Embed Size (px)
Citation preview
Univerzita Karlova
Přírodovědecká fakulta
Študijní program: Virologie
Študijní obor: Genetika, molekulární biologie a virologie
Bc. Mária Dubišová
Štúdium výskytu genotypov ľudského parvovírusu B19 u pacientov Fakultnej
nemocnice Motol
Human parvovirus B19 genotype study among the patients of Motol University
Hospital
Diplomová práca
Školiteľ: MUDr. Petr Hubáček, Ph.D.
Praha, 2018
Prohlášení:
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla
všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část
nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze, 30.04.2018
Podpis
Poďakovanie:
Rada by som poďakovala MUDr. Petrovi Hubáčkovi, Ph.D. a Mgr. Miroslavovi
Zajacovi za ochotu pri vedení mojej diplomovej práve a možnosť prácu
vypracovať na Oddelenií Virológie vo FN Motol. Taktiež by som rada poďakovala
celému kolektívu virologického laboratória za ich pomoc a vytvorenie
príjemnéhho pracovného prostredia.
Abstrakt
Parvovírus B19 je bežný ľudský patogén, ktorý typicky infikuje erytroidné
progenitory a spôsobuje hematologické problémy ako sú najmä anémia
a aplastická kríza. Klinická manifestácia pacienta najčastejšie závisí od jeho
imunologického statusu. U imunokompromitovaných pacientov po transplantácií
môže spôsobiť závažné klinické problémy. V tejto práci bolo testovaných viac ako
1500 vzoriek od 90 pacientov, ktorí v roku 2015 podstúpili HSCT, na prítomnosť
PVB19. Práca popisuje incidenciu vírusu a zároveň dve typické obdobia nástupu
infekcie u pacientov po transplantácií. Napriek tomu, že viaceré zdroje uvádzajú
negatívny vplyv infekcie PVB19 na prežitie alogenného štepu pacientov, táto
práca toto tvrdenie nepotvrdila. Taktiež výsledky tejto práce naznačujú, že
alogénny-štep nie je zdrojom transmisie, ale že sa jedná pravdepodobne
o reaktiváciu po dlhodobej perzistentnej, prípadne latentnej, PVB19 infekcií.
PVB19 sa člení do 3 genotypov. Genotyp 1 je najrozšírenejší, genotyp 2 je za
posledné 10-ročia v oblastiach Európy veľmi vzácny a genotyp 3 sa vyskytuje
najmä v tropických lokalitách. Táto práca ako prvá popisuje rozloženie genotypov
v Českej republike. Viac ako 130 vzoriek od 125 PVB19 pozitívnych pacientov,
uskladnených vo FN Motol od roku 2004 do 2017, bolo genotypizovaných na
základe analýzy NS1-VP1u regiónu. Až na 3 pacientov, kedy bol detekovaný
vzácny genotyp 2 (2,4%) sa jednalo vždy o genotyp 1.
Kľúčové slová: parvovírus B19, anémia, alogénna HSCT,
imunokompromitovaný pacient, incidencia, GVHD, genotyp
Abstract
Parvovirus B19 is a common human pathogen that typically infects
erythroid progenitors and causes hematological problems such as anemia and
aplastic crises. The clinical presentation depends mainly on the immunological
status of the patient. PVB19 can cause serious clinical disorders in
immunocompromised patients after transplantation. More than 1500 samples
from 90 patients who passed the HSCT in 2015 were tested for the presence of
PVB19 in this work. This work describes the incidence of the virus and two typical
periods of onset of infection in patients after the transplantation. Although several
sources report the negative effect of PVB19 infection on the survival of allogeneic
graft patients, this work did not confirm this assertion. Also, the results of this
work suggest that allogenic grafts are not the main source for transmission, but
that it is likely to be reactivated after long-term persistent or latent PVB19
infections.
PVB19 is divided into 3 genotypes. Genotype 1 is the most widespread, genotype
2 is very rare in Europe for the last 10 years, and genotype 3 occurs mainly in
tropical localities. This work as the first describes the distribution of genotypes in
the Czech Republic. More than 130 samples from 125 PVB19 positive patients,
stored in the Motol University Hospital from 2004 to 2017, were genotyped based
on the NS1-VP1u region analysis. Up to 3 patients when a rare genotype 2 was
detected (2.4%) were genotype 1.
Keywords: parvovirus B19, anemia, allogeneic HSCT, immunocompromised
patients, incidence, GVHD, genotype
Obsah
1 Úvod .............................................................................................................. 14
2 Ciele práce .................................................................................................... 15
3. Literárny prehľad .......................................................................................... 16
3.1 Parvovírus B19 ....................................................................................... 16
3.2 Vírusové proteíny .................................................................................... 16
3.2.1 Kapsidové proteíny-VP1, VP2 .......................................................... 16
3.2.2 Neštruktúrny proteín, NS1 ................................................................ 17
3.3 Genóm .................................................................................................... 17
3.4 Vstup do bunky ....................................................................................... 19
3.4 Infekcia .................................................................................................... 20
3.4 Replikácia ............................................................................................... 22
3.5 Imunitná odpoveď a prevalencia ............................................................. 23
3.6 Klinický obraz infekcie ............................................................................. 25
3.7 Perzistencia ............................................................................................ 26
3.8 Trasplantácia hematopoetických kmeňových buniek .............................. 27
3.8.1 Infekcia pacientov po transplantácií.................................................. 28
3.9 Genotypy ................................................................................................. 30
3.9.1 Genotyp 1 ......................................................................................... 30
3.9.2 Genotyp 2 ......................................................................................... 30
3.9.3 Genotyp 3 ......................................................................................... 31
3.9.4 Historická analýza ............................................................................ 31
4. Materiál a Metódy ......................................................................................... 33
4.1 Materiál ................................................................................................... 33
4.1.1 Materiál pre detekciu PVB19 pomocou polymerázovej reťazovej
reakcie v reálnom čase.............................................................................. 33
4.1.2 Materiál pre genotypizáciu vzoriek ................................................... 34
4.1.3 Chemikálie použité v práci ................................................................ 35
4.2 Metódy .................................................................................................... 36
4.2.1 Izolácia DNA ..................................................................................... 36
4.2.1 Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase .............................. 36
4.2.2 Genotypizácia ................................................................................... 38
4.2.3 Elektroforéza .................................................................................... 39
4.2.4 Sekvenovanie .................................................................................. 39
4.2.3 Fylogenetická analýza ...................................................................... 40
4.2.4 Štatistická analýza ........................................................................... 40
5. Výsledky ....................................................................................................... 41
5.1 Pozitívni pacienti na infekciu PVB19 ...................................................... 41
5.2 Nástup infekcie PVB19 ........................................................................... 45
5.2 Koinfekcia pacientov s EBV a CMV ........................................................ 46
5.3 Výskyt relapsu, akútneho GVHD (aGVHD), chronického GVHD (cGVHD)
a úmrtnosť pacientov .................................................................................... 48
5.4 Genotypizácia ......................................................................................... 49
6 Diskusia......................................................................................................... 53
7 Súhrn ............................................................................................................ 57
8 Zoznam použitej literatúry ............................................................................. 58
Zoznam skratiek
AA Aplastická anémia Aplastic anemia
aGVHD Akútna GVHD Acute GVHD
ALL Akútna lymfoblastická leukémia Acute lymfoblastic leukemia
AML Akútna myeloidná leukémia Acute myeloid leukemia
bp Páry bazí Base pair
cGVHD Chronická GVHD Chronic GVHD
CLL Chronická lymfocytárna leukémia Chronic lymphocytic leukemia
CML chronická myeloidná leukémia Chronic myeloid leukemia
CMML Chronická myelomonocytická leukémia
Chronic myelomonocytic leukemia
DNA Deoxyribonukleová kyselina Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynukleotid trifosfát Deoxynucleotid triphosphate
dsDNA Dvojvláknové DNA Double stranded DNA
EBV vírus Epstein-Barrovej Epstein-Barr virus
EPO Erytropoetín Erythropoetin
Gb4 Globotetraosylceramidový receptor-P antigén
Globotetraosylceramid receptor-P antigen
GVHD Reakcia štepu proti hostiteľovi Graft versus host disease
HHV6 Ľudský herpes vírus 6 Human herpes virus
HLA Ľudský leukocytový antigén Human leucocyte antigen
HSCT Transplantácia hematopoetických kmeňových buniek
Hematopoietic steam cell transplatation
IFN Interferón Interferon
Ig Imunoglobulín Immunoglobuline
IMF Idiopatická myelofibróza Idiopathic myelofibrosis
IVIg Terapia intravenóznym podávaním imunoglobulínov
Intravenous Immunoglobulin therapy
JAK2 Jánusová kináza 2 Janus kinase 2
kDa Kilodalton Kilodalton
MDS Myelodysplastický syndróm Myelodysplastic syndrome
mM Milimól Milimolar
MPS Mukopolysacharidóza Mucopolysaccharidosis
mRNA Mediátorová RNA Messenger RNA
NCBI Národné Centrum pre Biotechnologické Informácie
National Center for Biotechnology Information
NHL Non-Hodgkin lymfóm Non-Hodgkin lymphoma
NS1 Neštruktúrny proteín 1 Nonstructural protein 1
NSBS NS1-väzobné miesta NS1-binding site
ORF Otvorený čítací rámec Open reading frame
PCR Polymerázová reťazová reakcia Polymerase chain reaction
PVB19 Parvovírus B19 Parvovirus B19
qPCR PCR v reálnom čase Real-time PCR
RFLP-PCR Polymorfyzmus restrikčných fragmentov PCR
Restriction fragment length polymorphism PCR
Sp Proteín špecificity Specificity protein
ssDNA Jednovláknové DNA Single stranded DNA
TBE Tris-borát EDTA pufor Tris-borate EDTA buffer
trs Miesto konečného rozhodnutia Terminal resolution site
VP1 Vírusový proteín 1 Viral protein 1
VP1u Unikátny región VP1 VP1 unique region
VP2 Vírusový proteín 2 Viral protein 2
µl Mikroliter Microliter
14
1 Úvod
Parvovírus B19 je jeden z najmenších známych DNA vírusov, ktorý
špecificky infikuje len ľudské bunky. Jeho genóm je jednovláknový a vírus je
neobalený. Vstup do hostiteľskej bunky mu umožňuje prítomnosť Gb4 receptoru
(Gb4-globotetraosylceramid receptor) na jej povrchu. Tento receptor sa
nachádza vo vysokých hladinách na erytroídnych progenitoroch, no je možné ho
pozorovať aj na iných typoch buniek, čo umožňuje infekciu rôznych tkanív.
Infekcia PVB19 môže byť na jednej strane úplne asymptomatická, na strane
druhej môže mať fatálne následky. Najčastejšie k nej dochádza v detskom veku,
kedy vírus môže vyvolať exantémové 5. detské ochorenie. Okrem toho je ale
nákaza spojená s radou ďalších klinických prejavov ako je artropatia, hydrops
plodu, hepatitída či niektoré hematologické a neurologické ochorenia. Klinická
prezentácia PVB19 infekcie je daná ako kondíciou jedinca, tak aj vekom a stavom
imunitného systému. Vírus sa stáva nebezpečným v prípade
imunosuprimovaných pacientov, u pacientov s poruchou krvotvorby alebo
v tehotenstve, kedy infekcia môže viesť k odumretiu plodu.
Táto diplomová práca sa vo svojej prvej časti zaoberá pacientami, ktorí
podstúpili alogénnu transplantáciu hematopoetických kmeňových buniek (HSCT-
hematopoietic steam cell transplantation). Týmto pacientom sú po dobu najmenej
6 mesiacov podávané silné imunosupresíva, čím sa zvyšuje riziko aj v prípade
infekcie najbežnejšími patogénmi. Najčastejším prejavom po infekcií PVB19
týchto pacientov je anémia, no tiež môže vyvolávať hepatitídu, pneumonitídu či
apláziu červených krviniek.
Druhá časť práce sa zameriava na popis genotypov PVB19. Vírus je
delený na základe analýzy NS1-VP1u nukleotidovej sekvencie, čo umožňuje
začlenenie vírusov do troch genotypov. Genotyp 1 je predominantný a vyskytuje
sa na celom svete, genotyp 2 je v oblastiach Európy za posledné 10-ročia vzácny
a genotyp 3 sa špecificky nachádza v tropických oblastiach.
Výsledky tejto diplomovej práce by mali prispieť k popisu výskytu a vplyvu
PVB19 u pacientov podstupujúcich transplantáciu hematopoetických kmeňových
buniek najmä na rozvoj chronickej a akútnej reakcie štepu proti hostiteľovi,
relapsu ochorenia a prežitie pacienta a taktiež popísať výskyt genotypov v rámci
Českej republiky.
