UNIVERSITÀ DI PISA

Dipartimento di Biologia

Corso di Laurea Magistrale in Biologia Applicata alla Biomedicina

Curriculum Fisiopatologico

Tesi di Laurea Magistrale

Analisi del polimorfismo 1444 G>A nel gene PGC-1α e suo coinvolgimento nella risposta allo

stress ossidativo durante l’esercizio fisico in pazienti con Sclerosi Laterale Amiotrofica

Candidato Relatore

Angelique Pasquinelli Prof. Gabriele Siciliano

Anno Accademico 2014-2015

Ai miei genitori.

“Bisogna sempre puntare alla luna.

Mal che vada, si è comunque

arrivati in mezzo alle stelle.”

(Cit.)

Indice Riassunto ...................................................................................................................................................... 1

1. Introduzione ............................................................................................................................................. 4

1.1. La Sclerosi Laterale Amiotrofica ........................................................................................................ 4

1.1.1. Aspetti Generali e Quadro Clinico .............................................................................................. 4

1.1.2. Epidemiologia della SLA ............................................................................................................. 6

1.1.3. Eziopatogenesi della SLA ............................................................................................................ 6

1.2. Il Coattivatore PGC-1 alpha ............................................................................................................. 17

1.2.1. Ruolo di PGC-1α nelle malattie neurodegenerative ................................................................ 19

1.2.2. PGC-1α e la regolazione del metabolismo ossidativo .............................................................. 20

1.2.3. PGC-1α e l’attività fisica ........................................................................................................... 21

1.3. Esercizio fisico e biomarcatori di stress ossidativo ......................................................................... 26

2. Scopo ...................................................................................................................................................... 32

3. Pazienti e metodi .................................................................................................................................... 34

3.1. Pazienti ............................................................................................................................................ 34

3.2. Protocollo del test da sforzo ai muscoli dell’avambraccio .............................................................. 35

3.3. Metodiche di laboratorio ................................................................................................................ 36

3.3.1. Estrazione di DNA genomico da sangue intero ........................................................................ 36

3.3.2. Genotipizzazione dello SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α ......................................................... 36

3.3.3. Purificazione del prodotto di PCR e analisi di sequenza .......................................................... 39

3.3.4. Dosaggi biochimici per l’analisi di marcatori periferici di danno ossidativo ............................ 42

4. Analisi statistica ...................................................................................................................................... 49

5. Risultati ................................................................................................................................................... 50

5.1. Analisi del polimorfismo 1444 G>A nel gene PGC-1α ..................................................................... 50

5.2. Valutazione dei biomarcatori di stress ossidativo ........................................................................... 51

5.3. Relazione tra i biomarcatori di stress ossidativo e lo SNP 1444 G>A in PGC-1α ............................. 52

5.4. Effetti del test da sforzo sui biomarcatori di stress ossidativo ....................................................... 53

5.5. Relazione tra la variazione nei livelli dei biomarcatori di stress ossidativo durante il test da sforzo

e lo SNP 1444 G>A in PGC-1α ................................................................................................................. 54

6. Discussione ............................................................................................................................................. 57

7. Conclusioni ............................................................................................................................................. 72

8. Bibliografia .............................................................................................................................................. 73

9. Ringraziamenti ........................................................................................................................................ 89

1

Riassunto

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da

paralisi muscolare progressiva che riflette la degenerazione dei motoneuroni della corteccia

motoria primaria, del tronco cerebrale e del midollo spinale.

Sebbene l’eziopatogenesi della malattia rimanga ancora sconosciuta, nel corso degli anni sono

stati proposti numerosi meccanismi di morte neuronale tra i quali i più accreditati sono

l’eccitotossicità glutammatergica, lo stress ossidativo, le disfunzioni mitocondriali, la presenza

di inclusioni citoplasmatiche costituite da aggregati di proteine e difetti nella maturazione

dell’RNA. Nonostante il coinvolgimento dello stress ossidativo nella SLA sia stato ampiamente

studiato, non è ancora noto il preciso meccanismo molecolare alla base della risposta cellulare

all’insulto ossidativo.

Le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS), prodotte principalmente a livello mitocondriale, in

condizioni fisiologiche, sono neutralizzate dai meccanismi di difesa antiossidante; quando tale

equilibrio viene alterato, si ha un incremento della produzione delle ROS e si instaura una

condizione di stress ossidativo. L’incremento delle ROS media molte funzioni biologiche, tra cui

l’attivazione di un co-attivatore trascrizionale tessuto-specifico, il Peroxisome Proliferator-

Activated Receptor Gamma Coactivator 1 alpha (Pgc-1α) che gioca un ruolo importante nella

regolazione della biogenesi mitocondriale e dei meccanismi di difesa antiossidante. PGC-1α è

maggiormente espresso nei tessuti con alto metabolismo, come il muscolo scheletrico e

l’encefalo. È stato osservato che il polimorfismo (SNP) 1444 G>A (Gly482Ser) nell’esone 8 del

gene PGC-1α induce un cambiamento nella struttura della proteina che provoca, a sua volta,

una riduzione dei livelli nonché dell’attività trascrizionale della proteina stessa. Studi condotti

su atleti hanno messo in evidenza che l’allele wild-type G è associato ad una maggiore

resistenza fisica, rispetto agli individui con genotipo omozigote AA (Ser482Ser).

Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare se lo SNP 1444 G>A costituisse un

fattore di rischio per l’insorgenza della forma sporadica di SLA (sSLA) e le sue possibili

implicazioni nella risposta cellulare all’insulto ossidativo in condizioni di riposo e durante un

esercizio fisico. Sono stati pertanto valutati:

a) la distribuzione delle frequenze alleliche e genotipiche (SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α)

in 197 pazienti con sSLA e 197 controlli sani. La genotipizzazione è stata condotta

2

mediante analisi Restriction fragment length polymorphism (RFLP) e, per conferma,

tramite sequenziamento diretto della regione del DNA di interesse;

b) i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo in un sottogruppo di 74

pazienti con sSLA e in 65 controlli sani; in particolare sono stati dosati, come marker di

danno ossidativo i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine (AOPP) e, come

markers antiossidanti non enzimatici, la Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP)

e i gruppi tiolici totali plasmatici. Inoltre, in 35 pazienti sono state valutate l’attività della

Superossido Dismutasi Totale (Sod) e della Catalasi (Cat), quali markers antiossidanti

enzimatici, mediante metodo colorimetrico e analisi spettrofotometrica;

c) eventuali variazioni nei livelli plasmatici dei biomarcatori analizzati tra pazienti con sSLA

omozigoti wild-type GG e portatori della variante allelica rara 1444A (A Carriers);

d) possibili variazioni dei livelli plasmatici di biomarcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP,

tioli e acido lattico) in un sottogruppo di 28 pazienti sSLA sottoposti ad un test da sforzo

incrementale ai muscoli dell’avambraccio: le valutazioni sono state condotte a diversi

steps: prima (basale), durante (30%, 50% e 70% della Contrazione Volontaria Massimale,

CVM) e dopo 15 minuti dalla fine dello sforzo (recupero);

e) l’eventuale influenza della variante allelica rara A sui livelli dei biomarcatori di stress

ossidativo, valutati durante il protocollo di esercizio fisico.

L’analisi dei dati relativi allo SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α non mostra differenze

statisticamente significative nella distribuzione genotipica e nelle frequenze alleliche dei

pazienti con sSLA rispetto ai relativi controlli.

Analizzando i risultati relativi allo stress ossidativo, si osserva che i livelli plasmatici basali degli

AOPP (p<0.001) risultano essere più elevati nei pazienti sSLA rispetto ai controlli, mentre i livelli

della FRAP (p<0.001) e dei tioli (p<0.001) sono ridotti nei primi rispetto ai secondi. Inoltre,

prendendo in esame rispettivamente la popolazione totale studiata, il gruppo dei pazienti e il

gruppo dei controlli, i livelli dei suddetti biomarcatori di stress ossidativo non differiscono tra

soggetti wild-type e A Carriers. Anche dalla valutazione dei livelli degli antiossidanti enzimatici

(Sod e Cat) nel sottogruppo di pazienti, esaminati solo per questi due biomarcatori, non si

osservano differenze tra portatori e non portatori della variante allelica rara A (482Ser).

Durante il test da sforzo muscolare incrementale, a fronte delle variazioni della curva

lattacidemica (aumento significativo dei livelli di acido lattico al 30% (p<0.01), al 50% (p<0.01) e

al 70% (p<0.001) della CVM rispetto ai livelli basali e al 70% (p<0.05) rispetto al 30% della CVM,

3

riduzione significativa dei livelli di acido lattico nella fase di recupero rispetto al 50% (p<0.05) e

al 70% (p<0.001) della CVM), non si osservano variazioni significative dei livelli plasmatici medi

degli AOPP, della FRAP e dei tioli misurati prima, durante e dopo lo sforzo fisico.

Suddividendo i pazienti in omozigoti wild-type (GG), eterozigoti (GA) e omozigoti mutati (AA),

non si osservano, nei tre gruppi, durante il test da sforzo, differenze statisticamente

significative nei livelli plasmatici della FRAP e dei tioli; tuttavia, gli omozigoti mutati mostrano,

per tutta la durata dell’esercizio, livelli medi di AOPP più elevati, rispetto sia ai soggetti wild-

type, che agli eterozigoti. Tale differenza risulta significativa al 50% della CVM (p<0.05, GG vs

AA; p=0.05, GA vs AA) e in corrispondenza della fase di recupero (p=0.01, GG vs AA; p<0.05, GA

vs AA). Individui eterozigoti GA presentano invece livelli medi di AOPP sovrapponibili agli

omozigoti wild-type. Differenze statisticamente significative, inoltre, si osservano, durante le

varie fasi contrattili del test da sforzo, nei livelli plasmatici dell’acido lattico. Più precisamente,

gli individui omozigoti AA mostrano incrementi significativi dei livelli di acido lattico al 30%

(p<0.01) e al 50% (p<0.001) della CVM, rispetto ai soggetti con genotipo GG. Anche gli individui

eterozigoti, a questi due steps, mostrano un lieve aumento dei livelli di acido lattico rispetto agli

omozigoti wild-type, ma queste differenze non risultano significative.

In conclusione, i dati relativi al polimorfismo in esame, 1444 G>A (Gly482Ser), fanno supporre

che lo SNP non rappresenti un fattore di suscettibilità genetica per la SLA. I risultati ottenuti dal

confronto dei diversi marcatori di stress ossidativo tra pazienti sSLA e relativi controlli,

confermano il coinvolgimento dello stress ossidativo nella malattia; lo SNP Gly482Ser non

sembra essere implicato nelle variazioni dei livelli plasmatici a riposo dei biomarcatori di stress

ossidativo analizzati. Nonostante sia noto da tempo che l’esercizio fisico incrementa,

nell’immediato, la produzione dei radicali liberi, il test da sforzo incrementale eseguito dai

pazienti in esame non ha avuto alcun effetto sui livelli plasmatici dei biomarcatori AOPP, FRAP e

tioli, mentre induce variazioni dei livelli di acido lattico. Infine, i risultati ottenuti, suddividendo i

pazienti in omozigoti per la variante allelica rara A (genotipo AA), eterozigoti (genotipo GA) e

omozigoti per l’allele comune (genotipo GG), fanno ipotizzare che la presenza della variante

allelica rara A, possa concorrere ad incrementare il danno ossidativo alle proteine e l’accumulo

di acido lattico durante l’attività fisica.

4

1. Introduzione

1.1. La Sclerosi Laterale Amiotrofica

1.1.1. Aspetti Generali e Quadro Clinico

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), conosciuta anche come Morbo di Lou Gehrig, o malattia

di Charcot, è una patologia neurodegenerativa caratterizzata da una progressiva paralisi

muscolare che riflette la degenerazione del primo e del secondo motoneurone. L’etimologia

stessa della definizione sclerosi laterale amiotrofica è di fatto una descrizione della patologia: il

termine “amiotrofico” indica l’indebolimento e l’atrofia delle fibre muscolari, l’aggettivo

“laterale” si riferisce alla zona del midollo spinale occupata dai neuroni sofferenti; infine, il

termine sclerosi è riferito al fatto che questa “zona laterale” del midollo spinale tende ad

indurirsi nel momento in cui i motoneuroni ivi contenuti iniziano a morire (Wijesekera et al.,

2009) (figura 1).

Figura 1: il motoneurone centrale o primario trasmette il segnale nervoso dalla corteccia cerebrale motoria al

midollo spinale; il motoneurone periferico o secondario trasporta il segnale ricevuto dall’encefalo ai muscoli (da

Fotolia.com).

La prima descrizione di SLA, che precede quella ufficiale di Charcot, si deve a Charles Bell, che

illustrò un caso caratterizzato da deterioramento motorio progressivo associato alla

degenerazione della metà anteriore della spina dorsale. Charcot, invece, fu il primo a

5

considerare la progressiva debolezza muscolare come conseguenza di una condizione

patologica dei neuroni motori spinali e non come una malattia muscolare (Dickson, 2006).

Il termine SLA è usato, nella pratica clinica moderna, per indicare la forma più comune delle

Malattie dei Motoneuroni (MND), distinguibili in relazione al coinvolgimento del primo o del

secondo motoneurone o sulla base del distretto anatomico colpito all’esordio della patologia.

Clinicamente la malattia è associata alla perdita progressiva e irreversibile della capacità

motoria, mentre restano intatte le funzioni cognitive, sensoriali, sessuali e sfinterali (Wijesekera

et al., 2009). I soggetti affetti dalla malattia sviluppano una paralisi progressiva, che coinvolge

tutto il muscolo scheletrico, i muscoli bulbari e respiratori, e che porta al decesso dell’individuo

entro pochi anni dalla comparsa dei primi segni, quali brevi contrazioni muscolari

(fascicolazioni), e crampi agli arti, che anticipano di qualche mese o addirittura di alcuni anni i

sintomi clinici veri e propri: debolezza muscolare, alterazione dei riflessi tendinei e segno

positivo di Babinski (D’Amico et al., 2013).

La SLA è una patologia a carattere prettamente sporadico anche se il 10% dei casi mostra

un’origine familiare (Ingre et al., 2015). La forma sporadica (sSLA) è contraddistinta da tipiche

inclusioni all’interno delle cellule neuronali, quali i Corpi di Bunina, costituiti da granulociti

eosinofili; queste inclusioni, di 2–4 µm di diametro, possono essere singole, riunirsi in cluster o

assemblarsi in catene. I Corpi di Bunina sono stati osservati all’interno del corpo cellulare e dei

dendriti dei neuroni interessati dalla malattia (Dickson, 2006). La forma familiare (fSLA), invece,

è istologicamente divisibile in due tipi: il primo in cui si riscontra la presenza dei Corpi di Bunina,

il secondo associato al coinvolgimento delle colonne posteriori del midollo spinale.

Quest’ultima forma di fSLA, come la prima, è caratterizzata dalla presenza di inclusioni

citoplasmatiche costituite da aggregati di proteine; in particolare, sono stati identificati

accumuli di due proteine, TAR DNA Binding Protein (TARDBP/TDP-43) e Fused in

Sarcoma/Translocated in liposarcoma (FUS/TLS), responsabili del processo di maturazione

dell’RNA messaggero (mRNA) a livello del citoplasma dei neuroni (Neumann et al., 2009).

Attualmente non è disponibile una cura per questa malattia e il decesso solitamente è causato

dall’insorgenza di crisi respiratorie, che generalmente si presentano dopo 3-5 anni dalla

comparsa dei sintomi. Ad oggi, l'unico farmaco approvato dalla Food and Drug Administration e

raccomandato dal National Institute for Clinical Excellence, è il Riluzolo, un benzotiazolo che

riduce il rilascio di glutammato attraverso tre meccanismi: inibisce la liberazione del

glutammato dal terminale pre–sinaptico, lega in modo non competitivo i recettori N-Metil-D-

6

Aspartato (NMDA) e agisce direttamente sui canali del sodio voltaggio-dipendenti, bloccando il

re–uptake del glutammato stesso. Queste tre attività farmacologiche coordinate causano un

rallentamento della progressione della patologia con un aumento della sopravvivenza dai tre ai

dodici mesi (Harikrishnareddy et al., 2015).

1.1.2. Epidemiologia della SLA

La SLA è una patologia rara, con un'incidenza di 2-3 casi ogni 100.000 individui l'anno.

L’incidenza con cui si manifesta la malattia è simile in tutto il mondo con l’eccezione di alcune

aree ad alto rischio nel Pacifico Occidentale, in cui si presenta sotto una forma atipica associata

a demenza, parkinsonismo e alla presenza di aggregati neurofibrillari in molte regioni cerebrali

(Dickson, 2006).

Sebbene la SLA insorga generalmente in soggetti di età superiore ai 40 anni, sono stati descritti

casi con età di esordio inferiore, che annoverano il 10% dei soggetti e costituiscono le forme

giovanili (Shoesmith et al., 2006). L’età media di insorgenza è tra i 58 e i 63 anni per la forma

sporadica e tra i 40 e i 60 per la forma familiare. Si presenta più frequentemente negli uomini

rispetto alle donne, con un rapporto maschio:femmina di 1.5:1.2 (Ingre et al., 2015).

Recenti evidenze epidemiologiche indicano un aumento dei casi di SLA in molti Paesi, dovuto

probabilmente a fattori ambientali, come l’esposizione alle radiazioni, ma anche ad attività

fisica intensa o a traumi cranici e midollari. Nonostante queste evidenze, tali fattori non sono di

per sé la causa della patologia, che sembra invece riflettere una complessa interazione tra

componenti ambientali e suscettibilità genetica (Majoor–Krakauer et al., 2003).

1.1.3. Eziopatogenesi della SLA

Negli ultimi anni, grazie alle nuove tecnologie di biologia molecolare e alla creazione di un

consorzio mondiale per la ricerca sulla SLA è stato possibile identificare diversi geni o loci

genetici responsabili dell’insorgenza delle fSLA. Nonostante siano stati condotti molteplici studi,

sia su modelli murini, che nell’uomo, l’esatto processo molecolare di neurodegenerazione dei

motoneuroni nella sSLA rimane ancora sconosciuto. Probabilmente, nella comparsa e nella

progressione della malattia sono coinvolti più meccanismi cellulari patogenetici, non

necessariamente correlati tra loro (Cozzolino et al., 2015).

7

- Fattori di rischio genetici

Le forme di ereditarietà della SLA variano in base al tipo di mutazione; nella maggior parte dei

casi spesso la fSLA si trasmette con modalità autosomica dominante e raramente recessiva ad

alta penetranza (Ticozzi et al., 2011).

Finora sono stati identificati cinque geni diversi le cui mutazioni causano la malattia. Mutazioni

nei geni Cu-Zn Superossido Dismutasi (SOD1), TARDBP/TDP-43, FUS/TLS, e Vescicle-associated

protein B (VAPB) sono responsabili di circa un quarto dei casi familiari, mentre quelle

identificate nel gene Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) sembrano essere

responsabili di una parte più sostanziale dei casi familiari; infatti, mutazioni nel gene C9ORF72

sono state identificate in circa la metà dei casi familiari finlandesi e in un terzo di quelli europei

(Ingre et al., 2015).

Nel 1993, Rosen e collaboratori identificarono il primo gene causativo della fSLA: SOD1. La

presenza di mutazioni in tale gene è responsabile di circa il 20% delle forme fSLA e del 2% delle

forme sSLA (Furukawa et al., 2006). Il gene SOD1 mappa sul cromosoma 21q22.1 (Cluskey et al.,

2001) e, finora, nei pazienti SLA con forma familiare, sono state identificate più di 170

mutazioni (Ingre et al., 2015), quasi tutte ereditate con modalità autosomico dominante

(Ticozzi et al., 2011). Nell’uomo sono presenti tre isoenzimi della Sod: Sod1 localizzato nel

citoplasma, Sod2 nei mitocondri e Sod3 a livello extracellulare. La Sod1, omodimero con uno

ione rame e uno ione zinco in ogni subunità (Cluskey et al., 2001) è biochimicamente definita

come l’enzima responsabile della conversione dei radicali superossidi (∙O2-), in ossigeno (O2) e

perossido di idrogeno (H2O2), (Ingre et al., 2015), secondo la seguente reazione:

2∙O2- + 2 H+ ⇌ O2 + H2O2

Il H2O2 formatosi verrà poi convertito in ossigeno ed acqua (H2O) nella seguente reazione

catalizzata dalla catalasi (Cat), enzima appartenente alla classe delle ossido reduttasi:

2 H2O2 ⇌ O2 + 2 H2O

Quando i livelli di H2O2 sono troppo bassi per attivare le catalasi, la decomposizione dei

perossidi avviene per attivazione della glutatione perossidasi (GPx).

Inizialmente si riteneva che mutazioni nel gene SOD1 potessero causare una minore attività

dell’enzima. Tuttavia, come emerso da altri studi, condotti su soggetti affetti da fSLA e su topi

transgenici G93A, il quadro risulta essere più complesso. Infatti, molte mutazioni identificate in

pazienti con SLA, non intaccano l’attività di dismutazione di Sod1; altre, invece, accrescono

8

l’attività catalitica dell’enzima. Sorprendentemente, topi transgenici G93A sviluppano un

fenotipo simile alla SLA, mentre topi knock-out per SOD1 non sviluppano la malattia (Cluskey et

al., 2001), suggerendo che Sod1 non è necessaria per il normale sviluppo e funzionamento dei

motoneuroni (Sau et al., 2007). Ciò suggerisce che la perdita dell’attività non è ritenuta

sufficiente a provocare la malattia e probabilmente la tossicità della mutazione a carico del

gene che codifica per Sod1 si esplica attraverso uno sconosciuto guadagno di funzione

dell’enzima (Barber et al., 2010).

