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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Emanuell dos Santos Silva
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE POLI (ÁCIDO
LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS PARA
INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca
ORIENTADOR: Arnóbio Antônio da Silva Júnior
CO-ORIENTADOR: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL-RN
2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Emanuell dos Santos Silva
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE POLI (ÁCIDO
LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS PARA
INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Arnóbio Antônio da Silva Júnior
CO-ORIENTADOR: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
NATAL-RN
2018
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Silva, Emanuell dos Santos.
Nanopartículas poliméricas biodegradáveis de poli (ácido
láctico-co-glicólico) funcionalizadas para incorporação de
peçonha de Bothrops jararaca / Emanuell dos Santos Silva. -
2018.
72f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas. Natal, RN, 2018.
Orientador: Arnóbio Antônio da Silva-Júnior.
Coorientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.
1. Bothrops (jararaca) - Dissertação. 2. Nanopartículas de
PLGA - Dissertação. 3. Imunoadjuvantes - Dissertação. 4.
Nanobiotecnologia - Dissertação. I. Silva Júnior, Arnóbio Antônio
da. II. Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 598.115.33
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
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Emanuell dos Santos Silva
NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS DE
POLI (ÁCIDO LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) FUNCIONALIZADAS
PARA INCORPORAÇÃO DE PEÇONHA DE Bothrops jararaca
NATAL / RN
2018
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Dedico este trabalho ao meu Deus, e aos meus pais Francisca Maria e Manoel
Neto, que em TUDO estiveram do meu lado.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente, pela grande misericórdia, paciência e bondade que
tem tido comigo e por ter me livrado de todo o mal até o presente momento,
nunca esquecendo de mim.
Aos meus pais, por terem sido o meu suporte e meu afago nos momentos
mais difíceis, nunca me faltando o seu amor verdadeiro, carinho e compreensão.
Ao meu irmão Esaul Santos, por ser a pessoa que consegue tirar a minha
infinita paciência nas horas mais inoportunas, mas que me faz o amar e apoiar a
cada dia.
A toda minha família, por me inspirar a ser alguém melhor a cada dia, não
só por mim, mas também por eles.
Aos meus, não muitos, amigos, todos eles que conseguiram me
compreender e me respeitar na decisão de estar sempre me dedicando aos
estudos e mesmo com minha ausência, permaneceram por mim. Em especial a
Marcus Guedes por ter sido meu grande irmão, mesmo que distante, que me
ajudou e me suportou em quaisquer que fossem as circunstâncias; e a Iaponira
Barbosa que pegou na minha mão e me trouxe o grande presente de enxergar o
mundo da maneira mais real que ele possa ser.
Ao professor, doutor, orientador, aconselhador, paciente, pai, de ótimo
senso de humor, as vezes um pouco duro nas palavras, de ótimas intenções,
Arnóbio (SILVA-JÚNIOR, A.A) por ter todos esses adjetivos, por confiar em
minha capacidade e ter me dado a oportunidade de entrar na sua equipe e ter
experiências que eu jamais imaginaria.
Ao professor, meu coorientador, Matheus Pedrosa pela disponibilidade e
confiança no meu trabalho, ensinando a importância de se trabalhar em equipe e
dentro dos planos.
As minhas filhotas IC’s, Renata de Carvalho, Laise Cerqueira e
Mariana Farias por terem tido toda essa paciência comigo, me suportando nos
altos e baixos, nos meus devaneios e hipóteses malucas, minhas tentativas de
ajuda e por todo o apoio.
Ao meu grupo de pesquisa em nanotecnologia, Alaine, Arthur, Lannya,
Tábata, Edilamar, Ednaldo e tantos outros que já concluíram sua passagem pelo
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grupo e deixaram um pouco deles em mim, para que eu possa crescer cada dia
mais como um excelente acadêmico.
Aos meus colegas de laboratório por me darem todo o orgulho que eu
poderia ter dentro do laboratório e serem pessoas que eu possa me inspirar e
contar sempre. Por todo o carinho e admiração de cada um, sabendo que
continuarei tendo vocês do meu lado e evoluindo junto comigo. Em especial,
Fiamma Gláucia que num dos momentos mais críticos da minha jornada, foi
muito além de colega de trabalho ou amiga, foi uma mãe, um ser humano de
imenso coração e me ajudou da forma mais especial que uma pessoa poderia
ajudar.
Aos meus parceiros do Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas, por todo o apoio durante essa trajetória.
Aos meus amigos e irmãos CCB, Deus os abençoe, seria impossível citar
todos e desejar tudo que penso, pois me faltam palavras.
A todos aqueles que minha mente consegue alcançar e até aqueles
somente torceram e me deram apoio e não consigo lembrar, o meu mais sincero
e humilde agradecimento. Meu muito obrigado.
8
“Porquanto, ainda que a figueira não floresça, nem haja fruto na vide; o produto da
oliveira minta, e os campos não produzam mantimento; as ovelhas da malhada
sejam arrebatadas, e nos currais não haja vacas, todavia, eu me alegrarei no
Senhor, exultarei no Deus da minha salvação. Jeová, o Senhor, é minha força, e
fará os meus pés como os das cervas, e me fará andar sobre as minhas alturas. ”
Habacuque 3:17-19
9
RESUMO
Envenenamento por serpentes representa um problema de saúde pública
mundial. A pesquisa por novos imunoadjuvantes e vacinas expande as
alternativas terapêuticas e melhoram soros antivenenos. A nanotecnologia é
associada à melhoria do soro do antiveneno, uma vez que as nanopartículas
carregadas com veneno modulam a liberação de proteína e ativam o sistema
imune a produzir anticorpos específicos. As nanopartículas poliméricas são
dispersões coloidais com tamanhos entre 1-1000 nm que são utilizados como
sistemas de administração de fármaco e macromoléculas bioativas. O objetivo
deste estudo foi obter e caracterizar nanopartículas catiônicas biocompatíveis
para o carreamento de proteínas. Nanoparticulas menos que 200 nm de poli
(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) foram produzidas e funcionalizadas com
polietilenimina hiper-ramificada (PEI) usando a técnica de nanoprecipitação. Os
parâmetros físico-químicos avaliados por dispersão de luz dinâmica, medidas de
potencial zeta e morfologia foram monitorados para estabelecer uma formulação
adequada. Foram obtidas partículas de tamanho reduzido (100-200 nm), esféricas
e com eficiência de associação de proteína de aproximadamente 100%. A alta
eficiência de associação da proteína, a eletroforese e os resultados do potencial
zeta demonstraram que a peçonha de Bothrops jararaca foi adsorvida na
superfície da partícula, permanecendo como uma dispersão coloidal estável
durante 6 semanas. Foi observado um perfil de liberação lento seguindo o
mecanismo cinético de difusão parabólica. Os testes in vivo mostraram
capacidade imunoadjuvante das nanopartículas, semelhante ao encontrado com a
utilização de hidróxido de alumínio. Sendo assim, as nanopartículas catiônicas
como veículo para moléculas bioativas foram desenvolvidas com sucesso e
demonstraram-se como um imunoadjuvante promissor e um novo nanocarreador
para a liberação de proteína ou ácidos nucleicos.
Palavras-chaves: Bothrops jararaca, imunoadjuvantes, nanopartículas de poli
(ácido láctico-co-glicólico), nanobiotecnologia
10
ABSTRACT
Snake-envenoming represents a worldwide public health issue. The search for
new immunoadjuvants and vaccines expands the therapeutics alternatives and
improves antivenoms sera. Nanotechnology is associated to antivenom serum
improvement once venom-loaded nanoparticles modulate the protein release and
activating immune response to produce specific antibodies. Polymeric
nanoparticles are colloidal dispersions with particle size between 1-1000 nm which
have been used as drug delivery systems for bioactive macromolecules. The aim
of this study is obtain and characterize biodegradable cationic nanoparticles to
proteins loading. The sub 200 nm poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)
nanoparticles were produced and functionalized with hyper-branched
polyethylenimine (PEI) using the nanoprecipitation technique. The parameters
assessed by dynamic light scattering, zeta potential measurements and
morphology were monitored to establish a suitable formulation. Small-sized (100–
200 nm) and spherical particles with protein association efficiency of about 100%
were reached. The high protein loading efficiency, electrophoresis and zeta
potential results demonstrated that Bothrops jararaca venom were adsorbed on
particle surface, which remained as a stable colloidal dispersion (over 6 weeks). A
slow release protein profile was observed admitting the release kinetics by
parabolic diffusion. The in vivo studies showed immunoadjuvant ability of the
nanoparticles, similar to that found to aluminum hydroxide. Thus, the cationic
nanoparticles as carrier to bioactive molecules was successfully developed and
demonstrated to promising immunoadjuvant and a novel nanocarrier for protein or
nucleic acids release.
Keywords: Bothrops jararaca, immunoadjuvants, PLGA nanoparticles,
nanobiotechnology
11
Lista de figuras
Figura 1. Representação esquemática do processo de obtenção de
nanopartículas pelo método de nanoprecipitação ....................... 20
Figura 2. Representação esquemática da estrutura química do
PLGA............................................................................................ 21
Figura 3. Representação esquemática da estrutura química da
polietilenimina............................................................................... 23
Figura 4. Serpente Bothrops jararaca.......................................................... 25
Figura 5. Diâmetro e potencial zeta (PZ) de nanopartículas poliméricas a
partir da variação da concentração de PLGA............................... 40
Figura 6. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas a partir
da variação da concentração dos
surfactantes................................................................................. 42
Figura 7. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas de
PLGA a partir da variação da razão de PEI:PLGA....................... 44
Figura 8. Determinação do perfil eletroforético de: MM, marcador
molecular; BJ, peçonha de Bothrops jararaca; PEI,
polietilenimina; NPC, nanopartículas catiônicas. Gel corado
com solução de nitrato de prata................................................... 48
Figura 9. Espectros de infravermelho de nanopartículas catiônicas
(NPC), peçonha pura de Bothrops jararaca (BJ) e
nanopartículas associadas a peçonha (NPC+BJ)........................ 50
Figura 10. Imagens topográficas em 2D e 3D obtidas por Microscopia de
Força Atômica e imagens de Microscopia Eletrônica de
Varredura...................................................................................... 52
Figura 11. Estudo de estabilidade física de nanopartículas catiônicas
(NPC); nanopartículas catiônicas associadas a peçonha de
Bothrops jararaca 0,5% (NPC+BJ0,5%); nanopartículas
catiônicas associadas a peçonha de Bothrops jararaca 1,0%
(NPC+BJ1,0%), no período de 45 dias......................................... 54
Figura 12. Perfil de liberação de proteínas in vitro de peçonha de Bothrops
jararaca, em diferentes concentrações (0,5 e 1,0%) associadas
a nanopartículas catiônicas, em função do tempo....................... 55
12
Figura 13. Viabilidade celular de nanopartículas catiônicas em diferentes
concentrações (1,7; 7; 17,5; 35; 70 e 140 µg.mL-1) em células
sanguíneas durante 72 horas.......................................................
