UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI CAMERINO Facoltà di Scienze e Tecnologie

Dipartimento di Biologia MCA

Bando Ricerca e Sperimentazione – L.R. 37/99 – DGR 1234/05

L’arca delle verdure (Progetto n° 4)

Relazione dettagliata sull’attività svolta e sui risultati ottenuti nel secondo

anno di attuazione del progetto

ALLEGATO 1

Responsabile scientifico: Prof. Evandro Fioretti Dipartimento di Biologia MCA, Università di Camerino 62032 Camerino (MC) Tel. 0737/403210 Fax 0737/636216 Email: evandro.fioretti@unicam.it

Premessa Il Progetto L’Arca delle Verdure nasce con lo scopo di incrementare la “qualità” delle produzioni di verdure spontanee commercializzabili influendo sia sul processo produttivo che sulla caratterizzazione del prodotto, soprattutto in termini salutistici. Il progetto ha una durata triennale e vede coinvolte oltre all’Università di Camerino (soggetto coordinatore) l’Azienda Agrifaber, la CIA Marche e la CIA Service. In questa relazione vengono riportati i risultati ottenuti nel secondo anno di attuazione (1 Gennaio 2008- 31 Dicembre 2008). Contesto scientifico del progetto (Strategie innovative per la caratterizzazione di specie vegetali: analisi metabolomica e funzionale) Le piante sintetizzano un’incredibile repertorio di molecole d'interesse applicativo nel campo farmaceutico, agrario e alimentare. Particolare importanza rivestono i metaboliti secondari (SMs), cui appartengono molecole non coinvolte nei processi metabolici di base delle cellule, ma che intervengono come mediatori nell'interazione delle piante con il loro ambiente. Le piante, a causa della loro immobilità, durante il ciclo vitale sono esposte ad ampie modificazioni delle condizioni ambientali e per questa ragione necessitano di sistemi di difesa sviluppati. Ogni volta che nell’ambiente si verifica una variazione, in difetto o in eccesso, si parla di “stress” perché l’organismo vivente è soggetto a modifiche potenzialmente dannose. La crescita e lo sviluppo delle piante dipendono dalle interazioni del genotipo con due diversi fattori di “stress” classificati in: • biotici quando l’agente è un organismo vivente (infezioni da virus, batteri, funghi, nematode) • abiotici quando il responsabile è l’ambiente (carenza idrica, salinità, metalli pesanti, ozono,

anidride carbonica, alte e basse temperature) Fino ad oggi, nelle piante, sono stati identificati decine di migliaia di SMs ed è stato stimato che ne esistono centinaia di migliaia, ancora non identificati, che rappresentano una autentica riserva di composti chimici con attività biologiche da chiarire. L'insieme di tutti i metaboliti, intermedi di metaboliti e metaboliti secondari, che descrivono dinamicamente un organismo (1-3) viene indicato come metaboloma. Esso può essere analizzato per sottoinsiemi congruenti, al fine di evidenziare relazioni fra variazioni delle componenti di tali sottoinsiemi e condizioni di vita dell'organismo. In particolare, alcune classi di SMs di specie vegetali sono state messe in relazione al tipo di cultivar e possono essere utilizzate quali markers delle condizioni coltivari e degli stress ambientali alla quale la pianta viene sottoposta. La produzione di metaboliti secondari è il risultato della co-evoluzione tra gli organismi vegetali e i loro parassiti/predatori. Infatti, tali metaboliti svolgono un ruolo fondamentale in numerose interazioni ecologiche, quali la deterrenza nei confronti di erbivori, la protezione da patogeni o l'allelopatia. La produzione di metaboliti secondari all'interno dei tessuti vegetali è fortemente influenzata dai fattori biotici/abiotici ed è considerata una tipica risposta delle piante agli stress (4). Tra le numerose funzioni svolte nelle specie vegetali da SMs è molto importante l’azione antiparassitaria svolta dai metaboliti benzopiranici (flavonoidi). Essi costituiscono una delle fondamentali strategie di difesa delle piante, e i livelli e la composizione di tali metaboliti vengono, da tempo, messe in relazione con la "qualità di vita" della pianta stessa. Inoltre, il pattern di tali metaboliti evolve durante il processo di maturazione. Parti specifiche della pianta, che devono resistere anche isolatamente (ad es. semi, radici, buccia) sono dotati di un corredo specifico di tali metaboliti. Un'altra sfida per le ricerche volte alla scoperta di nuove molecole bioattive di origine vegetale è costituita dalla necessità di avere un quadro completo del profilo metabolico delle specie vegetali di interesse e, quindi, la necessità di sviluppare metodologie e tecnologie sensibili di analisi biochimica e fitochimica capaci di descrivere dettagliatamente la complessità e la diversità chimica dei prodotti metabolici totali sintetizzati da una data specie vegetale, anche quando presenti in quantità ridotte. A tale scopo, sono nate due nuove discipline (i) la metabolomica, che analizza l’insieme dei metaboliti intra ed extra-cellulari in sistemi biologici

(ii) la metabonomica che permette di definire il fingerprinting metabolico di un determinato organismo, anche in maniera dinamica rispetto al suo stato fisiologico ed in risposta a stimoli esterni diversi (5). Il range delle diverse applicazioni alla metabolomica sono di seguito descritte: • metabolite target analysis. Determinazione quantitativa di uno o più metaboliti in relazione ad

uno specifico pathway metabolico dopo tecniche di estrazione del campione biologico dalla matrice vegetale e separazione cromatografica con sensibili tecniche di rilevazione/identificazione.

• metabolite profiling/metabolic profiling. Analisi qualitativa e quantitativa del pattern metabolico mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa.

• metabolic fingerprinting. Analisi rapida, selettiva, discriminante di campioni vegetali o estratti di vegetali per la classificazione o screening dei diversi campioni. In questo caso l’indagine è discriminante, ma non quantitativa e non è necessaria l’identificazione di ogni metabolita del pattern biologico.

