UNIVERZITET U NIŠU

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Fenolni sastav, antioksidativna i antimikrobna

aktivnost delova ploda i lišća Prunus spinosa L. iz

Jugoistočne Srbije

- Master rad -

Mentor:

dr Blaga Radovanović

Kandidat:

Miljan Milenković

Niš, 2013.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редниброј, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Миљан Миленковић

Ментор, МН: др Блага Радовановић

Наслов рада, НР: Фенолни састав, антиоксидативна и антимикробна активност делова плода и лишћа Prunus spinosa L. из Југоисточне Србије

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2013.

Издавач, ИЗ: Ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: пог лавља 6 / страна 37 /цитата 17 / табела 4 / слика и графика 22

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Органска хемија, Инструменталне методе у органској хемији

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Prunus spinosa L., фенолни састав, антиоксидативн, антимикробна активност

УДК [547.56 + 547.972 + 579.66] : 634.22 (497.11)

Чувасе, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН: Рад је рађен у лабораторији Природно-математичког факултета у Нишу

Извод, ИЗ: У овом раду одређена је концентрација укупних полифенола, естара винске киселине и флавонола, као и антиоксидативна активност делова плода и лишћa Prunus spinosa L. из Југоисточне Србије. Утврђено је присуство корелације између нађених фенолних једињења и антиоксидативне активности . Утврђена је антимикробна активност.

Датум прихватања теме, ДП: 15.01.2013.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: University master degree thesis

Author, AU: Miljan Milenković

Mentor, MN: Blaga Radovanović

Title, TI: Phenolic composition, antioxidant and antimicrobial activity of parts of the fruit and leaves of Prunus spinosa L. from Southeast Serbia

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2013

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: chapters 6 / pages 37 / ref 17 /tables 4 / pictures and graphs 22

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Organic chemistry, Instrumental methods in organic chemistry

Subject/Key words, S/KW: Prunus spinosa L., phenolic compound, antioxidant activity, antimicrobial activity

UC [547.56 + 547.972 + 579.66] : 634.22 (497.11)

Holding data, HD: library

Note, N: Done in laboratory of Faculty of Science an Mathematics in Nish

Abstract, AB: In this work determinated concentration of total phenolic compounds, esters of tartaric acid and flavonols, like the antioxidant activity parts of the fruit and leaves Prunus spinosa L. from Southeast Serbia. It was

determinated present corelation between determinated phenolic compounds and antioxidant activity parts of the fruit Prunus spinosa L. It was determinated antimicrobial activity.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2013.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

ОбразацQ4.09.13- Издање 1

Ekperimentalni deo ovog master rada rađen je na Odseku za hemiju Prirodno – matematičkog fakulteta u Nišu.

Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom, upućujem svom mentoru dr Blagi Radovanović na stručnoj pomoći,

ukazanom strpljenju i razumevanju.

Takođe se zahvaljujem profesorki Tatjani Mihailov Krstov i svima koji su mi na bilo koji način pomogli da

završim ovaj rad.

Posebnu zahvalnost bih ovom prilikom iskazao svojoj porodici i prijateljima na razumevanju i podršci koju su

mi pružili tokom studiranja.

Uvod

Sadržaj

1 UVOD ............................................................................................................................ 1

2 TEORIJSKI DEO ........................................................................................................ 2

2.1 Trnjina (Prunus spinosa L.) .................................................................................... 2

2.1.1 Botaničke karakteristike ................................................................................... 2

2.2 Hemijski sastav ....................................................................................................... 3

2.2.1 Fenolna jedinjenja ............................................................................................ 4

2.2.2 Taninske materije ............................................................................................. 7

2.2.3 Ugljeni hidrati .................................................................................................. 8

2.2.4 Pektinske materije ............................................................................................ 8

2.2.5 Organske kiseline ........................................................................................... 10

2.2.6 Vitamini ......................................................................................................... 10

2.2.7 Mineralne materije ......................................................................................... 12

2.3 Antioksidansi ......................................................................................................... 13

2.3.1 Mehanizam dejstva antioksidanasa ................................................................ 16

2.3.2 Slobodni radikali ............................................................................................ 16

2.3.3 Metode određivanja antioksidativne aktivnosti ............................................. 18

2.3.4 Mikrobiološka aktivnost ................................................................................ 19

2.4 UV/VIS spektrofotometrija ................................................................................... 20

3 EKSPERIMENTALNI DEO .................................................................................... 23

3.1 Materijal ................................................................................................................ 23

3.2 Reagensi i hemikalije ............................................................................................ 23

3.3 Aparatura ............................................................................................................... 23

3.4 Pripremanje uzoraka i ekstrakcija ......................................................................... 24

3.5 Metode ................................................................................................................... 24

3.5.1 Određivanje ukupnih fenola, flavonola i estara vinske kiseline .................... 24

3.5.2 Određivanje antocijana .................................................................................. 24

3.5.3 Određivanje antioksidativne aktivnosti .......................................................... 24

3.5.4 Odredjivanje antimikrobne aktivnosti ............................................................ 25

4 REZULTATI I DISKUSIJA ..................................................................................... 27

4.1 Određivanje fenolnih jedinjenja u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine .......... 27

4.2 Određivanje antioksidativne aktivnosti u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine 30

Uvod

4.3 Antioksidativna aktivnost u delovima ploda i lišća trnjine i njena korelacija sa

fenolnim jedinjenjima ...................................................................................................... 31

4.4 Određivanje antimikrobne aktivnosti u ekstraktima delova ploda i lišća trnjine .. 33

5 ZAKLjUČAK ............................................................................................................. 35

6 LITERATURA ........................................................................................................... 36

Uvod

1 UVOD

Bobičasto voće takozvane „crvene bobice“ obuhvata više od 1500 vrsta, većinom

u obliku malih grmova. U domaće prepoznatljive vrste ubrajaju se: kupina, malina,

jagoda, borovnica, ribizla, šipurak, glog, kleka, trnjina, trešnja, višnja i dud. Ono što je

zajedničko svom bobičastom voću jeste prisustvo hranljivih, farmakološki aktivnih

jedinjenja koja doprinose da voće kao hrana ima antioksidativno, antikancerogeno,

antimikrobno i citotoksično dejstvo.

Sami plodovi bobičastog voća su izuzetno bogati šećerom, kiselinama, vitaminima

(C i A), mineralima, biljnim vlaknima i mnogim bioflavonoidima. Konzumiraju se u

svežem ili prerađenom obliku, a poslednjih godina veliku primenu nalaze u farmaceutskoj

industriji. Mnoge vrste bobičastog voća spadaju u prirodne samonikle biljke, plodovi

divljih i gajenih biljaka mogu se preraditi na različite načine (voćni sokovi, džemovi,

kompoti, marmelade, voćno vino) i svi ovi proizvodi su vitaminski mnogo vredniji od

proizvoda od kultivisanog voća.

Bobice sadrže esencijalnih kiselina i minerala, a kako najveće količine vitamina C

i provitamina A koncentrisana je u samoj kori (opni) voća, ukazuje da sušenjem voća

možemo dobiti čajne sirovine koje imaju antioksidativna svojstva.

Postoje mnogobrojne studije o pozitivnim efektima bobičastih plodova na imuni

sistem, krvni pritisak, sa dokazanim antibakterijskim i antivirusnim dejstvom, pre svega

zbog visokog sadržaja antocijana. [14]

U ovom radu biće ispitivan fenolni sadržaj delova ploda i lista trnjine (Prunus

spinosa L.) iz Jugoistočne Srbije (okoline Bele Palanke) i određena njihova

antioksidativna i antimikrobna aktivnost.

Slika 1.1. Trnjina (Prunus spinosa L.)

Teorijski deo

2

2 TEORIJSKI DEO

2.1 Trnjina (Prunus spinosa L.)

2.1.1 Botaničke karakteristike

Sistematika trnjine (Prunus spinosa L.) prikazana je u tabeli 2.1, a izgled trnjine

na slici 2.1.

Tabela 2.1 Sistematika trnjine (Prunus spinosa L.)

Sistematika trnjine

Carstvo: Plantae - Biljke

Divizija: Magnoliophyta

Razred: Magnoliopsida

Red: Rosales

Porodica: Rosaceae

Potporodica: Prunoideae

Rod: Prunus

Slika 2.1. Trnjina (Prunus spinosa L.)

Trnjina (Prunus spinosa L.) ponekad i nazivana trnula, trnavka, trn, crni trn, divlja

šljiva, mačja šljiva je listopadna žbunasta i bodljikava biljka. Iz dubokog i razgranatog

korena raste listopadni grm visine od 1 do 5 m s trnovitim granama. Listovi su

naizmenični, imaju peteljke, jajoliki su, nazubljenog oboda, dlakavi po žilicama naličja.

Cvetovi su dvopolni, petočlani, rastu pojedinačno na kratkim drškama, a cvetaju pre

listanja u aprilu i maju a latice su bele boje. Plodovi su okrugle, tamnoplavo-sivkaste

koštunice, oporog i kiselog ukusa, veličine oko 1 cm.

