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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE
TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CARACTERIZAÇÃO DA BIOMASSA DE LEVEDURAS PROVENIENTE DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CERVEJA
MARCOS ANDRÉ DE ALMEIDA FILHO
NATAL/RN
2019
2
MARCOS ANDRÉ DE ALMEIDA FILHO
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CARACTERIZAÇÃO DA BIOMASSA DE LEVEDURAS PROVENIENTE DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CERVEJA
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Departamento de Tecnologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como
requisito parcial para a obtenção do título de
bacharel em Engenharia Química.
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini
Co-orientador: Me. Fábio Gonçalves Macêdo de Medeiros
NATAL/RN
2019
3
MARCOS ANDRÉ DE ALMEIDA FILHO
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
CARACTERIZAÇÃO DA BIOMASSA DE LEVEDURAS PROVENIENTE DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CERVEJA
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Departamento de Tecnologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como
requisito parcial para a obtenção do título de
bacharel em Engenharia Química.
Trabalho apresentado e aprovado em ___ de ____________ de _____.
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________
Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini
Orientadora
__________________________________________________
Me. Fábio Gonçalves Macêdo de Medeiros
Co-orientador
__________________________________________________
Carolina da Silva Costa
Membro interno
__________________________________________________
Eduardo Wagner Vasconcelos de Andrade
Membro interno
__________________________________________________
Raul Victor de Souza
Membro externo
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar aos meus pais, por me ajudarem todos os dias, permitindo
que eu persiga meus sonhos e me apoiando sempre para enfrentar os desafios da vida adulta.
Por todo o apoio, amor e carinho que me foi dado, sendo os principais responsáveis por tudo
que eu conquistei.
Sou grato aos meus amigos, Ciro, Matheus, Pedro Rolim, Pedro Teleton, Gustavo
Mister, Gustavo Costa, Giovanny, Joemil, Jordan e Rayan, integrantes do Grupo de Jovens,
pelo suporte diário e o apoio nas horas difíceis, me ajudando a superar os obstáculos da vida e
por serem a minha segunda família.
Agradeço à minha namorada, Alice Justo, por todo o apoio, amor e carinho em todos
esses anos de convivência.
À minha orientadora Profª Dra. Márcia por todo o suporte e disponibilidade na condução
desse trabalho.
Ao meu co-orientador Prof. Fábio por toda a paciência e ajuda durante o projeto. Além
de toda a sua genialidade em ensinar o que sabe sempre da melhor forma possível.
A todos os integrantes do LEA em especial, a Stephany, Thiago, Eduardo e Aline pela
ajuda com os experimentos, os quais foram fundamentais para a execução do trabalho.
À empresa-jr NUTEQ e aos seus integrantes, em especial a Rayan, Juan, Mateus e
Lorena, por me proporcionar o ganho de experiência e conhecimentos fundamentais para o meu
crescimento profissional e pessoal.
Aos professores e servidores da UFRN, pelo conhecimento passado, disponibilidade e
ajuda nas questões fundamentais na realização do meu curso.
Ao Futebol Interativo, por me proporcionar a primeira experiência profissional e
experiências engrandecedoras fundamentais para o meu desenvolvimento.
Aos meus colegas de trabalho, George, Jardel, Airton, Mattheus, Jâncy, Marcus e
Millena, por serem também meus amigos e me acolherem bem todos os dias. Por compartilhar
o seu conhecimento e me ensinarem lições valiosas que vão além da vida profissional.
5
RESUMO
A reutilização de resíduos provenientes de processos industriais tem cada vez mais relevância
econômica e social. Na indústria de alimentos, é crescente o número de estudos que abordam a
viabilidade do aproveitamento dos resíduos de processos como insumos, ou até como produtos
finais. Nesse contexto, destaca-se com grande potencial a indústria cervejeira, sendo
responsável, no Brasil, pela produção de 13,3 bilhões de litros em 2016. Um dos insumos
principais na fabricação da cerveja é a levedura, responsável pela transformação dos açúcares
dos cereais em álcool. A biomassa de levedura é reutilizada no processo até que suas
propriedades não sejam mais adequadas, então o descarte é realizado. A biomassa de levedura
(BL) corresponde ao segundo maior subproduto da indústria cervejeira. Dessa forma, este
trabalho abordou a caracterização da biomassa de leveduras da espécie Saccharomyces
cerevisiae, provenientes de quatro processos de produção diferentes, com objetivo de identificar
aplicações para esses resíduos. Foram analisados: o teor de proteínas, de gorduras, cinzas,
umidade e a cultivabilidade. Os teores médios de proteína, gordura e cinzas obtidos foram,
respectivamente, cerca de 32, 0,62 e 5,53%. A cultivabilidade teve ordem de grandeza de 108 .
Todos os experimentos ocorreram de forma satisfatória com a obtenção de parâmetros coerentes
para a posterior análise das possíveis aplicações dos subprodutos estudados.
Palavras-chave: subproduto; leveduras; biomassa; reutilização; caracterização.
6
ABSTRACT
The reuse of waste from industrial processes has increasing economic and social relevance. In
the food industry, the number of studies that address the feasibility of using the leftovers of
processes such as inputs, or even as final products, is increasing. In this context, the brewing
industry stands out with great potential, being responsible, in Brazil alone, for the production
of 13.3 billion liters in 2016. One of the main inputs in the manufacture of beer is yeast,
responsible for transforming cereal sugars into alcohol. Yeast biomass is reused in the process
until its properties are no longer adequate, so discarding is performed. Yeast biomass
corresponds to the second largest by-product in the brewing industry. Thus, this work addressed
the characterization of yeast biomass of the species Saccharomyces cerevisiae, from four
different production processes, in order to identify possible applications for these residues. The
following were analyzed: protein content, fats, ash, moisture and cultivability. The mean levels
of protein, fat and ash obtained were, respectively, about 32, 0.62 and 5.53%. Cultivability was
order of magnitude of 108 . All experiments occurred satisfactorily with the obtaining of
coherent parameters for the subsequent analysis of the possible applications of the studied by-
products.