Diversi studi hanno identificato altri due geni coinvolti nell’insorgenza delle forme familiari di

SLA: TDP-43 (Sreedharan et al., 2008) e FUS/TLS (Kwiatkowsky et al., 2009). Le proteine

codificate, rispettivamente Tdp43 e Fus/Tls, sono entrambe connesse al processamento

dell’mRNA, in quanto sono deputate al suo trasporto dal distretto nucleare a quello

citoplasmatico (Lagier-Tourenne et al., 2010). TDP-43 e FUS/TLS hanno una struttura molto

simile (figura 2), con un dominio ricco di glutammina, asparagina e glicina, che sembra essere

fondamentale per la polimerizzazione, in sede extracellulare, di fibre costituite da materiale

proteico insolubile, simili ad aggregati di amiloide (Lee et al., 2015).

Figura 2: rappresentazione schematica della struttura dei domini di TDP-43 e FUS/TLS. Entrambe le proteine

contengono domini RRM NLS=Nuclear Localization Signal, RRM=RNA Recognition Motif, NES=Nuclear Export

signal, Gly-rich=Glycine rich region, SYGQ-rich=Glutamine/Glycine/Serine/Tyrosine rich region,

RGG=Arginine/Glycine rich region, ZnF=Zinc finger motif (da Lee et al., 2015).

Mentre nei soggetti sani, Tdp-43 e Fus/Tls sono localizzate nel nucleo (Finelli et al., 2015), nei

pazienti affetti da SLA, si accumulano in inclusioni citoplasmatiche contenenti ubiquitina: il

9

legame tra ubiquitina e le proteine Tdp-43 e Fus/Tls porta alla degradazione delle proteine

stesse tramite ubiquitinazione (Ingre et al., 2015).

Le conseguenze delle mutazioni nei geni TDP-43 e FUS/TLS non sono ancora del tutto note, ma

recenti studi in vitro, suggeriscono che potrebbero essere associate alla morte delle cellule

neuronali (Finelli et al., 2015). L’accumulo di aggregati insolubili di Tdp-43 potrebbe

compromettere il normale funzionamento di questa proteina e indurre la progressione della

malattia. L’ossidazione di cisteine nel motivo di riconoscimento dell’RNA di Tdp-43 induce

cambiamenti conformazionali che, successivamente, provocano aggregazione proteica che, a

sua volta, facilita la progressione della malattia (Li et al., 2013). Recenti studi suggeriscono che

le inclusioni citoplasmatiche contenenti Tdp-43 sono costituite prevalentemente dal dominio C-

terminale di Tdp43, dove sono state ritrovate quasi tutte le mutazioni di questo gene; inoltre,

studi condotti in vitro, mostrano che il dominio C-terminale frammentato ha una maggiore

capacità di aggregazione (Polymenidou, 2011). Vari studi hanno identificato la proteina Fus/Tls

come una componente delle inclusioni citoplasmatiche, sia nei pazienti con sSLA che in individui

affetti da demenza frontotemporale (FTD). La maggior parte delle mutazioni nel gene FUS/TLS,

riscontrate nelle forme fSLA, ereditate come carattere autosomico dominante (Ticozzi et al.,

2011), interrompono un segnale di localizzazione nucleare (NLS) nel dominio C-terminale,

portando alla formazione, nel citoplasma, di granuli da stress, nonché riduzione delle funzioni

nucleari. Inoltre, si suppone che, anche la regione N-terminale della proteina Fus/Tls sia

implicata nella formazione di aggregati proteici reversibili simili ad amiloide; ciò potrebbe

essere l’inizio della generazione dei granuli contenenti RNA, tra cui i granuli nucleari (Kino et al.,

2011). TDP-43 e FUS, dunque, giocano un ruolo importante nella patogenesi della SLA; tuttavia,

sono necessari ulteriori studi per chiarire il loro esatto meccanismo d’azione (Lee et al., 2015).

Altri studi hanno identificato in pazienti affetti da fSLA mutazioni a carico del gene che codifica

per la proteina Vescicle-associated membrane protein-associated protein B (Vapb). Vapb

appartiene alla famiglia di Vap, è una proteina adattatrice a livello del reticolo endoplasmatico

coinvolta nel trasporto dei lipidi (Fasana et al., 2010). L’azione patogenetica di VAPB mutato si

esplica nella promozione della formazioni di inclusioni intracellulari e nell’attivazione delle vie

di morte cellulare (Chen et al., 2010). Mutazioni a carico di questo gene sono responsabili

dell’insorgenza della forma rara di SLA a lenta progressione (SLA8), della tipica forma di SLA

severa a rapida progressione e di una forma tardiva di atrofia muscolare spinale (SMA).

10

Probabilmente la co-localizzazione delle inclusioni della proteina mutata, nel citosol e nel

reticolo endoplasmatico, può interferire con i processi vitali della cellula (Fasana et al., 2010).

Il gene che codifica per la proteina c9orf72, la cui funzione non è ancora del tutto nota, è stato

identificato in modo indipendente e simultaneo nel 2011 da due gruppi di ricerca, guidati

rispettivamente da DeJesus-Hernandez e Renton. Il gene, localizzato sul cromosoma 9p21, è

costituito da 12 esoni, di cui i primi due non codificanti (1a e 1b). L’alterazione identificata

consiste in un’espansione esanucleotidica, GGGGCC, localizzata nella regione intronica tra gli

esoni 1a e 1b ed è stata riscontrata nel 40% dei casi fSLA e nel 20% degli sSLA (DeJesus-

Hernandez et al., 2011; Renton et al., 2011).

Nei pazienti affetti da SLA, sono state ritrovate più di un migliaio di ripetizioni, mentre nella

popolazione sana il numero varia da 2 a 30 ripetizioni. L’espansione GGGGCC nel gene C9ORF72

provoca la formazione di grovigli ibridi DNA/RNA che interferiscono con le normali attività della

cellula; inoltre tali aggregati sono in grado di legare e bloccare quasi 288 proteine nucleari, tra

cui la nucleolina, preposta alla produzione dei ribosomi, strutture necessarie per la traduzione

dei messaggeri in proteine (Haeusler et al., 2014). Farg e collaboratori (2014) hanno dimostrato

che l’espansione GGGGCC può interferire anche nel traffico vescicolare e nel meccanismo di

autofagia.

Circa il 5% delle fSLA è dovuto a mutazioni, soprattutto delezioni frameshift o nonsense e

sostituzioni missense, riscontrate in altri geni, tra cui Amyotrophic Lateral Sclerosis 2 (ALS2),

Senataxin (SETX), Spastic Paraplegia 11 (SPG11) e Angiogenin (ANG), che provocano forme

atipiche ad esordio giovanile, ereditate con modalità a carattere autosomico recessivo. Più

precisamente, nel 1994 è stato scoperto il gene ALS2, sito sul cromosoma 2q33-35, codificante

per la proteina Alsin, associato alla SLA2, caratterizzata da atrofia dei muscoli distali, debolezza

e spasticità progressiva ascendente, dagli arti inferiori alla cervicale e ai segmenti bulbari. Altre

mutazioni riscontrate alla fine degli anni ’90, nei gene SETX, sito sul cromosoma 9q34, e SPG11,

localizzato sul cromosoma 15q15-21, che codificano rispettivamente per due proteine

Senataxin e Spatacsin, causano la SLA4 e la SLA5: i giovani pazienti, solitamente, sviluppano

debolezza simmetrica e atrofia dei muscoli distali degli arti, con coinvolgimenti dei tratti

corticospinali e dei muscoli bulbari (Ticozzi et al., 2011).

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- Degenerazione dei motoneuroni nella SLA

Il processo di degenerazione dei motoneuroni è il risultato della combinazione di diversi

pathways molecolari: eccitotossicità, stress ossidativo, disfunzione mitocondriale, aggregazione

proteica, disfunzione citoscheletrica e difetti nella maturazione dell’RNA. Non è ancora chiaro

quali tra queste condizioni siano le cause primarie della malattia e quali siano, invece, le

conseguenze (Matsumoto et al., 2007).

Attualmente è ancora valida l’ipotesi che l’eccitotossicità possa contribuire alla selettiva perdita

dei motoneuroni, principalmente attraverso l’alterazione dei meccanismi del turnover del

glutammato a livello sinaptico (Wijesekera et al., 2009). Per eccitotossicità si intende un

fenomeno di tossicità neuronale dovuto ad elevate concentrazioni di glutammato, il principale

neurotrasmettitore ad attività eccitatoria del Sistema Nervoso Centrale (SNC). L’eccessivo

rilascio di glutammato, liberato nel vallo sinaptico, va ad iperattivare, sul neurone

postsinaptico, i recettori NMDA e α-amino-3-idrossi-5-metil-a-isoxazoloproprionato (AMPA).

Questa sovra-stimolazione dei recettori glutammatergici facilita, attraverso il canale Na+/Ca2+, il

flusso intracellulare di ioni Ca2+, che si accumulano nelle cellule, portando ad un aumento della

formazione di Ossido Nitrico (NO) e all’attivazione delle caspasi, implicate nel processo di morte

cellulare programmata (Wijesekera et al., 2009). I livelli di glutammato, nella fessura sinaptica,

sono regolati sia dall’inattivazione dei recettori NMDA e AMPA, sia dall’azione delle proteine

trasportatrici, note come Trasportatori degli Amminoacidi Eccitatori (EAATs) che inducono, a

livello dei neuroni e degli astrociti, la ricaptazione intracellulare del glutammato stesso

mediante un meccanismo di co-trasporto (Mulligan et al., 2013). La presenza di elevate

concentrazioni di glutammato nel fluido cerebrospinale dei pazienti con sSLA, suggerisce che

l’eccitotossicità glutammatergica possa contribuire ai meccanismi di neurodegenerazione

riscontrati in questa patologia (Cluskey et al., 2001). Studi condotti su topi knock-out per EAAT

mostrano un aumento dei livelli di glutammato nella fessura sinaptica, con conseguente

incremento della degenerazione dei motoneuroni. Studi post-mortem condotti su pazienti con

sSLA, hanno messo in evidenza una riduzione del 30-90% dei livelli di EAAT2, rispetto ai controlli

(Cluskey et al., 2001). La perdita del trasportatore EAAT2 non è comunque generalizzata, ma

riguarda soltanto le popolazioni astrocitarie del midollo spinale e della corteccia motoria che

sono coinvolte nella malattia (Cluskey et al., 2001). Poiché la perdita della proteina non è

accompagnata ad un equivalente decremento del suo mRNA, e poiché non sono state

identificate mutazioni nelle regioni codificanti per il trasportatore, si è ipotizzato che l’assenza

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di EAATs sia dovuta ad un erroneo meccanismo di processazione del suo trascritto, che lo rende

instabile e, quindi, facilmente degradabile (Cluskey et al., 2001).

Tra le ipotesi formulate riguardo le modalità di insorgenza della SLA, le più accreditate, oltre a

quella eccitotossica, chiamano in causa lo stress ossidativo e le alterazioni a carico del

mitocondrio. Lo stress ossidativo può essere definito come una condizione in cui l’equilibrio

fisiologico esistente tra la produzione delle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) e la loro

detossificazione, attraverso il sistema di difesa antiossidante, viene ad inclinarsi favorendo

l’accumulo di specie chimiche reattive (Fisher-Wellman et al., 2009). Il SNC, per le sue

caratteristiche anatomiche e per la sua fisiologia, risulta essere ipersensibile allo stress

ossidativo (Emerit et al., 2004). L’encefalo, per adempiere alle sue funzioni, produce elevate

concentrazioni di ATP, con un massimo consumo di ossigeno e glucosio. Ciò rende i neuroni

molto suscettibili nei confronti dell’O2 e in grado di generare elevate quantità di radicali liberi.

Infatti, in condizioni fisiologiche, circa l’1-2% dell’O2 consumato viene convertito in ROS ma, con

l’avanzare dell’età, nell’encefalo, tale percentuale aumenta, a causa dei minori livelli di

antiossidanti e della bassa capacità di rigenerazione dei neuroni “più anziani” (Uttara et al.,

2009).

Lo stress ossidativo appare legato a una serie di eventi cellulari che si verificano nei

motoneuroni e che contribuiscono alla degenerazione e morte dei neuroni. L’analisi post-

mortem di tessuti neuronali di pazienti con sSLA mostra un consistente danno ossidativo alle

proteine, ai lipidi e al DNA, suggerendo che questo sia, probabilmente, uno dei principali

epifenomeni di degenerazione dei motoneuroni (D’Amico et al., 2013). Studi condotti su

modelli murini di SLA, supportano l’ipotesi che lo stress ossidativo non sia la causa della

malattia ma che il danno effettivo derivi dall’interazione dello stress ossidativo stesso con

l’eccitotossicità e l’apoptosi, che sarebbero le principali cause della morte neuronale (Emerit et

al., 2004).

Altri studi, che evidenziano alterazioni nei livelli dei biomarcatori di stress ossidativo in pazienti

con sSLA e fSLA, ipotizzano invece che questo fenomeno potrebbe essere coinvolto nella

patogenesi della malattia. Il glutatione ridotto (GSH), per esempio, è stato trovato, in vivo, a

bassi livelli nei motoneuroni della corteccia di pazienti SLA rispetto ai controlli sani. In modelli

murini con mutazioni nel gene SOD1, la riduzione del GSH accelera la comparsa dei deficit

neurologici e mitocondriali. Inoltre, in colture neuronali, la deplezione del glutatione induce la

formazione di inclusioni citoplasmatiche TDP-43, simili a quelle riscontrate nelle forme sSLA

13

(Carrì et al., 2015). È noto infatti che lo stress ossidativo può anche provocare cambiamenti

conformazionali e strutturali delle proteine, con conseguente formazioni di aggregati proteici,

ampiamente descritti in topi SLA e in tessuti di pazienti con SLA. Tali inclusioni possono indurre

un’ulteriore produzione delle ROS, provocando neurotossicità, come accade con TDP-43.

Inoltre, mutazioni in TDP-43 sembrano indurre disfunzioni mitocondriali e danno ossidativo,

indicato da un aumento dei livelli di perossidazione lipidica (Li et al., 2013).

Resta comunque ancora da chiarire se lo stress ossidativo sia una causa della degenerazione

neuronale o ne sia una conseguenza diretta. L’insulto ossidativo sembra, in ogni caso, avere un

ruolo centrale legato alla perdita dei motoneuroni nei pazienti SLA e per questo potrebbe

rappresentare un buon target terapeutico, anche se finora la terapia antiossidante non ha dato

i risultati sperati, probabilmente per la difficoltà di raggiungere una posologia sufficiente per

ottenere un effetto terapeutico a livello del SNC (Graf et al., 2005). Lo stress ossidativo, inoltre,

può anche contribuire ad esacerbare altri meccanismi, come l’eccitotossicità, che portano a

neurodegenerazione (Rao et al., 2004).

Recenti osservazioni indicano il coinvolgimento dei mitocondri nella genesi della

neurodegenerazione nella SLA (Cozzolino et al., 2015). I mitocondri sono organelli cellulari,

delimitati da una doppia membrana e sono la fonte principale di energia chimica all'interno

delle cellule in quanto producono, tramite il processo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS),

la maggior parte di adenosina trifosfato (ATP) (Cluskey et al., 2001). I mitocondri, inoltre,

svolgono diverse funzioni importanti tra cui la regolazione dell’apoptosi, della biosintesi dei

lipidi e dell’omeostasi del calcio (Ca2+) citosolico (Lin et al., 2006). Le funzioni mitocondriali si

alterano con l’avanzare dell’età, che a sua volta costituisce il principale fattore di rischio per le

malattie neurodegenerative (Cluskey et al., 2001). Disfunzioni mitocondriali, a livello

dell’apparato muscolo scheletrico, sono associate ad un incremento delle ROS e ad

un’attivazione della cascata apoptotica, nonché ad una riduzione della trascrizione genica, con

conseguenze quali la perdita di massa muscolare e l’affaticamento muscolare. Tuttavia, i precisi

meccanismi alla base di questi processi non sono ancora del tutto noti (Oliveira et al., 2014). La

disfunzione mitocondriale è riconosciuta come uno dei fattori di rischio per lo sviluppo della

sSLA (Cozzolino et al., 2015). Diversi studi hanno evidenziato in motoneuroni di modelli animali

e pazienti la presenza di vacuolizzazione (Cluskey et al., 2001), anomalie strutturali dei

mitocondri (Bowling et al., 1993), alterazioni della catena di trasporto degli elettroni a livello dei

complessi I (Wiedemann et al., 1998) e IV (Vielhaber et al., 2000) e difetti nel meccanismo di

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trasporto delle proteine all’interno dei mitocondri (Cozzolino et al., 2012; Tan et al., 2014).

Infine, sono state descritte, in rari casi, anomalie del DNA mitocondriale (mtDNA), come

delezioni multiple o mutazioni nonsense nel gene che codifica per la subunità I della citocromo

c ossidasi (Comi et al., 1998).

Conseguenze dirette delle alterazioni mitocondriali includono: deficit nella produzione di

energia a livello cellulare, aumento dello stress ossidativo, induzione dei processi apoptotici e

aumento dei livelli del Ca2+ intracellulare. Considerando che il mitocondrio è simultaneamente

bersaglio e produttore di ROS, è ovvio che lo stress ossidativo e le alterazioni mitocondriali sono

fenomeni strettamente correlati (figura 3) (Carrì et al., 2015). L’aumentata produzione di

ROS/RNS, lo stress del Reticolo Endoplasmatico (RE) e, almeno in parte, la disregolazione

trascrizionale e l’anormale processamento dell’RNA sono tutte conseguenze della disfunzione

mitocondriale e dello stress ossidativo, che contribuiscono alla morte dei motoneuroni. A loro

volta, questi eventi patologici causano altri effetti dannosi come la formazione di proteine

misfolded, che portano alla formazione di aggregati insolubili citoplasmatici e mitocondriali, ad

una compromissione del trasporto assonale e all’alterazione dell’attività enzimatica delle

Proteine Disolfuro Isomerasi (PDI) nel RE, enzimi che catalizzano la formazione o la rottura

di ponti solfuro. Tuttavia è difficile spiegare la correlazione tra causa ed effetto dei singoli

eventi in quanto sono tutti strettamente correlati (Carrì et al., 2015).

Figura 3: disfunzioni mitocondriali e stress ossidativo sono strettamente correlati, dipendono l’uno dall’altro e

sono alla base della disregolazione dell’equilibrio redox nella SLA. Le frecce rosse potrebbero rappresentare le

cause primarie, mentre le frecce grigie potrebbero rappresentare gli effetti secondari (da Carrì et al., 2015).

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Negli ultimi anni, è stato proposto un nuovo meccanismo molecolare per spiegare la patogenesi

della SLA, che coinvolge i trasportatori del lattato, ATP-dipendenti, muscle neuronal lactate

shuttle (MNLS). Vadakkadath e collaboratori (2012) suggeriscono che gli MNLS, a livello della

giunzione neuromuscolare (NMJ), siano in grado di mantenere l’omeostasi del lattato tra i

muscoli e i motoneuroni. Un loro malfunzionamento sembra indurre accumulo di lattato a

livello della NMJ, causando nella cellula condizioni di stress e tossicità, che potrebbero condurre

a denegerazione; la mancata neurotrasmissione che ne consegue, porterebbe all’atrofia. Allo

stesso modo, anche l’accumulo di lattato nei miociti potrebbe promuovere la degenerazione

muscolare; infatti, la perdita dell'omeostasi del lattato e la successiva morte dei motoneuroni

possono creare un circolo vizioso, in cui le fibre muscolari superstiti devono lavorare

maggiormente per compensare la normale funzione muscolare. Ne consegue, una maggiore

produzione di lattato e/o di altri radicali tossici, che possono indurre ulteriore neurotossicità nei

motoneuroni, portando a degenerazione e morte neuronale. Questo meccanismo potrebbe

spiegare la rapida progressione della malattia (Vadakkadath et al., 2012).

- Fattori di rischio ambientali ed esercizio fisico

Come detto precedentemente, la SLA, così come altre forme morbose, è il risultato

dell’interazione di componenti endogene ed esogene. Numerosi studi sono stati condotti al fine

di identificare i fattori ambientali che contribuiscono alla perdita delle cellule neuronali nella

SLA. Da questi lavori è emerso, ad esempio, che in alcuni tessuti di pazienti i livelli di alcuni

metalli, come ferro, manganese e alluminio sono più elevati rispetto a quelli riscontrati nel

resto della popolazione, anche se la veridicità di questi risultati è limitata dalla grandezza del

campione analizzato (Callaghan et al., 2011).

È stata anche considerata una possibile relazione tra attività sportiva e SLA. Chiò e

collaboratori, in uno studio del 2005, hanno esaminato circa settemila giocatori professionisti di

calcio, che avevano espletato la loro attività nel periodo 1970–2001; i risultati di quest’analisi

suggeriscono che una prolungata attività calcistica costituisca un fattore di rischio per lo

sviluppo della malattia.

Molti studi condotti su umani e roditori mostrano che l’esercizio fisico di moderata intensità

esercita effetti benefici sul SNC, in quanto incrementa l’apprendimento e la capacità

mnemonica, attenua il declino cognitivo legato all’età, espleta effetti neuroprotettivi contro la

depressione e ritarda l’insorgenza delle malattie neurodegenerative (Kaspar et al., 2005; Bello-

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Haas et al., 2007). Tuttavia, mentre alcuni studi suggeriscono che la malattia si presenta più

frequentemente in individui che conducono uno stile di vita sedentario, altri dimostrano che

l’attività intensa potrebbe aumentare il rischio di insorgenza della SLA (Carreras et al., 2010).

