidade do GSH para modular as várias vias de sinalização
celular, incluindo as descritas acima, as quais favorecem o hospedeiro contra o parasita,
foi utilizado a NAC (análogo da glutationa) como adjuvante no tratamento da
leishmaniose visceral. A hipótese é que o NAC irá modular a resposta imune inata e
adaptativa, com aumento do efeito leishmanicida e ativação da resposta imune
protetora.
Portanto, o presente trabalho tem por objetivo realizar ensaio clínico para
avaliar os níveis de sCD40L e demais biomarcadores de evolução clínica no tratamento
adjuvante com N-Acetilcisteína na leishmaniose visceral humana ( Ensaio clínico).
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 LEISHMANIOSE VISCERAL: CONSIDERAÇÕES GERAIS E
EPIDEMIOLOGIA
A leishmaniose visceral é uma doença causada por parasitas do complexo L.
donovani - L. infantum e transmitida aos seres humanos e outros mamíferos através de
flebótomos, maioria das infecções são assintomáticas, embora o acompanhamento
longitudinal mostre que algumas vítimas, eventualmente, desenvolvem leishmaniose
visceral clínica, sendo a desnutrição e imunossupressão, nomeadamente a infecção pelo
HIV, predisponham à doença clínica (MURRAY et al., 2005; WHO, 2010).
Considerada uma das doenças tropicais negligenciadas (DTN) (WHO, 2012), a
leishmaniose pode ser causada por cerca de 20 espécies e incluem um ciclo de vida
complexo que envolve vários artrópodes vetores e como reservatório diversos espécies
de mamíferos (READY, 2014).
Os parasitas que causam a leishmaniose são encontrados em 88 países ao redor
do mundo, principalmente na América do Sul e Central, África, Ásia e sul da Europa.
No entanto, mais de 90% das infecções potencialmente fatais ocorrem em apenas seis
países: Brasil, Etiópia, Sudão, Sudão do Sul, Índia e Bangladesh. Poucos estudos
analisaram a distribuição da leishmaniose em diferentes países, desse modo ainda não se
dispõe de um quadro completo da situação da doença em uma escala global (PIGOT et
al., 2014).
As leishmanioses são classificadas como o líder entre as DTN em termos de
mortalidade e morbidade com uma estimativa de 50.000 mortes em 2010 (LOZANO et
al., 2012) e 3,3 milhões de incapacitações, ajustados por anos de vida (MURRAY et al.,
2012).
A leishmaniose visceral corresponde a sua forma mais grave e é caracterizada
por febre, caquexia profunda, hepatoesplenomegalia, sangramentos graves e pode
evoluir para a morte se não tiver tratamento adequado.
Na América Latina, a LV é causada por Leishmania infantum (Leishmania
chagasi) (ROMERO E BOELAERT, 2010), possui como vetor os flebotomíneos do
gênero Lutzomyia (BRASIL, 2006) e o cão doméstico é o principal reservatório do
20
parasita em áreas urbanas (GONTIJO e MELO, 2004; ROMERO E BOELAERT,
2010).
No Brasil desde os anos 1980, a distribuição geográfica da LV tem se expandido
com o aumento da urbanização, e a doença se espalhou para todas as regiões do país, em
contínua expansão para áreas não-endêmicas (GONTIJO e MELO, 2004; DANTAS-
TORRES e BRANDAO-FILHO, 2006; MAIA-ELKHOURY et al., 2007; WERNECK,
2010).
De acordo com Martins-Melo et al. (2014) as maiores taxas de mortalidade no
Brasil foram observadas nas menores de um ano e maiores de 70 anos residentes em
áreas endêmicas. E o maior número de casos e mortes relatadas em populações infantis
(GONTIJO e MELO, 2004; BORGES, B. K. et al., 2008; QUEIROZ, ALVES,
CORREIA, 2004) pode ser explicada pelo contato mais freqüente com animais
reservatórios e vetores em relação aos adultos, maiores taxas de deficiência nutricional,
e um estado imunológico em formação, levando à redução da imunidade específica
(BORGES, B. K. et al., 2008; QUEIROZ, ALVES, CORREIA, 2004).
A região Nordeste, principal região endêmica, apresentou as maiores taxas de
mortalidade e risco de morte com aproximadamente o dobro da média nacional. O
elevado número de casos e mortes na região reflete a vulnerabilidade ambiental e social,
favorecendo a disseminação da doença. Além disso, o forte aumento do número de
casos e mortes em outras regiões brasileiras reflete a expansão geográfica e processo de
urbanização nas últimas décadas (GONTIJO e MELO, 2004; WERNECK, 2010)
Fatores relacionados a mudanças na ocorrência de padrões geográficos como
resultado da intensa migração das populações rurais para a periferia das médias e
grandes cidades associadas à pobreza, habitação precária, ao desmatamento
descontrolado e um número crescente de cães infectados contribuíram para a expansão
do LV e aumento letalidade (WERNECK, 2010; MADALOSSO et al., 2012).
2.2 O CICLO DE VIDA DA LEISHMANIA
Os parasitas tripanosomatídeos do gênero Leishmania tem um ciclo de vida
dimórfico dividido entre a fase promastigota no vetor flebotomíneo e um estágio
amastigota em hospedeiros mamíferos. A forma promastigota é flagelada, o que lhe
confere mobilidade, além de ser extracelular e de morfologia alongada, com
21
desenvolvimento e multiplicação dentro do trato alimentar da fêmea do flebotamíneo,
ocorrendo a transmissão por inoculação durante o repasto sanguíneo deste vetor nos
mamíferos (ROBERTS, 2006; SAHA et al., 2006).
O estágio promastigota flagelado é transmitido para o hospedeiro mamífero
pela picada de um mosquito infectado (gênero Phlebotomus ou Lutzomyia) durante o
repasto sanguíneo (BANULS, HIDE e PRUGNOLLE, 2007). Os neutrófilos são as
primeiras células recrutadas para o local da picada e capturam as formas promastigotas
por fagocitose. Os parasitas são então absorvidos pelas células dendríticas e os
macrófagos, ou através de fagocitose de parasitas livres ou de neutrófilos infectados
(RIBEIRO-GOMES et al., 2012).
Os macrófagos representam a principal célula hospedeira de parasitas
Leishmania. Dentro do fagolisossoma do macrófago, o aumento da temperatura e
diminuição do pH induz o promastigota a diferenciar-se na forma amastigota. As
amastigotas podem infectar outros macrófagos ou serem aspirados por flebótomos. No
intestino dos flebotomíneos, as formas amastigotas se diferenciam em pro cíclicos (não-
infecciosa) promastigotas. As formas promastigotas tornam-se maduras à medida que
migram anteriormente no intestino do mosquito, transformando-se na forma metacíclica
(infecciosa) e acumulando-se na junção do intestino médio e intestino anterior e na
probóscide, completando assim o ciclo de vida do parasita (SACKS e KAMHAWI,
2001; BANULS, HIDE e PRUGNOLLE, 2007).
2.3 DIAGNÓSTICO
A presença de sintomas como febre e disfunções hepáticas e esplênicas, comum
a outras infecções, dentre elas malária e tuberculose, possibilita a confusão no
diagnóstico dos pacientes sintomáticos de calazar. Dados epidemiológicos em conjunto
com achados clínicos e exames laboratoriais devem direcionar para a suspeita de
leishmaniose visceral. O método padrão de diagnóstico é a biópsia para o exame
parasitológico do tecido afetado, o que é feito a partir da punção em linfonodos, baço,
fígado ou medula óssea, sendo o material examinado em lâminas coradas, obtendo-se
uma taxa de positividade por volta de 80%. Ainda para o diagnóstico parasitológico
esse material colhido por punção pode ser cultivado em meios apropriados ou inoculado
em hamster (PASTORINO et al., 2002; RATH, et al., 2003; SAHA et al., 2006).
22
O diagnóstico precoce como medida de controle da LV ainda não constitui uma
realidade em nosso meio. A elevada taxa de indivíduos já apresentando emagrecimento,
queda de cabelo, palidez e protrusão abdominal devida à hipertrofia do baço e do
fígado, denota o prolongado tempo decorrido entre a manifestação dos primeiros sinais
e sintomas e o diagnóstico da infecção, observando-se em alguns locais uma demora
média de 60 dias (SILVA et al., 2008).
A inerente resposta humoral do calazar vem sendo aproveitada no
desenvolvimento de exames diagnósticos mais específicos dessa infecção. Para tanto,
anticorpos contra os antígenos das formas promastigota e amastigota, assim como suas
frações e mesmo antígenos recombinantes são utilizados em testes imunológicos a
exemplo do ELISA (ensaio imunoadsorvente ligado à enzima), hemoaglutinação,
imunofluorescência indireta (IFI) e, destacando-se, o teste de aglutinação direta, que usa
diferentes antígenos, e o “strip test.”, que detecta a presença de IgG contra o antígeno
recombinante K39 (rK39) e que pode ser utilizado no diagnóstico de calazar causado
por L. donovani,L. chagasi ou L. infantum (SAHA et al., 2006).
Ainda assim, os testes sorológicos apresentam limitações como sensibilidade
inadequada, alto custo, resultado falso negativo em presença de imunodeficiência, e
reações cruzadas com outros parasitos, a exemplo de Plasmodium, Mycobacterium,
Trypanosoma e Schistosoma.Quanto ao rK39, outro fator limitante ao seu uso é a
produção de IgG anti-K39 em indivíduos saudáveis habitantes de áreas endêmicas e
também, por um longo período (em alguns casos até dois anos), nos pacientes curados
após tratamento (PASTORINO et al., 2002; ROBERTS, 2006; SAHA et al., 2006).
Mesmo a pesquisa de antígenos da leishmania usando-se a técnica PCR
(Polymerase Chain Reaction), a qual apresenta alta sensibilidade e alta especificidade,
tem sua limitação quanto ao uso em pacientes de áreas endêmicas, devido à elevada
exposição antigênica a que essas pessoas estão submetidas em tais regiões
(PASTORINO et al., 2002).
Desse modo, segundo Elmahallawy et al. (2014) a seleção do teste sorológico
adequado para o diagnóstico deve ser baseado em diferentes parâmetros como região,
custo, sensibilidade, especificidade, viabilidade, sustentabilidade e campo de
aplicabilidade, especialmente em áreas endêmicas problemáticas, pois a detecção de
respostas de anticorpos aos antígenos parasitários tem limitações inerentes ( níveis de
anticorpos séricos elevados em pacientes com LV sintomáticos e assintomáticos e com
permanência durante vários anos pós-tratamento, o que complica o diagnóstico de
23
recaída). Além disso, a especificidade desses testes em áreas endêmicas é variável por
conta de certo número de indivíduos sem LV clínica que têm anticorpos, prejudicando
essa especificidade. Por sua vez a presença de co-infecção por Leishmania/HIV pode
aparecer sem os sinais clínicos típicos. Um teste sorológico ou parasitológico adicional
molecular ou outro pode ser necessário para chegar a um diagnóstico preciso, se os
resultados dos testes sorológicos são negativos.
2.4 QUADRO CLÍNICO
As manifestações clínicas da leishmaniose visceral variam amplamente, desde
a forma assintomática, até as formas oligossintomática e progressiva da doença, com
severas manifestações como febre, caquexia, hepatoesplenomegalia,
hipergamaglobulinemia, pancitopenia, anemia, hemorragias, taquicardia, e ainda, em
alguns casos, são encontradas tosse e diarréia. A desnutrição que se desenvolve com o
transcorrer da doença, além da perda de peso, leva à formação de edemas periféricos,
alterações de pele e unhas além de queda de cabelos. (GOTO; LINDOSO, 2004;
PASTORINO et al., 2002; PERUHYPE-MAGALHÃES et al., 2005).
Na doença aguda, além da disseminação do parasita pelo organismo do
paciente, migrando especialmente para o fígado, baço, linfonodos e medula óssea,
ocorre também a produção elevada de anticorpos e a diminuição da resposta imune tipo
um mediada pelas células T, com uma baixa nos níveis de IFN-γ e IL-2 em
concomitância ao aumento das IL 4e IL10. Os casos assintomáticos da LV costumam
ser encontrados em residentes de áreas endêmicas, sendo que tais indivíduos apresentam
imunidade protetora, representada pela predominância da resposta imune celular tipo
Th1 (PERUHYPE-MAGALHÃES et al., 2005).
No Sudão e na Índia, é comum após a cura os pacientes desenvolverem a
chamada leishmaniose dérmica pós-calazar, que é a forma derma trópica da LV causada
pela L. donovani, espécie encontrada na região (SAHA et al., 2006).
24
2.5 RESPOSTA IMUNE, BIOMARCADORES E EVOLUÇÃO CLÍNICA NA LV
De acordo com Mccall (2012), a evolução clínica da LV resulta da interação de
fatores associados ao vetor (dose infectante, vasodilatação provocada pela picada do
flebótomo e imunidade às proteínas salivaves do flebótomo), parasita (diferentes genes
espécie-específicos, diferentes perfis de mRNA, padrões de expressão de proteínas,
modificações translacionais e outros) e hospedeiro (genética, por exemplo padrões de
expressão de citocinas, quimiocinas e receptores; condições adquiridas como
desnutrição, imunodeficiências, co-infecções).
De acordo com Badaró et al. (1986) estima-se a razão entre indivíduos com
leishmaniose visceral subclínica e sintomática em até 18:1, sugerindo que muitas
pessoas infectadas desenvolvem resposta imune eficaz e não manifestam a doença
clínica.
