Universidade Federal do Rio de Janeiro - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp064620.pdf · 3.2 Indução da Silicose e Tratamento 34 3.3 Técnica do Lavado Broncoalveolar

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas

Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos

Januário Gomes Mourão e Lima

Orientadores: Profª. Drª Patrícia Machado Rodrigues e Silva Profº Dr. Marco Aurélio Ma rtins

Rio de Janeiro

2007

Livros Grátis

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas



Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.

Rio de Janeiro

2007



Banca Examinadora composta para defesa de Tese de Doutorado para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Aprovada em: _____ de ____________ de 2007.

Presidente da Banca Examinadora:_____________________________________

1º Membro:________________________________________________________

2º Membro:________________________________________________________

Rio de Janeiro

2007

Lima, Januário Gomes Mourão

Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos. / Januário Gomes Mourão e Lima – Rio de Janeiro, RJ: [s.n.], 2007. Orientadora: Profª Drª Patrícia Machado Rodrigues e Silva

XIV, 123 p.; Dissertação (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biológicas – Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas.

1. Inflamação; 2. Pulmão; 3. Partículas de sílica; 4. Glicocorticóides. I. Patrícia Machado Rodrigues e Silva; II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título (série).

Agradecimentos

Quando optamos por fazer um doutorado, sabemos que não será fácil e

que teremos que contar com a ajuda de diversas pessoas que estão a nossa volta,

familiares, amigos e colegas de trabalho. Por conta disso gostaria de agradecer a

todos que me ajudaram e principalmente incentivaram a realização desse projeto.

Porém, existem algumas pessoas que devem receber um agradecimento especial

por sua participação na minha vida.

Agradeço inicialmente a minha orientadora Dra. Patrícia M. Rodrigues e

Silva , por sempre me apoiar nos momentos mais difíceis quando, por conta do

meu trabalho, precisei me ausentar do laboratório. Agradeço também ao Dr.

Marco Aurélio Martins , a oportunidade de poder desenvolver minha tese em seu

laboratório.

Não poderia deixar de agradecer muito à minha amiga Tatiana Paula

Ferreira , que conheci como estagiária do Laboratório de Inflamação e hoje é uma

colega de trabalho, pela sua enorme ajuda no desenvolvimento dessa tese.

Aproveito para agradecer ao Francisco pela sua importante colaboração na tese

e a todos os colegas do Laboratório de Inflamação da FIOCRUZ.

Ao Dr. John Wallace pela concessão no fornecimento das NCX-1024. Ao

Dr. Marcelo Pelajo pela colaboração nos ensaios de visualização de neutrófilos

nos cortes histológicos. À Dra Patrícia R. Macedo Rocco , Cristiane Garcia e

Alba Barros de Souza , pela colaboração na realização dos ensaios de função

pulmonar realizados no Laboratório de Investigação Pulmonar/IBCCFº/UFRJ.

Agradecer à FIOCRUZ, ao CNPq e a UNESCO pelo auxílio financeiro ao

projeto.

Aos meus amigos professores da UNISUAM, especialmente: Luis Felipe

da F. Reis , Gilson Ramos de Oliveira Filho , Anke Bergmann e Marcus Stutz .

À Chancelaria da UNISUAM, Prof. Ana Cristina e seus filhos Daniel , Arapuan e

Paulo Vitor , pelo imenso apoio desde o início da minha carreira até hoje.

Aos meus amigos e estagiários do Laboratório de Morfologia da UNISUAM

– LABMORF, pela fidelidade e dedicação ao trabalho.

A minha mãe, Nilza , pelo amor e dedicação na minha formação como

pessoa. Sempre me apoiando de todas as formas. Minha namorada, Mariana ,

pelo incentivo, amor e paciência na reta final desse projeto.

Epígrafe

"O único lugar onde o sucesso vem antes que o trabalho é no dicionário."

(Albert Einstein)

Lima, Januário Gomes Mourão e Lima . Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos. Rio de Janeiro, 2007, 123pp. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biológicas. Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Resumo

A silicose é uma das doenças ocupacionais mais antigas, já matou milhares de

pessoas no mundo todo. Neste estudo nós desenvolvemos um modelo não-

invasivo do silicose em camundongos para investigar os efeitos do tratamento

curativo com os glicocorticóides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta silicótica.

A análise comparativa entre diferentes espécies de camundongos como

C57Black6, Balb/c e Swiss-Webster revelou a ocorrência de inflamação

leucocitária ao dia 7, formação de granuloma peribronquiolar no dia 14, seguido

por um quadro de fibrose no dia 28. Tomando por base que todas as três espécies

exibiram o mesmo padrão de resposta inflamatória foram escolhidos

camundongos Swiss-Webster, espécie não-isogênica, por melhor representar a

variabilidade da resposta em humanos. A análise do infiltrado inflamatório no BAL

revelou que há um aumento significativo no número de leucócitos totais e células

mononucleares em 7 dias, que reduziu progressivamente com tempo. O número

de neutrófilos permaceu elevado nos três tempos analisados. A análise do tecido

mostrou, pela coloração com HE, um progressivo infiltrado leucocitário (neutrófilos

e macrófagos), com aparecimento de numerosos nódulos silicóticos. Vimos

também um aumento significativo nos níveis de KC, MIP-2, IFN-γ, TNF-α e TGF-ß,

bem como maior expressão de MMP-2 e MMP-9 nos animais silicóticos. O

tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024, realizado diariamente entre os

dias 21 e 28 após instilação da sílica, levou a uma significativa diminuição da

resposta inflamatória e granulomatosa, assim como da geração de mediadores

inflamatórios. Nossos achados indicam que a instilação intranasal de sílica

reproduz as da silicose humana. O tratamento com flunisolida e NCX-1024 foi

eficiente em inibir, de forma curativa, componentes inflamatórios relevantes dentro

do quadro da silicose, constituindo assim opção terapêutica promissora no caso

da silicose.

Palavras chaves: Inflamação, pulmão, partículas de sílica, glicocorticóides.

Abstract

Silicosis is one of the oldest occupational diseases, still killing thousands of people

in the world. In this study we developed a non-invasive model of silicosis in mice, in

order to investigate the effect of the treatment with glucocorticoids flunisolide and

NCX-1024 on the silicosis. The comparative analysis among different strains of

mice as C57Black6, Balb/c and Swiss Webster revealed the occurrence of

leukocyte infiltration at day 7, peribronchiolar granuloma formation at day 14,

followed by an extensive tissue fibrosis at day 28. The tissue analysis showed,

under conditions of HE staining, a progressive inflammatory infiltration (neutrophils

and macrophages), in parallel with numerous silicotic nodules. A significant

progressive increase in the levels of KC, MIP-2, IFN-γ, TNF-α e TGF-ß was

detected. By means of immunohistochemistry we noted a strong staining for MMP-

2 and MMP-9 in the silicotic group. Curative treatment with flunisolide and NCX-

1024, once a day from 21 to 28 days, reduced significantly the inflammatory and

granulomatosus response, as well as the increased levels of inflammatory

mediators. Our findings indicate that nasal silica instillation reproduces several

features of the human silicosis. In addition, treatment with flunisolide or NCX-1024

showed to be effective to inhibit curatively silicotic response, indicating that they

seem to constitute promising therapeutic approach in the case of silicosis.

Key words : Inflammation, lung, silica particles, glucocorticoids.

Lista de Abreviaturas

SDRA - Síndrome do Desconforto Respiratório no Adulto

DPOC - Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica

PIFD - Pneumopatias Intersticiais Fibrosantes Difusas

IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer

OMS – Organização Mundial de Saúde

MIP-2 - Proteína Inflamatória de Macrófago – 2

ROI - Intermediários Reativos de Oxigênio ()

NF-κβ – Fator Nuclear-κβ

IFN-γ - Interferon Gamma

TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alpha

TGF-β - Transforming Growth Factor Beta

IGF – Insulin Growth Factor

MMP – Metaloproteinase

TIMP - Inibidor Tecidual de Metaloproteinase

PAF – Fator Ativador de Plaquetas

GRE - Elementos Responsivos aos Glicocorticóides

POMC - Pró-opiomelanocortina

GM-CSF - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

COX-2 - Ciclooxigenase-2

∆P1, L – Variação de Pressão do Pulmão

Pi, L – Ponto de Inflexão do Pulmão

∆P2, L - Variação de Pressão do Pulmão

Pel, L – Pressão de Resistência Elástica

Est, L - Elastância Estática

Edyn, L - Elastância Dinâmica

VT - Volume Corrente

Sumário Pág.

Folha de Rosto II

Folha de Aprovação III

Agradecimentos IV

Epígrafe VI

Resumo VII

Abstract IX

Lista de Abreviaturas X

1. Introdução 16 1.1 Pulmão 16 1.2 Disfunções Pulmonares 17 1.3 Silicose 18 1.3.1 Epidemiologia 19 1.3.2 Sílica 20 1.4 Fibrose Pulmonar 22 1.4.1 Células Epiteliais 23 1.4.2 Macrófagos Alveolares 24 1.5 Modelos Experimentais 25 1.6 Tratamento da Silicose 26

1.6.1 Glicocorticóides 27

2. Objetivos Gerais 33

2.1 Objetivos Gerais 33 2.2 Objetivos Específicos 33 3. Material e Métodos 34

3.1 Animais 34 3.2 Indução da Silicose e Tratamento 34 3.3 Técnica do Lavado Broncoalveolar 35 3.3.1 Contagem dos Leucócitos 35 3.4 Análise Histopatológica 36 3.4.1 Hematoxilina-Eosina (HE) 36 3.4.2 Picro-Sírius 36

3.4.3 Giemsa de Lennert 37 3.4.4 Imunohistoquímica para MMP-2 e MMP-9 37 3.4.5 Histoquímica para Marcação de Macrófagos Ativados 38

3.5 Quantificação de Quimiocinas e Citocinas por ELISA 38 3.6 Mecânica Respiratória 39 3.7 Análise Estatística 40

4. Resultados 41 4.1 Análise Comparativa da Resposta Inflamatória Pulmonar 41 Induzida pela Instilação de Sílica em Camundongos 4.2 Cinética da Resposta Inflamatória Pulmonar Induzida 42 pela Instilação de Sílica em Camundongos Swiss-Webster 4.2.1 Avaliação do Conteúdo Leucocitário no Lavado 42

Broncolaveolar 4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas ao Nível 42 do Tecido Pulmonar 4.2.3 Avaliação do Infiltrado Celular ao Nível do Parênquima 43 Pulmonar 4.2.4 Identificação de Mediadores Inflamatórios Gerados 44 Durante a Resposta Silicótica em Camundongos 4.2.5 Análise da Presença de Metaloproteinase 2 e 9 45 (MMP-2 e MMP-9) no Tecido Pulmonar 4.2.6 Avaliação da Mecânica Respiratória em Camundongos 45 Silicóticos

4.3 Efeito do Tratamento Curativo com Flunisolida e NCX-1024 45

Sobre a Resposta Silicótica em Camundongos 4.3.1 Avaliação da População Leucocitária no Lavado 46 Broncolaveolar

4.3.2 Avaliação das Alterações Morfológicas ao Nível do 46 Tecido Pulmonar

4.3.3 Avaliação do TNF-α no Lavado Broncoalveolar 47 4.3.4 Avaliação da Mecânica Respiratória 47

5. Figuras

5.1. Figura 2 - Estrutura química dos compostos flunisolida 50 e NCX-1024.

5.2. Figura 3 – Análise do Lavado Broncoalveolar. Comparação das 51 Espécies.

5.3. Figura 4 – Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 52 de camundongos Swiss-Webster (HE). Comparação das espécies. 5.4. Figura 5 - Cinética do infiltrado leucocitário do lavado 53 broncoalveolar (BAL). 5.5. Figura 6 – Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 54 de camundongos Swiss-Webster (HE). Análise da cinética. 5.6. Figura 7 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 55 de camundongos Swiss-Webster (HE). Análise da cinética. 5.3. Figura 8 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 53 de camundongos Swiss-Webster (Picro-Sírius). Análise da cinética. 5.3. Figura 9 - Fotomicrografias de histoquímica (BSL-1) de pulmões 57 de camundongos de camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 10 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 58 de camundongos Swiss-Webster (Giemsa). Análise da cinética. 5.3. Figura 11 - Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no 59 lavado broncoalveolar (BAL). 5.3. Figura 12 - Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no 60 tecido pulmonar. 5.3. Figura 13 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-2. 61 5.3. Figura 14 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-9. 62 5.3. Figura 15 - Avaliação temporal da mecânica respiratória de 63 camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 16 - Análise do Lavado Broncoalveolar. Tratamento 64 com a flunisolida e NCX-1024. 5.3. Figura 17 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 65 de camundongos Swiss-Webster (HE). Tratamento com a flunisolida e NCX-1024. 5.3. Figura 18 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 66 de camundongos Swiss-Webster (Picro-Sírius). Tratamento com a flunisolida e NCX-1024.

5.3. Figura 19 - Fotomicrografias de histoquímica (BSL-1) de pulmões 67 de camundongos de camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 20 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-2. 68 5.3. Figura 21 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-9 69 5.3. Figura 22 – Quantificação de TNF-alfa no BAL. 70 5.3. Figura 23 - Avaliação temporal da mecânica respiratória de 71 camundongos. Tratamento com a flunisolida e NCX-1024.

6. Discussão 73

7. Conclusão 85

8. Referências Bibliográficas 86

9. Anexo 104

1. Introdução

Um significante número de patologias graves implicam no aparecimento de

uma resposta inflamatória pulmonar aguda, que é seguida, em tempos mais

tardios, pelo desenvolvimento de um processo fisiológico de reparo, associado à

ocorrência de fibrose, com acúmulo excessivo de matriz extracelular e células

mesenquimatosas, ou de remodelamento tissular. Em conjunto, estes eventos

levam a uma progressiva alteração da arquitetura das vias aéreas, redução no

processo de trocas gasosas e perda funcional do órgão.

1.1 Pulmão

O pulmão é um órgão que atua efetivamente no processo de trocas

gasosas entre o sangue e o ar inspirado, tendo como estrutura básica de

condução o sistema da árvore respiratória que se constitui da traquéia, a qual ao

ramificar-se origina dois brônquios também conhecidos como primários. Estes ao

penetrarem nos pulmões irão dirigir-se para baixo e para fora, e ao ramificarem-se

darão origem aos brônquios lobares. Estes últimos ao se dividirem repetidas vezes

formando estruturas cada vez menores darão origem a uma estrutura complexa

que constitui os bronquíolos (terminais), que por sua vez terminarão nos

bronquíolos respiratórios que marcam, então, o início da porção respiratória. Esta

compreende os ductos alveolares, sacos alveolares e alvéolos que compõem no

seu todo o parênquima pulmonar (Kobzik, 1999).

Desta forma o pulmão encontra-se em contato amplo com o meio externo,

ficando, assim exposto à ação de diversos agente agressores incluindo

patógenos, poluentes, substâncias antigênicas e xenobióticos. Para manter a

integridade indispensável ao fenômeno de trocas gasosas que se dá ao nível dos

alvéolos e capilares, o pulmão no curso do processo evolutivo, manteve um

sistema de detoxicação e de defesa particularmente adaptativos e eficazes. No

entanto, as estruturas alveolares são bastante finas e com grande susceptibilidade

a respostas de natureza inflamatória. Isto tem por conseqüência a ocorrência uma

ampla gama de patologias inflamatórias, que podem ser classificadas de uma

maneira mais geral em obstrutivas e restritivas (Kobzik, 1999; Caramori & Adcok,

2003).

1.2 Disfunções pulmonares

No caso das doenças de natureza obstrutivas, observa-se um aumento na

resistência ao fluxo de ar que resulta em obstrução parcial ou substancial em

diferentes níveis da árvore brônquica incluindo desde a traquéia e grandes

brônquios até bronquíolos terminais e respiratórios. No caso das restritivas,

verifica-se a ocorrência de redução da expansão do parênquima pulmonar e

queda da funcionalidade do órgão. De forma geral, grande parte destas patologias

encontra-se associada ao processo de remodelamento tissular como verificado no

caso da asma brônquica, na síndrome aguda de desconforto respiratório (SDRA),

doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC) e pneumopatias intersticiais

fibrosantes difusas (PIFD) como a silicose. Neste contexto, insere-se de forma

importante a resposta de fibrose pulmonar, que é uma condição progressiva e até

mesmo fatal, caracterizada patologicamente por proliferação de células

mesenquimais (fibroblastos) (Lehnert e col., 1994), expansão da matriz

extracelular e extenso processo de remodelamento tecidual. Embora a

patogênese das disfunções pulmonares obstrutivas e restritivas seja complexa e

não completamente esclarecida fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e

reguladores de apoptose têm sido implicados no processo (Kobzik, 1999).