15
2 Ciele práce
- popísať výskyt PVB19 u pacientov, ktorý podstúpili alogénnu transplantáciu
hematopoetických kmeňových buniek
- určiť prípadný vplyv na stav pacientov po HSCT, najmä na relaps ochorenia,
rozvoj akútnej a chronickej reakcie štepu proti hostiteľovi prípadne na ich prežitie
- genotypizovať archívne vzorky pozitívne na PVB19, popísať rozloženie v rámci
Českej republiky a porovnať toto rozloženie so susednými zemami
16
3 Literárny prehľad
3.1 Parvovírus B19
Parvovírus B19 (PVB19) je malý, neobalený, jednovláknový DNA vírus (ssDNA-
single stranded DNA), ktorý je zaradený do rodu Erythrovírusov (čeľaď
Parvoviridae) (International Committe on Taxonomy of Viruses). Taktiež je to
ľudský patogénny vírus, ktorý sa radí medzi autonómne vírusy a teda jeho
replikácia je nezávislá na pomocnom víruse (Wang et al., 1995). Jeho prenos je
primárne spôsobený respiračnými sekrétmi, menej často krvou a krvnými
derivátmi a tiež bol potvrdený jeho prenos z matky na plod v priebehu
tehotenstva (Norbeck et al., 2002).
Od roku 1975, keď bol tento vírus identifikovaný Yvonne Cossart (Cossart
et al., 1975), bolo popísané široké spektrum klinických syndrómov zahrňujúce
Erythema Infectiosum, hydrops plodu, artritídu či hepatitídu. Klinická
manifestácia je závislá na klinickom a hematologickom stave hostiteľa,
závažnejšie prejavy infekcie môžu byť u imunokompromitovaných pacientov,
kedy môže vyvolávať chronickú apláziu červených krviniek, alebo u pacientov
s poruchami krvotvorby.
3.2 Vírusové proteíny
3.2.1 Kapsidové proteíny-VP1, VP2
Ikosahedrálna vírusová kapsida je zložená zo 60 kapsomér (viz.obr.č.1),
96% kapsidy je tvorené majoritným štruktúrnym proteínom VP2 (VP2-viral protein
2) (58 kDa) a 4% minoritným štruktúrnym proteínom VP1 (VP1-viral protein1) (84
kDa) (Ozawa et al., 1987). Tieto dva kapsidové proteíny sú identické až na N-
koniec VP1, ktorý tvorí 226 aminokyselín. Táto oblasť sa nazýva unikátny región
VP1 (VP1u-VP1 unique region) (Agbandje et al., 1994) a je hlavným antigénnym
cieľom pre neutralizačné protilátky (Young and Brown, 2004). VP1 je silným
inhibítorom Na+/K+ ATPázy vďaka jeho aktivite podobnej fosfolipáze A2, čo má
pravdepodobný efekt na patofyziológiu pri PVB19 infekcií. Táto aktivita VP1
umožňuje prienik cez epiteliálnu bariéru (Almilaji et al., 2013; Chiu et al., 2014).
Proteín VP2 umožňuje integráciu s bunkovým globotetraosyl-ceramidovým
17
receptorom a tým naviazanie na hostiteľskú bunku (Brown et al., 1993). Leisi et
al. (Leisi et al., 2013) vo svojej práci tiež poukazuje na dôležitosť VP1u pri vstupe
do permisívnych buniek. VP1u interaguje s bunkovým koreceptorom počas
skorého naviazania vírusu na povrchový receptor, čo je dôležitý krok pri
internalizácií vírusu. Za túto internalizáciu je zodpovedných 5-80 aminokyselín vo
VP1u oblasti.
3.2.2 Neštruktúrny proteín, NS1
NS1 (NS1-nonstructural protein 1) je multifunkčný proteín, ktorý je dôležitý
počas celého životného cyklu vírusu. Jeho veľkosť je 77 kDa (Ozawa and Young,
1987). Uplatňuje sa pri regulácií transkripcie, replikácie, aktivácií apoptózy a tiež
sa podieľa na indukcií zastavenia bunkového cyklu v G2 fáze hostiteľskej bunky.
Tento kontrolný bod je dôležitý pre zastavenie erytropoézy u erytroidných
progenitorov a smrť bunky. Zastavenie bunkového cyklu v G2 fázy je
sprostredkované pomocou C-terminálnej domény NS1 proteínu, ktorá aktivuje
ATR-CDC25-CDk1 dráhu (Xu et al., 2017; Zhi et al., 2006). Taktiež stimuluje
imunitnú odpoveď prostredníctvom aktivácie interferónovej dráhy (IFN-interferon)
a produkciu IFNα a IFNβ (Wu et al., 2016).
3.3 Genóm
Jednovláknový genóm je zložený z približne 5 600 nukleotidov. Oba konce
genómu sú tvorene identickými invertovanými terminálnymi repetíciami o dĺžke
383 nukleotidov. Distálnych 365 nukleotidov tvorí palindrómy, ktoré formujú
vlásenkovú štruktúru, ktorá je potrebná pre „priming“ DNA replikácie (Deiss et
al., 1990). Na pravej strane genómu gény kódujú dva kapsidové proteíny VP1
a VP2, ich sekvencia je kolineárna a vznikajú alternatívnym zostrihom. Genóm
PVB19 kóduje na ľavej strane neštruktúrny proteín NS1.
18
Obr.č.1: Ikosahedrálny virión a štruktúra genómu PVB19 (prevzaté a upravene
podľa (Marano et al., 2015).
Ako kompenzáciu na tento extrémne malý genóm, využíva PVB19 mnohé
mechanizmy na zvýšenie kódujúceho potenciálu genómu, ako napríklad využitie
alternatívneho zostrihu alebo prekrývajúce sa otvorené čítacie rámce (ORF-open
reading frame) (Ozawa et al., 1987).
Transkripcia prebieha z jedného promotoru p6, ktorý sa nachádza na
5´palindróme a reguluje syntézu všetkých vírusových transkriptov (Blundell et
al., 1987; Doerig et al., 1990). Aktivita promotoru je regulovaná väzbou NS1
proteínu v tejto oblasti. Väzba NS1 môže byť priama pomocou naviazania na
špecifickú sekvenciu AGGGCGGA, ktorá sa nachádza na ľavej aj pravej strane
vlásenkového regiónu vírusového genómu. Druhá možnosť je väzba nepriama
prostredníctvom bunkových transkripčných proteínov Sp1/Sp3 (Sp-specificity
protein) (Raab et al., 2002). Počas transkripcie je generované alternatívnym
zostrihom a polyadenyláciou približne 12 transkriptov z jedinej mRNA (Guan et
al., 2008).
19
3.4 Vstup do bunky
Vstup PVB19 do hostiteľskej bunky, je podmienený prítomnosťou Gb4
receptorov. Tieto receptory sa typicky vyskytujú na povrchu skorých a neskorých
erytroidných progenitorov (Srivastava and Lu, 1988) a okrem toho boli
identifikované v rade ďalších ľudských tkanív (viz.obr.č.2). Gb4 receptor
umožňuje naviazanie PVB19 prostredníctvom kapsidového proteínu VP2.
V prípade dedičného defektu, ktorý spôsobí neprítomnosť Gb4 receptoru na
povrchu buniek, infekcia PVB19 nie je možná a jedinci sa stávajú prirodzene
rezistentní (Brown et al., 1994). Gb4 receptor je síce nevyhnutný ale nie
dostačujúci faktor pre produktívnu infekciu PVB19. Vstup do bunky je tiež
sprostredkovaný α5β1 integrínmi, vďaka ktorým sa bunky stávajú permisívne.
Tento koreceptor sa nachádza vo vysokých hladinách práve na skorých
a neskorých erytroídnych progenitoroch (Weigel-Kelley et al., 2003).
Obr.č.2: Distribúcia Gb4 receptoru v ľudských tkanivách (upravené podľa (Cooling,
2015)).
(GSL- glykosfingolipid, HUVEC – ľudské endotelové bunky z pupočníkovej žily)
20
Ďalším popísaným koreceptorom pre vstup PVB19 do bunky, je
heterodimérný DNA-väzobný proteín Ku80 (Munakata et al., 2005). Tento
proteín ma mnoho rolí v jadrových procesoch a bol identifikovaný na membráne
eukaryotických buniek (Prabhakar et al., 1990). Prítomnosť Ku80 na povrchu
imunitných buniek vysvetľuje infekciu PVB19 v neerytroídnych bunkách.
Stimuláciou bunkových receptorov PVB19 dochádza k aktivácií signálnych dráh
hostiteľských buniek, čo by mohlo spôsobovať funkčné zmeny imunitných buniek
pri akútnej či dlhotrvajúcej B19 infekcií alebo v kĺboch počas reumatoídnej
artritídy (Munakata et al., 2005).
Okrem klasickej receptorom sprostredkovanej endocytózy, bol popísaný
vstup PVB19 do monocytov a endoteliálných buniek prostredníctvom protilátkovo
závislému mechanizmu ADE (antibody-dependent enhacement) (von Kietzell et
al., 2014; Munakata et al., 2006). Napriek tomu, po tomto vstupe nedochádza
k produktívnej infekcií a pravdepodobne vedie k akumulácií vírusovej DNA
v bunkách, ktoré nie sú permisívne.
3.4 Infekcia
Infekcia bunky je zahájená naviazaním PVB19 na špecifický receptor.
Vstup do bunky prebieha endocytózou a pomocou klatrínových vačkov je
prenesený do endozómu, odkiaľ je transportovaný do lyzozómu. Nízke pH
lyzozómu zmení lokalizáciu fosfolypázy A2 z vnútra natívnej kapsidy von. Tento
lypolytický enzým narušuje membránu, čím sa dostáva vírus do cytosolu.
Transport k jadru zabezpečujú mikrotubuly a aktínový cytoskelet. Navigáciu
vírusu do jadra umožňuje jadrový lokalizačný signál na NS1 proteíne, čo vedie
k jadrovej translokácií. V jadre dochádza k replikácií vírusu a zostaveniu viriónov,
tie sú potom uvoľnené do extracelulárneho priestoru (Tu et al., 2015). Na
zvýšenie replikačného potenciálu vírusu, PVB19 indukuje zastavenie bunkového
cyklu v G2 fázy pomocou NS1 proteínu a jeho asociáciou s E2F transkripčnými
faktormi (viz.obr.č.3). Najnovšia štúdia uvádza, že PVB19 je schopný sa
integrovať do genómu erytroídnych progenitorov. Táto integrácia pravdepodobne
umožňuje vírusu dlhodobo pretrvávať v latentnej fáze. Možný mechanizmus,
ktorý následne spustí reaktivácie PVB19 je pomocou superinfekcie s pomocným
vírusom ako napríklad s ľudským herpes vírusom 6 (HHV6-human herpes virus
21
6), vírusom Epstein-Barrovej (EBV-Epstein-Barr virus) či adenovírusom (Janovitz
et al., 2017).
Obr.č.3: V rannom štádiu infekcie dochádza k asociácií NS1 proteínu s E2F4 alebo
E2F5 transkripčnými faktormi, čo zvyšuje hladiny E2F a spôsobuje zastavenie v G2 fázy
bunkového cyklu. Súčasne dochádza k downregulácií cieľových génov pre E2F
a nakoniec pozastavuje erytroídnu diferenciáciu. Tým, že sa aktivujú transkripčné faktory
pre G2 fázu alebo DNA opravné proteíny, dochádza k zvýšeniu DNA replikácie a RNA
transkripcie. Vďaka tomu sa aktivuje p53 signálna transdukcia a upregulujú sa E2F7
a E2F8 transkripčné faktory ako odpoveď na poškodenú DNA, čo blokuje bunkový cyklus
(upravené podľa(Wan et al., 2010)).
22
3.4 Replikácia
Kódovacia kapacita PVB19 je veľmi limitovaná pri veľkosti genómu 5 kb,
preto tento autonómny parvovírus je vysoko závislý na syntetickom aparáte
a programovaní hostiteľskej bunky.
Na 5´ a 3´konci genómu sú identické invertované terminálne repetície,
ktoré sa skladajú a tým formujú vlásenkové štruktúry (Deiss et al., 1990). Ako
primer pre hostiteľskú DNA polymerázu slúži vlásenková štruktúra na 3´konci.
Replikačné proteíny predlžujú ssDNA formu do dvojvláknovej DNA (ds-double
strand DNA) a dochádza ku kovalentnému prepojeniu 3´a 5´konca, čím vzniká
čiastočne cirkulárna DNA. NS1 proteín sa kovalentne viaže do tzv. miesta
konečného rozhodnutia (trs-terminal resolution site) kde vytvorí nick. Dochádza
k vytvoreniu nového primeru, ktorý umožní premiestnenie vlákna a replikáciu
DNA modelom valivej vlásenky. Vírusový genóm je rozštiepený pomocou NS1
proteínu a ssDNA sú zabalené do kapsidy (Luo and Qiu, 2015).
