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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
Marcelle Figueiredo Vilaça
QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE ENTREGUE PARA
PROCESSAMENTO INDUSTRIAL
CURITIBA
2012
Marcelle Figueiredo Vilaça
QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE ENTREGUE PARA
PROCESSAMENTO INDUSTRIAL
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de
Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade
Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Médica Veterinária
Orientadora: Profa. Dra. Anderlise Borsoi
CURITIBA
2012
TERMO DE APROVAÇÃO
Marcelle Figueiredo Vilaça
QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE ENTREGUE PARA
PROCESSAMENTO INDUSTRIAL
Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção do título de Bacharel no Curso de Bacharelado
em Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.
Curitiba, 19 de Junho 2012
Bacharelado em Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.
Orientador: Prof. Dra Anderlise Borsoi
UTP
Prof. Dr. Welington Hartmann
UTP
Prof. Dr. José Mauricio França
UTP
AGRADECIMENTOS
À Deus por estar presente me ajudando e dando força para seguir em frente
não apenas no decorrer de todo curso mas sim ao longo da minha vida.
À minha mãe Ana Lúcia por todo amor, esforço e dedicação, pessoa que sigo
como exemplo de mulher guerreira.
À minha tia Luzia que sempre esteve presente não apenas nos meus estudos.
À minha querida vó Olívia pelo o carinho e cuidado no decorrer da minha vida.
A minha irmã Michelle que do seu jeito sempre me deu apoio.
À minha amiga peludinha Meg pela inspiração e lembrança diária do porque
da escolha desta profissão.
À todos meus familiares que torceram e acreditaram na conclusão desta
etapa.
À minha orientadora Prof. Dra. Anderlise Borsoi por sua dedicação, paciência
e ensinamentos dados no desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus colegas de curso e professores pelos ensinamentos
compartilhados no decorrer desta etapa.
Aos funcionários do Laboratório de microbiologia da UTP e da Leiteria da
Fazenda Pé da Serra - UTP pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Deocy França pela oportunidade de estagiar no laboratório de
microbiologia de alimentos da UFPR
Obrigada a todos que direta ou indiretamente participaram desta etapa,
me fizeram crescer, tanto pessoalmente como profissionalmente
RESUMO
As condições higiênicas do local de obtenção do leite podem favorecer a presença e multiplicação de microrganismos patogênicos, podendo potencialmente contaminar o processamento.Visando avaliar a qualidade do leite entregue para processamento industrial esse trabalho pesquisou a contaminação por bactérias mesófilas, coliformes totais, Escherichia coli, Estafilococos aureus e Salmonella. O estudo foi conduzido com 16 amostras em duplicata de leite cru obtidas na Fazenda Pé da Serra-UTP e analisadas no laboratório de Microbiologia da UTP. Todas as amostras estavam dentro das normas quanto a ausência de Salmonella e dentro do padrão para contagem em placa de mesofilos segundo a IN 62 que é de 6,0 x 105 UFC/mL. Somente as amostras 3 da manhã e 3 da noite foram negativas para a presença de coliformes fecais. A amostra 3 da manhã apresentou contagem de Stahpylococcus aureus estatisticamente superior as demais amostras. Palavras-chave: leite cru, qualidade, Salmonella , Estafilococos aureus, Escherichia coli
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO _________________________________________________ 6
2 OBJETIVOS ___________________________________________________ 7
3 ORIENTAÇÃO E LOCAIS DE ESTÁGIO _____________________________ 8
4 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES ___________________________________ 9
5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA _______________________________________12
5.1 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS ____________________12
5.2 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E PESQUISA DE COLIFORMES
FECAIS __________________________________________________________ 12
5.3 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS _______________________________ 13
5.4 PESQUISA DE Salmonella _______________________________________ 16
5.5 COLORAÇÃO DE GRAM ________________________________________ 17
6 MATERIAIS E MÉTODOS _______________________________________ 20
7 RESULTADOS ________________________________________________ 28
8 CONCLUSÕES ________________________________________________ 30
REFERÊNCIAS ____________________________________________________ 31
1 INTRODUÇÃO
O leite é um alimento de extrema importância nutricional, é constituído de:
água, proteínas de alta qualidade, vitaminas, antioxidantes, gordura, lactose, cálcio e
outros minerais. (LANNA, 2000) Devido a sua grande quantidade de nutrientes,
possuir pH com valores variáveis entre 6,6 a 6,8 e sua temperatura no momento da
ordenha ser de aproximadamente 37ºC, o leite se apresenta como um meio
favorável ao crescimento bacteriano (OHI et al., 2010), tornando assim
imprescindível sua análise microbiológica.