58
Figura 14. Taxa de apoptose celular de nanopartículas catiônicas de em
diferentes concentrações (1,7; 7; 17,5; 35; 70 e 140 µg.mL-1)
em células sanguíneas durante 72 horas .................................... 59
Figura 15. Avaliação dos títulos de anticorpos obtidos a partir de animais
imunizados com hidróxido de alumínio (Al(OH)3) e
nanopartículas catiônicas (NPC) associadas a peçonha de
Bothrops jararaca (BJ) em diferentes concentrações (0,5 e
1,0%). a) Densidade óptica na diluição de 1:200, b) Curva de
densidades ópticas em diluição seriada ...................................... 61
13
Lista de Tabelas e Quadros
Tabela 1. Eficiência de Associação de BSA em nanopartículas catiônicas
de PLGA ...................................................................................... 45
Tabela 2. Eficiência de Adsorção da peçonha da serpente Bothrops
jararaca em nanopartículas catiônicas de PLGA......................... 46
Tabela 3. Tratamento matemático para o estudo da liberação de
proteínas in vitro .......................................................................... 56
Tabela 4. Médias das absorbâncias das diluições dos títulos de
anticorpos produzidos pelos animais durante o protocolo de
imunização.................................................................................... 61
Quadro 1. Distribuição dos grupos de animais experimentais que foram
imunizados com peçonha de Bothrops jararaca e peçonha de
Bothrops jararaca associado ás nanopartículas funcionalizadas
de PLGA e ao hidróxido de alumínio. N=49 animais para cada
peçonha, 7 por grupo.................................................................... 38
14
Lista de abreviaturas e siglas
BCA: Ácido Bicincronínico
BJ: Bothrops jararaca
BSA: Bovine Serum Albumin / Albumina bovina sérica
CP: Grupo Controle
CMSP: Células mononucleares do sangue periférico
Da: Dalton
EA: Eficiência de Associação
FA: Fase aquosa
FO: Fase orgânica
FTIR: Fourrier Transform Infrared/ Infravermelho por transformada de Fourrier
kDA: Kilodalton
MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura
MFA: Microscopia de Força Atômica
MM: Marcador molecular
MP: Massa de proteína
MPD: Massa de proteína dissolvida
MPt: Massa de proteína determinada
NPC: Nanopartículas catiônicas
P188: Poloxâmero 188
P407: Poloxâmero 407
PEI: Polietilenimina
pKa: Logaritmo negativo da constante de acidez
PLA: Poli (ácido lático)
PLGA: Poli (ácido lático-co-ácido glicólico)
PZ: Potencial zeta
r2: Coeficiente de determinação
rpm: Rotações por minuto
s.c.: Via de administração subcutânea
SAB: Soro antibotrópico
SDS-PAGE: Dodecil sulfato de sódio e Gel de poliacrilamida
15
Sumário
1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 17
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................... 19
2.1 Obtenção de nanopartículas poliméricas por nanoprecipitação ....... 19
2.2 Poli (ácido lático-co-ácido glicólico) ..................................................... 21
2.3 Funcionalização das nanopartículas com polietilenimina ................. 22
2.4 Acidentes ofídicos ................................................................................... 23
2.5 Serpente Bothrops jararaca ................................................................... 24
2.6 Imunização passiva – Soroterapia ......................................................... 25
3. OBJETIVOS .............................................................................................. 28
3.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 28
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 28
4. JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 29
5. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 30
5.1 Equipamentos, materiais e reagentes químicos .................................. 30
5.1.1 Materiais e reagentes químicos ................................................................ 30
5.1.2 Equipamentos ........................................................................................... 30
5.2 Obtenção das nanopartículas de PLGA ................................................ 31
5.3 Preparação das nanopartículas de PLGA-PEI ...................................... 32
5.4 Incorporação de albumina sérica bovina (BSA) ................................... 32
5.5 Incorporação da peçonha de Bothrops jararaca .................................. 32
5.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida ................................................... 33
5.7 Caracterização das nanopartículas ....................................................... 33
5.7.1 Determinação do tamanho de partícula e do potencial zeta ..................... 33
5.7.2 Eficiência de incorporação de proteínas ................................................... 34
5.7.3 Microscopia de Força Atômica (MFA) ....................................................... 34
5.7.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ....................................... 34
5.7.5 Análise de espectroscopia na região do infravermelho -
Infravermelho Transformado de Fourier (FTIR – ATR) ...................
35
5.8 Testes de performance ........................................................................... 35
5.8.1 Estudo de estabilidade física ........................................................... 35
5.7.2 Estudo de liberação in vitro ....................................................................... 35
5.7.3 Estudo de biocompatibilidade in vitro......................................................... 36
16
5.9 Testes in vivo ........................................................................................... 37
5.9.1 Animais ...................................................................................................... 37
5.9.2 Obtenção dos soros................................................................................... 37
5.9.1.1 Avaliação dos títulos de anticorpos por ELISA (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay)..........................................................................
38
5.10 Análise estatística ................................................................................... 39
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 39
6.1 Efeito da variação da concentração do polímero, no tamanho da
partícula............................................................................................ 39
6.2 Efeito da variação da concentração do surfactante, no tamanho da
partícula .................................................................................................... 41
6.3 Efeito da variação do agente funcionalizante, no tamanho da
partícula .................................................................................................... 43
6.4 Incorporação de proteínas em nanopartículas catiônicas de PLGA. 45
6.5 Morfologia das nanopartículas .............................................................. 51
6.6 Estudo de estabilidade física ................................................................. 53
6.7 Ensaio de liberação de proteínas in vitro ............................................ 55
6.8 Viabilidade celular ................................................................................... 57
6.9 Determinação de títulos de anticorpos ................................................ 60
7. CONCLUSÕES .................................................................................. 63
REFERÊNCIAS ............................................................................... 65
17
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, o Ministério da Saúde atribui um perfil de 135.000 casos
anualmente de acidentes com animais peçonhentos. Apesar das subnotificações
e falta de atualização dos registros em âmbito nacional, dados fornecidos pelo
Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) em 2016 mostraram o
registro de 172.412 acidentes, sendo os ataques por serpentes responsáveis por
26.295 ocorrências. O gênero Bothrops destaca-se como responsável por mais de
70% dos acidentes ofídicos registrados e a espécie Bothrops jararaca é
responsável pela maioria dos óbitos (SINAN, 2016).
No contexto da associação de nanocarreadores à proteínas (MESQUITA et
al., 2017; ROCHA SOARES et al., 2012), as nanopartículas podem ser
direcionadas para liberação modificada dessas biomoléculas e serem utilizadas
na produção de soros antiveneno, através de imunização ativa de animais, ou até
mesmo em pesquisas de vacinas contra envenenamento por animais
peçonhentos (WAGHMARE et al., 2014).
A aplicação de nanotecnologia tem se ampliado gradativamente com o
avançar dos anos. Através da indústria farmacêutica, produtos nanoparticulados
já são oferecidos para aplicação biomédica desde 1995 (WEISSIG; PETTIGER;
MURDOCK, 2014) como alternativa para terapias tradicionais. Os sistemas de
liberação de fármacos e biomoléculas são capazes de promover uma liberação
modificada de acordo com o período de tempo que se deseja a ação da
substância ativa. Uma vez que nanopartículas se encaixam como um dispositivo
para liberação modificada, outras funcionalidades têm sido associadas aos
sistemas para melhorar a eficácia terapêutica e diminuir os efeitos tóxicos(DE
CROZALS et al., 2016).
Quando a superfície das nanopartículas são funcionalizadas, a sua
performance é melhorada em testes in vitro e in vivo. Pesquisas, utilizando
materiais nanobiodegradáveis funcionalizados, têm aumentado nos últimos anos.
Nanopartículas, funcionalizadas para associação de biomoléculas, podem ser
direcionadas a tecidos/células-alvo (HU et al., 2017; WANG et al., 2016) e são
capazes de aumentar a internalização celular de substancias carreadas (HASHAD
et al., 2017; SANTOS-SILVA et al., 2017) e/ou interferir na modulação do sistema
18
imune (DOBROVOLSKAIA; SHURIN; SHVEDOVA, 2016; NAIT MOHAMED;
LARABA-DJEBARI, 2015).
Alguns estudos têm demonstrado uma importante interação entre
nanomateriais e sua capacidade de estimular e/ou suprimir as respostas imunes
(LIU et al., 2016). A compatibilidade das nanopartículas frente ao sistema
imunológico é determinada principalmente pelas propriedades da superfície. O
tamanho da partícula, a forma, a composição, a ligação às proteínas e as rotas de
administração parecem ser os principais fatores que contribuem para estas
interações com o sistema imunológico (NAJAFI-HAJIVAR et al., 2016).
Diante do exposto, o presente trabalho consiste na obtenção de
nanopartículas biodegradáveis e biocompatíveis funcionalizadas com carga
positiva para a liberação modificada de peçonha de Bothrops jararaca. Desta
forma, pode-se inferir que seja possível empregar nanopartículas com o objetivo
de fornecer pequenas quantidades de peçonha em longa exposição no
hospedeiro a fim de que seja viável a indução de uma resposta imune adequada.
Com o sucesso das etapas experimentais pretende-se aumentar a
imunogenicidade da peçonha, observar a eficiência de internalização celular e
estudar os mecanismos de imunização envolvidos com a aplicação do sistema em
modelo in vivo.
19
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
As nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos ou
biomoléculas, medidos em escalas nanométricas que têm sido amplamente
aplicadas na administração por via parenteral. Por apresentarem diâmetro médio
entre 1-1000 nm, as nanopartículas são consideradas dispersões coloidais. Esses
sistemas são de grande interesse em diversos ramos das ciências médicas,
desde o diagnóstico até o tratamento de doenças (CHEN; YIN, 2014; MASOOD,
2016). Características como estabilidade, tamanho de partícula, forma da
partícula, sua carga de superfície, porosidade, perfil de liberação e o tipo de
funcionalização para tecidos/células-alvo, são propriedades que precisam ser
conhecidas sobre as nanopartículas para aplicação biomédica (TANG et al.,
2016).
2.1 Obtenção de nanopartículas poliméricas por nanoprecipitação
O desenvolvimento de nanopartículas para carreamento de substâncias
tem se mostrado promissor para o delineamento de sistemas de liberação
modificada de fármacos e biomoléculas. O avanço nas pesquisas com
biomateriais têm mostrado a biocompatibilidade e biodegradabilidade de alguns
polímeros utilizados em dispersões coloidais para vetorização, liberação
tecido/célula-específica, aumento da estabilidade, solubilidade e permeabilidade
de moléculas bioativas em barreiras biológicas (CHEN; YIN, 2014; KAMALY et al.,
2013; TANG et al., 2016). Diversos métodos vêm sendo desenvolvidos para a
preparação de nanopartículas poliméricas. Estes métodos podem ser
classificados em duas categorias principais: métodos que envolvem uma reação
de polimerização e métodos que envolvem o uso de um polímero solúvel ou
insolúvel já formado (PINTO REIS et al., 2006). A obtenção de nanopartículas
através da polimerização de monômeros pode apresentar algumas desvantagens,
como a presença de resíduos dos reagentes, que podem ser tóxicos. A partir de
polímeros insolúveis formados, as nanopartículas podem ser preparadas por
diversas técnicas como emulsificação com evaporação de solvente, emulsificação
com difusão do solvente, nanoprecipitação e salting-out, e as partículas obtidas
20
podem ser nanoesferas ou nanocápsulas. (FECZKÓ et al., 2011; MISHRA;
PATEL; TIWARI, 2010; MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010, 2011).
Em 1989, Fessi e colaboradores desenvolveram o método da
nanoprecipitação (Figura 1), também conhecido como deslocamento de solvente.
Esta técnica é bastante aplicada na obtenção de sistemas nanoparticulados, pois
é um método reprodutível, rápido e que obtém partículas entre 50-300nm. O
processo consiste na precipitação interfacial do polímero insolúvel dissolvido em
um solvente orgânico, miscível em água. Durante adição da fase orgânica na
solução aquosa, a rápida difusão do solvente pela água forma um sistema
coloidal que se estabiliza com ajuda de tensoativos presentes na fase aquosa. O
mecanismo de formação da nanopartícula pode ser entendido pela interação
entre água-solvente, água-polímero e solvente-polímero, pois durante a dispersão
da fase orgânica na fase aquosa, o solvente hidrofílico difunde rapidamente
carregando consigo o polímero ainda solubilizado. A medida que ocorre a difusão
pela água, o polímero que é insolúvel, precipita em vários locais e em diferentes
formatos, tanto em tamanhos nanométricos como micrométricos (BECK-
BROICHSITTER et al., 2010; DI PASQUALE; MARCHISIO; BARRESI, 2012;
FESSI et al., 1989; GALINDO-RODRÍGUEZ et al., 2005).
Figura 1: Representação esquemática do processo de obtenção de nanopartículas pelo método
de nanoprecipitação.
Em geral esse método é utilizado para encapsular moléculas hidrofóbicas,
mas é possível introduzir variações na mesma para a encapsulação de moléculas
21
hidrofílicas (MORALES-CRUZ et al., 2012). O tamanho e a estabilidade das
partículas obtidas por esse método são influenciados por parâmetros que devem
ser otimizados, como a razão de fase aquosa e fase orgânica, concentração de
tensoativo, forma de adição da fase orgânica na fase aquosa, o tempo de
evaporação do solvente, concentração do polímero e o tipo de solvente utilizado
(DI PASQUALE; MARCHISIO; BARRESI, 2012; MORA-HUERTAS; FESSI;
ELAISSARI, 2011).
2.2. Poli (ácido lático-co-ácido glicólico) - PLGA
Existem diversos polímeros que podem ser utilizados na obtenção de
nanocarreadores. Dentre eles, o poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) é
um copolímero (poliéster alifático) biodegradável, amplamente utilizado na
indústria farmacêutica para sistemas de liberação de fármacos, aprovado pelo US
Food and Drug Administration (FDA). Este copolímero é composto por
monômeros de ácido láctico e ácido glicólico (Figura 2). Este polímero possui
características interessantes que incluem a sua alta estabilidade, a fácil
modificação química de seus monômeros, a biocompatibilidade e
biodegradabilidade. Os monômeros de ácido láctico e ácido glicólico são
produzidos através da erosão superficial da partícula por meio de hidrólise
enzimática. Estes monômeros são utilizados em rotas bioquímicas, como o Ciclo
de Krebs, sendo totalmente eliminado do organismo na forma de dióxido de
carbono e água (BIKIARIS, 2013). A substância encapsulada pode ser protegida
pelo polímero, através de uma rede de polímero que dificulta a sua degradação
(JAVADZADEH et al., 2010; MASOOD, 2016; ZHANG et al., 2014)
Figura 2: Representação esquemática da estrutura química do PLGA; a) monômero de ácido
glicólico e b) monômero de ácido láctico.