Le applicazioni della metabolomica alle piante sono molteplici e non sono confinate solo alla mera descrizione globale fitochimica di una specie vegetale ed alla scoperta di nuove molecole naturali di origine vegetale. E' generalmente riconosciuto che una singola tecnica analitica non fornisce una visualizzazione sufficiente del metaboloma di una pianta e, quindi, tecnologie diverse complementari sono necessarie per una visione globale della complessità biochimica di una pianta (6). Attualmente la maggior parte della popolazione dipende per i suoi bisogni alimentari soltanto da 30 specie di piante edibili, l’altra restante fetta è raccolta allo stato spontaneo o “selvatico”. Questo scarso utilizzo dell’intera gamma di specie vegetali edibili, causato dalla sostituzione delle vecchie varietà locali con moderne varietà più produttive, può determinare nel tempo un rapido processo di semplificazione, riducendo la biodiversità degli ecosistemi. L’analisi metabolomica e metabolonica delle specie aromatiche, officinali ed edibili rappresenta una grande potenzialità per la conservazione ex-situ di ecotipi con caratteristiche peculiari favorendo lo sviluppo di nuovi settori produttivi nell'agricoltura italiana. Lo sviluppo di tali metodologie, per quanto riguarda esempi di specie vegetali, hanno la finalità di favorire la domesticazione/coltivazione della specie spontanea per produzione in terza/quarta gamma mediante (i) comparazione del valore nutritivo (contenuto di polifenoli, capacità antiossidante, variazione del fingerprint cromatografico) della specie coltivata rispetto alla selvatica come indice di qualità, (ii) valutazione dei marker biochimici secondari che sono indice di condizioni ambientali territoriali e ontogenetici favorevoli, (iii) individuazione delle migliori condizioni coltivari alle quali la pianta deve essere sottoposta. Inoltre recentemente, l’interesse scientifico si è rivolto verso lo studio delle attività dei flavonoidi non solo per le loro proprietà salutiste come antiossidanti naturali (azione di radical scavenging), ma, soprattutto, quali ligandi/effettori di numerose macromolecole coinvolte in processi fisiologici. E' stato infatti riportato in letteratura che essi si legano alle proteine del plasma ed influenzano la attivazione piastrinica (7, 8). La capacità mostrata dai flavonoidi di agire come modulatori di attività enzimatiche appare molto interessante anche alla luce di crescenti evidenze che indicano come molte patologie umane siano il risultato di una alterazione nei meccanismi di controllo di enzimi diversi come ad esempio gli enzimi proteolitici (9, 10) e gli enzimi coinvolti nel metabolismo dell'acido folico (con particolare riguardo alla diidrofolato reduttasi (DHFR)) (11, 12). Tale attività risulta particolarmente interessante anche alla luce di un utilizzo di tali metaboliti quale base di partenza per la progettazione di nuovi farmaci specifici.

Riferimenti bibliografici 1) Oliver, S.G., Winson, M.K., Kell, D.B. and Baganz, F. (1998). Systematic functional analysis of

the yeast genome. Trends Biotechnol. 16, 373-378.

2) G. G. H. a. R. Goodacre, Metabolic Profiling: Its Role in Biomarker Discovery and Gene Function Analysis, Kluwer Academic Publishers, London, 2003.

3) Weckwerth, W. Metabolomics in systems biology. (2003). .Annu. Rev. Plant Biol. 54, 669–689

4) Lambers H, Chapin III FS, Pons TL. (1998). Plant physiological ecology. New York: Springer.

5) Dunn, W.B. and Ellis, D.I. (2005). Metabolomics: current analytical platforms andmethodologies. Trends Anal Chem 24, 285–294.

6) Dunn, W.B., Bailey, N.J.C. and Johnson, H.E. (2005). Measuring the metabolome: current analytical technologies. Analyst 130, 606–625.

7) Dangles, O., Dufour, C., Manach, C., Morand, C. & Rémésy, C. (2001). Binding of flavonoids to plasma proteins. Methods Enzymol. 335:319-333.

8) Shanmuganayagam, D. & Folts, J. (2001). Effect of polyphenolic flavonoid compounds onplatelets. Methods Enzymol. 335:369-380.

9) Kompis, I. M.; Islam, K.; Then, R. L. (2005). DNA and RNA synthesis: Antifolates Chem. Rev.105, 593-620.

10) Mozzicafreddo M., Cuccioloni M., Eleuteri AM, Fioretti E., Angeletti M. (2006). Flavonoids inhibit the amidolytic activity of human thrombin. Biochimie, accettato per la pubblicazione.

11) Navarro-Pera´n, E., Cabezas-Herrera, J., Garcıa-Canovas, F., Durrant, M. C., Thorneley, R. N. F., and Rodrı´guez Lo´pez, J. N. (2005). The antifolate activity of tea catechins. Cancer Res. 65, 2059-2064.

12) Michele Spina, Massimiliano Cuccioloni, Matteo Mozzicafreddo, Francesca Montecchia,Stefania Pucciarelli, Anna Maria Eleuteri, Evandro Fioretti and Mauro Angeletti. Mechanism of inhibition of wt-dihydrofolate reductase from E. coli by tea epigallocatechin-gallate. (2008)Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics.

Attività svolta e Risultati ottenuti Come accennato nella premessa, le attività oggetto della presente relazione, e relative alla realizzazione del progetto sono state effettuate durante l’anno solare 2008 secondo la scansione programmata all’atto della stesura del progetto (vedi Identificativo della proposta progettuale-fasi di attuazione del progetto) che, di seguito, vengono richiamate in corsivo.

(La numerazione delle fasi fa riferimento a quello adottato nella relazione relativa alle attività del secondo anno (fasi 7-11) Fase 7. Proseguimento dell’attività indicata nella Fase 4 della prima annualità (ovvero:

messa a punto di protocolli per la ottimizzazione della coltivazione delle specie selvatiche e monitoraggio del processo di produzione/confezionamento in IV gamma)

Le specie selvatiche oggetto del progetto, per la loro natura, non sono mai state, finora, considerate da un punto di vista agricolo per cui è stato necessario analizzare il loro ciclo biologico al fine di comprenderne la fenologia. Innanzitutto sono state individuate le specie eduli (nove) che crescono in tre aree fitologiche naturali (bordo strada, fossi ed incolti). Le stesse sono state studiate al fine della conoscenza del processo della induzione a fiore al fine di comprenderne il comportamento (perenne, perennante o annuale). I passaggi agronomici intrapresi sono stati finalizzati a sperimentare l’applicabilità, alle varie specie, delle normali condizione di gestione. Con particolare riguardo alla individuazione dei sesti ottimali di impianto tenendo sempre in considerazione le finalità produttive dell’Azienda rivolte al confezionamento in regime di IV gamma. Particolare attenzione è stata dedicata alla preparazione del substrato di impianto tenendo anche in conto che tale variabile incide profondamente sulle proprietà salutistiche delle specie in osservazione (con particolare riguardo al contenuto in flavonoidi e metaboliti secondari). I dati ottenuti nell’ambito dell’anno 2008 indicano che delle nove specie selezionate ed oggetto della ricerca (vedi relazione del primo anno) due (grugno ed aspraggine) non hanno risposto positivamente alle tecniche di riproduzione naturale nonostante i ripetuti tentativi attuati (semina o trapianto, colture in pieno campo od in serra, apporto di irrigazione o meno) per cui si è ritenuto opportuno non proseguire nella sperimentazione essendosi dimostrate queste specie “non addomesticabili”. D’altra parte queste evidenze rappresentano, anche se in negativo, un risultato del progetto che si prefiggeva, tra l’altro, di individuare specie spontanee “addomesticabili” per essere poi trasferite nel mercato della IV gamma. Per le altre specie, invece sono stati ottenuti risultati colturali incoraggianti o molto incoraggianti (come nel caso della cicoria, della pimpinella e del tarassaco). I dati relativi a questi risultati vengono raccolti con il fine di predisporre delle specifiche schede tecniche (o disciplinari) di produzione che saranno predisposte in maniera ultimativa nel corso dell’anno 2009.

