UNIVERZITET U NIŠU - pmf.ni.ac.rs · Bakterije mlečne kiseline (BMK) mogu se definisati kao grupa gram pozitivnih koka ili bacila, koje su asporogene, nepokretne i anaerobne ili

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jovana D. Stanković

Probiotske karakteristike bakterija mlečne kiseline izolovanih iz

peglane kobasice

Master rad

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Probiotske karakteristike bakterija mlečne kiseline izolovanih iz

peglane kobasice

Master rad

Kandidat: Mentor:

Jovana D. Stanković 230 Dr Nataša Joković

Niš, Septembar, 2018.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Master thesis

Probiotic characteristics of lactic acid bacteria isolated from

ironed sausage

Candidate: Mentor:

Jovana D. Stanković 230 PhD Nataša Joković

Niš, 2018.

Biografija kandidata

Jovana Stanković je rođena 21. januara, 1993. godine u Leskovcu.

Osnovnu školu Vuk Karadžić završava 2007. godine, i iste godine upisuje Medicinsku školu,

smer ginekološko-akušerska sestra, koju završava 2011. godine.

2013. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu,

na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2016. godine i

time dobija zvanje “biolog’’. Po završetku osnovnih studija, iste godine upisuje master

akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, koje završava u

roku 2018. godine.

Zahvalnica

Najsrdačnije se zahvaljujem,

svom mentoru dr Nataši Joković, na izdvojenom vremenu, stručnoj

pomoći, dragocenim savetima, uloženom trudu i strpljenju prilikom

izrade ovog master rada.

Zahvalnost dugujem i asistentu Nikoli Stankoviću na uloženom

vremenu i nesebičnoj pomoći oko izvođenja eksperimentalnog dela

rada.

Neizmerno hvala mojoj porodici i prijateljima koji su verovali u mene.

Hvala im na njihovoj beskrajnoj moralnoj podršci tokom ovih godina

studiranja!

Sažetak

U ovom radu ispitivane su probiotske karakteristike bakterija mlečne kiseline (BMK)

izolovanih iz peglane kobasice. Testirano je 10 izolata, koji pripadaju vrstama Lactobacillus

sakei (4), Lactobacillus curvatus (3), Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (1),

Weissella viridescens (1) i Carnobacterium maltaromaticum (1).

Probiotska svojstva koja su ispitivana u radu su preživljavanje u kiseloj sredini (pH2,

pH3 i pH4) i pod delovanjem tripsina, površinska hidrofobnost, sposobnost autoagregacije i

sposobnost rasta u sredini sa teškim metalima. Ispitivana je i rezistentnost izolata na određene

antibiotike i sinteza biogenih amina. Svi izolati su pokazali veći stepen preživljavanja na pH3

i pH4 vrednosti kisele sredine nego na pH2. Tripsin je smanjivao rast jednog izolata vrste

Lb.curvatus kao i W.viridescens, a jedan izolat Lb.sakei i jedan izolat Lb.curvatus su

povećavali stopu preživljavanja u prisustvu tripsina. Površinska hidrofobnost se nije mogla

uočiti samo kod dva izolata Lb.curvatus i W.viridescens, dok je stepen autoagregacije visok

kod svih izolata. Svi BMK izolati ispitivani u ovom radu su mogli da rastu u sredini koja

sadrži Pb i Ni. Cd inhibira rast svih vrsta. Na bakar su najotpornija dva izolata koja pripadaju

vrstama Lb.sakei i Lb.curvatus. Većina izolata je otporna na Zn, izuzev jednog soja Lb.sakei i

W.viridescens. Skoro svi izolati su pokazali osetljivost na većinu antibiotika, što je utvrđeno

difuzionom-disk metodom, s izuzetkom na Trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT), na koji

su svi izolati pokazali rezistentnost. Samo dva izolata su imala delimičnu sposobnost

produkcije biogenih amina i oba pripadaju Lb.sakei vrsti.

Ključne reči: Bakterije mlečne kiseline, peglana kobasica, probiotici

Abstract

The aim of this study was to examine probiotic charateristics of lactic acid bacteria

(LAB) isolated from ironed sausage. Ten isolates were tested and they belong to these

species: Lactobacillus sakei (4), Lactobacillus curvatus (3), Leuconostoc mesenteroides ssp.

dextranicum (1), Weissella viridescens (1) and Carnobacterium maltaromaticum (1).

The probiotic properties examined in this research were: survival in the acidic

environment (pH2, pH3 and pH4), the influence of trypsin, surface hydrophobicity,

autoaggregation capability, and ability to grow with heavy metals. Antibiotic resistance, and

the formation of biogenic amine were also performed. All isolates showed a higher degree of

survival in acidic environment at the values of pH3 and pH4, than at pH2. Trypsin reduced the

growth of one isolate of the species Lb. curvatus, as well as W.viridescens, while two isolates

of the species Lb.sakei and one isolate Lb.curvatus increased survival rates in the enviorment

with trypsin. Surface hydrophobicity has not beed observed only in two isolates, Lb.curvatus

and W.viridescens, while the degree of autoaggregation was high in all isolates. All LAB

strains examined in this paper grew in a medium containing Pb and Ni. Cd inhibited the

growth of all species. Species like Lb.sakei and Lb.curvatus were the most resistant to the

presence of Cu in medium. Most of the isolates ware resistant in the medium with Zn, except

for the one strain of Lb.sakei and W.viridescens. Almost all isloates showed sensitivity to the

most antibiotics, as proved by the disc-diffusion method, with the exception of

Trimethoprim/Sulfamethoxazole (SXT), to which all isolates were resistant. Only two strains

had a partial ability to produce biogenic amines and both belong to the Lb.sakei species.

Key words: Lactic acid bacteria, ironed sausage, probiotics

Sadržaj

1. Uvod ................................................................................................................................... 1

1.1. Bakterije mlečne kiseline ..........................................................................................................2

1.1.1. Rod Lactobacillus ..............................................................................................................4

1.1.2. Rod Leuconostoc ...............................................................................................................5

1.1.3. Rod Weissella ....................................................................................................................6

1.1.4. Rod Carnobacterium .........................................................................................................7

1.2. Probiotici .................................................................................................................................7

2. Ciljevi istraživanja .............................................................................................................. 11

3. Materijal i metode .............................................................................................................. 12

3.1. Materijal ............................................................................................................................... 12

3.1.1. Bakterijski sojevi ............................................................................................................. 12

3.1.2. Podloge ........................................................................................................................... 12

3.1.3. Antibiotici ....................................................................................................................... 14

3.2. Metode .................................................................................................................................. 14

3.2.1. Preživljavanje BMK na niskoj pH .................................................................................... 14

3.2.3. Preživljavanje BMK sa tripsinom..................................................................................... 15

3.2.4. Procena stepena autoagregacije ........................................................................................ 16

3.2.5. Ispitivanje površinske hidrofobnosti ................................................................................. 16

3.2.6. Ispitivanja sposobnosti rasta BMK sa teškim metalima .................................................... 17

3.2.7. Metoda disk difuzije ........................................................................................................ 17

3.2.8. Ispitivanja sinteze biogenih amina od strane BMK ........................................................... 18

4. Rezultati i diskusija ............................................................................................................ 19

4.1. Preživljavanje BMK na niskoj pH .......................................................................................... 19

4.2. Dejstvo tripsina na BMK ........................................................................................................ 23

4.3. Stepen autoagregacije ............................................................................................................. 24

4.4. Površinska hidrofobnost ......................................................................................................... 26

4.5. Rast u podlozi sa teškim metalima .......................................................................................... 28

4.6. Rezistencija na antibiotike ...................................................................................................... 30

4.7. Sinteza biogenih amina ........................................................................................................... 33

5. Zaključak ............................................................................................................................ 35

6. Literatura ............................................................................................................................ 36

Master rad

Probiotske karakteristike bakterija mlečne kiseline izolovanih iz peglane kobasice

1

1. Uvod

Fermentacija predstavlja metabolički proces kojim se razgrađuju ugljeni hidrati, u

odsustvu kiseonika. Kao produkt fermentacije nastaju organske kiseline, alkohol ili gasovi.