22
2.3 Funcionalização das nanopartículas com polietilenimina
No uso de nanopartículas para melhoramento terapêutico, é possível
funcionalizar a superfície adicionando uma carga positiva a partícula promovendo
um comportamento de sistemas furtivos e aumentar a internalização celular por
endocitose (SPERLING; PARAK, 2010; WU et al., 2012). Além disso, a superfície
positiva permite interação com biomoléculas negativas ou especificamente com
resíduos de aminoácidos ionizados com carga negativa.
O uso de nanopartículas funcionalizadas tem demonstrado uma estratégia
promissora para o direcionamento intracelular de fármacos e biomoléculas. Os
polímeros catiônicos utilizados para esta finalidade apresentam uma série de
aplicações. Dentre elas, é importante destacar a capacidade que os polímeros
têm de complexar com biomoléculas, e a bioatividade inerente ao polímero, capaz
de produzir um aumento da eficácia terapêutica ou aumento de resposta para
diferentes atividades biológicas. Exemplos de atividade de polímeros catiônicos
são o estimulo ou inibição do sistema imunológico (DOBROVOLSKAIA; SHURIN;
SHVEDOVA, 2016), atividade antimicrobiana, antioxidante, antitumoral,
antiinflamatória, transfecção gênica e adsorção de peptídeos (LEE et al., 2014;
LOHCHAROENKAL et al., 2014; MESQUITA et al., 2017; ZHANG et al., 2016).
Os policátions têm sido compostos eficientes para funcionalizar superfície
de partículas, tornando os nanocarreadores excelentes sistemas de liberação.
Dentre esses polímeros catiônicos, a polietilenimina (PEI) (Figura 3) é um
policátion de alta densidade de carga positiva que pode apresentar-se
comercialmente com cadeias carbônicas lineares ou ramificadas e disponível em
diferentes massas molares. A PEI linear contém apenas aminas secundárias
enquanto a unidade monomérica do PEI ramificado contém aminas secundárias,
primárias e terciárias na proporção 1:2:1, respectivamente. A gama de massas
molares de PEI ramificada disponíveis comercialmente é 0.7-800 kDa, sendo o
pKa das suas aminas primárias 5.5. Por outro lado, PEI linear está disponível com
pesos moleculares 22 -220 kDa, sendo o pKa das aminas primárias semelhante
ao do PEI ramificado (PARK; SHIN; OH, 2008; XIAO et al., 2012).
23
Figura 3: Representação esquemática da estrutura química da polietilenimina.
Esse polímero é um policátion solúvel em água e em solventes orgânicos
polares. Apresenta elevada densidade de carga devido aos seus grupamentos
amina secundária e terciária protonáveis com pKa próximo do pH
endossomal/lisossômico. Devido essas características, este policátion exibe alta
capacidade de tamponamento de pH em uma ampla faixa de pH. Essa
propriedade tamponante promove citotoxicidade no uso da PEI (KIM et al., 2016;
WANG et al., 2016). A PEI tem sido usada como ligante para adsorver
biomoléculas de interesse terapêutico devido às interações eletrostáticas
possíveis entre as diferentes cargas encontradas em ambas as macromoléculas.
(MESQUITA et al., 2017; SAMAL et al., 2012; WANG et al., 2016).
2.4 Acidentes ofídicos
No Brasil, estima-se um perfil de 135.000 casos anuais de acidentes com
animais peçonhentos. Em 2016, o Sistema de Informação de Agravos de
Notificação (SINAN) registrou 172.412 acidentes, na qual os ataques por
serpentes contribuem com 26.295 ocorrências e um percentual de letalidade de
0,49%. As regiões com maior incidência de acidentes ofídicos foram o Norte e o
Nordeste acumulando 58,2% dos ataques registrados (SINAN, 2016). Esses
valores também podem ser extrapolados, uma vez que as notificações de
acidentes por animais peçonhentos ainda não é uma prática comum em regiões
de risco, existindo a subnotificação que são os acidentes que ocorrem, mas não
são registrados. Outro fator são as notificações excessivas de casos
desconhecidos e encaixados em acidentes ofídicos.
24
Existem cerca de 300 espécies de serpentes peçonhentas distribuídas pelo
mundo (SUNTRAVAT; NUCHPRAYOON; PÉREZ, 2010) e no território brasileiro
há o predomínio de 4 principais gêneros: Bothrops, Crotalus, Micrurus e Lachesis.
Dentre esses gêneros, o Bothrops destaca-se como responsável por mais de 70%
dos acidentes ofídicos registrados e a espécie Bothrops jararaca é responsável
pela maior causa de morte. Essa espécie é encontrada com mais frequência na
região sul do Brasil e apresenta taxa de letalidade em torno de 80 óbitos (SINAN,
2016). O envenenamento por Bothrops jararaca também é considerado um
preocupante fator de interesse público devido ao percentual de letalidade e
morbidade das vítimas, incluindo as sequelas.
2.5 Serpente Bothrops jararaca
A Bothrops jararaca (Figura 4) é uma das 60 espécies do gênero Bothrops
encontradas no Brasil. Estas serpentes geralmente apresentam uma cauda lisa
com ausência de chocalho e dependendo da região que forem encontradas,
podem apresentar diversas cores (BRASIL, 2001, 2009). A peçonha da Bothrops
jararaca é composta por uma mistura complexa de componentes como fosfolipase
A2, metaloproteases, serinoproteases, L-aminoácido oxidase, lectina do tipo C,
hialunoridase, nucleotidase, carboxipeptidase, fosfolipase B, dipeptidase,
glutaminil ciclotrasnferase, fosfodiasterase, fatores de crescimento e CRISP
(Cysteine Rich Secretory Protein) (ZELANIS et al., 2016).
As principais atividades relatadas da peçonha é apresentar alta capacidade
coagulante, hemorrágica e proteolítica. O efeito local da picada é caracterizado
principalmente pela presença de dor, edema e formação de bolhas que podem
evoluir para necrose. Os efeitos sistêmicos incluem vômitos, hipotensão arterial e
hemorragias que podem evoluir para choque e óbito (CARDOSO et al., 2003;
SANDRIN; PUORTO; NARDI, 2005).
25
Figura 4. Serpente Bothrops jararaca. (Fonte: Adaptado de GONÇALVES-MACHADO et al.,
2016)
2.6 Imunização passiva - Soroterapia
A imunização passiva consiste na inoculação de imunoglobulinas (Igs),
específicas ou poliespecíficas, no intuito de proteger os organismos, humanos ou
animais, de infecções e/ou doenças. Um exemplo fisiológico natural de
imunização passiva que podemos destacar é o período de lactação dos
mamíferos, quando o leite da mãe é composto por Igs capazes de proteger o
recém-nascido contra doenças entéricas ou outras doenças (HURLEY; THEIL,
2011). No que diz respeito à proteção contra toxinas, a imunização passiva
consiste na utilização de soro/anticorpos de animais já imunizados para o
tratamento de acidentes letais como infecções por tétano ou picadas de cobra.
Em casos de acidentes ofídicos, o tratamento adotado é a soroterapia com
antiveneno poliespecífico. Na produção de soros antiveneno, geralmente utiliza-se
animais de grande porte, como equinos, que são submetidos a hiper-imunização
de antígeno referente à produção do soro. Quando imunizado com a peçonha de
apenas uma espécie de serpente, o soro antiveneno é considerado
monoespecífico. Por outro lado, quando o animal recebe um inóculo de várias
espécies de serpentes, o soro antiveneno é considerado poliespecífico
(GUTIÉRREZ et al., 2013).
O soro antibotrópico (SAB), usado na soroterapia para acidentes com
serpentes do gênero Bothrops, é um imunobiológico poliespecífico produzido pela
inoculação em equinos. A formulação utilizada no protocolo de hiper-imunização
dos animais, é produzida a partir de peçonhas de 5 espécies de serpentes do
26
gênero Bothrops em quantidades relativas de 50% B. jararaca e 12,5% das
demais: B. alternatus, B. jararacussu, B. moojeni, B. neuwiedi (CARDOSO et al.,
2003; ESTEVAO-COSTA et al., 2016).
Após o estímulo antigênico, promovido pela imunização com a mistura das
peçonhas, o plasma dos cavalos é obtido e submetido a um processo de
purificação e fracionamento para obtenção de moléculas ativas. De acordo com o
protocolo de purificação utilizado, pode-se obter 3 tipos de moléculas antiveneno:
imunoglobulina G (IgG) íntegra, fragmentos F(ab’)2, ou Fab da IgG. Para aumentar
a estabilidade do soro, o produto obtido após o processo pode ser congelado
(GUTIÉRREZ; LEÓN; BURNOUF, 2011)
Soros antiveneno devem ser seguros e efetivos para uso em humanos e
animais. Sua eficácia deve ser demonstrada por meio de ensaios que atendam
aos requisitos de níveis pré-clínicos e clínicos (WHO, 2010).
Embora o uso do soro apresente protocolos já consolidados para terapia,
os estudos em busca de vacinas contra envenenamentos continuam avançando.
No intuito de aumentar a resposta imune do organismo, já é comprovado que
alguns compostos, quando associados ao inóculo, são capazes de elevar a
resposta imune e essa característica de compostos como os imunoadjuvantes,
que podem ser sintéticos ou naturais. Tais componentes são importantes para
antígenos que possuem baixa imunogenicidade, porém existe a desvantagem de
apresentarem diversos efeitos adversos (RYAN; DOWNES; ISBISTER, 2015). Em
vacinas, o principal imunoadjuvante utilizado e aprovado para uso em humanos é
o hidróxido de alumínio, devido este componente apresentar alto poder
inflamatório. Com isso, diversos estudos em busca de novos imunoadjuvantes
apontam alguns biomateriais poliméricos como sistemas promissores quando
utilizados em escalas nanométricas (ANDRIANOV & MUTWIRI, 2012, SOARES et
al., 2012).
Desta forma, o desenvolvimento de formulações que possibilitam aumentar
a eficácia na produção dos soros antiveneno é de grande importância para a
saúde pública e inovação em saúde. Uma vez que a qualidade do soro seja igual
ou superior aos que já são obtidos, a estratégia de utilizar nanocarreadores como
moduladores de resposta imune utilizando menores quantidades de ativo, torna-
se uma alternativa na produção de antiveneno. O dados e resultados obtidos
27
desse trabalho, podem auxiliar no entendimento da vetorização e aumento da
eficácia de biomoléculas, assim como ampliar as possibilidades do uso dessas
estratégias na vinculação de outras proteínas de interesse terapêutico.
28
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Desenvolver nanopartículas de poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA),
funcionalizadas com o polietilenimina (PEI) pela técnica de nanoprecipitação, para
a adsorção da peçonha da serpente Bothrops jararaca.
3.2 Objetivos Específicos
Obter nanopartículas à base de PLGA por nanoprecipitação;
Funcionalizar a superfície das nanopartículas com polietilenimina;
Incorporar peçonha de Bothrops jararaca às nanopartículas;
Fazer a caracterização fisico-química das nanopartículas obtidas;
Avaliar performance in vitro das nanopartículas por meio de:
o Estudo de liberação in vitro da peçonha;
o Estudo de biocompatibilidade in vitro das nanopartículas;
o Estudo de estabilidade física;
Avaliar performance in vivo por meio de:
o Imunização de camundongos Balb/c;
o Determinação dos títulos de anticorpos.
29
4. JUSTIFICATIVA
O envenenamento por Bothrops jararaca é considerado um preocupante
fator de saúde público devido ao percentual de letalidade e morbidade das
vítimas, além do reflexo de sequelas que podem perpetuar pelo resto das vidas
dessas vítimas. A soroterapia é a única forma de tratar pacientes de acidentes
ofídicos. Para tanto, há a necessidade de estudos em busca de alternativas que
aumentem as possibilidades de tratamento para as vítimas por picadas de
animais peçonhentos. Existem vários estudos com foco na produção e
caracterização de nanocarreadores associando biomoléculas. Esses sistemas são
aplicados em diversas áreas da terapêutica, porém quando se analisa a aplicação
para o uso na associação com peçonhas, a utilização para imunização é escassa.