Segundo pesquisas realizadas pela FAO (2010a) o Brasil é o quinto maior
produtor mundial de leite com um total de 31,7 milhões de toneladas, sendo o
segundo maior produtor das Américas ficando atrás apenas dos Estados Unidos que
produziu 87milhões de toneladas de leite. Do total do leite produzido no Brasil,
apenas 21 milhões de toneladas são de leite inspecionado (IBGE, 2010b). A
produtividade anual por animal em 2010 foi de 1.340 litros (FAO, 2010b) e o número
de vacas ordenhadas no ano de 2010 foram aproximadamente 23 milhões (IBGE,
2010a).
A maior parte da produção de leite do Brasil concentra-se nas regiões
Sudeste e Sul. Entre os estados, Minas Gerais lidera a produção nacional, com
27,3%, ficando em segundo lugar o Rio Grande do Sul com 11,8% da produção e o
Paraná em terceiro lugar com 11,7% (IBGE, 2010c).
Atualmente a IN (Instrução Normativa) 51 (Brasil, 2002) e a IN 62 (Brasil,
2011), ambas do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA),
regularizam o padrão de qualidade do leite cru refrigerado, incluindo o padrão
microbiológico. Segundo a IN 51 o leite deve possuir na Contagem Padrão em
Placas o valor máximo de 5,0 x105 UFC/mL enquanto que na IN 62 o valor máximo é
de 6,0 x 105 UFC/mL, com redução gradativa a partir de 2014 para no máx. 3,0 x
105 UFC/mL e em 2016 de no máx. 1,0 x 105 UFC/mL para os produtores individuais
das regiões Sul, Sudeste e Centro Oeste.
2 OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho de conclusão de curso foi analisar
microrganismos presentes no leite ordenhado e refrigerado para entrega a caminhão
coleta através das análises de contagem de microrganismos mesófilos, contagem de
coliformes totais, contagem de Staphylococcus, pesquisa de coliformes fecais e
pesquisa de Salmonella. Avaliar os resultados obtidos durante as analises e
compara-los com a legislação vigente.
3 ORIENTAÇÃO E LOCAIS DE ESTÁGIO
O Estagio Curricular Obrigatório para a obtenção do título de Medico
Veterinário foi realizado no mês de abril no laboratório de microbiologia de alimentos
da Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizado na Fazenda Experimental
do Canguiri, Rua Ivone Pimentel nº 1000, Bairro Canguiri, Pinhais, CEP 83300 - 000;
Neste local foi orientado pelo Dr.Deocy França, professor de tecnologia de alimentos
na UFPR. Durante o mês de maio, as atividades foram realizadas no laboratório de
microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná (UTP) utilizado para atividades
praticas nos cursos da universidade, Rua Sydnei a Rangel Santos 238, Santo Inacio,
CEP 82.010 - 330; orientado pela professora Dra.Anderlise Borsoi, responsável
pelas disciplinas de Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal e Doença de
Aves e Suínos. A carga horária total desenvolvida no estágio foi de 360h.
4 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES
As atividades realizadas foram preparação de materiais e meio de cultura
para as análises microbiológicas, esterilização de materiais limpos e contaminados,
preparo e diluições de amostras, análises microbiológicas (mesófilos, psicrotróficos,
coliformes totais, estafilococos, coliformes fecais e Salmonella), leitura e contagem
em placa e expressão de resultados.
FIGURA 01 – PREPARO DO AGAR PCA: ERLENMEYER COM SOLUÇAO DE AGUA E ÁGAR,
SOB APARELHO DE AGITAÇAO MAGNETICA E AQUECIMENTO.