1.3 Silicose

Dentro do contexto acima mencionado situa-se a silicose, que é uma

doença crônica, difusa do parênquima pulmonar que resulta da exposição

prolongada a poeiras inaladas que contenham dióxido de silício ou sílica, sob a

forma livre e cristalina (Beckett e col., 1997). É diagnosticada através de

radiografia de tórax simples que revela a presença de finas nodulações nas

regiões superiores dos pulmões. A função pulmonar pode estar na condição

normal ou moderadamente afetada, sendo que na maioria dos pacientes a

dispnéia surge numa fase mais tardia. Esta patologia apresenta em geral uma

evolução bastante lenta, progressiva e irreversível, levando à insuficiência

respiratória, mesmo em condições nas quais o paciente não esteja mais exposto à

inalação da sílica. A insuficiência respiratória resultante é decorrente de alterações

da ventilação pulmonar e das trocas gasosas, sendo o comprometimento da

função respiratória um fator limitante para as atividades cotidianas do paciente

(Godleski, 1994). Em humanos caracteriza-se por nódulos fibróticos causados por

uma inflamação persistente que leva à proliferação de fibroblastos e acúmulo

exagerado de colágeno (Hunninghake e col., 1984; Cook, 2002). O infiltrado

inflamatório mononuclear e a fibrose subseqüente ocorrem nos locais de

deposição da partícula mineral. Esta doença inclui-se no grupo de patologias

pulmonares causadas pela exposição à “poeira” (pneumoconioses) descritas

desde a Antigüidade, tendo sido no período do Renascimento adotadas as

primeiras medidas preventivas como o uso de máscaras. Isto teve como base a

identificação de associação direta entre lesões pulmonares e o óbito precoce de

indivíduos trabalhadores em minas de carvão ou em fundições (Fujimura, 2000).

Muito embora após a segunda guerra mundial medidas sanitárias de controle

tenham sido implementadas em países desenvolvidos, naqueles

subdesenvolvidos e em desenvolvimento, estatísticas apontam para um

incremento nos índices de incidência destas fisiopatologias (Parkes e col, 1982).

Encontram-se como de atividades de maior risco aquelas que envolvem o

jateamento de areia, mineração, trabalho em fundição de ferro, indústrias

cerâmica e abrasivos, pedreiras e moagem de granito (Mossman, 1998).

Até a década de 80, não se relacionava a sílica e o câncer de pulmão.

Porém, em 1982, Parkes, descreveu a associação entre o carcinoma

broncogênico e pacientes com silicose. A OMS – Organização Mundial de Saúde

(1986), afirmou que não há risco de câncer de pulmão em exposições

ocupacionais até 40 mg/m3. No entanto, o parecer publicado pela Agência

Internacional de Pesquisa em Câncer da OMS - IARC (International Agency for

Research on Cancer) (1997) refere haver evidências suficientes em humanos e

em animais de experimentação de que a sílica cristalina inalada na forma de

quartzo ou cristobalita de fontes ocupacionais é carcinogênica.

1.3.1 Epidemiologia

A silicose representa um sério problema de saúde pública uma vez que,

apesar de ser evitável, apresenta altos índices de incidência e prevalência,

especialmente nos países menos desenvolvidos. Pois é irreversível e não passível

de tratamento, podendo cursar com graves transtornos para a saúde do

trabalhador, assim como resultar em um sério impacto sócio-econômico.

No Vietnam a silicose é a doença ocupacional com maior número de

concessões de benefícios, chegando a 90%. Na Índia a prevalência da silicose

chega a 55% dos trabalhadores. Nos Estados Unidos esses números diminuem

bastante, onde 1 milhão de trabalhadores estão expostos à sílica na forma livre e

cristalina, e 100 trabalhadores correm o risco de desenvolver silicose (Goelzer,

2000). No Brasil a silicose também é a pneumoconiose de maior prevalência e

estima-se que cerca de seis milhões de trabalhadores estejam expostos à sílica

em todo o país (Terra-Filho, 2006). Deste número, estima-se que 4 milhões

trabalhem na construção civil, 500 mil na mineração e 2 milhões na industria

(Goelzer, 2000).

As partículas de sílica estão presentes em uma ampla variedade de

situações: extração e beneficiamento de rochas como o granito e pedras em geral,

mineração de ouro, arsênico, estanho e de pedras preciosas e perfuração de

poços, nas indústrias de cerâmica, de materiais de construção, na fabricação de

vidro e de fertilizantes (rocha fosfática), em fundições e na produção de talco

(comumente contaminado com sílica), operação de jateamento de areia,

rebarbação, retífica e polimento de metais e minerais com abrasivos contendo

sílica, e em atividades de manutenção e limpeza de fornos, moinhos e filtros;

confecção de prótese dentária (Terra-Filho, 2006).

1.3.2 Sílica

A sílica é um nome genérico utilizado para denominar compostos que

possuem átomos de silício e oxigênio, e ao se estruturarem entre si formam

diversas substâncias químicas. Apresenta-se na forma cristalina (quartzo,

cristobalita e tridimita) ou amorfa, sendo a primeira a de maior importância no

contexto ocupacional, já que a forma amorfa praticamente é atóxica para os

pulmões (Balaan & Banks, 1992). As partículas de poeira inalada depositam-se

em vários locais do sistema respiratório dependendo do tamanho, forma, massa,

características aerodinâmicas e outras propriedades físicas (Hounam & Morgan,

1977). Como as partículas são irregulares, seu tamanho é expresso em diâmetro

aerodinâmico, um parâmetro que descreve o movimento da partícula inalada no ar

inspirado. O diâmetro aerodinâmico determina onde as partículas inaladas se

depositarão no pulmão (Hounam & Morgan, 1977). Partículas maiores do que 15

µm de massa média de diâmetro aerodinâmico (MMAD) ficam retidas na região

nasal. As intermediárias, entre 5 a 10 µm depositam-se nos brônquios e

bronquíolos, sendo removidas através do mecanismo mucociliar. As menores

penetram nos bronquíolos terminais e alvéolos e são parcialmente removidas,

pelos macrófagos alveolares. No pulmão humano verificou-se que as partículas de

sílica retidas têm diâmetros que variam entre 0,5 a 0,7 µm. Outras partículas

entram em contato com o epitélio alveolar levando ao aumento da síntese de

Macrophage Inflammatory Protein-2 (MIP-2) e outras quimiocinas para a atração

de neutrófilos (Barret e col., 1998). Além disso, parte das partículas atravessa o

epitélio respiratório sendo fagocitadas pelos macrófagos intersticiais ou

depositando-se diretamente no interstício (Brody e col., 1982). Uma parte da sílica

inalada e depositada nos pulmões pode ser eliminada (Davis e col., 1981). Horas

após exposição a aerossóis de sílica, foi verificado que os macrófagos alveolares

que em condições fisiológicas encontram-se dispostos ao acaso nos alvéolos

pulmonares, encontram-se concentrados na bifurcação do duto alveolar, local

onde as partículas depositam-se (Brody e col., 1980). Evidências indicam que a

interação dos macrófagos alveolares com as partículas de sílica se faz através de

receptores do tipo “scavenger” (Kobzik, 1995; Palencada & Kobzik, 2000). Vale

ressaltar que a sílica tem propriedades citotóxicas, em grande parte dependentes

de radicais livres presentes na superfície cristalina. Estes radicais, intermediários

reativos de oxigênio (ROI) são formados durante a ruptura ou esmagamento da

sílica e tem uma meia-vida de cerca de 1-2 dias (Lapp e Castranova, 1993;

Vallyathan e col., 1988). Os ROI podem atuar como mensageiros secundários

estimulando a translocação do fator de transcrição relacionado com estresse, o

fator nuclear kappa beta (NF-kB) (Schreck e col., 1992). A citocina pró-

inflamatória TNF-α também possui um papel crítico na silicose pulmonar,

mediando inicialmente a reação inflamatória aguda e participando mais

tardiamente da indução do processo fibrogênico (Piguet e col., 1990).

1.4 Fibrose Pulmonar

Para muitos a resposta de fibrose pulmonar é vista tradicionalmente como

um fenômeno que ocorre posteriormente a uma resposta inflamatória de caráter

agudo, muito embora até o presente momento não haja evidências clínicas que

comprovem a real existência de uma correlação direta entre parâmetros

inflamatórios e a evolução da doença. No entanto, tem sido descrito na literatura

que a fibrose tissular amplifica-se a partir da ocorrência de uma lesão inicial e atua

modulando o fenômeno de reparo tecidual, no que tange tanto o acúmulo de

células mesenquimatosas como o de síntese de componentes da matriz

extracelular (Keane & Strieter, 2002). Este fato tem direcionado diversos grupos

de pesquisadores a focar seus estudos na expressão de componentes da matriz

extracelular e moléculas normalmente envolvidas na regulação da homeostase.

No caso particular da matriz extracelular, evidências indicam que sua manutenção

é um processo dinâmico, no qual há a síntese de proteínas como colágeno fibrilar,

fibronectina e proteoglicanos, seja sempre balanceada por uma taxa equivalente

de proteólise. Como reguladores, tem sido dada ênfase a uma classe de

proteases conhecida como metaloproteinases (MMP), que sofre por sua vez

regulação de sua atividade enzimática por ação de uma família de inibidores

teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Tem sido reportado na literatura que

durante um processo de desregulação do processo homeostático, ocorre a

formação de fibrose tecidual, que corresponde a um fenômeno de reparo

excessivo, traduzido por alterações funcionais importantes (Keane & Strieter,

2002). Neste cenário amplo, incluem-se também outras células residentes como

as epiteliais de revestimento da árvore brônquica, bem como outras células

constitutivas (macrófagos), que desempenham uma participação importante como

contribuintes do processo de agressão tissular mediante a ativação em cascata de

diferentes tipos celulares e fenômenos de reparo (Mossaman & Churg, 1998;

Rocco e col, 2003).

1.4.1 Células epiteliais

Células epiteliais têm como característica básica apresentarem-se

classificadas em subtipos específicos, exercendo como função básica o

revestimento de diferentes locais do organismo, dentre os quais a árvore

respiratória encontra-se incluída. No caso particular dos alvéolos, adquirem a

denominação de pneumócito I e II e possuem participação ativa no processo de

trocas gasosas. Neste sentido, um crescente número de evidências aponta para

um papel importante das células epiteliais das vias aéreas no estabelecimento do

quadro inflamatório, fenômeno este que parece estar associado a uma alteração

fenotípica no sentido de levar à produção de uma variedade de mediadores que

incluem prostaglandinas, Platelet-activating factor (PAF), citocinas e quimiocinas

(Smith, 1990; Jany e cols., 1995; Kinnula e col., 1992). Mais ainda, estudos

complementares demonstraram a capacidade de células epiteliais brônquicas em

expressar moléculas de adesão (CD 11b/CD18, ICAM-1), o que de forma clara

reforça a potencial contribuição destas células no recrutamento leucocitário para o

foco inflamatório (Kai e col., 1994).

1.4.2 Macrófagos alveolares

Macrófagos alveolares aparecem, em geral, localizados no interior dos

alvéolos e constituem as primeiras células pulmonares residentes que entram em

contato com o agente agressor, apresentando-se em número elevado no

interstício pulmonar e dentro dos alvéolos e constituindo assim uma importante

células efetora do processo de imunidade imediata. Sua implicação no processo

de reparação é relevante uma vez que possuem a capacidade de liberar citocinas

e fatores quimiotáticos que podem regular tanto o acúmulo local de células

mesenquimatosas (fibroblastos) como de matriz extracelular.

Macrófagos alveolares constituem importantes membros da família de

células macrofágicas, que apresentam heterogeneidade de fenótipos, em

conseqüência: a) do processo de diferenciação celular que está diretamente

relacionado ao tipo de citocina com a qual faz contato e interação com o estroma

em órgãos hematopoiéticos; b) da ampla distribuição em tecidos do organismo e

variada responsividade a estímulos endógenos e exógenos. O reconhecimento

destes estímulos faz-se mediante interação com uma gama extensa de receptores

ligados à membrana plasmática, que irá resultar em fagocitose ou endocitose,

sinalização intracelular e alterações complexas de ativação e repressão de gens.

Os ligantes são reconhecidos por macrófagos incluem os receptores do tipo

”scavenger”, opsoninas (no caso de anticorpos, complemento, colectinas e

proteína ligante de lipopolissacarídeo), ou ainda por reconhecimento direto de

carbohidratos, proteínas, lipídios e ácido nucléico através dos receptores do tipo

“Toll” e lectinas. Estes últimos possuem marcada importância no reconhecimento

não apenas de resíduos bacterianos conservados como também de estruturas

endógenas como lipoproteínas, hidrolases lisosomais, proteínas de choque

térmico e complexos de proteinases, o que os torna peças fundamentais no

“clearance” do espaço extracelular e homeostase tecidual, compondo parte do

mecanismo de defesa do organismo (Dunn, 2003).

1.5 Modelos Experimentais de Silicose

Os modelos animais de silicose procuram reproduzir a seqüência de

eventos da silicose pulmonar humana (Reiser e cols., 1982 e 1983; Kumar, 1989;

Ohtsuka e cols., 1995; Gossart e cols., 1996; Mariani e cols., 1996; Weirich e cols.,

1996; Huaux e cols., 1998 e 1999; Davis e cols., 1999; Piguet e cols., 1994;

Hubbard e cols., 1989) e têm sido explorados para a compreensão dos

mecanismos celulares e moleculares envolvidos na doença. Basicamente,

existem duas formas de se induzir silicose em animais: por meio de inalação das

partículas em aerosol (Davis e cols., 1999) e por instilação intratraqueal das

partículas de sílica. Essa última sendo a forma mais comum de indução da doença

em modelos experimentais (Borges e cols., 2001; Faffe e cols., 2001; Reasor e

cols., 2000). Porém, existem alguns problemas nessas duas modalidades de

indução da silicose em animais. O aerossol exige um período de

aproximadamente duas semanas de exposição diária à sílica e a instilação

intratraqueal, apesar de rápida, se torna muito invasiva por conta do procedimento

cirúrgico para exposição da traquéia e introdução da sílica utilizando uma seringa.

Além disso, com a injeção intraqueal é anulada uma parte do caminho seguido

pelas partículas de sílica uma vez inaladas, incluindo as fossas nasais, laringe e a

traquéia propriamente dita.

1.6 Tratamento da Silicose

Quanto mais precoce for o diagnóstico e a interrupção da exposição, melhor

é o prognóstico do paciente. Porém, dificilmente o paciente procura o serviço de

saúde precocemente, pois as alterações funcionais decorrentes da silicose

acontecem numa fase mais tardia.

Alguns trabalhos indicam a utilização de um alcalóide isolado da Stephania

tetrandra, uma planta utilizada na medicina chinesa, como eficaz no tratamento

experimental e clínico da silicose (Liu e cols., 1994; Ernst, et at. 2002). Entretanto,

é importante mencionar que a maioria dos trabalhos referentes à terapêutica da

silicose tem como base a fase precoce da fibrose pulmonar, o que não

corresponde a realidade dos pacientes silicóticos, uma vez que estes só procuram

o atendimento de saúde na fase crônica da doença. Mais ainda, a lavagem

broncoalveolar tem sido proposta como método para a remoção de partículas do

pulmão em indivíduos com silicose crônica e nos casos de silicoproteinose,

embora não tenha sua eficácia bem estabelecida. Um dos questionamentos

levantados relaciona-se ao fato das partículas que se encontram em vias aéreas

mais distais serem pouco alcançáveis por este procedimento, já que o retorno de

partículas do interstício para o espaço alveolar é discreto. Uma outra forma de

tratamento utilizada, apenas para casos selecionados, é o transplante pulmonar

(Terra-Filho, 2006). Com base no acima exposto, fica clara a importância pela

busca de terapias mais eficazes para a silicose.