Ovaj proces mogu vršiti bakterije i kvasci. Sa fermentacijom se poboljšavaju organoleptički i

nutritivni kvaliteti hrane (Han et al., 2017). Značajni fermentisani proizvodi od mesa su

fermentisane kobasice u kojima suštinsku ulogu imaju bakterije mlečno kiselinskog vrenja.

Bakterije koje učestvuju u procesu fermentacije i proizvode mlečnu kiselinu su tek početkom

dvadesetog veka detektovane. Dalja istraživanja na ovom polju odnosila su se na upotrebu

starter kultura u proizvodnji kobasica, koja je imala za cilj dobijanje što kvalitetnijeg

produkta. U savremenoj tehnologiji, proces fermentacije može biti kontrolisan samo uz

pomoć laktobacila (Hammes et al., 1990). Interesantno je da u procesu tradicionalnog

pravljenja fermentisane kobasice bakterije, kvasci i gljive utiču zajedno i specifično na

kvalitet produkta. Tradicionalan pristup pravljenja hrane od mesa podrazumeva prirodnu

kontaminaciju od strane ekološke flore, koja se javlja tokom klanja životinja i povećava se

tokom proizvodnje (Ammor et al., 2005). Peglana kobasica predstavlja autohtoni fermentisani

proizvod poreklom iz Srbije.

Danas je u porastu proizvodnja i upotreba takozvane funkcionalne hrane, kao i brojnih

prehrambenih proizvoda koji poseduju pozitivna probiotska svojstva, i samim tim imaju

pozitivan uticaj na ljudsko zdravlje (Plessas et al., 2017). U proizvodnji ovakvog tipa hrane

značajnu ulogu imaju bakterije mlečne kiseline. Kulture ovih bakterija se ubacuju u različite

prehrambene proizvode ili suplemente u ishrani, tako da svojim metaboličkim proizvodima

doprinose organoleptičkim i nutritivnim karakteristikama hrane. Kada putem hrane bakterije

uđu u gastrointenstinalni trakt čoveka one imaju ulogu u održavanju stabilnosti crevne

mikroflore kao i u sprečavanju različitih procesa koji mogu da dovedu do ozbiljnih problema.

Kako bi se omogućio adekvatan unos ovih bakterija u organizam, potrebno je da sojevi

bakterija, koji imaju pozitivan efekat na ljudsko zdravlje, mogu da prežive unutrašnje uslove

samog čovekovog organizma, tj gastrointenstinalnog trakta, zatim da se vežu za epitelne ćelije

zida creva i da razmnožavajući se, kolonizuju taj prostor za duži vremenski period (Rogelj,

1994). Sojeve bakterija koji će se koristiti u ove svrhe je potrebno dobro testirati, pripremiti i

utvrditi njihovu bezbednost za čoveka.

Master rad


2

1.1. Bakterije mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline (BMK) mogu se definisati kao grupa gram pozitivnih koka

ili bacila, koje su asporogene, nepokretne i anaerobne ili fakultativno anaerobne. BMK su

katalaza negativne bakterije i nemaju citohrome. Kao krajnji i glavni proizvod metabolizma

ugljenih hidrata daju mlečnu kiselinu. U zavisnosti od toga da li je mlečna kiselina jedini

proizvod na kraju fermentacije dele se na homofermentativne i heterofermentativne

(Korhonen, 2010). Kod homofermentativnih bakterija glukoza se kataboliše glikolitičkim

putem i mlečnom fermentacijom i krajnji produkti su dva mola mlečne kiseline, i jedan mol

ATP. Kod heterofermentativih bakterija glukoza se razlaže 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim

(6-PG/PK) putem, dajući 1 mol mlečne kiseline, etanola i ATP. Mlečna kiselina koja se

sintetiše kao proizvod fermentacije dovodi do snižavanja pH sredine i samim tim sprečava

rast nepoželjnih patogenih mikroorganizama. BMK se gaje na podlogama koje moraju da

budu bogate ugljenim hidratima, i obogaćene vitaminima i aminokiselinama (Salminen & von

Wright, 1998; Milosavljević, 2015). Mogu da razlažu kazein iz mleka svojim proteinazama, i

pored ovoga mogu da sintetišu baktericidna, antimikrobna jedinjenja koja inhibiraju rast

drugih bakterija. Neke vrste BMK su patogene za životinje. Najpoznatiji patogeni među BMK

potiču iz roda Streptococcus. Vrste ovog roda su izazivači bolesti poput upale pluća, upale

srednjeg uha, endokarditisa, meningitisa i drugih (Petković, 2015). BMK su industrijski

značajni mikroorganizmi, kako zbog svog metabolizma, tako i zbog pozitivnog uticaja na

zdravlje čoveka i povećanje nutritivnih svojstava proizvoda. Pored ovoga, BMK proizvodima

daju specifičnu teksturu, ukus i miris. Upotrebom ovih bakterija za proizvodnju fermentisane

hrane, povećava se kvalitet hrane, kao i ustvajanje hranljivih produkata iz hrane (Rogelj,

1994). Mlečna kiselina stimuliše lučenje želudačnog soka i pored toga omogućava

odstranjivanje štetnih toksičnih materija iz organizma.

Prva zabeležena proizvodnja fermentisanih proizvoda korišćenjem BMK povezana je

sa otkrićem malih rupičastih posuda u blizini Nešatelskog jezera u Švajcarskoj za koje se

pretpostavlja da potiču iz vremena od oko 3000 godina p.n.e., i smatra se da su ljudi još tada

mogli da utiču i kontrolišu proces zgrušavanja mleka (Milosavljević, 2015). Ubrzo nakon toga

počinje upotreba BMK za proizvodnju različitih fermentisanih proizvoda od kojih su

Master rad


3

najznačajniji sir, hleb, fermentisani proizvodi od mesa, ribe, itd. (Champomier -Verge`s et al.,

2002; Milosavljević, 2015).

BMK se uglavnom nalaze na staništima koja su bogata hranljivim materijama (mleko,

meso, pića alkoholna, sokovi) odatle se mogu i izolovati. U prirodi se nalaze kao normalna

epifitna mikrobiota biljaka, neke su čak i deo mikrobiote usta, gastrointenstinalnog trakta, i

vagine sisara. (Stiles & Holzapfel, 1997).

Prvu čistu kulturu BMK izolovao je J. Lister, iz mleka, 1873. godine i nazvao je

Bacterium lactis (kasnije će promeniti naziv u Lactococcus lactis) (Champomier -Verge`s et

al., 2002). Na osnovu ispitivanja molekularnim metodama BMK su svrstane u 16 rodova:

Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Glabicatella,

Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella (Axelsson, 1998; Milosavljević,

2015).

U fermentaciji mesa, bakterije mlečne kiseline imaju sledeću ulogu :

poboljšavaju bezbednost mesa, jer sprečavaju razvijanje patogena,

poboljšavaju kvalitet proizvoda povećavajući mu rok trajanja i stabilnost tako što

inhibiraju neželjene promene u samom produktu koji nastaju delovanjem drugih

mikroorganizama,

omogućavaju raznovrsnost dobijenih produkta različitim modifikacijama same

sirovine, radi dobijanja novih senzornih osobina mesa (Lücke, 2000).

Drugi mikroorganizmi u mesu kao npr katalaza pozitivne koke (Staphylococcus),

kvasci (Debaromyces) i plesni (Penicillium), takođe, mogu da utiču na organoleptička i

nutritivna svojstva proizvoda od mesa (Lücke, 2000).