Teorijski deo

3

Trnjina je rasprostranjena u skoro celoj Evropi, Maloj Aziji, Iranu i delu severne

Afrike. Uspeva uz rubove šuma, na neplodnim zemljištima i pašnjacima, po brežuljcima,

kraj puteva, naročito na suvom, kamenitom i sunčanom zemljištu. U našoj zemlji je

široko rasprostranjena vrsta u pojasu hrastovih šuma. Raste i na području Stare planine.

Kod nas je još ima pokraj Tamiša, kraj obodnih kanala i poljskih puteva. Nalazi se do

1000 odnosno do 1300 i 1500 m nadmorske visine. Podnosi niske temperature i do -30˚C.

Pogodna je za zaštitu strmih i jaružastih terena od erozije zbog obilja široko razvedenog

korenovog sistema.

Trnjina se koristi za pravljenje soka, sirupa, vina, a u nekim zemljama i za

pravljenje žestokih pića (naročito likera). Može se stavljati i u voćne pite [15]. Od

cvetova trnjine pravi se čaj. Cvet se bere od marta do aprila, plod u jesen, kad ga je mraz

omrazio, a koren u proleće i jesen. Listovi su bogati viaminom C i koriste se za čaj. Beru

se dok su još mladi, u drugoj polovini aprila i u maju. Trnjina se koristi i kao ukrasna

biljka za žive ograde i za sprečavanje erozije tla. Semenka ploda je otrovna jer sadrži

otrovni glukozid amigdalin koji se, u organizmu čoveka i životinja, dejstvom enzima

razlaže na glukozu, benzaldehid i veoma otrovnu cijanovodoničnu kiselinu.

Trnjina se, zbog svojih lekovitih osobina, ubraja u lekovite biljke. Lekovitost

ispoljavaju: koren, kora, list, cvet i plod. Čaj od korena trnjine pomaže u lečenju groznice.

Kora pomaže u lečenju dijareje i dizenterije. Listovi su bogati viaminom C i koriste se za

čaj. Cvetovi jačaju želudac, umiruju grčeve želuca, pospešuju izlučivanje urina, kamenca

u bubregu, sprečava hipertrofiju prostate, čiste krv, odstranjuju kožne osipe. Svež sok

trnjine smiruje upalu želuca i izuzetno je delotvoran protiv žutice, a sirup je delotvoran u

lečenju reume. Koktel od soka i čaja od korena trnjine je efikasno sredstvo za ispiranje i

osvežavanje usta i umirenje krvarenja iz nosa.

2.2 Hemijski sastav

Trnjina sadrži najviše vitamin C, ali vitamine A, B1, B2, B6, E, ugljene hidrate

(glukozu, fruktozu, saharozu), fenolna jedinjenja (antocijane, tanine) i organske kiseline

(jabučnu i dr.) i vodu. Od mineralnih materija zastupljeni su natrijum, kalijum, kalcijum,

magnezijum, gvožđe i fosfor. U plodu i kori ima tanina i gorkih materija, u stabljici i lišću

ima kalijuma, kalcijuma i flavonoida, a u plodu ima pektina, jabučne i cijanovodonične

kiseline, kao i vitamina C.

Teorijski deo

4

2.2.1 Fenolna jedinjenja

Poslednjih godina su mnoga polifenolna jedinjenja privukla pažnju naučnika iz

oblasti hemije, hrane i medicine zbog svojih antioksidativnih, antimutagenih,

antikancerogenih i antibakterijskih osobina. S obzirom na veliku raznovrsnost biljnih

fenola, njihova klasifikacija je veoma kompleksna. Podela fenolnih jedinjenja data je u

tabeli 2.2.

Tabela 2.2 Podela fenolnih jedinjenja

Osnovni

skelet

Klasa Primer

C6 Jednostavni fenoli

Benzohinoni

Katehol, hidrohinon, rezorcinol

C6-C1 Fenolne kiseline p-Hidroksibenzoeva kiselina, salicilna

kiselina

C6-C2 Fenilsirćetne

kiseline

p-Hidroksifenilsirćetna kiselina

C6-C3 Fenilpropeni Eugenol, mirsticin

Kumarini Umbeliferon, eskuletin, skopolin

Hromoni Eugenin

C6-C4 Naftohinoni Juglon

C6-C1-C6 Ksantoni Mangostin, mangiferin

C6-C2-C6 Stilbeni Razveratrol

Antrahinoni Emodin, hrizofanol, rein

C6-C3-C6 Flavonoidi

Flavoni

Sinensetin, nobiletin, izosinensitin,

tangeretin,diosmin

Flavonoli Kvercetin, kempferol

Flavonol glikozidi Rutin

Flavanoli

Dihidroksikvercetin i

dihidroksikempferol glikoizdi

Flavanoni Hesperidin, naringenin

Flavanon glikozidi Neohesperidin, narirutin,

naringin,eriocitrin

Antocijanini Glikozidi pelargonidina, peonidina,

delifinidina, petunidina, cijanidina

Flavanoli (katehini) (+)-Katehin, (-)-epikatehin, (+)-

galokatehin, (-)-epigalokatehin

Halkoni Floridžin, arbutin, halkonaringenin

(C6-C3)2 Lignini Pinorezinol

(C6-C3-C6)2 Biflavonoidi Agatisflavon

Teorijski deo

5

2.2.1.1 Flavonoidi

Flavonoidi su polifenoli široke rasprostranjenosti u biljnom svetu. To su

rastvorljivi pigmenti koji se mogu naći u korenju, lišću, semenkama, pokožici voća i

cvetu viših biljaka, a prilikom prerade voća i povrća prelaze u sok u kom su dobro

rastvorljivi. Flavonoidi predstavljaju najveću grupu polifenolnih jedinjenja. Do danas je

izolovano preko 4000 jedinjenja iz ove grupe. Flavonoidi ispoljavaju veliki broj biološki

značajnih aktivnosti kao što je antioksidativna aktivnost. Antioksidsansi imaju zadatak da

smanje oksidativna oštećenja kod ljudi izazvanih slobodnim radikalima i reaktivnim

kiseoničnim vrstama u uslovima „oksidativnog stresa”. Ova jedinjenja čine najveću grupu

biljnih polifenola, nalaze se u značajnim količinama u povrću i voću, kao i u biljnim

prehrambenim proizvodima. Pokazuju širok spektar antioksidantnih svojstava in vitro.

Sposobni su da vezuju metalne jone gradeći helate i da prekinu reakcije stvaranja

slobodnih radikala. U poslednjih nekoliko godina flavonoidi i druga fenolna jedinjenja

biljnog porekla imaju važno mesto, posebno u oblasti farmacije i medicine, zbog

njihovog potencijala da spreče veliki broj hroničnih i degenerativnih bolesti, uključujući

maligna oboljenja i kardiovaskularne bolesti. Različite studije, in vitro i in vivo pokazale

su da flavonoidi poseduju antioksidativne, antimutagene, antivirusne, antimikrobne,

antiinflamatorne, antikancerogene i imuno-modulatorske efekte.

Kvercetin je najaktivniji od većine bioflavonoida, a biološka aktivnost brojnih

biljaka upravo zavisi od njegovog sadržaja. Dobar je antiinflamatorni agens, jer učestvuje

u blokiranju nekoliko inflamatornih procesa. Blokira sintezu, a samim tim i oslobađanje

histamina i drugih medijatora upale. Veoma je jak antioksidans, pa štiti LDL-holesterol

od oksidacije i smanjuje opasnost od njegovog nakupljanja na unutrasnjim zidovima

arterija. Sprečava zgrušavanje krvi i stvaranje krvnih ugrušaka.

Slika 2.2. Strukturna formula kvercetina

Teorijski deo

6

U zavisnosti od stepena oksidacije centralnog piranovog prstena kao i od pozicije

sekundarnog aromatičnog prstena flavonoidi su podeljeni u više klasa i potklasa:

1. Fenilhromoni (pravi flavonoidi),

- flavoni, flavonoli (monomerni i dimerni)

- flavanoni i dihidroflavonoli

- izoflavoni i izoflavononi

2. Fenilhromani (gradivne jedinice tanina),

- flavani

- flavan-3-oli i flavan-3,4-dioli

3. Halkoni i dihidrohalkoni,

4. Auroni i antocijani.

Strukturna raznolikost flavonoida rezultat je brojnih modifikacija osnovne

skeletne strukture, koje su uslovljene reakcijama hidrogenizacije, hidroksilacije, O-

metilacije hidroksilnih grupa, dimerizacije, vezivanja neorganskog sulfata i

glikolizacijom hidroksilnih grupa ili flavonoidnog jezgra. Osnovnu strukturu flavonoida

čini difenilpropan (C6-C3-C6). Ugljenikov skelet flavonoida sadrži dva benzenova prstena

(A i B) međusobno povezana tročlanim ugljeničnim nizom, koji sa atomom kiseonika

formira heterociklični prsten.

Slika 2.3. Struktura flavonoida

U zavisnosti od tipa strukture flavonoidi se dele u šest podgrupa:

1. flavonoli,

2. flavoni,

3. izoflavoni,

4. flavanoni,

5. antocijanidini i

6. flavanoli (katehini i proantocijanidini).