Per quanto riguarda il monitoraggio del processo produttivo (dal punto di vista della trasformazione in confezioni di IV gamma) nell’Allegato 2 sono presentate delle specifiche schede di produzione con raccolti i dati previsti all’atto della presentazione del progetto e che danno una idea estremamente puntuale delle problematiche sia in termini di impiantistica che in termini di impegno economico (ore uomo/quantità materiale lavorato). I dati presentati saranno raccolti ed analizzati per predisporre delle schede tecniche per le sette specie in osservazione sia in termini agronomici che di trasformazione in confezioni di IV gamma.

Fase 8. Caratterizzazione quali-quantitativa dei polifenoli purificati nella Fase 3 della prima annualità

Fase 9. Determinazione dell’attività antiossidante dei campioni purificati nella Fase 3 della

prima annualità Fase 10. Diversificazione delle diverse tipologie di coltivazione e cultivar in base alla

mappatura polifenolica ottenuta nella Fase 8 e nella determinazione dell’attività antiossidante determinata nella Fase 9.

Alla luce della stretta correlazione fra le metodologie utilizzate, i dati ottenuti ed il loro significato si è ritenuto opportuno compendiare le tre fasi in un discorso unitario. Utilizzando metodologie analitiche classiche, caratterizzate da elevata sensibilità, come la cromatografia ad alte prestazioni (HPLC) (1) e saggi spettrofoto/fluorimetrici ufficiali (2) è stato determinato il profilo polifenolico totale e l’attività antiossidante di sette specie di erbe spontanee in esame (le altre due inserite inizialmente nel progetto non hanno fornito risposte positive alla coltivazione per cui, in accordo con l’azienda fornitrice, (vedi fase 7) sono state escluse dalla sperimentazione. La determinazione della capacità antiossidante di ogni estratto è stata effettuata mediante metodiche standard internazionali AOC (Antioxidant Capacity), quali il DPPH, TRAP e FRAP assay (3). Queste determinazioni sono state effettuate direttamente negli estratti fenolici purificati nel primo anno di attività (vedi Relazione primo anno). Di seguito viene riportata la parte sperimentale per ogni determinazione/analisi.

Materiali e Metodi utilizzati TPC (Total Phenolic Content; contenuto fenolico totale) Definizioni Na2CO3: carbonato di sodio GAE: equivalenti di acido gallico (Gallic Acid Equivalents) Strumentazione necessaria

Spettrofotometro UV-VIS Preparazione dei campioni standard per la costruzione della retta di taratura Si sciolgono 50 mg di acido gallico anidro in acqua distillata in un matraccio da 10 ml. Si trasferiscono aliquote di 0 – 100 – 200 – 500 – 1000 μl in matracci da 10 ml e si portano a volume con acqua distillata. La concentrazione fenolica di queste soluzioni (espressa in equivalenti di acido gallico - GAE) è pari rispettivamente a 0, 50, 100, 250, 500 mg/l. Da ciascuna soluzione si pipettano 100 μl in matracci (separati) da 10 ml; si aggiungono 6 ml di acqua distillata, poi 500 μl del reagente di Folin-Ciocalteau; si agita bene; dopo 30 sec. e prima di 8 min si aggiungono 1.5 ml di una soluzione di Na2CO3 anidro 20% m/v; si agita bene e si porta a volume con acqua distillata. Le soluzioni vengono lasciate a riposo per 2 h a temperatura ambiente prima della lettura allo spettrofotometro (760 nm). Preparazione del campione in esame Si sciolgono circa 10 mg di estratto secco della pianta in acqua distillata in un matraccio da 10 ml. Per migliorare la dissoluzione, il campione viene lasciato in un bagno ad ultrasuoni per circa 5 min. Se la soluzione è torbida si filtra su filtro di carta. Si pipettano 500 μl di tale soluzione in un matraccio da 10 ml e si aggiungono 6 ml di acqua distillata, poi 500 μl del reagente di Folin-Ciocalteau; si agita bene; dopo 30 sec. e prima di 8 min si aggiungono 1.5 ml di una soluzione di Na2CO3 anidro 20% m/v, si agita bene e si porta a volume con acqua distillata. Si lasciano le

soluzioni a riposo per 2 h a temperatura ambiente prima della lettura allo spettrofotometro (760 nm). Bibliografia di riferimento: Singleton et. al. (2) RP-HPLC di estratti alcolici di erbe spontanee Tutti i campioni (estratti alcolici di erbe spontanee) sono stati filtrati (cut-off 0.45µm), iniettati in HPLC (Amersham Biosciences - Model AKTA-1) e separati utilizzando una colonna "Phenomenex® - Luna 5u C18(2) 100A - 250 x 4.60 mm munita di precolonna (Phenomenex® Security Guard Cartridge). I dati venivano analizzati con software "Amersham Biosciences - Unicorn 4.12". L'eluizione veniva effettuta con due eluenti: A: H2O - HCOOH ( pH 3.6 ) B: CH3CN applicando il gradiente (sotto riportato) ad un flusso costante di 1 ml / minuto Target Concentration of ( B )

15% 15% 25% 55% 100% 100% 0%

Lenght of Gradient

4,8 CV 1,2 CV (static)

2,4 CV 6,0 CV 1,0 CV 2,0 CV (static)

3,0 CV

CV = Volumi Colonna Veniva misurato l'assorbimento a 278, 310 e 330 nm, i cui valori venivano riportati in funzione del tempo di eluizione. L’identificazione dei polifenoli presenti avveniva sia attraverso la misura dei tempi di ritenzione, standardizzati precedentemente, sia attraverso coeluizione con standard di riferimento. Al fine di migliorare la riproducibilità dei tempi di ritenzione, la colonna è stata termostatata a 26 °C. L’analisi quantitativa dei metaboliti fenolici in esame (8 catechine, 4 flavanoni come agliconi, 2 flavanoni glicosidici e 3 acidi idrossicinnamici) è stata effettuata attraverso l’uso di rette di calibrazione ottenute aggiungendo standard di elevata purezza. La linearità è stata determinata nel range 0-5 mg su quattro livelli di concentrazione. Analisi, intra-day, di soluzioni contenenti tutti i composti fenolici in esame nelle diverse matrici, sono state utilizzate per validare la precisione del sistema cromatografico. La precisione del metodo adottato è stata calcolata attraverso l’utilizzo di quattro repliche (la deviazione standard relativa (RSD) ai tempi di ritenzione era compresa fra < 0.5% e < 1% per le rispettive aree dei picchi). Bibliografia di riferimento: Spina et. al. [1] Attività antiossidante-DPPH Definizioni TE = Trolox Equivalents DPPH = 1,1-difenil-2-picrilidrazil radicale Trolox = 4,6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acido carbossilico Strumentazione necessaria

Spettrofotometro UV-VIS termostatato

Agitatore magnetico collegato allo spettrofotometro.

Preparazione della soluzione di DPPH Si sciolgono 7.8 mg di DPPH in 25 ml di metanolo ottenendo una concentrazione 8 x 10-4 M. Da questa soluzione si prelevano 0 - 250 - 500 - 750 - 1000 μl in un matraccio da 10 ml e si porta a volume con metanolo. Le soluzioni così ottenute hanno una concentrazione pari a 0 - 2 - 4 - 6 - 8 x 10-5 M. Tali soluzioni sono state utilizzate per la costruzione della retta di calibrazione. Per l’analisi del campione si è utilizzata una soluzione di DPPH pari a 8 x 10-5 M.