Storicamente, il primo paziente a cui è stata diagnosticata la SLA è Lou Gehrig, un celebre

giocatore statunitense di baseball. Diversi studi mostrano un aumento del rischio di sviluppare

SLA tra i giocatori di calcio e football americano, tra gli atleti agonisti e tra gli individui che

svolgono un’intensa attività fisica, ma i dati a riguardo sono ancora incerti e contraddittori (Chiò

et al., 2005). Oltre all’attività fisica di resistenza, altri potenziali fattori di rischio, che

potrebbero spiegare la correlazione tra SLA ed esercizio, sono i ripetuti traumi cranici, l’uso

illegale di sostanze dopanti nonché sostanze chimiche utilizzate per il trattamento dell’erba nei

campi sportivi (Ingre et al., 2015).

L’attività fisica è stata correlata ad un aumento della produzione delle ROS; in particolare, il

tessuto muscolare scheletrico rappresenta la principale fonte della produzione delle ROS

durante l’esercizio fisico, anche se, altri tessuti sono implicati nella loro formazione, tra cui il

cuore, i polmoni e il sangue (Mrakic-Sposta et al., 2015). Le ROS sono potenzialmente dannose

per le funzioni muscolari, in quanto causano affaticamento ed atrofia. Per questo motivo, molti

studi sono focalizzati sulla prevenzione della formazione delle ROS, e quindi del danno

ossidativo, durante e dopo l’attività fisica (Steinbacher et al., 2015 a). La produzione delle ROS

durante uno sforzo fisico è accompagnata anche ad una marcata riduzione delle capacità

antiossidanti, proporzionalmente all’intensità dell’allenamento (Finsterer, 2012). Sembra

dunque che l’esercizio fisico prolungato, se associato ai traumi cranici e ad altri fattori esterni,

come l’esposizione ai pesticidi o l’assunzione di farmaci, sia deleterio per alcuni individui.

Tuttavia, un’attività fisica moderata, dopo l’insorgenza della malattia, potrebbe migliorarne i

sintomi (Beghi et al., 2010).

Anche se questi dati sono interessanti, non rispondono alla domanda se le alterazioni

mitocondriali, lo stress ossidativo e una prolungata attività fisica sono casualmente coinvolte

nella patogenesi della SLA o sono un epifenomeno della degenerazione neuronale.

Recenti studi hanno identificato alcune proteine che potrebbero essere coinvolte nel controllo

della risposta cellulare a segnali di stress; in particolare numerosi studi indicano un ruolo

importante di alcune proteine cardine, tra cui spicca il Peroxisome Proliferator-Activated

Receptor Gamma Coactivator 1 alpha (Pgc-1α), che interagisce con un’ampia gamma di fattori

coinvolti in diverse risposte biologiche (Arany, 2008).

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1.2. Il Coattivatore PGC-1 alpha

Il Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1 alpha (PGC-1α), uno tra i

più studiati coattivatori trascrizionali tessuto-specifico, è una proteina codificata dal gene

PPARGC1A/ PGC-1α, localizzato sul cromosoma 4p15.1 e costituito da 13 esoni (Arany, 2008).

PGC-1α fa parte della famiglia PPAR, co-fattori di trascrizione in grado di regolare il

metabolismo dei lipidi e delle lipoproteine, la mitocondriogenesi, l’omeostasi del glucosio, la

proliferazione e la differenziazione cellulare e l’apoptosi; in particolare, PGC-1α è un

modulatore della risposta cellulare all’insulto ossidativo e infiammmatorio (Chinetti et al.,

2000).

Strutturalmente la proteina Pgc-1α è costituita da un dominio N-terminale, in cui è localizzato il

sito di legame per molecole attivatrici della proteina stessa. La regione centrale, invece,

contiene il sito di legame per i fattori di trascrizione, mentre nel dominio C-terminale è

presente una regione di riconoscimento per l’RNA. La capacità di Pgc-1α di regolare la

trascrizione dei geni coinvolti nella biogenesi mitocondriale e nella termogenesi, è dovuta al

coinvolgimento di questa proteina sia nella trascrizione, che nella capacità di processare

l’mRNA (Monsalve et al., 2000).

In condizioni fisiologiche, Pgc-1α, all’interno delle cellule, si trova in uno stato conformazionale

inattivo; tuttavia, durante una contrazione muscolare o un esercizio fisico, viene attivata dalla

deacetilazione da parte delle Sirtuine (SIRTs), o dalla fosforilazione dovuta a diverse chinasi, tra

cui P38 mitogen-activated protein kinases (p38 MAPK), Calcium/calmodulin-dependent protein

kinase (CaMK) e 5' AMP-activated protein kinase (AMPK) (figura 4); altre proteine coinvolte

nell’attivazione di PGC-1α sono steroid receptor coactivator 1 (SRC-1), CREB-binding protein

(CBP) e E1A binding protein p300 (p300) (Arany, 2008; Park et al., 2014). Studi recenti hanno

mostrato che la sovraespressione delle SIRTs e la conseguente attivazione di Pgc-1α producono

effetti positivi per la salute dell’organismo, inclusi la protezione dal declino metabolico, dalle

malattie cardiovascolari, dalla neurodegenerazione e dal danno epatico (Guo et al., 2014).

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Figura 4: cascata di attivazione di PGC-1α e sue funzioni: Ormone tiroideo (TH), ossido nitrico sintasi (NOS/cGMP),

p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK), sirtuine (SIRTs), calcineurine (CaN), calcium-calmodulin-

activated kinases (CaMKs), adenosine-monophosphate-activated kinase (AMPK), cyclin-dependent kinases (CDKs) e

b-adrenergic stimulation (b/cAMP) regolano l’espressione e/o l’attivazione di PGC-1α, che co-attiva fattori di

trascrizione come nuclear respiratory factors (NRFs), estrogen-related receptors (ERRs) e peroxisome proliferator-

activated receptors (PPARs), noti per regolare diversi aspetti del metabolismo energetico, tra cui biogenesi

mitocondriale, ossidazione degli acidi grassi e difesa antiossidante (da Ventura-Clapier et al., 2008).

Una volta attivata Pgc-1α trasloca nel nucleo dove, tramite l’interazione con una vasta gamma

di fattori di trascrizione, inclusi il Nuclear Respiratory Factor 1 e 2 (NRF-1 e NRF-2), l’Estrogen-

Related Receptor Alpha (ERRα) e il Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR), attiva la

trascrizione di geni coinvolti in diverse risposte biologiche, tra cui la gluconeogenesi, la

termogenesi, il metabolismo del glucosio e degli acidi grassi, la biogenesi mitocondriale, la

fosforilazione ossidativa, l’induzione dello switch del tipo di fibra muscolare e il sistema di

difesa antiossidante (Puigserver et al., 2003; Valle et al., 2005; Liang et al., 2006).

Una funzione centrale di PGC-1α, strettamente correlata con la biogenesi mitocondriale, è la

detossificazione dalle ROS (Valle et al., 2005; St-Pierre et al., 2006). PGC-1α, infatti, oltre a

promuovere l’incremento del numero e dell’attività dei mitocondri, co-regola l’induzione di un

gruppo di proteine coinvolte nella risposta cellulare allo stress ossidativo mitocondriale. Tale

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regolazione positiva aumenta la capacità cellulare di eliminare le ROS, prevenendo disfunzioni

endoteliali e morte per apoptosi, in risposta a condizioni di stress, come per esempio elevati

livelli di glucosio (Valle et al., 2005). È stato infatti mostrato che PGC-1α, sia in condizioni

normali, che in condizioni di stress ossidativo, induce l’espressione di geni implicati nel sistema

di difesa antiossidante, come Sod1, Sod2, Gpx, Cat, Peroxirredoxins 3 and 5 (Prx3, Prx5),

mitochondrial Thioredoxin (TRX2), mitochondrial Thioredoxin Reductase (TRXR2) e

Mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP-2), tramite, probabilmente, una diretta interazione

con il promotore di questi geni (Valle et al., 2005; St-Pierre et al., 2006).

1.2.1. Ruolo di PGC-1α nelle malattie neurodegenerative

Le malattie neurodegenerative sono state associate alle disfunzioni mitocondriali, come una

ridotta capacità respiratoria, un aumento nella produzione delle ROS e dunque al danno

ossidativo. Elevati livelli di PGC-1α migliorano i fenotipi di modelli murini di queste condizioni

patologiche, probabilmente tramite l’aumento del metabolismo mitocondriale e della

detossificazione dalle ROS (figura 5) (Austin et al., 2012).

Figura 5: impatto di PGC-1α sulle malattie neurodegenerative (da Austin et al., 2012).

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Le prime prove del coinvolgimento di PGC-1α nelle malattie neurodegenerative sono state

osservate in topi knock-out PGC-1α-/-, i quali mostrano neurodegenerazione associata ad un

fenotipo clinico simile a quello della malattia di Huntington (HD) (Lin et al., 2004). Inoltre, studi

condotti su pazienti HD mostrano una concomitante riduzione delle funzioni mitocondriali e

dell’espressione di PGC-1α, suggerendo che difetti nel gene PGC-1α potrebbero contribuire allo

sviluppo di HD (Weydt et al., 2006).

Studi condotti da Shin e collaboratori (2011) hanno mostrato che PGC-1α potrebbe avere un

ruolo protettivo nei confronti della Malattia di Parkinson (PD). È stato osservato che PARIS, un

substrato che interagisce con la proteina Parkin e i cui livelli sono regolati dall’ubiquitinazione

da parte della E3 ubiquitina ligasi, è uno dei maggiori repressori della trascrizione di PGC-1α.

Infatti, topi knock-out per Parkin mostrano una progressiva perdita dei neuroni dopaminergici,

una sovraespressione di PARIS e una diminuzione nella trascrizione di PGC-1α (Shin et al.,

2011).

PGC-1α sembra essere implicato anche nella Malattia di Alzheimer (AD), dove, sia nei pazienti

che in modelli murini AD, l’espressione di PGC-1α è ridotta, nella distrofia muscolare di

Duchenne e nella SLA (Sheng et al., 2012). In particolare, studi condotti su modelli murini G93A

hanno dimostrato che PGC-1α migliora il fenotipo complessivo della malattia (Liang et al.,

2011). Infatti, un aumento dell’attività di Pgc-1α, a livello del tessuto muscolare, si traduce in

un incremento significativo della resistenza muscolare, riduce l’atrofia e migliora l’attività

locomotoria anche in fasi avanzate della malattia (Da Cruz et al., 2012).

1.2.2. PGC-1α e la regolazione del metabolismo ossidativo

In diversi tessuti connessi con il metabolismo ossidativo, incluso il tessuto muscolare, i

coattivatori della famiglia delle proteine Pgc-1 svolgono molteplici attività biologiche. Infatti, sia

Pgc-1α che Pgc-1β sono altamente espresse nei tessuti dove è attivo il metabolismo ossidativo

come il cuore, l’encefalo, il rene e il muscolo, promuovendo la biogenesi mitocondriale e

aumentando la respirazione cellulare (Arany, 2008). È stato dimostrato che Pgc-1α aumenta

l’espressione e l’attività dei fattori di trascrizione NRFs, che a loro volta regolano l’espressione

di numerosi geni mitocondriali (Wu et al., 1999). Studi successivi hanno dimostrato che Pgc-1α

ha come principale funzione fisiologica l’incremento dell’espressione dei geni mitocondriali e

un’induzione sostanziale della respirazione cellulare (St-Pierre et al., 2003). Questi due studi

21

identificano Pgc-1α come il maggior induttore della biogenesi e della respirazione mitocondriale

(Austin et al., 2012).

Modelli animali PGC-1α -/- e PGC-1β -/- presentano anomalie nel tessuto scheletrico e

alterazioni del metabolismo energetico del muscolo cardiaco. Viceversa, se nel muscolo

scheletrico viene indotta l’espressione di PGC-1α e PGC-1β si ha un incremento della biogenesi

mitocondriale (Arany, 2008). Studi condotti sui tessuti di modelli murini PGC-1α -/- e PGC-1β -/-

mostrano un volume mitocondriale ridotto nelle fibre lente o rosse del muscolo scheletrico

reclutate in azioni muscolari di scarsa entità ma di lunga durata (Leone et al., 2005), nonostante

gli animali abbiano comunque un pool di mitocondri funzionali. La delezione dei co-attivatori

PGC-1, effettuata solo nell’ambito di cellule del grasso bruno, porta alla quasi completa perdita

dei mitocondri (Arany, 2008). Inoltre, a conferma di ciò, l’espressione forzata di PGC-1α, in

cellule di mammifero in cultura o in tessuti specifici di topi transgenici, aumenta il numero e il

volume dei mitocondri, con conseguente miglioramento della capacità respiratoria cellulare (Da

Cruz et al., 2012).

1.2.3. PGC-1α e l’attività fisica

È stato osservato che le fibre muscolari in risposta a stimoli esterni, tra cui l’attività fisica, a

causa della loro elevata plasticità, possono modificare la loro composizione. Questa

considerevole proprietà delle fibre muscolari induce uno shift tra i diversi tipi di fibre, dovuto

ad uno switch delle isoforme proteiche che caratterizzano ogni miofibra (Röckl et al., 2007). I

muscoli scheletrici dei vertebrati contengono miofibre che differiscono per la capacità

contrattile, il contenuto mitocondriale e le proprietà metaboliche. Le miofibre a contrazione

lenta, dette anche Slow-twitch myofibers (SM) o fibre di tipo I sono fibre ossidative, di piccole

dimensioni, caratterizzate da un alto contenuto di lipidi e di mitocondri e sono tipiche della

resistenza alla fatica; vengono quindi preferenzialmente attivate durante azioni muscolari di

scarsa entità, ma di lunga durata. I muscoli contengono anche fibre a contrazione rapida, note

come White fast-twitch fibers (FWM) o fibre di tipo IIb. Queste ultime sono fibre glicolitiche più

grandi delle SM, con un alto contenuto di glicogeno e pochi mitocondri; sono attivate quando vi

è necessità di generare una forza rapida e intensa. Oltre alle fibre SM e FWM, vi sono anche

miofibre a contrazione rapida, chiamate Red fast-twitch myofibers (FRM) o di tipo IIa, queste

sono fibre intermedie ossidative-glicolitiche, simili alle SM per il colore e alle FWM per le

22

proprietà contrattili, in quanto possiedono funzionalità metaboliche sia aerobiche che

anaerobiche (Berchtold et al., 2000; Lin et al., 2002).

Le ripetute contrazioni muscolari che si verificano durante l’attività fisica, inducono diverse

risposte fenotipiche e fisiologiche, tra cui l’attivazione della biogenesi mitocondriale, con un

aumento della dimensione e del numero dei mitocondri, la transizione fast-to-slow delle fibre

muscolari e l’aumento delle capacità ossidative del muscolo, quindi aumento della resistenza

del muscolo alla fatica (Rasbach et al., 2011). L’esercizio fisico è accompagnato da un aumento

dell’attività motoria nervosa, con conseguente incremento, nel muscolo, dei livelli intracellulari

del Ca2+ (Olson et al., 2000; Hood et al., 2001). Il Ca2+ e la calmodulina (proteina legante Ca2+)

attivano sia la CaMKIV, sia la protein phosphatase calcineurin A (CnA), così come molti altri

fattori (Berchtold et al., 2000). Una volta attivata, la CaMKIV fosforila un complesso proteico

inibitorio con conseguente rilascio di un fattore di trascrizione, il myocyte enhancer factor 2

(MEF2). A questo punto i fattori MEF2s vengono esportati dal nucleo, e diventano

trascrizionalmente attivi, andando a legare co-attivatori tra cui CBP, p300 e Pgc-1α (Michael et

al., 2001; Wu et al., 2001). La formazione del complesso PGC-1α/MEF2 attiva l’espressione dei

geni per le fibre muscolari lente (Handschin et al., 2003), dando inizio allo shift delle miofibre da

rapide a lente. È stato osservato che l’over-espressione di PGC-1α aumenta la proporzione di

fibre ossidative di tipo I (Lin et al., 2002), mentre topi knock-out per PGC-1α mostrano un

cambiamento da fibre ossidative verso fibre glicolitiche (Handschin et al., 2007). La proteina

Pgc-1α sembra dunque essere implicata sia nella regolazione del cambiamento, indotto da

esercizio fisico, delle fibre muscolari verso un fenotipo lento, sia nella protezione dall’atrofia

muscolare (Holloszy, 2008; Olesen et al., 2010; Kang et al., 2013).

Stimoli quali l’attività fisica, che aumenta la produzione delle ROS, il freddo e/o la presenza di

glucagone inducono un incremento dell’espressione di PGC-1α (figura 6) (St-Pierre et al., 2006).

L’attività fisica è una delle vie più efficaci per prevenire la perdita della massa muscolare in

condizioni patologiche, come il cancro, la sepsi, i difetti renali e le malattie neurodegenerative,

patologie nelle quali si assiste a una forte riduzione dell’espressione di PGC-1α nel muscolo

scheletrico; questa osservazione suggerisce che PGC-1α potrebbe proteggere dall’atrofia

muscolare. La denervazione effettuata su arti posteriori di topo per mimare l’atrofia osservata

nelle malattie neuromuscolari umane come la SLA, induce l’espressione di PGC-1α, che a sua

volta blocca la risposta atrofizzante, invertendo quindi l’effetto dannoso della denervazione

(Arany, 2008).

23

Figura 6: presentazione schematica del ciclo di regolazione delle ROS, mediato attraverso l’induzione di PGC-1α.

L’esercizio fisico nel muscolo può aumentare l’espressione di PGC-1α, portando a un incremento della biogenesi e

della respirazione mitocondriale. Contemporaneamente, PGC-1α avvia un programma anti-ROS, che mantiene

bassi i livelli intracellulari delle specie reattive. Le ROS stesse possono indurre l’espressione di PGC-1α (da St-Pierre

et al., 2006).

Nel muscolo scheletrico di umani e roditori, l’attività fisica induce l’espressione di PGC-1α e di

conseguenza, un incremento della biogenesi mitocondriale, mentre non sembra influire

sull’espressione di PGC-1β. Queste osservazioni fanno supporre che PGC-1α sia in grado di

mediare molti degli effetti genomici dell’esercizio (Arany, 2008).

Studi condotti nel tessuto muscolare scheletrico di topi PGC-1α -/- riportano una ridotta

capacità nella prestazione fisica basale (Arany, 2008), in seguito ad un’attività motoria di lieve

entità. Negli uomini, un singolo scatto di esercizio di 2 minuti, effettuato alla massima potenza,

corrisponde ad un aumento dell’espressione di mRNA di PGC-1α, con un picco massimo intorno

alle 2 ore, dopo l’esercizio. Inoltre, è stato osservato che, provocando una condizione di ipossia

mediante una restrizione di flusso sanguigno all’arto inferiore durante l’esercizio, si ha una

prolungata sovraespressione di PGC-1α, suggerendo che le perturbazioni metaboliche possono

influenzare la sua espressione (Lucia et al., 2005).

Evidenze che esercizi su cyclette, caratterizzati da brevi “bursts”, portano ad un rapido aumento

dell’attività degli enzimi mitocondriali (Gibala et al., 2006), fanno ipotizzare che un intenso e

rapido esercizio sia in grado di attivare pathways coinvolti nel rimodellamento del muscolo

scheletrico. Un altro studio è stato condotto da Gibala e collaboratori (2009), su tessuto

muscolare di alcuni soggetti volontari, sottoposti a biopsia prima e dopo esercizio fisico su

24

cyclette. I risultati dello studio mostrano che quattro ripetizioni massimali di “pedalata”, di 30

secondi ciascuna, stimolano l’attivazione di PGC-1α, AMPK e p38 MAPK mediata e la

regolazione della biogenesi mitocondriale nel muscolo scheletrico; è stato osservato che circa

due minuti di esercizio molto intenso sono sufficienti per aumentare i livelli di mRNA di PGC-1α,

misurati durante la fase di recupero, anche se la quantità di proteina Pgc-1α, nel muscolo,

rimane invariata. Ciò fa supporre agli autori che, per ottenere un maggior contenuto proteico di

Pgc-1α nel muscolo scheletrico, sia necessario un esercizio di lunga durata (Gibala et al., 2009).

Altri studi sulla regolazione di PGC-1α si basano su esercizi molto prolungati nel tempo

(Pilegaard et al., 2003; Watt et al., 2004) e suggeriscono che occorre un’attività contrattile

sostenuta per più di un’ora per osservare aumenti dei livelli dell’mRNA di PGC-1α (Russell et al.,

2005).

La performance fisica è strettamente legata alla sintesi di acido lattico (Cairns, 2006); ad

esempio, mentre un esercizio fisico intenso induce produzione di lattato nel muscolo

scheletrico e un costante aumento dei livelli di lattato nel sangue, un allenamento regolare

contrasta questi effetti (Hagberg, 1988). Studi condotti sul muscolo scheletrico di topi,

mostrano che, durante fasi di post-esercizio, elevati livelli di Pgc-1α sono associati a una

riduzione dei livelli di lattato nel sangue (Wende, 2007). Tuttavia, non è stato ancora chiarito il

meccanismo molecolare alla base della presunta riduzione di lattato PGC-1α-mediata. Studi

condotti da Summermatter e collaboratori (2013) mostrano che PGC-1α è necessario per

aumentare la trascrizione di alcune subunità dell’isoenzima lattato deidrogenasi (LDH) e

mantenere quindi l’omeostasi del lattato durante l’esecuzione degli esercizi.

Nelle popolazioni umane, il gene PGC-1α esiste in diverse varianti che differiscono dall’allele

principale per un singolo nucleotide (Steinbacher et al., 2015 b). Poiché, nel muscolo

scheletrico, la capacità fisica dipende fortemente dall’attività mitocondriale, polimorfismi

funzionali nel gene PGC-1α potrebbero avere effetti negativi sulla capacità fisica (Nishida et al.,

2015). È il caso della sostituzione nucleotidica G>A che, se presente in posizione 1444

nell’esone 8 del gene PGC-1α (rs8192678), determina un cambiamento da Glicina (Gly) a Serina

(Ser) in posizione 482 della sequenza aminoacidica (Gly482Ser) e un conseguente cambiamento

strutturale della proteina. Ciò sembra indurre livelli di proteina più bassi e quindi una ridotta

attività di PGC-1α, nonché una minore ossidazione degli acidi grassi (Prior et al., 2012). È stato

osservato che la variante allelica A è presente nel 27% della popolazione mondiale e nel 36%

della popolazione europea.