Este trabalho apresenta um forte caráter de inovação na produção de produtos
biotecnológicos, especialmente na obtenção de soros para tratamento de
envenenamentos com imunobiológicos envolvendo antiveneno. Considerando o
emprego do polímero biocompatível e biodegradável, o PLGA, como base
matricial de um nanocarreador com propriedades imunoadjuvantes para
veiculação da peçonha da serpente da espécie Bothrops jararaca, será possível
construir uma plataforma de estudo e aplicação dessa formulação para a
obtenção de novos soros contra as toxinas presentes nas peçonhas desses
animais peçonhentos, além da possibilidade de ampliação para a imunização de
animais com outros antígenos.
30
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Equipamentos, materiais e reagentes químicos
5.1.1 Materiais e reagentes químicos
Acetona – Qhemis (São Paulo, BRA)
Acrilamida – Biosystems (Barcelona, ESP);
Albumina bovina sérica (BSA) - Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA.);
D,L-PLGA 50:50 (lactico:glicólico) (viscosidade inerente 0.63 dL g-1 a 30°
C) - Birmingham Polymers Inc. (Pelham, AL, EUA);
Dodecil Sulfato de sódio (SDS) - Biosystems (Barcelona, ESP)
Hidróxido de alumínio - Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA.);
Kit BCA Protein Assay - Pierce Biotechnology (Woburn, MA, EUA);
Kit de ELISA para IgG total para camundongos – eBioscience (San Diego,
CA, EUA);
Kit FITC Annexin V – Becton Dickinson Bioscience (San Jose, CA, EUA)
Marcadores de peso molecular para eletroforese ColorBurst (St. Louis, MO,
EUA.);
Polietilenimina ramificada de massa molecular 25.000 Da - Sigma-Aldrich
Co. (St. Louis, MO, EUA.);
Peçonha da serpente Bothrops jararaca (Instituto Butantan, SP)
Poloxâmero 188 - Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA.);
Poloxâmero 407 - Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA.).
5.1.2 Equipamentos
Analisador de potencial zeta e tamanho de partícula, NanoBook ZetaPlus c/
aparato 90Plus/BIMAS – Brookhaven Instr. (EUA);
Balança analítica Gehaka, AG-200
Banho termostático modelo SL-150/22, Solab;
Centrífuga 5804R - Eppendorf® (Alemanha);
Espectrofotômetro UV visível Thermo Fisher Scientific, Evolution 60S;
31
Infravermelho Transformado de Fourier (FTIR – ATR) - SHIMADZU IR
Prestige 21 (Japão);
Leitora de microplaca Epoch ™ Microplate Spectrophometer – BioTek
(EUA);
Microscópio de Força Atômica (MFA), SPM – 9700 - Shimadzu (Japão);
pHmetro Gehaka, PG 1800;
Sistema purificador de água por osmose reversa, modelo OS50 LX –
Gehaka (Brasil);
Vidrarias analíticas.
5.2 Obtenção das nanopartículas de PLGA
Inicialmente, as nanopartículas de PLGA foram obtidas pelo método
nanoprecipitação. Através desta técnica, concentrações de polímero e
surfactantes poliméricos (poloxameros 407 e 188) foram variadas a fim de
melhorar os parâmetros de obtenção das nanopartículas como o tamanho e
eficiência de incorporação. O polímero teve variação entre 0,25% a 1,25% (p/v) e
os surfactantes tiveram variação entre 0,25% - 2,0% (p/v). Para obtenção, o
polímero foi solubilizado em um solvente orgânico (acetona) formando a fase
orgânica (FO). Os surfactantes foram solubilizados com água, separadamente,
formando a fase aquosa (FA). As soluções orgânicas contendo polímero foram
filtradas em membrana de nylon com tamanho de poro de 0,22 µm, da marca
Maxcrom OEM, e as soluções aquosas contendo o surfactante foram filtradas
utilizando membrana de acetato de celulose com tamanho de poro de 0,45 µm
Milipore®. A solução orgânica foi injetada na fase aquosa na proporção de 3:7
(FO/FA) em fluxo contínuo de aproximadamente 1 ml.min-1, utilizando uma agulha
de calibre 25x0,7 mm. Após injeção da fase orgânica na fase aquosa, os sistemas
foram acondicionados a uma temperatura de 25°C, por um período de 24 horas,
sob agitação magnética constante na velocidade de 720 rpm. A otimização
consistiu na escolha da melhor concentração para o polímero na solução orgânica
e melhor concentração de surfactante na fase aquosa.
32
5.3 Preparação das nanopartículas de PLGA funcionalizadas com PEI
A formulação contendo 0,5% (p/v) de poloxâmero 407 e 0,75% (p/v) de
PLGA foi considerada a melhor condição experimental da seção 5.2, capaz de
produzir partículas com distribuição de tamanho uniforme inferiores a 200nm. Esta
formulação foi selecionada para a etapa de funcionalização com PEI em
diferentes proporções. O agente funcionalizante foi adicionado a fase orgânica
juntamente com o polímero e foram testadas diferentes razões de PEI:polímero
(1:5, 1:10 e 1:15) (p/p). Ao final desta etapa é esperada a obtenção de partículas
com distribuição de tamanho uniforme menores que 200 nm e com potencial zeta
positivo.
5.4 Incorporação de albumina sérica bovina (BSA)
A formulação de nanopartículas utilizando 0,75% (p/v) de PLGA, 0,5% (p/v)
de poloxâmero 407 e a razão 1:5 (p/p) de PEI:PLGA, foi selecionada para
incorporação de albumina sérica bovina (BSA) em diferentes concentrações - 0,5
e 1,0% (p/v) - em relação a massa do polímero. Para obter um volume final de 8
mL de nanopartículas com a proteína incorporada, foi utilizado 2 mL da
suspensão de nanopartículas catiônicas e completou-se o volume com água
purificada. Sob agitação magnética de 720 rpm, as soluções de BSA contendo
1mg/mL foram adicionadas a estas amostras, que ficaram sob agitação por 1 hora
a 22°C ±2, em um sistema fechado para evitar possível evaporação da fase
aquosa. Ao final desta etapa, é esperada a obtenção de partículas carreadas com
albumina para serem utilizadas como sistemas modelo para a incorporação da
peçonha.
5.5 Incorporação da Peçonha de Bothrops jararaca
A formulação de nanopartículas utilizando 0,75% (p/v) de PLGA, 0,5% (p/v)
de poloxâmero 407 e a razão 1:5 (p/p) de PEI:PLGA, foi selecionada para a
incorporação da peçonha de Bothrops jararaca em diferentes concentrações - 0,5
e 1,0% (p/v) - em relação a massa do polímero. Para obter um volume final de 8
33
mL de nanopartículas com peçonha incorporado, foi utilizado 2 mL de
nanopartículas catiônicas e completou-se o volume com água ultrapura. Sob
agitação magnética de 720 rpm, as soluções de peçonha contendo 1mg/mL foram
adicionadas a estas amostras, que ficaram sob agitação por 1 hora a 22°C ±2, em
um sistema fechado para evitar possível evaporação da fase aquosa. Ao final
desta etapa é esperada a obtenção de partículas carreadas com peçonha para
serem utilizadas nos estudos de caracterização físico-químicos e performance in
vitro e in vivo.
5.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida
O perfil eletroforético da peçonha de B. jararaca, nanopartícula branca, PEI
e nanopartícula associada a peçonha, foram determinados por eletroforese em
gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), de acordo com
Laemmli (1970) utilizando-se o sistema de minigel (Mini-ProteanTM II) (LAEMMI,
1970). As amostras foram misturadas ao tampão de amostra SDS-PAGE com
redução, fervidas durante 5 minutos e aplicadas ao gel. A eletroforese foi
desenvolvida verticalmente, em placas de dimensão 10,0 x 8,0 x 0,8cm, à
180V, 24 mA, durante 3 horas. A massa molecular relativa das proteínas foi
determinada em gel de poliacrilamida, por comparação da migração eletroforética
de uma mistura de proteínas padrão, obtida comercialmente. O gel obtido foi
corado em solução de Prata (MORRISSEY, 1981).
5.7 Caracterização das nanopartículas
5.7.1 Determinação do tamanho de partícula e do potencial zeta
O diâmetro das partículas foi determinado usando a técnica de
espalhamento de luz (Dynamic Light Scattering) num modelo de analisador
NanoBrook 90Plus (Brookhaven Instruments Corp.) do Laboratório de
Biopolímeros - Biopol, do Centro de Biociências da UFRN. A análise de potencial
zeta foi feita pelo mesmo equipamento através da mobilidade eletroforética
usando o sistema Zeta-Meter a temperatura de 25 ± 2ºC. Para isso, cada sistema
34
teve sua viscosidade e índice de refração conferidos, adequando-se para análise
quando injetados no equipamento.
5.7.2 Eficiência de incorporação de proteínas
As nanopartículas funcionalizadas contendo tanto albumina quanto
peçonha de Bothrops jararaca foram centrifugadas a 16.000 x g a 4°C por 30
minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e submetido a
análise de proteínas usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA através do método
ácido bicincronínico. O ensaio foi feito em triplicatas, utilizando BSA como
controle, e a eficiência de associação (EA) das proteínas foram calculadas
usando a seguinte equação:
Equação1
5.7.3 Microscopia de Força Atômica (MFA)
A forma e o tamanho das nanopartículas foram observados usando
imagens MFA. As dispersões foram previamente secas sob dessecador durante
24 horas. As medições foram realizadas utilizando MFA (SPM - 9700, Shimadzu)
a 25ºC em cantilever sem contato, digitalização de 1 Hz.
5.7.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Para a obtenção das imagens por MEV, as amostras foram preparadas
espalhando uma gota da dispersão de nanopartículas numa fita de carbono do
microscópio, mantidas em 24h no dessecador utilizando um Microscópio SSX550,
Shimadzu, Tóquio, Japão.
35
5.7.5 Análise de espectroscopia na região do infravermelho - Infravermelho
Transformado de Fourier (FTIR – ATR)
As análises espectroscópicas na região do infravermelho foram realizadas
com o objetivo de investigar o nível de interação do fármaco com os componentes
estruturais dos sistemas obtidos em fase sólida ou de possíveis alterações
químicas dos componentes dos sistemas obtidos. Para isso, foram obtidos os
espectros de absorção na região do infravermelho dos componentes estruturais
isolados e, posteriormente, dos diferentes sistemas obtidos, assim como das
respectivas misturas físicas de mesma composição. O equipamento utilizado foi
um Infravermelho Transformado de Fourier (FTIR), SHIMADZU IR Prestige 21. Os
espectros foram registados em 20 varreduras e a uma resolução de 4 cm-1 em
números de onda entre 5000 e 700 cm-1.
5.8 Testes de performance
5.8.1 Estudo de estabilidade física
O estudo de estabilidade física foi realizado para nanopartículas
funcionalizadas (catiônicas), contendo ou não peçonha da serpente Bothrops
jararaca. As análises foram feitas durante o período de 45 dias avaliando o
tamanho médio, potencial zeta e índice de polidispersão conforme o item 5.7.1.
As dispersões foram acondicionadas em geladeira na temperatura de 5 °C ± 2.
5.8.2 Estudo de liberação in vitro
Para determinar o perfil de liberação in vitro das proteínas, as
nanopartículas catiônicas contendo a peçonha da serpente Bothrops jararaca
foram incubadas em solução tampão fosfato pH = 7,4 (KH2PO4 0,05 mol/L) e
mantidas em banho termostatizado à 37 °C ± 0,2 °C, em condição sink, em um
volume final de 1 mL. Em intervalos de tempo pré-determinados, as
nanopartículas foram centrifugadas a 16000 x g a 4,0 °C por 30 min e o
sobrenadante foi retirado para a dosagem de proteínas totais. Novo volume de
36
solução tampão foi adicionado aos tubos de dissolução, os quais foram mantidos
no banho termostatizado até o próximo tempo de coleta. Com auxílio da equação
de regressão linear extraída da curva padrão construída nas mesmas condições
da análise, foi determinado o percentual de massa de proteína dissolvida a partir
da seguinte equação (adaptado de SILVA-JÚNIOR et al., 2008):
Equação2
em que MPD (%) é o percentual de massa de proteína dissolvida, MPt é a massa
de proteína determinada no tempo t e MP, a massa de proteína utilizada no
experimento. A massa percentual acumulada de proteínas da peçonha foi plotada
versus o tempo e diferentes modelos matemáticos foram utilizados para linearizar
os dados experimentais. Os modelos matemáticos aplicados para cinética de
liberação foram: Primeira ordem, Bhaskar, Freundlich e Difusão Parabólica. Como
critério de escolha do modelo que melhor explica o fenômeno de liberação das
proteínas das nanopartículas, foi selecionado o coeficiente de determinação (r2),
para avaliar o ajuste do modelo.
