Corso di Biologia Molecolare - Laurea

TriennaleMODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE

1) Metodiche per lo studio dell’RNA (trascrizione in vitro, Northern blot, interazioni nnRNA-proteine)

2) Produzione delle estremità 3’ degli mRNA - La poliadenilazione e U7 snRNA

3) Lo splicing e i piccoli RNA nucleari (regolazione di splicing – L32)

4) RNA interference e miRNA

Materiale didattico:Materiale disponibile su: http://www.gbm.uniroma1.it/informazioni/elencoDocenti.php

Testi consigliati:Biologia Molecolare – R.F. Weaver – Mc Graw Hill -Biologia Molecolare della cellula –Lodish et al. Ed. ZanichelliIl Gene - B. Lewin, Ed. Zanichelli

Quale è la differenza tra l’RNA ed il DNA?

L’ RNA ha l’uracile al posto della timina

L’ RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio

L’ RNA è a singola elica, rispetto alla doppia elica del DNA, ma può strutturarsi in conformazioni a doppia elica molto complesse

Differenze tra DNA e RNA

L’ RNA ha l’uracile al posto della timina

CH3 timina

Desossi-ribosio

DNA

RNA

O

OH OH

O5’ribosio

P

Base

azotata

P P

O

OH H

O5’ P

Base

azotata

P P

Queste differenze hanno delle implicazioni funzionali ed evolutive

Le prime molecole “viventi” dovevano essere in grado di replicare e svolgere funzioni

Agli inizi degli anni ‘80 furono scoperti RNA che erano in grado di ricopiare altre molecole di RNA e che svolgevano funzioni catalitiche simili a quelle svolte dagli enzimi proteici

• mRNA splicing e la traduzione sono ribo-enzimi

• l’RNA regola la stabilità di altre molecole di RNA

• parte del genoma deriva da elementi ad RNA

L’RNA è in grado di replicare se stesso

RNA RNA proteine

?

Mondo ad RNA

Solo i polimeri di RNA hanno

mostrato capacità replicativa.catalytic

(+) strandtemplate(–) strand

catalytic (+) strand copies unfolded template (–) strand

two catalytic (+) strandsand original template (–) strand

Se l’RNA può essere sia enzima che stampo, e l’RNA può replicare se stesso….ecco la prima molecola “vivente”!

Cech dimostrò che l’RNA poteva polimerizzare legamifosfodiesterici ricopiando un templato di RNA

Protogenomamolecole di RNA

autoreplicanti capaci di dirigere semplici reazioni

biochimiche

Verso un mondo a DNA

sintesi di deossiNTP da riboNTP -

sintetasi mutanti che incorporavano dNTP (retrotrascrittasi) - prime sintesi di DNA

vantaggi del DNA - desossiribonucleotidi più stabili perché manca l’OH in 2’ sullo zucchero

OH H OH OH

upstream elements

promoter elements

transcription START site

introns

exons

TRANSCRIPTIONCAPPING

SPLICINGPOLYADENYLATION

m7G

m7G AAAAAAAAAn

m7G AAAAAAAAAn

TRANSPORT

TRANSLATION

gene

pre-mRNA

polyadenylated pre-mRNA

mature mRNA

Espressione genica negli eucarioti

La regolazione post-trascrizionale

Per tanti anni lo studio della regolazione dell’espressione genica si è concentrato sul controllo trascrizionale.Il motivo risiede nel fatto che i primi geni isolati codificavano per prodotti espressi nel differenziamento terminale (prevalentemente sotto controllo trascrizionale - globine, immunoglobuline, ovalbumina)

Quando si sono isolati i geni housekeeping o quelli finemente modulati nel differenziamento cellulare ci si è accorti che molta parte della regolazione dell’espressione genica avveniva a livello post-trascrizionale

Perché studiare l’RNA?

splicing/processing sn-snoRNAs

poliadenilazione/formazione 3’ snRNAs

modificazioni (CH3,U) snoRNAs

trasporto

traduzione miRNAs

editing gRNAs

stabilità siRNAs

Regolazione post-trascrizionale

nu

cle

us

cyto

pla

sm

RNA non codificanti

large - rRNA 18+28S

Xist

small - 5S rRNA traduzione tRNA traduzione snRNAs splicing snoRNAs modificaz./process. rRNA

scRNAs controllo traduzionale gRNAs editing

piRNAs stabilità del genoma miRNAs controllo traduzionale

siRNAs stabilità dell’RNA rasiRNAs silenziamento trascriz. …?….

…?…

……

La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine

……

……

Metodi di studio Metodi di studio dell’RNAdell’RNA

• Trascrizione in vitroTrascrizione in vitro• Northern blotNorthern blot• Preparazione di estratti cellulariPreparazione di estratti cellulari• Studio delle interazioni tra RNA e proteineStudio delle interazioni tra RNA e proteine

• Trascrizione in vitroTrascrizione in vitro• Northern blotNorthern blot• Preparazione di estratti cellulariPreparazione di estratti cellulari• Studio delle interazioni tra RNA e proteineStudio delle interazioni tra RNA e proteine

Trascrizione Trascrizione in vitro in vitro dell’RNAdell’RNA

• Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un

promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)

-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)

-Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasipolimerasi

-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C

-estrarre l’RNA-estrarre l’RNA

• Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un

promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)

-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)

-Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasipolimerasi

-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C

-estrarre l’RNA-estrarre l’RNA

T7 o SP6

promoter

Sito di restrizione per *

cDNA

+ RNA pol+ NTPs+ 32P-UTP

Trascrizione

RNA radioattivo

digestionelinearizzazione

1000V 22 mA

RNA RNA circolarecircolare

RNA e DNA sono RNA e DNA sono carichi negativamentecarichi negativamente

catodocatodo

--

anodoanodo

++

Analisi diAnalisi di RNA marcato su gel e RNA marcato su gel e autoradiografiaautoradiografia