25

Soggetti portatori della variante allelica rara A mostrano una maggiore probabilità di incorrere

in elevati livelli di colesterolo a bassa densità (Zhang et al., 2007), alta insulino-resistenza e un

maggior rischio per la sindrome metabolica e diabete di tipo 2 (T2D) (Hara et al., 2002). Inoltre,

in risposta all’esercizio fisico, questi individui, rispetto ai soggetti non portatori dello SNP,

mostrano un minore incremento della soglia anaerobica individuale e una ridotta fitness

cardiorespiratoria (Lucia et al., 2005; Stefan et al., 2007). A conferma di ciò, uno studio

condotto da Steinbacher e collaboratori (2015 b) dimostra che maschi di mezza età, portatori

dello SNP Gly482Ser, hanno una ridotta capacità fisica. Studi condotti su atleti, che mostrano

un’elevata resistenza, e individui che non praticano attività fisica rilevano che lo SNP Gly482Ser

è meno frequente (0.29%) nei primi, rispetto ai secondi (0.40%) (Lucia et al., 2005).

Considerando le funzioni metaboliche del gene e il modo in cui l’esercizio modula la sua

espressione è plausibile che la variazione Gly482Ser modifichi l’effetto protettivo di PGC-1α

durante esecuzione di attività fisica. È stato osservato che individui portatori dell’allele Ser482

mostrano livelli più bassi di PGC-1α rispetto ai non portatori (Lucia et al., 2005) e che gli

individui con genotipo Ser482Ser hanno una maggiore riduzione della performance fisica. La

presenza della variante allelica rara A comporta un metabolismo glucidico più lento, con

compromissione della capacità fisica (Ginevičienė et al., 2010). Studi in letteratura condotti da

Nishida e collaboratori (2015) hanno mostrato che l’allele Gly482 è associato a una maggiore

resistenza fisica; inoltre è stato osservato che lo SNP Gly482Ser sembra avere un impatto anche

sui livelli del lattato (LT). Tuttavia, il meccanismo d’azione alla base di questi fenomeni rimane

ancora sconosciuto, anche se Choi e colleghi (2006) ipotizzano che la variante allelica rara A del

gene PGC-1α alteri la trascrizione del Mitochondrial transcription factor A (Tfam), implicato

nella replicazione di mtDNA.

Un lavoro condotto da Zhang e collaboratori (2007) mostra inoltre che lo SNP Gly482Ser cambia

la sequenza aminoacidica nel dominio per MEF2 sulla proteina Pgc-1α, causando l’inibizione

dello switch fast to slow.

26

1.3. Esercizio fisico e biomarcatori di stress ossidativo

L’esercizio fisico, sia aerobico che anaerobico, può incrementare la produzione dei radicali

liberi, provocando sempre, in misura variabile, un certo grado di stress ossidativo (Fisher-

Wellman et al., 2009).

L’attività anaerobica, cioè un’attività di potenza, durante la quale, in un breve lasso di tempo,

un soggetto è sottoposto ad uno sforzo intenso, o “massimale”, viene alimentata dal

metabolismo anaerobico e dunque dall’assenza di O2, con conseguente accumulo di LT che

causa un peggioramento della performance, senso di fatica, dolore muscolare e interruzione

dello sforzo (Gomes et al., 2012).

Con attività aerobica si intende, invece, un’attività a bassa intensità e di lunga durata; se ben

condotta, sia a livello amatoriale sia agonistico, essa può avere molti effetti benefici

sull’organismo, come migliore funzionalità cardiocircolatoria, respiratoria e metabolica. Infatti,

diminuisce gradualmente la frequenza cardiaca e aumenta la capacità respiratoria (maggiore

ossigenazione dei tessuti); ciò significa anche maggiore resistenza e minor senso di fatica

(Gomes et al., 2012). Nell’esercizio aerobico, l’aumento delle ROS e il danno che ne consegue

sono dovuti ad un incremento del flusso nel trasporto degli elettroni e alla dispersione dei

radicali superossidi, a livello mitocondriale, mentre nell’esercizio anaerobico sono mediati da

diversi pathways, come la produzione di xantina e NADPH ossidasi, il meccanismo di ischemia-

riperfusione, il metabolismo dei prostanoidi, la respirazione fagocitaria, la distruzione delle

proteine contenenti ferro e l’accumulo di calcio (Jackson, 2000). Per esempio, è stato visto che,

l’esercizio fisico, soprattutto se intenso, come uno sforzo massimale condotto su

cicloergometro, induce un aumento indiscriminato dei livelli di idroperossidi sierici,

indipendentemente dall’allenamento, con superamento del livello soglia di 350 U CARR.

Tuttavia, un’ora dopo tale sforzo, mentre i soggetti regolarmente allenati tornano rapidamente

a valori normali o al di sotto di 300 U CARR, soggetti non allenati mantengono, più

persistentemente nel tempo, elevati livelli sierici di idroperossidi (>350 U CARR) (Iorio, 2003).

Il monitoraggio di alcuni biomarcatori di stress ossidativo durante un test da sforzo, può essere

utile per una migliore comprensione dei meccanismi alla base della risposta cellulare all’insulto

ossidativo ipossia mediato e allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche finalizzate al

mantenimento del benessere dell’apparato muscolo scheletrico.

I biomarcatori sono prodotti o sostanze usate come indicatori di uno stato biologico, per

misurare oggettivamente nell’organismo processi fisiologici o patogeni, che si verificano in

27

condizione di salute, durante il decorso di una patologia oppure in risposta a trattamenti, per

esempio farmacologici o in seguito ad uno sforzo fisico (Finsterer, 2012). La maggior parte degli

studi che, nell’uomo, misurano i biomarcatori dello stress ossidativo, sono effettuati sul plasma

o sul siero, in quanto può essere raccolto facilmente e riflette lo stato ossido-riduttivo meglio di

altri fluidi biologici (Mrakic-Sposta et al., 2015).

Le ROS possono, proprio per la loro capacità ossidante, attaccare e, quindi, danneggiare

molecole endogene, quali lipidi, glicidi, acidi nucleici e proteine, con conseguenti lesioni

dapprima circoscritte e poi sempre più diffuse (Valko et al., 2007). Una valutazione indiretta

dello stress ossidativo può essere eseguita tramite la misurazione dei prodotti molecolari,

formatisi dalla reazione delle ROS con le biomolecole; per esempio possono essere dosati i

prodotti bersaglio dell’ossidazione, inclusi prodotti finali della perossidazione lipidica, come il 4-

idrossi-2-nonenale (HNE), la malondialdeide (MDA), le Specie Reattive all’Acido Tiobarbiturico

(TBARS), gli isoprostani che includono gli F2-isoprostani (F2-isoPs) e gli F4-neuroprostani (Wang

et al., 2014). Anche la forte produzione di acido lattico, tipica delle attività anaerobiche, è nota

da tempo essere fonte di stress ossidativo; la concentrazione di lattato è, infatti, positivamente

correlata alla presenza di markers di perossidazione lipidica come TBARS (Lovlin et al., 1987;

Kayatekin et al., 2002). Oltre a questa evidenza è ora dimostrato che alte concentrazioni di

lattato sono direttamente responsabili della formazione di radicali idrossili attraverso la

reazione di Fenton (Ali et al., 2000).

L’azione dannosa delle ROS può esplicarsi anche a livello del DNA, sia nucleare che

mitocondriale, tale da indurre la rottura del doppio filamento dell’elica e modificazioni delle

basi azotate. La base azotata maggiormente modificata è la Guanina, soggetta ad ossidazione

da parte dei radicali liberi ossidrili; per tale motivo, uno dei biomarcatori più studiato per

valutare, in vivo, un incremento del danno al DNA è rappresentato da 8-Oxo-deoxyguanosine

(8-oxo-dG) (Lee et al., 2007).

Entrambi i tipi di esercizio hanno simili conseguenze sul danno ossidativo, ma sembra che

l’esercizio anaerobico induca un aumento lievemente più critico dei biomarcatori 8-oxo-dG e

HNE (Shi et al., 2007). Studi condotti da Radak e collaboratori mostrano che l’attività fisica

condotta in modo regolare, porta ad una riduzione dei livelli delle carbonil proteine, principali

marcatori di danno ossidativo alle proteine, e ad un aumento dell’attività dell’enzima 8-oxo-

dGuanine glycosylase (OGG1), implicato nel meccanismo di riparazione del DNA che si attiva in

seguito alla formazione di 8-oxo-dG (Radak et al., 2008). Le carbonil proteine sono dovute a

28

modificazioni ossidative di alcuni aminoacidi e la 3-nitrotirosina, un prodotto di nitrazione della

tirosina mediata attraverso le specie reattive azotate (Wang et al., 2014). Un marker di danno

ossidativo che permette di valutare la quantità di proteine modificate da processi di

ossidazione, a livello di specifici residui amminoacidici, è rappresentato dai prodotti di

ossidazione avanzata alle proteine (AOPP) (Witko-Sarsat et al., 1996). Gli AOPP possono

formarsi in seguito ad esposizione con l’acido ipocloroso (HOCl) (Witko-Sarsat et al., 1996), un

potente ossidante che, in condizioni fisiologiche, viene prodotto mediante una reazione tra lo

ione cloruro (Cl-) e il H2O2; tale reazione è catalizzata dall’enzima mieloperossidasi (MPO),

secreto dai neutrofili (Fu et al., 2000). La MPO è responsabile della produzione degli AOPP sia

tramite l’attività del 2HOCl, sia tramite l’attività diretta dell’enzima stresso (Fialovà et al., 2006;

Noyan et al., 2006). L’azione dell’HOCl sulle proteine plasmatiche è responsabile della

produzione di proteine clorinate e cloramine (Witko-Sarsat et al., 1998). Alcuni di questi

intermedi hanno un’emivita molto breve e vengono facilmente idrolizzati a formare aldeidi,

ammoniaca ed anidride carbonica (CO2) con conseguente rapido incremento dei carbonili totali

(Hawkins and Davies, 1998). La MPO, invece, agendo direttamente sui residui di tirosina,

contribuisce alla formazione dei dimeri di tirosina, tipici delle proteine ossidate, con

conseguente aumento dell’aggregazione proteica (Fu et al., 2000). È stato dimostrato che, in

vivo, i livelli plasmatici degli AOPP sono strettamente correlati con i livelli dei dimeri di tirosina e

con i livelli di pentossidina, un marker dei prodotti finali di glicazione delle proteine (AGEs)

(Capeillère-Blandin et al., 2004). Inoltre, la MPO è in grado di convertire la L-serina in

glicolaldeide, che media la formazione dei prodotti degli AGE. In pazienti affetti da patologie

croniche si è osservato un innalzamento degli AGEs che correla con un aumento degli AOPP

(Witko-Sarsat et al., 1998). La struttura degli AOPP sembrerebbe essere affine a quella degli

AGEs ed entrambi questi prodotti eserciterebbero delle attività biologiche simili, come per

esempio l’induzione delle citochine proinfiammatorie (Kalousová et al., 2002). I valori degli

AOPP sono anche associati con i livelli della Gamma Glutamil Transferasi (GGT), un enzima noto

per catalizzare la formazione dei radicali liberi e, quindi, per indurre un incremento del danno

ossidativo, determinando il rilascio di un catabolita, il dipeptide cistenilglicina, estremamente

efficiente nel ridurre i cationi metallici, tra cui il Ferro (Franzini et al., 2010).

La glicolisi è una via metabolica cruciale, che contribuisce alla regolazione dei livelli di ATP nel

muscolo. Il prodotto finale della glicolisi è il piruvato, un metabolita che, a seconda della

richiesta energetica e delle condizioni cellulari, può essere ridotto a lattato o ossidato a CO2 e

29

H2O (Cabrera et al., 1999). Il muscolo scheletrico, durante la contrazione, risulta essere il

principale produttore di LT, i cui livelli risultano essere associati alla fatica e ad una mancata

ossigenazione (Van Hall, 2009). Alterazioni della catena respiratoria mitocondriale sembrano

indurre una “rottura” nel metabolismo del glucosio, che a sua volta induce un aumento dei

livelli di lattato. Infatti, pazienti con disfunzioni mitocondriali mostrano una concentrazione

maggiore di acido lattico, che sembrano essere dovuti a una sua maggiore produzione nel

muscolo scheletrico (Jeppesen et al., 2013). La valutazione cinetica del lattato, uno dei

principali markers delle funzioni mitocondriali in vivo, durante la contrazione muscolare,

potrebbe essere dunque utile per investigare indirettamente eventuali danni del metabolismo

ossidativo nel muscolo scheletrico durante l’esecuzione di un esercizio fisico (Siciliano et al.,

2001).

A livello tissutale e, in particolare, ematico, la difesa nei confronti dell’attacco lesivo delle

specie ossidanti e dei radicali liberi, è garantita dalla cosiddetta barriera antiossidante. Gli

antiossidanti sono distinti in antiossidanti non enzimatici e antiossidanti enzimatici. Gli

antiossidanti non enzimatici includono sostanze a basso peso molecolare ed agiscono come

“scavengers” (spazzini), e possono essere di derivazione endogena o esogena (assunti con la

dieta). Includono diversi fattori tra cui l’acido urico, il glutatione, l'acido lipoico, la bilirubina,

l’acido ascorbico, il beta-carotene, il tocoferolo. Di questi, il glutatione sembra essere il più

importante, in quanto riduce i processi di perossidazione lipidica bloccando direttamente

l'attività delle ROS. Inoltre, il glutatione è importante per mantenere la vitamine E e la vitamina

C in forma ridotta, conferendo loro proprietà antiossidanti (Padurariu et al., 2013). Il glutatione

ridotto (GSH) è il più importante antiossidante tiolico presente a livello intracellulare (Valko et

al., 2006).

Un test per la valutazione dello stato ossidante nel siero/plasma misura la capacità o potenziale

antiossidante plasmatico in funzione della capacità del campione ematico di ridurre un metallo

di transizione, generalmente il ferro o il rame. Tra questi, il saggio FRAP (Ferric Reducing

Antioxidant Power), sviluppato da Benzie e Strain (1996), si basa sulla capacità del plasma di

ridurre il complesso Fe(III)-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) a complesso Fe(II)-TPTZ, colorato in

blu (assorbanza massima a 595 nm). La reazione consente di misurare la capacità antiossidante

di agenti riducenti con potenziali redox inferiori a 0.7 Volt e, quindi, in ordine decrescente:

l’acido urico (60%), l’acido ascorbico (15%), le proteine (10%), l’α−tocoferolo (5%), la bilirubina

(5%) ed altre sostanze/attività non identificate (5%) (Benzie et al., 1996). Tra questi, l’acido

30

urico svolge un ruolo chiave nel meccanismo di difesa antiossidante in quanto reagisce con i

radicali liberi formando il radicale urato, un composto relativamente stabile, interrompendo

così la propagazione delle reazioni radicaliche. Infatti, a concentrazioni fisiologiche, l’urato

riduce la metaemoglobina formata dalla reazione del perossido con l’emoglobina, protegge gli

eritrociti dalla perossidazione lipidica e dalla lisi cellulare (Rodonev, 2003).

Esistono, poi, altri test che consentono la quantificazione di intere classi di sostanze

accomunate dal possedere un comune gruppo funzionale come nel caso dei tioli. I tioli

rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante.

Infatti, i gruppi sulfidrilici (-SH) delle molecole plasmatiche, possono opporsi alla propagazione

dei processi perossidativi inattivando i radicali alcossilici (RO·) ed idrossilici (HO·). In pratica, una

coppia di gruppi tiolici può ossidare una coppia di RO· o HO·, cedendo ad essa due elettroni

(sotto forma di due atomi di idrogeno). In questo modo ambedue i tipi di radicali vengono

inattivati: i primi sono rilasciati come molecole di alcool mentre i secondi diventano innocue

molecole di acqua; i gruppi tiolici ormai ossidati, invece, reagiscono tra loro generando ponti

disolfuro (Hu, 1994). La determinazione dei tioli plasmatici è basata sulla capacità dei gruppi -SH

di sviluppare un complesso colorato rilevabile fotometricamente quando reagiscono con l’acido

5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB).

L’esercizio fisico sembra inoltre essere coinvolto nell’attivazione di enzimi antiossidanti, come

la Sod, la Cat, la GPx e le aldeidi deidrogenasi che, oltre a tamponare gli elevati livelli delle ROS,

riparano anche eventuali danni ossidativi (Radak et al., 2008). Questi enzimi catalizzano le

reazioni di riduzione dei radicali liberi diminuendo il loro potere ossidativo e quindi lo loro

tossicità (Padurariu et al., 2013). L’enzima Sod catalizza la conversione del ·O2- in H2O2, che è un

composto relativamente più stabile ed ha quindi un potere ossidante inferiore. L’attività della

SOD viene misurata cimentando la fonte enzimatica, con un sistema generatore di ·O2- ,

secondo la reazione catalizzata dalla xantina ossidasi:

xantina → acido urico + ∙O2-

·O2- così generato, dopo reazione con un sale di piodonitrotetrazolio, genera un complesso

formazanico colorato. Gli enzimi GPx e cat, invece, assieme a vari cofattori, trasformano il H2O2

in H2O. La Cat è una metalloproteina localizzata principalmente nei perossisomi delle cellule

eucariotiche ed ha la funzione di proteggere i tessuti dai perossidi. Le Cat hanno un’elevata

velocità di tourn-over, infatti, sono in grado di convertire ogni minuto approssimativamente 6

31

milioni di molecole di H2O2 in H2O e O2 (Valko et al., 2006). Anche l’attività della Cat ematica,

così come quella della SOD e della GPx può essere valutata mediante tecnica fotometrica.

32

2. Scopo

Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare se lo SNP 1444 G>A, nell’esone 8

del gene PGC-1α (rs8192678), costituisse un fattore di rischio per l’insorgenza della forma

sporadica di SLA e le sue possibili implicazioni nella risposta all’insulto ossidativo in condizioni di

riposo e durante un esercizio fisico.

Per indagare l’eventuale associazione del polimorfismo 1444 G>A (Gly482Ser) con lo sviluppo

della patologia sono stati genotipizzati, tramite Restriction fragment length polymorphism

(RFLP) e sequenziamento diretto del DNA, 197 pazienti con sSLA e 197 controlli sani. Per

valutare la condizione di stress ossidativo, in un sottogruppo di 74 pazienti e 65 controlli sono

stati analizzati i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo; in particolare, come

marker di danno ossidativo, sono stati valutati i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine

(AOPP), e come markers antiossidanti non enzimatici, sono stati dosati la Capacità

Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici. Nella popolazione totale

studiata, nel gruppo dei pazienti e nel gruppo dei controlli, sono state anche indagate eventuali

variazioni dei livelli dei biomarcatori analizzati in base al genotipo. Inoltre, come markers

antiossidanti enzimatici, sono stati valutati, in 35 pazienti con sSLA, suddivisi in portatori e non

portatori della variante allelica rara A (482Ser), l’attività totale dell’enzima Superossido

Dismutasi (Sod) e della Catalasi (Cat).

Dato che l’esercizio fisico sembra essere correlato ad un aumento della produzione dei radicali

liberi, e dunque allo stress ossidativo, in un sottogruppo di 28 pazienti con sSLA, sottoposti ad

un test da sforzo incrementale all’avambraccio, sono state valutate eventuali variazioni dei

livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli e acido lattico),

misurati prima (basale), durante (30%, 50% e 70% della Contrazione Volontaria Massimale,

CVM) e dopo 15 minuti dalla fine dello sforzo (recupero).

Infine, considerando che l’attività fisica induce l’espressione di PGC-1α e che la presenza della

variante allelica rara 482Ser comporta un metabolismo glucidico più lento e una ridotta

capacità fisica, a differenza dell’allele Gly482 che sembra associato ad una maggiore resistenza

fisica, è stato verificato un possibile effetto dello SNP Gly482Ser nella risposta cellulare allo

stress ossidativo. L’eventuale influenza della variante allelica rara A sui livelli dei biomarcatori di

stress ossidativo, valutati sia in condizioni di riposo che durante e dopo esercizio fisico, è stata

33

effettuata mediante suddivisione dei pazienti, in base al genotipo: omozigoti wild-type GG,

eterozigoti GA e omozigoti AA.

34

3. Pazienti e metodi

3.1. Pazienti

I pazienti ed i soggetti di controllo analizzati nella presente tesi sono stati reclutati presso il

Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, sezione Neurologia, dell’Università di Pisa.

La diagnosi di SLA è stata condotta seguendo i criteri elettrofisiologici di El Escorial dettati dalla

World Federation of Neurology (WFN) (Brooks, 1994). Sono stati esclusi dallo studio pazienti

con familiarità positiva per SLA, con tracheostomia o ventilazione assistita non invasiva, pazienti

con gravi disturbi psichiatrici (asse 1 o 2 del DSM IV), in stato di gravidanza o allattamento e con

età inferiore ai 18 anni.

Il campione dei controlli è composto da soggetti sani volontari che non hanno alcun legame di

parentela con i soggetti colpiti dalla malattia, di età maggiore ai 18 anni. Inoltre, è stata

analizzata la storia familiare di ogni individuo sano in modo da escludere la presenza di malattie

neurodegenerative non conclamate.

Ciascun soggetto analizzato, appartenente sia al gruppo dei pazienti sia dei controlli, ha

sottoscritto il consenso informato per la partecipazione allo studio prima dell’inizio del lavoro.

Lo studio è stato condotto in accordo con i principi della Dichiarazione di Helsinki e con

l’approvazione del Comitato Etico Locale, con sede presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia

dell’Università di Pisa.