Segundo Pearson et al. (1992) e Gomes et al. (2007), o estado nutricional de
indivíduos infectados com Leishmania ssp. desempenha um papel significativo na
evolução clínica da LV, principalmente em crianças menores de cinco anos. A
desnutrição está associada à diminuição dos níveis de óxido nítrico (NO) e fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) nos órgãos viscerais, e aumento de produção
prostaglandina E2 (PGE2) (ANSTEAD et al., 2001). A inadequação dietética na
ingestão energético-protéica, de ferro, vitamina A e zinco aumenta o risco de infecção
por leishmaniose visceral e evolução para doença clinicamente manifesta (WHO, 2010).
Desse modo, a desnutrição energético-protéica aumenta o risco de desenvolver
leishmaniose visceral sintomática em humanos (DYE e WILLIAMS, 1993; MACIEL et
al., 2008; MALAFAIA, 2009).
Estudo recente de Kumar e col. (2014) mostrou que a desnutrição energético-
protéica associada à LV prejudica gravemente a mobilidade e função das células
imunitárias inatas e pode ser um fator decisivo na dinâmica da evasão L. donovani da
função das células imune inatas de indivíduos infectados.
A herança genética influencia o desenvolvimento da doença (JERÔNIMO et al.,
2007; JAMIESON et al., 2007; SAKTHIANANDESWAREN, FOOTE, HANDMAN,
2009). Em particular, o gene da proteína 1 associada à resistência natural do macrófago
(NRAMP1) desempenha um papel chave na susceptibilidade para doença visceral
(BUCHETON et al., 2003).
25
Além dos fatores genéticos, características adquiridas, como AIDS (DESJEUX e
ALVAR, 2003), pré-exposição ao parasita no útero (OSORIO et al., 2012), desnutrição
(DYE e WILLIAMS, 2003; MACIEL et al., 2008) e idade (MULLER et al., 2008;
SINGH, N. et al., 2007), também podem aumentar o risco de desenvolver leishmaniose
sintomática e estão associados a uma resposta imune deficiente contra o parasita.
A leishmaniose visceral em indivíduos HIV co-infectados pode ser causada por
cepas e espécies que normalmente causam a doença cutânea (GRAMICCIA, 2003) e
está associada a manifestações de doenças atípicas, como o presença de lesões cutâneas,
assim como a parasitemia visceral (SANTOS-OLIVEIRA et al., 2011).
Em geral, essas observações indicam que uma resposta imune celular Th1 eficaz
é necessária para controlar a infecção. Esta resposta envolve a liberação de IL-12 por
células APCs, que conduz à diferenciação de células Th1. Pacientes com predomínio da
resposta imune tipo Th1, representada especialmente pela maior indução de interferon-
gama (IFN-γ), interleucinas 2 (IL-2) e 12 (IL-12) e de resposta imune celular adaptada,
mostram-se resistentes ao desenvolvimento da doença. Essa liberação de IFN-y, resulta
na ativação de macrófagos e a produção de óxido nítrico (NO) (STANLEY e
ENGWERDA, 2007).
A dicotomia de resposta imune Th1 versus Th2 provavelmente é influenciada
por padrões de citocinas presentes durante os primeiros estágios de sobrevivência da
Leishmania dentro do macrófago. Após a sua entrada no macrófago humano a
Leishmania induz sinais contrastantes: induz a síntese de TNF-α, o que conduz à
ativação de macrófagos, ou à produção de TGF-ß ou IL-10, ligada à desativação de
macrófagos e inibição de IFN-γ (BARRAL, A. et al., 1995; BARRAL-NETTO et al.,
1991).
A modulação da síntese de citocinas desempenha papel chave na elaboração da
resposta imune do hospedeiro contra a infecção por Leishmania e determina a
prevenção ou progressão da infecção. As citocinas que neutralizam o desenvolvimento
de uma resposta imune do tipo Th1 protetora e inibem a morte de Leishmania em
macrófagos incluem TGF-β e IL-10 e são tipicamente induzidas pelos próprios parasitas
(BHATTACHARJEE e BHATTACHARYA, 2010).
A expressão de IFN-γ por células Th1 atua sobre os macrófagos e por ativar o
estresse oxidativo, produz ROS (peróxido de hidrogênio ≡ H2O2, radical hidroxila livre
(OH-)·, radical superóxido (O2
-) e estimula a geração de NO (MURRAY, CARTELLI,
26
1983; VERDOT et al., 1999). Portanto a produção de IFN-γ ajuda no controle da
infecção por meio da eliminação do parasita.
A IL-12 parece conferir proteção, estimulando a síntese de IFN-γ por um lado e
por supressão da IL-4 e polarização da resposta Th2, por outro. Além disso, tal efeito
protetor não é criticamente dependente da presença de IFN-γ. O efeito protetor de IL-
12 observada em camundongos susceptíveis BALB/c requer a presença de IFN-γ. Em
modelo de infecção por Leishmania em camundongos, infectados há duas semanas, a
IL-12 é eficaz em reduzir a carga parasitária do fígado em 34 a 45%, no entanto, ela foi
incapaz de reverter o padrão de secreção de citocinas de células Th2 totalmente
diferenciadas. Quanto ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é conhecido por sua
sinergia com IFN-γ durante ativação do macrófago (PARK, A. Y. et al., 2002;
BHATTACHARJEE e BHATTACHARYA, 2010) .
A IL-4 desempenha um papel importante na infecção por Leishmania e segundo
RÜCKERL et al. (2012) ela não desenvolve a cura de lesões inflamatórias no local da
infecção por L. major. Além disso, de acordo Bogdan e Nathan (1996), ela promove a
progressão da doença através da indução e polarização de células T em direção ao
subtipo Th2, e através da inibição, em vez de estimular a função dos macrófagos.
Assim, a neutralização de IL-4 por anticorpos ou por receptor solúvel de IL-4 resulta em
proteção.
A secreção de IL-10 resulta na disseminação da infecção e progressão da doença
de forma não controlada e seus efeitos diretos são a diminuição na proliferação de
linfócitos, a inibição da produção de IFN-γ e da atividade citotóxica de células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) (BARRAL‑NETTO et al., 1998).
Início da resposta imunitária celular de hospedeiro envolve o recrutamento de
células imunitárias no local de infecção. Tal evento migratório celular é controlado por
quimiocinas, produzidas no local da infecção por leucócitos e células tissulares em
resposta ao estimulo pró-inflamatório. As quimiocinas possibilitam a montagem de uma
resposta imune protetora do hospedeiro por meio da regulação do recrutamento e
ativação subseqüente de classe distinta de leucócitos através de aderência, quimiotaxia,
degranulação e estresse oxidativo (BHATTACHARJEE e BHATTACHARYA, 2010).
Na leishmaniose as citocinas parecem apresentar sinergia com elementos da
Leishmania para regular a produção de quimiocinas. As citocinas, que estão diretamente
envolvidas com a produção de quimiocinas, também podem preceder a expressão de
algumas quimiocinas, que, por sua vez, induzem a produção de mediadores
27
inflamatórios adicionais. As citocinas exercem um efeito secundário sobre o
recrutamento de leucócitos, induzindo a expressão de vários genes (FROMM et al.,
2012).
A capacidade da Leishmania de modular quimiocinas selecionadas,
estabelecendo a inibição de funções microbicidas chaves é crucial para a sua
sobrevivência inicial durante a invasão de macrófagos. Por exemplo, um dos perigos
encontrados pelo parasita ao provocar o recrutamento de macrófagos e ao ser fagocitado
por essas células é a capacidade dessas células para produzir radicais livres de
nitrogênio, notadamente o NO (LIEW et al., 1990; MOOKERJEE et al., 2006; BLOS et
al., 2003; MACMICKING, XIE, NATHAN, 1997) e oxigênio (MURRAY, 1982).
O NO é fundamental para a eliminação do parasita do interior dos macrófagos
uma vez que estudos em camundongos sem expressão da enzima iNOS (também
chamados iNOS2) não são capazes de controlar a infecção, e macrófagos derivados
desses camundongos são incapazes de eliminar promastigotas em cultura
(MOOKERJEE et al., 2006; BLOS et al., 2003; NAHREVANIAN et al., 2012).
A capacidade para induzir iNOS ou gerar NO em resposta ao IFN-γ e/ou ao LPS
foi inibida em macrófagos infectados ou macrófagos incubados com a lipofosglicana
(LPG) purificada ou glicoinositol fosfolípide (GIP), moléculas de superfície de
Leishmania (PROUDFOOT et al., 1996; PROUDFOOT, O’DONNELL, LIEW,
1995).
Em artigo recente MITTRA et al. (2013) mostrou que ROS e ferro, dependentes
de superóxido dismutase (SOD), coordenadamente regulam a diferenciação de formas
promastigotas em amastigotas virulentas, após a invasão de macrófagos.
A disfunção na apresentação de antígenos constitui uma das estratégias mais
comuns a ser utilizada por patógenos para evasão do sistema imune. A comunicação
celular através de moléculas co-estimulatórias, tais como B7/CD28 e CD40/CD40L
mostrou-se capaz de modular a apresentação de antígeno, e a inibição da ligação
CD40/CD40L foi responsável pela ausência de atividade da iNOS e da atividade
microbicida de macrófagos (KAMANAKA et al., 1996) enquanto a cura infecção por L.
major foi dependente da ligação ativa CD40/CD40L (CAMPBELL et al., 1996).
Verificou-se ainda que a sinalização dependente de p38 MAPK desencadeada por CD40
foi alterada em macrófagos infectados, e isto pode levar a uma diminuição da expressão
de iNOS (AWASTHI et al., 2003).
28
Por outro lado, o CD40 expresso por macrófagos regula a resposta imune à
infecção por Leishmania major por meio de sinalização recíproca através de MAPK p38
e ERK1/2. A reciprocidade entre MAKP-1 e de MAKP-3 contribui para essa
sinalização do CD40. Além disso o parasita Leishmania é capaz de estabelecer uma
nova estratégia de evasão imune direcionada para MAKP. Desse modo a regulação
diferencial de MAKP-1 e MAKP-3 pode redirecionar a sinalização de CD40 e, assim,
regular muitas respostas imunes do hospedeiro (SRIVASTAVA, SUDAN e SAHA,
2011; MATHUR, R. K. et al., 2004).
A figura 1. ilustra esse modelo de regulação em a reticulação de CD40 em doses
mais baixas induz a ativação de ERK-1/2 e a produção de IL-10, uma citoquina que
promove a imunossupressão, enquanto que com doses mais elevadas é ativada a p38
MAPK com secreção de IL-12 e NO.
Figura 1. O modelo proposto para a regulação recíproca de
sinalização de CD40 na infecção Leishmania por MKP-1 e de
MKP-3 (SRIVASTAVA, SUDAN e SAHA, 2011).
Uma célula responde a estímulos extracelulares por alteração de sua fisiologia
através de vias de sinalização intracelular, geralmente desencadeadas por ligantes
externos, tais como citocinas e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs)
de Leishmania. A interação desses ligantes com receptores de membrana definidos
resultam na ativação e desencadeamento de cascatas bioquímicas, comumente por
29
fosforilação e/ou mudanças de conformação molecular, resultando na ativação de
segundos mensageiros dentro do citoplasma. Esses por sua vez são muitas vezes
proteínas quinases, que, em seguida, fosforilam outros cinases, para continuar uma
cascata que, finalmente, resulta na ativação de moléculas efetoras, tais como ativadores
de transcrição ou os filamentos de actina, o que promove uma mudança no
comportamento da célula (BHATTACHARJEE e BHATTACHARYA, 2010).
Deve ser enfatizado que segundo Bhattacharjee e Bhattacharya (2010), a
atividade de uma via intracelular, é normalmente determinada por um equilíbrio de
regulação, tanto positivos como negativos e que a ativação de uma determinada cascata
de quinase, muitas vezes, resulta na ativação de suas fosfatases opostas, em um exemplo
clássico de “feedback” negativo.
De acordo com Shadab e Ali (2010) a Leishmania é capaz de interferir com a
transdução do sinal de hospedeiro, de tal forma que a função efetora de macrófagos fica
prejudicada, o que por sua vez facilita a sobrevivência do parasita.
Uma vez que as vias de sinalização intracelulares são reguladas por fosforilação
de proteína, e os níveis de fosforilação da proteína celular são controlados pelas
atividades de ambas as quinases protéicas e fosfatases (SU e KARIN, 1996; HUNTER,
1995), não é de estranhar que o parasita interfira com o processo de fosforilação de
proteínas, prejudicando o equilíbrio de quinase fosfatase, distorcendo assim a função
antimicrobiana do macrófago (OLIVIER, GREGORY, FORGET, 2005).
De fato, há inúmeras evidências na literatura de que a Leishmania afeta uma
gama diversificada de mecanismo de sinalização de células hospedeiras: vias
dependentes de Ca2+
e PKC, vias dependentes de Janus quinase 2 (JAK2)/ativador e
transdutor de sinal de transcrição (STAT1), sinalização pela família MAPKs, proteína
tirosina fosfatase (SHP-1) e receptores “Toll-like” (TLRs).
A infecção por Leishmania promove aumento da concentração de
Ca2+
intracelular de fagócitos (EILAM, EL-ON, SPIRA, 1985; OLIVIER,
BAIMBRIDGE, REINER, 1992) e esse aumento da concentração de cálcio intracelular,
parece ser resultado da absorção aumentada de Ca2+
por células infectadas, em resposta
à depleção de estoques intracelulares (MANSFIELD e OLIVIER, 2002).
Enquanto as células infectadas com L. donovani ou L. mexicana apresentaram
inibição de respostas dependentes de Ca2+
, como quimiotaxia e produção de ROS
(OLIVIER, BAIMBRIDGE, REINER, 1992; BRAY, R. S. et al., 1983). Por exemplo, a
inibição da produção de ROS também pode ser devido a uma redução significativa da
30
inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) (OLIVIER, BROWNSEY, REINER, 1992), isto pode ser
devido à ação de uma fosfatase ácida de Leishmania responsável pela desfosforilação de
IP3, ou a concentração de Ca2 + elevada poderia ativar uma série de fosfatase de IP3
como parte de uma cascata dependente de cálcio.