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 02 – AGAR EMB ( À ESQUERDA, CONTEÚDO ESCURO ) E AGAR PCA ( À DIREITA,
CONTEÚDO CLARO) PRONTOS PARA SEREM AUTOCLAVADOS
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 03 – MEIOS DE CULTURA EM AUTOCLAVE
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 04 – SECAGEM DO MEIO XLD NAS PLACAS DE PETRI, EM FLUXO LAMINAR.
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 05 – CALDO EC DISTRIBUÍDO EM TUBOS DE ENSAIO ANTES DA AUTOCLAVAGEM.
FONTE: o próprio autor.
5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
5.1 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS
Este grupo de bactérias tem grande importância por incluir a maioria dos
contaminantes do leite, tanto deteriorantes como patógenos, podem ser
caracterizados por se desenvolverem entre temperaturas de 20 a 45ºC, com a
temperatura ótima de crescimento entre 30 e 40ºC (LORENZETTI, 2006).
Sua presença em grande número indica matéria-prima excessivamente
contaminada, limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas, higiene insuficiente
na produção e condições inapropriadas de tempo e temperatura durante a produção
ou conservação dos alimentos (CARDOSO et al. , 2000).
A refrigeração do leite a 4°C tem como principal objetivo controlar a
multiplicação destes microrganismos (LORENZETTI, 2006).
O meio de cultura mais utilizado na metodologia convencional é o Agar
Padrão para Contagem (PCA). Esta contagem detecta o número de bactérias
aeróbias ou facultativas mesófilas, presentes em forma vegetativa e esporulada
(OLIVEIRA, 2005).
5.2 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E PESQUISA DE COLIFORMES
FECAIS
O grupo de coliformes totais é constituído por enterobactérias como
Enterobacter sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp., Escherichia sp. entre outras. Estes
quatro gêneros mais frequentes são encontrados nas fezes do homem, animais de
sangue quente, na natureza e em certos vegetais (SILVA JR, 1995). Os coliformes
incluem todos os bacilos gram-negativos, aeróbios e anaeróbios facultativos,que não
formam esporos e são capazes de a 32-35°C em 48 horas fermentar a lactose,
produzir ácido, gás e degradar proteínas (OHI et al., 2010; TRONCO, 2010).
Os coliformes fecais ou coliformes termotolerantes pertencem ao grupo de
bactérias coliformes, porém utilizam a lactose a 44,5ºC no meio de cultura EC (Caldo
Escherichia coli) com produção de gás. O mais importante microrganismo deste
grupo é a Escherichia coli, bactéria exclusiva do intestino de animais de sangue
quente. A E. coli é indicadora de condições sanitárias, sua presença evidencia
práticas de higiene inferiores ao padrões requeridos, indica se houve contaminação
fecal. Os principais sintomas da intoxicação por E. coli são diarréia podendo
conter sangue, vômito, febre, cólica, mal estar e calafrios (SILVA JR, 1995).
Os coliformes do leite têm origem de utensílios mal desinfetados, tais como
baldes, tarros, tanques e máquinas de ordenha, podendo haver contaminação de
esterco e pêlos do animal que caem durante a ordenha (TRONCO, 2010). Além de
serem indicadores de higiene de produção, também podem produzir uma série de
enzimas que comprometem a qualidade dos derivados a que o leite cru é destinado
(NERO, 2005). Estas bactérias podem ser controladas pelo método de alta
temperatura em curto tempo (pasteurização) (OHI et al., 2010).
No Agar EMB (Eosin Methylene Blue Agar) as colônias de coliformes fecais
características (Figura 06) apresentam de 2 a 3 mm de diâmetro, com brilho
metálico esverdeado (TRONCO, 2010).
FIGURA 06 – ESCHERICHIA COLI ATCC 51823 EM AGAR EMB
FONTE: o próprio autor.
5.3 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS
Os estafilococos estão presentes na pele e mucosas de mamíferos, portanto
seres humanos e outros animais podem veicular este microrganismo para o leite e
seus derivados, visto que vários fatores como uso de ordenha manual, falhas na
higiene dos animais e equipamentos, bem como ausência de programas de controle
de mastite, ainda ocorrem em muitos rebanhos (SANTOS, 2008). O Staphylococcus
aureus (S. aureus) é um dos principais agentes etiológico da mastite bovina,
contaminando o leite na sua obtenção (SANTANA et al., 2006).