Lo studio di associazione del polimorfismo Gly482Ser (1444 G>A), nell’esone 8 del gene PGC-1α,

è stato condotto mediante Restriction fragment length polymorphism (RFLP) e sequenziamento

diretto del DNA su un totale di 197 pazienti (82 F/115 M, età media ± deviazione standard (ds):

62.7 ± 11.7 anni) e 197 controlli sani (99 F/102 M, età media ± ds: 63.4 ± 9.7 anni).

La valutazione dello stato redox cellulare è stata effettuata in un sottogruppo di 74 pazienti con

sSLA (37 F/37 M, età media ± ds: 62.4 ± 10.8 anni) e 65 controlli sani (30 F/35 M, età media ±

ds: 74 ± 5.5 anni), tramite l’analisi dei livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress

ossidativo; in particolare sono stati valutati i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine

(AOPP), come marker di danno ossidativo e, come markers antiossidanti non enzimatici, la

Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici. Inoltre, in 35

pazienti (19 F/16 M, età media ± ds: 61.4 ± 11 anni) sono state valutate l’attività totale

35

dell’enzima Superossido Dismutasi (Sod) e della Catalasi (Cat), quali markers antiossidanti

enzimatici.

L’analisi della variazione nei livelli plasmatici dei marcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli

e acido lattico), durante esercizio fisico, è stata eseguita in 28 pazienti con sSLA (15 F/13 M, età

media ± ds: 62.9 ± 9.8 anni), sottoposti ad un test da sforzo incrementale ai muscoli

dell’avambraccio.

La valutazione dei livelli di acido lattico è stata condotta presso l’U.O. Laboratorio di Analisi

Chimico Cliniche dell’Ospedale Santa Chiara di Pisa.

3.2. Protocollo del test da sforzo ai muscoli dell’avambraccio

Il test da sforzo sui muscoli dell’avambraccio è stato condotto con l’ausilio di un miometro

connesso ad un “hand-grip” (Digital Multi-Myometer, MIE Medical Research Ltd., Leeds, UK). Il

protocollo di esercizio incrementale consiste nell’impugnare l’hand-grip del miometro e

contrarre massimamente la mano contro la resistenza offerta dallo stesso, determinando, in

Newton, il livello di Contrazione Volontaria Massimale (CVM). Sono state eseguite, da 28

pazienti con sSLA (15 F/13 M, età media ± ds: 62.9 ± 9.8 anni), una serie di fasi contrattili o

“steps”, condotte in maniera intermittente per un periodo di un minuto, con intervalli di riposo

di 2 minuti tra uno “step” e l’altro. In ciascuno “step” le contrazioni intermittenti sono eseguite

con frequenza di una al secondo contro la resistenza richiesta offerta dal miometro. L’esercizio

inizia con un primo “step” al 30% della CVM, prosegue con un secondo “step” al 50% della CVM

ed un ultimo “step” al 70% della CVM. Questo tipo di esercizio è principalmente aerobico

all’inizio del test e diviene progressivamente anaerobico man mano che aumenta la forza

esercitata per progressivo reclutamento delle unità motorie rapide (Wasserman et al., 1973). I

prelievi ematici venosi per la determinazione dei marcatori biochimici di stress ossidativo sono

stati eseguiti a livello basale, dopo le diverse fasi contrattili (30%, 50%, 70%) e dopo 15 minuti

dalla fine dell’esercizio.

36

3.3. Metodiche di laboratorio

3.3.1. Estrazione di DNA genomico da sangue intero

L’estrazione del DNA genomico, da linfociti di sangue periferico, raccolto in provette

contenente l’anticoagulante Potassio- Acido Etilendiamminotetraacetico (K+-EDTA), è stata

eseguita mediante l’uso di un kit commerciale (QIAamp DNA blood MINI kit, Qiagen). In una

provetta da 1.5 ml, a 200 μl di sangue intero vengono aggiunti 20 μl di proteinasi-K, per

degradare la componente proteica e 200 μl di Lysis Buffer (AL) per degradare. Il campione è

stato incubato a 56°C per 10 minuti, al termine dei quali sono stati aggiunti 200 μl di etanolo

assoluto (96-100%), per permettere la precipitazione del DNA. Dopo aver trasferito il tutto in

una Dneasy Mini spin column, inserita in una eppendorf, si procede ad una centrifugazione di 1

minuto a 8000 rpm a temperatura ambiente. Questo passaggio permette alle scorie di

precipitare nella eppendorf e al DNA di rimanere intrappolato nella membrana di silice della

colonna stessa. Dopo aver scartato il contenuto della eppendorf, sono stati effettuati una serie

di lavaggi con due diversi tamponi: Buffer AW1, usato per denaturare le proteine nel campione

e Buffer AW2, contenente etanolo, necessario per rimuovere i sali dalla colonna e purificare il

DNA. Dopo aver scartato il Buffer AW2, il DNA genomico intrappolato nella colonna è stato

eluito, in una nuova eppendorf, aggiungendo 200 µl di Elution Buffer (AE) e centrifugando la

colonnina ad 8000 rpm per un minuto in modo da ottenere il DNA.

3.3.2. Genotipizzazione dello SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α

La genotipizzazione è stata condotta usando la tecnica della Reazione a Catena della Polimerasi

(PCR), seguita da digestione con enzima di restrizione, tramite metodica Restriction fragment

length polymorphism (RFLP).

Reazione a Catena della Polimerasi. La PCR permette di amplificare, tramite l’uso di DNA

polimerasi termostabili, per esempio la Taq polimerasi, una sequenza di DNA, compresa fra

due brevi sequenze, per cui si costruiscono opportuni oligonucleotidi sintetici, detti

primers, complementari ai filamenti opposti del DNA stampo che deve essere amplificato.

La Taq polimerasi, in questa fase, determinerà a partire dai primers, la sintesi dei filamenti

di DNA complementari. Completato il primo ciclo di PCR si ottengono due molecole di DNA

37

a doppio filamento e ciascun ciclo successivo determinerà una miscela completamente

dominata da frammenti neosintetizzati.

Figura 7: fasi della Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) (da http://www.slideshare.net/MetheeSri/principle-of-

pcr).

La miscela di reazione di PCR utilizzata per amplificare il frammento di nostro interesse è

costituita da: 6 µl di acqua deionizzata; 3 µl di Buffer PCR [10x] con Mg2+; 3 µl di dNTPs [2mM];

0.8 µl di Fast Start Taq [2.5 U]; 5µl di DNA genomico e 5 µl di ciascun primer [1 µM]:

Primer Forward: 5’- TGCTACCTGAGAGAGACTTTG - 3’

Primer Reverse: 5’- CTTTCATCTTCGCTGTCATC - 3’

La regione del genoma nucleare di interesse (frammento di 260 paia di basi) è stata amplificata

tramite un termociclatore (Applyed Biosystem) mediante l’utilizzo del seguente programma di

amplificazione:

un ciclo di denaturazione a 94°C per 6 minuti;

30 cicli di amplificazione, ciascuno dei quali costituito da:

38

fase di denaturazione a 94°C per 30 secondi;

fase di annealing dei primers a 57°C per 30 secondi;

fase di estensione a 72°C per 30 secondi;

un ciclo di estensione finale a 72°C per 7 minuti;

4°C ∞

Per verificare che l’amplificazione della regione di interesse fosse avvenuta correttamente, il

prodotto di PCR è stato sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio al 2% in buffer TAE (Tris-

Acetato e EDTA [0.5 M], pH 8.0). La soluzione di agarosio è stata riscaldata fino all’ebollizione e

posta, sotto cappa chimica, dove è stato aggiunto l’Etidio Bromuro (pari ad 1/20 del volume

finale della nostra soluzione), molecola che, quando è sottoposta ai raggi UV, emette

fluorescenza permettendo di visualizzare lo stato di migrazione del DNA. La soluzione è stata

quindi versata nel gel-caster, precedentemente preparato con appositi pettinini e lasciata

solidificare sotto cappa. Una volta che il gel è solidificato, tolti i pettinini, sono stati caricati, nei

rispettivi pozzetti, 5 µl di ciascun campione diluito con 3 µl di PCR loading buffer (contiene

glicerolo che aumenta la densità del campione evitando la sua fuoriuscita dal pozzetto) e 5 µl di

un marcatore contenente frammenti di DNA di dimensioni note. Il gel viene quindi sottoposto a

corsa elettroforetica, ad un voltaggio costante di 150 Volt. Al termine della corsa, il risultato

viene visualizzato mediante l’utilizzo di un fotodocumentatore a raggi UV.

Digestione Enzimatica. Per rivelare piccole mutazioni all’interno di una sequenza genica,

amplificata tramite la PCR, si procede all’incubazione dell’amplificato con enzimi di restrizione,

che hanno la proprietà di tagliare il filamento di DNA, a livello di specifiche basi azotate.

Per analizzare il genotipo 1444 G>A dei pazienti SLA e dei controlli reclutati, è stato utilizzato

l’enzima di restrizione MspI (HpaII). Per ciascun campione è stata allestita una miscela di

reazione costituita da 10 µl di amplificato, 2 µl di Buffer Tango, 2 µl di acqua Dnasi/RNasi free e

1 µl di enzima (10 U/ml). I campioni sono stati incubati a 37°C per tre ore e quindi sottoposti a

corsa elettroforetica su gel in agarosio al 3.2% in TAE 1X (figura 8).

L’enzima di restrizione MspI riconosce il sito 5’- C^CGG-3’ e, alla temperatura di 37°C, taglia la

sequenza wild-type che presenta una G in posizione 1444; se in posizione 1444 è presente una

A l’enzima non effettuerà alcun taglio:

39

wild-type 1444 G>A

5’-C↓CGG-3’ 5’-CCAG-3’

3’-GGC↑C-5’ 3’GGTC-5’.

L’incubazione del frammento di 260 bp con l’enzima MspI consente quindi di identificare il

genotipo dei soggetti analizzati in base alla diversa lunghezza dei frammenti che si sono

formati:

o genotipo wild-type GG: 149 bp + 111bp;

o genotipo eterozigote GA: 260 bp + 149 bp + 111 bp;

o genotipo mutato AA: 260 bp.

Figura 8: elettroforesi su gel di agarosio al 3.2%.

3.3.3. Purificazione del prodotto di PCR e analisi di sequenza

Per confermare i risultati ottenuti con la tecnica RFLP, 14 pazienti e 5 controlli sono stati

sottoposti a sequenziamento diretto del DNA mediante l’utilizzo di un sequenziatore

automatico ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Life Technologies). Dopo aver verificato l’avvenuta

amplificazione (elettroforesi su gel di agarosio al 2%), 5 µl del prodotto di PCR sono stati

purificati mediante l’aggiunta di 2 µl ExoSAP (Ge Healthcare) per degradare tutti i componenti

della mix in eccesso. Tale reazione è costituita da due fasi: un primo step di degradazione (30

50 AA GG GG GA AA

bp

40

minuti a 37°C), seguito da un secondo step in cui si ha il blocco della reazione (15 minuti a

80°C).

Segue una reazione di marcatura dell’amplicone. La reazione avviene aggiungendo a 1.5 µl di

campione precedentemente purificato, 1.9 µl di acqua RNAsi-DNAsi Free, 4 µl di Buffer 10X con

EDTA, 1.6 µl di primer (forward o reverse) [1 µM] e 1 µl di BigDye Terminator (Life Technologies)

che contiene i quattro di-deossinucleotidi terminatori (ddNTPs) coniugati con un fluorocromo

diverso per ciascuna base azotata.

L’amplificazione è stata eseguita sul termociclatore secondo il seguente protocollo:

un ciclo di denaturazione a 96 °C per 1 minuto;

25 cicli di amplificazione, ciascuno dei quali costituito da:

o fase di denaturazione a 96 °C per 10 secondi;

o fase di annealing del primer a 50 °C per 5 secondi;

o fase di estensione a 60 °C per 4 minuti;

4 °C ∞.

Il prodotto della reazione di sequenza, è stato purificato mediante filtrazione con l’utilizzo di

colonnine preidratate (Qiagen); in uno step iniziale, le colonnine vengono centrifugate a 3000

rpm per 3 minuti al fine di disidratare la resina contenuta all’interno; è stato quindi aggiunto il

prodotto di PCR di sequenza, sulla superficie della resina (facendo attenzione a non toccare la

resina con il puntale) ed è stata effettuata una seconda centrifugazione a 3000 rpm per 3

minuti; all’eluato ottenuto è stato aggiunto un uguale volume di Formamide (Life

Technologies). I campioni sono stati quindi incubati a 94 °C per 2 minuti, per ottenere la

separazione dei due filamenti di DNA e quindi sono stati caricati nel sequenziatore automatico

per la corsa. La sequenza ottenuta per ciascun campione è stata confrontata con la sequenza di

riferimento, presente in banche dati, mediante software open source BLAST. Di seguito sono

riportati alcuni esempi degli elettroferogrammi ottenuti: in figura 9 è mostrata una sequenza

omozigote wild-type (GG), in figura 10 è rappresentata una sequenza con mutazione in

eterozigosi (GA), nella figura 11 è riportato l’elettroferogramma di una sequenza con mutazione

in omozigosi (AA).

41

Figura 9: elettroferogramma della regione di interesse nell’esone 8 del gene PGC-1α. Assenza di SNPs.

Figura 10: elettroferogramma della regione di interesse nell’esone 8 del gene PGC-1α. SNPs in eterozigosi.

Figura 11: elettroferogramma della regione di interesse nell’esone 8 del gene PGC-1α. Presenza della mutazione in

omozigosi G>A in posizione 1444.

42

3.3.4. Dosaggi biochimici per l’analisi di marcatori periferici di danno ossidativo

Il sangue prelevato è stato raccolto rispettivamente in una provetta K+- EDTA per il dosaggio

degli AOPP e dei tioli, e in una provetta con l’anticoagulante litio-eparina per il dosaggio della

FRAP, dell’attività della SOD totale e della Cat. I campioni sono stati prontamente centrifugati

per 10 minuti a 1000 x g ad una temperatura di 4°C; il plasma così ottenuto è stato congelato e

conservato a - 80°C fino al momento del dosaggio, effettuato al massimo entro un mese dalla

raccolta del campione.

a) Determinazione dei prodotti di ossidazione avanzata delle proteine (AOPP)

La determinazione degli AOPP è stata eseguita secondo il protocollo descritto da Witko-

Sarsat e collaboratori (1996).

1. Preparazione delle soluzioni

o Tampone fosfato di Dulbecco (PBS): sono stati sciolti 4.77g di PBS in 500 ml di acqua

deionizzata, grazie all’uso di un agitatore magnetico.

o Ioduro di potassio (KI) [1.16 M]: è stato preparato sciogliendo 1.925g di polvere in

10 ml di acqua deionizzata.

o Standard Cloramina T (100X) - [10 mM]: sono stati sciolti 2.27g di cloramina T per

litro di PBS al fine di ottenere una soluzione “stock”.

Per la valutazione delle concentrazioni di AOPP è stata allestita una curva di calibrazione

utilizzando diluizioni scalari a partire dalla soluzione Standard Cloramina T (100X), dalla

quale si è ottenuta una soluzione Cloramina T [1 mM] (10X: 100 µl di stock in 900 µl di PBS)

e Cloramina T [0.1 mM] (1X: 140 µl di soluzione 10X in 1200 µl di PBS). Dalla soluzione 0.1

mM, tramite diluizioni scalari, sono stati ottenuti gli standards a diverse concentrazioni:

0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625, 0.003125, 0.0015625 mM. Lo standard 0mM (“bianco”) era,

costituito da 700 µl di PBS.

2. Semina su piastra

Su una piastra da 96 pozzetti (Costar), sono stati dispensati, in doppio, nell’ordine 200 µl di

bianco, 200 µl di ciascuno standard, 30 µl di ciascun campione di plasma da analizzare diluiti

con 170 µl di PBS. Ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 20 µl di acido acetico glaciale

43

(CH3COOH) e 10 µl di KI. Dopo 1 minuto di incubazione a temperatura ambiente è stato

letto il valore di assorbanza dei campioni ad una lunghezza d’onda di 340 nm mediante

l’ausilio di un lettore di piastra (Tecan Spectra Classic).

La concentrazione di AOPP di ciascun campione di plasma analizzato è stata calcolata

utilizzando l’equazione della retta di regressione lineare ottenuta dalla curva standard; il

valore degli AOPP è stato espresso in nmol/ml di equivalenti di cloramina T.

Il valore di assorbanza del campione deve essere compreso tra il valore di assorbanza del

bianco e il valore di assorbanza dello standard 1:2; se cade al di fuori di tale intervallo, non

si considera accettabile.

b) Determinazione della capacità antiossidante ferro-riducente (FRAP) del plasma

Il dosaggio della FRAP è stato eseguito seguendo il protocollo descritto da Benzie e Strain

(1996).

1. Preparazione delle soluzioni

o Soluzione di CH3COOH [0.3 M]: sono stati diluiti 1.76 ml di CH3COOH glaciale in 100

ml di acqua deionizzata.

o Soluzione di acetato di sodio (CH3COONa) [0.3 M]: sono stati sciolti 0.817g di

CH3COONa in 20 ml di acqua deionizzata, mediante l’ausilio di un agitatore.

o Tampone sodio acetato ([0.3 M], pH 3.6): è stato preparato aggiungendo la

soluzione di CH3COONa [0.3 M] alla soluzione di CH3COOH [0.3 M] fino a raggiungere

un pH di 3.6.

o Acido cloridrico (HCl): sono state effettuate delle diluizioni scalari partendo da una

soluzione stock [12 M]:

HCl [1 M]: ad 1 ml di stock 12 M sono stati aggiunti 11 ml di acqua

deionizzata;

HCl [0.04 M]: ad 1 ml di HCl 1 M sono stati aggiunti 24 ml di acqua

deionizzata;

HCl [0.01 M]: a 5 ml di HCl 0.04 M sono stati aggiunti 15 ml di acqua

deionizzata.

o Standard di Solfato di ferro eptaidrato (FeSO4∙7H2O) [4 mM]: sono stati sciolti 11.1

mg di FeSO4∙7H2O in 10 ml di HCl 0.01 M per ottenete la soluzione “stock” [4 mM].

44

Per la valutazione della concentrazione della FRAP è stata disegnata una curva di

calibrazione allestita utilizzando diluizioni scalari ottenute a partire da FeSO4∙7H2O [4

mM]: 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mM. Lo standard 0mM (“bianco”) era, costituito

da 100 µl di HCl.

o Tripiridiltriazina (TPTZ) [10 mM]: è stata preparata sciogliendo 15.62 mg di polvere

di TPTZ in 5 ml di HCl [0.04 M].

o Cloruro ferrico (FeCl3) [20 mM]: 27 mg di FeCl3 sono stati sciolti in 5 ml di acqua

deionizzata.

o Reattivo FRAP: è stato preparato miscelando

10 volumi di tampone sodio acetato (pH 3.6);

1 volume di TPTZ;

1 volume di FeCl3.

Il reattivo così preparato è stato incubato a 37°C per 10 minuti.

2. Semina su piastra

La semina, in doppio, è stata effettuata utilizzando 8 μl di bianco, 8 μl di standard e 8 μl di

plasma dei campioni da analizzare, su una piastra da 96 pozzetti (Costar). A questi sono stati

aggiunti 250 μl di reattivo FRAP e dopo un’incubazione di 4 minuti sono stati letti i valori di

assorbanza ad una lunghezza d'onda di 620 nm, con un lettore di piastra (Tecan Spectra

Classic).

È stata allestita la curva di calibrazione utilizzando i valori di assorbanza delle diluizioni

scalari di FeSO4∙7H20. Dalla media dei valori di assorbanza di ciascun campione è stato

sottratto il valore medio di assorbanza del bianco; i valori della FRAP dei campioni analizzati

sono stati calcolati utilizzando l’equazione della retta di regressione lineare ottenuta dalla

curva standard. I dati sono stati espressi in mmol/l.

c) Determinazione dei gruppi tiolici plasmatici

Il dosaggio dei gruppi tiolici è stato effettuato seguendo il protocollo descritto da Hu (1994)

e successivamente modificato nel nostro laboratorio.

45

1.Preparazione delle soluzioni

o EDTA [50 M]: sono stati sciolti 37.22 g in 200 ml di acqua deionizzata.

o EDTA [20 mM]: sono stati diluiti 200 µl di EDTA 50 M con acqua deionizzata fino a

raggiungere un volume finale di 500 ml.

o TRIS [25 mM]: sono stati sciolti 1.5 g di Trizma Base in 500 ml di acqua.

o Tris Base [25 mM] – EDTA [20 mM] pH 8.2: la soluzione di EDTA 20 mM è stata

portata ad un pH di 8.2 mediante aggiunta di Tris 25 mM.

o 5-5-5'di-tio-bis(2nitrobenzoico) (DTNB) [10mM]: sono stati sciolti 0.008 g di DTNB in

2 ml di metanolo.

2. Preparazione dei campioni e semina su piastra

A 50 μl di plasma di ciascun campione sono stati aggiunti nell’ordine:

150 μl di TRIS [25 mM] – EDTA [20 mM];

800 μl di metanolo;

10 μl di DTNB.

I campioni sono stati vortexati ed incubati per 30 minuti a temperatura ambiente. Trascorso

questo intervallo di tempo, sono stati centrifugati a temperatura ambiente per 10 minuti a

5315 rpm; 250 μl di supernatante di ciascun campione sono stati seminati in doppio, su

piastra. L’assorbanza di ciascun campione e del bianco, costituito solo da DTNB, è stata

misurata ad una lunghezza d’onda di 412 nm, con un lettore di piastra (Tecan Spectra

Classic).