Keywords: by-product; yeasts; biomass; reuse; characterization.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Cerveja Raffe 084 ..................................................................................................... 20
Figura 2 - Equipamentos da empresa ....................................................................................... 20
Figura 3 - Amostras colhidas. .................................................................................................. 21
Figura 4 - Amostras de levedura antes da secagem ................................................................. 22
Figura 5 - Destilador de nitrogênio durante a destilação da amônia. ....................................... 25
Figura 6 - Titulação do borato de amônio. ............................................................................... 26
Figura 7 - Balança determinadora de umidade ........................................................................ 28
Figura 8 - Colônias de levedura após a incubação ................................................................... 29
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Quantidades dos reagentes. ..................................................................................... 23
Tabela 2 - Massa para determinação das proteínas .................................................................. 24
Tabela 3 - Massa das amostras para extração Soxhlet ............................................................. 27
Tabela 4 - Massas das amostras e cadinhos correspondentes .................................................. 28
Tabela 5 - Teor de proteínas .................................................................................................... 30
Tabela 6 - Composição centesimal de lipídios ......................................................................... 31
Tabela 7 - Teor total de cinzas ................................................................................................. 31
Tabela 8 - Teor de umidade ..................................................................................................... 31
Tabela 9 - Teor de carboidratos ............................................................................................... 32
Tabela 10 - Cultivabilidade (UFC/mL) .................................................................................... 33
Tabela 11- Parâmetros de composição centesimais ................................................................. 33
9
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1 - Determinação do teor de proteína total ................................................................ 25
Equação 2 - Cálculo para determinação dos carboidratos ....................................................... 29
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 12
2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 14
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................... 14
2.2. Objetivos específicos ....................................................................................................... 14
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 15
3.1. Economia circular ............................................................................................................ 15
3.2. Cerveja ............................................................................................................................. 16
3.3. Levedura ........................................................................................................................... 18
3.4. Cervejaria Raffe ............................................................................................................... 19
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 21
4.1. Amostras .......................................................................................................................... 21
4.2. Caracterização .................................................................................................................. 22
4.2.1. Secagem ....................................................................................................................... 22
4.2.2. Proteínas ....................................................................................................................... 22
4.2.3. Gorduras ....................................................................................................................... 26
4.2.4. Cinzas ........................................................................................................................... 27
4.2.5. Umidade ....................................................................................................................... 28
11
4.2.6. Carboidratos ................................................................................................................. 29
4.2.7. Cultivabilidade ............................................................................................................. 29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 30
5.1. Proteínas .......................................................................................................................... 30
5.2. Gorduras .......................................................................................................................... 30
5.3. Cinzas .............................................................................................................................. 31
5.4. Umidade .......................................................................................................................... 31
5.5. Carboidratos .................................................................................................................... 32
5.6. Cultivabilidade ................................................................................................................ 32
5.7. Comparação dos valores ................................................................................................. 34
5.8. Possíveis aplicações ........................................................................................................ 35
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 36
12
1. INTRODUÇÃO
De acordo com Jurgilevich (2016), o conceito de economia circular se refere aos
esforços para remodelar, reciclar e reutilizar matéria-prima, diminuindo a utilização de recursos
naturais através do aproveitamento dos subprodutos. Esse conceito encontra bastante
aplicabilidade no contexto industrial, principalmente no que diz respeito a indústria alimentícia,
devido ao seu volume de produção e crescente expansão para atender a demanda
de consumo.
Segundo o anuário de 2016 da Associação Brasileira da Indústria da Cerveja
(CervBrasil), o setor cervejeiro se destaca, sendo a cerveja, a 4º bebida mais consumida no
mundo. No Brasil, esse setor é expressivo, colocando o país como o 3º maior produtor mundial,
com cerca de 14,1 bilhões de litros produzidos em 2016, ficando atrás apenas da China e dos
EUA. Apesar da recessão econômica, o setor cervejeiro nacional apresentou crescimento
contínuo (CervBrasil, 2016). Segundo Marcusso e Müller (2018), o número de cervejarias
artesanais no país apresentou um aumento de 1170% no período de 2008 a 2018. Essa grande
produção acarreta também uma enorme geração de resíduos. O país produz cerca de 2,5 milhões
de toneladas/ano de resíduos oriundos de cervejaria, fato que reforça a importância da economia
circular para o cenário nacional (SOUZA et al, 2018).
A levedura é um dos principais insumos da cerveja, sendo responsável pela
fermentação dos açúcares do mosto e sua transformação em álcool. Após ciclos sucessivos de
fermentação, ocorre a perda das suas características originais e é realizado o seu descarte
(Hellborg e Piškur, 2009) A biomassa de levedura (BL) representa, assim, um dos principais
resíduos do processo. A levedura residual da cerveja possui em sua composição, quantidades
significativas de compostos nitrogenados, proteínas e carboidratos, que viabilizam o seu
reaproveitamento para outras atividades (RECH et al., 2017).
São diversos os estudos sobre as possibilidades de reutilização da BL. Os usos mais
comuns são a aplicação como ração para ruminantes e a produção de alimentos destinados à
dieta humana (RECH et al., 2017). Porém, estudos mais recentes revelaram novas
possibilidades. Abrangendo a área farmacêutica, com pesquisas sobre a produção utilização
como substrato para produção de enzimas e até mesmo o uso como bioencapsulante para
transporte e liberação de medicamentos no interior do corpo (Sultana et al., 2017). Ambas os
estudos com um enorme potencial econômico no reaproveitamento desse resíduo.
13
Além do fator econômico, existe também o ambiental. Os subprodutos e resíduos
gerados do processamento de cerveja são reconhecidos por alta carga poluidora relacionada a
efluentes com alta carga orgânica e grande quantidade de biomassa, entre resíduos de matéria-
prima e de levedura (Maiti et al., 2017). Assim sendo, neste trabalho foram determinadas as
composições de amostras variadas de BL, por meio de diferentes técnicas de caracterização, a
fim de avaliar as possíveis aplicações desse subproduto.