5.8.3 Estudo de viabilidade celular in vitro
Amostras de sangue heparinizadas foram coletadas de pacientes
voluntários saudáveis, assegurados pelo comitê de ética humano com número de
CAAE: 56191416.0.0000.5537. As células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) foram separadas por centrifugação sobre um gradiente de Ficoll-Hypaque
(GE, New Jersey, EUA). As células mononucleares foram ressuspensas em meio
RPMI suplementado com 10% de soro humano AB Rh- (Corning, EUA), 10 mM de
HEPES (Sigma, EUA), 1,5 µM de L-glutamina (Sigma, EUA), 200 UI de penicilina
por ml e 200µg de estreptomicina por mL (Sigma, EUA) e foram ajustados para 2
x 106 células/mL. As CMSP (106 células por poço) foram cultivadas in vitro em
placas de fundo plano de 24 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 37 °C numa
atmosfera umidificada de 5% de CO2 e na presença de diferentes concentrações
de nanopartículas catiônicas (1,7 a 140 µg/mL) ou meio sozinho. Após 3 dias em
37
cultura, as células estimuladas foram colhidas e processadas para análises de
apoptose. Para análises de apoptose, foi utilizado o kit de detecção de apoptose
FITC Annexin V (BD), seguindo o protocolo proposto pelo kit. Vinte mil eventos
foram analisados de cada amostra na região de linfócitos usando um citómetro de
fluxo FACS Canto II (BD, citómetro de fluxo Canto II, Becton Dickinson
Bioscience, EUA). Anexina V e Iodeto de Propídio (PI) foram analisados usando o
software FlowJo vX.
5.9 Testes in vivo
5.9.1 Animais
Camundongos Balb/c (25–35 g) de 6–8 semanas de idade foram obtidos do
“Biotério de Criação de Animais do Centro de Ciências da Saúde da UFRN”. Os
animais foram mantidos em salas com temperatura controlada, recebendo
alimento e água ad libitum. Os animais foram mantidos nas salas de experimentos
por pelo menos 1 semana para se adaptarem. Os experimentos foram submetidos
às exigências das regulamentações estabelecidas pela Comissão de Ética de Uso
de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética de
uso de Animais do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte sob o protocolo de número 026.037/2017.
5.9.2 Obtenção dos soros
Os camundongos foram imunizados semanalmente por via subcutânea
(s.c), durante 6 semanas, com 100 μL de diferentes concentrações da peçonha
(0,5 e 1 %) adsorvidas as nanopartículas catiônicas de PLGA, bem como
associadas ao hidróxido de alumínio (Al(OH)3) na concentração de 10%, como
mostra a divisão dos grupos no Quadro 1. O sangue dos animais foi coletado por
punção cardíaca para obtenção das amostras de soro. Amostras de sangue, na
ausência de anticoagulante, foram mantidas a 37°C por 30 minutos e,
posteriormente, a 4°C por 2 horas para retração do coágulo. Em seguida, as
38
amostras foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos a 4 °C, sendo o
sobrenadante (soro) coletado e estocado a -20 °C.
Quadro 1. Distribuição dos grupos de animais experimentais que foram imunizados com peçonha de Bothrops jararaca ou peçonha de Bothrops jararaca associado ás nanopartículas funcionalizadas de PLGA e ao hidróxido de alumínio. N=49 animais para cada tratamento, 7 por grupo.
Grupos Tratamento
Grupo 1 (7 animais) 100 µL Nanopartículas de PLGA s.c
Grupo 2 (7 animais) 100 µL Hidróxido de alumínio 10% s.c
Grupo 3 (7 animais) 100 µL PBS s.c
Grupo 4 (7 animais) 100 µL Nanopartículas + Peçonha de Bothrops
jararaca 0,5% s.c
Grupo 5 (7 animais) 100 µL Hidróxido de alumínio 0,1% + Peçonha de
Bothrops jararaca 0,5% s.c
Grupo 6 (7 animais) 100µL Nanopartículas + Peçonha de Bothrops
jararaca 1,0% s.c
Grupo 7 (7 animais) 100µL Hidróxido de alumínio 0,1% + Peçonha de
Bothrops jararaca 1,0% s.c
5.9.1.1 Avaliação dos títulos de anticorpos por ELISA (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay)
Os títulos de anticorpos das amostras dos soros de camundongos foram
obtidos após o processo de imunização e determinados por ensaios de ELISA.
Para tanto, placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100 µL de peçonha
em tampão PBS (10 µg/mL) e incubadas “overnight” a 4°C. Após este período, as
placas foram lavadas com PBS e incubadas por 2 h a 37°C com a solução de
bloqueio (PBS/BSA/ 5%) e, posteriormente, incubadas com 100 µL dos soros
(soro de camundongo normal, soro de camundongo anti-peçonha, diluídas em
PBS/BSA 0,1%, e incubadas a 37°C por 1 h. As placas foram lavadas com
PBS/Tween 0,05% (três lavagens/ 5 min) e incubadas com o anticorpo secundário
39
(anti-IgG de camundongo) conjugado com peroxidase, diluído 1:3.000, por 1 h a
37°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween 0,05% e as reações reveladas
pela adição de o-fenilenediamina e peroxido de hidrogênio, e interrompidas após
20 minutos pela adição de ácido sulfúrico 2M. As absorbâncias foram
determinadas a 492 nm em leitor de ELISA.
5.10 Análise estatística
Os dados experimentais foram apresentados com as médias dos valores
experimentais e seus respectivos desvios padrões. Inicialmente será realizado
teste de normalidade, seguido de teste t Student para análises pareadas de duas
médias ou da análise da variância de uma entrada (ANOVA), seguido de teste
Tukey quando aplicável, e foram considerados significativamente diferentes os
valores p < 0,05.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com os métodos desenvolvidos para a preparação de
nanopartículas poliméricas, nesse trabalho foram utilizados métodos que
envolvem o uso de um polímero já formado, seguido do método de
nanoprecipitação.
6.1 Efeito da variação da concentração do polímero no tamanho da partícula
O efeito inicial da concentração do polímero no tamanho das
nanopartículas é mostrado na Figura 5, onde foi utilizada uma fase aquosa fixa
contendo 0,25% (p/v) dos poloxameros (188 e 407) a serem testados, e
quantidade variadas de polímero entre 0,25-1,25% (p/v).
40
Figura 5. Diâmetro e potencial zeta (PZ) de nanopartículas poliméricas a partir da variação da
concentração de PLGA, onde [A] são sistemas estabilizados com poloxâmero 188 (P188) e [B]
estabilizados com poloxâmero 407 (P407).
Na figura 5A, é possível observar o diâmetro médio das nanopartículas
estabilizadas com poloxâmero 188 que variaram entre 121-168 nm. Na figura 5B
o diâmetro médio das nanopartículas estabilizadas com poloxâmero 407 variou
entre 129-186 nm. Os sistemas apresentaram distribuição homogênea com
polidispersões menores de 0,3 e potencial zeta levemente negativo (p<0,05).
Resultados semelhantes foram encontrados em estudos desenvolvidos por
Anwer e colaboradores (2016), os quais durante estudos de formulação de
nanopartículas de PLGA para incorporação de quercitina, fixaram uma
concentração de tensoativo e variaram concentrações crescentes de PLGA. Os
diâmetros encontrados foram entre 118 e 179 nm (ANWER et al., 2016).
O aumento do diâmetro médio de nanopartículas poliméricas com o
aumento da concentração do polímero matriz é bastante reportado na literatura
(JAVADZADEH et al., 2010; THIOUNE et al., 1997). Os resultados mostram que o
acréscimo da concentração do polímero resulta no aumento significante do
tamanho médio da partícula (p<0,05). Esse fenômeno é atribuído ao aumento da
viscosidade da fase orgânica onde a resistência na transferência de massa leva a
difusão lenta do solvente na fase aquosa e consequentemente a formação de
gotas maiores durante a adição da fase (DE OLIVEIRA et al., 2013).
As partículas menores foram obtidas com baixas concentrações de
polímero e a concentração escolhida para seguir com os estudos foi a de 0,75%
A B
41
(p/v) por apresentar, no uso dos dois surfactantes, uma maior massa de polímero
com menor variação do diâmetro. O potencial zeta de todas as concentrações
estão próximos de 0 mV, pois tanto o polímero quanto os surfactantes utilizados
na obtenção são não-iônicos, conferindo uma carga neutra na camada de difusão
da partícula.
6.2 Efeito da variação da concentração do surfactante no tamanho da
partícula
Os poloxameros 407 e 188 foram utilizados como surfactantes poliméricos
para estabilizar os sistemas com o objetivo de reduzir o tamanho das partículas.
Ambos os tensoativos são não-iônicos com baixa toxicidade e baixa irritabilidade,
tornando-os viáveis na aplicação como sistemas de liberação de fármacos e
biomoléculas (DEVI; SANDHYA; HARI, 2013).
Os resultados experimentais mostrados na Figura 6, representam as
variações do tamanho da partícula e seus respectivos valores de potencial zeta.
Nesta etapa, a concentração da fase orgânica é fixa contendo 0,75% (p/v) de
polímero e a fase aquosa foi variada entre 0,25 – 2,0% (p/v) para ambos os
poloxâmeros, separadamente.
Na figura 6A, podemos observar o diâmetro médio das nanopartículas
estabilizadas com poloxâmero 188, que variaram entre 121-195 nm. Na figura 6B
o diâmetro médio das nanopartículas, estabilizadas com poloxâmero 407, variou
entre 99-146 nm. O segundo ponto de concentração do surfactante poloxâmero
407 (0,5%) reduziu o tamanho das partículas consideravelmente, quando
comparado à concentração anterior (0,25%).
42
Figura 6. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas a partir da variação da
concentração dos surfactantes, onde A são sistemas estabilizados com poloxâmero 188 e B
estabilizados com poloxâmero 407.
Diversos estudos demonstraram a capacidade dos poloxâmeros de
estabilizarem e reduzirem o tamanho de nanopartículas poliméricas (GIROTRA;
SINGH; KUMAR, 2016; JAIN et al., 2013; MANDAL; KUNDU, 2009;
SANTANDER-ORTEGA et al., 2006). Comumente, encontram-se resultados da
influência da variação da concentração de poloxâmero 188 nos aspectos físico-
químicos da obtenção de nanopartículas. Como no caso de Girotra e
colaboradores (2016), que utilizaram o componente para modular o tamanho de
nanopartículas de PLGA para incorporar zomultriptano, diminuindo ou
aumentando o diâmetro da partícula conforme a alteração da razão de massa do
tensoativo (GIROTRA; SINGH; KUMAR, 2016). Já em estudos desenvolvidos por
Shubhra e colaboradores (2014), observou-se o efeito do revestimento de
poloxamero na superfície de nanopartículas magnéticas para adsorção de
proteínas plasmáticas. Os resultados do revestimento de nanopartículas
magnéticas de PLGA por poloxâmero 188, levaram a um aumento do tamanho da
partícula, uma vez que o revestimento foi realizado com as nanopartículas já
obtidas (SHUBHRA et al., 2014).
Essa característica de aumento de partícula também é observada nos
resultados de obtenção das nanopartículas do presente estudo.
Os dados mostram que os aumentos das concentrações dos surfactantes
tendem a aumentar o diâmetro médio da partícula (p<0,05). Isto pode ser
A B
43
explicado devido à adsorção de moléculas excedentes de poloxâmero ao redor da
partícula nas primeiras etapas do processo de obtenção. Quando a gotícula de
fase orgânica é envolvida pelo surfactante, acima de sua concentração crítica, a
coalescência das gotículas diminui até que superfície fica saturada de surfactante
e para de coalescer. Essa etapa final da obtenção leva a um tamanho específico
de partícula polimérica que pode ser determinada experimentalmente de acordo
com os tipos de surfactantes utilizados (MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI,
2011; SHUBHRA et al., 2014).
Os dois poloxâmeros possuem cadeias hidrofílicas similares, mas são
distintos quando compara-se as frações de massa das cadeias hidrofóbicas. A
cadeia hidrofóbica do poloxâmero 407 possui a massa da fração de óxido de
propileno maior que a do poloxâmero 188. Com isso, os tamanhos obtidos são
semelhantes quando comparados o desempenho dos surfactantes. Com tudo, é
possível observar que os sistemas estabilizados com poloxâmero 407 apresentam
tamanho menores devido às suas características mais hidrofóbicas tendo melhor
afinidade pelo polímero hidrofóbico, PLGA (JINDAL; MEHTA, 2015).
Com isso, os dois surfactantes têm se mostrado eficazes para obter e
estabilizar (p<0,05), com sucesso, as nanopartículas de PLGA, porém o sistema
escolhido para continuar os estudos foi o que contém 0,5% (p/v) de poloxâmero
407, por apresentar menor tamanho. O potencial zeta de todas as concentrações
estão em torno de 0 mV (± 10), pois tanto o polímero quanto os surfactantes
utilizados são não-iônicos, atribuindo uma falta de carga na camada de difusão da
partícula. A distribuição dos sistemas apresentou polidispersões menores de 0.3.