Ai valori medi di assorbanza dei campioni è stato sottratto il valore medio di assorbanza del

bianco; i dati sono stati espressi in µmol/l.

d) Determinazione dell’attività delle Superossido dismutasi (SOD)

La determinazione della superossido dismutasi (SOD) è stata effettuata mediante kit

commerciale (Cayman, Francia). Il kit prevede l’utilizzo di un sale tetrazolium per la

determinazione dei radicali superossidi generati dalla xantina ossidasi e dalla ipoxantina. Il

kit permette di valutare tutti e tre i tipi di SOD (Cu/Zn-, Mn- e Fe-SOD).

46

1. Preparazione delle soluzioni

o ASSAY BUFFER (10X): sono stati diluiti 3 ml di Assay Buffer concentrato con 27 ml di

acqua deionizzata; la soluzione diluita [50 mM Tris-HCl, pH 8.0] è costituita da acido

dietilenetriaminapentaacetico (DTPA) [0.1 mM] e ipoxantina [0.1 mM].

o SAMPLE BUFFER (10X): sono stati diluiti 2 ml di Sample Buffer concentrato con 18 ml

di acqua deionizzata; la soluzione finale diluita ha una concentrazione di Tris-HCl 50

mM, pH 8.0.

o RADICAL DETECTOR: 50 µl di soluzione sono stati diluiti con 19.95 ml di Assay Buffer

diluito.

o SOD STANDARD: 20 µl di standard (fornito dal Kit) sono stati diluiti con 1.98 ml di

Sample Buffer diluito; da questa soluzione “stock” sono stati ottenuti gli standards a

diverse concentrazioni: 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005 U/ml. Lo standard 0 U/ml

(“bianco”) era costituito da Sample Buffer diluito.

o XANTINA OSSIDASI: sono stati diluiti 50 µl di enzima in 1.95 ml di Sample buffer

diluito.

2. Preparazione dei campioni e semina su piastra

Prima di dosare l’attività della SOD, i campioni di plasma sono stati diluiti 1:5 con Sample

Buffer e vortexati. Su una piastra da 96 pozzetti, fornita dal kit, sono stati seminati in doppio

10 µl di ciascuno standard o 10 µl di plasma dei campioni da analizzare. In ciascun pozzetto

sono stati aggiunti nell’ordine 200 µl di radical detector diluito e 20 µl di xantina ossidasi. La

piastra è stata poi incubata, su un agitatore automatico, per 30 minuti, a temperatura

ambiente. L’assorbanza dei campioni è stata letta ad una lunghezza d’onda di 450 nm

usando un lettore di piastra (Tecan Spectra Classic).

Per valutare l’attività della SOD è stata allestita una curva di calibrazione utilizzando i valori

di assorbanza degli standards. È stato calcolato il rapporto tra l’assorbanza del bianco e il

valore di assorbanza di ciascun campione e standards. L’attività della SOD è stata calcolata

utilizzando l’equazione ottenuta dalla retta di regressione lineare; i dati sono stati espressi

in U/ml; un’unità è definita come il totale di enzima necessario per dismutare il 50% del

radicale superossido in O2 e H2O2.

47

e) Determinazione dell’attività della catalasi

La determinazione dell’attività della catalasi è stata effettuata mediante kit commerciale

(Cayman, Francia). Il metodo è basato sulla reazione dell’enzima con il metanolo in presenza

di una concentrazione ottimale di H2O2. Le aldeidi prodotte sono state determinate

colorimetricamente con l’aggiunta di 4-amino-3-idrazino-5-mercapto-1,2,4-triazolo

(Purpald) come cromogeno. Il Purpald forma un eterociclo con le aldeidi che, in seguito ai

processi di ossidazione, porta ad un cambiamento di colore dal giallo al porpora.

1. Preparazione delle soluzioni

o CATALASI ASSAY BUFFER (10X): sono stati diluiti 2 ml di Catalasi Assay Buffer

concentrato con 18 ml di acqua deionizzata; si ottiene così un buffer diluito (fosfato

di potassio [100 mM], pH 7.0).

o CATALASI SAMPLE BUFFER (10X): 5 ml di Catalasi Sample Buffer concentrato sono

stati diluiti con 45 ml di acqua deionizzata. Questo buffer diluito (fosfato di potassio

[25 mM], pH 7.5) contiene EDTA [1 mM] e BSA 0.1%.

o CONTROLLO POSITIVO DELLA CATALASI: il liofilizzato fornito dal kit è stato

ricostituito con 2 ml di Sample Buffer diluito e 100 µl dell’enzima ricostituito sono

stati ulteriormente diluiti con 1.9 ml di Sample Buffer diluito.

o IDROSSIDO DI POTASSIO (KOH): il pellet di KOH, posto in ghiaccio, è stato sciolto

con 4 ml di acqua deionizzata e vortexato per ottenere una soluzione 10 M.

o PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2): 40 µl della soluzione fornita dal kit [8.82 M] sono

stati diluiti con 9.96 ml di acqua deionizzata.

o CATALASI PURPALD (CROMOGENO): il reagente fornito, pronto per l’uso, contiene

acido idrocloridrico [0.5 M].

o PERIODATO DI POTASSIO: il reagente contiene potassio periodato in KOH [0.5 M].

o CATALASI FORMALDEIDE STANDARD: è costituito da formaldeide [4.25 M]; gli

standard a diverse concentrazioni (0.25, 0.2, 0.15, 0.10, 0.05, 0.025, 0 nmol/min/ml)

sono stati ottenuti partendo da una soluzione “stock” [4.25 mM] costituita da 10 µl

di Catalasi formaldeide diluita con 9.99 ml di Sample Buffer diluito.

48

2. Semina su piastra

Su una piastra da 96 pozzetti, fornita dal kit, sono stati seminati in doppio, 20 µl di tutti gli

standard, 20 µl di controllo positivo e 20 µl di plasma di ciascun campione da analizzare. In

ciascun pozzetto sono stati poi aggiunti 30 µl di metanolo e 100 µl di Assay Buffer diluito.

Sono stati poi aggiunti 20 µl di H2O2 diluito che dà il via alla reazione, la piastra è stata

coperta e messa ad incubare per 20 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.

Trascorso questo periodo di tempo sono sostati aggiunti, ad ogni pozzetto, 30 µl di KOH

diluito per far terminare la reazione e 30 µl di cromogeno. La piastra è stata nuovamente

coperta ed incubata per 10 minuti, a temperatura ambiente, su un agitatore. 10 µl di

potassio periodato sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e la piastra è stata incubata per altri

5 minuti prima di leggere i valori di assorbanza dei campioni ad una lunghezza d’onda di 550

nm. Il valore medio di assorbanza del bianco è stratto sottratto rispettivamente

all’assorbaza di standards e campioni di plasma. L’attività della catalasi dei campioni di

plasma analizzati è stata calcolata utilizzando l’equazione ottenuta dalla regressione lineare

della curva standard. I dati sono stati espressi in nmol/min/ml.

49

4. Analisi statistica

Per verificare che la distribuzione delle frequenze genotipiche e alleliche tra i gruppi oggetto di

studio (pazienti SLA e controlli) fossero in accordo con l’equilibrio di Hardy – Weinberg e per

esaminare la possibile associazione tra la variante allelica rara A per il polimorfismo 1444 G>A

PGC-1α e il rischio di sviluppare SLA è stato utilizzato il test del χ2, con calcolo dell’odds ratio e

dell’intervallo di confidenza al 95%.

Il confronto tra le medie dei livelli plasmatici di ciascun parametro biochimico esaminato, dei

pazienti vs controlli e quelle misurate prima (T0), durante (30%, 50%, 70%) e dopo il test da

sforzo ai muscoli dell’avambraccio è stato effettuato tramite il test “t di Student”. Questo test è

stato adoperato anche per confrontare le medie di ciascun marcatore biochimico di stress

ossidativo tra individui portatori della variante allelica rara A per lo SNP -1444 G>A nel gene

PGC-1 α ed individui omozigoti wild-type. I livelli di significatività p utilizzati in questo lavoro

sono 5%, 1% e 0.1%; il test è stato definito “statisticamente significativo” per p ≤ 5%.

50

5. Risultati

5.1. Analisi del polimorfismo 1444 G>A nel gene PGC-1α

I risultati ottenuti dall’analisi del polimorfismo 1444 G>A nell’esone 8 del gene PGC-1α sono

mostrati in tabella 1, in cui sono riportate le frequenze genotipiche e le frequenze alleliche sia

dei pazienti affetti da sSLA, sia dei soggetti di controllo. Le distribuzioni dei genotipi e delle

frequenze alleliche, relative al polimorfismo in esame, sono in accordo con l’equilibrio di Hardy

- Weinberg. Allo scopo di valutare se la presenza della variante allelica rara A possa influire sulla

probabilità di sviluppare SLA, le due popolazioni sono state suddivise in portatori (A Carriers) e

non portatori (omozigoti wilde-type) dell’allele raro A. Dall’analisi dei risultati, non si osserva

alcuna differenza significativa nella distribuzione degli individui A Carriers nel gruppo dei

pazienti rispetto a quello dei controlli.

Genotipo Pazienti sSLA

n (%) Controlli

n (%) X 2

Test

p value

OR I.C. 95%

GG 64 (32%) 77 (39%)

GA 98 (50%) 85 (43%) 2.12 0.15

AA 35 (18%) 35 (18%) 0.4 0.53

A Carriers 133 (68%) 120 (61%) 1.87 0.17 1.33 0.88; 2.02

Frequenza allele A 43% 39% 0.89 0.35

TOTALE 197 197

Tabella 1: frequenze genotipiche e alleliche del polimorfismo 1444 G>A nel gene PGC-1α in pazienti affetti da sSLA

e controlli sani; OR: Odds Ratio, I.C.: intervallo di confidenza.

51

5.2. Valutazione dei biomarcatori di stress ossidativo

Dall’analisi dei livelli plasmatici degli AOPP, si osserva che il valore medio di tale marcatore è più

elevato nei pazienti sSLA (397.91 ± 206.97 nmol/ml; p<0.001), rispetto ai controlli (207.35 ±

85.65 nmol/ml) (figura 12A). I valori medi dei livelli plasmatici della FRAP sono pari a 0.69 ± 0.26

mmol/l nei pazienti sSLA e a 0.80 ± 0.13 mmol/l nei controlli; tale differenza risulta essere

statisticamente significativa (p<0.001) (figura 12B). L’analisi statistica dei dati relativi ai gruppi

tiolici plasmatici evidenzia una differenza altamente significativa (p<0.001) tra i valori medi di

questo marcatore antiossidante nei pazienti sSLA rispetto ai controlli (0.21 ± 0.09 µmol/l vs 0.47

± 0.17 µmol/l) (figura 12C).

Figura 12: livelli plasmatici degli AOPP (A), della FRAP (B) e dei gruppi tiolici plasmatici (C), nei pazienti sSLA (PZ

SLA) e nei controlli (CTRL); *** p<0.001.

52

5.3. Relazione tra i biomarcatori di stress ossidativo e lo SNP 1444 G>A in PGC-

1α

Al fine di individuare una possibile relazione tra lo SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α ed eventuali

variazioni nei livelli plasmatici dei biomarcatori di stress ossidativo analizzati, i pazienti sSLA

sono stati suddivisi in omozigoti wild-type GG e portatori della variante allelica rara A (A

Carriers), includendo in questi ultimi sia i soggetti eterozigoti (GA) che gli omozigoti (AA). Non

emergono differenze statisticamente significative tra i livelli plasmatici osservati nei pazienti

omozigoti wild-type GG e quelli riscontrati nei pazienti A Carriers per nessuno dei marcatori di

stress ossidativo analizzati: AOPP (figura 13A), FRAP (figura 13B), tioli (figura 13C), attività

plasmatica della SOD totale (figura 13D) e della catalasi (figura 13E).

Figura 13: livelli plasmatici basali degli AOPP (A), della FRAP (B), dei gruppi tiolici (C), dell’attività della SOD (D) e

della catalasi (E) in pazienti sSLA omozigoti wild-type GG e A Carriers.

53

Analogamente ai risultati riscontrati nel gruppo dei pazienti, non si osservano variazioni

statisticamente significative dei livelli di AOPP, FRAP e tioli tra individui wild-type e soggetti A

Carriers, prendendo in considerazione i soli controlli o tutta la popolazione in studio (pazienti e

controlli) (dati non mostrati).

5.4. Effetti del test da sforzo sui biomarcatori di stress ossidativo

I livelli plasmatici medi degli AOPP valutati nei pazienti sSLA sottoposti a esercizio fisico, al

basale, al 30%, al 50%, al 70% della CMV e 15 minuti dopo l’esercizio (recupero), non subiscono

variazioni significative durante il test da sforzo (figura 14A). Analogamente agli AOPP, dal

confronto dei livelli plasmatici medi sia della FRAP (figura 14B) che dei gruppi tiolici (figura 14C),

non emergono variazioni statisticamente significative tra i valori riscontrati al basale, durante i

vari steps della CVM e dopo recupero.

Figura 14: andamento dei livelli plasmatici di AOPP (A), della FRAP (B), dei gruppi tiolici (C) dei pazienti sSLA

sottoposti a test da sforzo incrementale ai muscoli dell’avambraccio; CVM: Contrazione Volontaria Massimale.

Variazioni nei livelli plasmatici dell’acido lattico sono state osservate durante i vari steps della

CVM e dopo recupero (figura 15); in particolare, i pazienti sSLA mostrano un aumento dei livelli

al 30% (p<0.01), al 50% (p<0.01) e al 70% (p<0.001) della CVM rispetto ai livelli basali e al 70%

54

(p<0.05) rispetto al 30% della CVM. Inoltre, si osserva una riduzione significativa nei livelli di

acido lattico nella fase di recupero rispetto al 50% (p<0.05) e al 70% (p<0.001) della CVM.

Figura 15: variazione dei livelli plasmatici dell’acido lattico dei pazienti sSLA sottoposti a test da sforzo ai muscoli

dell’avambraccio: ** p<0.01 basale vs 30%, ** p<0.01 basale vs 50%, *** p<0.001 basale vs 70%; $ p<0.05 30% vs

70%; # p<0.05 50% vs recupero, ### p<0.001 70% vs recupero; CVM: Contrazione Volontaria Massimale.

5.5. Relazione tra la variazione nei livelli dei biomarcatori di stress ossidativo

durante il test da sforzo e lo SNP 1444 G>A in PGC-1α

Per valutare se la presenza della variante allelica A (SNP 1444 G>A) influisca sui livelli dei

biomarcatori di stress ossidativo, valutati durante il protocollo di esercizio fisico, il gruppo di

pazienti sSLA sottoposto a test da sforzo è stato suddiviso in individui omozigoti wild-type (GG),

in individui portatori della variante allelica A in condizione di eterozigosi (GA) e individui A

Carriers in condizione di omozigosi (AA). Non si osserva alcuna differenza nell’andamento dei

livelli plasmatici della FRAP (figura 16A) e dei tioli (figura 16B) nei tre gruppi di pazienti con

diverso genotipo.

55

Figura 16: valutazione dei livelli plasmatici della FRAP (A) e dei gruppi tiolici (B) tra pazienti sSLA con genotipo

omozigoti wild-type GG, eterozigote GA e omozigote AA durante il test da sforzo; CVM: Contrazione Volontaria

Massimale.

I livelli medi di AOPP misurati prima, durante e dopo l’esercizio muscolare, mostrano invece

variazioni circa sovrapponibili in eterozigoti GA e omozigoti GG; tuttavia, gli omozigoti per la

variante allelica rara (AA) presentano livelli plasmatici di AOPP più elevati per tutta la durata del

test rispetto sia agli eterozigoti GA, che agli omozigoti GG. Tale differenza risulta significativa al

50% della CVM (p<0.05, GG vs AA; p=0.05, GA vs AA) e in corrispondenza della fase di recupero

(p=0.01, GG vs AA; p<0.01, GA vs AA) (figura 17).

Figura 17: variazione dei livelli plasmatici degli AOPP tra pazienti sSLA omozigoti wild-type GG, eterozigoti GA e

omozigoti AA durante il test da sforzo. * p<0.05 GG vs AA; # p=0.05 GA vs AA; ** p=0.01 GG vs AA; ## p<0.01 GA vs

AA; CVM: Contrazione Volontaria Massimale.

56

Infine, livelli più elevati di acido lattico si osservano durante i vari steps del test da sforzo, nei

pazienti omozigoti AA, rispetto agli altri due gruppi. In particolare, gli individui omozigoti AA

mostrano incrementi significativi dei livelli di acido lattico al 30% (p<0.01) e al 50% (p<0.001)

della CVM, rispetto ai soggetti con genotipo wild-type GG (figura 18).

Figura 18: variazione dei livelli plasmatici dell’acido lattico tra pazienti sSLA omozigoti wild-type GG, eterozigoti GA

e omozigoti AA durante il test da sforzo. ** p<0.01 GG vs AA; *** p<0.001 GG vs AA; CVM: Contrazione Volontaria

Massimale.

57

6. Discussione

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia complessa multi-sistemica e

multifattoriale (Cozzolino et al., 2015): mutazioni in diversi geni sono state riscontrate nei casi

di fSLA mentre il processo di degenerazione dei motoneuroni nelle sSLA sembra essere il

risultato della combinazione di diversi pathways molecolari, quali l’eccitotossicità, lo stress

ossidativo, la disfunzione mitocondriale, l’aggregazione proteica, la disfunzione citoscheletrica e

i difetti nella maturazione dell’RNA (D’Amico et al., 2013). Tuttavia, non è ancora chiaro quali

tra queste condizioni siano le cause primarie della malattia e quali siano, invece, le

conseguenze (Matsumoto et al., 2007).

In particolare, lo stress ossidativo sembra essere in grado di esacerbare altri processi causativi

della malattia, come l’aggregazione proteica e l’alterato metabolismo del glutammato (Emerit

et al., 2004). Numerose evidenze di letteratura hanno riportato nella SLA un’alterazione

dell’equilibrio redox cellulare; elevati livelli dei biomarcatori di danno ossidativo a DNA, lipidi e

proteine (Bogdanov et al., 2000; Agar et al., 2003; Simpson et al., 2004; Barber et al., 2010) e un

decremento dell’efficacia dei meccanismi di difesa antiossidante, sono stati osservati in pazienti

con sSLA e fSLA rispetto ai soggetti di controllo (Beckman et al., 2004; Weiduschat et al., 2014;

Carrì et al., 2015).

Studi epidemiologici osservano inoltre che la SLA può insorgere in soggetti appartenenti a tutte

le categorie socio-professionali, ma con una maggiore prevalenza negli sportivi e nei soggetti

che esercitano un’intensa attività fisica (Felmus et al., 1976; Gregoire et al., 1991; Scarmeas et

al., 2002; Chiò et al., 2005). Queste osservazioni hanno fatto ipotizzare che l’attività agonistica

intensa sia un fattore eziologico e di rischio per la malattia. Altri dati clinici ed epidemiologici

suggeriscono invece che l’attività fisica aerobica moderata, condotta in modo regolare, possa

esercitare un’azione benefica, attenuando i sintomi della patologia (Strickland et al., 1996;

Veldink et al., 2005).

Il Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1 alpha (Pgc-1α), codificato

dal gene PPARGC1A/PGC-1α, è un co-attivatore trascrizionale tessuto-specifico (Arany, 2008),

che regola positivamente la respirazione e la biogenesi mitocondriale, la termogenesi

adattativa, la gluconeogenesi e altri importanti processi metabolici (Handschin et al., 2007).

58

Una funzione centrale di Pgc-1α, intimamente collegata alla biogenesi mitocondriale, è la

detossificazione dalle ROS. Infatti, le ROS sono prodotte durante la respirazione mitocondriale e

Pgc-1α sembra giocare un ruolo chiave nella loro rimozione, tramite la regolazione

dell’espressione di numerosi geni per enzimi antiossidanti, come Sod1 e Sod2, Cat e GPx (St-

Pierre et al., 2003; Valle et al., 2005; St-Pierre et al., 2006). Sembra dunque che Pgc-1α

contemporaneamente aumenti le funzioni mitocondriali e minimizzi l’accumulo delle ROS,

garantendo un impatto globale positivo sul metabolismo ossidativo (Austin et al., 2012).

L’espressione di PGC-1α è altamente indotta da stimoli fisiologici, inclusi il freddo, il digiuno e

l’esercizio fisico (Handschin et al., 2007). In particolare, i livelli di mRNA di questa proteina

incrementano durante l’attività fisica e PGC-1α è espresso maggiormente in tessuti con un’alta

attività metabolica, in cui abbondano i mitocondri, tra cui il cuore, i reni, il fegato, il tessuto

adiposo, l’encefalo e il tessuto muscolare (Lucia et al., 2005). Inoltre, Pgc-1α sembra essere

implicato nella regolazione dello switch, indotto da esercizio fisico, da fibre muscolari di tipo II

(fast-twitch), a fibre di tipo I (slow-twitch) (Holloszy, 2008; Olesen et al., 2010; Kang et al.,

2013); queste ultime conferiscono resistenza alla fatica dato che utilizzano il metabolismo

ossidativo e presentano un contenuto mitocondriale molto più alto rispetto alle fibre di tipo II,

caratterizzate da metabolismo glicolitico (Lin et al., 2002). È stato osservato che l’over-

espressione di PGC-1α aumenta la proporzione di fibre ossidative lente di tipo I, mentre topi

knock-out per PGC-1α mostrano un cambiamento da fibre ossidative verso fibre glicolitiche (Lin

et al., 2002; Handschin et al., 2007).

La proteina Pgc-1α sembra inoltre mediare gli effetti anti-atrofici a livello della giunzione

neuromuscolare; studi condotti prevalentemente su modelli animali suggeriscono infatti un

ruolo protettivo di Pgc-1α nei confronti di malattie come la Distrofia Muscolare di Duschenne

(DMD) e la SLA. Nel modello animale di DMD è stato riscontrato che la proteina Pgc-1α attiva

l’espressione di diversi geni che sono inattivati in modo anomalo nella malattia e l’over-

espressione indotta di PGC-1α sembra mitigare i sintomi clinici della patologia (Handschin et al.,

2007). Nel midollo spinale e nel tessuto corticale motorio di topi transgenici SOD1 G93A e

pazienti SLA, sono stati riscontrati bassi livelli di mRNA e di proteina Pgc-1α (Thau et al., 2012).