Como resultado, pode ser surpreendente observar uma queda na atividade da
proteína quinase C (PKC) em macrófagos infectados com L. donovani, algo que
contribui para a sobrevivência do parasita (REYLAND, 2009; SEVERN, WAKELAM,
LIEW, 1992; WARZOCHA et al., 1995). O papel da LPG de formas promastigotas
nesse processo de supressão também foi demonstrado. No entanto as formas
amastigotas que carecem de LPG também são capazes de suprimir a PKC em monócitos
humanos infectados. E isso é indicativo da disponibilidade de mecanismos alternativos
para o processo. Existem evidências de que a SHP-1 é ativada imediatamente após
infecção por Leishmania donovani e essa ativação ocorre através das vias JAKs e
MAPK (OLIVIER; GREGORY; FORGET, 205; SHIO etal., 2012).
A disfunção dos macrófagos induzida pela Leishmania, como a produção
deficiente de NO (PROUDFOOT et al., 1996) e a expressão do complexo maior de
histocompatibilidade (MHC) (REINER, N. E. et al., 1998) em resposta ao IFN-γ não
pode excluir a possibilidade de que o parasita pode alterar a sinalização JAK2/STAT1,
que é a principal via a jusante do receptor de IFN-γ.
Outra via de sinalização inibida após infecção por Leishmania é a família
MAPKs (NANDAN e REINER, 1995). Ainda de acordo com Martiny et al. (1999), as
formas amastigotas de L. amazonensis foram capazes de alterar rapidamente a
fosforilação de ERK1 MAPK em resposta a LPS (MARTINY et al., 1999). Além disso,
estudo de Nandan e Reiner (1995) mostrou que essa alteração da ERK1/2 MAPK foi
acompanhada pela inibição da expressão do fator de transcrição de Elk-1 e
protooncogenes c-fos (NANDAN e REINER, 1995). Em ambos os estudos, foi sugerido
que as fosfotirosina fosfatase (PTPs) foram responsáveis pela desfosforilação de
ERK1/2 MAPK. Embora Martiny et al. (1999) tenha achado que a PTP em questão foi
derivada do parasita, enquanto Nandan e Reiner (1995) assinalaram sua origem
endógena do macrófago.
A Leishmania também pode ativar diversas moléculas que inibem cascatas de
sinalização intracelular, por exemplo, uma importante molécula reguladora negativa, é a
SHP-1 (Fosfatase 1 com região de homologia a Src, também chamado SHPTP-1, HCP e
PTP1C), que é expressa principalmente em células hematopoiéticas, mas também em
31
músculo liso (MARRERO et al., 1998) e células epiteliais (BANVILLE, STOCCO,
SHEN, 1995).
Alguns estudos têm mostrado que a atividade da PTP dos macrófagos é ativada
rapidamente, aproximadamente dentro de 5 minutos de exposição às formas
promastigotas de L. donovani, o que se correlaciona com a rápida desfosforilação de
tirosina de proteínas de elevado peso molecular. A SHP-1 é o componente mais
importante dessa ativação das PTPs. Além disso, a SHP-1 associa-se diretamente com
JAK2 durante a infecção por L. donovani, e essa interação poderia explicar, em parte, à
incapacidade de sinalização JAK2 ativada em resposta a estimulação de IFN-γ
(BLANCHETTE, J. et al., 1999).
Mais recentemente, foi relatado em Bhattacharjee e Bhattacharya (2010) que a
PTP é responsável pela inativação de JAK2 e ERK1/MAPK2 e a proteção dessas
quinases em macrófagos deficientes de SHP-1 permite que essas células respondam à
estimulação com IFN-γ por geração de NO, mesmo quando eles estão infectados.
2.6 TRATAMENTO
Há cerca de 25 compostos com efeitos leishmanicidas, mas apenas alguns são
classificados como drogas leishmanicidas utilizados para os seres humanos e a maioria
delas são parenteral. No entanto, a primeira droga efetiva foi ureastibamine, que foi
descoberto em 1912 e foi relatada pela primeira vez para ser eficaz contra Leishmania
donovani por Brahmchari da Índia em 1922. Esta descoberta salvou milhões de vidas de
índios pobres, para os quais o Prof. Brahmchari foi nomeado para o Prêmio Nobel em
1929 (site oficial do Prêmio Nobel). Mais tarde, o refinamento e desenvolvimento de
antimoniais penta valentes (Sbv) reduziram os efeitos secundários, e esses compostos
constituem a base para tratamento de todas as formas de leishmaniose. Os compostos
orgânicos mais utilizados de Sbv são antimônio gluconato de sódio (SAG) (fabricado
pela Albert-David do Reino Unido) e antimoniato de meglumina (fabricado pela Rhone-
Poulence, Paris) (SINGH et SIVAKUMAR, 2004).
No tocante ao tratamento da leishmaniose visceral têm sido usados compostos à
base de antimônio penta valente, sendo que no Brasil a primeira escolha é o antimoniato
de metilglucamina, comercializado como antimoniato de meglumina ou Glucantime®,
que age eficientemente sobre a leishmaniose, fazendo cessar as manifestações clínicas e
32
hematológicas desta infecção, levando também à esterilização do parasita. Os
antimoniais são administrados via intramuscular ou intravenosa, diariamente, durante 28
dias. A Organização Mundial de Saúde (OMS) determina que a dose máxima
administrada de antimoniais não deve exceder o limite de 20 mg/kg/dia, não indo além
de 850 mg de antimônio, por causa da alta toxicidade deste medicamento. Dentre os
efeitos colaterais de tais drogas estão dores abdominais, arritmias, mialgias, pancreatites
e disfunção hepática. Na Índia, devido à crescente resistência que o parasita vem
apresentando, a taxa de cura pelo uso dos antimoniais tem declinado ao baixo índice de
35% (RATH et al., 2003; ROBERTS, 2006).
Como alternativas de quimioterapia, podem ser utilizados outros fármacos, a
exemplo da anfotericina B, pentamidina, miltefosine e paromomicina (RATH et al.,
2003). Na Europa e em países desenvolvidos, anfotericina lipossomal tem sido o
tratamento de escolha, com alta taxa de cura variando de 90 a 100%, além dos reduzidos
efeitos colaterais e da abreviação no tempo de internamento dos pacientes. Entretanto, o
custo desse agente restringe seu uso de forma abrangente. Por outro lado, alternativas
como anfotericina convencional, pentamidina e paromomicina, apesar de serem
eficazes, requerem administração parenteral e possuem significativos efeitos colaterais.
Atentando-se para o desenvolvimento de resistência, têm sido propostas
combinações de drogas para a terapia (ROBERTS, 2006). Não obstante aos grandes
avanços obtidos nos campos da biologia celular e da imunologia sobre a leishmaniose, a
quimioterapia para essa infecção ainda não atingiu evolução equivalente, tendo sido
bem discreta a contribuição da indústria farmacêutica para o desenvolvimento de novos
medicamentos (RATH et al., 2003).
2.7 LIMITAÇÕES DO TRATAMENTO
Muitos desses regimes de tratamento são prolongados (antimoniais penta valente
ou anfotericina B, cursos de injeções por até um mês, paromomicina injeções durante 21
dias, o tratamento miltefosina durante 28 dias) e com efeitos colaterais significativos,
sendo os mais graves associados ao antimônio penta valente, pentamidina e anfotericina
B. Os efeitos da pentamidina são tão graves que limitam seu uso: diabetes,
miotoxicidade e nefrotoxicidade foram relatados (WHO, 2010).
33
Os antimoniais penta valentes são também muito tóxicos, levando a náuseas,
vômitos, dores musculares e articulares (WHO, 2010), além de cardiotoxicidade e dano
renal (PANDEY et al., 2009). Para anfotericina B são comuns efeitos colaterais
incluindo febre, nefrotoxicidade e raramente miocardite. No entanto, estes efeitos são
significativamente atenuados pelo uso de formulações lipídicas que só causam reações
leves. Os efeitos colaterais da paromomicina são mais leves, limitado a ototoxicidade
reversível, dor leve e raros casos de nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Efeitos
colaterais Miltefosina também são menores (náuseas, vômitos, diarréia), mas é um
agente teratogênico e, portanto, não é apropriado para o tratamento de mulheres
grávidas ou mulheres em idade fértil (WHO, 2010).
Os tratamentos em si são caros (a partir de 2010, US$ 7 por paciente para
paramomicina e US$ 65 para miltefosina) (WHO, 2010). Embora existam acordos de
preços preferenciais entre a Organização Mundial de Saúde e as empresas
farmacêuticas, e versões genéricas de medicamentos existentes estejam em
desenvolvimento (MATLASHEWSKI et al., 2011), os regimes de tratamento de longo
prazo estão associadas a custos adicionais para além dos próprios medicamentos, como
a alimentação, viagens, alojamento do hospital e salários perdidos.
Por exemplo, o custo global de um curso de tratamento de 30 dias com a
anfotericina B em Bihar foi estimado em US$ 372,66 a US$ 719,45 (LEE et al., 2012).
Mesmo antimônio penta valente genéricos pode custar US$ 13por paciente (JHA,
2011). Isto é significativo em uma área onde salários diários podem ser inferiores a US$
1 (ALVAR, YACTAYO e BERN, 2006).
Além dos custos e efeitos colaterais, a emergência de resistência às drogas é uma
preocupação significativa para o tratamento da leishmaniose. Espécies de Leishmania
diferentes têm diferentes susceptibilidades intrínsecas à miltefosina (YARDLEY et al.,
2005). Da mesma forma, o tratamento de AmBisome parece ser menos eficaz na África
(MATLASHEWSKI et al., 2011).
A resistência clínica adquirida às drogas é também uma grande preocupação. Por
exemplo, a resistência ao antimônio penta valente apareceu em Bihar (Índia) em 1970 e,
desde então, a falha do tratamento foi observada em mais de 60% dos pacientes de lá
(JHA, 2011), pode estar se espalhando para o Nepal (CROFT, SUNDAR e
FAIRLAMB, 2006) e tem sido relatada em Sudão (MALTEZOU, 2010). A resistência à
pentamidina tem aumentado ao longo do tempo na Índia (SUNDAR, 2001) e
suscetibilidade a miltefosina pode estar diminuindo (SUNDAR et al., 2012). Para a
34
anfotericina B, a ocorrência de resistência clínica rara, também tem sido relatada
(SRIVASTAVA et al., 2011).
Finalmente, muitas drogas anti-Leishmania, como antimônio penta valente,
miltefosina e anfotericina B induzem um mecanismo comum de apoptose associada a
espécies ativas de oxigênio. Tolerância cruzada a apoptose induzida por droga foi
observada no laboratório (MOREIRA, LEPROHON e OUELLETTE, 2011) e um
aumento da resistência à anfotericina B e miltefosina foi observada em regiões com
elevada resistência aos antimoniais penta valentes (KUMAR et al., 2009).
As combinações de drogas tais como a OMS recomenda anfotericina lipossomal
mais miltefosina, anfotericina B lipossomal mais paramomicina ou miltefosina mais
paromomycin (WHO, 2010), podem limitar o aparecimento de resistência às drogas,
mas aumentaria os custos.
Regimes de dose única de anfotericina B na Índia podem aumentar a adesão ao
tratamento, diminuir os custos e diminuir riscos de resistência (SUNDAR;
CHATTERJEE, 2006). No entanto, dadas as limitações dos tratamentos existentes, a
gravidade da doença, bem como o risco de resistência à droga, é necessária a
identificação de novas opções terapêuticas. Uma melhor compreensão das vias de
sinalização celular que modulam a doença visceral pode conduzir à descoberta de novos
fatores de patogenicidade, que pode ser usado para desenvolver novos alvos
terapêuticos, inclusive a utilização de agentes adjuvantes de tratamento.
2.7 TRATAMENTO ADJUVANTE: GLUTATIONA E ANÁLOGOS
A glutationa (GSH) é um tripeptídeo (L-γ-Glutamil-L-cisteinil-glicina) com
várias funções essenciais dentro da célula (BALLATORI, 1994; DELEVE E
KAPLOWITZ, 1991; WANG E BALLATORI, 1998; MEISTER E ANDERSON,
1983). Nota-se a ligação γ-peptídica pouco usual, a presença da porção γ-glutamil e do
grupo α-carboxilato livre prevenindo a hidrólise da GSH pelas peptidases celulares que
degradam outros peptídeos pequenos (Figura 02).
É mais abundante tiol não protéico em quase todas espécies aeróbias, que ocorre
em concentrações intracelulares de 0.5 a 10 mM (LU, 2013). Em contraste, as
concentrações de GSH extracelulares são geralmente 3-4 ordens de grandeza inferior.
Em condições fisiológicas, a GSSG redutase mantém mais do que 98% do GSH
35
intracelular na forma reduzida, forma de tiol (GSH). O resto está presente na célula
como mistura de dissulfuretos (principalmente GM-S-proteina), como o dissulfureto
(forma oxidada: GSSG), e como tioéteres.
Figura 02 - Glutationa: γ-L-glutamil-L-
cisteinilglicina. Adaptada de Huber e
Almeida (2008).
Para que a atividade protetora da glutationa expressa pela redução de espécies
oxidantes, e conseqüente oxidação da GSH à glutationa dissulfeto (GSSG) seja mantida,
a GSH precisa ser regenerada através do ciclo catalítico, representado na Figura 4. Nele
podemos identificar a atividade de três grupos de enzimas: a glutationa oxidase (GO), a
glutationa peroxidase (GSH-Px) e a glutationa redutase (GR). As duas primeiras
enzimas, GO e GSHPx, catalisam a oxidação de GSH à GSSG e a última, GR, é
responsável pela regeneração de GSH, a partir de GSSG, na presença de NADPH
(Figura 03).