S. aureus é um coco Gram positivo, anaeróbico facultativo, não móvel,
catalase e coagulase positiva, não esporulados. As células são esféricas podendo
ocorrer sozinhas, pareadas, ou apresentam formações semelhantes a cachos de
uva (CHAPAVAL et al., 2009).
O método de referência para enumeração de S. aureus é a contagem em
placas contendo ágar Baird-Parker (BP), que permite o isolamento e a enumeração
de microorganismos injuriados sem a etapa de enriquecimento não seletivo,
apresentando como desvantagem, o fato de não ser totalmente seletivo. Por tal
razão, a detecção de S. aureus em amostras de leite cru e derivados, que estejam
muito contaminadas por microrganismos competidores, é limitada neste meio
(SANTOS, 2008).
As características de crescimento das colônias típicas no BP (Figura 07) são
negras, brilhantes, delimitadas e com dois halos, sendo associada estas
características a capacidade do microrganismo em produzir a enzima coagulase
(SANTANA et al., 2006). Para confirmação das colônias típicas de S. aureus pode-
se fazer os testes bioquímicos da Catalase e o da Coagulase.
FIGURA 07 - PLACA DE PETRI COM COLÔNIAS TÍPICAS DE S. AUREUS.
FONTE: PVL, disponível em: < http://www.pvl.pt/pt/produto/38_46+184/baird-parker-agar-base-
bk055/>
O Teste da Catalase consiste em emulsionar uma alçada de uma colônia
típica de S.aureus em uma gota de água oxigenada (peróxido de hidrogênio) em
uma lâmina de vidro e observar a ocorrência de borbulhamento imediato (teste
positivo) ou não (teste negativo) (Figura 08). O S. aureus possuí a enzima catalase
que degrada peróxido de hidrogênio e o transforma em água e oxigênio (CHAPAVAL
et al., 2009).
FIGURA 08 – TESTE NEGATIVO (2) E TESTE POSITIVO (5) PARA CATALASE
FONTE: o próprio autor.
O Teste da Coagulase consiste em colocar uma gota de salina em uma
lâmina e emulsionar uma colônia isolada a ser testada em seguida colocar uma gota
de plasma de coelho e homogeneizar com um palito de madeira, observar se há
aglutinação em alguns segundos. Quando ocorre a coagulação considera-se teste
positivo, a coagulase está presente no S. aureus e induz a coagulação do sangue,
convertendo o fibrinogênio do plasma em fibrina (ANVISA, 2004).
Algumas cepas de S. aureus, geralmente cepas coagulase positiva, estão
aptas à produzir enterotoxinas estafilocócicas (CHAPAVA, 2009), são estas
liberadas no alimento durante seu desenvolvimento e não o microrganismo em si o
agente causador da intoxicação alimentar (SANTOS, 2008). Os principais
sintomas da intoxicação estafilocócica são náuseas , vômito, cãibras
abdominais e diarréia (SANTANA et al., 2006).
Quanto à resistência térmica, são microrganismos termolábeis, sendo
inativados em temperaturas superiores a 60 ºC por três minutos (SANTOS, 2008), as
enterotoxinas estafilocócicas não são inativadas pelo processo de pasteurização e
permanecem no leite pasteurizado tornando-se um risco à saúde humana
(BORGES, 2008).
5.4 PESQUISA DE Salmonella
O gênero Salmonella é composto por bacilos gram-negativos, não produtores
de esporos, pertencentes à família das Enterobacteriaceae. As bactérias desse
gênero são anaeróbias facultativas, móveis (com poucas exceções), tem a
capacidade de reduzir nitratos a nitritos, fermentam glicose e geralmente não
fermentam lactose ou o fazem lentamente (GUERRA, 2010).
É um importante patógeno que utiliza como reservatório o trato
gastrointestinal do homem e de animais (SILVEIRA et al., 2011), causando
enfermidades, como diarreia em bezerros, e produz altas taxas de morbidade e
letalidade nos animais portadores. Pode ser o agente causal de mastite bovina
subclínica (GENEROSO, 2011).