Oblasť Ori bola identifikovaná ako 67 nt dlhá a pozostáva z trs a NS1
väzobného miesta (NSBS-NS1 binding site). V oblasti NSBS sa nachádzajú GC-
bohaté oblasti, pričom NSBE1 a NSBE2 sú identické (Guan et al., 2009). Práve
tieto oblasti Ori sú tie, ktoré umožňujú naviazanie NS1 proteínu. NSBE3 a NSBE4
pravdepodobne poskytujú miesto na naviazanie potencionálnych bunkových
faktorov (Tewary et al., 2014).
Väčšina hematopoetických progenitorov ma nízke hodnoty pO2
a proliferácia erytroidných progenitorov nastáva práve v hypoxickom prostredí
(Chow et al., 2001). Počas hypoxie sa vylučuje erytropoetín (EPO), ktorý je
nevyhnutný pre diferenciáciu, vývoj a prežitie erytroídnych progenitorov počas
neskorších štádií dozrievania (Grebien et al., 2008). Po väzbe EPO na EPO
receptor, dochádza k signalizácií, ktorá je nevyhnutná pre replikáciu PVB19
(Chen et al., 2010). Bola preukázana up-regulácia expresie vírusových proteínov
a replikácie redukciou dodaného kyslíku. Hypoxia vedie k zvýšenému množstvu
buniek exprimujúcich vírusové proteíny (Pillet et al., 2004). Tieto hypoxické
podmienky upregulujú signálny prevodník Janusová kináza 2 (JAK2-Janus
kinase 2) a aktivátor transkripcie 5 (STAT5), ktorý je nevyhnutný pre replikáciu
vírusu. Fosforylovaný STAT5 špecificky interaguje s vírusovým Ori počas
infekcie, čo umožňuje integráciu s MCM (Minichromosome Maintenance protein
23
complex) komplexom, čo naznačuje, že fosforylovaný STAT5 uľahčuje replikáciu
náborom bunkového replikačného aparátu do miesta Ori vírusu (Ganaie et al.,
2017)
3.4.1 Inhibícia replikácie
Inhibítory replikácie sú potenciálne vhodné prostriedky pri liečbe infekcie.
Boli prezentované tri lieky, ktoré sa preukázali ako vhodné. Prvý je aktívny
metabolit nazývaný cidofovir, ktorý špecificky inhiboval replikáciu PVB19, ale
neinterferoval s DNA syntézou a metabolickou aktivitou bunky (Bonvicini et al.,
2015). Druhým inhibítorom replikácie u erytroidných progenitorov je hydroxyurea,
ktorá sa využíva pri liečbe kosáčikovitej anémie (Bonvicini et al., 2017). Ďalším
potencionálnym liekom je pimozide, ktorý špecificky inhibuje fosforyláciu STAT5,
bez aktivácie JAK2 alebo signálnych dráh s kinázou spojených (Bar-Natan et al.,
2012; Ganaie et al., 2017).
3.5 Imunitná odpoveď a prevalencia
Kritickým krokom infekcie je internalizácia vírusu do permisívnych buniek,
kedy dochádza k aktivácií humorálnej imunitnej odpovede. Inkubačná doba
PVB19 sa pohybuje v rozmedzí 4-14 dní.
Pri infekcií primárne dochádza k zvýšeniu imunoglobulínu M (Ig-
immunoglobuline), tieto protilátky sú namierené proti majoritnému kapsidovému
proteínu VP2, pričom dochádza k poklesu virémie. IgM spôsobujú zmeny
konformácie epitopov na povrchu kapsidy a pretrvávajú niekoľko týždňov po
akútnej virémií. Následne sú IgM nahradené IgG, ktoré pretrvávajú celoživotne
a teda zabezpečujú dlhodobú imunitu. Napriek minoritnému zastúpenie VP1u
v kapside, IgG protilátky sú namierené práve proti epitopom nachádzajúcim sa
v tejto oblasti a zodpovedajú za dominantnú imunitnú odpoveď (Kurtzman et al.,
1989). Počas akútnej infekcie je vírusová nálož extrémne vysoká, až 1013 IU/ml
periférnej krvi (Young and Brown, 2004). Po imunitnej reakcií sú stále niekoľko
mesiacov až rokov detekovateľné nižšie hladiny DNA vírusu (101-104 IU/ml)
u imunokompetentných jedincoch (Musiani et al., 1995). Počas infekcie
dochádza takisto k rozvoju bunkovej imunitnej odpovedi. Aktivácia cytotoxických
24
T lymfocytov a tvorba imunokomplexov je zodpovedná za vznik symptómov
spojených s infekciou.
Graf č.1 nám poukazuje na závislosť medzi vekom jedincov a prevalenciou
PVB19. Prevalencia u detí mladších ako 9 rokov je približne 26%, vo veku od 10-
19 sa zvyšuje na 56% a v staršej populácií sa pohybuje už pri 66,6-73,2%.
Taktiež je zrejmé, že prevalencia nesúvisí s pohlavím jedincov (Mor et al., 2016).
.
Graf č.1: Prevalencia PVB19 na základe IgG-pozitívnych prípadov zaradených podľa
veku a pohlavia (n=1008) (Mor et al., 2016).
25
3.6 Klinický obraz infekcie
Infekcia PVB19 je spojená s celou radou klinických prejavov a je závislá
na hematologickom a klinickom stave jedinca. U zdravých jedincov môže byt
úplne asymptomatická alebo vyvolávať benígne ochorenia. Závažnejšie klinické
prejavy nastávajú u pacientov s potlačenou imunitou alebo u jedincov s poruchou
tvorby erytrocytov.
Obr.č.4: Vírusový, hematologický a klinický priebeh po infekcií PVB19
u imunokompetentných jedincov (upravene podľa (Marano et al., 2015)).
26
3.7 Perzistencia
Po akútnej infekcií a eliminácií PVB19 z periférnej krvi, je vírusový genóm
schopný dlhodobo perzistovať v rade ľudských tkanív. Amplifikačné testy
potvrdili, že PVB19 DNA pretrváva v niektorých tkanivách u zdravých jedincov
niekoľko rokov až desaťročí (Söderlund-Venermo et al., 2002). Jeho perzistencia
bola popísaná napríklad v pokožke, synoviálnej membráne, pečeni a tiež v B
bunkách pochádzajúcich z tonsil (Norja et al., 2006; Pyöriä et al., 2017).
Perzistencia v kostrových pozostatkoch umožnila historickú analýzu vírusových
genotypov (Toppinen et al., 2015).
Najvyššia frekvencia perzistencie u asymptomatických pacientov je v koži
(76%), potom nasleduje myokard (63%), synovium (55%). Výrazne nižšie
hodnoty perzistencie boli v kostnej dreni (20%) aj napriek tomu, že tam dochádza
k replikácií vírusu. U týchto pacientov bola detekovaná nízka vírusová nálož
a nedostatok expresie vírusových proteínov. (Corcioli et al., 2008). V súčasnosti
nie je známe, či tieto bunky produkujú infekčné partikule a či vírusový genóm
môže byť reaktivovaný na produktívnu replikáciu. Je teda otázne, či nie je vírus
potencinálne prenosný a či nemá negatívny efekt u pacientov po alogénnej
transplantácií hematopoetickými kmeňovými bunkami.
27
3.8 Trasplantácia hematopoetických kmeňových buniek
Trasplantácia hematopoetických kmeňových buniek, či už autológna alebo
alogénna, sa využíva na obnovenie hematopoetických funkcií u pacientov,
ktorých kostná dreň alebo imunitný systém je poškodený alebo chybný. Táto
transplantácia, známa tiež ako transplantácia kmeňových buniek, bola pôvodne
koncipovaná ako liečba ochorení vyvolaných ožiarením a neskôr rakoviny.
V súčasnosti sa využíva na liečbu rady ochorení ako sú napríklad hematologické
a lymfoidné rakoviny. V prípade, že pri transplantácií nejde o geneticky
identického jedinca, sa táto transplantácia nazýva alogénna. Pri alogénnej
transplantácií môže dôjsť k reakcií štepu proti hostiteľovi (GVHD-graft versus
host disease), ktorá je vyvolaná imunologickou reakciou darcovských lymfocytov
proti príjemcovým tkanivám.
Na začiatku 60-tych rokov boli identifikované HLA (human leucocyte
antigen) gény, čo umožnilo úspešnú alotransplantáciu bez GVHD. Tieto gény sa
dedia ako haplotypy takže súrodenci majú šancu 1:4, že budú mať HLA rovnaké
(Gatti et al., 1968). V prípade, že sa nenájde zhoda medzi rodinnými
príslušníkmi, hľadá sa vhodný darca v medzinárodných registroch darcov.
Hematopoetické kmeňové bunky je v súčasnosti možné získať z kostnej
drene, periférnej krvi alebo z pupočníkovej krvi. V prípade alogénej
transplantácie, môže dochádzať ku vážnym komplikáciám ohrozujúcim život
príjemcu. Medzi komplikácie patria napríklad GVHD, relaps ochorenia, syndróm
sínusoidnej obštrukcie alebo rôzme infekcie pacienta (Arnaout et al., 2014).
Infekčné ochorenia pacientov môžu byť bakteriálneho, mykotického
a vírusového pôvodu. Stav pacientov po transplantacií je zčasti závislý na
včasnej diagnostike infekcií a následnej liečbe.
V tejto práci detekujeme PVB19 v prvých 6-tich mesiacoch po
transplantácií, kedy sú pacienti silno imunosuprimovaní.
28
3.8.1 Infekcia pacientov po transplantácií
Imunokompromitovaný jedinec je definovaný ako jedinec, ktorého
prirodzené imunitné mechanizmy sú narušené a jeho infekcia môže spôsobiť
život ohrozujúce stavy. Takýto pacienti sú typicky kontrolovaní na prítomnosť
rady vírusov, medzi ktoré patrí CMV, herpes simplex vírus, EBV a ďalšie.
V prípade potvrdenia infekcie sa zaháji liečba pomocou virostatík.
U imunokompromitovaných pacientov po infekcií PVB19 nedochádza
k vzniku typických príznakov ako je artropatia alebo vyrážka. Tieto príznaky môžu
vznikať sekundárne po podaní imunoglobulínov a následným vytvorením
imunokomplexov, ktoré sa ukladajú v pokožke a kĺboch.
Prvý popísaný prípad infekcie PVB19 po transplantácií bol popísaný v roku
1986 u pacienta, ktorý podstúpil transplantáciu obličiek (Neild et al., 1986).
U pacientov po transplantácií solídnych orgánov sa incidencia PVB19 pohybuje
od 23-31%, pričom 12% má viac ako dve pozitívne vzorky (Cavallo et al., 2003;
Ki et al., 2005).V prípade transplantácie HSC bolo incidencia v práci Schleuninga
et. al. popísaná ako 15% (Schleuning et al., 1999). Medián nástupu ochorení
vyvolaných infekciou PVB19 je 7 týždňov po transplantácií (Eid et al., 2006).
Počas primárnej infekcie dochádza k predĺženému vylučovaní vírusu
a nastáva virémia PVB19. Ak je táto primárna infekcia zahájená ešte pred
transplantáciou, tak spôsobuje miernu anémiu. (Würdinger et al., 2017). Akútna
infekcia PVB19 môže u imunosuprimovaných pacientov po transplantácií
spôsobovať apláziu červených krviniek alebo zhoršenú GVHD. Pre týchto
pacientov sú typické obrovské transformované proerytroblasty a pozastavenie
erytroídnej maturácie. Tieto proerytroblasty majú nukleárne vírusové inklúzie
pripomínajúce veľké nukleoly (viz.obr.č.5). Infekcia PVB19 bola spojená s radou
klinických symptómov, medzi ktoré patrí hepatitída, artropatia, thromocytopénia
či viaceré neurologické ochorenia, ktoré by pravdepodobne mohli tiež
spôsobovať komplikácie u pacientov. Aj napriek tomu, že väčšina dospelých má
celoživotnú imunitu proti PVB19, po podaní látky, potlačujúcej funkciu imunitného
systému môže nastať reinfekcia, čo vedie k dlhodobej anémií (Sadigh and Frank,
2017). O reinfekcií sa vyjadruje aj Gama et al. vo svojej práci, ktorá nám
naznačuje, že alogénny-štep nie je zdrojom transmisie PVB19, ale poukazuje na
29
jeho potencionálnu reinfekciu alebo endogénnu reaktiváciu vírusu (Gama et al.,
2017).
Obr.č.5: Kostná dreň, atypicky zväčšené, vírusom transformované erytroidné
prekurzory, obrázok A,B – farbenie Wrieght Giemsa, zväčšenie 100x; obrázok C –
zväčšenie 40x; obrázok D – e-kadherínová farba (Sadigh and Frank, 2017).
Aplázia červených krviniek spôsobená infekciou PVB19 môže dlhodobo
pretrvávať aj napriek dlhodobej terapie IVIg (intravenózne podávanie
imunoglobulínov) a znižovaniu liečby zameranej na liečbu GVHD (Karrasch et
al., 2017).