1.6.1 Glicocorticóides

O uso de glicocorticóides é a mais efetiva forma de tratamento para

doenças de caráter inflamatório como reumática, autoimune e alérgicas. Os

glicocorticóides exercem seus efeitos se ligando a receptores específicos

localizados no citoplasma das células alvo (Barnes, 1998) e atuam regulando a

expressão de genes de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e

metabólitos de ácido araquidônico (Buckingham e cols., 1994). Os glicocorticóides

interagem com proteínas receptoras específicas localizadas no citoplasma de uma

grande variedade de células-alvo para regular a expressão de determinados

genes. Estudos de imunolocalização e de hibridização in situ revelaram níveis

particularmente elevados de receptores para glicocorticóides no pulmão humano,

merecendo destaque a expressão nas células epiteliais e endoteliais. Esses

receptores pertencem a uma superfamília de proteínas estruturalmente

relacionadas, que transduzem os efeitos de um grupo diverso de pequenos

ligantes hidrofóbicos, como os hormônios esteroidais, o hormônio tireoidiano e a

vitamina D (Mangelsdorf e cols., 1995).

De acordo com estudos de mutagênese sítio-direcionada, os receptores de

corticosteróides exibem dois domínios extremamente conservados: uma região

contendo em torno de 70 aminoácidos, que formam dois domínios de ligação ao

zinco (dedos de zinco), e são essenciais para a interação do receptor com

seqüências específicas de DNA; e uma região na extremidade C-terminal, que

interage com o ligante. A extremidade N-terminal constitui a porção menos

conservada da molécula e parece importante não somente para a ativação da

transcrição gênica após ligação ao DNA, como também para ligação a outros

fatores de transcrição.

O receptor de glicocorticóides está localizado no citoplasma numa forma

predominantemente inativa e a transição para a forma ativa, seguida de

translocação para o compartimento nuclear, depende da ligação do esteróide

(Gronemeyer, e cols., 1992; Beato, e cols., 1995; Truss & Beato, 1993). O receptor

de glicocorticóide inativo é encontrado na forma de um complexo com outras

proteínas, como a proteína de choque térmico (hsp90), membro da família de

proteínas de choque térmico induzidas por estresse; uma imunofilina de 59 kDa,

pertencente ao grupo de proteínas intracelulares que se ligam aos

imunossupressores ciclosporina e tacrolimo; e outras proteínas inibitórias. A hsp90

atua como uma chaperona molecular e acredita-se que, mediante interações com

o domínio de ligação aos esteróides, mantenha a conformação do receptor

adequada para a ligação do glicocorticóides, impedindo sua translocação para o

núcleo na ausência de ligante (Barnes, e cols., 1998).

Após a ligação dos glicocorticóides, o receptor torna-se livre de suas

proteínas associadas e dirige-se para o núcleo, onde regula a transcrição de

genes-alvo, direta ou indiretamente. O complexo hormônio-receptor interage com

seqüências de DNA específicas nas regiões reguladoras dos genes afetados. As

seqüências curtas de DNA, denominadas elementos responsivos aos

glicocorticóides (GRE), fornecem especificidade para a indução da transcrição

gênica. A seqüência de consenso do GRE é um palíndromo imperfeito

GGTACAnnnTGTTCT, onde n representa qualquer nucleotídeo ao qual o receptor

de glicocorticóide, na forma dimérica, se liga (Barnes, e cols., 1998).

Sabe-se, no entanto, que nem sempre a transcrição gênica é regulada

positivamente pelos glicocorticóides. A regulação negativa do gene da pró-

opiomelanocortina (POMC) nos corticotropos constitui parte importante da

regulação do eixo hipotálamo/hipófise/supra-renal pelo mecanismo de

retroalimentação negativa. O receptor de glicocorticóide parece inibir a transcrição,

interagindo diretamente com um GRE no promotor POMC (Webster e Cidlowski,

1999).

Os receptores de glicocorticóides podem interagir diretamente com outros

fatores de transcrição, como NF-κB e AP-1 que regulam a expressão de

componentes do sistema imune e esses efeitos negativos sobre a expressão

gênica parecem contribuir significativamente para os efeitos antiinflamatórios e

imunossupressores dos glicocorticóides. Essas interações proteína-proteína entre

o receptor de glicocorticóide e os fatores de transcrição reprimem a expressão de

genes que codificam enzimas como, por exemplo, a colagenase e a estromelisina.

Além disso, a inibição do NF-κB pelos corticosteróides pode controlar muitos

aspectos do processo inflamatório em doenças pulmonares obstrutivas crônicas

visto que o NF-κB induz os genes de citocinas pró-inflamatórias, de enzimas-

chave na síntese de mediadores, de moléculas de adesão envolvidas no

recrutamento de eosinófilos e de receptores inflamatórios (Xu, e cols., 1999;

McKay & Cidlowski, 1999).

Resumindo o que foi relatado anteriormente, a importância dos

corticosteróides em processos inflamatórios deve-se à estimulação da transcrição

de genes antiinflamatórios e à inibição da transcrição de genes inflamatórios. Os

glicocorticóides inibem a transcrição dos genes de várias citocinas de interesse

em afecções respiratórias, como IL-1β, TNF-α, GM-CSF, entre outras. Seguem,

abaixo, alguns exemplos:

i) Anexinas - Os glicocorticóides podem controlar a inflamação pela inibição

da enzima fosfolipase A2, responsável pela conversão de lipídios de

membrana em ácido araquidônico. Esta inibição, no entanto, é indireta e

deve-se à capacidade destes hormônios em induzir a síntese de um grupo

de proteínas denominadas anexinas, que modulam a atividade da

fosfolipase A2 (Flower & Rothwell, 1994).

ii) NF-κB - Os glicocorticóides induzem a expressão de IκB-α, uma proteína

inibitória presente em algumas células e responsável pelo controle das

ações do NF-κB (Auphan e cols, 1995; Scheinman, e cols., 1995).

iii) Interleucina-10 (IL-10) - Os glicocorticóides parecem aumentar a secreção

de IL-10 pelos macrófagos alveolares in vivo. A IL-10 participa da inibição

da transcrição de muitas citocinas pró-inflamatórias (Ho & Moore, 1994).

iv) Antagonista do receptor de IL-1 (IL-1rα) - Os corticosteróides controlam o

efeito da IL-1, uma citocina pró-inflamatória, aumentando a expressão de

um antagonista do receptor de IL-1 (IL-1rα) em células epiteliais in vivo e in

vitro. Trata-se de uma proteína de 17 kDa, que compete com a IL-1 pela

ligação ao receptor e interrompe sua atividade tanto in vivo quanto in vitro

(Levine, e cols., 1996).

v) Ciclooxigenase-2 (COX-2) - A primeira enzima envolvida na via de síntese

das prostaglandinas é a prostaglandina endoperóxido-sintetase ou

ciclooxigenase. Atualmente, duas formas de COX, denominadas COX-1 e

COX-2, são conhecidas. A COX-1 é uma isoforma constitutiva, encontrada

na maioria das células e tecidos normais, enquanto a COX-2 é induzida em

condições de inflamação por citocinas e mediadores da inflamação (Seibert

e cols., 1997). Apesar dessa distribuição preferencial, a COX-2 também é

constitutivamente expressa em algumas células renais e cerebrais. (Breder

e cols., 1995; Harris e cols., 1994).

Apesar da grande potência como antiinflamatórios, os glicocorticóides

podem produzir uma série de efeitos adversos, tais como: osteoporose,

hipertensão e hiperglicemia (Turesin e cols., 2003), o que tem motivado a busca

por novas estratégias no sentido de minimizar estas ações. Neste sentido

compostos com maior potência inflamatória foram sintetizados (beclometasona,

budesonida, flunisolida) e a busca por esteróides de ação local intensificada. No

caso particular de doenças pulmonares crônicas, esteróides inalatórios têm

apresentado uma eficácia satisfatória como verificado no caso da asma brônquica

(Barnes, 1995). Alternativamente, coloca-se como otimização terapêutica, a

síntese de compostos com formulações que modificam o tempo de liberação de

fármacos ou, ainda, de pró-drogas (Belvisi & Hele, 2003). Como forma inovadora,

foi descrita uma outra classe de compostos, que inclui os esteróides nitrosilados.

Estes agentes se caracterizam por ter uma cadeia aromática que faz a ligação do

derivado glicocorticódie convencional com a molécula doadora de óxido nítrico.

Como representantes desta classe, podem ser citados NCX-1015 (NO-

prednisolona), NCX- 1024 (NCX-1024nisolida) e NCX-1022 (NO-hidrocortisona)

(Turesin e col., 2003; Wallace e col., 2004; Hyun e col., 2004). Com todos os

compostos nitrosilados foi verificada uma ocorrência de liberação lenta de óxido

nítrico e uma atividade antiinflamatória mais potente quando comparados aos

fármacos parentes. Devido ao efeito sinérgico foi evidenciado um aumento de 10

vezes da atividade inibitória da NO-prednisolona em modelos de peritonite e artrite

murina (Perretti e col., 2003). De forma extremamente interessante, já foi

demonstrado que NO-predinisolona apresenta menor toxicidade (osteoporose) do

que o composto parente. Em conjunto, os dados obtidos até o presente momento

indicam que esta manobra química melhorou substancialmente a potência dos

glicocorticóides, que desta forma colocam-se como extremamente promissoras na

aplicação terapêutica futura.

2. Objetivos

2.1 Objetivos Gerais

� Desenvolver um modelo experimental de silicose utilizando instilação de

partículas de sílica por via nasal em camundongos;

� Estudar o efeito do tratamento com o glicocorticóide flunisolida e do

derivado nitrosilado NCX-1024, visando a busca por alternativas

terapêuticas eficazes no caso de doenças que envolvam fibrose

pulmonar na fase crônica.

2.2 Objetivos Específicos

� Realizar estudo comparativo do desenvolvimento da resposta silicótica,

utilizando-se três diferentes linhagens de camundongos que incluíram

as linhagens isogênicas Balb/c e C57Black 6 e a linhagem não

isogênica Swiss-Webster;

� Analisar a participação de mediadores inflamatórios incluindo citocinas,

quimiocinas e metaloproteinases de matriz na resposta silicótica

pulmonar;

� Analisar o padrão da resposta inflamatória do tecido pulmonar através

do estudo histopatológico;

� Avaliar a função pulmonar através da análise da mecânica respiratória;

� Avaliar o efeito do tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024 sobre

o desenvolvimento da silicose.

3. Material e Métodos

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos C57/BL6, Balb/c e Swiss Webster (machos,

peso corporal de 18 a 20g) provenientes do Centro de Criação de Animais

(CECAL) da Fundação Oswaldo Cruz e todos os procedimentos foram aprovados

pelo Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA) (Protocolo 0213-4). Os animais

foram mantidos sob condições de temperatura entre 25 e 28oC, ciclo de luz

definido em 12 h de claro e 12 h de escuro e livre acesso à ração e água.

3.2 Indução da Silicose e Tratamento

Os animais foram submetidos à anestesia por halotano (Tanohalo, Cristália,

São Paulo) sendo em seguida instilados por via intranasal com 10 mg sílica (SiO2),

(SiO2, S-5631 Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA, tamanho de partícula: 0,5

-10 µm) diluídos em 50 µl de salina estéril. Os animais do grupo controle

receberam igual volume de salina estéril intranasal. As análises foram realizadas

em diferentes tempos, variando entre 7, 14 e 28 dias (fig.1). Para a análise

comparativa entre diferentes linhagens de camundongos, foi fixado o tempo de 28

dias após a instilação da sílica.

Para o estudo acerca do efeito do tratamento com glicocorticóides, os

animais foram divididos em quatro grupos. Um grupo recebendo salina (SAL),

outro recebendo sílica (SIL) por via intranasal, conforme descrito acima, sendo

sacrificados 28 dias após a instilação. Mais dois grupos de animais que receberam

sílica intranasal foram tratados por via intranasal com flunisolida (FLU) ou NCX-

1024 (0.005 e 0.022 µmoles/sítio) (Fig.1) durante sete dias consecutivos, incluindo

do 21º até o 28º dia após a instilação de sílica (Fig.1).

Fig. 1. Esquema de indução da silicose e tratamento.

3.3 Lavado Broncoalveolar (BAL)

A lavagem broncoalveolar foi realizada utilizando-se uma cânula de

polietileno inserida na traquéia e um volume total de 1,5 mL de solução salina

tamponada (PBS) contendo EDTA 10mM foi instilado e aspirado em 2 lavagens

consecutivas de 0,75 mL. As amostras foram centrifugadas a 300 x g por 10 min e

o sobrenadante recolhido congelado para posterior quantificação de mediadores.

O “pellet” celular foi ressuspendido em 0,25 mL para a realização da avaliação

celular.

3.3.1 Contagem de Leucócitos

Os leucócitos totais foram analisados mediante diluição das amostras em

líquido de Türk (1:10) e contagem realizada em câmara de Neubauer em

microscópio de luz. Para a análise diferencial foram utilizados citoesfregaços

corados pelo método de May-Grunwald-Giemsa, com avaliação feita em objetiva

de imersão em óleo em microscópio de luz (BX51, Olympus).

Instilação de sílica Sacrifício Grupo 28 d

O d 7 d 14 d 21 d 28 d

Sacrifício Grupo 7 d Sacrifício Grupo 14 d

3.4 Análise Histopatológica

Após o sacrifício com alta dose de Tiopental (i.p.), foi realizada perfusão por

meio de uma cânula intracardíaca com solução de salina e heparina (1:10) para a

retirada do sangue. Posteriormente os animais receberam paraformaldeído

tamponado a 4% pela mesma via. Em ambos os procedimentos os frascos com as

soluções ficaram elevados a 110 cm de altura para que a pressão hidrostática

reproduzisse as condições fisiológicas da circulação sangüínea. Em seguida, os

pulmões foram fixados em formol tamponado a 10% (24 h), desidratados em

soluções crescentes de etanol, clarificados em xileno e incluídos em parafina.

Cortes histológicos de 5 µm de espessura foram realizados utilizando-se blocos de

parafina contendo fragmentos do tecido pulmonar, e submetidos às seguintes

colorações e imunohistoquímicas:

3.4.1 Hematoxilina-eosina (HE)

Para a análise dos aspectos gerais do tecido pulmonar, cortes histológicos

foram corados com hematoxilina-eosina, analisados em microscópio de luz (BX51,

Olympus) em diversos aumentos, e fotografados através de câmera digital (C-

7070, Olympus).

3.4.2 Picro-Sírius

Para a quantificação do colágeno utilizamos cortes histológicos corados

pela técnica do ácido fosfomolíbdico-Sirius Red (PMA-SR) e observados em

microscópio de luz (BX51, Olympus). Foram obtidas cinco imagens de cada

lâmina em câmera digital (C-7070, Olympus) contendo áreas com lesões

nodulares induzidas pela sílica, no aumento de 20X. As imagens foram

processadas e a quantidade de colágeno foi quantificada através do programa de

análise de imagens Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics, USA).

3.4.3 Giemsa de Lennert

Para a avaliação da presença de neutrófilos no tecido pulmonar utilizamos a

coloração por Giemsa de Lennert com diferenciação em ácido acético a 0,5%.

Após a coloração, foram realizadas fotomicrografias das lâminas para posterior

análise.

3.4.4 Imunohistoquímica

Para evidenciação das metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9), foram

utilizados anticorpos MMP-2 (SC6838, Santa Cruz, CA, USA) e MMP-9 murinas

(SC6841, Santa Cruz, CA, USA). Após desparafinização, os cortes foram

hidratados com TBS pH 7,6, bloqueados com H2O2 a 3% em metanol por dez

minutos, posteriormente as lâminas foram lavadas três vezes com TBS e

bloqueadas com Tris-HCL + BSA 2% por 20 minutos. Os anticorpos primários anti-

MMP-2 e MMP-9 foram diluídos com Tris-HCL + BSA 1% na proporção de 1:100 e

1:80, respectivamente. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário por

12 horas. Após a incubação, as lâminas foram lavadas por duas vezes com TBS.

O anticorpo secundário, anti-IgG de cabra (811620, Zymed, USA), foi diluído em

Tris-HCL e feita incubação por 30 minutos. A revelação foi feita com AEC por

aproximadamente 10 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas em água

destilada, contra-coradas com hematoxilina de Mayer e montadas em meio

aquoso.

3.4.5 Histoquímica para Marcação de Macrófagos Ativ ados

Para evidenciação dos macrófagos alveolares foi utilizada lectina BSL 1

biotinilada (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Após

desparafinização, os cortes foram hidratados procedendo-se à inibição da

peroxidase endógena (H2O2 a 3% em metanol) e bloqueio de cargas existentes no

tecido (bórax a 3%) e das ligações inespecíficas dos reagentes através da

incubação com tampão salina fosfato (PBS) contendo albumina bovina (BSA) 3%.