14
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é a analisar e caracterizar a biomassa de levedura (BL)
proveniente de uma indústria cervejeira local a fim de identificar possíveis utilizações para
esse subproduto.
2.2. Objetivos específicos
a) Realizar a caracterização físico-química da biomassa da levedura com ênfase nos
parâmetros de composição centesimal (gorduras, proteínas, teor de cinzas, e
umidade);
b) Avaliar a viabilidade celular da biomassa de leveduras obtida após o processo de
fermentação;
c) Avaliar as possíveis aplicações do subproduto biomassa de leveduras a partir dos
parâmetros de composição.
15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Economia circular
Segundo Andrews (2015), a economia circular (EC) se apresenta como uma alternativa
à economia linear, que surgiu no contexto da Revolução industrial. Pela definição da Fundação
Ellen Macarthur, a EC tem como objetivo principal manter os produtos e materiais no nível
mais alto de utilidade pelo maior tempo possível. De acordo com dados retirados do Portal da
Indústria, pode-se dizer que a economia circular é um meio de uso mais eficiente dos recursos
naturais que aumenta a competitividade da indústria.
Figura 1: Comparação entre economia linear e circular.
Ainda segundo a Fundação Ellen Macarthur, a EC se baseia em três pilares: 1 – preservar
e aumentar o capital natural através do controle dos estoques finitos, 2 – otimizar a produção de
recursos por meio da circulação de produtos e materiais com alto nível de utilidade, 3 – fomentar
a eficácia do sistema pela redução de danos à produtos e serviços. Segundo o Portal da Indústria,
a transição para a economia circular exige um trabalho conjunto entre os setores público e
privado, por meio de incentivos fiscais, financeiros e de inovação.
Assim, a EC se relaciona intrinsecamente com a reutilização de resíduos por meio de
uma lógica sustentável de aproveitamento de recursos. Isso acaba por contribuir com a
diminuição do volume de descarte das indústrias, dentre elas, a cervejeira.
16
3.2. Cerveja
De acordo com o site Saint Bier, a cerveja tem sua origem atribuída à região da
mesopotâmia, onde teria surgido há seis mil anos. Os sumérios realizavam sua fabricação no
que se chamava de “casas de cerveja”, sendo a ocorrência de cevada selvagem na região, uma
das evidências da sua fabricação. Os egípcios também dominavam a fabricação dessa bebida,
que tinha grande relevância na sua estrutura social. No Egito, documentos revelam que a cerveja
era prescrita inclusive, como medicamento, para cura de certas doenças.
No Brasil, segundo a Associação Brasileira da Indústria da Cerveja (CERVBrasil), a
indústria cervejeira é responsável por cerca de 1,6% do PIB nacional com a produção de 14,1
bilhões de litros anuais, o que coloca o país como 3º maior produtor mundial. Segundo
Marcusso e Müller (2018), apesar da desaceleração da economia e indo na contramão de outros
setores, o número de cervejarias no país aumentou 8 vezes em 10 anos.
De acordo com a plataforma digital Homini Lúpulo, suas matérias-primas principais
são: água, malte, lúpulo e levedura. A água é o mais abundante, correspondendo por até 95%
da sua composição. Em segundo lugar está o malte, composto por grãos de cereais que foram
germinados controladamente. A esse processo de germinação controlada se dá o nome de
malteamento. Ele é o responsável pela produção de enzimas que irão transformar o amido em
açúcares fermentescíveis pelas leveduras. Segundo Venturini Filho (2016), utilizado em menor
quantidade, o lúpulo é o componente que dá o amargor da bebida, também contribuindo com a
sua conservação por possuir propriedades que inibem a proliferação de micro-organismos
indesejados. Em complemento a isso, Oliveira (2011) diz que as leveduras são as responsáveis
pela transformação dos açúcares gerados no malteamento em álcool por meio da fermentação,
sendo também utilizadas na produção de outros alimentos.
O processo produtivo da cerveja é relativamente simples, sendo as pequenas variações
das condições e matérias-primas, as responsáveis pelos diferentes estilos de cervejas. Segundo
o site de consultoria industrial Ianalítica, ele consiste basicamente nas seguintes etapas:
a) maltagem
b) moagem
c) brassagem/mosturação
d) filtração
e) fervura/adição do lúpulo
f) separação da torta
g) fermentação
17
h) maturação
i) clarificação
O processo tem início na preparação da matéria-prima, a partir da etapa de maltagem,
que é responsável pela produção de enzimas amilolíticas no interior dos grãos, posteriormente
utilizado como fonte energética dos vegetais. Em seguida a moagem expõe o interior dos grãos,
aumentando a área de contato do substrato (FILHO, 2016).
A mosturação consiste no cozimento do malte moído em água, para que as enzimas
produzidas na maltagem possam agir transformando o amido em açúcares fermentescíveis pelas
leveduras, processo batizado de sacarificação. A temperatura fica em torno dos 70 ºC e o tempo
de cozimento varia de acordo com o tipo de cerveja a ser produzida: quanto maior o teor
alcoólico final, maior o tempo de cozimento para uma conversão do amido. Para finalizar essa
etapa é aconselhado elevar a temperatura acima dos 75 ºC e desativar completamente as enzimas
(P&Q Engenharia).
Após a sacarificação, o mosto passa por uma filtração a fim de retirar o bagaço do malte
remanescente e segue para a adição do lúpulo. É realizada uma fervura (100 ºC) durante um
período de até 120 min, a depender do volume de líquido, para esterilizar o mosto e favorecer
a dissolução do lúpulo. A fervura também promove a volatilização de componentes indesejados
que podem causar sabores desagradáveis na cerveja (P&Q Engenharia).