Em humanos a enfermidade causada pela bactéria chama-se salmonelose e
seus principais sinais clínicos são infecção intestinal com disenteria, podendo
apresentar febre, vômito, mal estar, calafrios, hipotensão, septicemia, choque
endotoxico e morte (SILVA JR, 1995). O sorotipo de maior importância causador de
infecções alimentares é S. enteritidis, sendo a causa predominante de salmonelose
em diversos países (SHINOHARA et al., 2008).
É uma zoonose de grande preocupação da indústria de alimentos por ser
frequentemente isolada de produtos de origem animal tendo importância para
garantia da segurança alimentar (SILVEIRA et al., 2011). A salmonela é
termossensível podendo ser destruída pela pasteurização tornando o leite
pasteurizado um alimento seguro neste quesito (TOLEDO, 2003).
As colônias típicas de Salmonella em Agar Xilose Lisina Desoxicolato
(XLD) são vermelhas com o centro preto devido à produção de H2S (Figura 10) e em
Agar verde brilhante (AVB) são esbranquiçadas com halos vermelhos (Figura 09)
(BD, 2011).
FIGURA 09 – S. ENTERITIDIS ATCC 13076 EM AGAR VERDE BRILHANTE (AVB)
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 10 - S. ENTERITIDIS ATCC 13076 EM AGAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD)
FONTE: o próprio autor.
5.5 COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram é o método bacterioscópico mais importante e mais
utilizado atualmente na bacteriologia, sua finalidade é a classificação de
microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e
arranjo celular. As bactérias são classificadas basicamente em dois grandes grupos:
Gram-positivas (Figura 11) e Gram-negativas (Figura 12), corando-se de roxo e de
rosa respectivamente (FREITAS,2007).
FIGURA 11 - COLORAÇÃO DE GRAM-POSITIVO - STAPHYLOCOCCUS AUREUS
FONTE: KRIAT, 2007, disponível em: <http://www.geniebio.ac-aix-
marseille.fr/biospip/spip.php?article252&id_document=837#documents_portfolio>
FIGURA 12 - COLORAÇÃO DE GRAM-NEGATIVO - SALMONELLA
FONTE: KRIAT, 2007, disponível em: <http://www.geniebio.ac-aix-
marseille.fr/biospip/spip.php?article252&id_document=831>
Este método de coloração de bactérias foi desenvolvido pelo médico
dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, consiste no tratamento
sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal
violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina. Essa técnica permite a separação de
amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas baseando-se na
composição da parede bacteriana, permitindo determinar a morfologia e o tamanho
das bactérias analisadas (PERAZZOLO, 2006).
Segundo estudo realizado por Freitas (2007) o melhor protocolo da técnica
para coloração de Gram é a sequência a seguir: cristal violeta por 1 min , lavagem
com água, lugol por 1 min, lavagem com água , álcool-acetona gotejar até que não
desprenda mais a cor violeta do esfregaço, lavagem com água e fucsina 30 s.
6 MATERIAIS E MÉTODOS
Durante quatro semanas do mês de maio de 2012, realizou-se coletas de leite
para analise microbiológica na Fazenda Pé da Serra, localizada em São José dos
Pinhais. Semanalmente coletou-se 4 amostras de leite refrigerado da ordenha da
noite e 4 amostras de leite também refrigerado da ordenha da manhã. Ao final do
mês totalizou-se 32 de amostras para trabalho (16 coletas em duplicata).
Amostras com volumes de 200 mL foram coletadas em frascos de vidros
esterilizados e armazenados em caixa isotérmica com gelo até a chegada ao
laboratório no mesmo dia para processamento .
Todas as análises foram realizadas previamente para a aferição do método
com as seguintes bactérias controles: Escherichia coli ATCC 51823; Staphylococcus
aureus ATCC 6538; Salmonella Enteritidis ATCC 13076 (Figura 13).
FIGURA 13 – BANCADA ORGANIZADA PARA INÍCIO DAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
FONTE: o próprio autor.