Studi condotti da Liang e collaboratori (2011), su topi SOD1 G93A dimostrano che la sovra-

espressione di Pgc-1α rallenta la progressione della SLA ed aumenta moderatamente la durata

di vita, senza alcun effetto sull’insorgenza della malattia. I modelli murini SLA che sovra-

esprimono Pgc-1α, sottoposti al test rotarod, mostrano un significativo aumento della loro

59

prestazione fisica; tale miglioramento dell’attività motoria è stato associato ad una diminuzione

significativa della morte neuronale e dei danni a livello delle giunzioni neuromuscolari (Liang et

al., 2011). Successivamente, Da Cruz e colleghi (2012) hanno dimostrato che l’aumento

dell’attività di Pgc-1α, in topi SOD1 G37R, incrementa la resistenza muscolare, riduce l’atrofia e

migliora l’attività locomotoria anche in fasi avanzate di malattia, senza però prolungare la

sopravvivenza dei topi. Sebbene una ridotta espressione di PGC-1α non possa essere

considerata un determinante per lo sviluppo della SLA, questi dati suggeriscono che un

incremento dei livelli di espressione della proteina può essere di fondamentale importanza per

migliorare le funzioni muscolari dei pazienti affetti dalla malattia (Liang et al., 2011).

Diversi polimorfismi (SNPs) del gene PGC-1α sono stati indagati in varie patologie allo scopo di

valutare i loro eventuali effetti sui pathways regolati dalla proteina stessa. In particolare, il

polimorfismo in posizione 1444 nell’esone 8 del gene PGC-1α (rs8192678) che consiste in una

sostituzione di base G>A, induce un cambiamento aminoacidico in posizione 482 da Glicina

(Gly) a Serina (Ser) e un cambiamento nella struttura della proteina stessa (Prior et al., 2012;

Steinbacher et al., 2015 a). È stato ipotizzato che questo SNP possa influenzare l’efficacia di Pgc-

1α come coattivatore trascrizionale e, tramite un meccanismo autoregolatorio, alterare

l’espressione di PGC-1α nel muscolo; infatti, i portatori dell’allele raro A, mostrano, nel muscolo

scheletrico, una riduzione del 60% dei livelli di PGC-1α, rispetto ai non portatori (Ling et al.,

2004). Inoltre, tale SNP è noto per essere meno frequente negli atleti, rispetto ai controlli (Lucia

et al., 2005). I portatori di questa variante allelica sono più soggetti ad aumenti di colesterolo a

bassa densità (Zhang et al., 2007) e all’insulino-resistenza (Hara et al., 2002) e, in risposta ad un

allenamento fisico, i portatori dello SNP Gly482Ser mostrano una riduzione della soglia

anaerobica e maggiore sensibilità all’insulina rispetto ai soggetti non portatori (Stefan et al.,

2007). Lo SNP, infatti, è stato associato con un maggior rischio di sviluppare diabete di tipo 2

(Ek et al., 2001; Hara et al., 2002; Ling et al., 2004) e nefropatie (Jung et al., 2006; Gayathri et

al., 2010). Diversi studi hanno dimostrato che la presenza della variante allelica 482Ser

comporta un metabolismo glucidico più lento (Gineviciene et al., 2010), compromettendo la

performance fisica, mentre l’allele Gly482 sembra conferire una maggiore resistenza (Ahmetov

et al., 2009; Eynon et al., 2010; Nishida et al., 2015). Uno studio condotto da Steinbacher e

collaboratori (2015 a), mostra inoltre che nel muscolo dei portatori dello SNP Gly482Ser,

rispetto ai non portatori, non si verifica l’aumento, indotto normalmente dall’attività fisica, del

contenuto di fibre ossidative lente.

60

Gli studi finora descritti suggeriscono quindi che l’espressione di PGC-1α giochi un ruolo

centrale nel proteggere i mitocondri dallo stress ossidativo attraverso la riduzione

dell’accumulo delle ROS e della morte cellulare per apoptosi (Valle et al., 2005; St-Pierre et al.,

2006). È stato osservato che elevati livelli di ROS, così come l’esercizio fisico inducono, nel

muscolo l’espressione di PGC-1α, che in condizioni fisiologiche si trova in uno stato

conformazionale inattivo. Inoltre alcune varianti genetiche di PGC-1α sembrano influenzare

l’espressione del gene (Prior et al., 2012); infine, alcuni SNP di PGC-1α sono risultati associati a

maggiori concentrazioni di 8-oxo-dG, un marker di danno al DNA (Lai et al., 2008).

In base a queste considerazioni, l’intento di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare in

pazienti con sSLA il ruolo del polimorfismo 1444 G>A nella risposta allo stress ossidativo, in

condizioni basali e durante l’attività fisica. È stata valutata, innanzitutto, la possibile

associazione di questo polimorfismo con la SLA. In questo studio non sono state riscontrate

differenze nella distribuzione degli A Carriers nei pazienti rispetto ai controlli, suggerendo che

lo SNP Gly482Ser non è associato alla malattia. Non vi sono in letteratura altri studi che abbiano

indagato tale SNP su pazienti SLA. Del resto gli studi effettuati su modelli murini per valutare gli

effetti dell’espressione della proteina, non hanno mostrato alcun effetto diretto di Pgc-1α

sull’insorgenza della malattia (Liang et al., 2011; Da Cruz et al., 2012).

Per valutare la condizione di stress ossidativo nei nostri pazienti rispetto al gruppo di controllo,

abbiamo misurato i livelli plasmatici degli AOPP, come marker di danno ossidativo alle proteine,

della FRAP e dei gruppi tiolici totali, come markers antiossidanti non enzimatici; è stato quindi

valutato l’eventuale effetto dello SNP Gly482Ser sui livelli dei biomarcatori analizzati.

Questi biomarcatori sono stati scelti in quanto permettono una valutazione complessiva dello

stress ossidativo, che tenga conto sia della componente pro-ossidante, che di quella

antiossidante.

I pazienti analizzati mostrano, rispetto ai controlli, un aumento significativo dei livelli plasmatici

basali degli AOPP, confermando la presenza di danno ossidativo nella SLA. Questi risultati sono

in accordo con precedenti studi che indicano lo stress ossidativo come un evento implicato

nella malattia. Bogdanov e collaboratori (2000), hanno rilevato la presenza di elevati livelli di 8-

oxo-dG nei fluidi biologici dei pazienti SLA rispetto ai controlli sani. Studi condotti da Simpson e

collaboratori (2004), successivamente confermati da Kabuta e colleghi (2015) mettono in

evidenza un incremento dei livelli di HNE, prodotto della perossidazione lipidica, a livello di

midollo spinale, corteccia motoria, fluido cerebrospinale, plasma/siero e urine dei pazienti con

61

SLA rispetto ai pazienti affetti da altre malattie neurodegenerative, a controlli con malattie di

tipo-non degenerativo o controlli sani. Inoltre, a livello del SNC di topi e pazienti SLA, sono stati

riscontrati elevati livelli di nitrotirosina; la nitrazione della tirosina mediata dal perossinitrito

rappresenta un potenziale meccanismo che porta alla morte neuronale, in molte malattie

neurodegenerative, tra cui la SLA (Beckman et al., 2004; Siciliano et al., 2007).

I risultati ottenuti mettono inoltre in evidenza nei pazienti SLA una riduzione dei livelli

plasmatici dei biomarcatori antiossidanti non enzimatici FRAP e tioli, rispetto ai controlli,

confermando precedenti studi che evidenziano una diminuzione delle riserve antiossidanti nella

SLA. Uno studio condotto da Keizman e collaboratori (2009) ha mostrato in pazienti con SLA,

rispetto ai soggetti sani, bassi livelli sierici di acido urico, che rappresenta circa il 60% del valore

della FRAP. L’acido urico è un importante antiossidante endogeno, con proprietà metallo-

chelanti e capacità di eliminare i radicali nitrogenati; può, infatti, eliminare l’anione superossido

(∙O2-), quindi prevenire la sua reazione con l’ossido nitrico e bloccare la formazione dei

perossinitriti (Keizman et al., 2009). In accordo con questo lavoro di tesi, Baillet e colleghi

(2010), in uno studio condotto su eritrociti di sangue periferico di 31 pazienti sSLA e 30 soggetti

di controllo, riscontrano livelli più bassi dei gruppi tiolici totali nei primi rispetto ai secondi.

Inoltre, un altro studio ha mostrato che il GSH, il più abbondante antiossidante tiolico

endogeno intracellulare, è presente a bassi livelli nei motoneuroni corticali di pazienti SLA

rispetto ai controlli (Weiduschat et al., 2014). I dati presenti in letteratura a riguardo risultano

essere comunque contrastanti; per esempio, Babu e collaboratori (2008), confrontando 20

pazienti SLA vs 20 controlli, non riscontrano alcuna differenza nell’attività eritrocitaria della Sod

e della GPx, anche se i livelli dell’attività di altri enzimi (glutatione reduttasi e Cat) e molecole

antiossidanti (GSH) risultano più basse nei primi rispetto ai secondi (Babu et al., 2008). Baillet e

colleghi (2010) nel loro studio, hanno osservato che i livelli del GSH e del GSSG, così come il

rapporto GSH/GSSH, non differiscono tra pazienti SLA e controlli.

L’aumento dei livelli degli AOPP e la contemporanea diminuzione dei livelli di FRAP e tioli,

riscontrati nei pazienti sSLA in questo lavoro di tesi, rispetto ai controlli sani, sembrano

pertanto riflettere una condizione di alterato equilibrio redox, e confermano quindi la maggior

parte dei dati di letteratura, che indicano lo stress ossidativo come un fattore chiave nei

meccanismi patogenetici della SLA.

Successivamente, sono stati dunque confrontati i livelli plasmatici basali di AOPP, FRAP e gruppi

tiolici totali tra soggetti omozigoti wild-type (GG) e A Carriers. I risultati ottenuti non mostrano,

62

tra soggetti portatori e non portatori di A, differenze significative nei livelli plasmatici per

nessuno dei marcatori di stress ossidativo analizzati, prendendo in esame rispettivamente la

popolazione totale studiata, il gruppo dei pazienti e il gruppo dei controlli. Il polimorfismo

Gly482Ser non sembra quindi avere alcun effetto sui livelli dei biomarcatori di stress ossidativo

analizzati. Gli studi che hanno indagato l’eventuale associazione di questo polimorfismo con lo

stress ossidativo sono pochi e mostrano dati contrastanti. A differenza di quanto osservato in

questo lavoro di tesi, uno studio condotto su soggetti con diabete mellito e controlli sani

mostra un’associazione tra l’allele raro A e biomarcatori di stress ossidativo. Infatti, i soggetti

sia diabetici che sani, con genotipo omozigote AA, hanno livelli sierici significativamente più alti

di TBARS, prodotto dalla perossidazione lipidica, rispetto ai soggetti omozigoti wild-type; tali

differenze si riscontrano anche confrontando individui A Carriers e individui omozigoti wild-type

GG. Inoltre, gli stessi autori osservano livelli dei gruppi tiolici plasmatici più bassi nei soggetti

con genotipo omozigote AA rispetto ai soggetti con genotipo eterozigote GA (Weng et al.,

2010). In accordo con i nostri dati, Lai e colleghi (2008) non hanno tuttavia trovato alcuna

associazione tra il polimorfismo Gly482Ser e livelli di 8-oxo-dG nelle urine di pazienti diabetici.

Gli stessi autori hanno identificato altri tre SNPs (m1668, i55301, 3U4898) in PGC-1α che

mostrano, invece, un’associazione significativa con il danno al DNA. Occorre comunque

considerare che i livelli dei biomarcatori analizzati in questo lavoro di tesi non sono regolati

direttamente da Pgc-1α anche se la proteina potrebbe avere un effetto indiretto almeno sui

livelli di marcatori di danno ossidativo: un’efficiente trascrizione dei geni del sistema

antiossidante (genotipo favorevole GG) potrebbe infatti ridurre i livelli di ROS e quindi di danno

ossidativo, mentre una riduzione dell’espressione di PGC-1α o una minore attività della

proteina (genotipo sfavorevole AA) potrebbe risultare in un incremento di ROS e danno

ossidativo. I dati ottenuti non sono a sostegno però dell’ipotesi iniziale e sembra che questo

polimorfismo non conferisca a chi ne è portatore una condizione di stress ossidativo peggiore

rispetto a chi ha un genotipo omozigote wild-type.

Ciò è stato confermato anche dai risultati ottenuti dosando l’attività della Sod totale e della Cat,

i cui geni antiossidanti sono regolati da Pgc-1α, ma anche da altri cofattori e fattori di

trascrizione. La valutazione degli enzimi antiossidanti Sod totale e Cat in questo lavoro di tesi è

stata effettuata solo su un limitato numero di soggetti, cioè solo sui pazienti con SLA che sono

stati più recentemente reclutati per essere sottoposti a test da sforzo; il dosaggio dell’attività di

questi due enzimi, eseguito mediante kit commerciale in un’unica seduta, poteva infatti essere

63

effettuato solo sui campioni raccolti non più di un mese prima. Come per gli altri marcatori di

stress ossidativo, non sono state riscontrate differenze nelle attività di questi due enzimi tra

portatori e non portatori della variante allelica rara. Ipotizzando che l’allele A comportasse una

minore efficienza di Pgc-1α nel regolare la trascrizione dei geni antiossidanti, ci aspettavamo di

trovare una ridotta attività di Sod e Cat nei soggetti portatori dell’allele raro. Al contrario,

l’allele A non sembra compromettere l’espressione di questi geni. Possiamo supporre che

l’aminoacido in posizione 482, che sia Gly o Ser, sia localizzato in un dominio della proteina che

non è coinvolto nel legame di questo cofattore con i promotori dei geni che codificano per Sod

e Cat. È possibile che altri polimorfismi di PGC-1α, con diversa localizzazione, siano in grado di

influenzare o compromettere la stabilità di tale legame, ma non vi sono in letteratura studi al

riguardo. Elevati livelli di ROS possono comunque attivare, oltre all’espressione di PGC-1α,

anche altri pathways molecolari, che sono a loro volta in grado di indurre la trascrizione dei

geni di enzimi antiossidanti, come per esempio la via del fattore di trascrizione Nuclear factor

erythroid 2-related factor 2 (Nfe2l2). In assenza di un adeguato stimolo di stress, non essendo

necessario indurre attivazione genica, Nfe2l2 è legato a Keap1, che funziona da soppressore del

fattore di trascrizione. Keap1 è sensibile allo stress ossidativo e in presenza di danno ai suoi

residui di cisteine, subisce un cambio conformazionale che provoca il rilascio di Nfe2l2 e la

conseguente trascrizione dei geni antiossidanti (Itoh et al., 2003; Motohashi et al., 2004). È

possibile quindi che per la regolazione della trascrizione di questi geni, in condizioni basali di

stress ossidativo, con livelli di ROS pressoché costanti, siano preferenzialmente attivate altre vie

molecolari; l’espressione di PGC-1α potrebbe essere chiamata in causa, solo in seguito a stimoli

intensi come un elevato incremento delle ROS, che si può ad esempio verificare dopo un

esercizio fisico intenso. È infatti noto che Pgc-1α, in condizioni fisiologiche, si trova all’interno

della cellula in uno stato conformazionale inattivo e viene attivato solo in seguito a stimoli,

come un insulto ossidativo, l’esercizio fisico e la contrazione muscolare (St-Pierre et al., 2006;

Park et al., 2014).

L’attività fisica gioca un ruolo decisivo nel rompere o riequilibrare il bilanciamento redox

cellulare (Iorio, 2003). Diversi studi suggeriscono che un esercizio intenso e anaerobico possa

ridurre le difese antiossidanti (Childs et al., 2001; Waring et al., 2003) e, tramite un incremento

delle ROS, aumentare il danno ossidativo (Bloomer et al., 2005).

Alla luce di queste considerazioni e nell’ottica di una possibile associazione tra attività fisica

intensa e la SLA, uno degli obiettivi di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare, in un

64

gruppo di pazienti sSLA sottoposto ad un test da sforzo incrementale, eventuali alterazioni nel

bilanciamento redox in seguito ad esercizio fisico. Successivamente, visto il ruolo che è stato

ipotizzato per lo SNP Gly482Ser nell’attività fisica, è stato valutato un suo eventuale effetto,

durante l’esecuzione dell’esercizio, sui livelli dei biomarcatori analizzati.

Non si osservano, nei pazienti SLA analizzati, cambiamenti nei livelli plasmatici di AOPP, FRAP e

tioli valutati prima, durante e dopo il protocollo di esercizio fisico; sia il marker che valuta il

danno ossidativo alle proteine, che i markers che valutano la componente antiossidante non

enzimatica, restano quindi costanti durante lo sforzo e, anche 15 minuti dopo l’esercizio, i valori

dei suddetti biomarcatori non subiscono variazioni, rimanendo pressoché uguali ai valori

riscontrati al basale (prima dello sforzo). Numerosi studi, condotti sia su modelli murini che

sull’uomo, hanno valutato la relazione tra equilibrio ossido-riduttivo ed esercizio fisico, eseguito

in modo regolare e costante o con sforzo intenso e di breve durata, riportando comunque dati

contrastanti. Confrontando tali studi si notano differenze nei protocolli di esercizio e nelle

tempistiche di raccolta/valutazione dei campioni. Pialoux e collaboratori (2006), analogamente

a questo lavoro di tesi, non rilevano, subito dopo il test da sforzo, variazioni significative, dei

livelli plasmatici di AOPP, MDA e FRAP, in 14 corridori sottoposti a test anaerobico incrementale

su tapis roulant. Selman e collaboratori (2002), in uno studio effettuato sui topi sottoposti al

rotarod test, dimostrano che la corsa su una ruota non induce aumento di danno a livello del

DNA, saggiato tramite comet assay, e lipidi. In aggiunta, più recentemente, Siu e colleghi (2011)

hanno osservato che in topi sottoposti a esercizio fisico volontario, la percentuale di danno al

DNA, dopo 8 e 20 settimane, risulta più bassa rispettivamente del 21% e del 45%, rispetto a

quella riscontrata in topi di controllo non sottoposti ad attività fisica. Successivamente, de

Souza e colleghi (2012) osservano che nei ratti sottoposti ad un protocollo di training mediante

tapis roulant, della durata di 8 settimane, per 50 minuti/giorno, si ha una riduzione dei livelli

dell’∙O2- ed un incremento dell’attività della Sod e della GPx, mentre non rilevano variazioni

significative nell’attività della Cat rispetto ai ratti non sottoposti ad esercizio. Un recente studio

condotto su 10 giovani corridori sottoposti ad una corsa di 21 Km e valutati al basale e 4 ore

dopo la corsa, mostra una diminuzione dei livelli plasmatici del TBARS e della Sod, mentre non

riscontra variazioni nei livelli della Cat, del GSH e della capacità antiossidante totale (TAC); dopo

12 mesi di training, gli autori osservano, dopo la corsa, una ulteriore diminuzione, rispetto ai

valori basali, dei livelli dei TBARS associato, però, ad un incremento dell’attività della Cat e della

TAC (Tong et al., 2013).

65

Altri studi, in cui sono stati valutati i livelli di biomarcatori di stress ossidativo in individui

sottoposti ad esercizi anaerobici, hanno dimostrato un incremento di MDA, prodotto della

perossidazione lipidica, 6 ore dopo l’esercizio (Viitala et al., 2004) e un aumento delle proteine

carbonilate a 6 e 24 ore post-esercizio (Bloomer et al., 2005). Inoltre, è stato osservato anche

un aumento dei livelli degli antiossidanti sia enzimatici (Sod1, Sod2, GPx e Cat) (Childs et al.,

2001), che non enzimatici (GSH, acido urico e bilirubina), 40 minuti dopo l’esercizio (Waring et

al., 2003).

Nonostante i progressi delle tecniche analitiche utilizzate e la raffinatezza dei disegni di studio

messi a punto, i dati di letteratura sono in grande disaccordo riguardo l’influenza dell’esercizio

fisico sul danno muscolare e sull’omeostasi cellulare (Nikolaidis et al., 2013). Infatti, se da un

lato l’esercizio fisico effettuato in modo regolare ha effetti benefici ed è associato ad un ridotto

rischio di sviluppare malattie correlate ad un eccessivo stress ossidativo, dall’altro un’attività

fisica intensa può indurre un aumento del danno a livello di diversi tessuti con particolare

riferimento al tessuto muscolare (Radak et al., 2008).

Occorre considerare che le variazioni nei livelli dei biomarcatori di stress ossidativo riscontrate

nella maggior parte di questi studi in seguito ad esercizio fisico anaerobico o aerobico, si

verificano diverse ore dopo la fine dello sforzo. Nel presente lavoro di tesi il periodo di tempo

intercorso tra il primo e l’ultimo prelievo (circa 25-30 minuti) potrebbe infatti rivelarsi un

intervallo temporale non sufficientemente ampio da permettere il verificarsi dei meccanismi

implicati nell’incremento del danno ossidativo e nelle variazioni plasmatiche degli antiossidanti.