Ao final da fervura, o mosto é resfriado promovendo a formação de um “lodo” de lúpulo
que se adere as paredes do recipiente e um sobrenadante composto por outros componentes não
solúveis. Dessa forma é necessário realizar uma separação, a qual é feita a partir da técnica de
whirlpool, onde o mosto é submetido a uma rotação, fazendo com que o resíduo decante no
centro do recipiente, fato que é facilitado com a queda na temperatura (NACHEL E
ETTLINGER, 2014).
A fermentação pode ser considerada a parte mais importante do processo, pois é a etapa
responsável de fato pela transformação do mosto e além de influenciar no sabor final, visto que
em paralelo à formação do álcool, a levedura produz em menor quantidade, outras substâncias
que interferem no aroma e sabor da cerveja. O processo de alta fermentação ocorre entre 15 e
20 ºC durante um período de três a cinco dias, originando cervejas do tipo Ale. A baixa
fermentação ocorre na faixa entre 6 e 8 ºC, por um período maior, de sete a 10 dias, dando
origem ao tipo Lager (TRINDADE, 2013).
Após a fermentação, o mosto segue para a maturação, ou segunda fermentação, onde as
suas propriedades são consolidadas. A depender da quantidade de açúcares presentes no mosto
18
ainda podem haver alterações no teor alcoólico final. Nessa etapa a cerveja é deixada repousar
em baixas temperaturas, próximas a 0 ºC, com duração variando de acordo com o estilo. Na
maturação também ocorre a decantação de alguns sólidos o que promove a clarificação da
bebida (TRINDADE, 2013).
A cerveja ainda passa por uma filtração para retirar as impurezas que causam turbidez e
assim clarificar o líquido, o que pode ser feito utilizando filtros com terra diatomácea, filtros de
placas ou filtros de membranas (FILHO, 2016). Após o fim dessa etapa, a cerveja já se encontra
própria para consumo, podendo ainda passar por outras etapas de acordo com objetivo da
produção. Para processos industriais ainda ocorrem a carbonatação, pasteurização e envase
(TRINDADE, 2013).
3.3. Levedura
As leveduras são organismos unicelulares, pertencentes ao reino dos fungos que
metabolizam matéria orgânica para obter energia, processo que é denominado de fermentação
(NITZKE E BIEDRZYCKI, 2019). São utilizadas pelo homem desde as primeiras civilizações
na produção de alimentos fermentados, como pães, vinhos, queijos. Possuem alto valor proteico
e também são fontes de vitaminas do complexo B, sendo utilizadas na fabricação de alimentos
probióticos pela sua ação contra patógenos. De acordo com Oetterer (2006), na indústria
alimentar, em especial na produção de cerveja, os gêneros mais comuns são o Saccharomyces
cerevisiae e Saccharomyces uvarum.
Figura 2: Saccharomyces cerevisiae
19
De acordo com Venturini Filho (2016), essas espécies conseguem fermentar sacarose,
glicose, frutose, maltose e outra diversidade de açúcares, os quais estão presentes no mosto da
produção de cerveja. Sendo mais utilizadas, as da espécie cerevisiae , por apresentarem alta
atividade fermentativa. Ribeiro (1999) cita fatores relevantes que despertam interesse no que
diz respeito a sua produtividade, eficiência fermentativa, tolerância ao etanol, resistência à altas
concentrações de açúcar e a propriedade de produzir anti-contaminantes.
Segundo Santos (2005), ao fim da fermentação alcoólica na produção de cerveja, a
separação das leveduras do produto é feita com a obtenção do resíduo úmido cervejeiro (RUC).
Esse resíduo pode ser obtido na primeira etapa da mosturação e também ao final do processo,
onde forma uma massa sólida composta pela levedura utilizada.
De acordo com Baccarin e Pezzato (2001), parte da levedura separada retorna ao mosto
para uma nova fermentação. Isso se repetindo até a sétima geração, ocorrendo em seguida o
descarte, após o oitavo ciclo. É estimado que um litro de resíduo de levedura é obtido a cada
83,3 litros de cerveja produzidos, sendo a biomassa residuária considerada um commodity
comercial.
3.4. Cervejaria Raffe
Apesar da maior parcela da indústria cervejeira se concentrar no sul e sudeste, o
Nordeste apresenta cada vez mais relevância no cenário nacional, sendo o estado do RN
responsável por 7% da produção nacional de cervejas artesanais. Essas indústrias movimentam
a economia por meio da utilização de ingredientes regionais e valorização da cultura local
(Marcusso e Muller, 2019).
Nesse contexto se encontra a cervejaria Raffe, indústria localizada em Natal/RN com
dois anos de funcionamento e oito rótulos distintos. Segundo o site da empresa, a Raffe nasce
do desejo de compartilhar o sabor de qualidade de suas cervejas. A cervejaria possui oito rótulos
que contam com estilos diferenciados, feitos com ingredientes regionais que abordam a cultura
potiguar através de personagens e locais históricos. Abaixo se encontram a imagem de um dos
rótulos da cervejaria e a sua logomarca estampada em um de seus equipamentos.
20
Figura 1- Cerveja Raffe 084
Figura 2 - Equipamentos da empresa
21
Figura 3 - Amostras colhidas.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Amostras
As amostras de levedura foram obtidas de quatro processos industriais distintos da
Cervejaria Raffe, localizada em Natal (Rio Grande do Norte). Todas pertencem à mesma
espécie (Saccharomyces cerevisiae), mas possuem características diferenciadas, selecionadas
de acordo com a cerveja a ser produzida. São elas: US-05 (13ºC), US-05 (18°C), WB-06 e T-
58. A figura abaixo apresenta as amostras utilizadas no trabalho.
Duas são do mesmo tipo, US-05, diferindo apenas na temperatura de fermentação: uma
para fabricação de cervejas do Lager (13°C) e a outra para o tipo Ale (18°C). Sendo a primeira
coletada após dois ciclos de fermentação e a segunda coletada após um ciclo. De acordo com a
Escola Virtual da Cerveja, esse fermento pertence a uma das cepas americanas mais comuns,
possui alta tolerância ao álcool e é ideal para cervejas que exigem fermentação neutra e limpa.