Teorijski deo

7

2.2.1.2 Antocijani

Antocijani su biljni pigmenti crvene do plave boje. Među svim biljnim

pigmentima oni su najranije privukli pažnju mnogih istraživača. Naziv antocijani dolazi

od grčke reči »antos« - cvet i »kyaneos« - plav. Nalaze se u cvetnim laticama i u drugim

delovima viših biljaka. Antocijani su najviše prisutni u pokožici ploda trnjine.

Antocijani pripadaju flavonoidima. U prirodi se ne pojavljuju u obliku aglikona

(antocijanidina), već kao glikozidi i to najčešće kao 3-glikozidi. Šest aglikona su

najrasprostranjeniji u prirodi a to su: cijanidin, delfinidin, petunidin, pelargonidin,

peonidin i malvidin. Najzastupljeniji je cijanidin. Antocijanidini imaju u osnovi 2-

fenilbenzopirilijum ili flavilijum jon i variraju jedino po broju OH i OCH3 grupa. Derivati

su benzopirilijum-hlorida.

Slika 2.4. Strukturna formula benzopirilijum-hlorida

Svi antocijanidini sadrže 3,5,7-trihidroksi-flavilijum-jon. Pelargonidi, cijanidin i

delifinidin su jedinjenja koja se razlikuju samo po položaju hidroksilne grupa u prstenu B.

Metilovanjem ovih hidroksilnih grupa dobijaju se novi pigmenti: peonidin, petunidin i

melvinidin.

2.2.2 Taninske materije

Tanini (polifenoli) ili štavne materije su složena jedinjenja biljnog porekla koja

imaju opor ukus. Sa solima gvožđa obrazuju rastvore crne, plave i zelene boje. Mogu da

ispunjavaju čitavu vakuolu biljne ćelije koja tada dobija naziv taninska vakuola. Nalaze

se u stablima i listovima nekih biljaka a sadrže ih i zeleni plodovi koji zbog toga imaju

opor ukus. Sazrevanjem plodova količina tanina u njima se smanjuje. Osim u medicinu,

našli su primenu u industriji kože za štavljenje.

Teorijski deo

8

Lekovitost tanina i njihova upotreba je višestruka:

imaju dejstvo protiv bakterija i gljiva

deluju hemostatično jer sužavaju krvne sudove i stvaraju čep od zgrušane krvi

ublažavaju i leče dizenteriju

protivotrovi su različitim materijama

2.2.3 Ugljeni hidrati

U plodu trnjine prisutni su monosaharidi glukoza i fruktoza, kao i disaharid

saharoza.

Glukoza ili grožđani šećer je najrasprostranjeniji monosaharid. U slobodnom

stanju se nalazi u biljnim plodovima i krvi sisara. Glukoza ima vrlo sladak ukus, lako je

rastvorljiva u vodi, a takođe je i neophodna za održavanje života jer kada se razgradi u

citoplazmi žive ćelije oslobađa velike količine energije potrebne za mnoge životne

funkcije.

Fruktoza ili voćni šećer je vrlo sladak šećer koji je dobro rastvorljiv u vodi. U

prirodi se nalazi zajedno s glukozom u slatkom voću i medu. Sa glukozom

čini saharozu gde se nalazi u D-furanoznom obliku. Slobodna fruktoza česta je u voću, a

vezana za glukozu čini disaharid saharozu. Najslađa je od svih monosaharida, dva puta je

slađa od glukoze, a 1,73 puta od saharoze.

Saharoza, poznata kao običan šećer, je disaharid koji se sastoji od molekula

glukoze i fruktoze. Neizbežni je dodatak namirnicama zbog slatkosti i zbog svojih

funkcionalnih osobina. Saharoza je namirnica koju organizam lako usvaja i koja za

organizam predstavlja brzi izvor energije dovodeći do naglog porasta koncentracije

glukoze u krvi. Čista saharoza se najčešće dobija kao fini, kristalni prašak bez boje i

mirisa, ugodnog slatkog ukusa.

2.2.4 Pektinske materije

Pektinske materije su heteropolisaharidi koji se nalaze u ćelijskom zidu biljaka.

Samo ime pektin potiče od grčke reči "pektos" što u prevodu znači želiran, ukrućen.

Komercijalni pektin je beli amorfini prah.

Teorijski deo

9

Pektinske materije su koloidne prirode, čija je osnovna gradivna jedinica

anhidrogalakturonska kiselina, međusobno povezana α-1,4 glukozidnom vezom i

ramnoza, povezana α-1,2 glukozidnim vezama za galakturonsku kiselinu. Karboksilne

grupe galakturonske kiseline su delimično esterifikovane metanolom ili slobodne,

odnosno delimično ili potpuno neutralisane jednom ili više baza. Sekundarne alkoholne

grupe mogu biti parcijalno acetilovane.

Pored galakturonske kiseline i ramnoze u molekulu pektinskih materija nalaze se i

neutralni šećeri, kao što su arabinoza, galaktoza i ksiloza u bočnim lancima.

Karakteristike sastava (vrsta i položaj neutralnih šećera, bočni lanci, stepen esterifikacije,

molekulska masa) zavise od sirovine i stepena zrelosti.

Prema nomenklaturi američkog hemijskog društva za različite oblike pektinskih

materija koriste se sledeći izrazi: protopektin, pektininske kiseline i pektinske kiseline.

Protopektin je u vodi nerastvorljiva frakcija, čijom ograničenom hidrolizom

(kiselom, baznom, enzimskom) nastaju pektininska i pektinska kiselina. Protopektin

predstavlja jedinjenje kompleksne građe. Danas se smatra da se protopektin sastoji od

polimerizovanih jedinica galakturonske kiseline i ramnoze za koje su vezane celuloza,

hemiceluloza, lignin i druge materije. Protopektin daje čvrstoću biljnom tkivu i nalazi se

u većoj količini u nezrelim plodovima. Sazrevanjem plodova protopektin, dejstvom

enzima protopektinaze, prelazi u rastvorljivi pektin što za posledicu ima omekšavanje

plodova.

Pektininske kiseline predstavljaju poligalakturonske kiseline sa karboksilnim

grupama koje su potpuno ili delom esterifikovane metil alkoholom. Koloidno su

rastvorljive u vodi. Jedan broj ovih kiselina pod pogodnim uslovima (prisustvo šećera i

kiselina ili sa određenim metalnim jonima ako poligalakturonski lanac sadrži malo

metoksilnih grupa) može da stvara gel. Pektininske kiseline sa metalima grade soli

pektinate.

Slika 2.5. Strukturna formula pektininske kiseline

Teorijski deo

10

Pektininske kiseline koje imaju sposobnost stvaranja gela nazivaju se pektinima.

Termin pektini ima više praktičan i komercijalan značaj. Prema stepenu esterifikacije

pektini se dele na visokoesterifikovane i niskoesterifikovane.

Pektinske kiseline su deesterifikovane pektininske kiseline i ne poseduju svojstvo

želiranja. Sa metalima grade soli pektate.

Slika 2.6. Strukturna formula pektinske kiseline

Sadržaj pektinskih materija je značajan za one vrste voća koje se prerađuju u

želirane proizvode kao i za proizvodnju kašastih sokova. [17]

2.2.5 Organske kiseline

Od organskih kiselina, u trnjini je najzastupljenija jabučna kiselina. Jabučna

kiselina, C4H6O5, je dvobazna organska kiselina prisutna u kiselom voću. To su bezbojni

igličasti kristali rastvorljiviu vodi i alkoholu. Nastaje, kao i druge organske kiseline, u

listu, a u manjoj meri i u bobici dok je još zelena i dok obavlja funkciju asimilacije kao i

list.

2.2.6 Vitamini

Vitamini su složena organska jedinjenja koja se nalaze u malim količinama u

biljnim i životinjskim tkivima. Nauka je poslednjih godina otkrila i dokazala ogromnu

ulogu koju imaju vitamini u ishrani.

Vitamin C ili L-askorbinska kiselina u prirodi se nalazi u obliku

dehidroaskorbinske kiseline. Mogu ga sintetizovati biljke i neke životinje, a nalazi se u

šipku, paprici, kupusu, spanaću i limunu. Ima veoma važnu ulogu u stvaranju kostiju i

hrskavice, a neophodan je i za zarastanje rana. Dokazano je da smanjuje toksičnost nekih

lekova. Fiziološko dejstvo ogleda se u učestvovanju u oksido-redukcionim procesima

metabolizma ćelija. Nedostatak vitamina C u hrani dovodi do pojave skorbuta.

Teorijski deo

11

Vitamin A je visokomolekularni alkohol, viskozna žuta, uljana tečnost rastvorljiva

u mastima. Nastaje u organizmu iz karotena, žutog pigmenta iz biljaka. Dnevne potrebe

organizma za ovim vitaminom iznose od 0,8 do 1,5 mg. Ima ga u šargarepi, zelenom

povrću, buteru, siru, žumancu, ribljem ulju, peršunu, jegulji, kajsijama. Uništava se

oksidacijom i delovanjem ultraljubičastih zraka.