Preparazione della soluzione standard di Trolox

Si sciolgono 20 mg di Trolox in 100 ml di metanolo; da questa soluzione madre si prelevano 1000 - 500 - 250 - 125 – 62.5 μl e si diluiscono in altri 10 ml di metanolo, al fine di ottenere soluzioni a concentrazione 80 - 40 - 20 - 10 - 5 μM rispettivamente. Preparazione del campione in esame Si sciolgono circa 10 mg di estratto secco in metanolo in un matraccio da 100 ml. Per migliorare la dissoluzione, il campione viene lasciato in un bagno ad ultrasuoni per circa 5 min. Se la soluzione è torbida si filtra su carta. A questo punto si pipettano 1000 - 500 - 200 - 100 - 50 μl e si inserisce ciascuna aliquota in un matraccio da 10 ml per ottenere una concentrazione finale pari a 10 - 5 - 2 - 1 – 0.5 mg/L rispettivamente. Risultati A 500 μl della soluzione di DPPH 8 x 10-5 M si aggiungono 500 μl di ciascuna soluzione metanolica (estratto alcolico e standard di riferimento). L’assorbimento a 517 nm viene registrato al tempo zero (A517(0)), e dopo 120 min (A517(120)). Bibliografia di riferimento: Atoui et al. (4) Attività antiossidante – TRAP Definizioni TRAP = total radical-trapping antioxidant parameter Strumentazione necessaria

Fluorimetro

Preparazione del tampone fosfato Preparare un litro di una soluzione di tampone fosfato 75 mM (pH 7.0) Preparazione della soluzione di fluoresceina Per preparare la soluzione madre, 29 mg di fluoresceina (FL) (32,9 mg per il corrispondente sale sodico) vengono disciolti in 100 ml di tampone fosfato. Tale soluzione può essere conservata a 4°C per diversi mesi. Per la soluzione di lavoro, 10 μl della soluzione madre vengono diluiti in 10 ml di tampone fosfato. In questo modo si ottiene una soluzione di lavoro di fluoresceina pari a 0,875 μM. La soluzione di fluoresceina deve essere mantenuta al riparo della luce. Preparazione della soluzione di AAPH Per preparare la soluzione di lavoro di AAPH 160mM, 43,4 mg di AAPH vengono disciolti in 1 ml di tampone fosfato. Questo reagente deve essere preparato fresco per ogni analisi e mantenuto in ghiaccio ed acqua fino all’utilizzo. Preparazione della soluzione standard di Trolox Si può preparare una soluzione madre sciogliendo 25 mg di Trolox in 10 ml di tampone. Successivamente, per ottenere la soluzione di lavoro, si prelevano 100 μl e si diluiscono in altri 10 ml di tampone. La soluzione di lavoro (100 μM) è stabile a -80°C per, al massimo, 4 mesi. Preparazione delle soluzioni

Le condizioni sperimentali migliori sono state raggiunte con le seguenti diluizioni: l'urina veniva diluita, in genere, 1:100 in tampone fosfato, la soluzione di lavoro di Trolox veniva diluita 1:2 in tampone fosfato, la soluzione di lavoro di AAPH veniva diluita 1:10 in tampone fosfato.

Misura Accendere il fluorimetro ( Molecular Devices - Spectra Max Gemini XPS, con bagno termostatato a 37 °C ed agitatore meccanico incorporati). Impostare la temperatura del lettore tramite display ( 37 gradi centigradi ). Avviare il software ( Molecular Devices - Softmax PRO 5.2 ). Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione (493 nm) e la lunghezza d'onda di emissione (515 nm). Impostare la durata della misura della cinetica della reazione (1 ora, con un intervallo di lettura ogni minuto). Lettura dei campioni Il tampone fosfato e la soluzione di fluoresceina venivano preincubati a 37°C per 15 min. Il saggio veniva condotto a 37°C in cuvette fluorimetriche. Durante ciascuna misura venivano analizzati anche un bianco ed uno standard. Per il bianco, venivano utilizzati 5.5 μl di tampone al posto di 5.5 μl di campione. Nel caso dello standard, il campione veniva sostituito con 5.5 μl di soluzione standard di Trolox. Quindi, nella cuvetta da saggio venivano inseriti 19.4 μl di tampone fosfato (75 mM, pH 7.0), 50 μl della soluzione di fluoresceina (0,875 μM), 5.5 μl di campione da esaminare, ed infine 25 μl della soluzione di AAPH (160 mM). La reazione veniva iniziata all’atto dell’inserimento dell’AAPH, dopo breve agitazione della cuvetta. Quindi, veniva immediatamente effettuata la prima misura della fluorescenza (lunghezza d’onda d’eccitazione 493 nm, di emissione 515 nm). Il rack di cuvette veniva mantenuto a 37°C per tutta la durata dell'analisi. Bibliografia di riferimento: Ghiselli et al. (5). Attività antiossidante – FRAP Definizioni

FRAP = Ferric Reducing Antioxidant Power Strumentazione necesaria

SpettrofotometroUV-VIS termostatato

Agitatore magnetico collegato allo spettrofotometro.

Reagenti

Tampone acetato (300 mM, pH 3.6) [3.1 g di sodio acetato triidrato + 16 ml di acido acetico glaciale, volume finale 1L (in acqua)]

10 mM TPTZ (2,4,6-trpyridil-s-triazine) + 40 mM HCl (15.6 mg TPTZ in 5 ml H20 + 12 uL HCL12 M). [da mantenere in ghiaccio ed al riparo dalla luce]

FeCl3.6H20 20 mM (27,03 mg in 5 ml H20 distillata) [da mantenere al riparo dalla luce]

Preparazione dei reagenti di lavoro (Frap reagent) Miscelare i tre reagenti in rapporto 10:1:1 (8 ml di tampone acetato + 0.8 ml di TPTZ acidificata + 0.8 ml di cloruro ferrico). Questa soluzione, preparata fresca per ogni set di analisi, veniva utilizzata come bianco reagente. Preparazione del campione Per la determinazione del FRAP value, gli estratti venivano diluiti 1:4 con metanolo. Preparazione dello standard Veniva preparata una soluzione 100 µM di Trolox, in metanolo.

Lettura dei campioni

Il saggio veniva effettuato a 37°C. Durante ciascuna analisi, venivano analizzati un campione ed uno standard in successione. Per il campione, a 970 uL di bianco reagente termostatato a 37°C venivano aggiunti 30 uL di estratto metanolico (vedi preparazione del campione) sotto agitazione magnetica. La misura consisteva nella determinazione della variazione dell’assorbanza a 593 nm da 0 a 4 minuti. Per la preparazione dello standard i 30 uL di estratto venivano sostituiti con una soluzione di Trolox 100 uM. Bibliografia di riferimento: Benzie and Strain (6).