A do tipo WB-06 foi coletada após dois ciclos de fermentação. De acordo com a
plataforma DW Brasil, pertence a cepa alemã muito utilizada na produção de cervejas de trigo
do tipo hefeweizen, ales aromáticas decorrente da produção de ésteres e fenóis durante a
fermentação.
22
Figura 4 - Amostras de levedura antes da secagem
Também foi coletada, após um ciclo de fermentação, amostras da cepa T-58. Cepa
europeia utilizada na produção de cervejas belgas, com sabores picantes e de especiarias,
oriundos da produção de ésteres. Também de acordo com a Escola Virtual da Cerveja, ela possui
boa resistência ao álcool, sendo utilizada na fabricação de cervejas mais alcoólicas.
4.2. Caracterização
4.2.1. Secagem
As amostras após a coleta, possuem uma grande quantidade de água, proveniente do
mosto. Para a realização das análises, elas foram submetidas ao processo de secagem durante
48 horas em uma estufa à 60 °C. A figura abaixo contém as amostras após o processo de
secagem
4.2.2. Proteínas
De acordo com o Instituto Adolfo Lutz (2008), a determinação do teor total de proteínas
é feita através do método de Kjedahl , que consiste na digestão dos compostos nitrogenados
presentes na amostra, seguida da destilação e titulação da amônia, resultando no teor de
proteínas total (%). O experimento foi feito em quadruplicata, somando ao todo 16 análises.
23
4.2.2.1. Materiais e Equipamentos
● Ácido sulfúrico P.A.
● Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) P.A
● Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) P.A
● Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 30%
● Solução de ácido bórico 3%
● Vermelho de metila
● Azul de metileno
● Solução padrão de HCl 0,1 N
● Bloco digestor com aquecimento
● Destilador de nitrogênio
● Tubos de Kjedahl
4.2.2.2. Procedimentos
Foram preparados reagentes suficientes para as 16 análises de acordo com a quantidade
equivalente para cada amostra, como mostra a tabela.
● Preparação do catalisador
Os sulfatos de sódio e de cobre são utilizados na preparação do catalisador da digestão.
Eles são adicionados na proporção de 10:1 de Na2SO4 (10 partes) e CuSO4 .5H2O (1 parte).
Foram preparados aproximadamente 33 g de catalisador.
Reagente/Solução Quantidade Total
Ácido sulfúrico 5 mL 80 mL
Catalisador 2 g 32 g
NaOH 30% 30 mL 480 mL
Ácido Bórico 10 mL 160 mL
Solução indicadora mista 3 gotas -
Tabela 1 - Quantidades dos reagentes.
24
● Preparação da solução indicadora mista
Foi pesado 0,1 g de vermelho de metila e 0,1 g de azul de metileno. Separadamente, cada
reagente foi dissolvido em 50 mL de etanol. As duas soluções foram misturadas e
homogeneizadas.
● Digestão da amostra
Foram pesados 0,2 g de cada amostra em papel filtro, as quais foram adicionadas aos
tubos de Kjedahl. Na capela, foi adicionado 5 mL de ácido sulfúrico à cada tubo, que após
submetidos a agitação, foram organizados no bloco digestor com aquecimento até a temperatura
de 350 °C. A digestão procedeu até que o líquido dos tubos adquiriu aparência límpida e
transparente de cor verde. Após isso, o aquecimento foi desligado e as amostras foram deixadas
resfriar. Abaixo se encontra a Tabela 2 que contém a massas das amostras e a Figura 4 com os
tubos após a digestão no bloco digestor na capela.
Amostra Massa Média (g) Desvio
US–05 13º 0,2035 ± 0,0096
US–05 18º 0,1985 ± 0,0016
WB-06 0,2089 ± 0,0025
eT-58 0,2071 ± 0,0033
Tabela 2 - Massa para determinação das proteínas
Figura 5 - Tubo de Kjedahl e bloco digestor.
25
● Destilação da amônia
À cada tubo foi adicionado 10 mL de água destilada e agitado até a diluição e em um
Erlenmeyer de 250 mL, foi preparada a solução com 10 mL de ácido bórico 3% e 3 gotas da
solução indicadora. Com a torneira do copo dosador do destilador fechada, foi adicionado 30
mL da solução de hidróxido. A torneira foi aberta e todo o hidróxido foi transferido para o tubo
de Kjedahl, onde a amostra escureceu. O aquecimento foi ligado e o Erlenmeyer foi colado no
bico do condensador e a amostra foi destilada até a cor verde e completar 50 mL quando toda a
amônia é evaporada. A Figura 6 apresenta o destilador de nitrogênio com Erlenmeyer na saída
para a coleta da amônia.
Figura 5 - Destilador de nitrogênio durante a destilação da amônia.
● Titulação da amônia
O destilado foi titulado com a solução padrão de HCl 0,1 N até atingir a viragem da cor
rosa para o amarelo/verde. Após essa etapa, o cálculo do teor de proteína total é feito a partir
do volume do titulante utilizado por meio da Fórmula 1:
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (%) =𝑉 . 𝑓𝑐 . 0,0014 . 6,25 . 100
𝑚
Equação 1 - Determinação do teor de proteína total
26
Figura 6 - Titulação do borato de amônio.
Onde:
V = volume de HCl utilizado
fc (fator de correção) = 0,92
0,0014 = miliequivalente grama do nitrogênio
6,25 = fator geral de conversão do nitrogênio em proteínas
m = massa da amostra
A Figura 6 apresenta as amostras após a titulação.
4.2.3. Gorduras
De acordo com o Instituto Adolfo Lutz (2008), o teor de gorduras das amostras foi
determinado por meio de uma adaptação do método de Extração direta em Soxhlet, em
duplicata.