BMK koje su najčešće izolovane iz fermentisanih kobasica pripadaju sledećim

rodovima: Lactobacillus, Weissella, Leuconostoc, Pediococcus, Entorococcus, Lactococcus

(Comi et al. 2005, Di Cagno et al. 2008; Rantsiou et al. 2006; Urso, Comi, & Cocolin 2006).

Master rad


4

1.1.1. Rod Lactobacillus

Ovaj rod je prvi put opisao 1901. godine Beijerinck (Bernardeau et al., 2008). Ovo su

bakterije mlečno kiselinskog vrenja koje su štapićastog oblika, pritom oblik može varirati, od

jako izduženih pa do kokoidnih bacila. Ne formiraju spore, fakultativni anaerobi su,

mezofilni, termofilni, a ima i psihrotrofnih. Mogu da budu homofermentativne i

heterofermentativne. Veći broj ovih bakterija sintetiše bakteriocine (Bernardeau et al., 2008).

Nastanjuju staništa poreklom od biljaka i životinja, zatim sluzokožu ljudi i životinja. Pored

toga što su značajni u proizvodnji fermentisane hrane, mogu da izazovu i kvarenje hrane

poput voća, piva, mesa, mleka, itd. Acidofilne su i acidotolerantne i snižavaju pH sredine, na

oko 4.

Laktobacili mogu da izazovu spontano fermentaciju sirovine na kojoj se nalaze ili da se

dodaju u vidu starter kultura u proizvodnji sira, fermentisanog mesa, fermentisane biljne

hrane, stočne hrane, kiselog testa, itd (Savić, 2007). Prema klasičnim fenotipskim

karakteristikama mogu se podeliti u 3 grupe: homofermentativne, fakultativno

heterofermentativne i obligantno heterofermentativne (Tannock, 2004).

Dominantni laktobacili koji učestvuju u fermentaciji kobasica su Lactobacillus

curvatus i Lactobacillus sakei. Oni se najčešće ubacuju kao starter kulture i na taj način se

tokom celog procesa fermentacije održavaju u produktu.

Lactobacillus sakei

Izgleda kao atipičan kratki štapić, i

najrasprostranjeniji je u mesu (Slika 1). Sintetiše D i L

oblik mlečne kiseline, i podnosi veće koncentracije soli.

Koristi se kao čista kultura za proizvodnju kobasica. Neki

sojevi mogu da proizvedu bakteriocine.

Slika 1. Lb. sakei

Master rad


5

Lactobacillus curvatus

Ima štapićastu formu, i ne formira spore (Slika

2). Formira sferične kolonije. Nalazi se u biljnom

materijalu, na ljudskoj koži, sirovoj kobasici i u mleku.

Ne podnosi dobro velike koncentracije soli.

1.1.2. Rod Leuconostoc

Rod Leuconostoc definisao je još

1878. Van Thieghema (Milosavljević,

2015). Ovaj rod predstavljaju

heterofermentativne koke koje fermentišu

šećere do mlečne kiseline, sirćetne kiseline

i CO2. Ćelije mogu imati i sočivast oblik

(Slika 3). Najčešće su ćelije grupisane u

parove, ili se javljaju u vidu lanaca.

Temperaturni optimum za njihov rast je

između 20 i 30 °C. Rastu na medijumu

obogaćenom faktorima rasta i aminokiselinama. Određeni sojevi koji poseduju oksidativne

mehanizme mogu da formiraju acetat umesto alkohola. Katalaza negativni su, i ne izazivaju

zgrušavanje i zakišeljavanje mleka, tj imaju slabu acidogenu sposobnost. Imaju slabu

proteolitičku aktivnost (Garvie, 1984). Ulaze u sastav starter kultura za proizvodnju sireva,

pavlake, maslaca. Toleranti su na visoke koncentracije šećera tako da mogu da rastu i na

proizvodima kao što je sladoled (Milosavljević, 2015).

Slika 2. Lb. curvatus

Slika 3. Leuconostoc sp.

Master rad


6

1.1.3. Rod Weissella

Bakterije iz roda Weissella su

gram kratki štapići ili su kokoidnog

oblika, formiraju lance, ili su grupisane u

parovima (Slika 4). Anaerobni su, i

razmnožavaju se na optimumu

temperature od 15 °C, dok temperatura od

45 °C im nije pogodna. Ne stvaraju spore,

nepokretne su, i katalaza i oksidaza

negativne (Collins et al., 1993). Izoluju se

sa kože, iz mleka, pljuvačke, fecesa, ili

vagine ljudi i životinja, sa biljaka, povrća

i mesa i mesnih proizvoda. Mnogi sojevi ove bakterije pokazuju značajna probiotska svojstva.

Weissella cibaria se pokazala delotvornom za suzbijanje paradontalnih bolesti usled svog

visokog probiotskog potencijala (Fusco et al., 2015). Weissella confusa i Weissella cibaria su

se pokazale kao efikasne u sintezi nesvarljivih oligo i polisaharida, od kojih je najpoznatiji

dekstran (Fusco et al., 2015). Zbog svog heterofermentativnog metabolizma bakterije iz roda

Weissella mogu u industriji mesa izazvati znatnu štetu. Weissella viridescens utiče na

formiranje sluzi i na formiranje zelenila kod mesa. Formiranje sluzi počinje sa pojedinačnim

kolonijama koje se pojavljuju na vlažnoj površini, da bi se vremenom formirao zelenkast sloj.

Osnovni uzrok formiranja ovoga je sinteza vodonik peroksida koji oksidiše

nitrozomiohromogen, obojeni pigment mesa (Marsden et al. 2009; Fusco et al., 2015).

Slika 4. Weissella viridescens

Master rad


7

1.1.4. Rod Carnobacterium

Ovo su bakterije štapićastog oblika, koje se

mogu naći u prirodi kao i u prehrambenim

produktima (Slika 5). Mogu formirati kratke

lance, i mogu biti pokretne ili nepokretne. Rastu i

u aerobnim i u anaerobnim uslovima, a optimum

pH je od pH7 do pH9. Katalaza su negativne i

fakultativni su anaerobi (Collins et al., 1987). Za

čoveka nisu patogene, ali za ribe mogu biti. Mogu

se pronaći u polarnim regionima, jer imaju visoku

toleranciju na nisku temperaturu. Carnobacterium maltaromaticum i Carnobacterium mobile

mogu da proizvedu gas iz glukoze. C. maltaromaticum ima sposobnost proizvodnje

bakteriocina koji inhibira rast patogenih mikroorganizama, kao što je npr. Listeria (Afzal et

al., 2010).

1.2. Probiotici

Termin „probiotik’’ je poreklom iz grčkog jezika. Uveli su ga 1960. godine u nauku

Lilly i Stillwell (Senok et al., 2005; Choudhari et al., 2011), i sam naziv predstavlja kovanicu

dve reči: pro(za), bios-(život). 1947. godine Parker definiše probiotike kao „Organizme i

supstance koji doprinose balansu mikrobne flore.’’ Fuler 1989. godine ih definiše kao „Živi

mikrobni suplementi koji čovekovom organizmu omogućavaju mikroflorni balans u

crevima.’’ Danas možemo definisati probiotike kao „Žive mikroorganizme koji kada se

adekvatno unose u organizam pozitivno utiču na zdravlje potrošača’’(FAO/WHO, 2002;

Plessas et al., 2017). Bakterije mlečne kiseline su najvažnija grupa mikroorganizama koja se

danas koriste za proizvodnju probiotskih namirnica. Pored njih možemo spomenuti i

bifidobakterije (Choudhari et al., 2011). Upotreba probiotika se povećala i u agrokulturi, radi

Slika 5. Carnobacterium maltaromaticum

Master rad


8

kontrole enterogenih patogena iz rodova Salmonela, Shigella, i Helicobacter (MacFarlane &

Cummings, 2002; Plessas et al., 2017), kao alternativa umesto upotrebe antibiotika (Anadón

et al., 2006; Menconi et al., 2014), kao sredstvo koje smanjuje simptome laktozne

intolerancije (Li et al., 2012) ili kao sredstvo koje poboljšava imuni sistem (Bezirtzoglou &

Stavropoulou, 2011).