Vitamin A je neophodan za stvaranje kolagenih tkiva, u toku rasta. Učestvuje u

regulaciji sinteze belančevina. Vitamin A učestvuje u reakcijama koje deluju na stabilnost

ćelijske membrane i membrana ćelijskih organela (lizozoma i mitohondrija), tj. učestvuje

u očuvanju strukturalnog integriteta i normalne propustljivosti ćelijske membrane.

Neophodan je za normalnu funkciju i građu svih epitelnih ćelija, u borbi protiv

infektivnih bolesti, za normalnu funkciju žlezda (naročito tiroidne i polnih žlezda), organa

za varenje i jetre.

Ima izraženu antioksidativnu ulogu, koja se najjasnije pokazuje prilikom zaštite

od infekcija. Nedostatak uzrokuje noćno slepilo, promene na koži i probavnom sistemu,

slabost organizma, deformacije kostiju, isušivanje i mekšanje rožnjače. Vitamina A

ili beta-karotena ima u namirnicama i životinjskog i biljnog porekla.

Vitamin B1 ili tiamin predstavlja jedan od vitamina B grupe koji su rastvorljivi u

vodi i učestvuju u mnogim metaboličkim procesima u organizmu. Vitamin B1 je

neophodan za stvaranje energije iz ugljenih hidrata, za pravilno funkcionisanje nervnih

ćelija, za rad svih mišićnih vlakana. Glavni izvori vitamina B1 su: pivski kvasac, žitne

klice i mekinje, žitna zrna, kupus, razno voće i plodovi. U današnje vreme nedostatak

vitamina B1 najčešće se javlja kod alkoholičara, jer velike količine alkohola smanjuju

usvajanje tiamina u organizmu. Na taj način dolazi do nastanka bolesti beri-beri, pri čemu

se oštećuju nervi, mozak i srčani mišić. Čoveku je potrebno dnevno da uzima oko 1 mg

ovog vitamina, što je sasvim dovoljno ako se hranimo mešovitom hranom, pre svega

svežom biljnom. [12]

Vitamin B2 ili riboflavin je vitamin B-kompleksa koji se primenjuje u obliku soli

rastvorljivih u vodi. Ima važnu ulogu u metaboličkim procesima celog tela pa je

neophodan u iskorišćavanju energije iz hrane. Izvori vitamina B2 su jetra, bubreg, riba,

jaja, mleko, zeleno povrće i razno voće. [13]

Vitamin B6 ili piridoksin je vitamin B-kompleksa rastvorljiv u vodi. To je beli

kristalan prašak. Najviše ga ima u biljnom i životinjskom tkivu, naročito u jetri i

bubrezima, zatim u kvascu, ribi, soji, jajima, voću i povrću. Preporučene dnevne količine

Teorijski deo

12

za odrasle muškarce su 2 mg, a za odrasle žene 1,6 mg. Simpomi nedostatka se

ispoljavaju na koži.

Vitamin E je antioksidans u oksidoredukcionim procesima metabolizma ugljenih

hidrata, masti, fosfata i kreatina. Rastvorljiv je u mastima i štiti supstance koje se lako

oksiduju (npr. vitamin A). Potrebe organizma za vitaminom E dovode se u vezu sa

sadržajem polunezasićenih masnih kiselina u telesnim tkivima (štiti od njihove

peroksidne oksidacije); Smatra se da su životinje i čovek nesposobne da sintetišu ovaj

vitamin. Vitamin E sprečava nastanak arterijskog plaka, suženje arterija i razvoj

ateroskleroze. Takođe, sprečava oksidaciju masti i oštećenja krvnih sudova,

ugradnju holesterola u arterijski plak, a na taj način sprečava i razvoj oboljenja srca i

krvnih sudova. Smatra se da je vitamin E zajedno sa drugim antioksidansima iz hrane

(vitamin C, flavonoidi) dobra prevencija za sprečavanje nastanka oboljenja srca i krvnih

sudova, malignih oboljenja, a doprinosi i poboljšanju opšteg zdravlja.

Depo vitamina E u organizmu se nalazi u masnom tkivu. Kao antioksidans,

vitamin E sprečava oksidaciju poluzasićenih masnih kiselina (membranskih lipida) te

reaguje sa slobodnim radikalima, i to pretežno sa peroksidnim radikalima. Tokoferoli su

vrlo rasprostranjeni u hrani. Bogati izvor vitamina E su biljna ulja, a

posebno suncokretovo, semenke, bademi, kikiriki, jaja i dr. Druge namirnice koje sadrže

vitamin E su: orasi, lešnici, hladno ceđena biljna ulja (maslinovo, kukuruzno, sojino),

spanać. Preporučene dnevne količine su za odraslu ženu 8 mg, a za odraslog zdravog

muškarca su 10 mg. Vitamin E nije dobro držati u plastici ili uz plastiku jer se veže za nju

što bi izazvalo razne probleme.

2.2.7 Mineralne materije

Natrijum je najzastupljeniji katjon vanćelijske tečnosti. Ima važnu ulogu u

regulaciji zapremine krvi, krvnog pritiska,osmotske ravnoteže i održavanja konstantne pH

vrednosti.

Kalijum je jedan od najčešće pripisivanih minerala. Koristi se u situacijama kada

dolazi do gubitka kalijuma iz organizma, kao što je terapija diureticima. Reguliše

metabolizam vode i soli unutar ćelije, osmotski pritisak, kiselo-baznu ravnotežu,

normalizuje rad srca. Ima važnu ulogu u biosintezi proteina, aktivira veliki broj enzima,

posebno onih koji učestvuju u stvaranju energije.

Teorijski deo

13

Kalcijum je gradivni element kostiju i zuba, neophodan je za mišićne kontrakcije,

prenošenje nervnih signala, za izlučivanje hormona i enzima. Stalan nivo kalcijuma u krvi

je neophodan da bi se procesi u organizmu nesmetano odvijali.

Magnezijum je mineral koji je uključen u preko 300 reakcija u organizmu. Važan

je za sve organe, a naročito za pravilan rad srca, mišića, bubrega, izgradnju zuba i kostiju.

Primenjuje se kod srčanih oboljenja, grčeva i slabosti mišića, zatvora, nedostatka

magnezijuma, alkoholizma, dijabetesa, kod astme, hroničnog umora, osteoporoze,

migrenskih glavobolja.

Gvožđe je sastavni deo hemoglobina koji omogućava transport kiseonika u krvi.

Anemija ili malokrvnost je nedostatak hemoglobina ili eritrocita. Anemija nastaje usled

nedovoljnog unošenja gvožđa u organizam, kod povećanih potreba za gvožđem

(trudnoća, dojenje, deca u periodu rasta i razvoja), smanjene apsorpcije gvožđa u crevima

i kao posledica krvarenja.

Fosfor je posle kalcijuma najzastupljeniji element u organizmu. U ljudskom

organizmu ga ima približno 1% od njegove ukupne telesne težine. Prisutan je u svakoj

ćeliji, ali ga najviše ima u kostima i zubima (oko 85% od ukupnog fosfora).

2.3 Antioksidansi

U vreme pojave prvih živih bića, Zemljina atmosfera je bila siromašna kiseonikom

i prva bića su bila anaerobna. Anaerobni organizmi su preživljavali takve uslove, ali im je

razvoj bio zaustavljen. Evolucijom, razvojem fotosintetskim organizama, povećavao se

sadržaj kiseonika u atmosferi, a živi organizmi su počeli da razvijaju antioksidativni

odbrambeni sistem kako bi se zaštitili od kiseonikove toksičnosti.

Kiseonik ima dvostuku funkciju u organizmu: neophodan je za život, ali je ujedno

i izvor potencijalno štetnih čestica – slobodnih radikala. Slobodni radikali nastaju kao

rezultat zagađenja vazduha, radijacije, preteranog izlaganja suncu, stresa, ali i zbog

prekomernog unosa industrijske hrane i hrane bogate zasićenim masnoćama. Savremena

naučna istraživanja pokazuju da je oksidativni stres jedan od glavnih uzroka različitih

neizlečivih oboljenja kao što su: ateroskleroza, dijabetes, maligna oboljenja, srčani

infarkt, moždani infarkt i druge teške i hronične bolesti. Sredstva za lečenje ovih bolesti

su antioksidansi.

Teorijski deo

14

Da bi se proizvod očuvao od niza nepoželjnih oksidativnih promena usled kojih

može doći do promena organoleptičkih i hemijskih svojstava hrane, dodaju se

antioksidansi. Široko definisani, antioksidansi su jedinjenja koja inhibiraju ili odlažu

oksidaciju substrata iako su prisutni u značajno manjoj količini od substrata koji podleže

oksidaciji.

Prema Pravilniku o kvalitetu i uslovima upotrebe aditiva u namirnicama i drugim

zahtevima za aditive i njihove mešavine, antioksidansi su supstance koje produžavaju

trajnost prehrambenih proizvoda štiteći ih od kvarenja prouzrokovanog oksidacijom, kao

što su užeglost masti i promena boje, uključujući i sinergiste antioksidanasa. Dodati u

malim količinama imaju sposobnost da spreče oksidaciju nekih sastojaka hrane, a da ne

utiču na promenu svojstava hrane. U širem smislu ova jedinjenja spadaju u „aditive

hrane“, a svaki antioksidans koji se koristi mora biti odobren propisima koji važe za taj

proizvod.