Risultati

Caratterizzazione intraspecie. Al fine di determinare la variabilità biologica intraspecie, rispetto al contenuto fenolico, per le sette piante spontanee in esame (vedi parte introduttiva), il campionamento, effettuato nel mese di Luglio 2007 presso l’azienda Agrifaber srl di Monsanpolo, è stato compiuto secondo le seguenti modalità: i) i campioni di rilevamento sono stati prelevati sul campo rispettando alcuni criteri di base: ogni area in esame è stata suddivisa in quadranti e in ognuno di questi sono stati eseguiti prelievi di materiale vegetale presente in punti qualsiasi delle due diagonali del quadrante. ii) i campioni di rilevamento sono stati prelevati in modo tale che la parte edule della pianta non mostrasse effetti macroscopici di stress di natura biotica o abiotica, secondo la supervisione dell’agronomo aziendale. Ogni campione di foglie verdi edibile è stato immediatamente essiccato nelle modalità descritte nella parte sperimentale del primo anno di attività, ed estratto in ASE 100 (vedi tecniche di estrazione di metaboliti secondari da matrici vegetali, primo anno di ricerca). Al fine di ottenere dei valori raffrontabili, è stato necessario determinare la quantità di acqua presente in ciascun campione edule e la percentuale di estratto ottenuto, espresso in mg di estratto per 100 mg di parte secca. In Tabella 1 sono riportati i parametri di estrazione ottenuti per la Sanguisorba m., una delle erbe spontanee più rappresentative da un punto di vista polifenolico. Ogni estratto vegetale ottenuto è stato risospeso in acqua distillata per determinare il contenuto fenolico totale (TPC) o in metanolo per determinare l’attività antiossidante in vitro (saggio del DPPH). I dati ottenuti per le sette piante in esame sono riportati in Figura 1 e in Tabella 1. La deviazione standard riportata è, ovviamente, relativa non alla ripetibilità dell’analisi ma, appunto, alla variabilità biologica all’interno della stessa specie. Tabella 1. Rese di estrazione e variabilità intraspecie della Sanguisorba m.

N° campioni Resa secco % Purezza estratto in polifenoli %

TPC* (mg/100g)

DPPH** (eq. Trolox)

1 24.25 13.3 465.85 0.17 2 24.21 13.5 471.98 0.23 3 24.04 13.6 473.35 0.16 4 23.73 11.9 408.09 0.22 5 24.55 13.4 475.28 0.21 Valore medio 459 0.20 Dev. Standard 28 0.03 * TPC: mg di polifenoli per 100 g di parte edibile ** DPPH: attività antiossidante dell’estratto alcoolico espressa in equivalenti di Trolox

Figura 1. Contenuto polifenolico totale (TPC) e attività antiossidante alcolica (DPPH) relative a nove erbe spontanee raccolte nel Luglio 2007. I valori sono riferiti rispettivamente ai mg di polifenoli per 100 g di parte edibile e in equivalenti di Trolox. La deviazione standard è relativa a 5 pool rappresentativi dell’intero campo di coltivazione. Profilo polifenolico del Cichorium intybus Tra le sei piante in esame quella più importante, ai fini edibili, per un consumo umano è senz’altro il Cichorium i., di cui si conoscono varie varietà commerciali (7). Poiché per i successivi studi in vivo di biodisponibilità dei polifenoli (vedi Tesi Sperimentale) ci siamo focalizzati su questa tipologia di erba edibile spontanea, è stata quella caratterizzata da un punto di vista del pattern fenolico. Il nostro scopo è stato quello di determinare il contenuto di acido cicorico, acidi fenolici e flavonoidi che sono rappresentativi della specie come riportato in precedenti lavori (7,8). Per eliminare l’eventuale degradazione enzimatica degli acidi fenolici in esame (7,9), l’estrazione è stata eseguita a valori di pH acido e sotto blande condizioni di agitazione, come riportato nella parte sperimentale. L’analisi RP-HPLC da noi effettuata è capace di separare sia gli acidi fenolici (tra 8 e 20 min), sia i flavonoli e i rispettivi glicosidi (tra 25 e 45 min), sia i flavan-3-oli in forma dimerica e monomerica (tra 15 e 50 min) e le frazioni polimeriche (oltre i 50 min di eluizione) attraverso un gradiente di eluizione. La programmazione del gradiente prevede di partire dal 100% di solvente A polare (H20/HCOOH pH 3.6) per arrivare in 80 min al 100% del solvente B a bassa polarità (acetonitrile). I cromatogrammi sono stati rilevati a tre diverse lunghezze d’onda, rispettivamete 330, 310 e 278 nm. Gli acidi fenolici e i flavonoli hanno il loro massimo di assorbimento intorno ai 330 nm grazie ai doppi legami coniugati presenti nella loro struttura chimica; invece i flavan-3-oli hanno il loro massimo a 278 nm e non assorbono nel vicino visibile perché non hanno doppi legami coniugati nel loro scheletro flavanico. In Figura 2 è riportato il profilo HPLC dell’estratto di cicoria

(coltivata raccolta nel mese di Luglio 2007) a 330 nm, in cui sono stati individuati 5 metaboliti polifenolici. L’individuazione è stata compiuta mediante comparazione con standard di riferimento, attraverso spike nell’estratto alcolico e la comparazione con risultati precedentemente ottenuti anche nel nostro gruppo di ricerca (7,8).

Figura 2. Cromatogramma RP-HPLC dell’estratto alcolico del Cichorium i. del Luglio 2007. Loop: 500 uL. Lunghezza d’onda 330 nm. I primi tre picchi sono relativi a tre acidi idrossicinnamici rispettivamente il di-caffeoyl-tartaric acid (acido cicorico), caffeoyl-tartaric acid (acido clorogenico) e l’acido caffeico. Gli altri due picchi identificati sono due glicosidi della quercetina: quercetin-3-glucoside o quercitrine e la quercetin-3-glucuronide o hyperoside.L’estratto è stato ottenuto mediante una estrazione in condizione supercritiche. Nella Tabella 2 vengono riportate le quantità di ogni metabolita, identificato nella parte edibile della pianta. L’acido cicorico è risultato essere il componente fenolico principale insieme all’altro caffeoyl estere, l’acido clorogenico, e questi dati sono in accordo con i valori presenti in letteratura (7). La successiva idrolisi acida dell’estratto alcolico si è resa necessaria per rompere tutti i legami glicosidici che uniscono gli agliconi agli zuccheri semplici e quindi quantificare due flavonoli presenti come glicosidi nella parte edibile (vedi Tabella 2). Le quantità in catechine presenti nella pianta, raccolta nel Luglio 2007, erano già state determinate in precedenza e riportate (8). In Figura 3 è riportato il cromatogramma dell’estratto di cicoria, raccolta nel mese di Maggio 2008, alla lunghezza d’onda di 278 nm e relativo sia alle catechine che ai flavonoidi che non assorbono nel visibile. Mediante l’aggiunta di standard interni, sono stati identificati il picco relativo alla gallocatechina (GC) e all’epigallocatechina-3-gallato (EGCG), che vengono eluiti, rispettivamente, a 17.18 e 30.29 min. Per quest’ultima identificazione si rimanda ai confronti dei due cromatogrammi in Figura 4- Panel a-b. Inoltre, si è cercato di identificare i due picchi che eluiscono a 23.95 e 27.39 min (Flav. 1 e Flav 2, rispettivamente) con standard interni di epicatechina e catechina. Come si nota dalla Figura 5-Panel c gli standard vengono eluiti come spalla o come picchi adiacenti ai due incogniti. Un terzo picco presente nell’estratto alcolico è eluito a tempi di ritenzione di 50.81 min (Flav. 3). Sia le due catechine, sia i tre picchi non identificati sono presenti in tutti i pool raccolti nel mese di Maggio 2008. Il contenuto di flavonoidi presenti nei pool delle

piante raccolte nel mese di Maggio 2008 saranno utilizzati come riferimento nella sperimentazione in vivo e considerati per individuare la reale biodisponibilità dei polifenoli nel metabolismo umano. Infine, il pool di piante raccolte nel Luglio 2007 e nel Maggio 2008 presentano delle differenze sostanziali:

1. maggiore contenuto di flavan-3-oli nel pool 2008 2. maggiore contenuto di acido cicorico nel pool 2008 3. contenuto polimerico assente nel pool 2007 (come a conferma del minore contenuto di

monomeri flavanolici) Queste differenze non possono essere addebitate alla diversa tecnica di estrazione (ASE 100 per il pool 2007 e in agitazione per il pool 2008) in quanto, appunto, per l’analisi 2008 si è preferito utilizzare quelle condizioni che meglio salvaguardano l’integrità chimica degli acidi idrossicinnamici (acido caffeico e i suoi esteri dell’acido quinico, quali l’acido clorogenico e l’acido cicorico), particolarmente instabili a trattamenti termici. Nonostante le due diverse tecniche di estrazione, il pool 2007 è risultato con un minor contenuto di catechine (flavonoidi particolarmente stabili nelle condizioni in ASE 100), vedi Tabella 2. Quindi, tale variabilità è da ricondurre alle diverse condizioni pedoclimatiche e alle diverse tecniche di coltivazione utilizzate (substrato, coltivazione in serra etc.) presso l’azienda Agrifaber srl (oggetto dello studio per il secondo anno di attività).

Tabella 2. Contenuto metabolico della parte edibile del Cichorium i. Cichorium intybus

Acidi idrossicinnamici Flavonoli Catechine Flavonoidi non identificati Data Campio.

Acido cicorico

Acido clorogenico

Acido caffeico

Hyperoside Quercitrina Gallocatechina (GC)

Epigallocatechin-3-gallato

(EGCG)

Flavonoide 1 (λmax = 278 nm)b

Flavonoide 2 (λmax = 278 nm)b

Flavonoide 3 (λmax=278 nm)b

1 Luglioa 2007

9.93 ± 0.03a 1.60 ± 0.3a < LOQ < LOQ < LOQ n.d. n.d. 0.36c ± 0.01a 0.93c ± 0.01a n.d.

1 Maggio 2008

10.7 30.2 n.d. n.d. n.d 11.0 3.90 12.79c 9.27c 6.60

31 Maggio 2008

10.5 30.7 n.d. n.d. n.d. 2.91 3.04 8.37c 12.22c 3.13

Dopo idrolisi acida Quercetina Kaempferolo Luglioa 2007

20.3 ± 0.8 10.3 ± 0.3

* I valori sono espressi in mg per 100 g di parte edibile LOQ = 0.01 mg per 100g di parte edibile a i valori sono relativi a tre analisi ripetute sullo stesso pool b massima λ di assorbimento c i valori sono espressi in equivalenti di catechina

Figura 3. Cromatogramma RP-HPLC dell’estratto alcolico del Cichorium i. raccolto nel mese di Maggio 2008. Loop: 500 uL. Linea continua: detector 278 nm; linea tratteggiata: detector 330 nm. GC: gallocatechina; EGCG: epigallocatechina-3-gallato; Flav.: flavonoide. L’estratto è stato ottenuto mediante una estrazione in agitazione meccanica con etanolo 70% pH 2.

Figura 4. Cromatogrammi RP-HPLC dell’estratto alcolico del Cichorium i. raccolto nel mese di Maggio 2008. Loop: 500 uL.; detector 278 nm. GC: gallocatechina; EGCG: epigallocatechina-3-gallato; Flav.: flavonoide; C: catechina; E: epicatechina. L’estratto è stato ottenuto mediante una estrazione in agitazione meccanica con etanolo 70% pH 2. Panel a: estratto tal quale; Panel b: estratto + spike di EGCG; Panel c: estratto + spike di catechina ed epicatechina Per i pool di Cichorium i. raccolti nel mese di Maggio 2008, di seguito vengono riportati i valori del contenuto polifenolico totale (TPC), e l’attività antiossidante espressa con due diverse tecniche

AOC (TRAP e FRAP assay). Tabella 3. Caratterizzazione biochimica del Cichorium i. raccolto nel mese di Maggio 2008 TPC (mg/100g)* FRAP (mM/kg)** TRAP (mM/Kg)** Cichorium i. 63.7 ± 0.7 281.6 ± 0.5 5.67 ± 0.02 * mg per 100 g di parte edibile ** attività antiossidante espressa in equivalenti di Trolox per Kg di parte edibile L’errore sperimentale è relativo alla ripetibilità su tre misurazioni consecutive. Analisi dei dati ottenuti La dieta mediterranea è considerata, dal mondo scientifico, quella più adatta al mantenimento di uno stato di salute ottimale e una prima difesa contro le patologie degenerative legate all’invecchiamento. In questo contesto, frutta e verdura ricca in metaboliti antiossidanti e funzionali sono di centrale importanza per cui gli studi finalizzati alla caratterizzazione “salutistica “ di erbe spontanee edibili assumono particolare rilevanza. Lo studio si è focalizzato su sette piante spontanee (coltivate) nell’area marchigiana. Il contenuto polifenolico totale di queste piante varia tra 62 mg e 459 mg per 100 g di parte edule, rispettivamente per la Tetragonia tetragonioides e la Sanguisorba minor. Dall’analisi statistica della varianza, quest’ultima pianta presenta il contenuto polifenolico e l’attività antiossidante dell’estratto alcolico significativamente più alto (P < 0.05), rispetto alle altre sei piante spontanee coltivate. In Tabella 4 vengono riportati i valori in TPC, presenti in letteratura, relativi alle piante eduli analizzate. In Tabella 5 sono invece comparate le attività antiossidanti determinate nell’estratto di Cichorium i. e Sanguisorba m. rispetto ai valori presenti in letteratura su altri fonti di erbe eduli spontanee caratteristiche dell’area mediterranea e di estratti di semi di uva biologica. In questo caso l’attività antiossidante dell’estratto di semi di uva (Grape Seed Extract) è utilizzata come valore di paragone per la sua alta attività radical scavenger (10). Dai dati presenti in letteratura, il contenuto polifenolico determinato per il Cichorium i. rientra nel range di variabilità della specie, mentre il contenuto presente nella Sanguisorba m. risulta particolarmente elevato. Il valore in TPC è proporzionale al valore di attività antiossidante: la Sanguisorba m. presenta il più alto valore di DPPH (espresso in equivalenti di Trolox) tra le piante analizzate ed è circa la metà del valore determinato per il GSE (vedi Tabella 2 e 13). L’attività antiossidante del Cichorium i. (DPPH, TRAP, FRAP assay) è stata confrontata con i valori presenti in letteratura: il valore di EC50 è leggermente superiore a quelli individuati per la specie selvatica (190 e 146 mg di parte edibile/mgDPPH rispettivamente per la pianta coltivata e quella selvatica) ed il valore del TRAP è la metà rispetto alla specie selvatica (5.67 e 10.52 mM/Kg di parte edule, rispettivamente per la pianta coltivata e quella selvatica ); invece, il valore del FRAP risulta 25 volte più alto rispetto ai valori determinati per il rispettivo partner selvatico (281.6 e 11.23 mM/Kg di parte edule, rispettivamente per la pianta coltivata e quella selvatica). Questi dati stanno ad indicare che la coltivazione delle varie specie selvatiche, secondo tecniche tradizionali, non induce una significativa perdita né in polifenoli né in attività antiossidante, e, per alcune specie, i valori risultano addirittura più elevati se confrontati con quelli presenti in letteratura (vedi la specie Sanguisorba m.). Ovviamente la discussione esula dal contributo di tutti gli stress abiotici (esposizione ai raggi ultravioletti, condizioni pedoclimatiche etc.) che inducono alla sintesi di metaboliti fenolici e antiossidanti, ma rimane il dato confortante che la coltivazione non altera il valore nutrizionale di base di queste specie spontanee. Inoltre, i dati ottenuti rappresentano un contributo significativo alle conoscenze sul valore nutrizionale di piante eduli spontanee che, in realtà, fino ad oggi non erano mai state analizzate nel loro profilo metabolico/nutrizionale. Tabella 4. Confronto in TPC di piante spontanee coltivate e selvatiche TPC*