Neke karakteristike su izuzetno bitne prilikom odabira odgovarajućeg i efektivnog

probiotika, kao što je npr tolerancija na gastrointenstinalne uslove u organizmu čoveka i

životinja, sposobnost vezivanja probiotskih mikroorganizma za crevni epitel, i uspešnost u

kompeticiji sa crevnim patogenima (Fontana et al., 2013). Kriterijumi za selekciju probiotskih

sojeva uključuju otpornost na enzime u usnoj duplji, preživaljvanje uslova koji vladaju u

želucu, i uticaj pankreasnog soka i žučnih soli u dvanaestopalačnom crevu, kako bi bakterije

stigle na mesto delovanja u fiziološki ispravnom, funkcionalnom stanju. Pored ovog bitna je i

sposobnost vezivanja za epitelne ćelije creva, kao i sposobnost proizvodnje antimikrobnih

jedinjenja.

Prednosti koje zapravo nude probiotici su nutritivne, terapijske, uključuju i

proizvodnju vitamina, nisko kaloričnog šećera, smanjuju rizik od dijareje, poboljšavaju

imunitet, nude prednost u prevenciji nastanka kancera, smanjuju nivo holesterola u serumu,

itd.

Da bi se probiotici mogli koristiti i proizvoditi za ljudsku upotrebu, oni moraju biti

procenjeni i verifikovani. Većina bakterija koje su danas u upotrebi poseduje GRAS

(Generally recognized as safe) status, tj bezbedne su za upotrebu. Međutim, postoji rizik od

transfera gena sa probiotskih mikroorganizama na mikroorganizme stanovnike digestivnog

sistema čoveka, tj i na same patogene koji se tu nalaze (Mathur & Singh, 2005). Pored ovoga,

potrebno je da probiotski sojevi zadovolje neke tehnološke kriterijume, poput održivosti

tokom proizvodnje hrane, distribuciju i skladištenje proizvoda (Saarela et al., 2000).

Pored vijabilnih sojeva, za pravljenje probiotika mogu se koristiti i nevijabilni sojevi

(Adams, 2010). Naime, još od 1907. se prave proizvodi koji sadrže mrtve mikroorganizme, i

za koje se pokazalo da imaju pozitivno dejstvo na čovekovo zdravlje. Pierre Boucard je tada

izolovao dva soja laktobacila iz ljudske stolice, ubio ih toplotom, i napravio suplement koji je

posedovao antidijareična svojstva (Lacteol TM) (Salazar-Lindo et al., 2007). Ovaj prozivod je

i danas dostupan u mnogim zemljama. Pored tretmana povišenom temperaturom,

Master rad


9

mikroorganizmima se vijabilnost može smanjiti i delovanjem ultrazvučnih talasa, tretmanom

sa visokim pritiskom, odmrzavanjem, ili taloženjem ( ovo nije dopušteno za one koji se

ubacuju u prehrambene proizvode) (Makinen et al., 2012). Treba napomenuti da bilo koj

probiotski proizvod pored vijabilnih mikroorganizama sadrži i nevijabilne zbog neizbežnog

gubitka vijabilnosti tokom proizvodnje i skladištenja (Makinen et al., 2012). Upotreba

nevijabilnih mikroorganizama ima svoje prednosti, kao npr mogućnost čuvanja proizvoda na

sobnoj temperaturi umesto na hladnom mestu. Pored ovoga za razliku od živih organizama

koji se ne mogu koristiti, nevijabilni se mogu koristiti i prilikom pravljenja produkata koji

zahtevaju korišćenje visoke temperature. Postoji još veći niz prednosti upotrebe nevijabilnih

mikroorganizama, i smatra se da će se vremenom oni više i češće upotreljavati, ali još uvek

nije dokazano da li i jedni i drugi imaju isti efekat na ljudsko zdravlje.

Pozitivan efekat probiotika se može postići konzumiranjem velikog broja vijabilnih

ćelija probiotskih mikroorganizama ili stimulisanjem brzog rasta poželjnih bakterija

snabdevanjem odgovarajućim nutritijentima. Najčešće su to izvori ugljenika koji ne mogu biti

metabolisani od bakterija u debelom i tankom crevu što probiotskim bakterijama daje

prednosti u rastu i dostizanju velike brojnosti. Ovi nutritijenti se nazivaju prebiotici i definišu

se kao nesvarljivi sastojci hrane koji imaju pozitivne efekte na domaćina stimulisanjem rasta

i/ili aktivnosti jedne ili više vrsta bakterija u debelom crevu (Cvetković, 2015). Pored ovoga

postoji i pojam simbiotik koji obuhvata oba ova termina. Umesto korišćenja probiotika i

prebiotika odvojeno, proizvod sadrži obe komponente, korisne mikroorganizme u velikom

broju i nutritijente koji im omogućavaju da se brzo razmnožavaju u gastrointestinalnom traktu

i izazivaju korisne efekte.

Laktobacili kao glavni predstavnici bakterija mlečne kiseline, imaju znatne probiotske

efekte. Najpoznatiji su: kontrola zapaljenskih procesa u crevima (Andoh & Fujiyama, 2006;

Bai & Ouyang, 2006; Bohm & Kruis,2006); održavanje remisije kod Kronove bolesti, (Rolfe

et al.,2006); poboljšavaju borbu protiv infekcija u toku trudnoće (Lewis, 2006); imaju

terapijsku ulogu u gastroenterologiji (Limdi et al., 2006; Huebner & Surawicz, 2006; Young

& Cash, 2006); kontrolnu ulogu imaju u dijarejama povezanim sa antibioticima (Kramer &

Bischoff, 2006); ulogu u prevenciji urinarnih transfekcija, (Falagas et al., 2006; Regal et al.,

2006).

Različite vrste mikroorganizama koje se mogu potencijalno koristiti kao pobiotici se

moraju identifikovati prema međunarodno prihvaćenim metodama, i pored toga se ispituje

Master rad


10

njihova primenljivost u in vitro i in vivo, mehanizam delovanja, područje primenljivosti, kao i

mogući neželjeni efekti delovanja. Svetska zdravstvena organizacija (WHO) i FAO su

preporučili da se probiotske bakterije ispitaju na određene karakteristike poput rezistencije na

antibiotike, njihove metabolička i hemolitičke aktivnosti, sposobnosti proizvodnje toksina, i

njihova infektivna moć kod imunosupresivnih stanja (Choudhari et al., 2011).

Probiotici poboljšavaju otpornost na kolonizaciju creva patogenim bakterijama, tako

što ojačavaju mukoznu barijeru i obnavljaju normalnu mikroekologiju ćelija nakon dijareje.

Ukoliko dođe do oštećenja crevne mikroflore povećava se transport antigena u crevima.

Probiotici se ’takmiče’ sa patogenima za mesta vezivanja i dostupne supstrate (Meurman,

2005). Dokazano je da probiotske bakterije štite miševe od crevne kandidiaze različitim

imunološkim i neimunološkim mehanizmima (Choudhari et al., 2011).

Master rad


11

2. Ciljevi istraživanja

Bakterije mlečne kiseline imaju veliki značaj u procesu fermentacije mesnih proizvoda

kao i jako veliki značaj za čovekovo zdravlje. Imajući u vidu da ova korisna svojstva

omogućavaju njihovu sve češću upotrebu za pravljenje probiotskih proizvoda i suplemenata,

ciljevi ovog rada su se odnosili na ispitivanje sledećih probiotskih karakteristika bakterija

mlečne kiseline izolovanih iz peglane kobasice:

1) sposobnost preživljavanja bakterija mlečne kiseline u uslovima niskih pH (pH2, pH3,

pH4) vrednosti koji vladaju u želucu,

2) sposobnost preživljavanja pod dejstvom tripsina,

3) sposobnosti autoagregacije,

4) površinska hidrofobnosti bakterijskih ćelija,

5) sposobnost rasta u sredini sa teškim metalima Cd, Pb, Ni, Zn i Cu;

Dodatno su ispitivane i karakteristike koje se odnose na bezbednost njihove upotrebe u

proizvodima:

6) rezistencija na različite vrste antibiotika,

7) sposobnosti sinteze biogenih amina.