U dospelých príjemcov transplantátu je bežné, že dochádza k reaktivácií
PVB19 bez anémie. Bol zaznamenaný prípad, kedy pacient pred transplantáciou
mal negatívny sérologicky status a bol bez patognomických prejavov. Po
transplantácií sa objavili príznaky podobné chrípke a neskôr akútna artralgia
vyvolaná infekciou PVB19. Príznaky boli vyvolané pravdepodobne
imunosupresívnou liečbou a potlačením funkcie T lymfocytov (Markova et al.,
2016). Prevalencia a hladina DNA bola porovnateľná u pacientov po
transplantácií so zdravými jedincami, ale s výraznou akumuláciou po
transplantácií. Prítomnosť nízkej hladiny DNA u príjemcov transplantátu nebola
spojená s anémiou (Plentz et al., 2013).
30
3.9 Genotypy
Od roku 2002 členíme PVB19 na 3 genotypy pomocou analýzy ich NS1-
VP1 nukleotidovej sekvencie. Celková rozdielnosť medzi jednotlivými
genotypami je veľmi nízka a pohybuje sa okolo 2%. Najväčšia rozdielnosť v
sekvencií je v oblasti p6 promotoru (20%). Táto výrazná odlišnosť promotorovej
oblasti, naznačuje, že by jednotlivé genotypy mohli mať odlišné patogénne
vlastnosti (Servant et al., 2002).
Genotypy PVB19 majú nízku aminokyselinovú variabilitu. Vysoko
konzervované sekvencie aminokyselín sú tie čo zastupujú fosfolipázovú aktivitu
na VP1 sekvencií a tiež aminokyseliny pre VP2 proteín. Najväčšiu variabilitu
možno pozorovať v aminokyselinovej sekvencií multifunkčného proteínu NS1
(Ekman et al., 2007). Pre všetky genotypy platí ten istý sérotyp.
3.9.1 Genotyp 1
Tento dominantný genotyp je rozšírený v celej populácií a vyskytuje sa vo
všetkých vekových kategóriách (Norja et al., 2006). Na základe fylogenetickej
analýzy bol genotyp 1 rozdelený do dvoch podskupín B19-1A a B19-1B.
Divergencia nukleotidov medzi týmito podskupinami sa pohybuje v rozmedzí 5-
6% (Toan et al., 2006).
3.9.2 Genotyp 2
Genotyp 2 sa zriedka vyskytuje v populácií a bol potvrdený hlavne
u jedincov narodených pred rokom 1973. Bol identifikovaný napríklad u pacientov
pochádzajúcich zo Spojeného Kráľovstva a Fínska (Cohen et al., 2006; Pyöriä
et al., 2017). Promotorová oblasť genotypu 2 je výrazne odlišná oproti genotypu
1. Vo väzobných miestach pre transkripčné faktory sú rôzne nukleotidové
sekvencie, avšak kinetika mRNA a proteínová expresia zostáva nezmenená. To
naznačuje podobnú replikáciu genotypov 1 a 2 v erytroidných bunkách (Blümel
et al., 2005).
31
3.9.3 Genotyp 3
Genotyp 3 sa delí na dva subtypy (3a a 3b), ktoré majú 4% sekvenčnú
odlišnosť. Porovnanie VP1 oblasti subtypov poukazuje na akumuláciu
synonymických mutácií. To naznačuje dlhodobý vývoj po staršej separačnej
udalosti (Lukashov and Goudsmit, 2001). Tento genotyp prevláda v západnej
Afrike. Endemická oblasť genotypu 3 je Ghana okrem toho bol tiež detekovaný
v Brazílii (Parsyan et al., 2007). Subtyp 3a prevláda v krajinách Afriky, zatiaľ čo
subtyp 3b sa šíri mimo Afriku (Hübschen et al., 2009).
3.9.4 Historická analýza
Najrozšírenejším genotypom v súčasnosti je genotyp 1. Avšak analýza
kostrových pozostatkov z druhej svetovej vojny údajných fínskych vojakov
nájdených v boreálnej divočine nám naznačuje, že genotyp 1 po druhej svetovej
vojne a nahradil genotyp 2 v krajinách Európy (Norja et al., 2008; Toppinen et
al., 2015). U jedincov narodených pred rokom 1950 bola podobná
génoprevalencia genotypov 1 a 2 v severských krajinách, po tomto roku sa
genotyp 2 začal vyskytovať len zriedka. V severských krajinách a centrálnej
Európe genotyp 1 a 2 cirkuloval v pravidelných frekvenciách od roku 1930 do
roku 1950. Po roku 1970 genotyp 2 z týchto oblastí úplne vymizol (Norja et al.,
2006).
Genotyp 3 sa pravdepodobne paralelne vyvíjal s genotypom 1.
Porovnaním genotypu 3 s genotypmi 1 a 2 sa preukázala vysoká genetická
diverzita tohto genotypu, čo naznačuje dlhšiu evolučnú históriu, prebiehajúcu
pravdepodobne v Afrike (Hübschen et al., 2009). V severnej Európe sa tento
genotyp neobjavil približne 70 rokov.
32
Na záver literárneho prehľadu, by som rada odkázala na svoju bakalársku
prácu spracovanú v rokoch 2015/2016, ktorá bola obhájená na Katedre genetiky
a mikrobiológie Přírodovědeckej fakulty Univerzity Karlovy, kde sa bližšie
vyjadrujem k problematike výskytu a patologického pôsobenia PVB19 v bežnej
populácií a u imunokompromitovaných pacientov 1.
1 https://is.cuni.cz/webapps/zzp/detail/173106/
33
4 Materiál a Metódy
4.1 Materiál
4.1.1 Materiál pre detekciu PVB19 pomocou polymerázovej reťazovej
reakcie v reálnom čase
Vzorky určené na detekciu PVB19 pochádzali od pacientov
transplantovaných na Ústave hematológie a krvnej transfúzie a z transplantačnej
jednotky Kliniky detskej hematológie a onkológie z roku 2015. Extrakcia týchto
vzoriek prebiehala na oddelení virológie vo FN Motol. Extrahované DNA boli
uchovávané pri -20°C. Počet vzoriek bolo 1595 od 90 pacientov a jednalo sa
o vzorky plnej periférnej krvi v EDTA. V tomto súbore pacientov sa nachádzalo
30 žien a 60 mužov s mediánom veku 36,6 roka (od 5 mesiacov do 67 rokov).
Pacienti podstupujúci HSCT boli primárne diagnostikovaní na aplastickú anémiu
(AA-aplastic anemia), chronickú myeloidnú leukémiu (CML-chronic myeloid
leukemia), chronickú lymfocytárnu leukémiu (CLL-chronic lymphocytic leukemia),
myelodysplastický syndróm (MDS-myelodysplastic syndrome), akútnu
lymfoblastickú leukémiu (ALL-acute lymfoblastic leukemia), non-Hodgkin lymfóm
(NHL-non-Hodgkin lymphoma), chronickú myelomonocytickú leukémiu (CMML-
chronic myelomonocytic leukemia), akútnu myeloidnú leukémiu (AML-acute
myeloid leukemia), idiopatickú myelofibrózu (IMF-idiopathic myelofibrosis) alebo
mukopolysacharidózu (MPS-mucopolysaccharidosis) či imunodeficienciu
(viz.graf.č.2).
34
Graf č.2: Primárne ochorenia pacientov podstupujúcich HSCT.
4.1.2 Materiál pre genotypizáciu vzoriek
Vzorky určené na genotypizáciu PVB19 taktiež pochádzali z FN Motol
a Ústavu hematológie a krvnej transfúzie. Tieto vzorky boli extrahované vo FN
Motol v období od 2004-2017 a skladované pri -20°C. Jednalo sa o 135 vzoriek
od 125 pacientov extrahovaných zo séra, krvi, kostnej drene, likvóru, biopsie
myokardu a plodovej vody (viz.graf č.3). V tomto súbore pacientov bolo 85 detí
a adolescentov a 40 dospelých s mediánom veku 19,3 roka (od 1 mesiaca do 63
rokov).
AA; 3; 4%
ALL; 16; 18%
AML; 27; 30%
CLL; 6; 7%
CML; 6; 7%
CMML; 2; 2%
IMF/MPS; 4; 5%
Imunodef; 3; 3%
MDS; 10; 11%
Met.dis.; 1; 1%
NHL; 11; 12%
35
Graf č.3: Pôvod materiálu použitého na genotypizáciu.
4.1.3 Chemikálie použité v práci
Všetky chemikálie použité v práci sú uvedené v tabuľke č.1.
Chemikálie Výrobca
PCR voda B Braun
PCR pufor + MgCl2 (15 mM) QIAGEN ®, Hilden, Německo
MgCl2 (25 mM) QIAGEN ®, Hilden, Německo
dNTP Sigma
Primer mix Invitrogen™,Carlsbad, USA
Sonda Invitrogen™,Carlsbad, USA
HotMaster polymeráza 5U/µl QIAGEN ®, Hilden, Německo
Sonda značka FAM Invitrogen™,Carlsbad, USA
FastDigest Kspa1 Thermo Scientific, Waltham, USA
FastDigest Taq1 Thermo Scientific, Waltham, USA
10x FastDigest Green Buffer Thermo Scientific, Waltham, USA
Top Vision agarózy ThermoFisher, (EU) Lithuana
Kostná dreň40%
Krv38%
Likvór2%
Plodová voda2%
Sérum8%
Srdce10%
36
Tris-borát-EDTA (TBE) pufor -
Midori Green (Advance DNA Stain) Nippon Genetics, Europe
GeneRuler Low Range DNA Thermo Scientific, Waltham, USA
Tab.č.1: Chemikálie využité v práci.
4.2 Metódy
Na detekciu parvovírusu B19 zo vzoriek bola využitá metóda
polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čace (qPCR- real-time polymerase
chain reaction) podľa práce (Saito et al., 2003). Na určenie jednotlivých
genotypov bola využitá nested PCR a následne RFLP-PCR (restriction fragment
length polymorphism PCR) podľa práce (Bock et al., 2014), kedy sa sledovalo
štiepenie PCR produktu pomocou restrikčných enzýmov Hpa1(KspA1) a Taq1.
V prípade nejasností výsledkov, vzorky boli sekvenované na určenie prípadných
mutácií genotypu. Dáta boli spracované podľa základných štatistických metód.
4.2.1 Izolácia DNA
Extrakciu DNA zo vzoriek krvi spracovali pracovníci FN Motol na oddelení
virológie, pričom využili QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN®, Hilden,
Nemecko). Na extrakciu DNA zo vzoriek tkaniva využili QIAamp DNA MiniKit
(QIAGEN®, Hilden, Nemecko). Pracovníci postupovali podľa inštrukcií od
výrobcu. Vzorky boli uskladnené pri -20 °C.
4.2.1 Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase
qPCR je kvantitatívna metóda PCR, založená na sledovaní amplifikácie
cielenej molekuly DNA v reálnom čase. Táto metóda bola využitá na detekciu
PVB19 zo vzoriek periférnej krvi. Celkový objem reakčnej zmesi bol 15 µl pričom
obsahoval 2 µl DNA. Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v tabuľke č.2. Primery
použité pre túto reakciu sú uvedené v tabuľke č.3 (Saito et al., 2003).
37
Chemikálie Finálna
Koncentrácia Objem
Koncentrácia
východisková
PCR voda - 9,565 µl -
PCR pufor + MgCl2 1x 1,5 µl 10x + 15 mM
MgCl2 3 mM 0,9 µl 25 mM
dNTP 100 µM pre
každú dNTP 0,3 µl 4x5 mM
DNA polymeráza 0,3
jednotiek/reakcia 0,06 µl 5 U/µl
Primer mix 0,5 µM 0,375 µl 20 µM každý
Sonda značka FAM 0,2 µM 0,3 µl 10 µM
Tab.č.2 : Použité chemikálie a ich množstvo a koncentrácie.
Forward 5´- CCCTAGAAAACCCATCCTCTGTG -3´
Reverse 5´- AGGTTCTGCATGACTGCTACTGG -3´
Sonda FAM- TCATGGACAGTTATCTGACCACCCCCA -BHQ1
Tab.č.3: Primery použité pre detekciu PVB19.
Vzorky boli spracované v duplikátoch. Plazmidy pre konštrukciu
kalibračnej krivky boli pripravené v Laboratóriu molekulárnej genetiky vo FN
Motol. Pre kontrolu detekcie vírusu aj v nízkych koncentráciach, boli nariedené
z výslednej koncentrácie 105 kópií/ µl na 103 kópií/µl 102 kópií/µl a 101 kópií/µl.
Takto nariedené plazmidy boli využité pre každú PCR reakciu. V každej reakcií
bola použitá aj negatívna kontrola ktorá obsahovala PCR vodu. Reakcie boli
spracované na prístroji BIO-RAD CFX96TM Real-Time System C1000TM Thermal
Cycler. Teplotný protokol pre túto rekciu je: denaturácia 95°C/15 min a 45 cyklov
pri 94°C/15s a 60°C/1 min. Výsledky boli následne vyhodnotené pomocou
programu Bio-Rad CFX Manager IVD.