36
Figura 03 - Representação esquemática do ciclo catalítico da glutationa. Fonte: Adaptada de Huber e Almeida (2008).
Estudos em humanos e animais indicam que, entre outras funções, a glutatinona
atua na regulação de diversos eventos celulares, dentre os quais a resposta imune e a
produção de citocinas, também sendo observado que tal substância desempenha papel
essencial para a ativação dos linfócitos T, assim como para a proliferação dos leucócitos
polimorfonucleares, fatos esses que contribuem para o desenvolvimento de uma
resposta imunológica mais eficiente, estando na adequada nutrição protéica a fonte para
a manutenção da homeostase da GSH. Em estados como estresse oxidativo, má nutrição
protéica e várias condições patológicas a concentração celular de GSH mostra-se
marcadamente diminuída (WU et al., 2004).
Por outro lado, aumentando-se o fornecimento dos precursores do GSH, seja por
via oral ou por via intravenosa, aumenta a sua síntese, além de prevenir a carência da
sua formação em diversos estados nutricionais e patológicos, tanto no organismo animal
quanto no humano (TOWNSEND, TEW E TAPIERO, 2003).
Os esforços para aumentar os níveis de GSH celular pela administração direta
apresentam limitações face pela solubilidade, absorção e estabilidade (CHEN,
CARYSTINSO E BATIST, 1998). Isso resultou em um esforço significativo para
identificar análogos ou precursores de GSH, ou para gerar moléculas capazes de
mimetizar a capacidade de reduzir os efeitos de radicais e de peroxidação relacionadas
com os radicais de oxigênio reduzido sobre as células.
O GSH é essencial para a vida celular, sua falta ou escassez acomete não
somente a conservação e a sobrevida do organismo, mas também o sistema
imunológico, diminuindo a capacidade de lutar contra a agressão viral e bacteriana.
37
Uma das formas de recompor os estoques de GSH consiste em recorrer à NAC, uma
precursora indispensável de sua síntese, agindo através da estimulação da glutationa
reduzida, por sua propriedade de ligação direta com as várias espécies de radicais livres
de oxigênio (SARAIVA, 1997).
O GSH foi reportado como capaz de alterar a liberação de citocinas em favor de
uma resposta TH1(VENKETARAMAN et al., 2006).
Em estudo recente Utsugi et al., (2002) sugerem que a produção de IL-12
induzida por LPS, a partir de monócitos humanos é regulada pela ação redox da
glutationa, especificamente a razão GSH/GSSG intracelular, durante a ativação da p38
MAP quinase e que o "priming" de monócitos produtores de IFN-γ produz um aumento
intracelular de GSH/GSSG, que provavelmente aumenta a ativação da p38 MAP
quinase induzida por LPS e de IL-12. Portanto, a noção de que o equilíbrio redox da
glutationa de APCs, por exemplo, monócitos, macrófagos e células dendríticas, regula o
equilíbrio entre as respostas do tipo Th1 e Th2 através da produção de IL-12 e pode não
só ajudar a explicar as diferenças em doenças tipo "Th1" e "Th2", mas também
proporcionar uma opção terapêutica para alterar o equilíbrio de Th1-Th2 em doenças
alérgicas e auto-imunes, bem como em outras condições.
A proposta de mecanismo pelo qual os perfis de citocinas são alteradas é devido
ao GSH esgotando os níveis dos ROS, este esgotamento leva ao fator nuclear
kappa B (NF-kB) ficar seqüestrado pelo FATOR INIBIDOR Kappa B (I Kb) no
citoplasma. O NF-kB tem sido sugerido como um fator de transcrição para citocinas IL-
1, IL-6 e TNF-α (GARG et al., 2011; VERHASSELT et al., 1999; BERNAL-
FERNANDEZ et al., 2010).
Em experimento realizado por Rocha-Vieira et al., (2003), os resultados obtidos
com a administração via oral do NAC aos camundongos da linhagem BALB/c,
infectados com a Leishmania major e com graves lesões cutâneas mostraram o efeito
modulador imunológico da glutationa sobre essa infecção, atuando na melhoria
histopatológica das lesões e também na resposta celular. Além disso, observou-se um
aumento na produção da IL-4, do IFN-γ e do TNF-α, tendo assim o NAC se mostrado
como um imunomodulador, provocando alterações na produção das citocinas do
microambiente de forma a possibilitar maior controle da proliferação parasitária e ainda
reprimindo o avanço da doença.
Diante dessas observações, faz-se notar o potencial papel de coadjuvante que o
NAC pode desempenhar no tratamento da leishmaniose em seres humanos (ROCHA-
38
VIEIRA et al., 2003). Leva-se em consideração ainda que o NAC mostrou-se seguro
quando administrado em seres humanos durante o tratamento de doenças crônicas
inflamatórias, bem como tem sido mínima sua interação com outras drogas
(TIROUVANZAM et al., 2006).
Em estudo experimental, Vieira et al., (2003) administraram NAC em
camundongos da espécie BALB/c infectados por Leishmania major. Foi observada uma
significativa diminuição na progressão das lesões, em nível histopatológico e uma
redução da carga parasitária nas cobaias tratadas com NAC. A modulação
histopatológica foi acompanhada por uma modificação no padrão de citocinas
linfocitárias, demonstrada pelo aumento nas produções de interferon-gama (IFN-γ) e
fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α). Este trabalho apontou para o importante papel da
glutationa na modulação da resposta efetiva contra L. major em camundongos BALB/c.
O NAC é um derivado N-acetílico da cisteína, aminoácido não essencial
presente nas proteínas animais, incluindo a glutationa, sendo o maior componente dos
tecidos epiteliais tais como: unhas, cabelos e pêlos. Industrialmente pode ser fabricada
utilizando as proteínas contidas nas penas, cabelos e peles de vários animais (ZIMENT,
1989).
A glutationa tem sua biossíntese ativada pela NAC que, ao ser desacetilada, dá
origem à cisteína, aminoácido indispensável para a síntese da glutationa reduzida (GSH)
(MOLDEUS, COTGREAVE E BERGGREN, 1986). É um dos mais importantes
compostos com ação desintoxicante e citoprotetora do organismo contra vários agentes
xenobióticos (WILLIAMSOM, 1982).
Monteiro et al., (2008) avaliou os efeitos da NAC, como suplemento GSH, no
curso da infecção por Leishmania amazonensis em camundongos BALB/c sensíveis. O
tratamento com NAC (200 mg/kg/dia) mostrou-se eficaz em aumentar os níveis de GSH
nos linfonodos e baço. Este tratamento causou uma diminuição significativa no número
de parasitos retirados das lesões e drenados dos linfonodos. Tais dados sugerem que a
morte intracelular das leishmanias in vivo foi aumentada com a elevação dos níveis de
GSH através da administração de NAC.
Estudo de Utsugi e cols. (2002) sugere que a produção de IL-12, induzida por
LPS, a partir de monócitos humanos é regulada pelo redox da glutationa,
especificamente a razão GSH/GSSG intracelular, durante a mediação de p38 MAP
quinase e que IFN-γ oriundos de monócitos conduz a um aumento intracelular de
39
GSH/GSSG, que provavelmente aumenta produção de IL-12 induzida por LPS via p38
MAP quinase. E a IL-12 é uma citocina chave que diferencia a partir de Th0 para Th1.
A depleção de glutationa aumenta os marcadores de estresse oxidativo,
incluindo hemeoxigenase (HO-1) que é uma enzima chave desencadeada por estresse
celular. Os pacientes com LV apresentam concentrações sistêmicas mais elevadas de
HO-1 do que os indivíduos saudáveis, e este aumento de HO-1 foi reduzido após o
tratamento leishmanicida, sugerindo que a HO-1 também está associada com a
susceptibilidade à doença. A infecção por L. chagasi ou lipofosfoglicano (LPG), isolado
a partir de promastigotas, desencadeia a produção de HO-1 em macrófagos de
camundongos (LUZ et al., 2012).
A expressão de HO-1 é induzida por vários estímulos e envolve várias vias de
sinalização celular. O gene que codifica a HO-1,o Hmox1, é fortemente induzido
por agentes ou condições que aumentam o estresse oxidativo (IMMENSCHUH e
RAMADORI, 2000; WAGENER et al., 2003). A expressão de HO-1 é regulada a nível
transcricional e pode ser induzida por estímulos tais como: metais pesados,
lipossacarídeosde bactérias, hipóxia, hiperóxia, isquemia, radiação UV, H2O2,
citocinas, óxido nítrico e o seu próprio substrato, o heme (IMMENSCHUH;
RAMADORI, 2000; OTTERBEIN e CHOI, 2000).
Supostamente, qualquer forma de heme livre ou heme-proteína pode agir na
reação de Fenton e catalisar a geração de OH- (RYTER et TYRRELL, 2000). Porto e
cols. (2007) propuseram que o heme pode estimular a migração de neutrófilos, além da
geração de ROS através da ativação de um receptor acoplado à proteína Gα,
amplificando assim a resposta inflamatória. Mais recentemente, autores do mesmo
grupo demonstraram que o heme aumenta a letalidade e secreção de citocinas induzida
pelo LPS, assim como agonistas para receptores do sistema imune inato (FERNANDEZ
et al., 2010).
Tem sido mostrado que a ativação da proteína quinase ativada por mitógeno
(MAPKs) desempenha um papel central na indução da expressão gênica de HO-1
(COULTHARD et al., 2009; KYRIAKIS e AVRUCH, 2001). A comunicação
intracelular entre receptores de membrana e os seus alvos nucleares ou citoplasmáticos
após estimulação é mediada por um número limitado de vias de sinalização, incluindo
cascatas de um grupo de MAPK. Este grupo inclui quatro cascatas distintas, que são
nomeados após a sua componente estágio MAPK: 1)-por sinal extracelular regulado
40
quinase 1 e 2 (ERK1 / 2); 2) c-Jun N-terminal quinase 1 a 3 (JNK1-3); 3) p38 MAPK e
4) ERK5 (Big MAPK) (WORTZEL e SEGER, 2011).
Acumulam-se evidências que muitos indutores da HO-1 ativam a cascatas de
sinalização proteína-dependente de fosforilação e convergem para os fatores de
transcrição que regulam o gene da HO-1 (RYTER et AL., 2006) e estudos recentes tem
mostrado o papel importante para as MAPKs na ativação da HO-1, embora outras
quinases, incluindo tirosina quinases, fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteína
quinases A, G, C também surgiram como potenciais mecanismos de contribuição
(ELBIRT e BONKOVSKY, 1999; IMMENSCHUH e RAMADORI, 2000).
Segundo Bhardwaj e col. (2010), a Leishmania modula a responsividade de
receptores em macrófagos: proteínas co-estimuladoras CD40/sCD40L (proteína CD40 e
seu ligante solúvel sCD40L), as MAPKs, receptores Toll-Like (TLRs), receptores de
interferon gama (IFN-γ) e receptor de interleucina 10 (IL-10). Dessa forma, o parasita
interfere com o sistema de sinalização da célula de tal modo que as funções efetoras
desencadeadas por vários receptores de superfície celular ou são ativamente reprimidas
ou são alteradas para provocar uma resposta imune favorável à sobrevivência do
parasita (BHARDWAJ et al., 2010).
Estudos de Kamanaka e col. (1996) mostram como a comunicação celular
através de moléculas co-estimuladoras, tais como B7/CD28 e CD40/sCD40L, foi capaz
de modular a apresentação de antígeno, e sugerem ainda que a inibição da ligação
CD40/sCD40L foi responsável pela ausência da enzima óxido nítrico sintase (iNOS) e
atividade microbicida do macrófago. Segundo Campbell e col. (1996), a cura da
infecção por L. major depende da ativação da ligação CD40/sCD40L. Verificou-se
ainda que a sinalização dependente de MPK p38 desencadeada pela interação com o
receptor CD40 foi alterada em macrófagos infectados, podendo levar a uma diminuição
da expressão de iNOS (AWASTHI e al., 2003).
As citocinas são os principais orquestradores no processo de defesa celular, com
papel central na modulação da resposta imune do hospedeiro contra a infecção por
Leishmania, e determinam a prevenção ou progressão da infecção de acordo com
Bhattacharjee e Bhattacharya (2010). Desse modo, o estudo da evolução dos níveis
desses biomarcadores ao longo do tratamento é importante para monitorizar o sucesso
terapêutico e predizer a evolução favorável da LV (OLIVEIRA et al., 2013).
41
A interação entre a molécula CD40 e seu ligante desencadeia respostas
específicas nas células onde esta ocorre, sendo comum exibirem a capacidade de ativar
uma sinalização pró-inflamatória (VAN KOOTEN e BANCHEREAU, 2000).
Embora o CD40 não tenha atividade de quinase, sua ligação leva à ativação de
várias quinases e à produção de segundos mensageiros. Após a ligação, sua porção
intracitoplasmática interage com os fatores associados ao receptor TNF (TRAFs),
desencadeando, a partir daí, cascatas de sinalização que culminam com a ativação da
transcrição gênica (VAN KOOTEN e BANCHEREAU, 2000; SCHOBECK e LIBBY,
2001). Desse modo, os sinais provenientes da ativação do CD40 são traduzidos na
ativação de fatores de transcrição que promovem a ativação de genes específicos. O
mais importante fator de transcrição ativado parece ser o NF-κB, embora também
ocorra à ativação dos fatores AP1, NF-AT e STAT-6 (VAN KOOTEN e
BANCHEREAU, 2000). Entretanto a participação de cada um desses fatores in vivo
ainda não está clara.