Oksidativne promene mogu da dovedu do:

promene u ukusu i mirisu (na užeglost)

potamnjivanje (promena boje)

gubitka labilnih sastojaka (vitamina i sl.).

Užeglost nastaje zbog oksidativnog razlaganja masnih kiselina. Ovu pojavu

aktivira svetlost (naročito UV), prisustvo kiseonika i prisustvo metala (Pb, Cu, Fe) koji

deluju katalitički.

Oksidacioni procesi se odvijaju u nekoliko faza: najpre dolazi do dehidratacije,

zatim vezivanja kiseonika i obrazovanja peroksida, a u završnoj fazi dolazi do izdvajanja

peroksida, aldehida, ketona i kiselina koji su kao sekundarno nastala jedinjenja nosioci

neprijatnog ukusa i užeglosti.

Promene boje i potamnjivanje su uglavnom oksidacione promene fenolnih

jedinjenja u prisustvu odgovarajućih fermenata, pri čemu nastaju jedinjenja tipa hinona.

Nagomilavanjem i polimerizacijom ovih jedinjenja pojavljuje se najpre žuta do svetlo-

mrka boja koja kasnije prelazi u mrku boju.

Gubitak lako oksidujućih sastojaka prvenstveno se odnosi na vitamin C. Kako

veliki broj voća i povrća sadrži vitamin C ili se on dodaje radi vitaminizacije proizvoda,

ovaj gubitak može da bude značajan. Da bi se sprečile ove pojave koriste se antioksidansi.

Teorijski deo

15

Antioksidansi se dele na dve grupe: pravi antioksidansi i sinergisti. Pravi antioksidansi su

najčešće jedinjenja koja po hemijskom sastavu spadaju u orto- i para-difenole ili imaju

sličnu elektronsku konfiguraciju.

Oksidacione reakcije mogu proizvoditi slobodne radikale, izuzetno štetne,

visokoreaktivne čestice koji u organizmu nastaju kao međuprodukti uobičajenih

metaboličkih procesa. Slobodni radikali, čiji je najčešći izvor kiseonik, započinju lančane

reakcije koje oštećuju ćelije. Antioksidansi zaustavljaju ove lančane reakcije tako što se

sami oksiduju, pri čemu se mogu smatrati redukcionim sredstvima.

U novije vreme pažnju zaokupljuju biljke sa antioksidativnom aktivnošću, usled

pojave sve većeg broja malignih oboljenja, kardio-vaskularnih bolesti i infekcija. Smatra

se da su ovi poremećaji izazvani, u najvećem broju slučajeva, štetnim delovanjem

slobodnih radikala.

Biljke i životinje poseduju kompleksne sisteme različitih antioksidanasa kao što je

glutation, vitamin C i vitamin E, kao i enzimi: katalaza, superoksid dismutaza i različite

peroksidaze. Nizak nivo antioksidanasa ili inhibicija enzima prouzrokuje antioksidativni

stres i može oštetiti ili ubiti ćelije. Pošto oksidativni stres može biti uzrok ljudskih

oboljenja kao što su: ateroskreloza, dijabetes, maligna obolenja, srčani infarkt, moždani

infarkt i druge teške i hronične bolesti, primena antioksidanasa se u farmakologiji

intenzivno proučava, delimično i kao tretman za neurodegenerativne bolesti.

Antioksidansi se široko primenjuju kao sastojci u dijetetskim proizvodima. Pored

primene u medicini, antioksidansi imaju primenu u prehrambenoj i kozmetičkoj industriji,

(dodaci u hrani i kozmetici). Antioksidansi stabilizuju materije podložne oksidaciji tj.

sprečavaju novu degradaciju. Od davnina je poznata antioksidativna osobina raznih

začinskih biljaka. Korišćeni su kao dodaci hrani ne samo za poboljšanje arome već i za

očuvanje kvaliteta.

Postoji veliki broj prirodnih antioksidanata, a najvažniji među njima su vitamini

(α-tokoferol-vitamin E, askorbinska kiselina-vitamin C, retinol-vitamin A, tiamin i

riboflavin-vitamini B1 i B2, itd.), flavonoidi, fenolne kiseline, polifenolna jedinjenja

biljaka, azotna jedinjenja (alkaloidi, amini i aminokiseline), hlorofil, glukozinolati i druge

supstance kao npr. neki diketoni i glikozidi.

Najpoznatiji sintetički antioksidansi su: askorbil-palmitat (AP), terc-butil-4-

hidroksianizol (BHA), terc-butil-4-hidroksitoluen (BHT), propil-galat (PG), butil-galat

(BG), oktil-galat (OG), dodecil-galat (DG), terc-butil-hidrohinon (TBHG) i limunska

kiselina. [2]

Teorijski deo

16

2.3.1 Mehanizam dejstva antioksidanasa

“Hvatanje” tj. neutralisanje reaktivnih kiseoničnih vrsta je jedan od mogućih

mehanizama dejstva antioksidanasa. Drugi mehanizmi uključuju sprečavanje stvaranja

reaktivnih kiseoničnih vrsta vezivanjem metala ili putem enzimske inhibicije.

Antioksidansi deluju tako što sprečavaju lančane reakcije substrata sa slobodnim

radikalima.

Jedinjenja sa antioksidativnom sposobnošću mogu biti obnovljena unutar ćelije ili

su nepovratno oštećena. Njihovi proizvodi oksidacije su manje štetni ili dalje mogu biti

konvertovani do štetnih produkata. Na ćelijskom nivou ili nivou organizma,

antioksidativna zaštita je obezbeđena brojnim enzimima i endogenim antioksidansima

malih molekulskih masa kao što je askorbinska kiselina, glutation, tokoferoli i dr. [5]

2.3.2 Slobodni radikali

Slobodni radikali su jaki oksidansi (teže da preotmu elektron drugim molekulima),

a njih neutrališu antioksidansi, jer imaju elektrone koje mogu da daju oksidansima i tako

ih stabilizuju (da ne budu reaktivni).

Stvaranje slobodnih radikala u direktnoj je vezi sa reakcijama oksidacije u hrani i

biološkim sistemima. Slobodni radikali su čestice koje sadrže jedan ili više nesparenih

elektrona i sposobni su da samostalno egzistiraju. Slobodni radikali kao što su trihlormetil

(CCl3● -

), superoksid (O● -

), hidroksil (HO● -

), peroksil (ROO● -

) i nitril-oksid (NO● -

) su

poznati produkti metabolizma u živim organizmima. Neki ne-radikalni derivati molekula

kiseonika, vodonik peroksid (H2O2), hipohlorna kiselina (HOCl), mogu se stvoriti u hrani

i biološkim sistemima. Sve ove reaktivne čestice sa kiseonikom, učestvuju u reakcijama

slobodnih radikala zbog čega se javlja potreba da se odredi sposobnost supstrata da

neutrališe („hvata“) čestice radikala, odnosno njegovu antioksidativnu aktivnost.

Teorijski deo

17

Slika 2.7. Neutralizacija slobodnog radikala

Slobodni radikali svakodnevno nastaju u svakom čoveku u ćelijama. Međutim,

organizam ima mehanizme da ih neutrališe i da na taj način spreči njihovo razorno

dejstvo. Postoje antioksdiansi u hrani koji se uspešno bore sa slobodnim radikalima. To

su pre svega sastojci voća i povrća.

Svo voće i povrće koje ima crvene, narandžaste i žute pigmente sadrži beta-

karotene, koji su moćni antioksidansi. Paradajz sadrži značajne količine likopena, jedne

varijante beta-karotena, koja ima izrazito jako antioksidativno dejstvo. Svo voće koje

je tamno-plave i ljubičaste boje sadrži antocijane, koji takođe ispoljavaju dejstvo protiv

slobodnih radikala. Grožđe i vino sadrže moćne antioksidanse, kao i borovnice, kupine i

drugo tamno-plavo i ljubičasto voće.

Slobodni radikali pokreću lančane reakcije, jer kada nekom stabilnom molekulu

preotmu elektron, on postaje slobodni radikal. Tada taj slobodni radikal napada druge

molekule, da im preotme elektron i postane stabilan.

Slobodni radikali oštećuju sve ćelijske strukture: ćelijsku membranu, ćelijske

organele, a najveća šteta nastaje kada dođe do oštećenja genetskog materijala, DNK.

Promene u genima vode ka mutacijama, a mutacije ćelija mogu biti i ka malignim

ćelijama. Oštećenjem zidova krvnih sudova omogućava se razvoj i napredovanje

ateroskleroze. Slobodni radikali oštećuju DNK i dovode do mutacija gena, na taj način

dolazi do stvaranja kancerogenih ćelija. Ako kancerogene ćelije počnu da se razvijaju

neograničeno nastaju tumori. U poslednje vreme došlo je do epidemije malignih

oboljenja, a pretpostavlja se da je to velikim delom zbog mnogo veće izloženosti

stanovništva zagađenjima vode, vazduha, hrane i životom pod stalnim stresom.