38
4.2.2 Genotypizácia
4.2.2.1 nested-PCR
Vzorky určené na genotypizáciu bolo nutné amplifikovať. Pre zvýšenie
citlivosti a špecificity tejto reakcie bolo využité nested-PCR, čo je modifikovaná
forma klasickej PCR reakcie. Reakcia prebieha v dvoch fázach, pričom je nutné
navrhnúť dve sady primerov . V tabuľke č.4 sú uvedené ich sekvencie. Pri nested-
PCR reakcií bola reakčná zmes a program rovnaký, rozdiel je len v použitých
primeroch. Množstvo reakčnej zmesi bolo 45 µl do ktorej sa následne pridáva 5
µl vzorky. Objemy chemikálií použitých pri nested-PCR sú uvedené v tabuľke č.5.
Počiatočná denaturácia bola pri 95°C na 15 min, nasledovalo 35 cyklov 94°C/30
s, 50°C/30 s, 72°C/30 s a na záver konečná polymerácia 72°C/10 min (Bock et
al., 2014).
antisense Sense
1. Kolo
PCR
ATTCCACAAATTGCTGATACA
C
CAGTTTCGTGAACTGT
TAGT
2. Kolo
PCR
AATTGCTGATACACAGCTTTA
G
CGTGAACTGTTAGTTG
GGGTTGA
Tab.č.4.: Primery použité pre nested-PCR reakciu
Chemikálie Finálna koncentrácia Objem Koncentrácia
východisková
PCR voda - 27,35 µl -
dNTP 250 µM pre každú dNTP 6,25 µl 5 mM x 4 pre
každú dNTP
Primer mix 0,8 µM 3 µl 20µM každý
DNA polymeráza 2 jednotiek/reakcia 0,4 µl 5U/µl
Pufor 10x 1x 1,5 mM MgCl2 5 µ 15 mM MgCl2
MgCl2 3 mM 3 µl 25 mM
Tab.č.5.: Chemikálie použité v nested-PCR
39
4.2.2.2 Štiepenie amplikónov
Amplikóny o veľkosti približne 338 bp boli štiepené pomocou enzýmov
KspA1 a Taq1 vo dvoch samostatných reakciách po dobu 10 min. Restrikčný
enzým Kspa1 štiepil pri 37°C, Taq1 pri 65°C. Resktrikcia pomocou týchto
enzýmov prebieha v oblasti NS1-Vp1u. Kspa1 vzorky štiepi v oblasti 5´-
GTT↓AAC-3´. Taq1 štiepi v oblasti 5´-T↓CGA-3´. Výsledky boli vyhodnocované
pomocou elektroforézy. Genotyp 2 a 3 je štiepený pomocou enzýmu KspA1.
Restrikčný enzým Taq1 štiepi genotypy 1 a 2 (viz.tab.č.6).
Tab.č.6.: Štiepny vzorec pre určenie genotypov
KspA1 Taq1
Genotyp 1 - +
Genotyp 2 + +
Genotyp 3 + -
4.2.3 Elektroforéza
Na vyhodnotenie RFLP-PCR reakcie bola použitá elektroforéza, čo je
metóda, ktorá umožňuje separáciu molekúl na základe veľkosti či náboja
v elektrickom poli. Gél bol pripravený z 0,5g Top Vision agarózy, 25ml tris-borát-
EDTA (TBE) pufru a 1 µl farbiva Midori Green pre vizualizáciu, čo odpovedá 2%
agarózovému gelu. Elektroforéza prebiehala pri napätí 80 V po dobu 60 min. Ako
rebríček bol použitý GeneRuler Low Range DNA. Produkty na géle boli
vizualizované pomocou prístroja Vilber Lourmat.
4.2.4 Sekvenovanie
Na sekvenáciu boli určené vzorky nezapadajúce do štiepneho vzorca,
ktorý je znázornený v tabuľke č.5. Taktiež boli osekvenované dve vzorové vzorky
genotypu 1 a dve genotypu 2, pre overenie správnosti štiepnych miest. Na
sekvenáciu sa využili amplikóny pochádzajúce z druhého kola nested PCR.
Jednalo sa o aplikóny odpovedajúce NS1-VP1u regiónu a ich veľkost bola
40
približne 338 bp. Sekvenáciu zhotovili pracovníci FN Motol v Laboratóriu
molekulárnej genetiky, podľa Sangerovej sekvenačnej metódy.
4.2.3 Fylogenetická analýza
Sekvencie boli spojené pomocou FinchTv Version 1.4.0 (Geospiza Inc.)
a topológia stromu boli dizajnovaná pomocou MEGA 6.0 software (Tamura et
al., 2013) s využitím Jukes-Cantor parametrov na vytvorenie matice
nukleotidovej vzdialenosti. Na porovnanie boli vybraté referenčné sekvencie
z GenBank (GenBank® zapísané pod číslom: genotyp 1: M13178, DQ225149;
genotyp 2: AY044266, AY064476; genotyp 3: AX003421, AY083234). Jednotlive
nukleotidové sekvencie boli následne porovnané pomocou Clustal Omega
(EMBL-EBI).
4.2.4 Štatistická analýza
Štatistická analýza výsledkov bola spracovaná pomocou dvoch testov.
Prvý bol chí-kvadrát test, kedy na výpočet bol využitý software Excel
(Microsoft®). Druhý test bol one-way test spracovaný programom SigmaStat®.
Hodnoty pod stupňom signifikancie 0,05, boli považované za štatisticky
významné.
41
5 Výsledky
5.1 Pozitívni pacienti na infekciu PVB19
V roku 2015 podstúpilo alogénnu HSCT vo FN Motol a ÚHKT 90 pacientov
(25 detí a adolescentov). Pacienti pozitívni na PVB19 boli primárne
diagnostikovaní na CML, MDS, ALL, NHL, CMML, AML a metabolickú poruchu.
Najčastejším diagnostikovaným ochorením medzi pozitívnymi PVB19
pacientami, bola akútna myeloidná leukémia (viz. graf č.4).
Graf.č.4: Primárne ochorenia pacientov pozitívnych na PVB19
9%
23%
23%9%
4%
27%
5%
CML MDS ALL NHL CMML AML Met.dis
42
Najčastejším primárnym ochorením pediatrických pacientov bola ALL (viz.
graf č.5), u dospelých pacientov to bola AML (viz.graf č.6). U pediatrických
pacientov ani dospelých pacientov nebola potvrdená signifikantná korelácia
medzi PVB19 infekciou a typom primárneho ochorenia (P>0,05, pomocou X2-
testu).
Graf č.5: Porovnanie pediatrických pacientov pozitívnych a negatívnych na PVB19 u jednotlivých ochorení.
Graf č.6: Porovnanie dospelých pacientov pozitívnych a negatívnych na PVB19 u jednotlivých ochorení.
0
1
2
3
4
5
6
7
Imunodef. Met.dis MDS NHL AA ALL CML AML
Deti a adolescenti
PVB19+ PVB19-
0
5
10
15
20
25
AA ALL AML CML CLL CMML IMF/MPS MDS NHL
Dospelí
PVB19+ PVB19-
43
Z 1595 vzoriek pochádzajúcich z roku 2015 bol PVB19 detekovaný v 30
vzorkách (1,88%).
V skupine 25 detí a adolescentov bolo pozitívnych na PVB19 9 pacientov
(36%). Jednalo sa o 5 dievčat a 4 chlapcov s mediánom veku pri HSCT 12,8
rokov (viz. graf č.7) Dospelých bolo 65 pacientov a z toho pozitívnych 13 (20%).
Dospelý pacienti zahrnovali 5 žien a 8 mužov s mediánom veku 47,8 (viz. graf č.
8). Celkovo bolo pozitívnych pacientov 22 (24,44%) z celkových 90, pričom 5
pacientov malo viac ako 2 pozitívne vzorky (22,7%). V incidencií PVB19 nie je
rozdiel medzi deťmi a dospelými (X2 -test P=0,11) a taktiež ani medzi pohlaviami
pacientov (X2 -test P= 0,17).
Graf č.7: Deti a adolescenti pozitívni na PVB19 po HSCT
0
1
2
3
4
0-1 1-4 5-10 10-15 15-18
po
čet
pac
ien
tov
vek
Deti a adolescenti(dievčatá-5, chlapci-4)
dievčatá chlapci
44
Graf č.8: Dospelí pozitívni na PVB19 po HSCT
0
1
2
3
4
18-30 30-40 40-50 50-60 60-70
po
čet
pac
ien
tov
vek
Dospelí(ženy-5, muži-8)
muži ženy
45
5.2 Nástup infekcie PVB19
Pacientom po HSCT boli pravidelne po dobu najmenej 6 mesiacov
odoberané vzorky periférnej krvi, čo umožnilo zaznamenať nástup infekcie
PVB19. V jednom prípade bol vírus detekovaný 3 dni pred transplantáciou, zatiaľ
čo posledná detekcia vírusu bola zaznamenaná 208 dní po transplantácií. Pričom
medián u detí bol 94 dní od HSCT a u dospelých je 111 dní. Na grafe č.9, je
možné pozorovať, že u týchto pacientov nastupuje infekcia v dvoch obdobiach
a to medzi 50-90 dňom a neskôr medzi 130-170 dňom. Vírusová nálož
u pozitívnych vzoriek sa pohybovala od 31,95 do 45,95x105 kopií DNA/ml krvi.
Graf.č.9: Počet dní po nástupe infekcie po HSCT
0
1
1
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210
Infekcia po HSCT
46
5.2 Koinfekcia pacientov s EBV a CMV
Po alogénnej HSCT boli pacienti rutinne testovaní na oddelení virológie
FN Motol na prítomnosť EBV a CMV. EBV sa vyskytoval u 45 (50%) a CMV u 49
(54,5%) pacientov. Medzi PBV19 pozitívnymi pacientami, bol signifikatne nižší
výskyt EBV aj CMV oproti pacientom negatívnym (one-way ANOVA test,
P<0,05). Je vidieť trend negatívnej korelácie medzi PVB19 a koinfekcie
EBV+CMV, avšak je pod hranicou signifikancie (one-way ANOVA test P>0,05)
(viz graf č.10,11,12).
Graf č.10: Porovnanie výskytu EBV u PVB19- a PVB19+ pacientov.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PVB19- PVB19+
po
čet
infi
kova
nýc
h p
acie
nto
v v
%
EBV
*
47
Graf č.11: Porovnanie výskytu CMV u PVB19- a PVB19+ pacientov.
Graf č.12: Porovnanie výskytu koinfekcie EBV aCMV u PVB19- a PVB19+ pacientov.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PVB19- PVB19+
po
čet
infi
kova
nýc
h p
acie
nto
v v
%
CMV
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PVB19- PVB19+
po
čet
infi
kova
nýc
h p
acie
nto
v v
%
CMV+EBV
48
5.3 Výskyt relapsu, akútneho GVHD (aGVHD), chronického GVHD
(cGVHD) a úmrtnosť pacientov
U pacientov pozitívnych na PVB19 sa aGVHD vyskytla u 13 pacientov
(deti/adolescenti-7, dospelí-6) a cGVHD u 9 pacientov (deti/adolescenti-1,
dospelí-8) (viz. graf č.13). U 2 pacientov (dieta-1, dospelý-1) sa vyvinul relaps
ochorenia s následnou smrťou.
Graf č.13 : Porovnanie pediatrických a dospelých pacientov pozitívnych na PVB19 na
rozvoj aGVHD a cGVHD.
Pacienti pozitívny a negatívny na PVB19 boli porovnaní na rozvoj aGVHD,
cGVHD, relaps ochorenia a úmrtnosť (viz.tab.č.7). Štatistická analýza
nepreukázala signifikantnú koreláciu medzi týmito dvoma skupinami (P>0,05 X2
- testu).
PVB19+ PVB19- Štatistická signifikácia (P=)
Relaps 9% 12% 0,6
aGVHD 59% 44% 0,4
cGVHD 41% 31% 0,5
Exitus 9% 13% 0,7
Tab.č.7: Štatistická analýza relapsu, aGVHD, cGVHD, úmrtnosti pacientov.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
aGVHD cGVHD
Výskyt aGVHD a cGVHD
deti/adolescenti dospelí
49
5.4 Genotypizácia
Po amplifikácií vzoriek pomocou PCR, boli vzorky štiepené
prostredníctvom KspA1 a Taq1 restrikčných enzýmov. Neštiepené amplikóny
majú veľkosť približne 338 bp. Po štiepení enzýmom KspA1 majú jednotlivé
fragmenty veľkosť okolo 117 a 221 bp. Restrikčný enzým Taq1 štiepi amplikóny
na veľkosti približne 153 a 185 bp. Genotyp 1 bol naštiepený pomocou Taq1
enzýmu, genotyp 2 štiepil Taq1 aj KspA1 enzým. Genotyp určený ako mutovaný
nebolo možné naštiepiť ani jedným z restrikčných enzýmov (viz.obr.č.6). Štiepne
miesta sekvencií boli identifikované a tiež porovnané so sekvenciami
pochádzajúcich z NCBI (National Center for Biotechnology Information), čo
potvrdilo presnosť RFLP-PCR metódy.