Os mecanismos controladores da desativação da via de sinalização do
CD40/CD40L ainda não estão totalmente esclarecidos. A inativação e degradação dos
TRAFs parecem ser parte desse controle, embora não esteja clara sua ocorrência in vivo
e em situações patológicas (FERRARI e PLEBANI, 2002). Essa família de proteínas
forma diferentes oligômeros, que através de interações proteína-proteína, ativam as
diferentes cascatas de sinalização, como por exemplo, as vias da tirosina quinases
JAK3, syk, lyn, IP3 e fosfolipase (VAN KOOTEN e BANCHEREAU, 2000). Os
resultados mostrando ativação de serina-treonina quinases (JNK/SPAK, p38 MAPK)
ainda são controversos e não confirmados, devido, provavelmente, ao uso de diferentes
modelos celulares em seu estudo (BISHOP e HOSTAGER, 2001).
A terapêutica atual para leishmaniose visceral está longe de ser a ideal em
função de muitos desses regimes de tratamentos serem longos e associados a efeitos
colaterais significativos. Os dois problemas mais importantes na concepção de um
antiparasitário estão em definir o alvo terapêutico e desenvolvimento de resistência aos
medicamentos pelo parasita. Desse modo a busca de novas opções terapêuticas além de
avaliação da eficácia de terapêutica adjuvante é muito importante, principalmente a
utilização de drogas que possam interagir em mecanismos celulares desfavorável ao
parasita.
Considerando a capacidade da glutationa de modular várias vias de sinalização,
incluindo as descritas acima, as quais favorecem o hospedeiro contra o parasita, foi
42
utilizado a N-acetilcisteína (análogo da glutationa) como adjuvante no tratamento da
leishmaniose visceral. A hipótese a ser testada: A N-acetilcisteína é capaz de modular a
resposta imune inata e adaptativa, com aumento do efeito leishmanicida e ativação da
resposta imune protetora.
Portanto, o presente trabalho tem por objetivo avaliar sCD40L e demais
biomarcadores de evolução clínica no tratamento adjuvante com N-acetilcisteína na
leishmaniose visceral humana (Ensaio clínico). Avaliar biomarcadores imunológicos
antes e após o tratamento de pacientes com leishmaniose visceral. Avaliar o papel da
hemeoxigenase na evolução clínica de pacientes com leishmaniose visceral.
43
3 OBJETIVOS
• GERAL
Avaliar os níveis de sCD40L e demais biomarcadores de evolução clínica no
tratamento adjuvante com N-acetilcisteína da leishmaniose visceral humana.
Hipótese: A N-acetilcisteína possui um efeito na modulação da resposta imune
inata e adaptativa, com aumento do efeito leishmanicida e ativação da resposta imune
protetora.
3.2 ESPECÍFICOS
Avaliar biomarcadores imunológicos antes e após o tratamento de pacientes com
leishmaniose visceral (Artigo 1).
Artigo 1: Alteration of the serum biomarker profiles of visceral leishmaniasis during
treatment. Duthie MS1, Guderian J, Vallur A, Bhatia A, Lima dos Santos P, Vieira de
Melo E, Ribeiro de Jesus A, Todt M, Mondal D, Almeida R, Reed SG. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2014 Apr;33(4):639-49. doi: 10.1007/s10096-013-1999-1. Epub
2013 Oct 31.
Avaliar o papel da hemeoxigenase na evolução clínica de pacientes com leishmaniose
visceral (Artigo 2).
Artigo 2: Heme Oxygenase-1 Promotes the Persistence of Leishmania Chagasi
Infection. Nívea F. Luz, Bruno B. Andrade, Daniel F. Feijó, Théo Araújo-Santos,
Graziele Q. Carvalho, Daniela Andrade, Daniel R. Abánades, Enaldo V. Melo, Angela
M. Silva, Cláudia I. Brodskyn, Manoel Barral-Netto, Aldina Barral, Rodrigo P. Soares,
Roque P. Almeida, Marcelo T. Bozza, and Valéria M. Borges. J Immunol. 2012 May
1;188(9):4460-7. doi: 10.4049/jimmunol.1103072. Epub 2012 Mar 28.
Avaliar os níveis de sCD40L e demais biomarcadores de evolução clínica no tratamento
adjuvante com n-acetilcisteína na leishmaniose visceral humana ( Ensaio clínico).
44
Objetivo 1: 1º Artigo publicado
“Alteration of the serum biomarker profiles of
visceral leishmaniasis during treatment”
45
Objetivo 2: 2º Artigo publicado
“Heme oxygenase-1 promotes the persistence of
Leishmania chagasi infection”
46
4 PACIENTES E MÉTODOS
Desenho do estudo
Trata-se de um estudo de intervenção, tipo ensaio clínico, cego e aleatorizado.
Área do estudo
Anualmente, em média, 50 casos de LV são notificados no Estado de Sergipe e
muitos destes casos são atendidos no Hospital Universitário (HU) da Universidade
Federal de Sergipe (UFS). Faz parte da estrutura do HU, uma enfermaria de Pediatria
com 20 leitos e outra de Doenças Infecciosas. Professores, médicos, residentes e
estudantes de Medicina fazem parte do seu corpo clínico.
Durante o período desse estudo foram incluídos na pesquisa 60 pacientes diagnosticados
com LV.
Definição diagnóstica
O diagnóstico clínico de LV foi caracterizado no paciente com febre e
hepatoesplenomegalia, com ou sem diarréia, epistaxe, icterícia, tosse e sinais e sintomas
de anemia. No hemograma e na bioquímica com: anemia, leucopenia, plaquetopenia,
hipoalbuminemia e hiperglobulinemia. O diagnóstico confirmatório foi realizado
através de sorologia positiva para L. chagasi pelo teste rápido rk39 e/ou
cultura positiva para o parasito obtido de biópsia aspirativa de medula óssea.
Seleção dos pacientes
Foram incluídos todos os pacientes com diagnóstico de LV, que atendiam aos
critérios de inclusão e distribuídos em um dos dois grupos (controle ou teste), seguindo
a tabela de aleatorização. Todos receberam o tratamento padrão preconizado pelo
Ministério da Saúde. Os critérios de exclusão do estudo foram: outras doenças
associadas agudas ou crônicas, uso de imunossupressores, AIDS, gravidez, neutropenia
grave, história de alergia ao NAC e/ou ao antimonial pentavalente ou anfotericina B.
No período do estudo, 64 pacientes receberam o diagnóstico de LV no HU-UFS,
destes, 4 apresentaram pelo menos um dos critérios de exclusão. Participaram do estudo
60 pacientes, sendo 30 alocados no grupo teste (G1≡ SbV + NAC) e 30 no grupo
controle (G2≡ SbV).
47
Sessenta pacientes, com idades entre dois e 50 anos, virgens de tratamento e com
diagnóstico de LV, foram incluídos. Oito pacientes foram excluídos, por apresentarem
algum dos critérios de exclusão; 1 apresentava sorologia anti-HIV positiva, 2
neutropenia grave, 1 esquistossomose, 1 alterações eletrocardiográficas que contra-
indicavam o uso de Glucantime®, 2 idade inferior a 2 anos e 1 idade superior a 50 anos.
Um pediatra e um infectologista ficaram responsáveis pela avaliação da evolução
clínica dos pacientes e pela coleta de dados quanto aos efeitos adversos e exames
laboratoriais. Estes médicos, não tinham conhecimento da aleatorização previamente
realizada.
Tratamento e seguimento
No Brasil, a única formulação de antimonial disponível é o antimoniato N-metil
glucamina (Glucantime®
), que vem sendo distribuída pelo Ministério da Saúde em
ampolas de 5 ml, contendo 405mg de Sb+5
(1 ml = 81mg de Sb+5
). Recomenda-se o
tratamento da LV com a dose de 20mg de Sb+5
kg/dia, com aplicação endovenosa ou
intramuscular, por no mínimo 20 e no máximo 40 dias, com bons índices de cura.
Os pacientes receberam os seguintes tratamentos:
• Grupo 1: controle (n=30): Glucantime®, com dose e tempo padrões –
20mg/kg/dia, IV, por 20 dias.
• Grupo 2, glutationa como adjuvante: teste (n=30): Glucantime®
, com dose e
tempo padrões – 20mg/kg/dia, IV, por 20 dias + NAC 600mg, VO, 3x ao dia,
por 20 dias.
A NAC é disponibilizada comercialmente no Brasil e foi utilizada conforme
orientação do fabricante. O tratamento com antimonial foi fornecido por um
farmacêutico e realizado por um técnico de enfermagem com treinamento para o
procedimento.
Os pacientes foram tratados em regime de internação hospitalar, que é a rotina
para o tratamento de LV no HU - UFS, facilitando a observação clínica e de possíveis
efeitos adversos ao tratamento.
Todos os pacientes arrolados no estudo foram acompanhados por um período de
12 meses. Avaliações clínico-laboratoriais rigorosas foram realizadas antes, com 10, 20
e 28 dias do tratamento e com 6 meses após, para avaliar recidiva ou cura da doença.
48
Procedimentos realizados antes da entrada dos pacientes no estudo
Todos os pacientes com o diagnóstico de LV do HU-UFS foram avaliados para
inclusão neste projeto. Eles receberam uma explicação verbal sobre o projeto, os
procedimentos a que seriam submetidos e foram convidados a participar, sendo
solicitada a assinatura de um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) por
escrito confirmando sua participação. Foram realizados uma avaliação clínico-
epidemiológica e um exame físico com descrição dos aspectos clínicos da doença
apresentada, em todos os pacientes. O critério de inclusão era ter o diagnóstico
confirmado da doença e, não ter outra doença ou condição clínica (gestação) que
interferisse na forma clínica da doença ou na sua gravidade. Exames laboratoriais foram
realizados para confirmar o diagnóstico e para acompanhamento durante o tratamento.
Todos os pacientes foram submetidos a eletrocardiograma antes do início do
tratamento, para identificação de alterações cardíacas que pudessem contra-indicar o
uso do antimonial.
Procedimentos realizados durante o tratamento
Para obtenção do soro, sangue periférico dos pacientes tratados e não tratados
com NAC, foi coletado em tubo sem anticoagulante e com gel separador. Após
coagulação, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 13000 rpm em
temperatura ambiente. O soro obtido foi armazenado a -70° C para dosagem das
biomarcadores. As coletas foram realizadas antes do tratamento (D0) e com 15 (D15) e
28 (D28) dias após seu início.
Antes do início do tratamento e nos dias, 10, 20 e 28 subseqüentes, os pacientes
foram submetidos a exames físicos e laboratoriais. Dentre estes: hemograma,
coagulograma, proteínas: total e frações, aspartato aminotransferase (AST), alanina
aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), gama-GT (GGT), amilase, uréia e
creatinina, séricos.
49
Critérios de cura
A cura foi definida no paciente com redução substancial do baço e fígado,
ausência de febre por mais de 15 dias após o tratamento, ganho de peso e melhora
significativa da leucopenia e anemia.
Dosagem citocinas
A quantificação dos níveis séricos das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-12p40,
IL-12p70 e sCD40L foi possível com uso do analisador LUMINEX, cujo sistema
baseia-se na dosagem simultânea de diversos analitos num único poço de reação em
microplaca.
Anticorpos de captura específicos para cada molécula pesquisada estão
imobilizados em microesferas de poliestireno através de ligações covalentes não
reversíveis, e se ligam ao respectivo analito, dando-se então a detecção por um
marcador fluorescente, a Estreptavidina-Ficoeritrina (EF) ligada ao anticorpo de
detecção. No aparelho Luminex então, tais esferas são movimentadas em uma única fila
passando por feixes de dois lasers diferentes num citômetro de fluxo, para que um faça a
classificação da microesfera de acordo com a sua cor, enquanto o outro quantifica o
sinal gerado por cada uma delas.
Análise estatística
Inicialmente procedeu-se a uma análise exploratória dos dados onde as variáveis
categóricas foram expressas em termos de freqüência simples e percentuais enquanto as
quantitativas, por meio médias e desvios padrões ou medianas e quartis ou percentis e
respectivos intervalos de confiança para 95% (IC 95%) quando adequados.
Para a estimativa dos IC 95% foi utilizada a técnica de “bootstrapp”. Trata-se de
um método estatístico de simulação em que se trabalha com a distribuição real dos
dados sem a premissa de utilizar-se uma distribuição de variável padrão. Assumiu-se
para estimativa de IC 95% reamostragens com reposição de tamanho N=1.000.
Para comparação de diferenças e distribuição entre médias ou medianas entre
grupos, foram empregados os testes t de Student e Mann-Whitney, respectivamente,
utilizando-se ainda a metodologia de “bootstrapp”.
50
Para avaliar a variação das variáveis ao longo do tempo utilizou-se o teste de de
Wilcoxon para dados pareados.
Para avaliar a relação entres as variáveis clínicas, os níveis de citocinas e
SCD40L foi utilizado a correlação de Spearman. Para a comparação entre os grupos
utilizou-se a técnica análise de variância com variável dependente o “rank” para os
níveis de biomarcadores e no tempo 15 ou 28 dias, o grupo como fator aleatório,
ajustados para idade, gênero e valores iniciais no tempo zero, utilizando-se da técnica de
“bootstrapp” para estimação.
Um valor de significância p ≤ 0.05 e um poder de 0,80 foram considerados para
significância estatística. Estas análises foram feitas utilizando o programa SPSS, versão
21 para teste.
Considerações éticas
O protocolo da pesquisa-objeto deste estudo foi submetido ao Comitê de Ética
em Pesquisa do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (HU),
obtendo sua aprovação por seguir as instruções da resolução 196⁄96. Protocolo SISNEP
0022.0.107.000-08.
Consentimento livre e esclarecido
Todos os indivíduos da amostra selecionada receberam uma explicação verbal
sobre o projeto e os procedimentos aos quais seriam submetidos e foram convidados a
participar do estudo, sendo solicitada a assinatura de um Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido (TCLE) por escrito pelos pacientes ou responsáveis em caso de menores
de 18 anos, confirmando suas participações.