6.3 Efeito da variação do agente funcionalizante no tamanho da partícula
O sistema escolhido para etapa de funcionalização foi da formulação
contendo 0,75% (p/v) de PLGA e 0,5% (p/v) de poloxâmero 407. Nesta fase, há a
adição do policátion polietilenimina no processo de obtenção para conferir uma
carga positiva a superfície da partícula tornando-a catiônica. A figura 7 mostra o
efeito da adição da PEI no tamanho da partícula e no potencial zeta. Razões de
PEI/polímero (p/p) – 1:5, 1:10, 1:15 – foram utilizadas considerando a
concentração de polímero de 0,75% (p/v).
44
Figura 7. Diâmetro e potencial zeta de nanopartículas poliméricas de PLGA a partir da variação da
razão de PEI:PLGA.
Os dados mostram um aumento linear do valor de potencial zeta (p<0,05),
variando de 0 a 45 mV, sendo observado desde as amostras que não contem PEI
até a maior razão de PEI/polímero (1:5). Os diâmetros médios das partículas
também variaram aumentando de 100nm, na formulação com a ausência da PEI,
para 150 nm na formulação com maior razão de PEI (p<0,05). A polidispersão dos
sistemas se manteve abaixo de 0,3 reafirmando a homogeneidade das partículas.
Apesar da citotoxicidade implícita da PEI, este componente é
frequentemente utilizado na composição de sistema de entrega de moléculas
ativas (MESQUITA et al., 2017; MUNIER et al., 2005; WANG et al., 2016).
Utilizando da estratégia de funcionalizar nanopartículas poliméricas de
forma catiônica, Kim e colaboradores (2005) adicionaram na fase externa do
processo de obtenção de nanopartículas de PLA (poli ácido lático) e PLGA, uma
polietilenimina de 64kDa em diferentes concentrações, para conseguir
nanopartículas catiônicas. Foi observado que com o aumento da concentração de
PEI, as nanopartículas reduziram o seu tamanho. Este dado é justificado pelos
autores através da carga positiva da PEI que pode afetar o processo de
solidificação das partículas (KIM et al., 2005).
O mesmo não acontece na funcionalização das nanopartículas desse
presente trabalho. Durante o processo de obtenção, a polietilenimina está
presente na fase orgânica (fase interna) juntamente com o polímero. Quando
45
ocorre o processo de nucleação das nanopartículas, uma parte das moléculas de
PEI é capturada pela matriz polimérica de PLGA, e outra parte ancora na
superfície da nanopartículas, que se acumulam com o aumento de sua
concentração. Esse acúmulo resulta no aumento do diâmetro das nanopartículas.
Além disso, o policátion utilizado apresenta massa molar de 25kDa,
caracterizando-se assim um dendrímero. As moléculas de PEI se organizam na
superfície das partículas de forma que as porções protonadas das moléculas
confiram um potencial zeta positivo na camada de difusão das nanopartículas
(SHABANIAN et al., 2015; SPERLING; PARAK, 2010).
6.4 Incorporação de proteínas em nanopartículas catiônicas de PLGA
No final da etapa de funcionalização das nanopartículas de PLGA (item
6.3), os nanocarreadores apresentaram o potencial zeta positivo, indicando que
as partículas apresentam superfície catiônica. A formulação escolhida para etapa
de incorporação de proteínas foi a que contém 0,5% de poloxâmero 407, 0,75%
de PLGA e a PEI na razão de 1:5 (p/p) PEI/polímero. Para incorporação de
proteínas aniônicas nos carreadores, a proteína modelo utilizada foi a albumina
bovina sérica (BSA). A tabela 1 mostra a eficiência de associação (EA) das
proteínas na superfície da nanopartículas catiônicas (NPC).
Tabela 1: Eficiência de Adsorção de BSA em nanopartículas catiônicas de PLGA
Sistemas
Diâmetro
médio
(nm)
Índice de
polidispersão
Potencial
zeta (mV) EA (%)
NPC 140,0 ± 1,8 0,130 ± 0,01 47,38 ± 6,24 -
NPC + 0,5%
BSA 170,1 ± 1,3 0,037 ± 0,03 21,91 ± 11,5 97,4 ± 0,3
NPC + 1,0%
BSA 164,3 ± 4,4 0,117 ± 0,03 18,55 ± 4,6 97,8 ± 0,5
Notas: PLGA, Poli (ácido lático-co-glicólico); NPC, nanopartículas catiônicas; BSA, albumina
bovina sérica; EA, eficiência de associação. Os resultados são expressos como média ± desvio
padrão (n=3).
46
Para as concentrações testadas de BSA (0,5-1,0%), as eficiências de
associação das proteínas foram superiores a 97%. Essa alta eficiência de
associação também pode ser verificada com alterações no diâmetro médio da
partícula e seu potencial zeta. Após a associação, houve um aumento no
diâmetro da nanopartículas passando de 140 nm (nanopartículas sem proteína)
para 170 nm (nanopartículas com proteínas) (p<0,05). Também foi observado
uma diminuição considerável do potencial zeta (p<0,05). As NPC apresentam
potencial zeta de aproximadamente 50 mV e após a incorporação da albumina, os
valores de potencial zeta diminuem para aproximadamente 20 mV.
Com o sucesso na incorporação da BSA nas NPC, a peçonha da serpente
Bothrops jararaca (BJ) foi incorporada as NPC como descrito no item 5.5. A tabela
2 mostra a eficiência de associação das proteínas da peçonha nas
nanopartículas.
Tabela 2: Eficiência de Adsorção de peçonha da serpente Bothrops jararaca em nanopartículas
catiônicas de PLGA
Sistemas
Diâmetro
médio
(nm)
Índice de
Polidispersão
Potencial
zeta (mV) EA (%)
NPC 140,0 ± 1,8 0,130 ± 0,01 47,38 ± 6,24 -
NPC +
0,5% BJ 167,3 ± 6,3 0,02 ± 0,02 42,83 ± 14,6 98,7 ± 0,07
NPC +
1,0% BJ 168,7 ± 3,8 0,01 ± 0,01 35,6 ± 13,4 98,2 ± 0,03
Notas: PLGA, Poli (ácido lático-co-glicólico); NPC, nanopartículas catiônicas; BJ, Bothrops
jararaca; EA, eficiência de associação. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão
(n=3).
Para as concentrações testadas de peçonha de Bothrops jararaca (0,5-
1,0%), as eficiências de associação das proteínas foram superiores a 98%. Essa
eficiência de associação também pode ser verificada com alterações no diâmetro
média da partícula. Após a associação, houve um aumento no diâmetro das
47
nanopartículas aumentando de 140 nm (nanopartículas sem proteína) para 168
nm (nanopartículas com proteínas) (p<0,05). Já para o potencial zeta é observado
uma aparente perturbação das cargas na superfície das nanopartículas (p>0,05).
As NPC apresentam potencial zeta de aproximadamente 50 mV e, após a
incorporação da peçonha, os valores de potencial zeta se mantem
aproximadamente 40 mV.
Na literatura já é bastante reportado o uso de sistemas nanoparticulados
contendo proteínas como princípio a ser carreado. Esses sistemas são
responsáveis geralmente para direcionar e aumentar a eficácia da atividade
biológica intrínseca dessas proteínas veiculadas (BEKALE; AGUDELO; TAJMIR-
RIAHI, 2015; LOHCHAROENKAL et al., 2014; NAJAFI-HAJIVAR et al., 2016).
A associação de proteínas em superfície de partículas através de
interações com polímeros de carga positiva, já possui possíveis mecanismos de
interação. Um estudo realizado em nosso grupo de pesquisa utilizando a BSA
como proteína modelo de associação, demonstrou a capacidade das
nanopartículas funcionalizadas com PEI de associar proteínas à superfície.
Alterações no potencial zeta das partículas e diminuição de estiramentos
espectroscópicos na região do infravermelho conseguem sugerir a interação
eletrostática das cargas negativas presentes na proteína com as cargas positivas
das aminas presentes na PEI (MESQUITA et al., 2017).
Os sistemas contendo a peçonha da Bothrops jararaca, as nanopartículas
catiônicas vazias, o agente funcionalizante (PEI) e a peçonha bruta, foram
submetidos a uma eletroforese em gel para demonstrar e confirmar a associação
das proteínas nos nanocarreadores. A figura 8 mostra o perfil eletroforético das
amostras em análise.
48
Figura 8. Determinação do perfil eletroforético de: MM, marcador molecular; BJ, peçonha de
Bothrops jararaca (15 µg); PEI, polietilenimina (15 µg); NPC, nanopartículas catiônicas (15 µg).
Gel corado com solução de nitrato de prata.
As bandas apresentadas na coluna referente à peçonha da serpente (BJ)
confirmam uma diversificada composição molecular da peçonha quando
comparando com a coluna do marcador de peso molecular (MM). A composição
da peçonha é, em sua grande maioria, composta por proteínas de peso molecular
abaixo de 20 kDa, ou seja, proteínas de baixo peso molecular. A PEI e a as
nanopartículas catiônicas, foram testadas como controles negativos de detecção,
uma vez que as nanopartículas não entram na malha do gel. As colunas
referentes aos sistemas contendo diferentes concentrações de peçonha
associados aos nanocarreadores, não apresentaram bandas depois da
eletroforese. Essa informação confirma a alta eficiência de associação das
proteínas aos sistemas.
A utilização da técnica de eletroforese em gel é aplicada nesse caso de
nanopartículas catiônicas para ajudar a confirmar a associação das proteínas
49
associadas ao sistema. Os resultados obtidos nesse trabalho corroboram com
estudos também já realizados no nosso grupo de pesquisa, os quais demonstram
a capacidade de confirmar a incorporação de proteínas em nanopartículas.
Soares e colaboradores (2017), utilizaram nanopartículas de quitosana para
incorporação da peçonha de escorpião Tityus serrulatus e, após submeter as
amostras ao gel, o perfil eletroforético das amostras confirmavam a incorporação.
A amostra de peçonha bruta aparece no gel com seu determinado perfil
eletroforético e as amostras com peçonha incorporadas as nanopartículas
apresentaram bandas de fraca intensidade quando comparadas com as do perfil
eletroforético da peçonha, sugerindo uma incorporação considerável das
proteínas (ROCHA SOARES et al., 2017). Utilizando uma estratégia semelhante
as nanopartículas catiônicas de PLGA, Mesquita e colaboradores (2017),
desenvolveu nanopartículas catiônicas de PLA funcionalizadas com PEI e
adsorveu albumina sérica bovina (BSA) na superfície das partículas. As bandas
referentes às nanopartículas com BSA associadas, apresentaram uma
intensidade bastante reduzida quando comparada com o perfil eletroforético da
BSA puro (MESQUITA et al., 2017).
Recentemente, Carneiro e Ward (2018) desenvolveram nanopartículas
paramagnéticas funcionalizadas com quitosana e um derivado do ácido
iminodiacético para demonstrar a capacidade de partículas paramagnéticas de
imobilizar e purificar proteínas. Esses testes se deram por capacidade de ligação
das proteínas a compostos da superfície das nanopartículas paramagnéticas. As
informações foram obtidas após submeter diferentes concentrações de proteínas
para associar as partículas e em seguidas avaliar a performance dessa
associação também através de perfil eletroforético (CARNEIRO; WARD, 2018).
Dentro desse contexto, as nanopartículas de PLGA funcionalizadas com
polietilenimina, desenvolvidas ao longo desse trabalho, apresentaram excelente
capacidade de associação com a peçonha da serpente e essa resposta pode ser
confirmada com o perfil eletroforético e alta eficiência de incorporação obtidos
durante os testes.
Uma vez que existe a associação e possíveis interações entre as proteínas
da peçonha e as nanopartículas catiônicas, foram realizadas análises de
espectroscopia na região do infravermelho para acessar informações sobre essas
50
possíveis interações. A figura 9 mostra os espectros provenientes de amostras
individualmente contendo nanopartículas catiônicas de PLGA (NPC), peçonha da
serpente Bothrops jararaca (BJ) e peçonha associadas a nanopartículas
catiônicas (NPC+BJ).
Figura 9. Espectros de infravermelho de nanopartículas catiônicas (NPC), peçonha pura de
Bothrops jararaca (BJ) e nanopartículas associadas a peçonha (NPC+BJ).
Uma análise inicial dos espectros de infravermelho sugere que não existam
reações que levem ao surgimento de ligações covalentes entre os componentes,
nem o surgimento de outros compostos diferentes dos já existentes. Os espectros
apresentam características de estiramentos semelhantes e apresentam os
grupamentos já esperados da composição da nanopartícula e da peçonha.