• Procedura Procedura – Isolare l’RNAIsolare l’RNA – Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o

PAGE)PAGE)– Trasferire l’RNA su membrana (nylon)Trasferire l’RNA su membrana (nylon)– Ibridazione con una sonda marcataIbridazione con una sonda marcata

• Procedura Procedura – Isolare l’RNAIsolare l’RNA – Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o

PAGE)PAGE)– Trasferire l’RNA su membrana (nylon)Trasferire l’RNA su membrana (nylon)– Ibridazione con una sonda marcataIbridazione con una sonda marcata

Northern blotNorthern blot

Elettroblot Elettroblot (per gel di (per gel di poliacrilammide)poliacrilammide)

Buffer Buffer TB 0.5XTB 0.5X

blotting paperblotting paper

gegell

blotting paperblotting papergel gel (acrilammide)(acrilammide)

MembranaMembrana(nylon)(nylon)

blotting paperblotting paper

10V10V 80 mA80 mA

ONON

Membrana (nylon)Membrana (nylon)

Polo +Polo +Polo -Polo -

Controllo, mediante colorazione con bromuro Controllo, mediante colorazione con bromuro d’etidio, del trasferimento dell’RNAd’etidio, del trasferimento dell’RNA

Membrana

prima28S rRNA

18S rRNA

Gel

dopo

A B C D

Gel

Soluzionedi sviluppo

Soluzionedi fissaggio

Lastra

mRNA per la proteina X

A B C D

Lastra autoradiograficamessa a contatto con il filtro

Lastra sviluppata

1) Ibridazione della membrana con una soluzione 1) Ibridazione della membrana con una soluzione nnnncontenente una sonda (RNA o DNA a singolo contenente una sonda (RNA o DNA a singolo nnnnfilamento) marcata radioattivamentefilamento) marcata radioattivamente2) 2) Rivelazione dei segnali

Alcune Alcune applicazioni...applicazioni...

1.1.In quali tessuti è In quali tessuti è espresso il trascritto?espresso il trascritto?

2. Come varia 2. Come varia l’espressione del l’espressione del trascritto?trascritto?

miR-124amiR-124a

miR-98miR-98

U2 snRNAU2 snRNAcontrollo di controllo di caricamentocaricamento

++stimolostimolo

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

100.000,00

120.000,00

miR-98 miR-124a

assenza di assenza di stimolostimolo

+ stimolo+ stimolo

Estratti cellulariEstratti cellulari

• ProceduraProcedura• Cellule sedimentate, incubate in tampone Cellule sedimentate, incubate in tampone

di lisi (contenente detergente non ionico)di lisi (contenente detergente non ionico)• Dopo agitazione, gli omogenati sono Dopo agitazione, gli omogenati sono

centrifugati: i supernatanti contengono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici.estratti citoplasmatici.

• I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nuclearigli estratti nucleari

• ProceduraProcedura• Cellule sedimentate, incubate in tampone Cellule sedimentate, incubate in tampone

di lisi (contenente detergente non ionico)di lisi (contenente detergente non ionico)• Dopo agitazione, gli omogenati sono Dopo agitazione, gli omogenati sono

centrifugati: i supernatanti contengono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici.estratti citoplasmatici.

• I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nuclearigli estratti nucleari

Purificazione di Purificazione di proteineproteine

• ProceduraProcedura• Si fissa ad un supporto solido una Si fissa ad un supporto solido una

molecola esca che ha affinità per la molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo)anticorpo)

• Si fa scorrere lungo il supporto solido un Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga estratto cellulare in modo che avvenga l’interazione specifica con la molecola l’interazione specifica con la molecola esca immobilizzataesca immobilizzata

• Si recuperano le proteine trattenute con Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola escacon la molecola esca

• ProceduraProcedura• Si fissa ad un supporto solido una Si fissa ad un supporto solido una

molecola esca che ha affinità per la molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo)anticorpo)

• Si fa scorrere lungo il supporto solido un Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga estratto cellulare in modo che avvenga l’interazione specifica con la molecola l’interazione specifica con la molecola esca immobilizzataesca immobilizzata

• Si recuperano le proteine trattenute con Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola escacon la molecola esca

Cromatografia per affinità

SDS-PAGE

Colorazione con Blu di Coomassie

acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

• ProceduraProcedura• si effettua una trascrizione in vitro si effettua una trascrizione in vitro

dell’RNA di interesse.dell’RNA di interesse.• Si incuba il trascritto marcato con un Si incuba il trascritto marcato con un

estratto proteico contenente la proteina estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare l’RNA di interesse che si ipotizza legare l’RNA di interesse

• Il complesso RNA-proteina viene quindi Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non analizzato su gel di acrilammide non denaturantedenaturante

• ProceduraProcedura• si effettua una trascrizione in vitro si effettua una trascrizione in vitro

dell’RNA di interesse.dell’RNA di interesse.• Si incuba il trascritto marcato con un Si incuba il trascritto marcato con un

estratto proteico contenente la proteina estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare l’RNA di interesse che si ipotizza legare l’RNA di interesse

• Il complesso RNA-proteina viene quindi Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non analizzato su gel di acrilammide non denaturantedenaturante

Analisi di Analisi di interazione RNA-interazione RNA-

proteineproteine

Analisi

interazioni

RNA-proteine:

band shift

RNA radioattivo

estratto proteico

legame specifico

RNA senza aggiunta di proteine

elettroforesiautoradiografia

complesso

RNA libero

incubazione

Saggio di band shift

RNA libero