Obr.č.6: Výsledky po štiepení restrikčnými enzýmami, zobrazených pomocou
elektroforézy. N- neštiepená východisková vzorka.
50
Genotyp 1 bol detekovaný v 96,7% prípadoch. U troch pacientov bol
identifikovaný genotyp 2 (viz.tab.č.8). Genotyp 3 sa v tejto kohorte nenachádzal.
Pri genotypizácií sa vyskytol aj prípad mutovaného genotypu (viz.tab.č.9). Tento
genotyp bol odoslaný na sekvenáciu, čím sa preukázal ako mutovaný genotyp 1.
Vek Pohlavie Počet kopií
PVB19/rekcia DNA z Diagnóza
Pacient č.1 26 M 2,2x106 Krv Anémia
z nedostatku železa
Pacient č.2 3 M 12 Kostná dreň Anémia NS
Pacient č.3 16 Ž 3 Srdce AML
Tab.č.8.: Pacienti detekovaný na genotyp 2.
Vek Pohlavie Počet kopií
PVB19/reakcia DNA z Diagnóza
Pacient č.4 36 Ž 3-350 Kostná dreň
Porucha bielych krviniek NS
Tab.č.9.: Pacient s mutovaným genotypom.
Na základe fylogenetickej analýzy mutovaného genotypu bolo možné
určiť, že sa jedná o genotyp 1. Genotyp 1 je štiepený pomocou restrikčného
enzýmu Taq1 a to v oblastiach 5´ T ↓CGA 3´ a 3´AGC↑T 5´. V prípade
mutovaného genotypu, došlo k mutácií v oblasti štiepneho miesta enzýmu Taq1
(viz.tab.č.10.).
Normálna sekvencia GGAAATTT↓CGAGAATTT
Mutovaná sekvencia GGAAATTTAGAGAATTT
Tab.č.10.: Nukleotidové sekvencie a) štiepne miesto enzýmom Taq1, b) bodová mutácia
mutovaného genotypu. Žlté podfarbenie znázorňuje nukleotidovú zmenu.
51
5.5 Overenie sekvencií genotypov PVB19
Na overenie správnosti štiepného vzorca, boli náhodné vybraté 2 vzorky
genotypu 1, dva vzorky genotypu 2 a tiež dva mutované vzorky.
Vzorky pod označením 92674 a 74126 boli pomocou restrikčnej analýzy
určené ako genotypy 1. Ich porovnaním s referenčnou sekvenciou M13178
(GenBank), bola preukázaná ich podobnosť 97,9%. S referenčným kmeňom
DQ225149 99,2%. Fylogenetická analýza potvrdila zoskupovanie 92674 a 74126
s referenčnými sekvenciami genotypu 1. Konkrétne sa jednalo o subtyp B19-1A.
Rozdielnosť sekvencie vzoriek genotypu 1 bola 0,32%.
S referenčným kmeňom AY044266 boli porovnávané sekvencie 17869
a 26008 (pacient č.1 a pacient č.2, viz.tab.č.8), ktoré boli určené ako genotypy 2.
Ich podobnosť je 91,72%. S referenčným kmeňom AY064476 bola ich podobnosť
bola 92,57%. Rozdielnosť sekvencí genotypu 2 bola 1,26%. Porovnaním
genotypov 1 a genotypov 2 sa diverzita pohybovala v rozmedzí 8,71% - 12,1%.
Vzorky pod označením 25704 a 27611 boli určené ako mutované.
Jednalo sa o dva vzorky pochádzajúce od stejného pacienta, odobrané 4
mesiace po sebe (viz.tab.č.9). Fylogenetická analýza nám preukázala
zoskupovanie s referenčnými sekvenciami genotypu 1, čo naznačuje, že ide
o mutovanú formu tohto genotypu. Podobnosť medzi nimi je 100%. Porovnaním
s referenčnými kmeňmi genotypu 1 je 98,45% (M13178) a 98,76% (DQ225149)
(viz.obr.č.7).
52
Obr.č.7.: Fylogenetická analýza sekvencií PVB19. Čísla vzoriek-Genotyp 1: 92674,74126, mutovaný genotyp 1: 25704, 27611, genotyp 2: 17869, 26008.
53
6 Diskusia
Komplikácie vyvolané infekciou PVB19 u transplantovaných pacientov sa
vyskytujú zriedka, ale napriek tomu, môžu byť závažné. Predominantnou
klinickou manifestáciou u pacientov, infikovaných PVB19, je anémia, avšak sa
môže taktiež podieľať na vyvolaní hepatitídy či pneumonotitídy (Eid et al., 2006).
Prvá časť tejto diplomovej práce sa zaoberá pacientami infikovanými PVB19,
ktorí podstúpili hematopoetickú transplantáciu kmeňových buniek. Pacienti v tejto
štúdií, pozitívni na PVB19, boli primárne diagnostikovaní na CML, MDS, ALL,
NHL, CML, AML a jeden prípad metabolickej poruchy. V práci bola porovnaná
frekvencia infekcie u jednotlivých ochoreni, avšak nebola potvrdená významná
korelácia medzi nimi. Vzhľadom na pomerne malú kohortu pacientov tejto práce,
by bolo treba na potvrdenie tejto hypotézy otestovať významne väčšiu skupinu
pacientov.
V tejto práci bola incidencia PVB19 infekciue u pacientov 24,4%.
Vzhľadom na ich imunosupresiu je jasne vidieť, že incidencia je výrazne vyššia
oproti imunokompetentným pacientom, kedy sa udáva ako 0,8% (Watanabe et
al., 2018). Incidencia v tejto kohorte sa zhoduje s výsledkami po transplantácií
solídnych orgánov, kedy je popísaná na 23-31%, naproti tomu po HSCT sa udáva
15% incidencia oproti čomu má táto práca hodnoty vyššie (Cavallo et al., 2003;
Ki et al., 2005; Schleuning et al., 1999). Prekvapením bola incidencia
u pediatrických pacientov (36%). Atay et al. vo svojej práci uvádza, že
u pediatrických pacientov po HSCT je incidencia PVB19 7%. Výsledky tejto práce
ukazujú až 36%, čo je výrazný rozdiel. Nie je známe s čím tento rozdiel mohol
súvisieť, ale mohlo by to byť odlišnou geografickou lokalitou (Turecko). Analýza
ale nepotvrdila rozdiely v incidencií u pediatrických pacientov oproti dospelým
a taktiež nebola potvrdená rozdielna incidencia infekcie medzi pohlaviami
pacientov.
Medián počiatku infekcie bol 105 dní po HSCT, pričom nebol výrazný
rozdiel medi pediatrickými a dospelými pacientami (94, 111 dní), avšak
porovnaním nástupu infekcie, bolo možné pozorovať, že infekcia typicky
nastupuje v dvoch obdobiach a to medzi 50-90 dňami a 130-170 dňami po
transplantácií. Skorší nástup infekcie (50-90 dní) sa zhodoval s prácou Eid et al.
54
(Eid et al., 2006), ktorý popísal nástup po transplantácií ako 1,75 mesiaca. Jeho
práca popisovala retrospektívne 96 pacientov po transplantácií, ktorí boli
pozitívny na PVB19.
GVHD je reakciou imunitného systému darcu na odlišné antigény
príjemcu. Viaceré zdroje uvádzajú, že infekcia PVB19 má nepriaznivý vplyv na
alogénny-štep týchto pacientov (Barzon et al., 2009; Eid et al., 2006; Xiao et
al., 2013). Napriek tomu sa v tejto práci sa nepreukázala korelácia medzi
infekciou PVB19 a rozvojom akútnej či chronickej GVHD a taktiež vplyv na relaps
ochorenia pacientov a ich úmrtie. Tieto odlišné výsledky, by mohli súvisieť so
zvolenými kohortami pacientov. Práce Barzon et al., Xiao et al., 2013 sa venujú
výlučne pacientom, ktorí podstúpili transplantáciu solídnych orgánov, práca Eid
et al., sa taktiž venuje z väčšiny transplantáciam solídnych orgánov. Pevné
tkanivá sú miesta kde je vírus schopný dlhodobo perzistovať, čo môže
vysvetlovať túto skutočnosť.
Vzorky pozitívne na PVB19 po HSCT, sa vyznačovali nízkou vírusovou
náložou. Vo väčšine vzoriek, bola nálož nižšia ako 6,6x103 partikulií/ml, pričom
najvyššia vírusová nálož bola 4,6x106 partikulií/ml. Vzhľadom na to, že sa
viremická fáza počas primárnej infekcie vyznačuje vysokou vírusovou náložou
(až 1013 partikulí/ml) (Young and Brown, 2004), je možné konštatovať, že u týchto
pacientov nedošlo k primárnej infekcií po transplantácií a že transplantát nebol
zdrojom transmisie. Tomuto tvrdeniu nasvedčuje aj schopnosť PVB19 integrovať
sa do genómu hostiteľskej bunky a tak latentne pretrvávať (Janovitz et al., 2017),
čo vysvetľuje neprítomnosť DNA vírusu u vzoriek pacientov, ktorí boli neskôr
potvrdení ako pozitívni. Na základe týchto zistení, je otázne, či by u pacientov po
transplantácií nebola vhodnejšia detekcia PVB19 z biopsie tkanív, kde vírus
môže dlhodobo perzistentne pretrvávať.
Pacienti po transplantácií sú rutinne testovaní na prítomnosť rady vírusov,
medzi ktoré patrí aj EBV a CMV. U pacientov tejto práce, sa potvrdil výrazne nižší
výskyt infekcie PVB19 (24,44%) oproti EBV a CMV. Incidencia EBV bola 50%
a u CMV 54,5%. Zvláštnosťou bolo, že po porovnaní pacientov pozitívnych
a negatívnych na PVB19 bol výskyt EBV a CMV výrazne nižší u pacientov, ktorí
boli infikovaní PVB19.
55
Po tom, čo boli odhalené rôzne varianty PVB19, sa začalo uvažovať nad
ich odlišným patogénnym potenciálom a rovnako aj na ich epidemiologickou
relevanciou. Doposiaľ publikované dáta nasvedčujú, že napriek pomerene
vysokej nukleotidovej odlišnosti v oblasti promotoru (20%) medzi genotypom 1
a 2 (Servant et al., 2002) je, vzhľadom na ich podobnú kinetiku replikácie
a kinetiku proteínovej expresie, patogenicita rovnaká (Blümel et al., 2005).
Napriek tomu doposiaľ nebola publikovaná dostatočné veľká klinická štúdia, ktorá
by porovnávala vo väčšej miere stav týchto pacientov.
Druhá časť tejto diplomovej práce sa venovala genotypizácií PVB19
pozitívnych vzoriek pochádzajúcich z FN v Motole, kde v obrovská väčšine
pacientov bola detekovaný na genotyp 1 (96,7%). Výsledky tejto štúdie, ktoré
ukazujú, že genotyp 1 je predominantným genotypom, sa zhodujú s doposiaľ
publikovanými prácami (Corcoran et al., 2010; Hokynar et al., 2004; Hübschen
et al., 2009).
Oproti tomu, genotyp 2 sa zdá byť veľmi vzácny. Norja et al. vo svojej
práci popisuje cirkuláciu genotypov 1 a 2 v oblastiach Európy pred viac ako pol
storočím. Uvádza, že po tomto období genotyp 2 medzi jedincami úplne vymizol
(Norja et al., 2006). Napriek tomu, za posledné roky pribúdajú práce detekujúce
genotyp 2. Ten bol identifikovaný u darca krvi a pacienta po renálnej
transplantácií z Nemecka (Eis‐Hübinger et al., 2014; Liefeldt et al., 2005),
u imunokompromitovaného pacienta z Poľska (Grabarczyk et al., 2011),
u pacienta pochádzajúceho z Bulharska (Ivanova et al., 2016) a tiež v B bunkách
u pacienta z Fínska (Pyöriä et al., 2017). Medzi pacientami, zapojenými do tejto
štúdie, sa podarilo detekovať genotyp 2 u troch pacientov (2,5%). Napriek tomu,
že Norja ďalej vo svojej práci uvádza, že jedinci narodení po roku 1973 nemajú
genotyp 2 (Norja et al., 2006), pacienti tejto štúdie boli všetci narodení po tomto
roku. Nie je ale známe, či zriedkavý výskyt genotypu 2 v Európe súvisí s nízkou
cirkuláciou tohto genotypu, alebo prenosom reaktivovaného vírusu
u perzistentne infikovaných jedincov (Norja et al., 2008). Nebolo prekvapením,
že medzi pacientami sa nevyskytoval genotyp 3. Jeho endemická oblasť je
Ghana (Candotti et al., 2004) a typicky sa vyskytuje v oblastiach Afriky.