Contagem de microrganismos mesófilos
A partir do leite in natura foram realizadas diluições decimais em água
peptonada a 0,1% (AP, OXOID) até a diluição 10-5 (Figura 14), sendo o leite in
natura a amostra 100. Alíquotas de 1mL de cada uma das diluições foi transferido
para placas de Petri (Figura 15) e semeados em profundidade com Agar de
contagem padrão em placas (PCA, Himedia) (Figura 16), incubado a 35°C por 48h.
A leitura das placas (Figura 17) e contagem (Figura 18) foi realizada selecionando-
se placas que continham entre 25 e 250 colônias.
FIGURA 14 – DILUIÇÕES DECIMAIS DE LEITE EM AP (10º A 10-5
), DA ESQUERDA PARA A
DIREITA.
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 15 – 1 ML DO TUBO 10º TRANSFERIDO PARA PLACA DE PETRI
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 16 - SEMEADURA EM PROFUNDIDADE COM PCA
FONTE: o próprio autor.
No cálculo das contagens, o resultado final foi expresso em UFC/ mL
(unidade formadora de colônias por mililitro), levando-se em conta a diluição
empregada, da seguinte modo: R = a x 10b UFC/g ou mL (sendo: R = resultado; a =
os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9; b = expoente de 0 a
10) e realizando média entre os resultados.
FIGURA 17 - PLACAS DE AGAR PCA DAS DILUIÇÕES 10º A 10-5
, APÓS INCUBAÇÃO, PRONTAS
PARA LEITURA E CONTAGEM DE COLÔNIAS.
FONTE: o próprio autor
FIGURA18 - PLACA COM MARCAÇÃO PARA CONTAGEM DAS COLÔNIAS EM AGAR PCA
FONTE: o próprio autor
Contagem de coliformes totais
A contagem de coliformes totais foi realizada a partir das diluições citadas e o
meio utilizado para a contagem foi o Agar EMB (Himedia) incubados a 35°C por 48h,
com mesma metodologia para expressão de resultados. (Figura 19)
FIGURA 19 - SEMEADURA EM PROFUNDIDADE COM AGAR EMB
FONTE: o próprio autor.
Pesquisa de coliformes fecais
A partir do crescimento em ágar EMB (Himedia), foram selecionadas 3
colônias de cada amostra processada, e inoculadas em caldo EC (Himedia) com
tubos de Duram. Incubou-se a 45°C por 48h. Foram considerados positivos os tubos
com presença de gás (Figura 20).
FIGURA 20 - TUBOS DE ENSAIO COM TUDOS DE DURAN NO INTERIOR E CALDO EC. LEITURA
DE TESTE POSITIVO ( À ESQUERDA) E TESTE NEGATIVO (À DIREITA). NOTAR PRESENÇA DE
BOLHA DE GÁS DENTRO DO TUBO DE DURAN (SETA)
FONTE: o próprio autor.
Contagem de estafilococos
Alíquotas de 0,1 mL (Figura 21) a partir das diluições iniciais foram semeadas
com alça de Drigalsky (Figura 22) em Agar Baird Parker (BP, BD Difco).
FIGURA 21 – 0,1 ML DA DILUIÇÃO 10º TRANSFERIDO PARA PLACA DE PETRI COM AGAR
BAIRD PARKER
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 22 – SEMEADURA EM SUPERFÍCIE COM ALÇA DE DRIGALSKY DESCARTAVEL EM
AGAR BAIRD PARKER
FONTE: o próprio autor.
Após incubadas por 24/48h a 35°C (Figura 23), foi realizada a contagem das
colônias típicas (negras com halo translúcido) e atípicas. A confirmação das colônias
típicas foi realizada através de aglutinação em látex (Staphclin Latex, Laborclin)
(Figura 24).
Figura 23 – PLACAS DE PETRI EM ESTUFA PARA INCUBAÇAO.
FONTE: o próprio autor.
FIGURA 24 – AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX (STAPHCLIN LATEX, LABORCLIN) 1. TESTE POSITIVO
2. TESTE NEGATIVO
FONTE: o próprio autor.