Numa análise entre os números de ondas entre 1000 e 2600 cm-1, observa-
se características interessantes a serem discutidas. No número de onda de 1635
cm-1 observamos a repetição do estiramento comum em todas as amostras. Esse
estiramento é referente ao grupamento amida primaria (N-H), grupo funcional
amplamente encontrado nos componentes das amostras, como os peptídeos e
51
proteínas da peçonha e o agente funcionalizante da nanopartícula, a
polietilenimina (ALVAREZ-ORDÓÑEZ et al., 2011).
Entre a região de 2310 e 2380 cm-1, observa-se o surgimento de
estiramentos referentes aos componentes organofosforados (C-P) (AEIA;
THOMAS, 1965). No espectro referente às nanopartículas não é observado esse
grupamento, porém após a adição da peçonha, o estiramento é mantido tanto no
espectro da peçonha bruta quanto no espectro das nanopartículas associadas a
peçonha. A razão do aparecimento dos estiramentos na região de
organofosforados indica a presença desses componentes na composição química
da peçonha da serpente.
Essa afirmação é observada por Zelanis e colaboradores (2016) que em
estudos de identificação proteômica da peçonha da serpente Bothrops jararaca,
confirmam e determinam a diferença dos marcadores moleculares nos gêneros
das serpentes em função da produção de veneno. Dentre a composição é
possível identificar pelo menos 3 principais enzimas organofosforadas, que são as
fosfodiasterases, fosfolipase A2 e fosfolipase B (ZELANIS et al., 2016).
6.5 Morfologia das nanopartículas
Propriedades físico-químicas como tamanho de partícula, a forma e a
carga superficial podem afetar o comportamento de sistemas biológicos, mais
especificamente no aspecto de internalização celular (SALATIN; MALEKI DIZAJ;
YARI KHOSROUSHAHI, 2015).
A forma e superfície das nanopartículas catiônicas de PLGA com e sem
associação de peçonha da Bothrops jararaca, foram acessadas a partir de análise
de microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de varredura
(MEV). Em todas as amostras, a figura 10 mostra que as partículas são esféricas
com superfície lisa. Na figura 10B-C pode-se observar que, mesmo após
adicionar as proteínas da peçonha, as formas das partículas permaneceram
esféricas e com superfície lisa.
52
Figura 10. Imagens topográficas em 2D e 3D obtidas por Microscopia de Força Atômica e
imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura, respectivamente, de: A) nanopartículas
catiônicas de PLGA sem peçonha; B) nanopartículas catiônicas de PLGA com peçonha de
Bothrops jararaca a 0,5% e C) nanopartículas catiônicas de PLGA com peçonha de Bothrops
jararaca a 1,0%.
É possível observar que os tamanhos de nanopartículas informados pelas
análises de MFA, não são compatíveis com os valores obtidos pela determinação
do tamanho através do espalhamento de luz (tabela 2). Essa diferença se dá
pelos distintos fundamentos dos métodos usados e o modo de preparo das
amostras. Para o espalhamento de luz, as nanopartículas se mantêm em meio
aquoso quando submetidas a análise tamanho. Por outro lado, para ambas as
análises de microscopia, as amostras são submetidas a um período de secagem.
Essa etapa do processamento pode levar as nanopartículas a formarem
agregados e terem seu tamanho aumentado, ou terem sua camada de hidratação
superficial retirado, reduzindo o tamanho da nanopartícula (HOO et al., 2008).
53
Essa camada de hidratação também é denominada por Lim e
colaboradores (2013) de raio hidrodinâmico. Durante a análise de espalhamento
de luz, é necessário um feixe monocromático para espalhar a luz e associar o
movimento browniano das partículas para fornecem informações necessárias ao
software de análise que irá determinar o raio hidrodinâmico da partícula. O
software utiliza da equação de Stokes-Einstein para a análise, onde a constante
de Boltzmann, a temperatura e a viscosidade são os dados fundamentais para
definir o raio que consiste a medida desde o centro da partícula até sua camada
mais externa de difusão (LIM et al., 2013).
6.6 Estudo de estabilidade física
Realizou-se um estudo de estabilidade das nanopartículas contendo ou
não a peçonha da Bothrops jararaca para observar possíveis instabilidades físicas
dos sistemas. Os resultados da variação do diâmetro médio da partícula em 45
dias podem ser visualizados na figura 11.
Comparando as análises desde 1° ao 45° dia, observamos que as
alterações no tamanho das nanopartículas foram mínimas, variando em torno de
20 nm (p<0,05). Os valores de potencial zeta continuaram positivos (+30mV ± 10).
Nenhum dos sistemas apresentou índice de polidispersão superiores 0,2
indicando uma homogeneidade do tamanho das partículas dos sistemas. Uma
característica interessante a se observar foi a distribuição dos diâmetros médios
dos sistemas contendo peçonha que mostraram valores de polidispersão menores
que 0,010.
54
Figura 11: Estudo de estabilidade física de nanopartículas catiônicas (NPC); nanopartículas
catiônicas associadas a peçonha de Bothrops jararaca 0,5% (NPC+BJ0,5%); nanopartículas
catiônicas associadas a peçonha de 1,0% (NPC+BJ1,0%), no período de 45 dias.
A correlação da distribuição do tamanho de partícula e as populações de
partículas analisadas, determina que quanto maior esse valor seja (ou quanto
mais próximo de 1) mais heterogênea a amostra será, podendo apresentar
diversas populações de partículas, caracterizando assim uma amostra
multimodal. Por outro lado, quanto mais próximo de 0, melhor será a distribuição e
mais homogêneo será a população de nanopartículas (CORTI. et al., 1977; LIM
et al., 2013).
Essa estabilidade das nanopartículas também é influenciada pela
quantidade de cargas que os sistemas apresentam. As dispersões coloidais
podem apresentar fenômenos de instabilidades referentes à floculação,
cremagem, sedimentação e coalescência (SHEKUNOV et al., 2007). Todos esses
fenômenos estão relacionados a cargas ao redor da superfície da partícula que
propicia forças de interação entre as partículas. Forças eletrostáticas de atração e
repulsão, forças estéricas (dependem da geometria da partícula) e forças de
solvatação, que se devem a mudanças na quantidade de solvente adsorvido com
a aproximação de partículas adjacentes, são exemplos de forças que influenciam
na estabilidade de coloides (BONIELLO et al., 2017; MURDAN, 2003).
55
As nanopartículas catiônicas já apresentam uma densidade de carga
considerável devido à presença da polietilenimina na sua composição. Mesmo
quando associada com concentrações de proteínas da peçonha, essas interações
entre as cargas continuam existindo uma vez que dentro da composição da
peçonha existem proteínas com moderada densidade de cargas, como o caso
das metaloproteases, que ajudam a aumentar a estabilidade física e eletrostática
do sistema (GAMBINOSSI; MYLON; FERRI, 2015).
6.7 Ensaio de Liberação de proteínas in vitro
Nanopartículas poliméricas são consideradas sistemas de liberação
modificada de fármacos e biomoléculas, por serem capaz de alterar o perfil de
biodisponibilidades desses componentes. O ensaio de liberação in vitro tem como
objetivo observar a influência da composição do sistema no perfil de liberação das
proteínas da peçonha de Bothrops jararaca.
Figura 12. Perfil de liberação de proteínas in vitro de peçonha de Bothrops jararaca, em diferentes
concentrações (0,5 e 1,0%) associadas a nanopartículas catiônicas, em função do tempo.
Tabela 3: Tratamento matemático para o estudo de liberação de proteínas in vitro
56
Modelo Cinético k ( r2)
Sistemas Primeira
Ordem Bhaskar Freundlich
Difusão
Parabólica
NPC + BJ 0,5% 0,0003 h-1
(0,59 ± 0,03)
0,1741 h0.65
(0,90 ± 0,02)
145,11 h
(0,91 ± 0,02)
0,2722 h-0.5
(0,96 ± 0,01)
NPC + BJ 1,0% 0,0002 h-1
(0,56 ± 0,04)
0,1329 h0.65
(0,89 ± 0,02)
89,62 h
(0,94 ± 0,01)
0,3635 h-0.5
(0,97 ± 0,01)
A figura 12 mostra o perfil de liberação de proteína em função do tempo. O
ensaio foi realizado por 168 horas, equivalente a 7 dias. Percebe-se que ambos
os sistemas apresentam perfis semelhantes de liberação e se caracterizam como
sistemas que estão prolongando a liberação das proteínas na peçonha.
A formulação que contem 0,5% de peçonha (NPC + BJ 0,5%) apresenta
um notável efeito “burst” entre os tempos de 8 e 10 horas, liberando
aproximadamente 30% da massa total de proteínas contidas nas nanopartículas.
Em seguida, o sistema entra em equilíbrio com o meio, porém se manteve
liberando proteínas durante o tempo de ensaio, 168 horas. Na última leitura, as
nanopartículas foram capazes de liberar 98,7% da massa total de proteínas.
A formulação contendo 1,0% de peçonha (NPC + BJ 1,0%) manteve sua
liberação prolongada, lenta e crescente. Ao fim dos 7 dias de ensaio, as
nanopartículas haviam liberado apenas 57,8% da massa total de proteínas
associadas as nanopartículas.
Para definir o mecanismo cinético da liberação das nanopartículas
catiônicas contendo peçonha de Bothrops jararaca nas diferentes concentrações,
foi necessário utilizar a aplicação de diferentes modelos matemáticos como:
primeira ordem, Bhaskar, Freundlich e difusão parabólica (Tabela 3).
A escolha do mecanismo cinético de liberação dos sistemas, se dá pela
análise do coeficiente de determinação (r2) obtido através da regressão linear dos
dados provenientes da aplicação dos modelos matemáticos. O modelo é
escolhido quando possui o r2 próximo de 1. Neste caso, ambos as formulações
NPC + BJ 0,5% (r2 = 0,96) e NPC + BJ 1,0% (r2 = 0,97). Após a avaliação dos
57
dados, observou-se que a cinética de liberação que melhor representa o perfil de
liberação é a difusão parabólica. Esse mecanismo propõe que as proteínas se
difundam no meio através de difusão intra-partícula ou difusão de proteínas
adsorvidas na superfície das nanopartículas.
Semelhantes aos resultados encontrados na literatura, as nanopartículas
catiônicas de PLGA, também foram capazes de prolongar a liberação das
proteínas da serpente.
No estudo de liberação de proteínas em nanopartículas, é conhecida a
capacidade desses sistemas de prolongar a liberação dessas biomoléculas e
diversos estudos são capazes de demonstrar este fato (LIU et al., 2016;
MESQUITA et al., 2017; MUNIER et al., 2005; ROCHA SOARES et al., 2017;
ZAMBAUX et al., 1999). Semelhante aos resultados obtidos nesse trabalho,
Munier e colaboradores (2005), utilizaram nanopartículas catiônicas de PLA para
modificar a liberação de DNA e observaram a liberação sustentada e contínua
durante o período de aproximadamente 100 horas. Apesar da semelhança, o
estudo não aplicou tratamentos matemáticos para indicar um possível mecanismo
de liberação (MUNIER et al., 2005). Mesquita e colaboradores (2017), ao
estudarem o perfil de liberação da BSA associadas a nanopartículas catiônicas de
PLA, observaram uma liberação sustentada e contínua das proteínas e após
tratamento matemático dos resultados, a cinética de liberação foi a difusão
parabólica (MESQUITA et al., 2017).
6.8 Viabilidade celular
A alta densidade de carga positiva encontrada na polietilenimina é
proveniente das aminas protonadas de seus monômeros. Essas cargas são
capazes de interagir com membranas negativas de células induzindo vias de
endocitose das moléculas de PEI. Essas moléculas livres no citoplasma da célula
irão interagir com as membranas das organelas celulares que ficarão instáveis,
levando a apoptose celular. Complexos de veiculação de moléculas utilizando
PEI, possuem a alta capacidade de aumentar a osmolaridade de vesículas ácidas
que resulta na ruptura endossomal e inibe a atividade lisossômica. Esse processo
58
caracteriza uma limitação no uso de PEI devido sua citotoxicidade (KIM et al.,
2016; SHEN et al., 2013; TAN; HUANG, 2002).
Neste contexto, foi realizado um ensaio de viabilidade celular para os
sistemas que foram funcionalizados com PEI 25 KDa. O objetivo desse ensaio foi
observar se a proporção de polietilenimina do sistema, obtida pela variação da
concentração de PLGA, causava citotoxicidade. Desta forma, foi avaliada a
viabilidade celular de células sanguíneas in vitro por ensaio utilizando CMSP das
nanopartículas catiônicas em concentrações de 140; 70; 35;17,5; 7; e 1,7 µg/mL
em 72 horas (Figura 13). O tempo de 72 horas foi escolhido por ser o período
necessário para se observar morte celular considerável, uma vez que 24 e 48
horas não apresentaram morte celular significante. Nesse mesmo ensaio, foi
possível analisar a taxa de apoptose recente e apoptose tardia causada pela
presença das nanopartículas, através da utilização do iodeto de propídeo.