V oblastiach severnej Európy sa nevyskytoval viac ako 70 rokov, čo môže
súvisieť s malou mierou africkej migrácie do tejto oblasti (Norja et al., 2006).
56
V tejto práci bol zaznamenaný jeden prípad, kedy vzorku nebolo možné
naštiepiť restrikčnými enzýmami, čo naznačilo možný výskyt mutácie v štiepnom
mieste sekvencie. Jednalo sa o 2 vzorky pochádzajúce od stejnej pacientky.
Vzorky boli odobraté z kostnej drene s odstupom 4 mesiacov. V kostnej dreni sa
nachádzajú erytroídne progenitory, ktoré vykazujú najvyššiu replikačnú aktivitu
(Bua et al., 2016). Vzhľadom na vysokú replikačnú aktivitu a na to, že oblasť
NS1/VP1/VP2 sa vyznačuje veľkým množstvom synonymických
a nesynonymických nukleotidových zmien s vysokým pomerom (Lukashov and
Goudsmit, 2001; Servant et al., 2002), bolo možné očakávať, že dôjde k mutácií
sekvencie. V prípade tejto sekvencie, sa jednalo o bodovú mutáciu nachádzajúcu
sa v mieste štiepenia restrikčným enzýmom Taq1.
Analýza sekvencií umožnila určiť mutovaný genotyp ako genotyp 1,
podobnosť s referenčnými genotypami 1 bola až ~98%. Sekvencie genotypov 1
tejto práce mali veľmi malú rozdielnosť voči referenčným sekvenciam a to
približne ~98,5%, zatiaľ čo sekvencie genotypu 2 majú nižšiu podobnosť
s referenčnými sekvenciami a to asi ~92%. Rozdielnosť medzi krátkymi
sekvenciami génov sa udáva viac ako 10% (Servant et al., 2002), pričom
genotypy tejto práce sa líšili o ~10%.
57
7 Súhrn
Predmetom tejto diplomovej práce bolo popísať výskyt a vplyv
parvovírusu B19 u pacientov FN Motol. Prvá časť štúdia popísala incidenciu
PVB19 (24,4%) u pacientov po HSCT. Taktiež popísala dve obdobia po
transplantácií, kedy infekcia typicky nastupuje medzi pacientami. U týchto
pacientov sa nepodaril potvrdiť vplyv infekcie na rozvoj akútnej či chronickej
GVHD a relapsu ochorenia, rovnako ako úmrtie pacienta. Vzhľadom na to, že sa
jednalo o pomerne malú kohortu pacientov, by bolo vhodné toto pozorovanie
potvrdiť na väčšej skupine pacientov.
Druhá časť práce sa zaoberala popisom rozloženia jednotlivých genotypov
v rámci Českej republiky. Určila, že genotyp 1 je predominantný a taktiež
zaznamenala výskyt vzácneho genotypu 2.
58
8 Zoznam použitej literatúry
Agbandje, M., Kajigaya, S., McKenna, R., Young, N.S., and Rossmann, M.G. (1994). The structure of human parvovirus B19 at 8 A resolution. Virology 203, 106–115.
Almilaji, A., Szteyn, K., Fein, E., Pakladok, T., Munoz, C., Elvira, B., Towhid, S.T., Alesutan, I., Shumilina, E., and Bock, C.-T. (2013). Down-regulation of na+/k+ atpase activity by human parvovirus b19 capsid protein vp1. Cell. Physiol. Biochem. 31, 638–648.
Arnaout, K., Patel, N., Jain, M., El-Amm, J., Amro, F., and Tabbara, I.A. (2014). Complications of Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Cancer Invest. 32, 349–362.
Bar-Natan, M., Nelson, E.A., Walker, S.R., Kuang, Y., Distel, R.J., and Frank, D.A. (2012). Dual inhibition of Jak2 and STAT5 enhances killing of myeloproliferative neoplasia cells. Leukemia 26, 1407–1410.
Barzon, L., Murer, L., Pacenti, M., Biasolo, M.A., Della Vella, M., Benetti, E., Zanon, G.F., and Palù, G. (2009). Investigation of intrarenal viral infections in kidney transplant recipients unveils an association between parvovirus B19 and chronic allograft injury. J. Infect. Dis. 199, 372–380.
Blümel, J., Eis-Hübinger, A.M., Stühler, A., Bönsch, C., Gessner, M., and Löwer, J. (2005). Characterization of Parvovirus B19 Genotype 2 in KU812Ep6 Cells. J. Virol. 79, 14197–14206.
Blundell, M.C., Beard, C., and Astell, C.R. (1987). In vitro identification of a B19 parvovirus promoter. Virology 157, 534–538.
Bock, C.-T., Düchting, A., Utta, F., Brunner, E., Sy, B.T., Klingel, K., Lang, F., Gawaz, M., Felix, S.B., and Kandolf, R. (2014). Molecular phenotypes of human parvovirus B19 in patients with myocarditis. World J. Cardiol. 6, 183–195.
Bonvicini, F., Bua, G., Manaresi, E., and Gallinella, G. (2015). antiviral effect of cidofovir on parvovirus B19 replication. Antiviral Res. 113, 11–18.
Bonvicini, F., Bua, G., Conti, I., Manaresi, E., and Gallinella, G. (2017). Hydroxyurea inhibits parvovirus B19 replication in erythroid progenitor cells. Biochem. Pharmacol. 136, 32–39.
Brown, K.E., Anderson, S.M., and Young, N.S. (1993). Erythrocyte P antigen: cellular receptor for B19 parvovirus. Science 262, 114–117.
Brown, K.E., Hibbs, J.R., Gallinella, G., Anderson, S.M., Lehman, E.D., McCarthy, P., and Young, N.S. (1994). Resistance to parvovirus B19 infection due to lack of virus receptor (erythrocyte P antigen). N. Engl. J. Med. 330, 1192–1196.
59
Bua, G., Manaresi, E., Bonvicini, F., and Gallinella, G. (2016). Parvovirus B19 Replication and Expression in Differentiating Erythroid Progenitor Cells. PLoS ONE 11.
Candotti, D., Etiz, N., Parsyan, A., and Allain, J.-P. (2004). Identification and characterization of persistent human erythrovirus infection in blood donor samples. J. Virol. 78, 12169–12178.
Cavallo, R., Merlino, C., Re, D., Bollero, C., Bergallo, M., Lembo, D., Musso, T., Leonardi, G., Segoloni, G.P., and Ponzi, A.N. (2003). B19 virus infection in renal transplant recipients. J. Clin. Virol. Off. Publ. Pan Am. Soc. Clin. Virol. 26, 361–368.
Chen, A.Y., Guan, W., Lou, S., Liu, Z., Kleiboeker, S., and Qiu, J. (2010). Role of Erythropoietin Receptor Signaling in Parvovirus B19 Replication in Human Erythroid Progenitor Cells. J. Virol. 84, 12385–12396.
Chiu, C.-C., Shi, Y.-F., Yang, J.-J., Hsiao, Y.-C., Tzang, B.-S., and Hsu, T.-C. (2014). Effects of human parvovirus B19 and bocavirus VP1 unique region on tight junction of human airway epithelial A549 cells. PloS One 9, e107970.
Chow, D.C., Wenning, L.A., Miller, W.M., and Papoutsakis, E.T. (2001). Modeling pO2 Distributions in the Bone Marrow Hematopoietic Compartment. II. Modified Kroghian Models. Biophys. J. 81, 685–696.
Cohen, B.J., Gandhi, J., and Clewley, J.P. (2006). Genetic variants of parvovirus B19 identified in the United Kingdom: Implications for diagnostic testing. J. Clin. Virol. 36, 152–155.
Cooling, L. (2015). Blood Groups in Infection and Host Susceptibility. Clin. Microbiol. Rev. 28, 801.
Corcioli, F., Zakrzewska, K., Rinieri, A., Fanci, R., Innocenti, M., Civinini, R., De Giorgi, V., Di Lollo, S., and Azzi, A. (2008). Tissue persistence of parvovirus B19 genotypes in asymptomatic persons. J. Med. Virol. 80, 2005–2011.
Corcoran, C., Hardie, D., Yeats, J., and Smuts, H. (2010). Genetic Variants of Human Parvovirus B19 in South Africa: Cocirculation of Three Genotypes and Identification of a Novel Subtype of Genotype 1. J. Clin. Microbiol. 48, 137–142.
Cossart, Y.E., Field, A.M., Cant, B., and Widdows, D. (1975). Parvovirus-like particles in human sera. Lancet Lond. Engl. 1, 72–73.
Deiss, V., Tratschin, J.-D., Weitz, M., and Siegl, G. (1990). Cloning of the human parvovirus B19 genome and structural analysis of its palindromic termini. Virology 175, 247–254.
Doerig, C., Hirt, B., Antonietti, J.-P., and Beard, P. (1990). Nonstructural protein of parvoviruses B19 and minute virus of mice controls transcription. J. Virol. 64, 387–396.
60
Eid, A.J., Brown, R.A., Patel, R., and Razonable, R.R. (2006). Parvovirus B19 infection after transplantation: a review of 98 cases. Clin. Infect. Dis. Off. Publ. Infect. Dis. Soc. Am. 43, 40–48.
Eis‐Hübinger, A.M., Reber, U., Edelmann, A., Kalus, U., and Hofmann, J. (2014). Parvovirus B19 genotype 2 in blood donations. Transfusion (Paris) 54, 1682–1684.
Ekman, A., Hokynar, K., Kakkola, L., Kantola, K., Hedman, L., Bondén, H., Gessner, M., Aberham, C., Norja, P., and Miettinen, S. (2007). Biological and immunological relations among human parvovirus B19 genotypes 1 to 3. J. Virol. 81, 6927–6935.
Gama, B.E., Emmel, V.E., Oliveira-Silva, M., Gutiyama, L.M., Arcuri, L., Colares, M., de Cássia Tavares, R., Bouzas, L.F., Abdelhay, E., and Hassan, R. (2017). Parvovirus B19 in the Context of Hematopoietic Stem Cell Transplantation: Evaluating Cell Donors and Recipients. Transplant. Direct 3, e217.
Ganaie, S.S., Zou, W., Xu, P., Deng, X., Kleiboeker, S., and Qiu, J. (2017). Phosphorylated STAT5 directly facilitates parvovirus B19 DNA replication in human erythroid progenitors through interaction with the MCM complex. PLOS Pathog. 13, e1006370.
Gatti, R., Meuwissen, H., Allen, H., Hong, R., and Good, R. (1968). Immunological reconstitution of sex-linked lymphopenic immunological deficiency. The Lancet 292, 1366–1369.
Grabarczyk, P., Kalińska, A., Kara, M., Wieczorek, R., Ejduk, A., Sulkowska, E., Gołębiowska-Staroszczyk, S., Matysiak, M., Baylis, S.A., and Brojer, E. (2011). Identification and characterization of acute infection with parvovirus B19 genotype 2 in immunocompromised patients in Poland. J. Med. Virol. 83, 142–149.
Grebien, F., Kerenyi, M.A., Kovacic, B., Kolbe, T., Becker, V., Dolznig, H., Pfeffer, K., Klingmüller, U., Müller, M., Beug, H., et al. (2008). Stat5 activation enables erythropoiesis in the absence of EpoR and Jak2. Blood 111, 4511–4522.
Guan, W., Cheng, F., Yoto, Y., Kleiboeker, S., Wong, S., Zhi, N., Pintel, D.J., and Qiu, J. (2008). Block to the production of full-length B19 virus transcripts by internal polyadenylation is overcome by replication of the viral genome. J. Virol. 82, 9951–9963.
Guan, W., Wong, S., Zhi, N., and Qiu, J. (2009). The Genome of Human Parvovirus B19 Can Replicate in Nonpermissive Cells with the Help of Adenovirus Genes and Produces Infectious Virus. J. Virol. 83, 9541.
Hokynar, K., Norja, P., Laitinen, H., Palomäki, P., Garbarg-Chenon, A., Ranki, A., Hedman, K., and Söderlund-Venermo, M. (2004). Detection and Differentiation of Human Parvovirus Variants by Commercial Quantitative Real-Time PCR Tests. J. Clin. Microbiol. 42, 2013–2019.
61
Hübschen, J.M., Mihneva, Z., Mentis, A.F., Schneider, F., Aboudy, Y., Grossman, Z., Rudich, H., Kasymbekova, K., Sarv, I., and Nedeljkovic, J. (2009). Phylogenetic analysis of human parvovirus B19 sequences from eleven different countries confirms the predominance of genotype 1 and suggests the spread of genotype 3b. J. Clin. Microbiol. 47, 3735–3738.