27
Nesse método, 1 g de amostra foi envolto em papel filtro e acondicionado nos tubos de
extração. Aos tubos, foram adicionados cerca de 100 mL de hexano, de forma que o nível do
líquido atingisse metade do papel filtro. O aquecimento foi ligado e a temperatura definida para
90 °C, superior ao P.E. do hexano (70°C). Dessa forma, o hexano em contato com a amostra
solubilizou os lipídios e os extraiu sucessivas vezes, ao evaporar e condensar durante
um período de 3 horas.
Após a extração, o aquecimento foi desligado e as amostras retiradas dos tubos, os quais
seguiram para a secagem. Nessa etapa, o hexano foi evaporado, restando apenas o resíduo
lipídico a ser pesado. O teor de gorduras final foi determinado por meio da diferença de massa
dos tubos, antes e após a extração. A Tabela 4 contém as massas obtidas para a determinação.
Amostra Massa Média (g) Desvio
US–05 13º 1,0712 ± 0,0768
US–05 18º 1,1241 ± 0,0083
WB-06 1,0987 ± 0,0953
T-58 0,9964 ± 0,0035
Tabela 3 - Massa das amostras para extração Soxhlet
4.2.4. Cinzas
Também chamada de resíduo por incineração, essa análise determina a quantidade de
inorgânicos presente na amostra, por meio da volatilização da parte orgânica à altas
temperaturas (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008).
Foi realizada em duplicata e 0,5 g de cada amostra foram pesados e adicionados aos
cadinhos de porcelana, que também foram pesados após aquecimento na mufla à 550 °C. As
amostras são acondicionadas na mufla durante 5 horas, também à 550 °C.
Após o período de aquecimento, os cadinhos foram deixados resfriar na mufla e depois
transferidos para um dessecador. Após a sua pesagem, o teor de cinzas foi determinado por
meio da diferença de massa. A Tabela 4 apresenta as massas medidas e os seus respectivos
cadinhos.
28
Figura 7 - Balança determinadora de umidade
Amostra Massa 1 (g) Cadinho Massa (g) Massa 2 (g) Cadinho Massa (g)
US–05 13º 0,4909 C1 23,1307 0,5131 C9 24,7700
US–05 18º 0,4915 C8 27,1528 0,5070 C4 27,5528
WB-06 0,5063 C5 24,9917 0,5043 C2 25,9500
T-58 0,4926 C3 25,5550 0,4918 C7 25,1334
Tabela 4 - Massas das amostras e cadinhos correspondentes
4.2.5. Umidade
A quantidade de água nas amostras foi determinada por meio da análise de umidade feita
com o auxílio de uma balança determinadora de umidade (M5 Thermo, Bel Engeneering, Itália).
A medição foi feita em triplicata, na qual amostras de 0,2 g foram acondicionadas em pratos de
alumínio e submetidas a aquecimento pelo tempo necessário para que a água contida na amostra
evapore e o equipamento determine o teor pela diferença de massa. A Figura 8 mostra a balança
utilizada com o teor de umidade sendo apontado no visor.
29
4.2.6. Carboidratos
O teor de carboidratos foi determinado por meio da diferença percentual, utilizando os
dados do restante das análises, através da Equação 2:
𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 (%) = 100 − 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 − 𝑔𝑜𝑟𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠 − 𝑐𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠 − 𝑢𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒
Equação 2 - Cálculo para determinação dos carboidratos
4.2.7. Cultivabilidade
A cultivabilidade, ou contagem da população foi determinada através do método de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC), baseado na metodologia de Câmara Júnior et al
(2019).
Desse modo, alíquotas de 1 mL de cada amostra foram diluídas em 9 mL de solução
salina tampão (PBS). Novamente, 1 mL da solução é diluída em mais 9 mL de PBS, assim
sucessivamente obtendo as concentrações de 10-1 até 10-6 mL para cada amostra.
Após a diluição, foi realizado o plaqueamento em duplicata, onde 0,1 mL de cada
solução diluída foram acondicionadas em placas de Petri, previamente preparadas com
meionutriente ágar. Sendo 4 amostras, 6 diluições para cada amostra e 2 plaqueamentos, foram
utilizadas ao todo, 48 placas.
As placas foram deixadas em estufa à 30 °C por 48 horas, tempo necessário para
incubação e multiplicação dos micro-organismos para posterior contagem das unidades
formadoras de colônia (UFC) e determinação da cultivabilidade. A figura abaixo mostra as
colônias em seu crescimento.
Figura 8 - Colônias de levedura após a incubação
30
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A discussão dos resultados foi feita da seguinte forma: primeiro as amostras tiveram
seus resultados comentados e comparados entre si, em seguida foi calculada uma média de todos
os parâmetros, tratando as amostras como uma só, para comparação com a literatura e estudo
das possíveis aplicações. Essa abordagem foi escolhida, dado que na indústria não há uma
separação do resíduo de levedura por cepas, a biomassa residual é misturada e depois é
descartada ou reutilizada.
5.1. Proteínas
A partir do volume de HCl 0,1 N utilizado nas titulações, foi possível calcular o teor
total de proteínas através da Equação 1. A Tabela 5 contém os resultados obtidos e os
respectivos desvios.
Levedura Proteína Total (%) Desvio
US–05 13º 29,3882 ± 2,1652
US–05 18º 22,3025 ± 0,8106
WB-06 43,9545 ± 1,1418
T-58 32,9711 ± 1,4290
Tabela 5 - Teor de proteínas
A partir dos resultados, nota-se que a cepa com maior teor proteico é a do tipo WB-06,
com aproximadamente 44% da massa total. Em seguida vem as amostras T-58, US-05 (13°C)
e US-05 (18°C), com cerca de 33, 30 e 29% de teor proteico total.
5.2. Gorduras
No geral as amostras possuem um baixo teor de lipídios, sendo a de maior teor, a US-05
(18°C), com cerca de 1,4%. Seguida pelas amostras: US-05 (13°C), WB-06 e T-58, com 0,76;
0,32 e 0,046 % de teor lipídico, respectivamente. A tabela abaixo apresenta o teor de gordura
para cada amostras.