Contribuições do projeto
Em relação às contribuições para os sujeitos da pesquisa, o projeto esclareceu
dúvidas sobre o os fatores de risco e medidas de proteção no que se refere à prevenção
do calazar.
51
Riscos e cuidados instituídos
O presente estudo não traz nenhum grande risco para os sujeitos da pesquisa,
além de pequeno incomodo decorrente do preenchimento de cadastros, questionário e
punção sanguínea. Procedimentos simples largamente utilizados na atenção aos
pacientes.
Quanto à confidencialidade dos dados, estão guardados com segurança os
arquivos físicos (questionários e TCLE) e eletrônicos do projeto (Banco de dados e
resultados brutos). O único documento que contem a identificação do paciente é o
TCLE, o qual está estocado em local separado dos outros documentos. O questionário e
o banco de dados contêm um código do indivíduo apenas. Assim, nenhum dado clínico,
laboratorial do banco de dados poderá ser associado ao sujeito da pesquisa.
52
5.1 RESULTADOS DO ENSAIO CLÍNICO
5.1 CARACTERIZAÇÃO BASAL DO GRUPO ESTUDO E CONTROLE
Ao analisar as características de cada grupo antes do tratamento, foram
evidenciadas semelhanças quanto às variáveis idade e gênero. A média de idade foi de
12,5 ± 11,1 anos no grupo estudo (SbV + NAC) e de 13,2 ± 12,8 anos no, controle(Sb
V),
(p=0,81). Não se observou diferença (p=0,60) na freqüência de menores de cinco anos
entre os grupos. Em relação às características clínicas, a média da medida de baço foi
maior no grupo estudo, com um diferença média de 2,4 ± 1,4 cm, porém tal diferença
não atingiu significância estatística (p=0,09). Enquanto as medidas de fígado foram
semelhantes nos dois grupos (p=0,55).
Quanto ao leucograma notadamente glóbulos brancos, neutrófilos, linfócitos, e
plaquetas apresentaram uma média de valores menores no grupo teste em relação ao
controle, no entanto sem diferença estatística.Quanto aos eosinófilos apresentaram uma
distribuição semelhante entre os grupos (0,91). Do mesmo modo a média dos níveis
séricos de uréia, creatinina e amilase não apresentaram diferença significativa entre os
grupos estudados.
A análise dos níveis séricos de transaminases que expressam a agressão ao
hepatócito e colangiócito, mostrou uma mediana de valores menor no grupo estudo,
porém a distribuição de valores foi semelhante (Tabela 1).
53
Tabela 1 - Características clínicas e laboratoriais de pacientes com diagnóstico de
leishmaniose visceral segundo o tratamento com SbV + NAC e SbV no tempo zero.
VARIÁVEL G1 ≡ SbV + NAC(N=30) G2 ≡ SbV(N=30) p
Idade (Anos) 7,5(3,0;22,3) 9,5(3,8;18,5) 0,94
Média 12,5± 11,1 13,2± 12,8 0,81
Variação 2-38 2-46 -
≤ 5 anos. Nº (%) 13(43,3) 11(36,7) 0,60
Sexo masculino Nº (%) 16(53,3) 19(63,3) 0,43
Fígado (cm abaixo da RCD) 5,3± 3,6 5,4± 3,2 0,89
Baço (cm abaixo da RCD) 10,5± 4,7 8,1± 4,5 0,09
Hemoglobina-g/dl 8,9± 1,7 8,7± 1,3 0,55
Glóbulos brancos (/mm3) 2.684± 1.076 3.167± 1.585 0,17
Neutrófilos (/mm3) 861± 491 1062± 754 0,23
Linfócitos (/mm3) 1.387± 789 1.632± 966 0,29
Eosinófilos (/mm3) 14(1;34) 14(2;38) 0,91
Plaquetas (/mm3) 169.700± 62.652 174.273± 64.840 0,74
Creatinina-mg/dl 0,54± 0,23 0,62± 0,27 0,19
Uréia-UI/dl 21,7± 6,8 24,4± 10,9 0,26
TGO-UI/dl 51,0(37,0;71,1) 70,5(59,5;107,5) 0,13
TGP-UI/dl 32,0(23,0;65,0) 42,5(27,8;89,0) 0,23
GGT-UI/dl 35,0(16,0;109,0) 106,0(22,8;152,3) 0,08
Amilase-UI/dl 53,9± 52,9 60,1± 27,1 0,60
Valores expressos em termos de média ± desvio padrão, demais registros no formato de
mediana (quartil1; quartil3). Teste t para dados independentes.
p= nível de significância.
5.2 RESPOSTA CLÍNICA E LABORATORIAL AO TRATAMENTO E
COMPARAÇÃO ENTRE OS GRUPOS
Ao final do tratamento os grupos apresentaram-se homogêneos com relação à
medida de fígado, baço e hemoglobina. Deve ser salientado para a medida de baço, que
a diferença observada no início do tratamento reduz-se de forma substancial.
54
Quanto às médias de glóbulos brancos, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos foram
superiores no grupo que utilizaram o NAC como tratamento adjuvante, porém sem
diferença estatisticamente significativa. Os níveis de plaquetas aumentaram até atingir
valores normais de referência com médias de valores menores no grupo NAC, no
entanto tal diferença entre os grupos não alcançou significância estatística (0,18).
No entanto para o grupo estudo os níveis de sCD40L correlacionaram-se
inversamente com a carga parasitária (R de Spearman = -0,442; p=0,007) e tamanho do
baço (R de Spearman = -0,351; p=0,006). Por outro lado no grupo controle os níveis de
sCD40L não se correlacionaram com o tamanho do baço (R de Spearman = -0,108;
p=0,43) nem com a carga viral (R de Spearman = -0,104; p=0,60). Desse modo os
grupos apresentaram diferença em relação a correlação de níveis de sCD40 L com a
carga viral tamanho do baço (Figura 4).
Figura 4 – Correlação dos níveis de ligante solúvel
(sCD40L) e tamanho do baço ao longo do tratamento,
segundo os grupos SbV + NAC e Sb
V.
55
Tabela 2 - Características clínicas e laboratoriais de pacientes com diagnóstico de
leishmaniose visceral segundo o tratamento com SbV + NAC e Sb
V após 20 dias.
VARIÁVEL
CLÍNICA/LABORATORIAL
G1 ≡ SbV +
NAC(N=30)
G2 ≡ SbV(N=30) p
Fígado (cm abaixo da RCD) 3,5± 2,6 3,3± 3,0 0,83
Baco (cm abaixo da RCD) 6,9± 3,3 5,3± 3,7 0,73
Hemoglobina-g/dl 9,8± 1,2 9,4± 1,3 0,19
Glóbulos brancos (/mm3) 5.903± 3.594 5.355± 2.712 0,33
Neutrófilos (/mm3) 2.441± 2.358 1.977± 1.249 0,37
Linfócitos (/mm3) 2.492± 1.561 2.454± 1.273 0,92
Eosinófilos (/mm3)1 170,0(36,8;277,9) 129,0(26,0;314,0) 0,64
Plaquetas (/mm3) 241.241± 92.023 269.541± 66.761 0,18
Valores expressos em média ± desvio padrão. Os valores de hemoglobina avaliados com 10 dias
de tratamento. Análise de variância com variável dependente a variável clínica/laboratorial no
tempo 20 dias, fator aleatório do grupo e ajustados para idade, gênero e valores iniciais no
tempo zero. Valor expresso em termos de mediana (q1; q3).
5.3 AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES AO LONGO DO TRATAMENTO PARA
OS GRUPOS TESTE E CONTROLE
Biomarcadores e sSCD40L, comparação entre os grupos no início da tratamento
O grupo estudo apresentou no início do tratamento uma mediana de TNF-α
superior no grupo estudo enquanto para os níveis de IL-12 p40, essa medida foi menor
nesse grupo, ambas as distribuições dos níveis séricos dessas citocinas foi semelhante
nos dois grupos (respectivamente p=0,38 e p=0,32).
Quanto a IL-10 no tempo zero, observaram-se medianas e distribuição dos
valores semelhantes nos dois grupos (p=0,77).
No entanto a mediana dos níveis séricos de sCD40L no tempo zero
apresentaram-se maiores e com uma distribuição significativamente (p=0,01) diferente
no grupo teste em relação ao controle (Figura 5).
Além disso, observa-se grande variabilidade intra-grupo nos níveis séricos das
citocina IL-12 p40 e sCD40L, nessa última com maior evidência. Enquanto TNF-α e IL-
10 apresentaram uma variabilidade menor.
56
Biomarcadores e sSCD40L, comparação entre os grupos ao longo do tratamento
A mediana dos níveis séricos de TNF-α, IL-12 p40 e IL-10 reduziram
significativamente entre o momento 15 dias e o tempo zero, dentro de cada grupo
permanecendo semelhante a partir de então, no entanto a distribuição dos valores dessas
citocinas não definiram entre os grupos.
Tabela 3 - Comparação dos níveis de citocinas de pacientes com diagnóstico de
leishmaniose visceral no dia 0;15 e 28, segundo o tratamento com SbV + NAC e Sb
V.
VARIÁVEL G1 ≡ SbV + NAC(N=30) G2 ≡ Sb
V(N=30) p
TNF-αD0 109,7(63,6;174,4) 64,2(42,7;179,1) 0,38
TNFα D15 53,7(15,0;81,5) 33,0(21,0;64,2) 0,86
TNF-α D28 16,1(11,2;30,1) 15,4(13,5;52,0) 0,43
IL-10 D0 351,5(243,6;536,7) 366,3(211,4,5;568,9) 0,77
IL-10 D15 42,9(12,1;110,4) 50,1(12,6;87,8) 0,93
IL-10 D28 18,8(4,3;27,0) 8,9(0,0;18,0) 0,42
IL-12p40D0 79,1(30,5;214,0) 150,6(32,2;599,2) 0,32
IL-12p40D15 26,9(0,0;58,6) 34,3(5,2;155,4) 0,89
IL-12p40D28 0,0(0,0;51,0) 17,1(0,0;34,5) 0,29
sCD40L D0 2.578,2(1.520,4;5.706,9) 1.108,7(330,5;2.258,3) 0,01
sCD40L D15 13.234,2(8.204,4;17.883,1) 3.793,8(757,9;11938,4) 0,004
sCD40L D28 14.826,4(9.971,1; 29970,5) 4.641,0(1408,4; 14.495,3) 0,006
Valor expresso em termos de mediana (q1; q3). Análise de variância com variável
dependente o “rank” para os níveis de biomarcadores e no tempo 15 ou 28 dias, fator
aleatório do grupo e ajustados para idade, gênero e valores iniciais no tempo zero. IC 95%
estimado mediante técnica de “bootstrapp” baseado em 1000 reamostragens.
A figura 5 ilustra a distribuição dos níveis séricos de sCD40L ao longo do tempo
e segundo os grupos SbV + NAC e Sb
V, onde se observa a diferença significativa entre
os dois grupos. Além disso, verificou-se nos dois grupos que essa variação importante
ocorre até 15 dias de tratamento, permanecendo a partir de então pelo menos até 28 dias
com medianas e distribuição de valores semelhante dentro de cada grupo. Vale salientar
57
a grande variabilidade intra-grupo observada para essa proteína e também alguns
pacientes apresentam valores “outliers” e extremos. (Tabela 3).
Figura 5 – Distribuição dos níveis de ligante solúvel (SCD40L) ao longo
do tratamento, segundo os grupos SbV + NAC e Sb
V.
Biomarcadores, sCD40L, características clínicas e laboratoriais, comparação ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC
A mediana da medida do baço reduziu significativamente até o vigésimo dia de
tratamento, permanecendo com valores semelhantes pelo menos até o vigésimo oitavo
(Figura 6). Observa-se essa mesma redução para as citocinas TNF-α, IL-12 p40e IL-10,
sendo o marco de tempo mais precoce por volta de 15 dias (Figuras 9, 10 e 11).
58
Figura 6 –Distribuição das medidas de baço (cm) ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
Salienta-se a variabilidade dessas variáveis biológicas mais evidentes no tempo
zero.
Figura 7 – Distribuição dos níveis de TNF-α ao longo do
tempo para o grupo SbV + NAC.
59
Figura 8 – Distribuição dos níveis de IL-12 p40 ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
Figura 09 –Distribuição dos níveis de IL-10 ao longo
do tempo para o grupo SbV + NAC.
Quanto ao sCD40L, registrou-se um aumento significativo em 15 dias de
tratamento, permanecendo com distribuição de valores semelhantes no dia 28 pós
tratamento. Vale salientar que a variabilidade aumenta com o passar do tempo e alguns
poucos pacientes comportam-se com valores “outliers” e extremos (Figura 12).
60
Figura 10 – Distribuição dos níveis de sCD40L ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
Digno de nota é a observação que as variáveis hematológicas, notadamente o
número de neutrófilos, eosinófilos e plaquetas seguem a mesma tendência de aumento
do sCd40L, ocorrendo mais tardiamente a partir de 20 dias de tratamento. Além disso,
as medianas dos valores e distribuição permanecem semelhantes a partir daí(Figura 13,
14 e 16).
Figura 11 –Distribuição do número de neutrófilos ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
61
Figura 12 – Distribuição do número de eosinófilos ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
A distribuição do número de linfócitos, no entanto atinge esse nível de
semelhança na distribuição mais precocemente a partir de 10 dias de tratamento. Vale
salientar o comportamento aumento da variabilidade do sCd40L e variáveis
hematológicas ao longo do tempo de modo inverso aos níveis de citocinas (Figura 15)
Figura 13 –Distribuição do número de linfócitos ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
62
Figura 14 – Distribuição do número de plaquetas ao
longo do tempo para o grupo SbV + NAC.