Master rad


12

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

3.1.1. Bakterijski sojevi

U ovom radu korišćeno je 10 sojeva bakterija mlečne kiseline izolovanih iz mesnog

nadeva ( M serija), kobasice u toku proizvodnje (PK serija), i finalnog proizvoda (PF serija).

Sojevi su molekularno identifikovani do nivoa vrste u Institutu za molekularnu genetiku i

genetičko inženjerstvo u Beogradu. Korišćene su sledeće vrste: Lactobacillus sakei (M14,

PK17, PF18, PF19), Lactobacillus curvatus (PK4, PK5, PF17), Leuconostoc mesenteroides

ssp. dextranicum (PK15), Weissella viridescens (M18) i Carnobacterium maltaromaticum

(M2). Sojevi su čuvani u stokovima na temperaturi od -20 °C, i aktivirani dvostrukim

presejavanjem na odgovarajućim podlogama. Kao radne kulture za ispitivanje probiotskih

svojstva BMK korišćene su prekonoćne kulture, zasejane u odgovarajuće podloge, i

inkubirane na temperaturi od 30 °C. Suspenzije ćelija, gustine 0,5 McF, pravljene su u

fiziološkom rastvoru (0,9% NaCl), od prekonoćnih kultura izolata. Gustina suspenzije merena

je dezintometrom (D-1, Biosan).

3.1.2. Podloge

Svi sojevi izolovani iz peglane kobasice gajeni su na čvrstoj MRS hranljivoj podlozi

ili u MRS bujonu (Lab M, Velika Britanija).

Za ispitivanje sposobnosti preživljavanja BMK na niskoj pH (pH2, pH3, pH4)

korišćena je modifikovana MRS tečna podloga, sa recepturom prikazanoj u Tabeli 1.

Master rad


13

Tabela 1.Modifikovana MRS podloga za ispitivanje preživljavanja na niskoj pH (1l)

Pepton 10 g

Ekstrakt kvasca 5 g

Mesni ekstrakt 10 g

Glukoza 20 g

Na – acetat 5 g

Mg – sulfat 0, 2 g

Mn – sulfat 0, 05 g

Tween 80 1, 08 g

NH4 – citrat 2 g

Za ispitivanje sposobnosti sinteze biogenih amina, korišćena je sledeća modifikovana

MRS podloga (Tabela 2).

Tabela 2. Podloga za ispitivanje sinteze biogenih amina ( 100 ml)

Tripton 0,5 %

Ekstrakt kvasca 0,5 %

Mesni ekstrakt 0,5 %

NaCl 0,25 %

Glukoza 0,05 %

Tween 80 0,1 %

Mg – sulfat 0,02 %

Mn – sulfat 0,005 %

Fe – sulfat 0,004 %

NH4 – citrat 0,2 %

K2HPO4 0,2 %

CaCO3 0,01 %

Agar 2 %

Bromkrezol purpurno 0,006 %

Aminokiselina 1 %

Master rad


14

3.1.3. Antibiotici

Za ispitivanje rezistencije BMK na različite antibiotike korišćeni su komercijalni

diskovi proizvođača Bioanalyse (Turska). Količine antibiotika na diskovima bile su sledeće:

Trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT) 25 µg, Ampicilin 10 µg (AM),

Amoxicillin/clavicular acid 3 µg (AMC), Amikacin 30 µg (AK), Vancomycin 30 µg (VA),

Ciprofloxacin 5 µg (CIP), Erythromycin 15 µg (E) i Imipenem 10 µg (IMP).

3.2. Metode

3.2.1. Preživljavanje BMK na niskoj pH

Rađene su dve metode ispitivanja preživaljavanja BMK na niskoj pH: Merenje

apsorbance zasejane podloge i određivanje broja ćelija u zasejanim bujonima.

Prva metoda ispitivanja tolerancije BMK na kisele uslove u podlozi rađena je po

metodi koju su primenili Divya i saradnici (Divya et al., 2012), sa malim modifikacijama.

Pripremljen je MRS bujon bez pufera (Tabela 2.) i snižena je pH vrednost podloge na pH2,

pH3 i pH4 dodavanjem HCl u kapima. pH vrednosti podloga i kontrola merene su pH metrom

(Eutech Instrument, Singapour). Za svaku od pH vrednosti pripremljeno je po 10 epruveta sa

podlogom. 100 µl izolata iz prekonoćnih kultura ubačeno je u MRS bujon bez pufera, i

očitana je apsorbancu na 600 nm spektrofotometrijski, za bujon sa pH2, pH3 i pH4, na 0h,

odmah nakon zasejavanja. Nakon toga epruvete sa MRS bujonom inkubirane su na 37 °C, 1h.

Po isteku tog vremena ponovo je očitana apsorbanca za sva 10 izolata i za sve tri pH

vrednosti. Nakon toga epruvete su ponovo odnešene na inkubaciju na 37 °C, 1h. Posle isteka

vremena još jednom je očitana apsorbanca. Na osnovu razlike u apsorbancama može se

zaključiti da li bakterije mogu da rastu u MRS bujonu sa niskom pH kakva je u želucu

čoveka, i to odmah nakon zasejavanja, na 0h, nakon 1h, i nakon 2h.

Brojanje preživelih bakterijskih ćelija na čvrstim MRS podlogama rađeno je

indirektnom metodom brojanja. S obzirom na veliki broj ćelija, pravljena su po 6 razređenja

za svaki od izolata. Za pravljenje razređenja korišćene su mikrotitarske ploče, gde je u svaki

Master rad


15

bunarčić ubačeno 90 µl fiziološkog rastvora. Iz prekonoćnih kultura prebačeno je po 100 µl

svakog izolata u epruvete sa bujonom sa pH vrednostima 2, 3 i 4. Nakon vorteksovanja svake

epruvete, uzeto je po 10 µl iz svake epruvete i ubačeno u bunarčiće na mikrotitarskoj ploči,

gde su dalje pravljenja razređenja ( 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 i 10-6). Iz svakog bunarića je

zatim prebačeno po 10 µl suspenzije na MRS agar, metodom “drop count’’. Nakon toga

epruvete sa MRS bujonima sa pH 2, 3 i 4 su inkubirane 1h na 37 °C, nakon čega je postupak

ponovljen. Ovaj postupak je ponovljen i nakog 2h inkubacije. Metoda je urađena i za

kontrolnu grupu koja je podrazumevala zasejavanje kultura u bujonu bez kisele sredine.

Preživljavanje BMK ispitivano „drop count“ izračunato je deljenjem srednjih

vrednosti broja ćelija na razređenjima 10-4 i 10-5, za svaki izolat, sa srednjim vrednostima

broja ćelija na istim razređenjima u kontrolnim grupama. Stepen preživljavanja računat je po

formuli :

%(stepen preživljavanja) = N (broj kolonija na određenom razređenju)/ n (broj kolonija na

određenom razređenju u kontroli) x 100%

Ova metoda je malo modifikovana za izolate Lb.sakei (PF18) i Lb.curvatus ( PK5), i

koji su direktno iz razređenja 10-4 za sve 3 pH vrednosti prebačeni na čvrstu MRS podlogu

posle 0h, 1h i 2h. Nakon inkubacije Petrijevih ploča na 30 °C, 24h, brojane su kolonije.