Ivanova, S.K., Mihneva, Z.G., Toshev, A.K., Kovaleva, V.P., Andonova, L.G., Muller, C.P., and Hübschen, J.M. (2016). Insights into epidemiology of human parvovirus B19 and detection of an unusual genotype 2 variant, Bulgaria, 2004 to 2013. Eurosurveillance 21.
Janovitz, T., Wong, S., Young, N.S., Oliveira, T., and Falck-Pedersen, E. (2017). Parvovirus B19 integration into human CD36+ erythroid progenitor cells. Virology 511, 40–48.
Karrasch, M., Schmidt, V., Hammer, A., Hochhaus, A., Rosée, P.L., Petersen, I., Sauerbrei, A., Baier, M., Sayer, H.G., and Hermann, B. (2017). Chronic persistent parvovirus B19 bone marrow infection resulting in transfusion-dependent pure red cell aplasia in multiple myeloma after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation and severe graft versus host disease. Hematol. Amst. Neth. 22, 93–98.
Ki, C.-S., Kim, I.-S., Kim, J.-W., Lee, N.-Y., Kim, S.H., Lee, K.W., Kim, S.-J., Joh, J.-W., Huh, W.S., and Oh, H.Y. (2005). Incidence and clinical significance of human parvovirus B19 infection in kidney transplant recipients. Clin. Transplant. 19, 751–755.
von Kietzell, K., Pozzuto, T., Heilbronn, R., Grössl, T., Fechner, H., and Weger, S. (2014). Antibody-mediated enhancement of parvovirus B19 uptake into endothelial cells mediated by a receptor for complement factor C1q. J. Virol. 88, 8102–8115.
Kurtzman, G.J., Cohen, B.J., Field, A.M., Oseas, R., Blaese, R.M., and Young, N.S. (1989). Immune response to B19 parvovirus and an antibody defect in persistent viral infection. J. Clin. Invest. 84, 1114–1123.
Leisi, R., Ruprecht, N., Kempf, C., and Ros, C. (2013). Parvovirus B19 Uptake Is a Highly Selective Process Controlled by VP1u, a Novel Determinant of Viral Tropism. J. Virol. 87, 13161–13167.
Liefeldt, L., Plentz, A., Klempa, B., Kershaw, O., Endres, A.-S., Raab, U., Neumayer, H.-H., Meisel, H., and Modrow, S. (2005). Recurrent high level parvovirus B19/genotype 2 viremia in a renal transplant recipient analyzed by real‐time PCR for simultaneous detection of genotypes 1 to 3. J. Med. Virol. 75, 161–169.
Lukashov, V.V., and Goudsmit, J. (2001). Evolutionary Relationships among Parvoviruses: Virus-Host Coevolution among Autonomous Primate Parvoviruses and Links between Adeno-Associated and Avian Parvoviruses. J. Virol. 75, 2729.
Luo, Y., and Qiu, J. (2015). Human parvovirus B19: a mechanistic overview of infection and DNA replication. Future Virol. 10, 155–167.
62
Marano, G., Vaglio, S., Pupella, S., Facco, G., Calizzani, G., Candura, F., Liumbruno, G.M., and Grazzini, G. (2015). Human Parvovirus B19 and blood product safety: a tale of twenty years of improvements. Blood Transfus. 13, 184–196.
Markova, A.A., Arelin, V., Jäckel, E., Richter, N., Lehner, F., Wagner, A.D., and Schiffer, M. (2016). Aseptic arthritis due to parvovirus B19 infection immediately after kidney and pancreas transplantation. Transplant. Rep. 1, 15–17.
Mor, O., Ofir, I., Pavel, R., Bassal, R., Kra-Oz, Z., Cohen, D., Shohat, T., and Mendelson, E. (2016). Parvovirus B19V infection in Israel: prevalence and occurrence of acute infection between 2008 and 2013. Epidemiol. Infect. 144, 207–214.
Munakata, Y., Saito-Ito, T., Kumura-Ishii, K., Huang, J., Kodera, T., Ishii, T., Hirabayashi, Y., Koyanagi, Y., and Sasaki, T. (2005). Ku80 autoantigen as a cellular coreceptor for human parvovirus B19 infection. Blood 106, 3449–3456.
Munakata, Y., Kato, I., Saito, T., Kodera, T., Ishii, K.K., and Sasaki, T. (2006). Human parvovirus B19 infection of monocytic cell line U937 and antibody-dependent enhancement. Virology 345, 251–257.
Musiani, M., Zerbini, M., Gentilomi, G., Plazzi, M., Gallinella, G., and Venturoli, S. (1995). Parvovirus B19 Clearance from Peripheral Blood after Acute Infection. J. Infect. Dis. 172, 1360–1363.
Neild, G., Anderson, M., Hawes, S., and Colvin, B.T. (1986). Parvovirus infection after renal transplant. The Lancet 328, 1226–1227.
Norbeck, O., Papadogiannakis, N., Petersson, K., Hirbod, T., Broliden, K., and Tolfvenstam, T. (2002). Revised Clinical Presentation of Parvovirus B19–Associated Intrauterine Fetal Death. Clin. Infect. Dis. 35, 1032–1038.
Norja, P., Hokynar, K., Aaltonen, L.-M., Chen, R., Ranki, A., Partio, E.K., Kiviluoto, O., Davidkin, I., Leivo, T., Eis-Hübinger, A.M., et al. (2006). Bioportfolio: Lifelong persistence of variant and prototypic erythrovirus DNA genomes in human tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 7450–7453.
Norja, P., Eis-Hübinger, A.M., Söderlund-Venermo, M., Hedman, K., and Simmonds, P. (2008). Rapid Sequence Change and Geographical Spread of Human Parvovirus B19: Comparison of B19 Virus Evolution in Acute and Persistent Infections. J. Virol. 82, 6427–6433.
Ozawa, K., and Young, N. (1987). Characterization of capsid and noncapsid proteins of B19 parvovirus propagated in human erythroid bone marrow cell cultures. J. Virol. 61, 2627–2630.
Ozawa, K., Ayub, J., Hao, Y.S., Kurtzman, G., Shimada, T., and Young, N. (1987). Novel transcription map for the B19 (human) pathogenic parvovirus. J. Virol. 61, 2395–2406.
63
Parsyan, A., Szmaragd, C., Allain, J.-P., and Candotti, D. (2007). Identification and genetic diversity of two human parvovirus B19 genotype 3 subtypes. J. Gen. Virol. 88, 428–431.
Pillet, S., Le Guyader, N., Hofer, T., NguyenKhac, F., Koken, M., Aubin, J.-T., Fichelson, S., Gassmann, M., and Morinet, F. (2004). Hypoxia enhances human B19 erythrovirus gene expression in primary erythroid cells. Virology 327, 1–7.
Plentz, A., Würdinger, M., Kudlich, M., and Modrow, S. (2013). Low-level DNAemia of parvovirus B19 (genotypes 1–3) in adult transplant recipients is not associated with anaemia. J. Clin. Virol. 58, 443–448.
Prabhakar, B.S., Allaway, G.P., Srinivasappa, J., and Notkins, A.L. (1990). Cell surface expression of the 70-kD component of Ku, a DNA-binding nuclear autoantigen. J. Clin. Invest. 86, 1301–1305.
Pyöriä, L., Toppinen, M., Mäntylä, E., Hedman, L., Aaltonen, L.-M., Vihinen-Ranta, M., Ilmarinen, T., Söderlund-Venermo, M., Hedman, K., and Perdomo, M.F. (2017). Extinct type of human parvovirus B19 persists in tonsillar B cells. Nat. Commun. 8.
Raab, U., Beckenlehner, K., Lowin, T., Niller, H.-H., Doyle, S., and Modrow, S. (2002). NS1 protein of parvovirus B19 interacts directly with DNA sequences of the p6 promoter and with the cellular transcription factors Sp1/Sp3. Virology 293, 86–93.
Sadigh, S., and Frank, D. (2017). Red cheeks to red cell aplasia: parvovirus B19 in a heart transplant patient. Blood 130, 1071–1071.
Saito, T., Munakata, Y., Fu, Y., Fujii, H., Kodera, T., Miyagawa, E., Ishii, K., and Sasaki, T. (2003). Evaluation of anti-parvovirus B19 activity in sera by assay using quantitative polymerase chain reaction. J. Virol. Methods 107, 81–87.
Schleuning, M., Jäger, G., Holler, E., Hill, W., Thomssen, C., Denzlinger, C., Lorenz, T., Ledderose, G., Wilmanns, W., and Kolb, H.J. (1999). Human parvovirus B19-associated disease in bone marrow transplantation. Infection 27, 114–117.
Servant, A., Laperche, S., Lallemand, F., Marinho, V., De Saint Maur, G., Meritet, J.F., and Garbarg-Chenon, A. (2002). Genetic diversity within human erythroviruses: identification of three genotypes. J. Virol. 76, 9124–9134.
Söderlund-Venermo, M., Hokynar, K., Nieminen, J., Rautakorpi, H., and Hedman, K. (2002). Persistence of human parvovirus B19 in human tissues. Pathol. Biol. (Paris) 50, 307–316.
Srivastava, A., and Lu, L. (1988). Replication of B19 parvovirus in highly enriched hematopoietic progenitor cells from normal human bone marrow. J. Virol. 62, 3059–3063.
64
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar, S. (2013). MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725–2729.
Tewary, S.K., Zhao, H., Deng, X., Qiu, J., and Tang, L. (2014). The human parvovirus B19 non-structural protein 1 N-terminal domain specifically binds to the origin of replication in the viral DNA. Virology 449, 297–303.
Toan, N.L., Duechting, A., Kremsner, P.G., Song, L.H., Ebinger, M., Aberle, S., Binh, V.Q., Duy, D.N., Torresi, J., Kandolf, R., et al. (2006). Phylogenetic analysis of human parvovirus B19, indicating two subgroups of genotype 1 in Vietnamese patients. J. Gen. Virol. 87, 2941–2949.
Toppinen, M., Perdomo, M.F., Palo, J.U., Simmonds, P., Lycett, S.J., Söderlund-Venermo, M., Sajantila, A., and Hedman, K. (2015). Bones hold the key to DNA virus history and epidemiology. Sci. Rep. 5.
Tu, M., Liu, F., Chen, S., Wang, M., and Cheng, A. (2015). Role of capsid proteins in parvoviruses infection. Virol. J. 12, 114.
Wan, Z., Zhi, N., Wong, S., Keyvanfar, K., Liu, D., Raghavachari, N., Munson, P.J., Su, S., Malide, D., Kajigaya, S., et al. (2010). Human parvovirus B19 causes cell cycle arrest of human erythroid progenitors via deregulation of the E2F family of transcription factors. J. Clin. Invest. 120, 3530–3544.
Wang, X.-S., Yoder, M.C., Zhou, S.Z., and Srivastava, A. (1995). Parvovirus B19 promoter at map unit 6 confers autonomous replication competence and erythroid specificity to adeno-associated virus 2 in primary human hematopoietic progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 12416–12420.
Watanabe, K., Otabe, K., Shimizu, N., Komori, K., Mizuno, M., Katano, H., Koga, H., and Sekiya, I. (2018). High-sensitivity virus and mycoplasma screening test reveals high prevalence of parvovirus B19 infection in human synovial tissues and bone marrow. Stem Cell Res. Ther. 9, 80.
Weigel-Kelley, K.A., Yoder, M.C., and Srivastava, A. (2003). α5β1 integrin as a cellular coreceptor for human parvovirus B19: requirement of functional activation of β1 integrin for viral entry. Blood 102, 3927–3933.
Wu, J., Chen, X., Ye, H., Yao, M., Li, S., and Chen, L. (2016). Nonstructural protein (NS1) of human parvovirus B19 stimulates host innate immunity and blunts the exogenous type I interferon signaling in vitro. Virus Res. 222, 48–52.
Würdinger, M., Modrow, S., and Plentz, A. (2017). Impact of Parvovirus B19 Viremia in Liver Transplanted Children on Anemia: A Retrospective Study. Viruses 9, 149.
Xiao, C., Wang, C.X., Liu, L.S., and Fu, Q. (2013). Clinical Investigation of Human Parvovirus B19 Infection After Renal Transplantation in China. Transplant. Proc. 45, 1593–1599.
65
Xu, P., Zhou, Z., Xiong, M., Zou, W., Deng, X., Ganaie, S.S., Kleiboeker, S., Peng, J., Liu, K., and Wang, S. (2017). Parvovirus B19 NS1 protein induces cell cycle arrest at G2-phase by activating the ATR-CDC25C-CDK1 pathway. PLoS Pathog. 13, e1006266.
Young, N.S., and Brown, K.E. (2004). Parvovirus B19. N. Engl. J. Med. 350, 586–597.
Zhi, N., Mills, I.P., Lu, J., Wong, S., Filippone, C., and Brown, K.E. (2006). Molecular and functional analyses of a human parvovirus B19 infectious clone demonstrates essential roles for NS1, VP1, and the 11-kilodalton protein in virus replication and infectivity. J. Virol. 80, 5941–5950.