Pesquisa de Salmonella
O pré enriquecimento foi realizado através das diluições 10 -1 de cada amostra
incubadas em estufa a 37°C por 24 horas após este período foi realizado o
enriquecimento seletivo em caldo Rappaport Vassiliadis Medium (RV, Himedia)
inoculando 100 µL de cada amostra já pré enriquecida nos tubos permanecendo em
estufa a 42°C por 24h. No terceiro dia foi realizado o plaqueamento em superfície
com alça bacteriológica em Agar Verde Brilhante (BD) e XLD (Himedia) (Figura 25)
incubadas por 24h a 37°C após este período foi realizada a leitura das placas.
FIGURA 25 – ESTANTE COM TUBOS DE ENSAIO CONTENDO CALDO RV APÓS INCUBAÇÃO E
AGARES PARA PLAQUEAMENTO AVB E XLD, PLACAS DISPOSTAS A FRENTE DA ESTANTE
(ESQUERDA PARA DIREITA).
FONTE: o próprio autor.
7 RESULTADOS
Abaixo na Tabela 01 são mostrados os resultados das contagens de
microrganismos mesófilos, coliformes totais e estafilococos; e presença de
coliformes fecais nas amostras de leite analisadas. Os dados da tabela 01 referem-
se as análises das coletas semanais, contando com número de 8 amostras, sendo
04 para cada turno (M) manhã e (N) noite.
TABELA 01 - RESULTADOS DAS CONTAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS,
MICRORGANISMOS MESÓFILOS, COLIFORMES TOTAIS E PRESENÇA DE COLIFORMES
FECAIS DURANTE AS QUATRO SEMANAS DE AMOSTRAGEM DO LEITE RESFRIADO
ORDENHADO A TARDE E NAS MANHAS, COLETADOS DO TANQUE RESFRIADOR.
Semanas Número
amostral
Médias de contagens UFC/mL Coliformes Fecais
SA MES CT
1M 4 5,5 x103bc
1,9 x 105 1,3 x 10
4 NR
1N 4 1,0 x103bc
4,5 x 105a
1,4 x 103 NR
2M 4 1,3 x103b
6,4 x 104ab
6,0 x 103a
Positivo
2N 4 1,4 x104c
4,7 x 105a
3,3 x 103b
Positivo
3M 4 4,9 x104a
1,3 x 105 5,4 x 10
3 Negativo
3N 4 3,8 x104 7,5 x 10
4ab 6,0 x 10
3 Negativo
4M 4 1,0 x104bc
1,7 x 105 3,9 x 10
3 Positivo
4N 4 1,3 x104bc
5,7 x 104ab
2,5 x 104 Positivo
Valor p 0,001 0,02 0,02 Positivo
SA: Staphylococcus aureus; MES: microrganismos mesófilos; CT: coliformes totais; M: manhã;
N: noite; p: nível de significância estatística; NR: não realizado.
As análises estatísticas dos dados foi realizada com o programa BioStat,
2009 (AnalystSoft . Inc. USA), analise ANOVA, em análise de um fator, completo
com variável de grupo. Nivel de confiança 95%.
Quanto a pesquisa de Salmonella, as amostras resultaram em ausência em
100% das analises.
A respeito das análises microbiológicas realizadas no presente trabalho,
conforme a legislação IN 62 o limite para mesófilos é de 6,0 x 105 UFC/mL, e todos
estavam dentro do limite.
Foram agrupadas as 16 amostras coletadas no turno da noite e as 16
amostras coletadas no turno da manhã em dois grupos e realizada as analises
estatísticas para os microrganismos pesquisados. Não houve diferença estatística
entre as diferentes contagens para os dois turnos de coleta, sendo elevada a
variância entre as médias.
8 CONCLUSÕES
1- Todas as amostras estiveram dentro do padrão da legislação para
contagem em placa de mesófilos.
2- As amostras 1N e 2N apresentaram maiores números de mesófilos frente
as demais amostras.
3- Todas as amostras estavam dentro das normas quanto a ausência de
Salmonella.
4- A amostra da semana 3 coleta da manhã (3M) apresentou contagem de
Stahpylococcus aureus estatisticamente superior as demais amostras.
5- A amostra 2M obteve maior numero de coliformes totais e positividade para
presença de coliformes fecais.
6- Somente as amostras 3M e 3N foram negativas para a presença de
coliformes fecais.
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