31
Levedura Gordura Total (%) Desvio
US–05 13º 29,3882 ± 0,2414
US–05 18º 22,3025 ± 0,0526
WB-06 43,9545 ± 0,0863
T-58 32,9711 ± 0,0916
Tabela 6 - Composição centesimal de lipídios
5.3. Cinzas
A Tabela 7 apresenta a composição centesimal de inorgânicos das amostras.
Levedura Cinzas (%) Desvio
US–05 13º 5,0029 ± 0,3177
US–05 18º 5,5544 ± 0,2643
WB-06 7,3916 ± 0,0151
T-58 4,1652 ± 0,2269
Tabela 7 - Teor total de cinzas
Observa-se que a cepa com maior quantidade de inorgânicos é a WB-06, apresentando
um teor de 7,4%. As demais: US-05 (13°C), US-05 (18°C) e T-58, apresentaram teores de 5,0;
5,5 e 4,2%, respectivamente.
5.4. Umidade
Os resultados foram expressos em base seca (g H2O/g amostra seca) na Tabela 8.
Levedura Umidade (%) Desvio
US–05 13º 1,57 ± 0,2752
US–05 18º 1,86 ± 0,4492
WB-06 0,84 ± 0,4830
T-58 1,97 ± 0,3318
Tabela 8 - Teor de umidade
32
A amostra T-58 apresentou o maior teor de umidade com 1,97% da massa total. Em
seguida estão as amostras US-05 (18 ºC), US-05 (13 ºC) e WB-06 com 1,86; 1,57 e 0,84% de
umidade respectivamente.
5.5. Carboidratos
O teor de carboidratos determinado através da Equação 2 encontra-se na Tabela 9.
Levedura Carboidratos (%) Desvio
US–05 13º 63,2798 ± 1,0761
US–05 18º 68,9299 ± 1,6498
WB-06 47,4946 ± 2,2541
T-58 60,8480 ± 1,2872
Tabela 9 - Teor de carboidratos
A amostra WB-06 apresentou o menor valor, aproximadamente de 47,5%. O maior teor
foi o da amostra US-05 (18 ºC) com cerca de 69% da massa total, seguida pelas amostras US-
05 (13 ºC) e T-58 com 63,3 e 60,8% respectivamente. Os valores obtidos possuem desvios
consideráveis devido ao fato de que a determinação é feita por diferença do teor total e alguns
componentes que não foram determinados em outras análises acabam sendo somados ao teor
de carboidratos.
5.6. Cultivabilidade
Os resultados dessa etapa foram colhidos a partir das placas com concentração de 10-6 e
10-5 . Apesar das outras diluições, apenas nessas concentrações foi possível identificar as
colônias individuais e realizar a sua contagem. Em diluições menores, havia uma alta
concentração das leveduras, o que impossibilitava o procedimento. As sucessivas diluições
servem exatamente ao propósito de obter a concentração ótima para a contagem.
O crescimento das amostras US-05 (13°C) e T-58 não possibilitou a identificação das
UFC’s para a contagem na diluição de 10-5 mL. Sendo assim, o cálculo foi feito com base apenas
na diluição de 10-6 , sem prejuízo para a determinação dos resultados. A Tabela 10 contém os
valores de cultivabilidade obtidos.
33
Amostra UFC/mL
US–05 13º 2,50E+07
US–05 18º 3,78E+07
WB-06 4,88E+07
T-58 9,15E+08
Tabela 10 - Cultivabilidade (UFC/mL)
A amostra T-58 apresenta uma concentração de 9,1 x108, 10 vezes maior que a das
outras amostras, 2,50 x107; 3,78 x107; 4,88 x107, para US-05 (13 ºC), US-05 (18 ºC) e WB-06
respectivamente. A hipótese é que ela se adaptou melhor às condições de incubação, como
temperatura, tempo e substrato, aliado ao fato que de que sua coleta foi realizada após o primeiro
ciclo de fermentação.
A Tabela 11 apresenta a composição centesimal dos parâmetros analisados de todas as
amostras.
Amostra Gorduras
(%)
Cinzas
(%)
Proteínas
(%)
Umidade
(%)
Carboidratos
(%)
Cultivabilidade
(UFC/mL)
US-05 13°C 0,7624 5,0029 29,3882 1,57 63,2798 2,50E+07
US-05 18°C 1,3499 5,5544 22,3025 1,86 68,9299 3,78E+07
WB-06 0,3193 7,3916 43,9545 0,84 47,4946 4,88E+07
T-58 0,0458 4,1652 32,9711 1,97 60,8480 9,15E+08
Tabela 11- Parâmetros de composição centesimais
Nota-se a partir dos resultados da cepa US-05, que só o processo de fermentação já altera
as composições da biomassa. Ambas as amostras são do mesmo tipo, porém foram submetidas
a condições de processo diferentes, como a temperatura (13 e 18°C) por exemplo, o que resulta
em diferenças consideráveis.
Todo o processo fermentativo é estressante para as leveduras, uma vez que há a
exposição a fatores adversos, como oscilações de temperatura e pH, alta concentração de açúcar
e etanol e competição com outros micro-organismos. Dessa forma ocorrem alterações
significativas no seu metabolismo e consequentemente composição para a adaptação a esses
fatores (LUCENA et al, 2007)
34
5.7. Comparação dos valores
Foi calculado o valor médio de cada parâmetro de composição de modo a tratar as
amostras como uma só, a biomassa de leveduras. A partir do valor médio foi realizada a
comparação com os valores da literatura. A partir desse comparativo foram levantadas as
possíveis aplicações para o resíduo. Os resultados se encontram na Tabela 12.