Figura 13. Viabilidade celular de nanopartículas catiônicas de em diferentes concentrações (1,7;
7; 17,5; 35; 70 e 140 µg.mL-1) em células sanguíneas durante 72 horas.
59
Figura 14. Taxa de apoptose celular de nanopartículas catiônicas de em diferentes concentrações
(1,7; 7; 17,5; 35; 70 e 140 µg.mL-1) em células sanguíneas durante em 72 horas.
Através desses resultados, podemos observar a viabilidade do sistema
nanoparticulado com a presença de PEI na superfície da partícula. A figura 13
mostra o percentual de viabilidade celular em função do aumento da
concentração de nanopartículas catiônicas. É possível observar que as
concentrações testadas de nanopartículas contendo polietilenimina apresentaram
morte celular considerável (p<0,05) apenas na concentração de 140 µg/mL,
atingindo uma viabilidade celular abaixo de 50%. Quando analisados os
resultados da taxa de apoptose na figura 14, somente após 72 horas as
nanopartículas conseguem estimular, em torno de 25% (p>0,05), o início do
processo de apoptose que é categorizado por apoptose recente. Também se
verifica que as nanopartículas apresentam apoptose tardia detectável com o
aumento da concentração das partículas, ou seja, as células entram no processo
de apoptose propriamente dito com o aumento da concentração de
nanopartículas.
Os resultados sugerem que quando a polietilenimina está associada a
nanopartículas, além de ser utilizada concentrações baixas, menor quantidade de
PEI livre está disponível para interagir com as células. Thomas e colaboradores
60
(2005) desenvolveram um estudo acerca da utilização de PEI com diversas
massas moleculares. Durante o estudo, os policátions foram testados analisando
a sua capacidade de entrega de DNA isolado em células de mamíferos, tanto em
testes in vitro, quanto em testes in vivo. Ao fim do estudo, observaram que as
polietileniminas que tinham menor cadeia, apresentavam perfil não tóxico no
direcionamento de DNA, sendo considerados veículos biocompatíveis (THOMAS
et al., 2005). Outro estudo realizado em nosso grupo de pesquisa, utilizou
nanopartículas de poli ácido lático (PLA) funcionalizadas com PEI na razão de
PEI:PLA 1:1 e 1:2 (p/p). Após realização do ensaio de MTT em células VERO E6,
observou-se uma citotoxicidade dose dependente da PEI em concentrações
acima de 80 µg.mL-1 (MESQUITA et al., 2017).
O sistema desenvolvido neste trabalho apresenta indicativos de ser um
nanocarreador biocompatível e promissor. Apenas após 72 horas, observou-se
morte celular detectável e concentrações abaixo de 80 µg.mL-1 obtendo
viabilidade celular como relatado na literatura.
6.9 Dosagem de títulos de anticorpos
Após toda a caracterização fisico-química do nanocarreador catiônico,
estudos de performance in vivo foram feitos para avaliar a capacidade
imunogênica dos sistemas. Para tanto, os sistemas NPC, NPC+BJ 0,5% e
NPC+BJ 1,0%, foram testados seguindo um protocolo de imunização (item 5.9.2).
Ao final do período de vacinação dos animais, foram feitas as dosagens dos
títulos de anticorpos produzidos pelos grupos imunizados através da técnica de
ELISA.
A tabela 4 mostra a média das absorbâncias obtidas através da diluição
dos soros. Os grupos experimentais considerados controles (PBS, NPC e
Hidróxido de Alumínio) apresentaram uma absorbância mínima para a diluição de
1:25 de anticorpos. Os grupos de animais que foram imunizados com hidróxido de
alumínio contendo peçonha e os grupos contendo nanopartículas com peçonha,
foram capazes de produzir anticorpos. A partir da diluição dos soros de 1:200,
observa-se uma alta absorbância para os grupos experimentais contendo
peçonha (BJ 0,5-1,0%) que decai com aumento das diluições, sendo a maior
61
diluição detectável a de 1:51200. Observando as absorbâncias isoladamente na
tabela 4, é possível identificar uma maior intensidade na absorbância dos grupos
imunizados com as nanopartículas contendo peçonha quando comparados aos
grupos em que a peçonha foi associada ao hidróxido de alumínio.
Tabela 4: Médias das absorbâncias das diluições dos soros produzidos pelos animais durante o
protocolo de imunização.
Grupos Experimentais
Diluições Salina NPC Al(OH)3 Al(OH)3 + BJ 0,5% Al(OH)3 + BJ 1,0% NPC+ BJ 0,5% NPC+ BJ 1,0%
1:25 0,377 ± 0,105 0,204 ± 0,075 0,200 ± 0,039 - - - -
1:200 - - - 2,479 ± 0,074 2,678 ± 0,168 3,069 ± 0,028 2,874 ± 0,036
1:400 - - - 2,233 ± 0,064 2,431 ± 0,160 2,919 ± 0,158 2,556 ± 0,014
1:800 - - - 1,948 ± 0,086 2,054 ± 0,243 2,781 ± 0,118 2,384 ± 0,079
1:1600 - - - 1,452 ± 0,091 1,659 ± 0,422 2,525 ± 0,087 2,238 ± 0,037
1:3200 - - - 1,035 ± 0,139 1,106 ± 0,225 2,171 ± 0,123 1,528 ± 0,098
1:6400 - - - 0,687 ± 0,070 0,690 ± 0,123 2,102 ± 0,212 1,043 ± 0,018
1:12800 - - - 0,433 ± 0,045 0,511 ± 0,161 1,239 ± 0,236 0,802 ± 0,050
1:25600 - - - 0,293 ± 0,030 0,335 ± 0,080 0,906 ± 0,179 0,483 ± 0,021
1:51200 - - - 0,222 ± 0,011 0,299 ± 0,106 0,691 ± 0,138 0,316 ± 0,022
Notas: NPC, nanopartículas catiônicas; BJ, Bothrops jararaca; Al(OH)3, Hidróxido de Alumínio. Os
resultados são expressos como média ± desvio padrão (n=3).
Figura 15. Avaliação dos títulos de anticorpos obtidos a partir de animais imunizados com
hidróxido de alumínio (Al(OH)3) e nanopartículas catiônicas (NPC) associadas a peçonha de
A B
62
Bothrops jararaca (BJ) em diferentes concentrações (0,5 e 1,0%). A) Densidades ópticas na
diluição de 1:200, B) Curva de densidades ópticas em diluição seriada.
Analisando a figura 15, podemos observar o decréscimo da densidade
óptica de anticorpos (15 B) e identificar que a diluição de 1:25600 é a diluição
máxima capaz de observar a detecção de anticorpos. Após aplicar ANOVA,
seguido de Tukey, para comparar os resultados dos grupos imunizados (15 A), os
grupos das NPC contendo as concentrações de peçonha obtiveram produção de
anticorpos equivalentes aos grupos com hidróxido de alumínio contendo peçonha,
ou seja, não mostraram diferença estatística (p>0,05).
Apesar dos valores não mostrarem diferença estatística entre os grupos, o
grupo NPC+BJ0,5% apresenta diluições superiores aos outros grupos. Esse
resultado pode ser correlacionado com os dados de liberação, sendo esse o
sistema capaz de liberar quase 100% do seu conteúdo no período de 7 dias,
sugerindo uma maior eficiência no reconhecimento das proteínas liberadas e uma
maior produção de anticorpos desse grupo.
Diversos estudos já sugerem que micropartículas e nanopartículas de
PLGA podem ser utilizadas como imunoadjuvantes. Esta capacidade pode ser
explicada pelo fato de nanopartículas de PLGA estimularem citocinas pro-
inflamatórias, quando fagocitadas por macrófagos (NAJAFI-HAJIVAR et al., 2016;
PAWAR et al., 2013).
Nosso grupo de pesquisa foi pioneiro no contexto de produção de
nanopartículas poliméricas para produção de soro anti-peçonha de animais
peçonhentos. Soares e colaboradores (2012), desenvolvendo estudo em nosso
laboratório, conseguiram obter nanopartículas de quitosana como agente
imunoadjuvante para produzir soro antipeçonha do escorpião Tityus serrulatus
(ROCHA SOARES et al., 2012). Em 2016, Ayari-Riabi e colaboradores,
desenvolveram nanopartículas aniônicas de PLA conjugadas a peçonha de duas
espécies de escorpião (Androctonus australis hector e Buthus occitanus
tunetanus) para avaliação da capacidade imunogênica das partículas (AYARI-
RIABI et al., 2016).
Considerando que a dosagem dos título de anticorpos seja
aproximadamente o dobro da absorbância obtida dos grupos controles temos que:
63
a diluição que representa os títulos do grupo Al(OH)3 + BJ 0,5% seja 1:28000; os
títulos do grupo Al(OH)3 + BJ 1,0% seja 1:28000; os títulos do grupo NPC+ BJ
0,5% seja superior a 1:51200 e os títulos do grupo NPC+ BJ 1,0% seja a
1:25600.
As nanopartículas catiônicas de PLGA conseguiram com sucesso estimular
o sistema imune e produzir uma resposta ativa contra a peçonha da serpente
Bothrops jararaca. A capacidade das NPC serem usadas como imunoadjuvantes
é confirmada uma vez que apresentam perfil de produção de anticorpo
semelhante ao do hidróxido de alumínio sendo uma alternativa biocompatível e
inovadora para futuros dispositivos de imunização.
7. CONCLUSÕES
Este trabalho desenvolveu com sucesso a obtenção de um sistema de
nanopartícula polimérica funcionalizada com uma carga catiônica para associação
de proteínas da peçonha da serpente Bothrops jararaca.
Através da nanoprecipitação foi realizada a padronização da produção de
nanopartículas utilizando PLGA como polímero matriz e surfactantes poliméricos
(poloxamero 407 e 188). Após o estudo de variação dos componentes, a
formulação final com concentrações fixas, foi capaz de produzir nanopartículas
com diâmetro médio de 99 nm.
No estudo de funcionalização, a polietilenimina foi capaz de fornecer uma
carga catiônica nas nanopartículas de PLGA, que mantiveram seu tamanho
reduzido com diâmetro médio de 140 nm e potencial zeta de +47,4 mV.
As nanopartículas funcionalizadas com carga catiônica foram testadas para
adsorver proteínas utilizando primeiramente a albumina bovina sérica como
proteína modelo, e em seguida utilizou-se a peçonha da serpente Bothrops
jararaca. Em ambos os testes, a eficiência de associação foi alta com percentual
acima de 95% e ensaios como eletroforese e infravermelho confirmaram a alta
eficiência de associação. Além disso, os diâmetros das nanopartículas
permaneceram abaixo de 200 nm e com potencial zeta positivo.
64
Com análises microscópicas, através de microscopia de força atômica e
microscopia eletrônica de varredura, foi revelado que as nanopartículas são
esféricas e com sua superfície lisa.
Para testar o desempenho do nanocarreador polimérico funcionalizado com
adsorção de proteínas em sua superfície, testes de performances in vitro e in vivo
foram realizados.
Estudos de estabilidades indicaram que as nanopartículas funcionalizadas,
contendo ou não proteínas adsorvidas, conseguem se manter estáveis
fisicamente por mais de 6 semanas com mínimas variações de tamanho das
partículas.
Quando submetidas a teste de viabilidade celular, as nanopartículas
funcionalizadas sem a presença de proteínas apresentaram-se viáveis em
estudos com células mononucleares do sangue periférico, apresentando um perfil
de início de morte celular (apoptose tardia) apenas depois de 72 horas.
Para testar a performance da liberação dos sistemas contendo proteínas
da peçonha associadas, as nanopartículas foram capazes de prolongar a
liberação das proteínas por pelo menos 7 dias, sob condições específicas.
Utilizando um protocolo de imunização aprovado por comitê de ética para
uso de animais, as nanopartículas funcionalizadas contendo diferentes
concentrações de peçonha, foram capazes de induzir uma resposta imunológica
de memória contra a peçonha, de forte intensidade atingindo títulos de anticorpos
superiores a escalas de diluição de 1:51200.
Portanto, as nanopartículas de PLGA funcionalizadas com polietilenimina
se mostraram um interessante sistema bionanotecnológico de interesse
farmacêutico, uma vez que sua aplicação não se limita apenas ao uso como
dispositivo de imunização. O sistema também se mostra uma excelente
ferramenta de utilização para outros campos de estudo farmacêutico, como
biologia molecular, diagnóstico e aumento de eficácia terapêutica.
65
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