Biomarcadores, sCD40L, características clínicas e laboratoriais, comparação ao
longo do tempo para o grupo SbV
As medianas da medida do baço diminuíram significativamente até o vigésimo
dia de tratamento enquanto para as citocinas TNF-α, IL-12 p40 e IL-10, isso ocorreu
mais precocemente a partir de 15 dias de tratamento. Depois disso as distribuições
foram semelhantes pelo menos até o vigésimo oitavo (Figura 17, 18, 19 e 20).
63
Figura 15 – Distribuição das medidas de baço (cm) ao longo
do tempo para o grupo SbV.
Salienta-se a variabilidade dessas variáveis biológicas maior no tempo zero e reduzindo-
se ao longo do tratamento.
Figura 16 – Distribuição dos níveis de TNF-α ao longo;
do tempo para o grupo SbV.
64
Figura 17 – Distribuição dos níveis de IL-12 p40 ao longo
do tempo para o grupo SbV.
Figura 18 – Distribuição dos níveis de IL-10 ao longo do
tempo para o grupo SbV.
Os níveis de sCD40L aumentaram significativamente, porém discretamente em
relação ao grupo estudo com 15 dias de tratamento, permanecendo a distribuição de
valores semelhantes no dia 28 pós tratamento. Vale salientar a grande variabilidade
65
dessa variável a partir do dia 15 de tratamento o e alguns poucos pacientes apresentando
valores “outliers” e extremos (Figura 21).
Figura 19 – Distribuição dos níveis de sCD40L ao longo do
tempo para o grupo SbV.
Figura 20 –Distribuição do número de neutrófilos ao longo
do tempo para o grupo SbV.
66
As variáveis hematológicas, notadamente o número de neutrófilos, linfócitos,
eosinófilos e plaquetas seguem a mesma tendência de aumento do sCd40L, porém
ocorrendo mais tardiamente com 20 dias de tratamento e as medianas dos valores
permanecem semelhantes a partir de então (Figura 22, 23, 24 e 25).
Figura 21 –Distribuição do número de linfócitos ao longo do tempo
para o grupo SbV.
67
Figura 22 – Distribuição do número de eosinófilos ao longo
do tempo para o grupo SbV + NAC.
Figura 23 – Distribuição do número de plaquetas ao longo
do tempo para o grupo SbV.
68
5.4 CORRELAÇÃO DOS NÍVEIS DE CITOCINA ENTRE SI E DIMENSÃO DO
BAÇO E FÍGADO
Antes do tratamento os níveis de IL-10 sérico correlacionaram-se positivamente
de modo significativo com as citocinas TNF-α, IL-12p70, IL-12p40, observando-se um
valor com magnitude decrescente entre eles. O IFN-γ e sCD40 L não se correlacionaram
com IL-10. Por outro lado os níveis de TNF-α apresentou correlação positiva com IL-
12p40, mas não com IL-12p70 e IFN-γ. Observou-se ainda uma correlação positiva de
sCD40 L com IL-12p70. Verificou-se também uma correlação negativa de sCD40 L
com TNF-α, porém sem significância estatística. Não houve correlação com IFN-γ e
dimensão do baço (Tabela 4).
Tabela 4 - Correlação entre os níveis de citocinas entre si e tamanho de baço em
pacientes com diagnóstico de leishmaniose visceral no dia 0.
CITOCINAS R p
IL-10 D0 vs
TNF-αD0 0,283 0,049
IL-12p70 D0 0,390 0,011
IL-12p40D0 0,347 0,013
IFN-γ D0 0,250 0,11
sCD40 D0 0,104 0,469
TNF-α D0 vs
IL-12p70 D0 0,195 0,22
IL-12p40D0 0,365 0,011
IFN-γ D0 0,238 0,13
sCD40 D0 vs
IL-12p40 D0 0,152 0,291
IL-12p70 D0 0,348 0,024
IFN-γ D0 0,261 0,095
TNF-αD0 -0,249 0,084
Baço (cm abaixo da RCD) 0,216 0,17
R≡Correlação de Spearman
Após 15 dias, os níveis de IL-10 sérico correlacionaram-se positivamente de
modo significativo com as citocinas TNF-α e IL-12p40, observando-se um valor com
69
magnitude decrescente entre eles. Os níveis de TNF-α apresentaram correlação positiva
com IL-12p40. No entanto os níveis de sCD40 L correlacionaram-se negativamente
com IL-10, TNF-α e IL-12p40 (Tabela 5).
Tabela 5 - Correlação entre os níveis de citocinas entre si e tamanho de baço em
pacientes com diagnóstico de leishmaniose visceral no dia 15.
CITOCINAS R p
IL-10 D15 vs
TNF-αD15 0,442 0,002
IL-12p40D15 0,319 0,024
TNF-α15 vs
IL-12p40D15 0,490 <0,0001
sCD40 D15 vs
TNF-αD15 -0,389 0,008
IL-12p40D15 -0,232 0,011
IL-10 D15 -0,301 0,036
R≡Correlação de Spearman
5.5 RESUMO DOS RESULTADOS
• Os níveis séricos de sCD40L foram significativamente maiores no grupo
SbV + NAC em relação ao grupo Sb
V ao longo do tempo. Essa diferença foi observada
logo após 15 dias de tratamento.
• Após 15 dias de tratamento a mediana e a distribuição dos níveis de
sCD40L permaneceram semelhantes tanto no grupo SbV + NAC quanto no Sb
V.
• As medidas de baço e citocinas TNF-α, IL-12 p40 e IL-10 diminuíram
significativamente intra-grupo, no entanto o baço mais tardiamente em relação às
citocinas.
• Vale salientar a variabilidade dessas variáveis entre os pacientes, para as
citocinas ela reduz com o tempo de tratamento enquanto a medida de baço, os níveis de
sCD40L e das variáveis hematológicas apresentam comportamento inverso.
70
• Antes do tratamento os níveis de IL-10 sérico correlacionaram-se
positivamente de modo significativo com as citocinas TNF-α, IL-12p70, IL-12p40,
observando-se um valor com magnitude decrescente entre eles. O IFN-γ e SCD40 L não
se correlacionaram com IL-10. Por outro lado os níveis de TNF-α apresentou
correlação positiva com IL-12p40, mas não com IL-12p70 e IFN-γ. Observou-se ainda
uma correlação positiva de SCD40 L com IL-12p70. Verificou-se também uma
correlação negativa de SCD40 L com TNF-α, porém sem significância estatística. Não
houve correlação com IFN-γ e dimensão do baço
• Após 15 dias, os níveis de IL-10 sérico correlacionaram-se positivamente
de modo significativo com as citocinas TNF-α e IL-12p40, observando-se um valor com
magnitude decrescente entre eles. Os níveis de TNF-α apresentaram correlação positiva
com IL-12p40. No entanto os níveis de SCD40 L correlacionaram-se negativamente
com IL-10, TNF-α e IL-12p40.
71
6 DISCUSSÃO
A terapêutica atual para leishmaniose visceral está longe de ser a ideal em
função de regimes de tratamentos prolongados e a ocorrência de efeitos colaterais
significativos. Não obstante aos grandes avanços obtidos nos campos da biologia celular
e da imunologia sobre a leishmaniose, a quimioterapia para essa infecção ainda não
atingiu evolução equivalente, tendo sido bem discreta a contribuição da indústria
farmacêutica para o desenvolvimento de novos medicamentos (RATH et al., 2003).
Existem várias maneiras pelas quais os patógenos intracelulares como
Leishmania fazem uso da maquinaria da célula hospedeira para sobreviver e reproduzir.
Um desses mecanismos é a distorção da própria via de sinalização do macrófago
anfitrião, para reprimir seletivamente ou aumentar a expressão de várias citocinas e
moléculas microbicidas e apresentação de antígenos. A interação entre as várias
moléculas de sinalização é complexa. Como as vias de sinalização podem ser
farmacologicamente manipuladas, um melhor conhecimento do seu papel e os
mecanismos pelos quais eles regulam as funções das células do sistema imunológico e
crescimento do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas terapias para o
controle desses agentes infecciosos (BHARDWAJ et al., 2010).
Os dois problemas mais importantes na concepção de um antiparasitário está em
definir o alvo terapêutico e desenvolvimento de resistência aos medicamentos pelo
parasita. Desse modo a busca de novas opções terapêuticas, além de avaliação da
eficácia de terapêutica adjuvante, é muito importante.
O potente papel de moléculas co-estimuladoras é apropriadamente estabelecido
na ativação ótima das células T e APCs; as células que desempenham um papel central
no combate às infecções. Assim, a imunoterapia envolvendo moléculas de co-
estimulação pode ser uma estratégia inovadora para o tratamento de diversas doenças,
minimizando os efeitos secundários provocados por drogas terapêuticas e para restringir
a emergência de resistência a drogas (KHAN et al., 2012).
Depois que foi identificado pela primeira vez em 1985, a pesquisa sobre CD40
foi inicialmente focada em torno da regulação da resposta imune humoral. Ele foi
identificado como uma molécula expressa em todas as fases de desenvolvimento de
células B e de diferenciação, enquanto que o CD40 ligante solúvel (sCD40L) (CD154,
gp39, T-BAM, TRAP ou), foi expressa principalmente nas células T ativadas CD41. O
papel fundamental de CD40-CD40L em respostas de células B dependentes das células
72
T foi confirmada pela descoberta de que os pacientes que sofrem de síndrome de hiper-
IgM ligado ao X (HIGM), foram caracterizados por mutações no seu gene CD40L e
apresentavam deficiências semelhantes na montagem de respostas imunitárias em
camundongos geneticamente modificados com a inativação do gene CD40 ou CD40L
(VAN KOOTEN e BANCHEREAU, 2000). Uma observação importante foi a
expressão de CD40 em monócitos e células dendríticas (DC). Na DC, CD40 parece ser
um passo crítico em sua maturação final tornando-a uma célula apresentadora de
antígeno plenamente competente.
No presente trabalho os níveis séricos de sCD40L foram significativamente
maiores no grupo SbV + NAC em relação ao grupo Sb
V.Do mesmo modo, a elevação ao
longo do tempo dos níveis dessa glicoproteina foi muito mais acentuada no grupo que
usou NAC.
Segundo Oliveira e col. (2013) os níveis de sCD40Laumentaram ao longo do
tratamento, sugerindo um efeito dessa proteína, constiuindo-se em um marcador de
cura. Deve ser salientado nesse que nesse estudo essa resposta ocorre após 15 dias de
tratamento.
A interação entre o CD40, uma molécula co-estimuladora expressa em
macrófagos, células B e células dendríticas (MIGA et al., 2000) e o seu ligante CD40L
(CD154) em células T (REN et al., 1994) resulta em uma resposta imune tipo Th1.
Sabe-se que o sinal do CD40 induz a produção de TNF-α e IL-12, favorecendo
assim a resposta do tipo Th1 (MATHUR, AWASTHI e SAHA, 2006).
Ao lado do seu papel na resposta imune do tipo Th1, interações CD40-sCD40L,
também foram capazes de estimular os macrófagos a produzir uma série de citoquinas e
de mediadores inflamatórios, incluindo o óxido nítrico (NO), que desempenha um papel
chave na morte do parasita (STOUT e SUTTLES, 1996). Quando o sCD40L se liga a
CD40, desencadeia-se o sinal através de vários intermediários de sinalização (FARIS et
al., 1994) para ativar a fosforilação da proteína quinase mitógeno induzida (MAPK)
(SUTHERLAND et al., 1996; KASHIWADA et al.,1996).
As observações de Awasthi et al. (2003) indicam que como uma estratégia de
evasão da resposta imune e para o estabelecimento de infecção, a Leishmania inibe a
sinalização p38MAPK acionada pelo CD40.
Por outro lado, o CD40 expresso por macrófagos regula respostas imunes a
infecção por Leishmania major por meio de sinalização recíproca através de MAPK p38
e ERK1/2. A reciprocidade entre MAKP-1 e de MAKP-3 contribui para essa
73
sinalização do CD40. Além disso o parasita Leishmania é capaz de estabelecer uma
nova estratégia de evasão imune direcionada para MAKP. Desse modo a regulação
diferencial de MAKP1 e MAKP-3 pode redirecionar a sinalização de CD40 e, assim,
regular muitas respostas imunes do hospedeiro (SRIVASTAVA, SUDAN e SAHA,
2011; MATHUR, R. K. et al., 2004).
Em MATHUR et al. (2004) observou-se com macrófagos infectados por
Leishmania, um aumento de ativação induzida de ERK-1/2 induzida por CD40,
sugerindo uma interação mútua entre o p38MAPK e ERK-1/2. Com efeito, uma
estimulação elevada induziu a fosforilação de p38MAPK e desse modo a secreção de
IL-12, enquanto uma mais fraca estimulou a fosforilação de ERK-1/2 e conseqüente
produção de IL-10. Por outro lado, Chamekh (2007) interessantemente mostra que
macrófagos infectados tratados com doses intermediárias de anti-CD40 Ab produziu
mais IL-10 e menos IL-12 do que os não infectados, sugerindo que a infecção por
Leishmania promove aumento da produção de IL-10 o que favorece a progressão da
doença.
Os resultados do presente estudo sugerem que o NAC como tratamento
adjuvante em pacientes com leishmaniose visceral em uso de antimonial pentavalente
foi capaz de elevar a expressão dos níveis de sCD40L. Por outro lado considerando os
trabalhos da literatura descritos anteriormente e os resultados desse estudo, sugere que o
NAC seja capaz de através da interação CD40-sCD40L estimular os macrófagos a
produzir uma série de citocinas e de mediadores inflamatórios, incluindo o óxido nítrico
(NO) e redução da hemeoxigenase 1, propiciando a resposta protetora Th1. E postula-se
que esse efeito através da ativação do MAPK p38 via o sistema redox de glutationa.