A lectina biotinilada foi incubada por 16 horas a temperatura de 4oC, em câmara

úmida (diluição de 1:250 em PBS-BSA 1%) e revelada pela Streptavidina-

Peroxidase utilizando a diaminobenzidina como substrato cromógeno – FAST DAB

(Sigma, St Louis, MO, USA) segundo as instruções do fabricante. As lâminas

foram contracoradas pela hematoxilina.

3.5 Quantificação de Quimiocinas e Citocinas por EL ISA

Foram utilizadas placas de 96 poços, às quais foram adicionados

50mL/poço do anticorpo capturador e diluído no tampão composto de NaCl 1,5 M

,H3BO4 0,5 M e NaOH 1N, sendo mantido período de incubação de 12 horas a

40Cº. A seguir, os poços foram lavados 3 vezes (200mL/poço) com tampão 1,

composto por salina tamponada PBS/0,005% de Tween 20. Após esta etapa,

para bloqueio de sítios inespecíficos, a placa foi preenchida (200µL/poço) com

solução salina tamponada PBS/soro albumina bovina (BSA, 2%) por 1 hora à

370Cº. Em seguida os poços foram lavados 3 vezes com tampão 1 (200µL/poço).

As amostras e os padrões foram diluídos em tampão 1 contendo 2%de soro fetal

bovino (SBF) (tampão2) e adicionados aos poços (50 µL/poço). Após o período de

incubação (1 hora a 370 Cº), procedeu-se nova seqüência de 3 lavagens (200

mL/poço) com tampão 1. A seguir foi acrescentado (50 µL/poço) o anticorpo

detector biotinilado ( 50mg/mL), sendo mantida incubação por 45 minutos a 370Cº.

Os poços foram lavados com o tampão 1 (200µL/poço), seguindo-se a etapa de

incubação por 30 minutos a 37 Cº (100 µL/poço) com a mistura neutravidina-

“horseradish peroxidase” (HRP) diluído no tampão 2. Após a última lavagem com

tampão 1 (200µL/poço), foi feita a adição do substrato orfofenilenodiamina

dicloreto (OPD) (100 µL/poço), para o desenvolvimento da reação colorimétrica

(aproximadamente 3 a 5 minutos), que foi interrompida após acréscimo de

50mL/poço de H2SO4 (3mM). A análise espectrofotométrica foi realizada em leitora

de placa no comprimento de onda de 450 nm.

A quantificação dos mediadores inflamatórios incluiu as citocinas TNF-α,

INF-γ, TGF-β e as quimiocinas KC e MIP-2α. Foram utilizados kits comerciais

(R&D System, Estados Unidos), sendo seguidas as recomendações do

frabricante. As amostras analisadas foram provenientes do lavado broncoalveolar

(item 3.3) e do tecido pulmonar. No caso do tecido, foi realizada homogeneização

em 1 mL de PBS contendo “complete” (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suiça),

que é um coquetel de inibidores de proteases, seguida de centrifugação a 3000

rpm por 10 minutos sendo o sobrenadante recuperado para posterior quantificação

de mediadores.

3.6 Mecânica Respiratória

Para os testes de mecânica respiratória, foram utilizados 5 animais de cada

grupo. Os mesmos foram sedados com diazepam (5 mg/Kg, i.p.) e,

posteriormente, anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/Kg, i.p.) e

traqueotomizados para introdução de um Jelco 20. Os animais foram

posicionados em decúbito dorsal para a retirada das paredes torácica e

abdominal, paralisados com trietiliodeto de galamina (2 mg/Kg, i.v) e, em seguida,

ventilados mecanicamente com fluxo e volume corrente constantes.

Um pneumotacógrafo foi conectado a uma cânula traqueal para medir o

fluxo aéreo (V') e, por integração do sinal de fluxo, obtivemos o volume gasoso

mobilizado (V) (Mortola, 1983). A pressão traqueal (Ptr) foi medida através de uma

saída lateral no circuito por meio de um transdutor diferencial de pressão.

A mecânica respiratória foi analisada pelo método de oclusão ao final da

inspiração, que se baseia na insuflação do sistema respiratório, com fluxo aéreo

constante, seguida de um rápido fechamento da via aérea ao final da inspiração.

Em seguida, foi observada uma queda rápida inicial em Ptr (∆P1, L) até um ponto

de inflexão da curva (Pi, L), seguida de uma queda lenta (∆P2, L) até ser atingido

um platô que representa a pressão elástica do sistema respiratório (Pel, L). ∆P1, L

e ∆P2, L correspondem respectivamente aos componentes viscoso e viscoelástico

do sistema respiratório. A soma de ∆P1, L e ∆P2, L é igual a ∆PTOT, L. As

elastâncias estática (Est, L) e dinâmica (Edyn, L) do sistema foram calculadas pela

divisão de Pel, L e Pi, L respectivamente, pelo volume corrente (VT ) (Bates, 1988).

3.7 Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como média ± erro padrão da

média (EPM) e analisados estatisticamente através de análise de variância

(ANOVA), seguida de teste de comparação múltipla de Newman-Keuls-Student.

Para ambos os testes, os valores de p < 0.05 foram considerados estatisticamente

significativos.

4. Resultados

4.1 Análise Comparativa da Resposta Inflamatória Pu lmonar Induzida

pela Instilação de Sílica em Camundongos

Objetivando estabelecer um modelo de silicose não invasiva, inicialmente

fizemos uma avaliação comparativa da resposta induzida por sílica em três

diferentes linhagens de camundongos. Foram escolhidas duas linhagens

isogênicas (Balb/c e C57 Bl6) e uma não isogênica (Swiss-Webster). Para tal

análise foi escolhido o tempo de 28 dias, por ser este correspondente à fase

crônica da doença e, assim, a fase mais crítica do processo silicótico. Inicialmente

avaliamos o conteúdo celular do lavado broncoalveolar dos animais silicóticos em

comparação com os controles (instilados com salina), e constatamos haver um

aumento no número de leucócitos presentes no lavado broncoalveolar (BAL) dos

animais em teste, com claro predomínio de macrófagos e um significativo infiltrado

de polimorfonucleares neutrófilos (Fig.3). Verificamos que todas as três linhagens

analisadas apresentaram resposta granulomatosa de intensidade similar,

conforme atestado pela coloração com hematoxilina e eosina (Fig. 4). Com base

nestes resultados, optamos por utilizar a linhagem Swiss-Webster nos ensaios

subseqüentes, uma vez que por ser não isogênica pode representar melhor a

variabilidade de resposta verificada na doença em humanos.

4.2 Cinética da Resposta Inflamatória Pulmonar Indu zida pela

Instilação de Sílica em Camundongos Swiss-Webster

4.2.1 Avaliação do Conteúdo Leucocitário no Lavado

Broncolaveolar

De nossa análise constaram os tempos de 7, 14 e 28 dias por

representarem os estágios agudo, intermediário e crônico da disfunção silicótica.

Vimos que no lavado broncoalveolar houve aumento no número de leucócitos

totais, máximo no tempo de 7 dias e, com progressivo decréscimo nos tempos de

14 e 28 dias. A análise diferencial revelou predominância de macrófagos, porém

com significativo aumento no número de neutrófilos. Estes últimos apresentaram

níveis elevados constantes ao longo do período de análise (Fig. 5).

4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas no Teci do

Pulmonar

Verificamos que os pulmões dos animais controles exibiram um parênquima

pulmonar preservado em todos os tempos analisados, com espaços alveolares

livres de células inflamatórias e estruturas bronquiolares revestidas por epitélio

cuboidal a cilíndrico, pseudo-estratificado (fig 6A). Como ilustrado nas figuras 6 e

7, foi observado que, em 7 dias, os animais silicóticos exibiram parênquima

difusamente alterado pela presença de células inflamatórias e grandes áreas de

colapso alveolar (fig. 6B). Observamos que esse infiltrado inflamatório mostrou-se

constituído pela presença marcante de polimorfonucleares neutrófilos (fig. 7A). No

grupo de animais silicóticos de 14 dias, observamos a existência de estruturas

nodulares (granulomas), por vezes confluentes (fig. 6C), constituídas por células

inflamatórias em meio a partículas de sílica (fig. 7B). No tempo mais tardio, de 28

dias, notamos que os granulomas mostraram-se melhor delimitados, com

celularidade mantida, incluindo macrófagos e neurófilos (fig. 6D). Os septos

alveolares apresentaram maior quantidade de células mononucleares, o que

determinou a identificação de um espessamento septal evidente (fig. 7C).

Utilizando-se a coloração com Picrus sirius para visualização de fibras

colágenas, foi verificado através de microscopia que havia uma pequena

quantidade de fibras colágenas no parênquima pulmonar nos animais controles,

em todos os tempos analisados (Fig. 8A). Na condição dos animais silicóticos, foi

detectado um aumento no conteúdo de fibras colágenas de forma tempo

dependente, com máximo sendo verificado em 28 dias, período correspondente à

fase crônica da resposta silicótica (Fig. 8B, 8C e 8D).

4.2.3 Avaliação do Infiltrado Celular ao Nível do P arênquima

Pulmonar

Os macrófagos existentes nos pulmões dos animais controles mostraram-

se não reativos ou fracamente reativos à BSL-1 (fig. 9B). No caso dos animais

silicóticos foi observado que os macrófagos intersticiais e alveolares apresentaram

grande positividade na membrana celular, o que favoreceu a identificação da

população ativada nos tempos de 7 (Fig. 9C), 14 (Fig. 9D) e 28 (Fig. 9E).

Utilizando a coloração pelo Giemsa de Lennert observamos que não houve

marcação para polimorfonucleares neutrófilos nos animais controles (Fig. 10A).

Nas mesmas condições experimentais, entretanto, foi notada a presença de

neutrófilos com aspecto apoptótico no tecido pulmonar dos animais silicóticos nos

três tempos analisados (Fig. 10B, 10C e 10D).

4.2.4 Identificação de Mediadores Inflamatórios Ger ados Durante a

Resposta Silicótica em Camundongos

Objetivando identificar mediadores inflamatórios participantes na resposta

silicótica, partimos para analisar algumas quimiocinas e citocinas relevantes para

o processo. Foram avaliados o lavado broncoalveolar e tecido pulmonar.

Inicialmente, verificamos haver no lavado broncoalveolar um aumento no conteúdo

de KC, uma quimiocina C-X-C correspondente à IL-8 humana (Fig. 11A).

Quantidades equivalentes de KC foram detectadas nos vários tempos de análise.

No que se refere aos medidores TNF-α e TGF-β, observamos que houve um

aumento de forma tempo dependente nos níveis de ambos os fatores no BAL,

com máximo sendo notado no tempo de 28 dias após a instilação da sílica (Fig.

11B e 11C, respectivamente).

Quando da análise do tecido pulmonar, observamos níveis aumentados de

KC (Fig. 12A) durantes os três tempos de análise. Para outros mediadores, foi

evidenciado um aumento progressivo nos níveis de quimiocinas e citocinas em

animais silicóticos, com máximo sendo notado no tempo de 28 dias. Foram

avaliadas MIP-2 (Fig. 12B), IFN-γ (Fig. 12C), TNF-α (Fig.12D) e TGF-β (Fig. 12E).

4.2.5 Análise da Presença de Metaloproteinase 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) no Tecido Pulmonar

Para a avaliação das MMP-2 e MMP-9 foi utilizada a técnica de

imunohistoquímica, o que permitiu a visualização de que nos pulmões dos animais

controles foi detectada uma fraca marcação para MMP-2 e 9 (Fig. 13B e 14B). Já

os animais silicóticos mostraram uma forte marcação para MMP-2 e MMP-9 nos

tempos de 7 a 28 dias (Fig. 13 e 14).

4.2.6 Avaliação da Mecânica Respiratória em Camundo ngos Silicóticos

Através da análise da mecânica respiratória observamos um aumento

significativo das variações das pressões resistivas. Em ∆P1, L (relacionado a vias

aéreas mais centrais) vimos um aumento dos animais sílica em relação ao grupo

salina (Fig. 15A). Já em ∆P2, L (relacionado com vias aéreas mais periféricas),

observamos um aumento apenas no grupo 28 dias (Fig. 15B) em relação aos

animais salina e aos silicóticos. Esse aumento parece estar relacionado à fibrose

pulmonar observada nos animais após 28 dias da instilação da sílica.

Observamos um aumento significativo nos animais silicóticos em relação a

salina em ∆Ptot (soma das duas pressões, ∆Ptot L= ∆P1, L + ∆P2, L) (Fig. 15C).

4.3 Efeito do Tratamento Curativo com Flunisolida e NCX-1024 Sobre a

Resposta Silicótica em Camundongos

4.3.1 Avaliação da População Leucocitária no Lavado

Broncoalveolar

Com vistas a verificar o potencial efeito curativo da flunisolida e NCX-1024,

foi utilizado o tempo de 28 dias, por se tratar da fase crônica e, portanto, mais

crítica e, também, por corresponder à situação verificada no caso de humanos.

Conforme ilustrado na figura 16, verificamos que o tratamento com flunisolida e

NCX-1024 não modificou o número de leucócitos totais e células mononucleares

(Fig. 16), enquanto que polimorfonucleares neutrófilos apresentaram-se em níveis

inferiores àqueles notados no caso dos animais silicóticos.

4.3.2 Avaliação das Alterações Morfológicas a o Nível do Tecido

Pulmonar

Verificamos que os pulmões dos animais controles exibiram um parênquima

pulmonar preservado e com espaços alveolares livres de células inflamatórias

(Fig. 17A). O tratamento dos animais silicóticos com flunisolida (Fig. 17C) e NCX-

1024 (Fig. 17D) determinou uma diminuição bastante significativa no infiltrado

inflamatório tecidual, assim como no número e tamanho dos granulomas, quando

comparados aos animais silicóticos não tratados (Fig. 17B).

Através da coloração com Picrus sirius, foi possível identificar a presença

de uma pequena quantidade de fibras colágenas no parênquima pulmonar nos

animais controles (Fig. 18A). Nos animais silicóticos, foi visto um aumento

significativo no depósito de fibras colágenas (Fig. 18B). Entretanto, nos cortes

histológicos dos animais tratados com flunisolida e NCX-1024 pode ser notada

uma diminuição significativa na quantidade de colágeno no parênquima pulmonar

em comparação ao conteúdo detectado no pulmão dos animais estimulados com

sílica (Fig. 18C e 18D).

Novamente os macrófagos existentes nos pulmões dos animais controles

apresentaram fraca reatividade a lectina BSL-1 (Fig. 19B). Nos animais do

grupo sílica observamos forte marcação na membrana célular (Fig. 19C).

Entretanto, na condição do tratamento com flunisolida e NCX-1024 vimos uma

fraca reatividade a BSL-1 nos animais tratados com flunisolida ou NCX-1024

(Fig. 19D e 19E), refletindo a inibição verificada no caso dos granulomas.

Considerando-se a importância das metaloproteinases para o processo

fibrótico, passamos à análise da presença das MMP-2 e MMP-9 no tecido

pulmonar mediante técnica de imunohistoquímica. Vimos uma forte marcação

nas amostras teciduais dos animais silicóticos (Fig. 20C e 21C), enquanto que

nos tecido dos animais submetidos ao tratamento com flunisolida e NCX-1024

apresentaram uma diminuição importante da marcação para as MMPs (Fig. 20D

e 20E; 21D e 21E).

4.3.3 Avaliação do TNF- αααα no Lavado Broncoalveolar

Ao quantificarmos os níveis de TNF-α no BAL observamos um aumento

significativo na condição dos animais silicóticos em comparação com os controles,

enquanto que o tratamento com flunisolida e NCX-1024 promoveu significativa

redução no conteúdo desta citocina (Fig. 22).

4.3.4 Avaliação da Mecânica Respiratória

Ao analisarmos a função respiratória dos animais tratados curativamente

com flunisolida ou NCX-1024 observamos uma redução significativa dos

parâmetros de ∆P1, L no grupo flunisolida em relação ao grupo sílica (Fig. 23A).

Ao analisar o ∆P2, L observamos uma diminuição significativa desse parâmetro

nos dois grupos tratados em relação aos animais silicóticos (Fig. 23B). Ao analisar

a soma das variações resistivas (∆Ptot L), podemos ver uma diminuição

significativa no grupo flunisolida e uma tendência a diminuição no grupo NCX-

1024 se comparados ao grupo sílica (Fig. 23C). A diminuição desses parâmetros,

principalmente ∆P2, L, pode estar relacionado com a diminuição do infiltrado

inflamatório, a menor formação de nódulos silicóticos no parênquima pulmonar e a

diminuição do depósito de fibras colágenas.