Non vi sono in letteratura dati precisi riguardanti i tempi necessari affinché certi meccanismi

siano portati a termine. In presenza di elevati livelli di ROS e considerata la loro elevata

instabilità e tendenza a reagire con altre molecole, ci potremmo aspettare che il primo evento a

verificarsi sia l’attacco da parte delle ROS stesse ai componenti cellulari, primi tra tutti i lipidi, e

quindi la produzione di danno ossidativo. Presumibilmente le difese antiossidanti, enzimatiche

e non, già presenti in condizioni basali nel nostro organismo, saranno le prime ad agire per

tamponare il danno. Tuttavia, affinché si verifichi un incremento dell’attività degli enzimi

antiossidanti, in risposta a questo insulto, saranno necessari tempi molto lunghi. È noto infatti

che l’attivazione della trascrizione dei geni, la maturazione dell’mRNA e la sua traduzione in

proteina, sono meccanismi che richiedono dalle 4 ore in poi, a seconda della lunghezza del gene

(Lewin, 2010). Sarebbe stato quindi, probabilmente, più opportuno effettuare le valutazioni dei

biomarkers anche in tempi successivi, a distanza di diverse ore dalla fine dello sforzo, come

66

effettuato in altri lavori di letteratura. È anche vero che tali studi sono stati per lo più condotti

su individui sani, giovani e allenati, in grado di sostenere uno sforzo fisico molto intenso. I

pazienti esaminati in questo lavoro di tesi, considerata la severità della malattia, sono stati

sottoposti ad un esercizio fisico di moderata entità, che risulta comunque molto faticoso per

soggetti con muscolatura atrofica e debole; inoltre, per motivi etici e logistici, non è stato

ritenuto opportuno trattenere i pazienti a lungo dopo lo sforzo, né tantomeno farli tornare il

giorno seguente.

In letteratura gli unici studi che hanno valutato i livelli di biomarcatori di danno ossidativo

durante e in seguito ad esercizio fisico in pazienti SLA sono stati effettuati dal nostro gruppo di

ricerca (Siciliano et al., 2001; Siciliano et al., 2002). È stato osservato in 10 pazienti SLA un

incremento dei livelli plasmatici di lipoperossidi e lattato, dopo l’esecuzione di un test

incrementale su cicloergometro (Siciliano et al., 2002). Questa discrepanza con i risultati

riscontrati nel presente lavoro di tesi potrebbe essere dovuta al fatto che nello studio condotto

da Siciliano e colleghi (2002) come marker di danno ossidativo sono stati determinati i

lipoperossidi: gli acidi grassi polinsaturi, che abbondano nelle membrane cellulari, vengono

danneggiati dalle reazioni a catena dei radicali liberi (Jones et al., 2008) e per questo vengono

considerati un indice indiretto dei livelli delle ROS stesse (Wang et al., 2014). Non v’è dubbio

che i lipidi, specialmente se insaturi, e, quindi, con doppietti di legame “disponibili” a soddisfare

l’avidità di elettroni dei radicali liberi, costituiscano targets importanti dell’attacco ossidativo, in

particolar modo se inseriti nel contesto di biomembrane e, come tali, maggiormente esposti

all’azione radicalica (Iorio, 2003). È probabile che il danno ossidativo alle proteine sia rilevabile

in tempi successivi rispetto a quello che si può riscontrare a carico dei lipidi. Un’altra differenza,

rispetto al presente lavoro di tesi, è l’utilizzo di un metodo diverso per l’esecuzione dello sforzo

fisico e cioè l’impiego del cicloergometro anziché l’handgrip; infatti, il primo risulta essere più

faticoso rispetto al secondo, in quanto attiva un maggior numero di fibre muscolari ed

incrementa l’attività cardiorespiratoria.

Considerando il coinvolgimento mitocondriale nella SLA e che uno dei principali biomarcatori, in

vivo, della compromissione della funzione mitocondriale è l’eccessivo accumulo di lattato

durante un esercizio sub-massimale (Siciliano et al., 2001), per verificare se l’esercizio influisse

sul metabolismo ossidativo dei pazienti, è stata anche valutata la cinetica dell’acido lattico

durante il test da sforzo incrementale. I valori basali medi di lattato riscontrati nella

popolazione in esame sono paragonabili a quelli che si riscontrano in condizioni fisiologiche in

67

soggetti adulti sani; i livelli di acido lattico aumentano con lo sforzo fisico, raggiungendo il picco

massimo al 70% della CVM e quindi diminuiscono di nuovo per tornare ai valori basali post

esercizio. Infatti, dal confronto tra i livelli di lattato riscontrati nei pazienti e i valori di

riferimento, forniti dal laboratorio che ha effettuato il dosaggio di questo marcatore, non

osserviamo variazioni tra i primi rispetto ai secondi. Ciò fa supporre che l’accumulo di lattato

riscontrato nei pazienti sSLA in esame sia dovuto unicamente allo svolgimento dell’attività

fisica, senza mostrare una correlazione con la malattia. Un altro studio osserva, invece, livelli

basali di lattato più elevati nei pazienti SLA rispetto ai controlli; inoltre dopo aver sottoposto i

soggetti a test da sforzo incrementale su cicloergometro, si osserva, nei pazienti SLA, un

aumento significativo dei livelli di acido lattico al 40-50% della potenza massimale teorica,

rispetto ai valori basali. Post-esercizio, nel gruppo dei pazienti, i valori di questo biomarcatore

restano leggermente più elevati rispetto al basale, non raggiungendo la significatività statistica,

mentre si avvicinano al valore del basale (pre esercizio) nel gruppo di controllo (Siciliano et al.,

2001). Infine, in un recente studio condotto su 10 pazienti affetti da malattie mitocondriali e 10

controlli, si osserva che nei pazienti, durante test da sforzo su cyclette, i livelli di lattato

aumentano di 3 volte rispetto ai controlli (Jeppens et al., 2013). Nonostante queste evidenze,

non c’è un accordo generale circa il ruolo che svolge l’acido lattico nelle malattie degenerative;

la comunità scientifica tutt’oggi dibatte se il lattato abbia un ruolo nel promuovere l’insorgenza

della fatica o se sia semplicemente un marker del metabolismo anaerobico (Renaud, 2006).

Infatti, sebbene alcuni studi hanno rilevato che il lattato può di per sé indurre fatica attraverso

l’accumulo di H+ (Dengler et al., 1996), altri studi suggeriscono che l’aumento della fatica non è

correlato all’accumulo di acido lattico, a livello muscolare (Duncan et al., 2004; Vissing et al.,

2001).

È noto che PGC-1α regola l’espressione di alcuni geni che codificano per diversi enzimi coinvolti

nell’ossidazione degli acidi grassi e nella fosforilazione ossidativa e che un allenamento intenso

induce un aumento dei livelli di Pgc-1α che, a sua volta, può incrementare le capacità ossidative

a livello del muscolo scheletrico. Finora, solo pochi studi sono stati condotti per verificare i

possibili effetti di PGC-1α sulla performance atletica (Eynon et al., 2010). Lucia e collaboratori

(2005) hanno riportato un’associazione tra l’esercizio fisico e il polimorfismo Gly482Ser (1444

G>A) dato che, negli atleti, l’allele raro A è significativamente meno frequente che nei controlli

(Lucia et al., 2005). La VO2 max, cioè la massima quantità di ossigeno che può essere utilizzata

nell'unità di tempo da un individuo, nel corso di un'attività fisica di intensità progressivamente

68

crescente e protratta fino all'esaurimento, è uno dei principali metodi per valutare la resistenza

fisica. Lucia e collaboratori (2005), nel loro studio, mostrano che i controlli hanno bassi livelli di

VO2 max, dimostrando che la presenza dell’allele raro A, insieme ad altri fattori ambientali e

genetici, potrebbe predire la capacità fisica. Questa scoperta è interessante dal punto di vista

delle prestazioni fisiche, ma può anche avere una certa rilevanza nell’identificare individui che,

in virtù di una determinata predisposizione genetica, possono essere esposti ad un maggiore

rischio di sviluppare disturbi associati alla sedentarietà e/o ad un’intolleranza all’esercizio (Lucia

et al., 2005). Anche altri studi di letteratura, affermano che l’allele raro A è associato con una

scarsa capacità fisica, mentre l’allele selvatico Gly482 risulta essere un fattore genetico

benefico che aumenta la resistenza muscolare (Nishida et al., 2015).

Considerando le caratteristiche metaboliche della proteina Pgc-1α e il modo in cui

l’allenamento fisico modula la sua espressione, è plausibile che la variazione Gly482Ser

modifichi gli effetti benefici della proteina stessa sull’esercizio fisico.

In questo lavoro di tesi, al fine di valutare se la presenza della variante allelica rara A potesse

influire sui livelli dei biomarcatori di stress ossidativo, valutati prima, durante e dopo il

protocollo di esercizio fisico, i pazienti sSLA sottoposti a test da sforzo, sono stati suddivisi in

omozigoti wild-type (GG), eterozigoti (GA) e omozigoti mutati (AA). I risultati ottenuti mostrano

che l’andamento dei livelli plasmatici della FRAP e dei gruppi tiolici totali non differiscono tra i

gruppi esaminati. Gli omozigoti AA mostrano, però, per tutta la durata dell’esercizio fisico, livelli

medi di AOPP più elevati, sia rispetto ai soggetti wild-type che agli individui eterozigoti, con

differenze statisticamente significative al 50% della CVM e post-esercizio. Tali risultati ci

spingono ad ipotizzare che, durante l’attività fisica, il genotipo wild-type GG potrebbe conferire

una sorta di protezione contro il danno ossidativo, mentre la presenza della variante allelica

rara A in condizione di omozigosi, sembrerebbe concorrere a incrementare i livelli di danno

ossidativo alle proteine. Individui eterozigoti GA, presumibilmente in virtù della presenza

dell’allele wild-type, presentano, invece, livelli medi di AOPP sovrapponibili agli omozigoti GG. I

livelli medi di AOPP, che nel totale dei pazienti sembravano non variare nel corso dell’esercizio,

mostrano invece un andamento genotipo-dipendente. Si osserva, inoltre, che gli individui

omozigoti AA mostrano un incremento significativo dei livelli di acido lattico al 30% e al 50%

della CVM, rispetto ai soggetti con genotipo wild-type. Gli individui eterozigoti, a livello di questi

due steps, mostrano un lieve aumento dei livelli di acido lattico rispetto ai soggetti omozigoti

wild-type, anche se queste differenze non risultano significative. Post-esercizio, nei portatori

69

dell’allele A in condizione di omozigosi, i valori di questo marker restano più elevati rispetto al

basale, non raggiungendo comunque la significatività statistica. Questi dati fanno ipotizzare che

l’allele raro A possa essere implicato in un maggiore accumulo di acido lattico rispetto agli

individui GG e, di conseguenza, possa indurre una minore prestazione fisica. Inoltre, studi di

letteratura hanno riportato che il lattato induce un incremento di H+ (Dengler et al., 1996) e

radicali idrossili (Ali et al., 2000) che, a loro volta, possono danneggiare le macromolecole

cellulari (Lovlin et al., 1987; Kayatekin et al., 2002). In questo lavoro di tesi, i dati ottenuti

mostrano, infatti, nei portatori della variante allelica rara A in condizione di omozigosi, un

aumento dei livelli degli AOPP e quindi, verosimilmente, un aumento del danno ossidativo alle

proteine.

Considerando che la SLA è una patologia progressivamente ingravescente, è ipotizzabile che

l’organismo metta in atto dei meccanismi finalizzati alla conservazione delle sue funzioni. Così,

ad esempio, è possibile ipotizzare che in un muscolo che va incontro ad atrofia e perdita di

forza, si possa mettere in moto un meccanismo atto a preservare la sua funzionalità, come ad

esempio lo switch fast to slow delle miofibrille. Tale fenomeno potrebbe risultare

nell’acquisizione di resistenza muscolare alla fatica e quindi potrebbe consentire, in ultima

analisi, il mantenimento dei movimenti volontari nonostante la severità della malattia. Il

polimorfismo Gly482Ser sembra avere un ruolo chiave proprio in questo fenomeno; infatti, è

noto dalla letteratura che lo SNP inibisca lo switch da fast a slow delle miofibre e che nei

muscoli dei portatori dello SNP Gly482Ser non si abbia l’aumento del numero di fibre ossidative

lente come accade normalmente durante l’attività fisica (Steinbacher et al., 2015 a). Uno studio

condotto da Zhang e colleghi (2007) mostra che il cambio aminoacidico Gly482Ser causa

un’alterazione nel sito di legame per MEF2, regolatore chiave dello switch miofibrillare,

compromettendo così la formazione del complesso Pgc-1α/MEF2, che normalmente andrebbe

ad attivare i geni per le fibre lente. Ciò potrebbe comportare un maggior utilizzo delle fibre

glicolitiche, dipendenti da un metabolismo anaerobico, che, pur sopperendo in parte alla

carenza di ossigeno, induce un aumento della produzione di acido lattico. L’eccessivo

incremento di lattato durante lo sforzo potrebbe eccedere la capacità dell'organismo di

limitarne i livelli, con conseguente accumulo del lattato stesso nel sangue. Diversi studi (Lucia et

al., 2005; Eynon et al., 2010) mostrano che la presenza dell’allele Gly482, contrariamente

all’allele 482Ser, favorisce le performances fisiche, probabilmente in quanto i soggetti GG

mostrano un minor accumulo di acido lattico. Questi dati sono in accordo con i risultati ottenuti

70

in questo lavoro di tesi, che vedono un incremento di lattato nei pazienti A Carriers, rispetto

agli individui wild type GG. È possibile dunque ipotizzare che la presenza dell’allele raro A

impedisca lo switch fast to slow conferendo al muscolo sollecitato, una minore resistenza alla

fatica, che potrebbe essere spiegata dall’accumulo di lattato riscontrato durante il test da

sforzo eseguito dai pazienti in esame. Questo meccanismo potrebbe concorrere, in associazione

ad una maggiore suscettibilità allo stress ossidativo, come dimostrato dai valori di AOPP che

sotto sforzo aumentano negli omozigoti AA, a favorire le conseguenze negative dell’esercizio

nei pazienti SLA. D’altro canto, un recente studio condotto da Nishida e collaboratori (2015),

rileva che soggetti A Carriers, sottoposti a test da sforzo su cicloergometro, mostrano una

maggiore soglia del lattato (LT) rispetto agli individui GG; mentre le differenze tra soggetti wild-

type ed eterozigoti risultano marginali, quelle osservate tra wild-type e omozigoti AA sono

significative. Questa incongruenza con i dati presenti in letteratura, potrebbe dipendere,

secondo l’autore, da differenze nella fitness cardiorespiratoria dei soggetti analizzati (Nishida et

al., 2015).

Risulta comunque difficoltoso comparare i risultati dei diversi studi presenti in letteratura circa

gli effetti dei protocolli di training nel migliorare o mantenere l’equilibrio ossido-riduttivo

cellulare. Basti pensare alle molteplici variabili da considerare tra cui i modelli analizzati (topo,

uomo), le differenze tra i biomarcatori valutati (danno ossidativo al DNA, alle proteine, ai lipidi

o marcatori che valutano la componente antiossidante, enzimatici e non enzimatici); il

materiale biologico (urine, plasma/siero, eritrociti, tessuti) e le metodiche con cui vengono

saggiati. Inoltre, non è da sottovalutare il background genetico degli individui, i fattori

ambientali (dieta, fumo), la molteplicità dei tipi di training adoperati, se si tratta quindi di

attività fisica di lieve, moderata o di intensa entità, se è di tipo aerobico o anaerobico, se si

considera un training a lungo termine o burts di esercizi intensi e di breve durata (secondi o

pochi minuti).

In conclusione, i dati ottenuti nel presente lavoro di tesi non hanno evidenziato alcun effetto

dello SNP sui biomarcatori di stress ossidativo, in condizioni basali. Durante l’esercizio si è

rilevato un aumento del danno ossidativo alle proteine solo nei portatori dell’allele raro in

condizione di omozigosi, anche se il meccanismo alla base di questo fenomeno non è ancora

chiaro. Non sono state invece riscontrate differenze nei livelli plasmatici dei biomarcatori

antiossidanti, enzimatici e non enzimatici, tra soggetti A Carriers versus soggetti G Carriers.

L’eventuale presenza nel gene PGC-1α dello SNP Gly482Ser, che potrebbe influire

71

negativamente sulla trascrizione dei geni antiossidanti, non basta a spiegare l’aumento del

danno ossidativo osservato; infatti, l’espressione dei geni, come visto in precedenza, richiede

tempistiche più lunghe (anche ore) rispetto ai tempi in corrispondenza dei quali abbiamo

valutato i biomarcatori di stress ossidativo. Sarebbe stato interessante investigare le variazioni

dell’attività degli enzimi antiossidanti Sod e Cat a distanza di diverse ore dalla fine dello sforzo

fisico; ciò non è stato possibile per i motivi sovraesposti e questo rappresenta probabilmente

un limite di questo studio. Non è stato possibile quindi dimostrare, ma neppure escludere, un

ruolo dello SNP sull’espressione dei geni che codificano per questi enzimi del sistema di difesa

antiossidante.

Il precoce accumulo di lattato osservato nei portatori dell’allele raro A, in particolare negli

omozigoti AA, sembra confermare precedenti studi in cui si dimostra che lo SNP inibisce la

conversione, indotta da esercizio fisico, da fibra veloce a fibra lenta. Potremmo quindi

ipotizzare che la presenza dello SNP possa compromettere gli effetti benefici che PGC-1α

sembra normalmente esercitare sul muscolo scheletrico, in particolari condizioni. Durante

l’esercizio fisico infatti la combinazione di stimolo neuromuscolare e contrazione promuove

l’espressione di PGC-1α; questa proteina, maggiormente presente nei muscoli di individui che

eseguono regolarmente attività fisica, sembra responsabile degli adattamenti muscolari legati

all’attività di endurance, come l’incremento delle capacità ossidative e una probabile

conversione delle fibre glicolitiche in quelle ossidative. Inoltre, Pgc-1α sembra svolgere

un’attività trofica sul tessuto muscolare, contribuendo al mantenimento della massa muscolare

stessa. Possiamo quindi ipotizzare che molecole che inducono l’espressione sistemica, o

tessuto-specifica, di PGC-1α, potrebbero essere usate come trattamento per migliorare le

funzioni muscolari, le prestazioni fisiche e ridurre l’atrofia, determinando una migliore qualità

di vita per i pazienti affetti da SLA.

72

7. Conclusioni

I risultati da noi ottenuti mostrano che i pazienti sSLA in esame, rispetto ai controlli sani, hanno

un aumento del danno ossidativo e una diminuzione delle riserve antiossidanti, confermando

che lo stress ossidativo sia coinvolto nella patogenesi della malattia.

I dati relativi al polimorfismo Gly482Ser, in posizione 1444 nell’esone 8 del gene che codifica

per PGC-1α (rs8192678), fanno supporre che lo SNP non sia un possibile fattore di suscettibilità

genetica per la SLA.

La presenza dell’allele raro A non sembra essere correlata allo stress ossidativo, in quanto, i

livelli plasmatici dei biomarcatori di danno alle proteine AOPP e antiossidanti non enzimatici

FRAP e tioli, valutati nell’intera popolazione presa in esame e singolarmente, nel gruppo dei

pazienti e nel gruppo dei controlli, non mostrano alcuna differenza tra portatori e non portatori

di questa variante allelica. Lo SNP non sembra inoltre avere alcun effetto sull’attività degli

antiossidanti enzimatici Sod e Cat.

Nonostante sia noto che l’esercizio fisico intenso possa indurre un incremento di stress

ossidativo, i pazienti, sottoposti a test da sforzo incrementale, non mostrano variazioni nei

livelli degli AOPP, della FRAP e dei gruppi tiolici totali, durante e subito dopo l’esecuzione

dell’esercizio, mentre induce variazioni dei livelli di acido lattico. Suddividendo i pazienti in base

al loro genotipo, si osserva, tuttavia, che gli omozigoti AA mostrano, rispetto al resto dei

pazienti, livelli degli AOPP più elevati per tutta la durata dello sforzo, suggerendo che la

variante allelica rara A possa concorrere, durante l’attività fisica, ad incrementare il danno

ossidativo.

Inoltre l’allele raro A sembra essere associato a un maggior accumulo di lattato durante

l’esercizio fisico, indicando un possibile ruolo dello SNP nella compromissione di un corretto

meccanismo di switch delle fibre muscolari.

Conoscere il genotipo di appartenenza di ogni paziente potrebbe, quindi, essere utile per

disegnare appropriati protocolli di training, al fine di mantenere la funzionalità dell’apparato

muscolo scheletrico il più a lungo possibile.

73

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9. Ringraziamenti

Desidero ringraziare il Professor Gabriele Siciliano per l’opportunità offertami, per la cortese e

validissima collaborazione concessami e per la disponibilità dimostrata sempre nei miei

confronti. Ringrazio inoltre la Professoressa Luciana Dente e il Professor Aldo Paolicchi,

correlatori della presente tesi, per la loro disponibilità e per i consigli che mi hanno fornito

durante il colloquio.

Un grazie particolare va a tutti i componenti del Laboratorio di Neurobiologia Clinica e

Neurochimica della Clinica Neurologica, in modo particolare alla Dottoressa Lucia Chico e alla

Dottoressa Lucia Petrozzi, per la disponibilità e la professionalità con cui mi hanno seguito sia

durante l’attività di tirocinio che nella stesura della tesi.

Un doveroso e sentito ringraziamento va ancora una volta ai miei genitori senza il cui costante

supporto, dimostratomi soprattutto nei momenti di difficoltà, non sarei mai riuscita a

completare i miei studi universitari, né tanto meno a raggiungere questo ulteriore traguardo.

Un ringraziamento caloroso al mio fidanzato Nicola, che con amore, fiducia e pazienza mi ha

sostenuta in questi ultimi anni universitari, con la speranza che continui a farlo a lungo.

Ringrazio tutti gli amici e i familiari che in questi anni mi sono stati vicini, ma anche tutti coloro

che hanno provato ad ostacolare il mio cammino: è anche grazie a voi se sono diventata più

forte.

E infine, rendo grazie a Dio, per ogni cosa che fa nella mia vita…Signore, non smetterò mai di

dirTi grazie.

Non è stato facile, ma ce l’abbiamo fatta!