Teorijski deo

18

Slika 2.8. Delovanje slobodnog radikala na zdravu ćeliju

Slobodni radikali se stalno stvaraju i neutrališu u organizmu. Problem nastaje kada

se oni stvaraju većom brzinom nego što organizam može da ih neutrališe, a do toga dolazi

u uslovima stresa, kod povećanih fizičkih i umnih naprezanja, pod dejstvom otrova,

pesticida, herbicida, duvanskog dima, zračenja, izduvnih gasova, prekomernog sunčanja,

nekih lekova. Kada se slobodni radikali stvaraju većom brzinom nego što organizam

može da ih neutrališe, nastaju uslovi za propadanje čelija i razvoj bolesti. Mnoga

oboljenja nerava, krvnih sudova, srca, tumori povezuju se upravo sa povećnom

izloženošću nekim štetnim agensima, koji su preko stvaranja slobodnih radikala doveli do

razvoja bolesti. Slobodni radikali takođe ubrzavaju starenje organizma, jer dovode do

ubrzanog propadanja ćelija. [13]

2.3.3 Metode određivanja antioksidativne aktivnosti

Postoji veliki broj metoda za ispitivanje antioksidativnog kapaciteta pojedinih

molekula. Za ispitivanje antioksidanasa kao potencijalnih hvatača slobodnih radikala

veoma često se koristi savremena i veoma osetljiva metoda za određivanje koncentracije

slobodnih radikala, tzv. elektron-spin rezonanca (ESR).

Za određivanje antioksidativne aktivnosti ispitivanih jedinjenja često se koriste

spektrofotometrijske metode. One se zasnivaju na spektrofotometrijskom praćenju

promene koncentracije nekog od reaktanata ili produkata reakcije antioksidanasa sa

slobodnim radikalima. Jedna od najčešće korišćenih je DPPH test, pored ove metode

primenjuje se FRAP test i metoda redukcije H2O2.

Teorijski deo

19

2.3.3.1 Određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH testom

DPPH metod je jednostavan, brz i osetljiv način da ispitujemo antioksidativnu

aktivnost određenog jedinjenja ili biljnog ekstrakta.

DPPH test pruža podatke o reaktivnosti potencijalnih antioksidanasa sa stabilnim,

slobodnim 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil radikalom (DPPH). Sam DPPH radikal je purpurne

boje i ima maksimum apsorpcije na 517 nm. Reakcijom sa antioksidansima on vezuje

vodonokov atom svojim nesparenim elektronom i na taj način prelazi u žut DPPH-H

(slika 2.8)

Slika 2.9. Mehanizam reakcije DPPH radikala sa antioksidansima

DPPH test se zasniva na praćenju procenta obezbojavanja, odnosno smanjenja

apsorbancije DPPH radikala na 517 nm, čime se dolazi do podataka o antioksidativnoj

sposobnosti ispitivanog molekula, tj. o njegovoj sposobnosti da radikalu DPPH preda

atom vodonika i na taj način ga dezaktivira.

2.3.4 Mikrobiološka aktivnost

Pojedine biljne vrste se vekovima koriste za lečenje različitih bolesti zbog

sadržaja mnogih komponenti koje su od velke terapeutske važnosti. Sve je veća primena

tradicionalne medicine kao alternativnog oblika lečenja raznih bolesti zbog pojave

rezistentnosti mikroorganizama na postojeće sintetske antibiotike.

Pored velikog napretka u oblasti hemijske sinteze, u iznalaženju novih lekova sve

je više onih koji potiču iz biljnih materijala. Mnoge od tih tradicionalno korišćenih biljaka

su u istraživanjima pokazala svoje efikasno dejstvo, a bioaktivne komponente su

ekstrahovane i izolovane.

Različiti delovi biljaka (koren, list, cvet, plod, stabljika, kora) uspešno se koriste

za lečenje mnogih bolesti. Oni svojim antioksidativnim i antimikrobnim delovanjem utiču

Teorijski deo

20

na mnoge fiziološke procese u organizmu, te na taj način štite od slobodnih radikala i

razvoja nepoželjnih mikroorganizama. Pored toga, mikroorganizmi dovode do čestog

kvarenja hrane tako da je njihovo prisustvo jedan od najvećih problema sa kojim se

susrećemo.

Mnogi mikroorganizmi, kao što su Escherichia coli, Staphylococcus aureus

i Listeria monocytogenes, su uzročnici kvarenja hrane i bolesti prenesenih

konzumiranjem inficiranih životnih namirnica. Iz tog razloga nužno je koristiti hemijske

konzervanse kao preventivnu meru za rast mikroba u procesu proizvodnje hrane.

Zbog rezistentnosti bakterija na veliki broj antibiotika, ali i sposobnosti biljaka da

sintetišu biološki aktivne materije, sve veći značaj dobija primena preparata biljnog

porekla u kontroli i suzbijanju bakteija. Upotreba biljaka u prehrambenoj industriji,

umesto sintetskih konzervanasa, antioksidanasa ili drugih prehrambenih aditiva, značajno

je porasla poslednjih godina.

U cilju pronalaženja novih, prirodnih antimikrobnih agenasa, veliki je broj

istraživanja u kojima je utvrđena antimikrobna aktivnost prirodnih fenolnih

antioksidanasa izolovanih iz biljaka.

Biljni fenoli predstavljaju jednu od glavnih grupa jedinjenja odgovornih za

antioksidantno ponašanje, kao i za antimikrobne efekte. Flavonoidi, koji su raznovrsna i

rasprostranjena grupa prirodnih jedinjenja su najvažniji prirodni fenoli. Poseduju širok

spektar biološke aktivnosti uključujući i antibakterijsko dejstvo. [3]

2.4 UV/VIS spektrofotometrija

Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na proučavanju

apsorbance (A) ili apsorptiviteta od talasne dužine zračenja (λ) koje je prošlo kroz

analiziranu supstancu. Apsorbancija se može pratiti kako u ultravioletnoj (UV) i vidljivoj

(VIS) oblasti, tako i u infracrvenoj (IC), mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti. U ovom

radu je od interesa bila oblast od 200-1000 nm.

Teorijski deo

21

Slika 2.10. Spektar elektromagnetnog zračenja

UV/VIS spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna metoda. Kvalitativna

analiza zasniva se na činjenici da apsorpcioni spektar supstance zavisi od njenog sastava i

strukture. Na osnovu zavisnosti apsorptiviteta talasne dužine ili vrednosti apsorptiviteta

na određenoj talasnoj dužini moguće je identifikovati apsorbujuću supstancu.

Kvantitativna analiza zasnovana je na Beerovom zakonu:

A = a x b x c

Gde je:

a – molarna apsorptivnost

b – debljina sloja

c – koncentracija

Kako je kod spektrofotometra b jednako debljini kivete i konstantno je, to

apsorbanca zavisi samo od koncentracije i apsorptiviteta. Za kvantitativnu analizu bitno je

da se merenje vrši sa najvećom mogućom tačnošću i osetljivošću.

Potreban je pravi izbor talasne dužine i ona mora da ispuni sledeće uslove:

merenjem mora da se postigne maksimalna osetljivost,

mala promena talasne dužine ne sme da utiče na reproduktivnost,

mora da važi Beerov zakon.

U zavisnosti od uslova, merenje apsorbance se može vršiti na:

talasnoj dužini gde je maksimalna apsorpcija, λmax

na talasnoj dužini optimalne apsorbance, λopt

na talasnoj dužini izobestičke tačke, λizob

Teorijski deo

22

Ako u posmatranoj oblasti spektra apsorbuje samo analizirana supstanca onda se

merenje apsorbance vrši na λmax jer je tu osetljivost merenja najveća. Diferenciranjem

Beerove jednačine dobija se: dA/dc = a odakle sledi da je promena apsorbance rastvora sa

promenom koncentracije utoliko veća ukoliko je veća vrednost apsorptiviteta ispitivanog

rastvora. Apsortivitet je uvek najveći na talasnoj dužini maksimalne apsorpcije tj. na

λmax, pa je i osetljivost merenja najveća na ovoj talasnoj dužini.

Upotreba spektrofotometara obuhvata različite naučne oblasti, kao što

su fizika, nauka o materijalima, hemija, biohemija i molekularna biologija. Oni su široko

korišćeni u mnogim industrijama, uključujući proizvodnju poluprovodnika, lasera i

optičkih materijala, štampanje i forenzičko ispitivanje, kao i u laboratorijama za

proučavanje hemijskih supstanci. Spektrofotometrom se može odrediti, u zavisnosti od

kontrole ili kalibracije, koje supstance su prisutne u uzorku, kao i u kojoj količini putem

proračuna za posmatrane talasne dužine.[18]

Eksperimentalni deo

23

3 EKSPERIMENTALNI DEO

3.1 Materijal

Za analizu su korišćeni plod (pokožica, pulpa i koštica) i listovi trnjine (Prunus

spinosa L. ) sa prosora oko Bele Palanke (Jugoistočna Srbija).