NCX-1024

OF

OO

HO

O

O

O

O2 NO

Flunisolida

OF

OO

HO

O

O

O

Figura 2. Estrutura química dos compostos flunisolida e NCX-1024.

Figura 3. Análise do conteúdo leucocitário do lavado broncoalveolar (BAL) de camundongos das cepas Swiss-Webster, Balb/c e C57 Bl6, 28 dias após a instilação nasal de sílica (10 mg). A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C- Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina.

Salina

Sílica

0

1

2

3

4

5

6 *

**

Leucócitos Totais (x10

-5)/BAL

0

1

2

3

4

5

6*

* *

Mononucleares (x10

-5)/BAL

0.00

0.25

0.50

0.75

** *

Swiss Webster Balb/c C57 Bl6

Neutrófilos (x10

- 5)/BAL

A

B

C

Figura 4. Fotomicrografias (aumento de 200X) de cortes histológicos de pulmões de camundongos Swiss-Webster (A), Balb/C (B) e C57/Bl6 (C), 28 dias após a instilação nasal de sílica (10 mg). Pode ser observado padrão de formação de granulomas e infiltrado celular inflamatório semelhante. Coloração por Hematoxilina e Eosina.

A

C

A

B

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 *#

*#

*#

Leucócitos Totais (x10

-5)/BAL

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 *#

*#

*#

Mononucleares (x10

-5)/BAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

* * *

Neutrófilos (x10

- 5)/BAL

7 d

14 28

Salina

Sílica

Figura 5. Cinética do infiltrado leucocitário do lavado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. Leucócitos totais; B. Células mononucleares e C. Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

C

B

A

Figura 6. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via nasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 7, intenso infiltrado inflamatório; C. Grupo SIL 14, formação de granulomas difusos no parênquima pulmonar; e D. Grupo SIL 28, granulomas bem formados, porém com uma diminuição do infiltrado celular inflamatório. Coloração por Hematoxilina e Eosina.

B

C D

A

Figura 7. Fotomicrografias (aumento 1000X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo SIL 7, mostrando a presença de intenso infiltrado inflamatório formado por uma grande quantidade de células polimorfonucleares (setas pretas); B. Grupo SIL 14, presença de partículas de sílica em meio às células (setas brancas); C. Grupo SIL 28, ocorrência de edema septal incluindo presença de células inflamatórias. Coloração por Hematoxilina e Eosina.

A

B C

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

SAL 7 SIL 7 SAL 14 SIL 14 SAL 28 SIL 28

*#

*#

*#

Fib

ras

Col

ágen

as/

µµ µµm2

B

C D

A

Figura 8. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes à cinética de deposição de fibras colágenas no pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), parênquima pulmonar normal e com poucas fibras colágenas; B. Grupo SIL 7, formação de pequenos granulomas, jácom intenso depósito de colágeno; C. Grupo SIL 14, estruturas granulomatosas bem formadas e circundadas por fibras colágenas; e D. Grupo SIL 28, fibras dispostas de maneira difusa no parênquima pulmonar. E. Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de análise de imagem (Olympus, Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica em tempos respectivamente anteriores. Coloração comPicro Sírius.

E

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

SAL 7 SIL 7 SAL 14 SIL 14 SAL 28 SIL 28

*#

*#

*#

Fib

ras

Col

ágen

as/

µµ µµm2

B

C D

A

Figura 8. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes à cinética de deposição de fibras colágenas no pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), parênquima pulmonar normal e com poucas fibras colágenas; B. Grupo SIL 7, formação de pequenos granulomas, jácom intenso depósito de colágeno; C. Grupo SIL 14, estruturas granulomatosas bem formadas e circundadas por fibras colágenas; e D. Grupo SIL 28, fibras dispostas de maneira difusa no parênquima pulmonar. E. Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de análise de imagem (Olympus, Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica em tempos respectivamente anteriores. Coloração comPicro Sírius.

E

Figura 9. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). Foi utilizada marcação com a lectina BSL-1. A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), apresentando uma fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para macrófagos, não sendo verificada diferença significativa entre os grupos de animais silicóticos em nenhum dos tempos analisados. Setas brancas indicam macrófagos ativados.

B C

D E

AA

Figura 9. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). Foi utilizada marcação com a lectina BSL-1. A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), apresentando uma fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para macrófagos, não sendo verificada diferença significativa entre os grupos de animais silicóticos em nenhum dos tempos analisados. Setas brancas indicam macrófagos ativados.

B C

D E

AA

Figura 10. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10mg). A. Grupo salina (SAL) apresentando discreta presença de neutrófilos; B. Grupo SIL 7; C. Grupo SIL 14; e D. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para neutrófilos (setas brancas), com infiltrado mais acentuado em tempos mais agudos. Coloração por Giemsa de Lennert.

A B

C D

0

100

200

300

400

TGF

β(pg)/BAL

Salina

Sílica

7 d 14 d 28 dSAL

0

100

200KC (pg)/BAL * *

*

* #

Figura 11. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no lavado broncoalveolar(BAL) de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (10 mg). Quimiocina KC em A e citocinas TNFα e TGFß em B e C, respectivamente. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

0

100

200

TNF

α(pg)/BAL

**

*

A

B

C

ND0

100

200

300

400

TGF

β(pg)/BAL

Salina

Sílica

Salina

Sílica

7 d 14 d 28 dSAL

0

100

200KC (pg)/BAL * *

*

0

100

200KC (pg)/BAL * *

*

* #

Figura 11. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no lavado broncoalveolar(BAL) de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (10 mg). Quimiocina KC em A e citocinas TNFα e TGFß em B e C, respectivamente. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

0

100

200

TNF

α(pg)/BAL

**

*

0

100

200

TNF

α(pg)/BAL

**

*

A

B

C

ND

Salina

Figura 12. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. KC; B. MIP-2; C. IFNγ; D. TNFα e E. TGFß. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

0.000

0.005

0.010

0.015TNF

α(ng)/m

g proteína

7 d 14 d 28 dSAL

* #

* #

Sílica

0.0

0.1

0.2

TGF

β(ng)/m

g poteína

7 d 14 d 28 dSAL

* *

0.0

0.1

0.2

KC (ng)/mg proteína * #

**

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

MIP-2 (ng)/mg proteína

** *

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

IFN

γ(ng)/m

g proteína

*

* #

7 d 14 d 28 dSAL

A B

C D

E

Salina

Figura 12. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. KC; B. MIP-2; C. IFNγ; D. TNFα e E. TGFß. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

0.000

0.005

0.010

0.015TNF

α(ng)/m

g proteína

7 d 14 d 28 dSAL

* #

* #

Sílica

0.0

0.1

0.2

TGF

β(ng)/m

g poteína

7 d 14 d 28 dSAL

* *

0.0

0.1

0.2


**

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4


** *

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

IFN

γ(ng)/m

g proteína

*

* #

7 d 14 d 28 dSAL

0.000

0.005

0.010

0.015TNF

α(ng)/m

g proteína

7 d 14 d 28 dSAL

* #

* #

0.000

0.005

0.010

0.015TNF

α(ng)/m

g proteína

7 d 14 d 28 dSAL

* #

* #

Sílica

0.0

0.1

0.2

TGF

β(ng)/m

g poteína

7 d 14 d 28 dSAL

* *

0.0

0.1

0.2

TGF

β(ng)/m

g poteína

7 d 14 d 28 dSAL

* *

0.0

0.1

0.2


**

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2


**

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4


** *

7 d 14 d 28 dSAL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

IFN

γ(ng)/m

g proteína

*

* #

7 d 14 d 28 dSAL0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

IFN

γ(ng)/m

g proteína

*

* #

7 d 14 d 28 dSAL

A B

C D

E

Figura 13. Fotomicrografias (aumento de 20X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. Controle negativo. B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram forte marcação para MMP-2.

B

E

C

D

A

Figura 13. Fotomicrografias (aumento de 20X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. Controle negativo. B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram forte marcação para MMP-2.

B

E

C

D

A

Figura 14. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). . A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram marcação intensa para MMP-9.

B

D

C

D E

A

Figura 14. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). . A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram marcação intensa para MMP-9.

B

D

C

D E

A

0

1

2

3

4

(cm

H2O

/ml)

0

1

2

(cm

H2O

/ml)

0

1

2

3

4

5

(cm

H2O

/ml)

∆P1

∆P2

∆Pto

t

Salina

Sílica

7 d 14 d 28 d

Figura 15. Avaliação temporal da mecânica respiratória de camundongos Swiss-Webster estimulados através de instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. ∆P1; B. ∆ P2 e C. ∆ Ptot. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

*

* #

*

*

*

*

*

A

B

C

0

1

2

3

4

(cm

H2O

/ml)

0

1

2

(cm

H2O

/ml)

0

1

2

3

4

5

(cm

H2O

/ml)

∆P1

∆P2

∆Pto

t

Salina

Sílica

7 d 14 d 28 d

Figura 15. Avaliação temporal da mecânica respiratória de camundongos Swiss-Webster estimulados através de instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. ∆P1; B. ∆ P2 e C. ∆ Ptot. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

*

* #

*

*

*

*

*

A

B

C

0

1

2

3

*Le

ucóc

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Tot

ais

(x10

-5)/

BA

L

0

1

2

3

*

Mon

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10-5

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0.0

0.1

0.2

0.3 *

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*#

Neu

tróf

ilos

(x10

-5)/

BA

L

Estímulo:

Tratamento:

SAL SIL SIL SIL

SAL SAL FLU NCX-1024

Figura 16. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre o infiltrado leucocitário no labado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C-Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

A

B

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-5)/

BA

L

Estímulo:

Tratamento:

SAL SIL SIL SIL


Figura 16. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre o infiltrado leucocitário no labado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C-Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.

A

B

C

B

C D

A

Figura 17. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, formação de granulomas difusos; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição do infiltrado inflamatório e a ausência de granulomas no parênquima pulmonar. Coloração por Hematoxilina e Eosina.

B

C D

A

Figura 17. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, formação de granulomas difusos; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição do infiltrado inflamatório e a ausência de granulomas no parênquima pulmonar. Coloração por Hematoxilina e Eosina.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

SAL 28 SIL 28 FLU NO-FLU

Fib

ras

Col

ágen

as/

µµ µµm2

*

+ +

Figura 18. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes deposição de fibras colágenas em pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, grande depósito de colágeno; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição da quantidade de colágeno no parênquima pulmonar. E.Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de Analisador de Imagem (Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica. Coloração por Picrus sírius.

E

B

C D

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0

200

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1400

1600

SAL 28 SIL 28 FLU NO-FLU

Fib

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µµ µµm2

*

+ +

Figura 18. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes deposição de fibras colágenas em pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, grande depósito de colágeno; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição da quantidade de colágeno no parênquima pulmonar. E.Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de Analisador de Imagem (Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica. Coloração por Picrus sírius.

E

B

C D

A

B C

D E

Figura 19. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo SAL, mostrando fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 28, podem ser observados macrófagos alveolares ativados e fortemente marcados pela BSL-1; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade de marcação para macrófagos alveolares e intersticiais.

A

B C

D E

Figura 19. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo SAL, mostrando fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 28, podem ser observados macrófagos alveolares ativados e fortemente marcados pela BSL-1; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade de marcação para macrófagos alveolares e intersticiais.

A

Figura 20. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negartivo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 28 apresentou forte marcação para MMP-2; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-2.

A B

C D

A

Figura 20. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negartivo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 28 apresentou forte marcação para MMP-2; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-2.

A B

C D

A

Figura 21. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL,10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024nisolida (NCX-1024) (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-9; C. Grupo SIL 28 apresentou marcação acentuada para MMP-9; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-9.

A B

C D

A

Figura 21. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL,10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024nisolida (NCX-1024) (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-9; C. Grupo SIL 28 apresentou marcação acentuada para MMP-9; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-9.

A B

C D

A

0.00

0.05

0.10

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0.20

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g pr

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SAL SIL SIL SIL

*

+

Figura 22. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre a produção de TNFα no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. *p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; +p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.


Estímulo:

Tratamento:

0.00

0.05

0.10

0.15

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0.25

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g pr

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*

+

Figura 22. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre a produção de TNFα no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. *p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; +p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.


Estímulo:

Tratamento:

0

1

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(cm

H2O

/ml)

0

1

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/ml)

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t

SAL SIL SIL SIL


Estímulo:

Tratamento:

*

*

*

*+

+ +

++

Figura 23. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX- (0.022 µmol/Kg) sobre alteração na mecânica pulmonar verificada em camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica que não foram tratados.

A

B

C *

*

*+

0

1

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(cm

H2O

/ml)

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∆P1

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SAL SIL SIL SIL


Estímulo:

Tratamento:

*

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+ +

++

Figura 23. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX- (0.022 µmol/Kg) sobre alteração na mecânica pulmonar verificada em camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica que não foram tratados.

A

B

C *

*

*+

5. Discussão

A silicose é causada pela inalação de poeira contendo partículas de sílica,

sendo o quartzo a forma mais comum de sílica cristalina. O desenvolvimento e a

gravidade da silicose dependem da quantidade inalada, da intensidade da

inalação e da duração da exposição à sílica (Weil,1994). Em humanos a silicose

pulmonar é caracterizada por nódulos fibróticos causados por uma inflamação

persistente que leva à proliferação de fibroblastos e acúmulo de colágeno

(Hunninghake e cols., 1984), principalmente no ápice do pulmão (Fujimura, 2000).

A silicose representa um sério problema de saúde pública, uma vez que,

apesar de ser potencialmente evitável, apresenta altos índices de incidência e

prevalência, especialmente nos países menos desenvolvidos (Carneiro, 2001). O

diagnóstico é baseado na radiografia de tórax, em conjunto com histórias clínica e

ocupacional coerentes. A Organização Internacional do Trabalho padronizou a

técnica adequada para obtenção de radiografias de boa qualidade, assim como a

codificação das alterações radiológicas das pneumoconioses, de maneira

reprodutível. Porém, os casos iniciais de silicose, como as demais doenças

pulmonares intersticiais crônicas em fases precoces são de difícil avaliação, com

alterações radiológicas discretas, confundindo-se com estruturas normais do

parênquima pulmonar. Os diagnósticos nessa situação são os que causam maior

desacordo, mesmo entre leitores radiológicos mais experientes. Nesse estágio,

pequenos desvios da técnica radiológica ideal podem ocasionar distorções no

diagnóstico e a situação torna-se mais problemática se o leitor for inexperiente

(Carneiro, 2001).

Observações realizadas em humanos demonstraram haver, para uma

exposição comparável, diferenças interindividuais com respeito ao

desenvolvimento das lesões silicóticas (Katsnelson e cols., 1986; Honda e cols.,

1993). Existem algumas evidências, ainda não conclusivas, de que fatores

genéticos possam estar relacionados à susceptibilidade individual.

Os modelos experimentais de silicose procuram reproduzir a seqüência de

eventos da silicose humana e têm sido explorados ao longo dos anos com vistas a

permitir a compreensão acerca dos mecanismos celulares e moleculares

determinantes desta doença. Porém, existem poucos trabalhos publicados

voltados para descrição de um modelo experimental que reproduza de forma

fidedigna a fisiopatologia da silicose pulmonar.

Basicamente, foram descritas duas formas de se induzir silicose em

animais: por meio de inalação das partículas em aerosol, utilizado por Davis e

cols. (1998), na qual os animais eram mantidos em uma câmara por 5 horas

durante 12 dias consecutivos, recebendo 70 mg/m3 de sílica, e a análise sendo

analisados de 16 a 20 semanas após o final da instilação. Apesar de melhor

reproduzir o que ocorre em humanos, este modelo demanda um tempo longo de

estabelecimento, além de requerer uma infra-estrutura especial. A outra forma de

indução, bastante utilizada, envolve a instilação intratraqueal das partículas de

sílica. Nesta condição, é realizada uma pequena cirurgia na qual há exposição da

traquéia do animal, sendo a sílica introduzida através de uma seringa. A dose

normalmente utilizada é 20 mg de sílica diluídos em 50µl de salina estéril (Borges

e cols., 2001; Faffe e cols., 2001).