3.2.3. Preživljavanje BMK sa tripsinom

Metoda ispitivanja preživljvanja BMK pod dejstvom tripsina je rađena na osnovu

metode koju su opisali Han i saradnici u svom istraživanju (2017). Naime, napravljene su

prekonoćne kulture za sledeće bakterijske sojeve: Lb.sakei PF18, PF19; Lb.curvatus PK4,

PF17 i W.viridescens M18. Tripsin je rastvoren u sterilnom PBS-u, sa finalnom

koncentracijom 1g/l. Iz prekonoćnih kultura koje su zasejane u MRS bujonu prebačeno je 100

µl u bujon sa pH vrednošću 3. Nakon inkubacije u trajanju od 2h, 100 µl suspenzije iz tog

bujona prebačeno je u 10 ml rastvora sa tripsinom. Odatle je 10 µl prebačeno na mikrotitar

ploču u kojoj su pravljenja razređenja (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 i 10-6) za prva 4 soja

(Lb.sakei PF18, Lb.curvatus PK4, PF17 i W.viridescens M18). Rađena je metoda „drop

count’’, odmah na 0h, i suspenzija tripsina i bakterija je inkubirana u trajanju od 2h, na 30 °C,

Master rad


16

nakon čega je ponovo rađena metoda „drop count-a’’, i takođe i nakon 4h inkubacije.

Preživljavanje Lb.sakei (PF19) je ispitivano na tri načina. Prvi postupak je identičan

prethodno opisanom. Drugi način je podrazumevao direktno ubacivanje 100 µl prekonoćne

kulture u rastvor sa tripsinom, pravljenje istih razređenja na mikrotitarskoj ploči, i zasejavanje

na MRS agaru metodom „drop count’’, i na kraju inkubaciju u trajanju od 0h, 2h i 4h na

temperaturi od 30 °C. Treći način je podrazumevao centrifugiranje prekonoćne kulture (4, 000

g, 10 min), resuspendovanje u sterilnom PBS-u i prebacivanje 100 µl suspenzije u rastvor sa

tripsinom, odakle su pravljenja ista razređena i rađena je „drop count’’ metoda. Stopa

preživljavanja je računata preko količnika srednje vrednosti broja ćelija na razređenjima 10 -2 i

10-3 i broja ćelija iz kontrolnih grupa, pomnožena sa 100. Kontrolna grupa je podrazumevala

gajenje bakterija u prisustvu kisele sredine (pH3), kako bi se uočila brojnost bakterija koje su

dospele iz želuca u dvanaestopalačno crevo i izvršilo upoređivanje.

3.2.4. Procena stepena autoagregacije

Metoda ispitivanja sposobnosti autoagregacije je urađena prema metodi Del Re-a i

saradnika (Del Re et al., 2000) sa malim modifikacijama. Prekonoćne kulture su

centrifugirane (4, 000g, 15min), i isprane u fiziološkom rastvoru, u kome su i

resuspendovane. Napravljena je suspenzija do finalne koncentracije od 108 cfu/ml tj 0, 5 McF.

Nakon vorteksiranja 10 sekundi, na spektrofotometru je očitana absorbanca (600nm) na 0h.

Suspenzije su inkubirane na temperaturi od 37°, i ponovo je očitana apsorbanca posle

inkubacije od 5h, i 24h. Stepen autoagregacije je računat po formuli: (1-At /A0) x 100%.

At- Apsorbanca suspenzija posle inkubacije; A0- Apsorbanca suspenzije na 0h

3.2.5. Ispitivanje površinske hidrofobnosti

Ova metoda rađena je na osnovu metode koju su opisali Kos i saradnici (Kos et al,

2003), uz određene modifikacije. Metoda podrazumeva da su pripremljene prekonoćne

kulture centrifugirane (3, 000g, 10min) i isprane u sterilnom fiziološkom rastvoru, ponovo

centrifugirane i u istom resusprendovane do finalne koncentracije 108 cfu/ml, tj 0,5 McF.

Nakon toga je očitana absorbanca na 600nm, ćelijske suspenzije. 5ml suspenzije svakog soja

Master rad


17

je zatim pomešan sa 5ml hloroforma. Ta smeša je vorteksovana (3min), i ostavljena da odstoji

20 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je očitana absorbanca gornje vodene faze na 600 nm.

Procenat hidrofobnosti je izračunat po formuli :

Hidrofobnost (%) = (1-At/A0) x 100%

At- Apsorbanca vodene faze posle mešanja sa hloroformom; A0- Apsorbanca ćelijske

suspenzije pre mešanja sa hloroformom

3.2.6. Ispitivanja sposobnosti rasta BMK sa teškim metalima

Ispitivanje sposobnosti rasta BMK u sredini sa teškim metalima je rađeno

mikrodelucionom metodom. Ispitivan je rast bakterija u rastvoru sa teškim metalima Cu, Cd,

Ni, Zn, Pb, i to na sledećim koncentracijama: 1g/l, 0,5g/l, 0,25g/l, 0,125g/l, 0,0625g/l,

0,03125g/l, i 0,015625 g/l. Od prekonoćnih kultura napravljana je suspenzija bakterija u

fiziološkom rastvoru, do finalne koncentracije 108 CFU, tj 0,5 McF. Odatle je za svaki soj

posebno prebačeno 100 µl u 10 ml bujona da bi se dobila koncentracija od 106 CFU. U

mikrotitarskim pločama je najpre dodat rastvor sa metalima u bunarčiće sa koncentracijom od

1g/l i pravljenja su razređenja sa fiziološkim rastvorom, a zatim je dodato po 10 µl bujona, i

prebačene su ploče u inkubator na 37 °C. Posle 24h očitani su rezultati. Ova metoda nije

ispitivana za Pb za sledeće vrste: Lb.sakei PF18, Lb.sakei PF19 i Lb.curvatus PF17.

3.2.7. Metoda disk difuzije

Suspenzije ćelija, gustine 0,5 McF, pravljene su u fiziološkom rastvoru (0,9% NaCl),

od prekonoćnih kultura izolata. U sterilan fiziološki rastvor ezom nanešeni su izolati BMK iz

prekonoćnih kultura do dostizanja vrednosti optičke gustine od 0,5 McF na denzitometru. Na

prethodno pripremljene podloge MRS agara prebačeno je po 100 µl inokuluma čistih ćelijskih

suspenzija, i ezom ili štapićem po Drigalskom razliveno na celu podlogu. Na površinu svake

Petrijeve šolje stavljeno je po 8 antibiotika. Ploče su inkubirane na 30 °C, 24h. Nakon toga

lenjirom je izmerena zona inhibicije svakog antibiotika za svaki bakterijski soj. Bakterije koje

su osetljivije na određen antibiotik imaju veću zonu inhibicije, a one koje su rezistentne

nemaju zonu inhibicije.

Master rad


18

3.2.8. Ispitivanja sinteze biogenih amina od strane BMK

Sastav podloge za ovu metodu opisan je u Tabeli 2. U eksperimentu su korišćene 3

aminokiseline, tirozin, lizin i histidin. Napravljene su tri podloge od kojih je svaka sadržala po

jednu, različitu aminokiselinu. Na podloge sa odgovarajućim aminokiselinama ezom je

zasejano 10 izolata. Nakon inkubacije u trajanju od 24h na 30 °C, očitani su rezultati.

Master rad


19

4. Rezultati i diskusija

4.1. Preživljavanje BMK na niskoj pH

Sposobnost preživljavanja u uslovima niskih pH vrednosti je jedna od bitnih

karakteristika probiotskih mikroorganizama. Ovakvi uslovi sreću se unutar čovekovog

organizma. pH u želucu čoveka, odnosno želudačnog soka iznosi svega 1 tokom procesa

konzumacije i varenja hrane, dok u uslovima kada se ne vari hrana, posle obroka, ta vrednost

raste do 4,5. Hrana se vari u proseku 3h (Han et al., 2017). Da bi se BMK mogle

upotrebljavati kao probiotici, potrebno je da mogu da prežive ove uslove koji vladaju u

gornjim delovima digestivnog sistema. Ovakvi uslovi koji vladaju sprečavaju prodor

patogenih bakterija u čovekov organizam, tj formiraju barijeru koju BMK treba da prođu a

pritom zadrže svoje korisne osobine (Huang & Adams, 2004).