Em um recente estudo Utsugi et al. (2002) mostrou que o redox de glutationa
regula a produção de IL-12 induzida pela LPS através da ativação da p38 MPAK e o
efeito de iniciação de IFN-γ e a produção de IL-12 é em parte uma conseqüência do
equilíbrio redox da glutationa.
Uma variedade de vias co-estimuladoras contribuem para a reação imune contra
a leishmaniose diversificada com variação de resposta entre diferentes espécies de
Leishmania. A interação CD40-sCD40L auxilia no estabelecimento de uma resposta
imunitária protetora, por meio da produção IL-12, ativação de macrófagos e células T
CD4+ de células de iniciação, embora sob certas condições, tal interação promove
resposta imune supressiva pela produção de IL-10 e desenvolvimento de Treg. A
sinalização de B7-1/B7-2:CD28/CTLA-4 parece ser crítica para a resposta imune Th2,
74
no entanto, uma relação complexa parece existir de acordo com as características
genéticas básicas do hospedeiro, dose infectante e da espécie de parasita. A sinalização
OX40-OX40L medeia a proliferação de células T e expansão clonal, na seqüência de
uma resposta imune Th1 estabelecida/Th2 e, portanto, o resultado desta interação
depende da resposta imune do hospedeiro pré-existente. Devido à importância óbvia de
vias co-estimuladoras na leishmaniose, novos estudos que elucidem as complexas
interações de vias de co-estimulação trarão inovações sobre estratégias terapêuticas
contra a infecção por Leishmania (TULADHAR, NATARAJAN e SATOSKAR, 2011).
A dosagem sérica de citocinas antes do início do tratamento, comprovou que
todos os pacientes apresentavam o perfil de resposta tipo mista, representado pela
elevada produção de várias citocinas com os perfis Th1 e Th2.
Comparativamente, os pacientes do grupo Sbv + NAC, embora apresentassem
valores basais mais baixos antes do tratamento, notadamente para a dimensão do baço,
número de glóbulos brancos, neutrófilos, linfócitos e plaquetas, no 20º dia deste, seus
valores já se aproximavam aos dos produzidos pelo grupo Sbv especialmente para baço,
glóbulos brancos, neutrófilos, linfócitos.
Além disso, observa-se grande variabilidade entre os pacientes e intra-grupo
para os níveis séricos das citocinas TNF-α, IL-12 p40, IL-10 além de sCD40L e
tamanho de baço no início do tratamento, sugerindo diferentes padrões de modulação da
doença.
Como já evidenciado por outras pesquisas, a leishmaniose visceral (LV) na sua
forma aguda leva ao aumento da produção de citocinas. Células mononucleares do
sangue periférico (CMSP) expostas ao antígeno solúvel da Leishmania (Soluble
Leishmania Antigen ou SLA), Peruhype-Magalhães et al. (2005), observaram que em
pacientes com calazar agudo, a resposta Th2 era dominante, com o aumento na
produção de IL-10 por monócitos, ao mesmo tempo em que houve a diminuição tanto
dos linfócitos produtores de IFN-γ, quanto dos monócitos produtores de TNF-α e IL-12.
Ao investigar a produção das citocinas em pacientes curados, houve aumento de
neutrófilos, eosinófilos e células NK que produziam IFN-γ, assim como de monócitos
produtores de IL-12, o que faz acreditar que indivíduos curados do calazar ficam com
uma resposta imune inata efetiva no combate a uma reinfecção, visto que um novo
contato com o antígeno incita a pronta reação por parte dos neutrófilos, eosinófilos e das
células NK, que levará à eliminação do parasito.
75
Por se tratar de um inibidor da ativação dos macrófagos, a produção elevada da
IL-10 promove uma resposta inadequada do hospedeiro perante a invasão do parasito ao
organismo, instalando-se assim a doença. Ao longo do tratamento, ocorre a diminuição
dos níveis dessa citocina e o crescimento parasitário é controlado, o que assinala o
importante papel dessa interleucina no desenvolvimento da infecção.
A redução dos níveis séricos de TNF-α, IL-12 p40 e IL-10 ocorreu concomitante
ao aumento de sCD40L até 15 de tratamento, sugerindo que a resposta clínica foi
observada nesse período. Os valores dessas citocinas após o tratamento retornou aos
valores basais de indivíduos moradores de regiões endêmicas e assintomáticos,
conforme observado em outros trabalhos (COSTA et al., 2012; DUTHIE et al., 2013;
Diversos autores demonstraram a ação antagônica da subunidade solúvel da p40
da IL-12 na ativação da resposta Th1 pela IL-12p70 (MATNER et al., 1993;
GILLESEN et al., 1995; LING et al., 1995; HEINZEL et al., 1997; MATNER et al.,
1997; YOSHIMOTO et al., 1998). Gillesen et al. (1995) e Ling et al. (1995)
observaram em modelos murinos e humanos que quando na forma de dímero (p40) a
ação inibidora da resposta Th1 se dá pela ligação 1 no receptor da IL-12p70. Ao
dosarem a IL-12-p40, Caldas et al. (2005) da cadeia constataram elevados níveis
plasmáticos nos pacientes com infecção aguda da LV, sendo que esses valores
diminuíam de forma contínua com o passar do tempo.
7 CONCLUSÃO
O NAC foi capaz de aumentar as concentrações séricas de sCD40L ao longo do
tratamento. O tratamento com NAC melhorou os parâmetros clínicos dos pacientes
associados com o prognóstico dos pacientes: reduziu tamanho do baço, aumento do
número de neutrófilos/linfócitos e eosinófilos mais rapidamente. Os resultados sugerem
que a adição do NAC ao tratamento convencional melhora a resposta imunológica dos
pacientes, sobretudo na diminuição dos níveis séricos de IL-10, IL-12p40 e na elevação
da sDC40L que essa resposta ocorre já a partir de duas semanas. É provável que o
aumento dos níveis de sCD40L pelo NAC ocorra através da ativação do MAPK p38 via
o sistema redox de glutationa.
76
8 PERSPECTIVAS: QUESTÕES A SEREM REPONDIDAS
O NAC aumenta a produção do sCD40L ou a liberação desse da superfície das células.
• Qual a fonte de sCD40L induzida pelo NAC? Linfócitos B? Células
dendríticas? Plaquetas? Células T CD4?
– Realizar experimentos in vitro usando NAC em linfócitos T, B e
macrófagos infectados e não infectados.
– O NAC e sCD40L aumenta a capacidade antileishmanicida do
macrófago?
– Avaliar a capacidade microbicida do macrófago em tratamento NAC +
sCD40L + antimonial
• As diferenças clínicas observadas pró NAC apesar de não serem estatisticamente
significativas, possuem relevância clínica/biológica?.
─Utilizar NAC em pacientes mais graves.
77
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97
10 ANEXO A
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Convite e Objetivo:
Você está sendo convidado a participar de um estudo cujo objetivo é identificar
pessoas que tem leishmaniose na medula óssea ou no baço para estudara doença
chamada calazar ou leishmaniose visceral. Após lhe ser explicado o que contém
neste documento, você pode perguntar tudo sobre a pesquisa a seu médico.Todos
os pacientes com leishmaniose visceral diagnosticados no Hospital Universitário
serão convidados a participar do estudo. Caso decida participar do estudo, você
será solicitado a assinar este consentimento. Aproximadamente 40 pessoas
participarão deste estudo.
Participação voluntária:
Sua participação é voluntária. Você pode se recusar a participar ou pode desistir
da participação no estudo a qualquer momento. Sua recusa em participar ou
desistir de participar do estudo não afetará de modo algum qualquer tratamento
que você estiver recebendo no Hospital Universitário.
Finalidade do estudo: Este estudo visa determinar se o estudo da resposta imune
do paciente ao parasita e identificar fatores envolvidos na resistência de alguns
pacientes ao tratamento com antimonial (Glucantime®).
Procedimentos: Caso você aceite participar do estudo, um questionário será feito
para saber onde você mora, sua ocupação e seus hábitos. Um médico o
examinará para ver as características de sua doença. Você realizará os exames
que já são utilizados de rotina para o diagnóstico da doença,como exame de
sangue (sorológico), teste cutâneo e aspiração da medula óssea e/ou baço com
seringa e agulha para cultura do parasito que causa a doença. Além disso, seu
sangue será utilizada para avaliara a resposta imune frente a antígenos do
parasita.A participação nesta pesquisa não impede você de participar de outra
98
pesquisa, contanto que não mude o tratamento que vai receber.
Confidencialidade: Qualquer informação obtida durante este estudo será
confidencial, sendo apenas compartilhada com outros membros da equipe médica
do Comitê de Ética do Hospital Universitário. Embora os resultados obtidos
neste estudo sejam publicados, não haverá na apresentação destes resultados
meios que possam identificar os participantes. Suas fichas clínicas e os resultados
de seus exames poderão ser também vistos pelo Comitê de Ética do Hospital
Universitário. Fotos suas poderão ser mostrada em público sem identificar você e
protegendo partes íntimas.
Análise de riscos e benefícios: Todos os exames coletados são partes da rotina
utilizada para o diagnóstico de Leishmaniose, os quais você faria mesmo senão
participasse do estudo, exceto o sangue obtido ao mesmo momento que será
utilizado para os estudos da resposta imune, porém não trará novos riscos para
você como os previstos para retirada de sangue em rotina normal. A retirada de
sangue pode causar dor no local da punção com a agulha e raramente pode
ocorrer sangramento ou formação de hematoma. O exame da medula óssea é
também de rotina e não causam riscos iminentes. Porém, ocorrendo
complicações, os médicos do projeto e do Hospital cuidarão de você. Após o
diagnóstico da doença, você será tratado com antimônio (Glucantime®). Este
tratamento será acompanha dono Hospital Universitário.
Retorno de benefício para o sujeito e para a sociedade: O melhor conhecimento
sobre o tratamento da leishmaniose visceral e da resposta imune poderá o
contribuir no futuro para medidas de controle da doença.
Custos: Você não terá custos com a participação no estudo e, caso necessite de
tratamento para leishmaniose, a medicação lhe será fornecida gratuitamente.Você
não receberá nenhum pagamento para participar dessa pesquisa. Poderemos
apenas contribuir com o seu transporte para comparecer as visitas no ambulatório
após a alta do hospital.
99
Esclarecimentos: Caso tenha alguma pergunta ou apresente alguma
complicação relacionada aos procedimentos realizados na pesquisa, você pode
ligar para Dr. Roque Pacheco de Almeida (Tel.:(79)8823-7244) ou Dra. Amélia
Ribeiro de Jesus (Tel: (79)8823-7245). Caso você queira saber alguma coisa
sobre os seus direitos ou de seu filho, como paciente, você pode procurar o
Comitê de Ética do Hospital Universitário, cujo endereço consta no início deste
consentimento.
Consentimento: Se você leu o consentimento informado ou este lhe foi
explicado e você concorda em participar do estudo, favor assinar o nome
abaixo. Uma cópia deste consentimento lhe será entregue. Favor assinalar um
dos quadros abaixo para indicar se deseja ou não ter o parasito que causa esta
doença armazenado para estudos futuros aprovados sobre leishmaniose.
futuros aprovados sobre leishmaniose.
NÃOACEITO que o parasito que causa esta doença seja armazenado para
estudos futuros aprovados sobre leishmaniose.
Assinatura ou impressão do participante Data Hora
Nome/Assinatura do pesquisador Data Hora
Nome/Assinatura da testemunha Data Hora
100
FORMULÁRIO DE CONSENTIMENTO PARA MENORES DE
IDADE (MENORES DE 18)
Nome do Projeto: Marcadores Imunológicos e Moleculares Envolvidos na Gravidade Clínica da Leishmaniose
Visceral Humana e Canina e Possíveis Implicações na Transmissão da Doença no Estado de Sergipe.
NOME DO
PACIENTE:
Nodo Projeto:
Investigador Principal: Roque Pacheco de Almeida, Hospital Universitário da
UFS, Aracaju-Sergipe-Brasil.
Convite e Objetivo:
Você está sendo convidado a participar de um estudo cujo objetivo é identificar
pessoas que tem leishmaniose na medula óssea ou no baço para estudar a doença
chamada calazar ou leishmaniose visceral. Após lhe ser explicado o que contém
neste documento,você pode perguntar tudo sobre a pesquisa a seu médico. Todos
os pacientes com leishmaniose visceral diagnosticados no Hospital Universitário
serão convidados a participar do estudo. Caso decida participar do estudo,você
será solicitado a assinar este consentimento. Aproximadamente 40 pessoas
participarão deste estudo.
Nós perguntarem os a seus pais sobre sua saúde.Um médico lhe fará exames que
não causarão dor. Então, nós tiraremos um pouco de sangue (cerca de 2 colheres
de sopa) de seu braço, usando uma seringa e agulha. Algumas vezes, nós
faremos um teste na pele,onde injetaremos uma pequena quantidade de líquido
(duas gotas) no seu braço, usando uma agulha fina. Esperamos que a avaliação
da resposta imune frente a antígenos do parasita possa esclarecer mecanismos da
doença e resistência ao tratamento que algumas pessoas apresentam. O
tratamento com Glucantime ® será instituído independente de você participar ou
não do estudo.
101
Você pode ou não participar deste estudo. Se você quiser participar, por
favor, assine ou coloque sua impressão digital abaixo.
Esclarecimentos: Caso tenha alguma pergunta ou apresente alguma complicação
relacionada aos procedimentos realizados na pesquisa,você pode ligar para Dr.
Roque Pacheco de Almeida(Tel.:(79)8823-7244) ou Dra. Amélia Ribeiro de
Jesus (Tel:(79)8823-7245). Caso você queira saber alguma coisa sobre os seus
direitos ou de seu filho,
Data hora
Assinatura ou impressão do paciente
Data hora
Assinatura ou impressão do responsável
Data hora
Testemunha
Data hora
Investigador