3.2 Reagensi i hemikalije

Za analizu su korišćeni sledeći reagensi: metanol, etanol, 5% sirćetna kiselina,

hlorovodonična kiselina, 0.9% natrijum-hlorid, 1.1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal

(DPPH), galna kiselina, kafeinska kiselina, kvercetin i malvidin-3-glukozid (Sigma

Aldrich, Nemačka). Sve korišćenje hemikalije su bile analitičkog stepena čistoće.

3.3 Aparatura

Određivanje sadržaja fenolnih jedinjenja kao i praćenje antioksidativne aktivnosti

vršeno je snimanjem apsorpicionih spektara na aparatu UV/VIS spektrofotometru Agilent

8453 (slika 3.1).

Slika 3.1. UV/VIS spektrofotometar

Eksperimentalni deo

24

3.4 Pripremanje uzoraka i ekstrakcija

Plodovi i listovi trnjine su brani krajem septembra meseca na prostorima Bele

Palanke. Od ploda se odvoja pokožica, pulpa i koštica. Koštice i listovi su usitnjeni pre

analize. Odmerena količina uzorka je rastvarana u smeši rastvarača metanol, voda i 5%

sirćetna kiselina i nakon 72 h čuvanja na tamnom i na sobnoj temperaturi, vršeno je

centrifugiranje 10 min na 3000 obrtaja/min. Dobijeni ekstrakt ponovo je ekstrahovan sa

istom smešom rastvarača i pod istim uslovima. Dobijeni ekstrakti su skupljeni i se koriste

za dalju spektrofotometrijsku analizu.

3.5 Metode

3.5.1 Određivanje ukupnih fenola, flavonola i estara vinske kiseline

Ukupni sadržaj fenola, flavonola i estara vinske kiseline u ekstraktima ploda

trnjine i lišća određivano je po modifikovanoj Mazza metodi [10]. Spektrofotometrijski su

praćene promene apsorbance na 280, 320 i 360 nm. Ukupna količina fenola u datom

uzorku je proračunata na osnovu kalibracione krive standarda galne kiseline, ukupna

koncentracija flavonola na osnovu kalibracione krive kvercentina, a ukupna količina

estara vinske kiseline na osnovu kalibracione krive kafeinske kiseline. Rezultati su

izraženi u mg/g suvog uzorka.

3.5.2 Određivanje antocijana

Određivanje ukupnih antocijana vršeno je po modifikovanoj di Stefano metodi

[11]. Spektrofotometrijski je praćena promena apsorbance na 540 nm. Kao standard

korićen je malvidin-3-glukozid i rezultati su izraženi u mg/g suvog uzorka.

3.5.3 Određivanje antioksidativne aktivnosti

Antioksidativna aktivnost uzoraka je analizirana pomoću DPPH testa [11]. Ovaj

antioksidativni test se zasniva na merenju gubitka boje DPPH. radikala u metanolu

promenom apsorpcije na 517 nm, koju je izaziva reakcija DPPH. i uzorka. Ekstrakti

razblaženi metanolom su mešani sa sveže pripremljenim DPPH-radikalom koncentracije

Eksperimentalni deo

25

1.10

-4 M, u zapreminskom odnosu 1:1, zaštićeni od svetlosti, na sobnoj temperaturi.

Nakon perioda inkubacije od 20 minuta, očitana je apsorbanca na 517 nm. Inhibicija

DPPH u procentima (%) za svaki uzorak je izračunat po sledećoj jednačini:

Antioksidativna aktivnost(%) =100 - ((Auzorak – Ablank) / Akontrola) x 100, gde je:

Ablank - apsorpcija blanka (uzorak u metanol) na 517 nm

Akontrola - apsorpcija kontrolne probe (DPPH. u metanol) na 517 nm

Auzorak - apsorpcija uzoraka sa DPPH. na 517 nm.

3.5.4 Odredjivanje antimikrobne aktivnosti

Antimikrobna aktivnost ekstrakata je ispitivana na tri gram-negativne i tri gram-

pozitivne bakterije (ATCC sojevi): Escherichia coli 25922, Salmonella enteritidis 13076,

Proteus mirabilis 12453, Staphylococcus aureus 25923, Enterococcus faecalis 19433 i

Sarcina lutea 9341. Bakterijske vrste su gajene na kosom hranljivom agaru

(Mikrobiološka laboratorija, Departman za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematički

fakultet, Niš).

3.5.4.1 Priprema suspenzije

Bakterijske kulture su presejane na sveži hranljivi agar i inkubirane 18 h na 37 °C.

Zatim su napravljene suspenzije u fiziološkom rastvoru (0.9 % NaCl) i podešene

turbidimetrom na 0.5 McFarland-a, čime je postignuta gustina ćelija 1.0-1.5 x 108.

3.5.4.2 Antimikrobni test

Antimikrobna aktivnost je testirana u mikrotitracionim pločama sa 96 bunarčića.

U prvim bunarčićima (za svaki soj) je uneto 100 µl ekstrakta početne koncentracije, a

zatim je napravljena serija duplih razblaženja u tečnoj podlozi MHB (Mueller Hinton

Broth). Testirane koncentracije uzoraka su bile: 36.55-0.02 (pulpa), 35.87-0.02 (koštice),

35.78-0.02 (lišće), 35.91-0.02 (pokožica), 72.04-0.04 mg/ml.

Ploče su inokulisane bakterijskim sojevima gde je postignuta finalna gustina ćelija

od 1-2 x 106

CFU/mL (eng. colony forming units).Posle inkubacije 24 h na 37 °C i

dodavanja reagensa TTC (trifenil-tetrazolium hlorid), očitana je minimalna inhibitorna

koncentracija (MIC). MIC je definisan koncentracijom u prvom bunarčiću u kojem nema

Eksperimentalni deo

26

vidljivog rasta i crvenog obojenja. Sadržaji bunarčića bez vidljivog rasta su prenešeni na

MHA (Mueller Hinton Agar), a posle inkubacije (24 h na 37 °C) je očitana i minimalna

baktericidna koncentracija (MBC).

Eksperiment je rađen u tri ponavljanja, sa kontrolom rasta mikroorganizama

(inokulisana podloga bez ekstrakta), sterilnosti podloge (čista podloga) i pozitivnom

kontrolom-antibiotikom (tetraciklin).

Rezultati i diskusija

27

4 REZULTATI I DISKUSIJA

4.1 Određivanje fenolnih jedinjenja u ekstraktima delova

ploda i lišća trnjine

Ukupni sadržaj fenola, flavonola i estara vinske kiseline u ekstraktima ploda trnjine

i lišća određivano je po modifikovanoj Mazza metodi.

Za određivanje sadržaja ukupnih fenola korišćena je galna kiselina kao standard.

Sadržaj ukupnih fenola u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.1.

Slika 4.1. Sadržaj ukupnih fenola

Najmanja količina ukupnih fenola nalazi se u košticama trnjine koje a najveća

količina pronađena je u lišću trnjine.

Rezultati i diskusija

28

Za određivanje sadržaja estara vinske kiseline korišćena je kafeinska kiselina kao

standard. Sadržaj estara vinske kiseline u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.2.

Slika 4.2. Sadržaj estara vinske kiseline

Najmanja količina estara vinske kiseline nalazi se u košticama trnjine, a najveća

količina je pronađena u lišću trnjine.

Za određivanje sadržaja ukupnih flavonola korišćen je kvercetin kao standard.

Sadržaj ukupnih flavonola u ispitivanim uzorcima trnjine dat je na slici 4.3.

Slika 4.3. Sadržaj ukupnih flavonola

Najmanja količina ukupnih flavonola nalazi se u pulpi trnjine, a najveća količina

pronađena je u lišću trnjine.

Rezultati i diskusija

29

Određivanje ukupnih antocijana vršeno je po modifikovanoj di Stefano metodi. Za

određivanje ukupnih antocijana kao standard korišćen je malvidin-3-glukozid. Sadržaj

antocijana u pokožici trnjine dat je na slici 4.4.

Slika 4.4. Sadržaj ukupnih antocijana

Prisustvo antocijana utvrđeno je samo u pokožici trnjine a sadržaj antocijana

iznosi 0.48015 mg/g suvog uzorka.

Ako izvršimo upoređenje nađenih fenolnih jedinjenja u delovima ploda trnjine

dobijaju se rezultati prikazani na slici 4.5.

Slika 4.5. Sadržaj fenola, estara vinske kiseline i flavonola u delovima ploda

trnjine

Rezultati i diskusija

30

Najveća količina ukupnih fenola nađena je u pokožici a najmanja u košticama.

Najveća količina estara vinske kiseline nađena je u pokožici a najmanja u košticama.

Ako izvršimo upoređenje nađenih fenolnih jedinjenja u plodu trnjine u celini sa

fenolnim jedinjenjima prisutnih u lišću dobijaju se rezultati prikazani na slici 4.6.

Slika 4.6. Sadržaj fenolnih jedinjenja u plodu i lišću trnjine

U lišću je prisutna veća količina ukupnih fenola, estara vinske kiseline i ukupnih

flavonola u odnosu na plod u celini.

4.2 Određivanje antioksidativne aktivnosti u ekstraktima

delova ploda i lišća trnjine

Antioksidativna aktivnost uzoraka je analizirana pomoću DPPH testa. Rezultati

antioksidativne aktivnosti u ispitivanim uzorcima trnjine dati su na slici 4.7.