Entretanto, em um trabalho realizado no Laboratório de Patologia Celular da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, foi demonstrado que não havia diferença

entre a dose de 10 mg e de 20 mg de sílica intratraqueal. Apesar da indução

rápida e em dose única no caso da silicose induzida mediante instilação

intratraqueal, existem algumas críticas quanto a ser um processo invasivo o que

poderia influenciar no desenvolvimento do processo inflamatório, além da forma

de indução da doença que foge completamente a condição da silicose em

humanos.

No presente trabalho procuramos desenvolver um modelo que reproduzisse

de forma mais precisa os eventos associados à ocorrência na doença humana.

Com a indução da silicose por via intranasal, conseguimos superar os problemas

encontrados nos modelos de aerolisação e no de instilação intratraqueal. A

utilização de 10 mg de sílica diluídos em 50µl de salina se mostrou eficaz em

produzir uma lesão extensa, com comprometimento principalmente do terço médio

e ápice dos pulmões dos camundongos.

Optamos pela utilização da linhagem de camundongo Swiss-Webster por

serem camundongos não isogênicos e assim representarem melhor a

variabilidade na resposta inflamatória encontrada em humanos. Não existem na

literatura trabalhos mostrando a utilização do camundongo Swiss-Webster no

desenvolvimento do modelo de silicose pulmonar. Por conta disso, optamos por

comparar nosso animal com duas outras linhagens isogênicas de camundongos

(Balb/c e C57 Bl6) (Borges e col, 2001; Faffe e cols., 2001), sendo o camundongo

Balb/c o mais comumente utilizado nesse modelo de doença. Nossos resultados

mostraram que não havia diferença significativa entre linhagens de animais

analisadas no que se refere ao perfil de celularidade total e diferencial no lavado

broncoalveolar e nas alterações verificadas ao nível do tecido pulmonar quando da

coloração por hematoxilina e eosina. A partir desses resultados vimos que

poderíamos utilizar a linhagem Swiss-Webster uma vez que foi capaz de

reproduzir a resposta verificada em outras linhagens utilizadas por outros grupos.

Embora a silicose em humanos se desenvolva ao longo de anos de

inalação, os estudos em animais mostraram que mesmo uma única exposição de

sílica pode levar a mudanças funcionais e morfológicas similares nos pulmões, o

que claramente valida a utilização destes modelos (Kuncová,1971; Lugano, 1982;

Mariani, 1995; Schapira, 1998). Apesar de ser uma doença de caráter crônico,

optamos por estabelecer tempos de análise que incluíram de 7 a 28 dias, por

representarem os estágios agudo, intermediário e crônico da silicose. Outros

autores utilizaram os tempos de 10 e 30 dias, como representantes da fase aguda

e crônica, respectivamente (Faffe e cols., 2001; Borges e cols., 2001).

Quando da entrada das partículas de sílica nas vias aéreas, estas

caminham em direção aos alvéolos, onde são fagocitadas por macrófagos,

havendo como conseqüência processo de ativação celular e liberação de

mediadores inflamatórios tais como espécies reativas de oxigênio, enzimas

lisossomais, metabólitos de ácido araquidônico, quimiocinas e citocinas,

importantes para o recrutamento celular e intensificação do processo de

fibrogênese (Fujimura, 2000).

A ação citotóxica da sílica é relatada pela ativação dos macrófagos

alveolares e pela produção de espécies reativas de oxigênio, levando a lesão

celular e ruptura da membrana lisossomal (Davis, 1986; Vallyathan e cols., 1988).

Com a lise dos macrófagos, as partículas de sílica são ingeridas por novos

macrófagos alveolares que também morrem após a ingestão das partículas. Por

conta disso, os macrófagos alveolares não conseguem remover completamente as

partículas de sílica dos pulmões (Reasor, 2001).

De forma complementar aos macrófagos, incluem-se também como células

mononucleares, os linfócitos, que também foram identificados por participar na

reação pulmonar à sílica. Tanto em animais quanto em humanos, os linfócitos

estão presentes no infiltrado inflamatório ao redor dos granulomas, no interstício e

também formando agregados linfóides intrapulmonares e no tecido linfóide

associado aos brônquios (BALT) (Reise e cols., 1982; Kumar, 1989). Struhar e

cols. (1989) demonstraram, em ratos, que após a instilação da sílica houve um

aumento do número de linfócitos T no BAL e no tecido pulmonar. Foi verificado

também que a resposta linfocitária era dominada por células CD4+, com pico de

resposta ocorrendo entre 14-30 dias de exposição (Kumar, 1989). Além disso,

populações específicas de linfócitos T em pulmões silicóticos produzem IFN-γ em

quantidade aumentada. Esta citocina seria responsável pela manutenção da

população macrofágica ativada na silicose (Davis e cols., 2000). A diminuição

temporal do inflitrado inflamatório também pode ser observada na análise do

tecido pulmonar corado pela hematoxilina e eosina.

Em nossos resultados verificamos que a estimulação por sílica determinou

um aumento significativo no número de neutrófilos presentes no BAL, fenômeno

este que se mostrou de igual intensidade ao longo de todo o processo. Além

disso, vimos um aumento nos níveis de KC de no lavado broncoalveolar nos

animais silicóticos. Na análise do BAL não vimos diferenças significativas no

número de neutrófilos entre os grupos sílica, mesmo fato que foi observado

quando da quantificação do KC (IL-8 murina) que possui um importante papel no

recrutamento desse tipo celular.

Vanhee (1995) mostrou que citocinas e fatores de crescimento tais como o

TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8, TGF-β, PDGF e IGF produzidos pelos macrófagos

alveolares estão diretamente implicados na cascata de eventos que levam ao

desenvolvimento da fibrose pulmonar. Já foi demonstrado que na silicose, o TGF-

β promove o acúmulo de matriz extracelular tanto por aumentar a síntese de

colágeno e fibronectina, quanto por inibir a degradação da matriz extracelular pela

diminuição da secreção de proteases e/ou aumento da secreção de inibidores de

proteases (Jagirdar, 1996). Esses fenômenos corroboram com os resultados

encontrados com a quantificação das fibras colágenas, quando foi detectado um

aumento significativo, principalmente, no grupo silicótico em 28 dias.

Vimos em nosso trabalho um aumento significativo no conteúdo de

algumas dessas citocinas e fatores de crescimento envolvidos na silicose nos

animais que receberam sílica, quando comparados com o grupo salina.

Analisando o BAL, observamos um aumento temporal significativo dos níveis de

TNF-α, e TGF-β. Porém, no caso da quimiocina KC foram verificados níveis

aumentados durante todo o período de análise. Já na análise desses fatores no

tecido pulmonar, verificamos aumento nos níveis de KC e MIP-2, bem como de

TNF-α, IFN-γ e TGF-β. A geração destes fatores apresenta correlação temporal

com o infiltrado leucocitário e a cronificação do quadro, revelada pela ocorrência

de intensa fibrose e formação de granulomas. Estes achados encontram respaldo

na literatura e reforçam o fato de que o modelo desenvolvido foi capaz de

reproduzir o quadro silicótico verificado em outros modelos experimentais e

também na doença humana.

A degradação da MEC constitui um evento essencial em muitos processos

fisiológicos como durante o desenvolvimento embrionário, crescimento e reparo

dos tecidos. Por outro lado, sua excessiva degradação pode acarretar o

desenvolvimento de várias condições patológicas, dentre as quais cita-se artrite

reumatóide, osteoartrite e doenças autoimunes (Westermarck, 1999). Algumas

proteases específicas conhecidas como metaloproteinases de matriz (MMPs), do

inglês "matrix metalloproteinases", formam uma importante família de

endopeptidases metal-dependentes, secretadas na forma inativa, com zinco no

sítio ativo (Curran, 2000). Existem, atualmente 20 tipos de MMPs humanas, as

quais são agrupadas de acordo com a estrutura e substrato específico em:

colagenases (MMP-1, -8 e -13), estromelisinas, gelatinases (MMP-2, -9) e

metaloproteinases ligadas à membrana plasmática (Thomas, 1999; Nabeshima,

2002). O desequilíbrio existente entre as metaloproteinases (MMPs) e seus

respectivos inibidores teciduais (TIMPs) permite o acúmulo destas proteínas

secretadas principalmente por fibroblastos (Perez-Ramos cols., 1999). Ao

fazermos a marcação para MMP-2 e -9 no tecido pulmonar, observamos uma forte

marcação no caso dos animais silicóticos, em comparação com os controles. No

caso particular da MMP-9, observou-se marcação predominante em macrófagos o

que vem reforçar achados de literatura indicativos de ser esta MMP mais

associada a células inflamatórias (Corbel, 2000).

De forma interessante, podemos associar o aumento significativo no

conteúdo de colágeno no tecido pulmonar numa fase mais crônica ao aumento de

∆P2, L, (relacionado a vias aéreas periféricas). Faffe e cols. (2001), ao analisarem

a mecânica tecidual de pulmões silicóticos, também observaram um aumento

significativo da resistência tecidual em relação a dos animais controle. O aumento

de ∆P1, L (relacionado com vias aéreas centrais) parece estar mais relacionado

com o infiltrado inflamatório encontrado principalmente ao redor dos brônquios.

Segundo Marchiori (2002), a silicose na sua forma crônica clássica em geral

se desenvolve após longos períodos de exposição (acima de dez anos) a baixas

concentrações de poeira inalada. O tipo acelerado pode se desenvolver em

períodos de exposição de cinco a dez anos, sendo este um termo clínico aplicado

à doença com progressão intermediária entre a forma crônica e a aguda. A forma

aguda se desenvolve com um tempo de exposição relativamente curto a grandes

concentrações de sílica (de meses até cerca de cinco anos), com início rápido dos

sintomas clínicos e uma evolução progressiva fatal, não alterada pelo tratamento.

Clinicamente, os pacientes apresentam dispnéia de início súbito, que se torna

progressiva e incapacitante. Outras queixas comuns são tosse, fadiga, febre e

perda de peso.

Conforme mencionado anteriormente, o tratamento da silicose se baseia na

prevenção e no afastamento do trabalhador da sua atividade profissional. Porém,

as alterações funcionais são bastante tardias e com isso o paciente não procura o

atendimento médico a tempo de impedir a instalação da doença. Outro fato

importante é a autoprogressão da doença mesmo após o afastamento do paciente

do contato com a sílica (Reiser, 1983).

Existem poucos trabalhos na literatura a respeito do tratamento da silicose

em humanos ou com a utilização de modelos experimentais. Trabalhos utilizando

a tetrandrina (extraído da raiz da Stephania tetrandra) foram realizados como

terapia alternativa para o tratamento da silicose (Xie, 2002; Liu, 1994). Segundo

Liu (1994), foram observadas melhoras significativas nos aspectos radiográficos

de pacientes tratados com a tetrandrina de 1 a 3 anos. Outro composto bastante

testado na silicose pulmonar foi a polivinilpiridina-N-oxido (PVNO). O PVNO é

conhecido por reduzir ou prevenir os efeitos tóxicos, fibrogênicos e

imunossupressores da sílica, provavelmente por agir diretamente nos macrófagos

pulmonares (Larry, 1983). Zhao e cols. (1983) observaram significativa melhora

nos pacientes tratados com PVNO, porém quando o tratamento era interrompido a

doença progredia novamente.

Também, quando da utilização do tratamento profilático com PVNO,

Goldstein & Rendall (1987), descreveram haver melhora no caso dos animais

tratados, porém observaram, também, a progressão da doença quando do término

do tratamento.

Os glicocorticóides (exógeno ou endógeno) suprimem a resposta

imunológica normal, sendo esta propriedade imunossupressora a que melhor

caracteriza as suas indicações terapêuticas para o tratamento dos processos

inflamatórios, doenças auto-imunes e para a viabilização de transplantes

(Finamor, 2002; Kountz, 1997).

Os efeitos antiinflamatórios e imunossupressores dos glicocorticóides

ocorrem devido às suas seguintes ações: Interferem na circulação das células

imunes, diminuem o número de linfócitos periféricos, principalmente linfócitos T e

inibem o acúmulo de neutrófilos no local da inflamação. Além disso, promovem

apoptose das células linfóides, inibem a síntese de citocinas, modulam direta e

indiretamente a função das células B, inibem a resposta proliferativa dos

monócitos ao fator de estimulação de colônias e sua diferenciação em

macrófagos, também inibindo as suas funções fagocíticas e citotóxicas. Inibem o

movimento de células e fluídos a partir do compartimento intravascular; Inibem a

ação da histamina, a síntese das prostaglandinas e a ação dos ativadores do

plasminogênio (Kountz, 1997).

Sharma e cols. (1991), avaliaram o efeito da utilização do corticóide

prednisolona por seis meses em pacientes com silicose crônica. Os resultados

desse trabalho mostraram que a prednisolona, em determinados pacientes,

diminuiu a alveolite causada pela sílica, em associação com redução na

população leucocitária presente no lavado broncoalveolar, melhora na função

pulmonar e na PaO2 (pressão parcial de oxigênio).

Com base na escassez de tratamentos realmente eficazes no caso da

silicose, no presente trabalho buscamos investigar o potencial efeito curativo de

composto esteroidal de mais nova geração, a flunisolida. Este é um glicocorticóide

derivado da fluocinolona acetonida, usado no tratamento das inflamações das vias

aéreas, principalmente aqueles que possuem um componente alérgico. É

administrado primeiramente como um aerossol (nasal ou oral) (Pakes, 1980;

Wallace, 2004). O uso local de corticóides pode reduzir a dose total utilizada no

tratamento do paciente e minimizar efeitos colaterais sistêmicos.

Este pensamento conduziu ao desenvolvimento dos corticóides inalatórios

para o tratamento principalmente de quadros alérgicos. A segunda geração destes

compostos inclui o dipropionato do beclometasona, a budesonida, a fluticasona e

a flunisolida, entre outros. Os efeitos sistêmicos desses corticóides inalatórios são

mínimos quando utilizados nas doses recomendadas. Apesar da eficiência

corticóides inalatórios, entre eles a flunisolida, no tratamento da alergia, esses

compostos ainda não foram testados na silicose pulmonar (Szefler, 2001).

Estudos prévios demonstraram a eficiência de compostos associados a

uma molécula doadora de óxido nítrico. Wallace e cols. (2004), observaram uma

redução significativa da toxicidade sistêmica do NCX-1024, que nada mais é do

que a clássica flunisolida à qual foi acoplada uma molécula doadora de óxido

nítrico. Em estudos com a NXC-1015 (NO-prednisolona), Paul-Clark e cols.

(2002) observaram uma redução significativa da erosão óssea e cartilaginosa

associada à artrite em ratos tratados apenas com a prednisolona.

Ao testamos o efeito da NCX-1024 no tratamento da silicose, também

optamos pela via de administração intranasal de forma a minimizar a ocorrência

de efeitos sistêmicos adversos provocados pelo uso dos corticóides. Adotamos a

utilização de um tratamento curativo, ou seja, administração dos compostos por

um período de 7 dias, inciando-se 21 dias após a instilação de sílica. Com isto

buscamos nos aproximar mais da condição verificada na clínica, quando o

paciente ao procurar auxílio médico já se encontra com o quadro da doença

instalado.

Como resultado observamos que houve uma diminuição significativa da

resposta inflamatória nos animais tratados com flunisolida e com NCX-1024, no

que se refere ao infiltrado celular e deposição de componentes de matriz

extracelular e TNF-α. De forma coerente, as alterações verificadas na mecânica

respiratória, tanto nas vias aéreas centrais como periféricas, foram revertidas pelo

tratamento com flunisolida e NCX-1024. Entretanto, diferentemente dos estudos

realizados utilizando compostos nitrosilados em outros modelos experimentais, até

o presente momento não detectamos diferença significativa na intensidade de

inibição verificada nos animais tratados com flunisolida e aqueles que receberam

NCX-1024. Porém, vale mencionar que a dose de flunisolida utilizada mostrou-se

extremamente potente em inibir a fase crônica do processo silicótico, o que veio a

dificultar nossa análise comparativa entre as potências de NCX-1024 e o

composto parente flunisolida. Novos experimentos já encontram-se em andamento

no sentido de esclarecer este ponto.