U Tabeli 3. su prikazane vrednosti apsorbance izmerene spektrofotometrijski koje

pokazuju sposobnost preživljavanja BMK u bujonu sa niskom pH vrednošću (pH2, pH3,

pH4). Izmerena je apsorbanca na spektofotometru odmah nakon zasejavanja bujona i posle

inkubacije od 1h i 2h.

Na osnovu podataka koji su dobijeni ovim istraživanjem možemo zaključiti da svi

sojevi koji su izolovani iz peglane kobasice tolerišu nisku pH vrednost i rastu u uslovima

niskih pH vrednosti. Kod određenih sojeva je došlo do smanjenja broja ćelija (Lb.sakei PF18,

C.maltaromaticum M2). Određeni sojevi nakon inkubacije od 1h su smanjivali svoju brojnost,

da bi nakon 2h ponovo povratili svoju brojnost .Ovo govori o tome da su BMK izložene

stresu nakon stavljanja u kiselu sredinu, ali da se vremenom njihova brojnost povećava i

pređe i početni broj. Ovo je bio slučaj sa sojevima poput Lb.sakei M14 (pH3), PK17 (pH2,

pH3) i PF18 (pH3), Lb.curvatus PK4 (pH3) i PK5 ( pH2, pH3), W.viridescens M18 (pH3),

C.maltaromaticum M2 (pH3). Može se uočiti veći rast bakterija na pH4, nego na pH3 i pH2

kod svih sojeva, jer je stepen kiselosti manji i bakterije bolje preživljavaju i rastu. Svi sojevi

su pokazali najmanju razliku u apsorbanci u bujonu sa pH2, što znači da najsporije rastu u

najkiselijim uslovima.

Master rad


20

Tabela 3. Preživljavanje BMK u sredini sa niskom pH merenjem apsorbance

pH2 pH3 pH4

Vreme inkubacije

0h 1h 2h 0h 1h 2h 0h 1h 2h

Lb.sakei

M14 0,011 0,026 0,037 0,158 0,155 0,171 -

0,017 0,015 0,195

PK17 0,009 -

0,038 0,128 0,139 0,007 0,200 0,030 0,062 0,245

PF18 0,026 0,053 0,072 0,045 0,038 0,038 0,017 0,058 0,239

PF19 -

0,006 0,051 0,059 0,025 0,219 0,217 0,035 0,070 0,224

Lb.curvatus

PK4 0,014 0,043 0,047 0,157 0,151 0,162 -0,01 0,034 0,204

PK5 0,010 -

0,049 0,081 0,064 0,006 0,198 -0,03 0,003 0,220

PF17 -

0,039 0,047 0,055 0,112 0,174 0,175 -0,02 0,018 0,194

L.mesenteroides ssp.

dextranicum

PK15 0,015 0,030 0,052 0,152 0,165 0,174 0,003 0,022 0,214

W.viridescens

M18 0,00 0,002 0,011 0,155 0,151 0,157 0,002 0,024 0,214

C.maltaromaticum

M2 0,027 0,041 0,054 0,169 0,149 0,178 0,029 0,047 0,224

Preživljavanje BMK ispitivano „drop count“ metodom prikazano je u Tabeli 4. Može

se uočiti da u pH2 sredini, skoro svi izolati posle inkubacije u trajanju od 1h pokazuju

negativnu stopu preživljavanja, sem Lb.sakei PF18 (6,85% stopa preživljavanja) i Lb.curvatus

PK5 (9,63%). Većina izolata posle inkubacije u trajanju od 2h pokazuje negativnu stopu

preživljavanja (Lb.sakei M14, PK17 i PF18; Lb.curvatus PK5, PK4 i PF17; L.mesenteroides

ssp. dextranicum PK15 i C.maltaromaticum M2), jedino se pozitivan rast posle 2h inkubacije

uočava kod Lb.sakei PF19 (13,63% stopa preživljavanja) i W.viridescens M18 (2,22% stopa

preživljavanja).

Master rad


21

U sredini sa kiselošću pH3, sojevi pokazuju varijabilnost. Odmah na 0h po zasejavanju,

jedino Lb.sakei M14 ne preživljava na 0h. Lb.sakei PK17 (0h-27,27%, 1h i 2h-0) i

L.mesenteroides ssp. dextranicum PK15 (0h-38, 46%,1h-10%, 2h-0) pokazuju negativnu

stopu preživljavanja u pH3 sredini posle inkubacije od 1h i 2h. Posle 2h inkubacije pod istim

uslovima, pokazalo se da je bakterijski rast najveći kod Lb.sakei PF19 (stopa preživaljvanja je

veća od 100%), Lb.curvatus PF17 (> 100%).

pH4 sredina je povoljnija za preživljavanje i rast BMK sojeva. Povećan rast uočava se

kod svih izolata, a najveći je kod sledećih: Lb.sakei PF18 (44,5% stopa preživljavanja) i PF19

(stopa preživljavanja veća od 100%), Lb.curvatus PK4 (stopa veća od 100%) i PF17 (>100%),

i L.mesenteroides ssp. dextranicum PK15 (>100%). Niska stopa preživljavanja uočava se kod

vrste Lb. sakei M14 (0). Dok su bakterije poput W.viridescens i C.maltaromaticum pokazale

slab rast u ovoj sredini posle 2h inkubacije.

Dosadašnjim ispitivanjima tolerancije bakterija mlečne kiseline na kiselu sredinu,

utvrđena je manja stopa rasta u sredini sa vrednošću pH2. Metodom merenja apsorbance

spektrofotometrijski utvrđeno je da je opstanak u pH2 sredini relativno visok za vrste

W.cibaria i Enterococcus faecium. Lactobacillus plantarum se pokazao izuzetno tolerantnim

na pH3 i pH4 sredinu, povećavajući svoj rast (Divya et al., 2012). Utvrđeno je od strane

Fontane i saradnika (2013.) da izolati Lactobacillus spp. dobro podnose niske pH vrednosti

sredine, pogotovo pH3, što se ovim istraživanjem može i potvrditi. Kao jedan od dokaza da su

Laktobacili acidofilni uzima se i istraživanje kojim je ispitivana pH podloga na kojoj su

gajene bakterije mlečne kiseline. Utvrđeno je da gajenjem Lactobacillus curvatus R5 soja

izolovanog iz Harbin suve kobasice, posle 24h inkubacije, pH vrednost podloge iznosi 3,93.

Slični rezultati su dobijeni i za ostale sojeve poput Lactobacillus fermentum R6, Lb.plantarum

1.0391, Lactobacillus acidophilus AD1 (Han et al., 2017).

