UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE

MEDICO-FARMACEUTICHE

Biticchi Roberta

SEQUENZIAMENTO DEL DNA L’analisi di sequenze degli acidi nucleici rimane sempre il modo migliore per ottenere

informazioni precise e definitive su di un gene.I laboratori impiegati nella ricerca sul genoma e nei test genetici eseguono tutti i giorni

procedure di : sequenziamento ex novo, sequenziamento comparativo, mapping, rilevazione di mutazioni.

  METODO VANTAGGI SVANTAGGI

CHIMICO

- Non ci sono interferenze da parte di alcune strutture secondarie che si possono formare sul DNA da sequenziare;- Non è necessario utilizzare un innesco (primer);- Consente di sequenziare anche oligo piuttosto piccoli.- È più accurato

- È molto laborioso (doppio tratta- mento per ogni ottocampione); - Difficoltà nell’automatizzazione; - Bassa risoluzione. - Reagenti tossici - Richiesta maggior quantità di DNA.

TecnicheLe prime tecniche di sequenziamento del DNA sviluppate sono il metodo chimico di

Maxam e Gilbert e quello enzimatico di Sanger.

ENZIMATICO

- Ogni sottocampione è trattato una volta sola, quindi essendo meno laborioso è anche più rapido;- Più facilmente automatizzabile;- Si possono esaminare più campioni contemporaneamente;- Miglior risoluzione.- Minori richiesta di DNA

- La polimerasi si blocca e si può staccare dallo stampo. Questo causa degli oligo con estremità non deossi (falsi stop) e causano la lettura di una base inesistente.- Subcloning in vettori- Accuratezza legata all’enzima utilizzato.

Il sequenziamento affidabile dei prodotti di PCR si ottiene con il cycle sequencing.Il DNA viene amplificato con una DNA polimerasi termostabile a partire da un

unico primer di sequenza in prsenza di dideossinucleotidi (ddNTPs) che bloccano la polimerizzazione a livello di basi specifiche.

CYCLE SEQUENCING

“slab” gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea) per evitare la rinaturazione del DNA che modificherebbe la velocità di corsa

Gel di Sequenza

Marcatura RadioattivaPrimer o dNTPs marcati P32, P33, S35

Colorazione Silver StainingEvidenzia direttamente su gel le bande, senza ulteriori modificazioni,

attraverso la precipitazione di Ag

Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm -1 m)

Il forte campo elettrico a cui vengono sottoposti i campioni produce calore di 70°C

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Sequenziatori AutomaticiUno dei più importanti sviluppi nel sequenziamento del DNA, è stata

l'introduzione di apparecchiature automatiche per l'elettroforesi e l'analisi dei prodotti di sequenza.

Il segnale risultante produce un pattern di bande che correla con una sequenza di DNA .

La tecnologia del sequenziamento automatico prevede la rivelazione di frammenti di DNA, marcati in modo fluorescente man mano che si spostano lungo il gel

elettroforetico che è irradiato da un laser.

La fluorescenza emessa è raccolta da un detector.

Le apparecchiature per il sequenziamento automatico in fluorescenza consistono in genere di 3 moduli:

Un modulo elettroforetico dotato di raggio laser, di una serie di fotodiodi e di un microscopio a fluorescenza o di una camera CCD per la rilevazione.

Un modulo che ospita l'alimentatore per l'elettroforesi e per il laser

Un computer IBM o Macintosh: con il software che permette di gestire il controllo del sistema, il display, l'analisi, l'elaborazione e la stampa dei dati .

Sequenziatori a GelNei sequenziatori automatici che utilizzano slab gel, il lavoro manuale

dell'operatore consiste esclusivamente nel portare a termine le reazioni, nel versare il gel (laddove non si usa un gel preformato) e nel caricamento

dei campioni nei pozzetti.

SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO

1 Colorante - 4 Corsie Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di estensione separate (una per ogni ddNTP).

L’uso di 4 corsie aumenta però la variabilità di corsa

4 Coloranti - 1 CorsiaUnica reazione ed unica corsa, ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione

ddTTPddATP ddGTP ddCTP

Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa

Metodi di Marcatura

Marcatura dei Primers progettati con “tag” colorati a

Fluorescenza UV o Fluorescenza IR (minore background, maggiore sensibilità)

Marcatura dei Terminatori ddNTPs con fluorofori a differenti coloranti

A Fuoco Fisso Confocale

SISTEMI DI RILEVAMENTOMicroscopio a Fluorescenza

Camera CCD ( Charge - Coupled Device)

Altissima risoluzione immagine elettroferogramma. Sequenza in

pochi minuti

Assenza di Filtri

Uso di qualsiasi colorante

Camera a Lettura Multipla

Doppio Laser Doppio Rilevatore Ad es. NIR o SBS

SOFTWAREControlla e ottimizza i parametri elettroforetici Normalizza le bande

Sottrae il background

Corregge l’effetto “Smile” Adatta gli algoritmi se mobilità e spaziatura dei picchi escono dal range

ELETTROFEROGRAMMA

RiassumendoApplicazione

MappingTecnica del “Chromosome

Walking”

Sequenziamento di Library

Progetto Genoma

APPLICAZIONI SEQUENZIAMENTO

Sequenziamento Ex Novo

Uso di Primers Universali Es. M13

Sfrutta l’ Overlapping dei vari frammenti

Assemblaggio ed Allineamento delle sequenze tramite Computer

Tecnica del “Random Sequencing”

Comparativa e/o Mutazionale Uso Diagnostico

Implicazioni Terapeutiche

Applicazione non di routine

Monitoraggio pazienti in terapia

Test di Genotyping Es. HCV

APPLICAZIONI SEQUENZIAMENTO

Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo

Campione che presenta rumore di fondo sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi da parte del software

PROBLEMI

Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi

sono sempre meno definiti

Sequenza doppia dopo un tratto buono

PROBLEMI

Sequenza fuori scala

Regione ricca in GC

PROBLEMI

A Lettura Bidirezionale

Rilevazione nell’infrarosso con bassissimo background e elevata sensibilità

Lettura fino a 1400 basi con accuratezza del 99%

Doppio Laser a Diodi

Non necessita di preamplificazione o di elevata purezza del templato

Il software recupera i dati, li controlla e li rende accessibili in rete

Possibilità di usare anche terminatori marcati alternativamente ai primers

SEQUENZIATORI GLOBAL IR2

Nei sistemi automatici in cui l'elettroforesi avviene nei capillari le procedure manuali sono praticamente inesistenti.

Il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa

Esegue la separazione elettroforetica

I frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare

SEQUENZIATORI CAPILLARISEQUENZIATORI CAPILLARI

1 Capillare

16 Capillari

96 Capillari (Scala di Produzione)

Richiede campioni privi di: Sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati.

TERMINATORI BIGDYE

Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker

Vantaggi:

Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità maggiore, facilità

interpretativa per A e G attigue

D A

CONCLUSIONI

Il sequenziamento degli acidi nucleici rimane il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene

Con l’introduzione del sequenziamento automatico si sono ridotte notevolmente:

Le operazioni manuali per una migliore riproducibilità ed accuratezza

Eliminazioni di sostanze nocive all’operatore

Riduzione dei costi dei consumabili

L’ introduzione dell’elettroforesi capillare con un sistema di rilevazione molto sensibile ha ridotto le quantità di DNA per campione rispetto al sistema

a slab gel. Inoltre il vantaggio maggiore è rappresentato dall’eliminazione delle operazioni manuali, con il risultato di una maggiore riproducibilità ed

affidabilità dei risultati.