6. Conclusões

6.1. O estabelecimento de um modelo experimental de silicose em

camundongos Swiss-Webster, mediante instilação nasal de dose única de

partículas de sílica, mostrou-se eficaz em induzir resposta inflamatória marcante e

quadro de fibrose pulmonar, o que se refletiu em claro comprometimento da

função respiratória;

6.2. O tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024 se mostrou

extremamente eficaz em reverter o quadro de infiltrado inflamatório e da

conseqüente fibrose pulmonar, com conseqüente na melhoria da capacidade

respiratória dos animais silicóticos;

6.3. Devido à intensa supressão do quadro silicótico verificada na condição do

tratamento com flunisolida e NCX-1024, não nos foi possível detectar diferenças

significativas entre a potência anti-inflamatória de ambos os compostos, o que

implica na necessidade da realização de experimentos adicionais para

esclarecimento acerca deste ponto;

6.4. Em conjunto, nossos resultados indicam que tanto flunisolida e NCX-1024

constituem terapias promissoras de utilização no caso de doenças inflamatórias

pulmonares crônicas, de caráter fibrótico, como a silicose.

8. Referências Bibliográficas

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Hyg [B]. 178(3):259-62, 1983.

PRELIMINARY VERSION

Respiratory mechanics and morphological changes in

lung injury induced by intranasal silica in mice

Januário M. Lima; Tatiana P.T. Ferreira; Francisco A. Farias Filho, Patrícia B.

Jurgilas1, Jonas H. Perales1, Marcelo Pelajo2, Patrícia R. M. Rocco3; Cristiane

Garcia3, Alba Fernandes3, Vincent Lagente4, Cory Hogaboam5, Marco Martins and

Patrícia Silva.

Laboratory of Inflammation, 1Laboratory of Toxinology , 2Laboratory of Pathology,

Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil, no 4365, Manguinhos, CEP 21045-

900, 3 Laboratory of Pulmonary Investigation, CCS, Federal University of Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil; 4Université de Rennes 1, France; 5Department of

Pathology, University of Michigan, USA.

*Author for correspondence

E-mail address: [email protected]

Tel: 55.21.2562-0818, Fax: 55.21.2558-7382

A ser submetido ao American Journal of Pathology

Abstract

Silicosis is one of the oldest occupational diseases, still killing thousands of

people in the world. In this study we developed a non-invasive model of silicosis in

mice, in order to investigate the role of mediators involved in the genesis of

pulmonary fibrosis processes and the chronology of inflammatory phenomena

preceding the processes of tissue lesion and repair. The comparative analysis

among different strains of mice as C57Black6, Balb/c and Swiss Webster revealed

a the occurrence of leukocyte infiltration at day 7, peribronchiolar granuloma

formation at day 14, followed by an extensive tissue fibrosis at day 28. As revealed

by staining with pricrus-sirius, 28-day silicotic mice exhibited a massive deposition

of collagen in the lungs when compared from control mice. Analysis of different

mice strain responsiveness to intranasal silica showed that all three species

exhibited a similar pattern of response. Further experiments were performed in

Swiss Webster mice since this is not an inbred mouse strain thereby modeling the

outbred human condition associated with silicosis. The kinetics of leukocyte

infiltration in BAL fluid revealed that there is a marked increase in the number of

total leukocytes, at 7 days, which reduces progressively with time. A similar profile

was noted in the case of mononuclear cells, while neutrophil numbers remained

elevated for at least 60 days after the introduction of silica into mice. Tissue

analyses showed that there is a marked inflammatory celIn parallel, a marked

increase in the levels of fibrogenic cytokines namely TNF-alpha, TGF-beta and IL-

13 was detected. These responses directly correlated with alteration of lung

function as attested by elevation in lung resistance and static elastance.

Altogether, our findings indicate that the nasal instillation of silica into various

strains of inbred and outbred mice reproduces critical features of the human

silicosis.

Key words : Inflammation, lung, silica particles.

Introduction

Environmental and occupational lung disorders are an important aspect of

clinical medicine and the economic costs are staggering. Billions of dollars are

paid out in workers compensation annually for job-related illness and injuries

associated with silicosis. According to publications by the World Health

Organization, silicosis is an occupational disease that produces the largest number

of victims and kills thousands worldwide each year.

Silicosis is the consequence of a long-term exposure to inhaled dust of silica

dioxide or silica in its free and crystalline form, and it can be detected through a

simple chest X ray, which will reveal the presence of small nodules in the upper

lungs. The resulting respiratory insufficiency is a consequence of changes in lung

ventilation and gas exchange, and the decrease in respiratory function is a limiting

factor for the patient’s activities.

Pulmonary fibrosis response is traditionally seen as a phenomenon

occurring after an acute inflammatory response, although up to this moment there

is no clinical evidence proving the actual existence of a direct relationship between

inflammatory parameters and the evolution of this disease. However, it has been

described, in specialized literature, that tissue fibrosis begins its amplification from

an initial lesion, and thus acts by modulating the phenomenon of tissue repair,

regarding both the accumulation of mesenchymal cells and the synthesis of

extracellular matrix components (Keane and Strieter, 2002). This has led some

research groups to focus their studies on the expression of components of the

extracellular matrix and on molecules that are normally involved in the regulation of

homeostasis.

Experimental silicosis models attempt to reproduce the sequence of events

of human silicosis and have been explored over the years to provide

comprehension regarding the determination of cellular and molecular mechanisms

of this disease. However, there are very few published articles describing an

experimental model which faithfully reproduces the physiopathology of pulmonary

silicosis. Basically there are two described forms of inducing silicosis in animals.

According to Davis et al. (1998), animals inhaled aerosol particles during 5 hours

a day, during 12 consecutive days, receiving 70 mg/m3 of silica dust, and the

analysis was carried out from 16 to 20 weeks after instillation. Although it is a good

reproduction of what happens in humans, this model requires a long time for the

disease to establish itself, besides needing special infrastructure. The other, more

commonly used, form of induction involves the intratracheal instillation of silica

particles. A small surgical procedure is performed in which the animal’s trachea is

exposed and silica dust is introduced with a syringe. The commonly used dose is

20 mg of silica dust diluted in 50µl of sterile saline (Borges et al., 2001; Faffe et al.

2001). Although induction is fast and requires only one dose, this technique has

been criticized for being invasive, which might influence the development of the

inflammatory process, besides inducing the disease in a completely different

manner from what happens in humans.

In this paper we sought to develop a model which reproduced in a more

accurate manner the events associated to what happens in the human disease. By

inducing silicosis intranasally, we were able to overcome the problems found in

aerosol models and in intratracheal models.

We will focus our attention on the development of a non-invasive model of

silicosis in mice, in order to investigate the role of mediators involved in the

genesis of pulmonary fibrosis processes and the chronology of inflammatory

phenomena preceding the processes of tissue lesion and repair. We will give

particular emphasis to connective tissue elements, including extracellular matrix

components, as well as to matrix metalloproteinases, cytokines and chemokines,

aiming to identify potential therapeutic targets.

Materials and Methods

Animals

Male C57/BL6, Balb/c and Swiss Webster mice (180-200 g) were obtained

from the Oswaldo Cruz Foundation Breeding (Rio de Janeiro, Brazil) and and kept

in the animal-housing facilities of the Department of Physiology and

Pharmacodynamics with controlled room temperature (22-25 ºC) and a 12-h (6:00

AM-6 PM) light dark cycle. All the procedures involving care and use of laboratory

animals in this study were examined and approved by the Animal Ethics

Committee of the Oswaldo Cruz Foundation (licence 0213).

Silicosis induction

Animals were anaesthetised by halothane (Tanohalo, Cristália, São Paulo)

and then injected intranasally with 10 mg of silica (SiO2), (SiO2, S-5631 Sigma

Chemical Co, St. Louis, MO, USA, particle size: 0.5 -10 µm) diluted in 50 µl of

sterile saline intranasal solution. Tests were performed in different times, after 7,

14 and 28 days (figure 1). For comparative analysis between different types of

mice, a time of 28 days was fixed after silica dust instillation.

Bronchoalveolar Lavage (BAL)

Bronchoalveolar lavage was carried out with a polyethylene cannula

inserted in the trachea and a total volume of 1.5 ml of buffered saline solution

(PBS) containing 10 mM of EDTA was instilled and then aspirated in 2 consecutive

lavages of 0.75 ml. Samples were centrifuged at 300 x g for 10 minutes, and the

supernatant was collected and frozen for later quantification of mediators. The

cellular pellet was suspended again in 0.25 ml for cell analysis.

Leukocyte counting

The total number of leukocytes was analyzed by diluting the samples in Türk

liquid (1:10), and counting was carried out in a Neubauer chamber with light

microscope. The differential analysis used cell smears stained with the May-

Grunwald-Giemsa method. Evaluation was carried out with immersion in oil and

light microscope (BX51, Olympus).

Histopathologic Analysis

After being put down with a high dose of Thiopental (i.p.), perfusion was

performed by means of an intracardiac cannula with a solution of saline and

heparin (1:10) for blood collection. All animals later received buffered

paraformaldehyde at 4% through the same means. In both procedures the flasks

containing the solutions were kept at a height of 110 cm so that hydrostatic

pressure would reproduce the physiological conditions of blood circulation. The

lungs were then fixed in buffered formaldehyde at 10% for 24 hours, dehydrated in

increasingly concentrated ethanol solutions, clarified with xylene and finally set in

paraffin. Histologic cuts of 5 µm were performed using paraffin blocks containing

fragments of lung tissue, and submitted to the following staining and

immunohistochemical methods. For the analysis of general aspects of lung tissue,

the histologic cuts were stained with hematoxilin-eosin, analyzed with light

microscope (BX51, Olympus) at different magnifications, and photographed with a

digital camera (C-7070, Olympus). For collagen quantification we used histologic

cuts stained with phosphomolybdic acid-Sirius Red (PMA-SR) technique and

observed through a light microscope (BX51, Olympus). Five images were obtained

from each slide by using a digital camera (BX51, Olympus), each containing areas

with nodular lesions induced by silica dust, visible at 20X magnification. Images

were processed and the amount of collagen was quantified by using the image

analysis program Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics, USA). In order to

evaluate the presence of neutrophils in the lung tissue we used Lennert’s Giemsa

stain with differentiation in acetic acid at 0.5%. After staining, the slides were

photomicrographed for later analysis.

Immunohistochemistry for MMP-2 and MMP-9

To highlight metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) the antibodies

anti-MMP-2 (SC6838, Santa Cruz, CA, USA) and anti-MMP-9 (SC6841, Santa

Cruz, CA, USA) were used. After removal from paraffin, the cuts were hydrated

with TBS pH 7.6, blocked with H2O2 at 3% in methanol for ten minutes and the

slides were then washed three times with TBS and blocked with Tris-HCL + BSA

2% for 20 minutes. Primary anti-bodies anti-MMP-2 and MMP-9 were diluted with

Tris-HCL + BSA 1% in 1:100 and 1:80 ratios, respectively. The slides were

incubated with the primary antibody for 12 hours. After incubation they were

washed twice with TBS. The secondary antibody, anti-IgG (goat) (811620 Zymed,

USA) was diluted in Tris-HCL and incubated for 30 minutes. Development was

performed with AEC for approximately 10 minutes. The slides were finally washed

with distilled water, counter-stained with Mayer’s hematoxilin and mounted in an

aqueous substrate.

Immunehistochemistry for the marking of activated M acrophages

In order to highlight alveolar macrophages, biotinylated BSL 1 lectin (Vector

Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) was used. After removal from paraffin the

cuts were hydrated and endogenous peroxide was inhibited (H2O2 at 3% in

methanol) and tissue charges were blocked (3% borax), as were the unspecific

reagents links, by means of incubation with phosphate buffered saline (PBS)

containing bovine albumin (BSA) at 3%. The biotinylated lectin was incubated for

16 hours at 4o C in a humid room (1:250 dilution in PBS-BSA at 1%) and detected

by the Streptavidin-Peroxide conjugate by using diaminobenzidine as chromogenic

substrate – FAST DAB (Sigma, St Louis, MO, USA) according to the

manufacturer’s instruction. The slides were counter-stained with hematoxilin.

Quantification of chemokines and cytokines

We used 96-compartment plates where we added 50 ml/compartment of the

capturing antibody, diluted in a buffer composed of 1.5 M NaCl, 0.5 M of H3BO4

and 1 N of NaOH; incubation period was 12 hours at 40o C. The compartments

were washed 3 times (200 ml/compartment) with buffer 1, composed of buffered

saline solution PBS/0.005 % of Tween 20. After this phase, in order to block

unspecific sites, the plate was filled (200 ml/compartment) with buffered PBS saline

solution/bovine albumin serum (BSA, 2%) for one hour at 37o C. The

compartments were washed three times with buffer 1 (200 ml/ compartment).

Samples and standards were diluted in buffer 1 containing 2% of bovine fetal

serum (BFS) (buffer 2) and then added to the compartments (50 ml/compartment).

After the incubation period (1 hour at 37o C) a new sequence of 3 washings was

performed (200 ml/compartment) with buffer 1. The bioetinylated detector antibody

(50 mg/ml) was then added and kept in incubation for 45 minutes at 37o C. The

compartments were washed with buffer 1 (200 ml/compartment) and incubated for

30 minutes at 37o C (100 ml/compartment) with a NeutrAvidin “horseradish

peroxide” (HRP) mixture diluted in buffer 2. After the last wash with buffer 1 (200

ml/compartment) the orthophenylenediamine dichloride (OPD) substrate was

added (100 ml/compartment) to develop the colorimetric reaction (approximately 3

to 5 minutes), which was interrupted by adding 50 ml/compartment of H2SO4 (3 M).

The spectrophotometric analysis was carried out in a plate reader for 450 nm

wavelength.

The quantification of inflammatory mediators included cytokines TNF-α, INF-

γ, TGF-β and chemokines KC and MIP-2α. Commercial kits were used (R&D

System, USA) and all manufacturer’s instructions were followed. The analyzed

samples were taken from the bronchoalveolar lavage (point 3.3) and the lung

tissue. In the case of tissue, it was homogenized in 1 ml of PBS containing a

“complete” cocktail of protease inhibitors (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel,

Switzerland), followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the

supernatant was recovered for later quantification of mediators.

Respiratory mechanics

For respiratory mechanic tests we used 5 animals from each group. They

were sedated with diazepam (5 mg/kg, i.p.) and then anesthetized with sodium

pentobarbital (20 mg/kg, i.p.) and tracheostomized for the introduction of a 20-

gauge Jelco needle. The animals were positioned in supine position for the

removal of thoracic and abdominal walls, paralyzed with gallamine triethiodide (2

mg/kg i.v.) and then mechanically ventilated with constant flow and volume.

A pneumotacograph was connected to a tracheal cannula to measure air

flow (V’), and by integrating the flow signal, we obtained the mobilized gas volume

(V) (Mortola, 1983). Tracheal pressure (Ptr) was measured through a side exit of

the circuit, by means of a differential pressure transducer.

Respiratory mechanics were analyzed with the method of occlusion at the

end of inspiration, based on the insufflation of the respiratory system with constant

air flow followed by a quick closure of the airway at the end of inspiration. We

observed a quick initial drop of Ptr (∆P1, L) up to a point of curve inflexion (Pi, L),

followed by a slow decrease (∆P2, L) until it reached a plateau representing the

elastic pressure of the respiratory system (Pel, L). ∆P1, L and ∆P2, L respectively

correspond to the viscous and viscoelastic components of the respiratory system.

The sum of ∆P1, L and ∆P2, L equals ∆PTOT. Static and dynamic elasticity values

(Est, L and Edyn, L, respectively) of the system were calculated by dividing Pel, L

and Pi, L by current volume (VT) (Bates, 1988).

Statistic analysis

The results were expressed as mean ± standard error mean (SEM) and

statistically analyzed by variance analysis (ANOVA), followed by a Newman-Keuls-

Student multiple comparison test. Values of p < 0.05 were considered statistically

significant for both tests.

Results

Comparative Analysis of Pulmonary Inflammatory Resp onse Induced

by Instilled Silica Dust in Rats

In order to establish a non-invasive model of silicosis, first we made a

comparative evaluation of the silica-induced response in three different species of

mice. Two isogenic species were chosen (Balb/c and C57 Bl6), together with a

non-isogenic one (Swiss-Webster). For this analysis we chose a period of 28 days,

as this corresponds to the chronic phase of the disease and therefore to the most

critical stage of the silicotic process. We initially evaluated the cellular content of

bronchoalveolar lavage of silicotic animals when compared with controls (instilled

with saline). We observed an increased number of leukocytes in the

bronchoalveolar lavage (BAL) of the tested animals, with clearly predominant

macrophages and a significant infiltrate of neutrophil polymorphonuclears (Fig. 3).