(mg per 100 g di peso umido)

Chicorium intybus 98 ± 26

Sonchus oleraceus 92 ± 5 Taraxacum officinale 75 ± 19 Tetragonia tetragonioides 62 ± 5 Reichardia picroides 109 ± 69 Sanguisorba minor 459 ± 29 Chondrilla juncea 286 ± 40 TPC**

(mg per 100 g di peso umido)

Data di raccolta Luogo/nazione di coltivazione

Wild chicory[11] 573 Settembre 2005 Provincia di Firenze Spadona[11] 283 Settembre 2005 Provincia di Firenze Cichorium intybus (wild chicory)[12]

122 Non specificata Provincia di Ragusa

48 Non specificata Grecia Cichorium intybus[13] 64 Non specificata Italia 107 Non specificata Spagna Sonchus oleraceus[13] 122 Non specificata Grecia 157 Non specificata Italia 75 Non specificata Spagna Taraxacum officinale[14] 55 Giugno 2006 Cecoslovacchia Taraxacum officinale[15] 50 Non specificata Grecia Taraxacum officinale (wild plant)[16]

26 Settembre 2000 USA

Tetragonia tetragonioides Nessun dato in letteratura

Reichardia picroides Nessun dato in letteratura

Sanguisorba minor (wild plant)[16]

99 Settembre 2000 USA

* valori presentati ** valori presenti in letteratura Tabella 5. Confronto dell’attività antiossidante di piante spontanee coltivate e selvatiche

Campione vegetale DPPH (EC50)*

DPPH (eq. Trolox)

TRAP (mM/kg parte edule)

FRAP (mM/kg parte edule)

GSEa 0.47 Cichorium intybusaΨ (wild chicory)

190 0.09 5.67 281.6

Sanguisorba minoraΨ 55 0.20 Cichorium intybusϕ[11,12] (wild chicory)

146 10.52 19.03

Lattugaϕ[11] (rocket)

3829

Asparagus acutifoliusϕ[12] 5.29 11.23 Borrago officinalisϕ[12] 5.06 14.31 Diplotaxis erucoidesϕ[12] 3.29 10.33 Sinapis incanaϕ[12] 4.78 11.48 Sinapis nigraϕ[12] 2.92 10.74 adati presentati *mg di parte edibile/mg DPPH (quantità di parte edibile che induce il 50% della diminuzione della concentrazione del radicale DPPH) Ψpianta spontanea coltivata ϕpianta spontanea selvatica Il profilo metabolico del Cichorium i., descritto nella parte dei Risultati, riporta i valori dei principali acidi idrossicinnamici, flavonoli, e flavanoli, oltre a 3 metaboliti non ancora identificati. I valori dell’acido cicorico (2,3-O-Di-Caffeoyl tartaric acid) e dell’acido clorogenico sono nello stesso ordine di grandezza dei valori individuati in precedenti lavori (7,12). In letteratura, invece, non sono presenti dati circa la composione in catechine o proantocianidine nella parte edibile del Cichorium i. Il lavoro effettuato da Heimler et al. (11) mostra il profilo flavonoico globale dell’estratto del Cichorium i. in RP-HPLC diode array, ma è relativo solamente alla frazione

flavanica che assorbe a 330-350 nm. Il nostro gruppo di ricerca, nel 2007 (8), ha riportato dati riguardanti il contenuto in flavan-3-oli in cinque piante edibili spontanee (fra cui le radici e le foglie verdi del Cichorium i.) e i precedenti risultati sono stati confermati per il pool di piante raccolte nel Maggio 2008 (individuazione della gallocatechina e dell’epigallocatechina-3-gallato). Per il contenuto polimerico non sono presenti dati in bibliografia, se non relativi a un dimero flavanolico (procianidina B1) nel lavoro pubblicato da Salvatore et al [12]. Questi dati analitici, ottenuti su specie raccolte nel periodo (Luglio 2007-Maggio 2008) sono stati utilizzati dall’azienda Agrifaber per differenziare le condizioni di coltivazione base al profilo metabolico della specie. Sperimentazione “in vivo” È ben noto, alla comunità scientifica, che la significatività di un cibo da un punto di vista funzionale è strettamente legata alla biodisponibilità dei suoi componenti. Alla luce di ciò abbiamo predisposto una sperimentazione “in vivo” utilizzando come “cibo funzionale” la cicoria selvatica (Cichorium i.), coltivata presso l’Azienda Agrifaber. La scelta di questa specie è stata dettata dal fatto che essa rappresenta, da un punto di vista dell’impiego nella dieta, sicuramente la più importante tra le specie oggetto della sperimentazione. Questo studio, non contemplato all’atto della stesura del progetto, è stato riportato in una tesi di laurea sperimentale dal titolo “Biodisponibilità di polifenoli presenti in erbe spontanee” (Allegato 3) discussa presso l’Università di Camerino nel Luglio 2008. Il protocollo sperimentale utilizzato è stato quello di monitorare, dopo l’assunzione della cicoria selvatica, la presenza, nelle urine di volontari sani , dei componenti fenolici, o di loro derivati, con lo scopo di avere informazioni sul metabolismo di queste molecole, sia da un punto di vista qualitativo che quantitativo, anche alla luce degli importanti effetti biologici, potenzialmente attribuibili ai metaboliti fenolici, ampliamente documentati in letteratura negli ultimi anni. I risultati ottenuti indicano che l’assunzione di cicoria induce un aumento significativo dell’attività radical scavenger (almeno per un tempo attorno alle 4-5 ore). Molto più complessa risulta, invece, l’analisi degli escreti urinari rispetto alle molecole “flavonoide simile” in quanto alcune di queste sostanze non vengono assorbite, altre vengono modificate ed altre ancora vengono escrete immodificate. I dati ottenuti, pur preliminari, danno comunque informazioni abbastanza importanti sul metabolismo, e quindi la biodisponibilità, delle varie classi di composti fenolici presenti in erbe spontanee eduli ed essi potranno contribuire ad avere dei dati scientifici “certi” circa i possibili “benefici effetti” attribuiti ad una alimentazione ricca in questi vegetali. Fase 11. Studio dello shelf life del prodotto, stoccando i campioni vegetali a diverse