Rezultati i diskusija

31

Slika 4.7. Antioksidativna aktivnost

Na osnovu rezultata vidi se da lišće ima najveću antioksidativnu aktivnost a

koštice imaju najmanju antioksidativnu aktivnost. Potrebno je 3.9294 g uzorka lišća da

obezboji 50 % rastvora DPPH, a 86.9569 g uzorka koštica da obezboji 50 % rastvora

DPPH.

4.3 Antioksidativna aktivnost u delovima ploda i lišća trnjine i

njena korelacija sa fenolnim jedinjenjima

U tabeli je data korelacija antioksidativne aktivnosti sa fenolnim jedinjenjima u

delovima ploda i lišća trnjine.

Tabela 4.1. Korelacija antioksidativne aktivnosti sa fenolnim jedinjenjima

Korelacije Konstante korelacije (R+SD+P)

Ukupni fenoli vs AA (EC50) -0,8930 + 25,6618 + 0,1070

Estri vinske kiseline vs AA (EC50) -0,7664 + 36,6215 + 0,2335

Flavonoli vs AA (EC50) -0,7587 + 37,1430 + 0,2413

Iz tabele se vidi da između prisutnih fenolnih jedinjenja i antioksidativne

aktivnosti postoji zadovoljavajuća korelacija i ona se ima opseg od 0.7587-0.8930.

Najbolja je korelacija antioksidativne aktivnosti sa ukupnim fenolima i ona iznosi 0.8930.

Rezultati i diskusija

32

Slika 4.8. Korelacija između ukupnih fenola i antioksidativne aktivnosti u delovima ploda

i lista trnjine

Slika 4.9. Korelacija između estara vinske kiseline i antioksidativne aktivnosti u

delovima ploda i lista trnjine

Rezultati i diskusija

33

Slika 4.10. Korelacija između ukupnih flavonola i antioksidativne aktivnosti u delovima

ploda i lista trnjine

4.4 Određivanje antimikrobne aktivnosti u ekstraktima delova

ploda i lišća trnjine

Rezultati antimikrobne aktivnosti su prikazani u Tabeli 4.2. Može se uočiti da su

sva četiri ekstrakta ispoljila slično inhibitorno i baktericidno dejstvo. Takođe, nema

značajne razlike u njihovom uticaju na gram-negativne i gram-pozitivne sojeve (G+

bakterije se smatraju osetljivijim). Minimalne inhibitorne koncentracije su bile uglavnom

u opsegu od 2.24 do 17.96 mg/ml, dok je minimalna baktericidna koncentracija bila od

2.24 do 35.91 mg/ml. Nešto veći inhibitorni i baktericidni uticaj je imao ekstrakt lišća na

soj S. aureus 25923 (MIC/MBC=2.24/2.24 mg/ml) na sojeve E. coli 25922, S.enteritidis

13076, P. mirabilis 12453 i S. aureus 25923.

Rezultati i diskusija

34

Tabela 4.2. Antimikrobna aktivnost ekstrakata

MIC/MBC (mg/ml)

Ekstrakti G(-) G(+)

E.coli

25922

S. enteritidis

13076

P. mirabilis

12453

S. aureus

25923

E. faecalis

19433

S. lutea

9341

Pulpa 9.14/9.14 9.14/9.14 9.14/9.14 9.14/9.14 9.14/18.28 9.14/9.14

Koštice 8.97/8.97 8.97/8.97 8.97/17.94 8.97/8.97 17.94/17.94 8.97/8.97

Lišće 17.89/17.89 17.89/17.89 8.95/17.89 2.24/2.24 17.89/35.78 17.89/17.89

Pokožica 8.98/17.96 8.98/17.96 17.96/17.96 8.98/17.96 17.96/35.91 17.96/17.96

TET (µg/ml) 2/4 2/2 64/64 16/16 8/16 128/128

MIC - minimalna inhibitorna koncentracija

MBC - minimalna baktericidna koncentracija

TET - tetraciklin

Zaključak

35

5 ZAKLjUČAK

U ovom radu je ispitivan fenolni sadržaj delova ploda i lista trnjine (Prunus

spinosa L.) i određena njihova antioksidativna i antimikrobna aktivnost.

Ukupni sadržaj fenola, flavonola i estara vinske kiseline u ekstraktima ploda

trnjine i lišća određivano je po modifikovanoj Mazza metodi.

Najmanji sadržaj ukupnih fenola i estara vinske kiseline nalazi se u košticama

trnjine, a najveća u lišću trnjine. Dok, najmanji sadržaj ukupnih flavonola nalazi se u

pulpi trnjine, a najveća količina pronađena je u lišću trnjine.

Određivanje ukupnih antocijana vršeno je po modifikovanoj di Stefano metodi i

jedino su nađeni u pokožici trnjine.

Antioksidativna aktivnost uzoraka je analizirana pomoću DPPH testa i izraženo

preko EC50 vrednostima. Najveću antioksidativnu aktivnost je pokazao ekstrakt lišća, a

najmanju ekstrakt koštice, što je u saglasnosti sa nađenim kocentracijama fenolnih

jedinjenja.

Utvrđeno je postojanje dobre korelacije (konstanta korelacije se nalazi u intervalu

od 0,7587 do 0,8930) između sadržaja fenola, estara vinske kiseline i flavonola sa

antioksidativnom aktivnošću ispitivanih ekstrakata.

Utvrđena je zadovoljavajuća antimikrobna aktivnost prema tri gram-pozitivnih i

tri gram-negativnih bakterijskih vrsta. Minimalne inhibitorne koncentracije se nalaze u

opsegu od 2,24 do 17,96 mg/mL, dok je minimalna baktericidna koncentracija od 2,24 do

35,91 mg/mL za sva ispitivana ekstrakta. Ekstrakt lišća je pokazao najbolje delovanje od

2,24/2,24 mg/mL prema gram-pozitivne S. aureus 25923 bakterije, što je u saglasnosti sa

najvećom određenom koncentracijom fenolnih jedinjenja.

Zaključak

36

6 LITERATURA

1. Choi W.C., Kim C.S., Hwang S.S., Choi K.B., Ahn J.H., Lee Y.M., Park H.S., Kim

K.S., Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean

medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison, Plant Science 163 (2002)

1161-1168.

2. Ćetković G.S., Čanadanović-Brunet J.M., Djilas S.M., Tumbas V.T., Markov S.L.,

Cvetković D.D., Antioxidant potential, lipid peroxidation inhibition and antimicrobial

activities of Satureja montana L. subsp. kitaibelii extracts, International Journal of

Molecular Sciences, 8 (2007) 1013-1027.

3. Mărghitaş L., Dezmirean D., Chirilă F., Fiţ N., Bobiş O., Antibacterial Activity of

Different Plant Extracts and Phenolic Phytochemicals Tested on Paenibacillus Larvae

Bacteria, Animal Science and Biotechnologies, 44 (2) (2011).

4. Gulcin I., Küfrevioglu O.I., Oktay M., Büyukokuroglu E.M., Antioxidant, antimicrobial,

antiulcer and analgesic activities of nettle (Urtica dioica L.), Journal of

Ethnopharmacology, 90 (2004) 205–215.

5. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants, A rewiew

Biotechnology advances, 26 (2008) 548-560.

6. Nostro A., Germano M. P., D′Angelo V., Marino A., Cannatelli M. A., Extraction

methods and bioauthography for evaluation of medicinal plant antimicrobial activity.

Letters in Applied microbiology 30 (2000) 379-384.

7. Proestos C., Boziaris I.S., Nychas G.-J.E., Komaitis M., Analysis of flavonoids and

phenolic acids in Greek aromatic plants: Investigation of their antioxidant capacity and

antimicrobial activity, Food Chemistry, 95 (2006) 664–671.

8. Grujić B., Lajšic S. Hemija prirodnih proizvoda. GRO Prosveta, Niš 1983.

9. Radovanović B., Anđelković M. A., Radovanović A., Anđelković M., Antioxidant and

Antimicrobial Activity of Polyphenol Extracts from Wild Berry Fruits Grown in

Southeast Serbia, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 12 (5) (2013)

10. Mazza G, Fukumoto L, Delaquis P, Girard B, Ewert B. Anthocyanins, Phenolics, and

Color of Cabernet Franc, Merlot, and Pinot Noir Wines from British Columbia. Journal

of Agriculture and Food Chemistry, 47 (1999) 4009–4017.

Zaključak

37

11. Radovanović B., Radovanović A., Souquet JM. Phenolic profile and free radical-

scavenging activity of Cabernet Sauvignon wines of different geographical origins from

the Balkan region. Journal of Science and Food Agriculture, 90 ( 2010) 2455–2461.

12. Pelagić V., Lekovito bilje, Beoknjiga, Beograd (2009) 188–190

13. Todorović M., Đurđević P., Antonijević V., Optičke metode instrumentalne analize,

Hemijski fakultet, Beograd (1997) 232-233.

14. http://prirodnilek.com

15. http://www.pharmamedica.rs

16. http://www.lekovitebiljke.com

17. http://www.isra-news.net