All three species analyzed presented a similarly intense granulomatous response,

as attested by hematoxilin and eosin stains (Fig. 4). Based on these results we

decided to use Swiss-Webster mice in the subsequent essays, as their non-

isogenicity may be more representative of the response observed in humans with

the disease.

Kinetics of Silica-Induced Pulmonary Inflammatory Response in

Swiss-Webster Rats

Evaluation of Leukocyte Contents in Bronchoalveolar Lavage

Our analysis worked with periods of 7, 14 and 28 days, as these represent

the acute, the intermediary and the chronic stages of silicotic disorder. We

observed that the bronchoalveolar lavage contained an increased number of total

leukocytes, with a peak at 7 days and a progressive decline at 14 and 28 days.

The differential analysis revealed a predominance of macrophages, with a

significant increase in the number of neutrophils. These latter cells presented

constant high levels throughout the analysis period (Fig. 5).

Evaluation of Morphologic Changes in Pulmonary Tiss ue

We observed that the lungs of control animals showed preserved pulmonary

parenchyma for all times analyzed, with alveolar spaces free of inflammatory cells

and bronchiolar structures lined with cuboid to cylindrical pseudo-stratified

epithelium (Fig. 6A). As shown in figures 6 and 7, we observed that after 7 days

the silicotic animals showed diffusely altered parenchyma with the presence of

inflammatory cells and large areas of alveolar collapse (Fig. 6B). This inflammatory

infiltrate had a marked presence of neutrophil polymorphonuclears (Fig. 7A). In the

group of 14-day silicotic animals we observed the existence of nodular structures

(granulomas), sometimes confluent (Fig. 6C), made up of inflammatory cells

among silica particles (Fig. 7B). The 28-day group showed better delimitated

granulomas and maintained cellularity including macrophages and neutrophils (Fig.

6D). The alveolar walls presented a larger number of mononuclear cells, which

determined the identification of evident wall thickening (Fig. 7C).

By using Picrus-Sirius stain to visualize collagen fibers, our microscopy

showed a small amount of collagen fibers in the pulmonary parenchyma of control

animals, in all analyzed times (Fig. 8A). Silicotic animals showed a time-dependent

increased content of collagen fibers; its peak was observed on day 28,

corresponding to the chronic phase of silicotic response (Figures 8B, 8C and 8D).

Evaluation of Cellular Infiltrate in Pulmonary Pare nchyma

The macrophages in the lungs of control animals were either not responsive

or weakly responsive to BSL-1 (Fig. 9A). In the case of the silicotic animals we

observed that interstitial and alveolar macrophages were highly positive in their cell

membranes, which favored the identification of the activated population after 7

(Fig. 9B), 14 (Fig. 9C) and 28 (Fig. 9D) days.

Lennert’s Giemsa stain showed no markings for neutrophil

polymorphonuclears in control animals (Fig. 10A). However, under the same

experimental conditions we observed the presence of neutrophils with apoptotic

aspect in the pulmonary tissue of silicotic animals in all three times analyzed

(Figures 10B, 10C and 10 D).

Identification of Inflammatory Mediators Generated During Silicotic

Response in Rats

With the aim to identify inflammatory mediators which take part in the

silicotic response, we went on to analyze some relevant chemokines and

cytokines. We studied the bronchoalveolar lavage and pulmonary tissue and

initially detected an increased amount of KC in the bronchoalveolar lavage; KC is a

C-X-C chemokine which corresponds to human IL-8 (Fig. 11A). Equivalent

amounts of KC were detected in different analysis times. Both TNF-α and TGF-β

were increased in a time-dependant manner in the BAL, with a peak on the 28th

day after silica instillation (Figures 11B and 11C, respectively).

During pulmonary tissue analysis we observed high levels of KC (Fig. 12A)

during all three analysis times. Other mediators showed a progressive increase:

chemokines and cytokines were increased in the silicotic animals, with their peak

on day 28. MIP-2 (Fig. 12B), IFN-γ (Fig. 12C), TNF-α (Fig.12D) and TGF-β (Fig.

12E) were analyzed.

Analysis of the Presence of Metalloproteinases 2 a nd 9 (MMP-2 and

MMP-9) in Pulmonary Tissue

For the evaluation of MMP-2 and MMP-9 we used the

immunehistochemistry technique, which allowed us to observe that the lungs of

control animals showed weak marking for MMP-2 and 9 (Figures 13A and 14A).

Silicotic animals showed strong marking for MMP-2 and MMP-9 on days 7 and 28

(Figures 13 and 14).

Evaluation of Respiratory Mechanics in Silicotic Mi ce

The analysis of respiratory mechanics showed a significant increase of

variations of resistive pressures ∆P1, L (related to central airways), ∆P2, L (related

to peripheral airways) and ∆Ptot (the sum of both pressures, ∆Ptot L= ∆P1, L + ∆P2,

L) in silicotic animals when compared to saline animals, in all three analyzed times

(Fig. 15). On day 28 the silicotic animals presented a significant increase of ∆P2, L

when compared with other silicotic animals. This increase is apparently related to

pulmonary fibrosis observed in animals after 28 days of silica instillation.

Discussion

Silicon is a serious public health problem, since its incidence and prevalence

are very high, especially in less developed countries, even though it is potentially

avoidable (Carneiro, 2001).

Observations in humans showed inter-individual differences regarding the

development of silicotic lesions (Katsnelson et. al., 1986; Honda et. al., 1993).

There is some evidence that genetic factors may be related to individual

susceptibility, although such evidence is not as yet conclusive.

Experimental silicosis models attempt to reproduce the sequence of events

of human silicosis and have been explored over the years to provide

comprehension regarding the determination of cellular and molecular mechanisms

of this disease. However, there are very few published articles describing an

experimental model which faithfully reproduces the physiopathology of pulmonary

silicosis.

Basically there are two described forms of inducing silicosis in animals.

Davis et al. had animals inhale aerosol particles (1998). In his technique, animals

were kept in a room for 5 hours during 12 consecutive days, receiving 70 mg/m3 of

silica dust, and analysis was carried out from 16 to 20 weeks after instillation was

concluded. Although it is a good reproduction of what happens in humans, this

model requires a long time for the disease to establish itself, besides needing

special infrastructure. The other, more commonly used, form of induction involves

the intratracheal instillation of silica particles. A small surgical procedure is

performed in which the animal’s trachea is exposed and silica dust is introduced

with a syringe. The commonly used dose is 20 mg of silica dust diluted in 50µl of

sterile saline (Borges et al., 2001; Faffe et al. 2001). Although induction is fast and

requires only one dose, this technique has been criticized for being invasive, which

might influence the development of the inflammatory process, besides inducing the

disease in a completely different manner from what happens in humans.

In this paper we sought to develop a model which reproduced in a more

accurate manner the events associated to what happens in the human disease. By

inducing silicosis intranasally, we were able to overcome the problems found in

aerosol models and in intratracheal models. Our choice for 10 mg of silica dust

diluted in 50µl of saline proved to be efficient as it caused an extensive lesion,

compromising mainly the middle third and the apex of mice’s lungs.

We chose Swiss-Webster mice since they are not isogenic, therefore more

representative of the inflammatory response variability found in humans. There are

no other papers the in literature describing the use of Swiss-Webster mice to

develop models of pulmonary silicosis. For this reason we compared our animals

with two other isogenic mouse types (Balb/c and C57 Bl6) (Borges et al., 2001;

Faffe et al., 2001), as Balb/c is the most commonly used in this disease model. Our

results showed that there was no significant difference between the analyzed

animal strains in terms of cell profile and differential of the bronchoalveolar lavage,

or in the alterations observed in pulmonary tissue when stained with hematoxilin

and eosin. With these results we realized we could use the Swiss-Webster

animals, since they are capable of reproducing the response observed in other

strains used by other groups.

Although silicosis in humans develops over years of inhalation, studies with

animals have showed that even a single exposure event may lead to similar

functional and morphologic changes in the lungs, which clearly validates the use of

these models (Kuncová, 1971; Lugano, 1982; Mariani, 1995; Schapira, 1998). In

spite of the disease’s chronic character, we decided to establish analysis times

which included 7 to 28 days, as these represent the acute, intermediate and

chronic phases of silicosis. Other authors used 10 and 30 days as representatives

of acute and chronic phases, respectively (Faffe et al., 2001; Borges et al., 2001).

When the silica particles enter the airways, they move towards the alveoli,

where they are phagocyted by macrophages. The consequence of this is the

process of cellular activation and release of inflammatory mediators such as

reactive oxygen species, lysosomal enzymes, metabolites of arachidonic acid,

chemokines and cytokines, important for cellular recruitment and for the

intensification of the fibrogenesis process (Fujimura, 2000).

The cytotoxic action of silica is a consequence of the activation of alveolar

macrophages and of the production of reactive oxygen species, causing cellular

lesion and the rupture of lysosome membranes (Davis, 1986; Vallyathan et al.,

1988). With macrophage lysis, silica particles are phagocyted by new alveolar

macrophages, which also die after ingesting them. For this reason alveolar

macrophages cannot completely remove the silica particles from the lungs

(Reasor, 2001).

As complementary help to macrophages there are also mononuclear cells,

the lymphocytes, also shown to take part in pulmonary reaction to silica. In animals

as well as in humans, lymphocytes are present in the inflammatory infiltrate around

the granulomas, in the interstice and also forming lymphoid aggregates in the lungs

and in the bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) (Reise et al., 1982; Kumar,

1989). Struhar et al., (1989) demonstrated, in mice, that following silica instillation

there was in increase in the number of T-lymphocytes in BAL and in the pulmonary

tissue. They also observed that lymphocyte response was dominated by CD4+

cells, with a response peak between 14 and 30 days after exposure (Kumar, 1989).

Furthermore, specific populations of T-lymphocytes in silicotic lungs produce IFN-γ

in increased quantities. This cytokine could be responsible for the maintenance of

macrophage populations activated during silicosis (Davis et al., 2000). The time

reduction of inflammatory infiltrate can also be observed by analyzing pulmonary

tissue stained with hematoxilin and eosin.

Our results showed that silica stimulation caused a significant increase in

the number of neutrophils present in the BAL, a phenomenon which maintained the

same intensity throughout the process. We also observed increased levels of KC in

the bronchoalveolar lavage of silicotic animals. BAL analysis showed no significant

differences in the number of neutrophils among the silicotic groups; the same was

observed when quantifying KC (IL-8 murina), which plays an important role in the

recruitment of this cell type.

Vanhee (1995) showed that cytokines and growth factors such as TNF-α, IL-

1, IL-6 and IL-8, TGF-β, PDGF and IGF produced by alveolar macrophages are

directly involved in the sequence of events which lead to the development of

pulmonary fibrosis. It has been demonstrated that during silicosis TGF-β promotes

the accumulation of extracellular matrix, both because it increases the synthesis of

collagen and fibronectin and because it inhibits the degradation of extracellular

matrix by reducing the secretion of proteases and/or increasing the secretion of

protease inhibitors (Jagirdar, 1996). Such phenomena corroborate the results

found with the quantification of collagen fibers, when a significant increase was

detected mainly in the silicotic group, day 28.

Our work showed a significant increase in the content of some of these

cytokines and growth factors involved in the silicosis of animals exposed to silica

when compared to the saline group. By analyzing BAL we observed a significant

time increase of the levels of TNF-α and TGF-β. However, levels of chemokine KC

were increased throughout the analysis period. The analysis of these factors in the

pulmonary tissue showed increased levels of KC and MIP-2, as well as TNF-α,

IFN-γ and TGF-β. The generation of these factors presents a temporal relation with

leukocyte infiltrate and disease chronification, as demonstrated by the occurrence

of intense fibrosis and granuloma formation. These findings are backed by the

literature and corroborate the fact that the model developed was capable of

reproducing the silicotic scenario observed in other experimental models and in the

human disease as well.

The degradation of MEC is an essential event in many physiologic

processes such as during embrionary development and in tissue growth and

repair. On the other hand, excessive degradation may lead to the development of

various pathologic conditions, such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis and auto-

immune diseases (Westermarck, 1999). A few specific proteases known as matrix

metalloproteinases (MMPs) are an important family of metal-dependent

endopeptidases, secreted in their inactive form with zinc in the active site (Curran,

2000). Currently there are 20 known types of human MMPs, grouped according to

their structure and specific substrates in: collagenases (MMP-1, 8 and 13),

stromelysins, gelatinases (MMP-2 and 9) and metalloproteinases linked to the

plasmatic membrane (Thomas, 1999; Nabeshima, 2002). The existing imbalance

between metalloproteinases (MMPs) and their respective tissue inhibitors (TIMPs)

allows these proteins, mostly secreted by fibroblasts, to accumulate (Perez-Ramos

et al., 1999). When marking for MMP-2 and 9 in pulmonary tissue, we observed

strong marking in the case of silicotic animals when compared with controls. In the

specific case of MMP-9 we observed predominant marking in macrophages, which

strengthen literature findings indicating that this MMP is more associated with

inflammatory cells (Vincent – review). Neutrophils should also be considered

cellular sources of MMP-9.

Interestingly we may associate the significant increase of collagen contents

in pulmonary tissue in a more chronic stage to the increase of ∆P2, L (related to

peripheral airways). Faffe et al., (2001), when analyzing tissue mechanics of

silicotic lungs, also observed a significant increase of tissue resistance when

compared with control animals. The increase of ∆P1, L (related to central airways)

seems to be more related to the inflammatory infiltrate mainly found around the

bronchi.

Legends

Figure 1. Comparative analysis of the leukocyte infiltration in the bronchoalveolar

lavage (BAL) of three species of mice. White bars represent the saline group. Gray

bars represent the silica group. The mice were divided in three groups: Swiss

Webster, Balb/c and C57 Bl6. Total leucocytes (A), mononuclear cells (B) and

neutrophils (C). Values are means (SEM) of six animals. (+) Values significantly

different between salina and silica (p < 0.05). Photomicrographs of lung

parenchyma stained with hematoxylin and eosin (E, F and G) or Picro-Sirius (H, I

and J) in Swiss-Webster (E and H) Balb/c (F and I) and C57 Bl6 (G and J). 28

days after silica instillation (10 mg). We observed the same nodular infiltration of

neutrophils and macrophages in lung. (Magnification ×200. Scale bars = 200 µm).

Figure 2. Kinetics of leukocyte infiltration in the ronchoalveolar lavage (BAL).

White bars represent the saline group and Gray bars represent the silica group.

The mice Swiss Webster were divided in three groups: 7 days, 14 days and 28

days. Total leucocytes (A), mononuclear cells (B) and neutrophils (C). Cytokines

and chemokines in Bronchoalveolar Lavage (BAL). KC (D), TNF-α (E) and TGF-β

(F). Values are means (SEM) of six animals. (+) Values significantly different

between salina and silica (p < 0.05).

Figure 3. Photomicrographs of lung parenchyma stained with hematoxylin and

eosin (A, B, C and D) or Picro-Sirius (E, F, G and H) in Swiss-Webster, saline (A

and E), 7 (B and F), 14 (C and G) and 28 days (D and H) after silica instillation (10

mg). We observed a temporal increased in the size of granulomatous nodules

secondary to silica exposure. (Magnification ×200. Scale bars = 200 µm). Graphic

of quantification of collagen fiber content at pulmonary parenchyma. White bars

represent the saline group and Gray bars represent the silica group. (+) Values

significantly different from saline, P < 0.05. (*) Values significantly different from

other silica groups, P < 0.05.

Figure 4. Photomicrographs of imunohistochemistry of lung parenchyma marked

with F4/80 (A, B, C and D). Figures (E, F, G and H) were stained with Giemsa of

Lennert in Swiss-Webster, saline (A and E), 7 (B and F), 14 (C and G) and 28 days

(D and H) after silica instillation (10 mg). We observed a temporal increase in the

intensity of marking in silica groups (B, C and D). In slices stained with Giemsa,

we saw a strong marking for neutrophils (F, G and H). (Magnification ×200. Scale

bars = 200 µm).

Figure 5. Cytokines and chemokines on pulmonary tissue. White bars represent

the saline group and Gray bars represent the silica group. KC (A), MIP-2 (B), MIP-

1α (C), TNF-α (D), TGF-β (E) and IFN-γ (F). Values are means (SEM) of six

animals. (+) Values significantly different between salina and silica (p < 0.05).

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Universidade Federal do Rio de Janeiro - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp064620.pdf · 3.2 Indução da Silicose e Tratamento 34 3.3 Técnica do Lavado Broncoalveolar