temperature a tempi diversi e ricercando per ciascun campione in triplice copia la carica batterica totale.

Nell’ambito di questa tematica i lavori sono, attualmente, in corso nel senso che, in accordo con l’azienda Agrifaber, tale tipo di sperimentazione è stata iniziata nel corso delle ultime mensilità dell’anno 2008 e proseguiranno nell’anno 2009. I parametri microbiologici seguiti su alcuni lotti di produzione (2° TRIMESTRE per 2 tipologie distinte di verdure di stagione) sono stati:

• carica batterica totale - metodica di riferimento MF HPB 33 2001 • coliformi totali – metodica di riferimento ISO 4832:2006 • E.coli (coliformi fecali) – metodica di riferimento AOAC 991.14 2000

Le analisi microbiologiche, sono state effettuate lo stesso giorno di esecuzione del prelievo secondo i protocolli ufficiali in uso. I campioni "a fine shelf-life", sono stati analizzati dopo 6 giorni di conservazione del campione in frigorifero a 4°C±1. Le prove microbiologiche di tipo qualitativo sono state condotte su 25 g di prodotto. L'Italia come tutti i paesi dell'Unione Europea è soggetta al Regolamento della Comunità Europea (n° 2073/2005 "Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari"), dove sono definiti per ogni tipo di prodotto i limiti microbiologici che indicano l'igiene e sicurezza degli alimenti. Per la

IV gamma è indicata per la sicurezza l'assenza di Salmonella spp. e Listeria monocytogenes, mentre per l'igiene la presenza di E. coli in quantità inferiore a 100 - 1000 UFC/g. Non è previsto alcun limite per la carica batterica totale, perché non significativa della qualità igienica del prodotto. I primi risultati ottenuti dimostrano che nessuno dei campioni analizzati ha riscontrato la presenza di microrganismi fecali (< 100 UFC/g). La carica batterica totale è stata per tutti i campioni analizzati inferiore a 1x108 UFC/grammo, mentre i coliformi fecali sono risultati inferiori a 1x106

UFC/grammo, in sintonia con i valori pubblicati (*) da organi nazionali di controllo alimentare. *Mioni R. et al.: "Valutazione igienico sanitaria dei prodotti vegetali della IV gamma prodotti e commercializzati nel territorio nazionale: dati preliminari. Atti XIII Conferenza Nazionale. "La sicurezza microbiologica nella produzione di alimenti per il 21° secolo. Microbiologia degli alimenti conservati in stato di refrigerazione". Bologna, 2005, pag.129 -132. Fase 12. Avvio di azioni colturali dimostrative locali con elaborazione di materiale divulgativo

a supporto. Per quanto riguarda gli aspetti relativi a questa direttrice del progetto, le attività, così come nel primo anno di attuazione, sono state realizzate dalla CIA-Marche e dalla CIA-service (con la collaborazione e la sinergia degli altri partners) e sono consistite sia in attività divulgative che di sensibilizzazione nei confronti di agricoltori ed imprenditori agricoli. Per quanto riguarda il primo aspetto. 1) E’ stata predisposta una brochure illustrativa in cui sono presentati gli obiettivi del progetto ed i risultati finora ottenuti in particolare riguardo le proprietà salutistiche delle piante spontanee oggetto della sperimentazione (Allegato 4). Tale brochure è stata distribuita negli incontri con gli operatori agricoli che si sono tenuti sia in Provincia di Ancona che in Provincia di Ascoli. In tali incontri sono stati illustrati i risultati che si stanno ottenendo nell’ambito della sperimentazione soprattutto riguardo agli aspetti agronomici. In particolare, sono state messe in evidenza le caratteristiche di “addomestacabilità” e le condizioni di coltivazione (tipologia di terreni, preferenze idriche etc) di alcune delle specie in osservazione. Contemporaneamente, sono state discusse le “potenzialità”, anche economiche, legate alla valorizzazione salutistica delle specie cosi come riportate nella brochure stessa. 2) E’ stato realizzato e pubblicato un articolo sul sito web della CIA-Marche

(http://www.ciamarche.org) che, essenzialmente, riporta l’evoluzione del progetto (aggiornando quanto già pubblicato in precedenza) (Allegato 5).

Nell’ambito delle azioni di divulgazione/pubblicizzazione, và segnalata la organizzazione di un incontro-dibattito realizzato presso la sede di Fabriano della Comunità Montana Esino-Frasassi il 21 Ottobre 2008 su “Aspetti nutrizionali e salutistici delle erbe spontanee”(Allegato 6). . Nell’ambito di tale, incontro molto partecipato, sono state anche gettate le basi per la redazione di un volumetto sulla stessa tematica per sensibilizzare i cittadini/consumatori sul valore nutrizionale/funzionale delle erbe spontanee.

Conclusioni Al termine del secondo anno della realizzazione del progetto, ai soggetti attuatori appare che gli obiettivi prefissati siano stati ampiamente raggiunti. In particolare vanno segnalati: 1) La raccolta dati sul processo produttivo sia in termini agronomici che in termini di

produzione/confezionamento in IV gamma

2) La caratterizzazione intraspecie di piante spontanee coltivate rispetto al contenuto

polifenolico ed attività antiossidante. Tali valori andranno ad ampliare il profilo bromatologico di ogni specie in esame individuato nel primo anno di attività.

3) L’ottenimento di dati riguardo il rapporto tra la sintesi di flavonoidi e le condizioni

pedoclimatiche di crescita/coltivazione delle specie. La caratterizzazione metabolica delle specie edibili più interessanti per l’Azienda Agrifaber continuerà anche nel terzo anno di attività, con l’utillizo di tecniche analitiche avanzate quali la cromatografia liquida in spettrometria di massa (HPLC-ESI-MS)

4) Determinazione della reale biodisponibilità di polifenoli in seguito all’assunzione di un pasto

di erbe spontanee. Tale sperimentazione in vivo ci ha permesso di ottenere dati certi riguardo l’aumento dell’attività antiossidante dei fluidi biologici nei volontari che hanno assunto un pasto a base di cicoria selvatica.

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