Componentes Valor
médio RAMOS
(2009)
VALDUGA
(2016)
STROPPA et al
(2009)
Gorduras (%) 0,62 0,5 - 3,15 0,82 – 1,54 -
Cinzas (%) 5,53 4,95 – 7,99 1,74 – 13,72 -
Proteínas (%) 32,15 27,02 -
46,55 40,77 – 42,74 -
Umidade (%) 1,56 5,10 – 3,50 0,06 – 0,09 -
Carboidratos
(%) 60,14 - 44,61 – 53,67 -
Cultivabilidade
(UFC/mL) 2,57 x108 - - 2 x107 – 2 x108
No que diz respeito ao teor de proteínas, os resultados se mostram satisfatórios quando
comparados à literatura. Ramos (2009) obteve valores de 0,5 até 3,15% de teor lipídico para
BL oriunda de cervejaria, abrangendo os obtidos neste trabalho.
Realizando a determinação também por diferença, Valduga (2017) obteve teor de
carboidratos máximo de 53,67%, valor próximo do encontrado. A quantidade de cinzas
encontrada na literatura variou de 4,95 (RAMOS, 2009) até 13,72% (VALDUGA, 2017),
mostrando conformidade com os experimentos realizados. A umidade observada se aproximou
mais do valor obtido por Ramos (2009) que obteve valores entre 5,1 e 3,5 para secagem em
bandejas à 60 ºC por 120 min.
Por último a cultivabilidade foi comparada com os valores obtidos por Stroppa et. al.
(2009) que obteve resultados da ordem de 107 , demonstrando mais uma vez a conformidade
dos experimentos.
Ao realizar a pesquisa dos dados da literatura para comparação com os resultados
experimentais, nota-se uma gama de resultados diferentes. Isso é devido a enorme variação da
origem da levedura e dos processos fermentativos aos quais foram submetidas, ocasionado
35
valores discrepantes dos obtidos. Apesar dessa variação, foram escolhidos os resultados
provenientes de estudos de amostras semelhantes ao deste trabalho determinados por métodos
similares aos adotados.
5.8. Possíveis aplicações
De acordo com os resultados obtidos, foram levantadas as possibilidades de reutilização
da biomassa. É importante salientar que o resíduo de levedura pode ser aproveitado não somente
na sua forma integral. É possível o seu aproveitamento selecionando apenas alguns de seus
componentes, derivados tanto da parede celular quanto do conteúdo intracelular (COSTA,
2004). Destaca-se nesse contexto a operação de secagem, responsável por proporcionar a BL
uma forma física conveniente para o seu manejo, o que foi alcançado com sucesso neste
trabalho.
Com base nos dados, se mostra viável a utilização da BL, como complemento proteico
para ração animal. De acordo com Mandarino (2018), se equipara à soja, que possui cerca de
45% de teor proteico e ultrapassa com folga o milho, que apresenta em média 11%. No estado
do Rio Grande do Norte, essa via é bastante promissora, uma vez que além do setor pecuário,
existem a carcinicultura e a piscicultura, ambas atividades de relevância econômica para o
estado.
Ainda na área da suplementação animal, porém além do fator nutritivo, existem
pesquisas apontando outras potencialidades do uso da biomassa de levedura. Uma delas como
substituto de antibióticos promotores de crescimento em frangos (Franco, Pedroso e Grigoletti
,2005). Outros estudos analisaram o efeito de componentes da parede celular da levedura na
melhoria do sistema imunológico de suínos (Chiquieri et al., 2007)
Outra via possível é o seu aproveitamento como aditivo alimentar para dieta humana
devido ao seu alto valor nutritivo. Estudos já avaliaram a viabilidade do enriquecimento de
biscoitos e macarrão com extrato de leveduras, que apresentou perfil de aminoácidos essenciais
capaz de atender 100% a recomendação da FAO/OMS (SANTUCCI et al., 2003), e a
elaboração de cupcakes, de acordo com Rech (2017), utilizando a BL como aditivo na farinha
de trigo.
Estudos realizados por Melo (2010) apontam como possibilidades, a utilização da
biomassa como bioadsorvente no tratamento de soluções aquosas de metais pesados como o
chumbo e até mesmo o encapsulamento de compostos orgânicos.
36
6. CONCLUSÃO
O conceito de economia circular apresenta uma nova abordagem para diversos setores,
sendo o industrial um dos quais possui o maior impacto positivo, devido ao grande volume de
produção e agentes envolvidos. A sua aplicação no setor cervejeiro encontra grande potencial
com o aproveitamento da biomassa de levedura.
As caracterizações se mostraram em conformidade com o observado na literatura com
algumas ressalvas. O teor médio de lipídios foi de 0,62%, o de proteínas 32,15% o de cinzas
5,53%, a umidade obtida foi 1,56%, de carboidratos ficou em cerca de 60,14% e
cultivabilidade com de 108 . Dentre todos os parâmetros, o de carboidratos e a umidade foram
relativamente, os mais discrepantes em relação aos obtidos em outros estudos.
No caso dos carboidratos, isso se deve ao fato da sua medição ter sido realizada
indiretamente, por diferença da composição total. Dessa forma, outros componentes que não
foram contabilizados acabam por interferir no resultado. Já em relação a umidade isso se deve
aos diferentes métodos de secagem existentes que acabam por produzir resultados variados.
Levando em consideração apenas a cultivabilidade, os resultados demonstram ser
possível a reutilização das leveduras em outros ciclos de fermentação devido a alta
concentração de micro-organismos.
As possibilidades levantadas mostram ser pertinente, a parceria da cervejaria Raffe
com outras indústrias locais para o fornecimento de insumos para ração animal. O trabalho
conjunto com a universidade também se mostra relevante, permitindo o aprofundamento de
pesquisas nas áreas de alimentação humana e biotecnologia, o que pode agregar mais valor ao
resíduo e gerar lucro para a empresa.
Por fim, pode se afirmar que este trabalho possibilitou a determinação dos parâmetros
centesimais da composição de todas as amostras e forneceu informações valiosas que servem
como base para a avaliação do seu reaproveitamento.
37
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