Master rad


22

Tabela 4. Stepen preživljavanja BMK na niskim pH, ispitan „drop-count" metodom (%)

pH2 pH3 pH4

0h 1h 2h 0h 1h 2h 0h 1h 2h

Lb.sakei

M14 100 0 0 0 >100 0 >100 61,5 0

PK17 90 0 0 27,27 0 0 27,27 >100 >100

PF18 56,12 6,85 0 98,97 66,86 33,79 >100 53,14 44,5

PF19 34,78 0 13,63 86,95 41,7 >100 95,6 41,7 >100

Lb.curvatus

PK4 26,57 0 0 66,43 28,57 25 95,8 100 >100

PK5 73 9,63 0 92,3 85,54 36,9 90,7 84,74 42,97

PF17 >100 0 0 60 >100 >100 >100 >100 >100

L.mesenteroides

ssp. dextranicum

PK15 53,54 0 0 38,46 10 0 52,8 0 >100

W.viridescens

M18 14,5 0 2,22 99,23 80 1,1 >100 46,7 15,5

C.maltaromaticum

M2 0 0 0 50 0 0 0 100 17,6

Master rad


23

4.2. Dejstvo tripsina na BMK

Na svom putu kroz digestivni sistem čoveka, probiotski laktobacili stižu i do

dvanaestopalačnog creva. pH sredina u ovom delu digestivnog sistema je viša nego u želucu,

tj bazna je (pH8). BMK kada dospeju u dvanaestopalačno crevo su same po sebi već bile

izložene stresu koji vlada u želucu i u prednjim delovima digestivnog sistema, kako zbog

delovanja pepsina, tako i zbog kisele sredine. Njihov zadatak je da prežive uslove koji vladaju

i u dvanaestopalačnom crevu, gde se izlučuje žuč i digestivni enzimi pankreasa, od kojih je

najbitini tripsin. Za isipitivanje dejstva tripsina na BMK iz peglane kobasice korišćena je

metoda koju su Han i saradnici koristili, uz malo modifikacija. Preživljavanje BMK pod

dejstvom tripsina praćeno je određivanjem broja ćelija. Rezultati dobijeni ovim istraživanjem

prikazani su u Tabeli 5.

Tabela 5. Stopa preživljavanja BMK sa tripsinom (%)

Lb.sakei

PF18

Lb.sakei

PF19

Lb.curvatus

PK4

Lb.curvatus

PF17

W.viridescens

M18

Tripsin 0h 0 100% 0 1,72% 0

2h 0 >100% 18,71% 32,02% 2,88%

4h 1,41% 100% 32,83% 25,86% 0,59%

pH3

+ tripsin

0h 4,5%

2h 13,75%

4h 22,5%

Centrifugiranje

+ tripsin

0h 12%

2h 0

4h 0

U tabeli su prikazani rezultati za sva 5 izolata sa kojima je rađena ova metoda. Lb.

sakei PF19 je izolat koji je pored direktnog izlaganja delovanju tripsina ispitan na još dva

načina. Prvi je podrazumevao inkubaciju izolata u kiseloj sredini (pH3) a zatim je izložen

dejstvu tripsina. Drugi način je podrazumevao centrifugiranje prekonoćnih kultura ovog

izolata, da bi nakon toga ćelije iz peleta bivale izložene dejstvu tripsina. Na osnovu rezultata u

tabeli može se uočiti da odmah nakon zasejavanja bakterija u epruvetu sa tripsinom bakterije

ne preživaljavaju, izuzev Lb.sakei PF19 i Lb.curvatus PF17. Ovo se objašnjava isto

posledicom stresa kojem su bakterije izložene. Nakon inkubacije u trajanju od 4h povećava se

broj bakterija i raste stopa preživljavanja kod skoro svih sojeva sem kod W.viridescens M18

Master rad


24

(0,59%) i Lb.curvatus PF17 (25,86%). Lb.sakei PF19 koji je bio izložen dejstvu kisele

sredine, a zatim dejstvu tripsina je pokazao povećan rast nakon inkubacije od 4h.

Centrifugiranje je loše uticalo na bakterijske ćelije ove vrste i uočava se niska stopa

preživljavanja sa tripsinom.

Ispitivanja sposobnosti preživljavanja bakterija mlečne kiseline pod dejstvom tripsina

vršena su i sa izolatima izolovanim iz Harbin suve kobasice (Han et al., 2017). Svi ispitivani

izolati su preživeli simulirane uslove digestivnog sistema, pod dejstvom tripsina, i svima se

vremenom smanjivala stopa preživljavanja. Lactobacillus brevis R4, Lactobacillus curvatus

R5, kao i Lactobacillus pentosaceus pokazuju izuzetnu toleranciju na tripsin. Lactobacilli

zauzimaju dominantnu poziciju u okviru mikroflore čovekovog gastrointenstinalnog trakta,

stoga je njihova stopa preživljavanja visoka u crevima, što je u skladu sa dobijenim

rezultatima.

4.3. Stepen autoagregacije

Probiotski mikroorganizmi i mikroorganizmi koji čine mikrofloru digestivnog trakta

interaguju u ljudskom digestivnom sistemu. Sposobnost probiotskih mikroorganizama da

kolonizuju sredinu gastrointenstinalnog trakta dovodi do formiranja barijere unutar

digestivnog sistema koja sprečava patogene mikroorganizme u naseljavanju

gastrointenstinalnog sistema i vezivanju za crevni epitel (García-Cayuela et al., 2014; Peres et

al., 2014). Mehanizmi autoagregacije još uvek nisu sasvim poznati. Smatra se da su species-

specifični, i da sredina takođe utiče na njihovo formiranje. Ta sposobnost nastaje kao

posledica različitih fizičko-hemijskih reakcija, i smatra se da glavnu ulogu imaju površina

ćelije i komponente na ćelijskoj membrani i ćelijskom zidu. Ustanovljeni su i geni koji

kodiraju određene faktore zadužene za autoagregaciju, i opisani su u nekoliko radova (García-

Cayuela et al., 2014; Goh & Klaenhammer , 2010).

U ovom istraživanju ispitivana je sposobnost autoagregacije BMK iz peglane

kobasice. Rezultati su predstavljeni stepenom autoagregacije koji je izračunat po formuli (1-

At/A0) x 100%, na osnovu razlike u apsorbanci pre i posle inkubiranja BMK u roku od 5h i

24h. Metoda koja je korišćena u ovom istraživanju dala je sledeće rezultate prikazane u Tabeli

6. i na Slici 6.

Master rad


25

21%

39%

17%

53%

17%27,00%

36,00%

49,10%

29,00%

67%

9%

49%38%

81%

25%

76,00%

21%

79%

38%

84,00%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

At 5h At 24h

Lb.sakei M14 Lb.sakei PK17 Lb.sakei PF18 Lb.sakei PF19

Lb.curvats PK4 Lb.curvats PK5 Lb.curvatus PF17 L.mesent.dextr PK15

W.viridescens M18 C.maltaro M2

Slika 6. Stepen autoagregacije BMK

At 5h, At 24h –vreme inkubacije

Tabela 6. Stepen autoagregacije BMK

A0 0h At 5h Autoagregacija

(%) posle 5h

At 24h Autoagregacija

(%) posle 24h

Lb.sakei

M14 0,059 0,047 21% 0,036 39%

PK17 0,145 0,120 17,3% 0,068 53,2%

PF18 0,083 0,069 17% 0,061 27%

PF19 0,053 0,034 36% 0,027 49,1%

Lb.curvatus

PK4 0,073 0,052 29% 0,024 67,2%

PK5 0,070 0,064 9% 0,036 49%

PF17 0,074 0,046 38% 0,014 81,1%


dextranicum

PK15 0,120 0,090 25% 0,029 76%

W.viridescens

M18 0,057 0,045 21,1% 0,012 79%

C.maltaromaticum

M2 0,086 0,054 38% 0,014 84%

Master rad


26

Na osnovu ovih podataka može se uočiti znatno povećanje stepena autoagregacije

nakon inkubacije u trajanju od 24h. Posle inkubacije u trajanju od 5h, najveću stopu

autoagregacije posedovali su sledeći sojevi: Lb.sakei PF19 (36%) i Lb.curvatus PK4 (29%),

PF17 (38%) i C.maltaromaticum M2 (38%), dok je najmanji stepen kod sojeva Lb.sakei PF18

(17%) i Lb.curvatus PK5 (9%). Posle inkubacije u trajanju od 24h, najveću autoagregacionu

sposobnost pokazuju Lb.curvatus PF17 (81,10%), L.mesenteroides ssp. dextranicum PK15

(76%). W. viridescens M18 (79%) i C.maltaromaticum M2 (84%). Najmanju stopa uočava se

kod Lb.sakei M14 (39%) kao i kod Lb.sakei PF18 (27%).

Autoagregaciona sposobnost ispitivana je kod bakterija mlečne kiseline izolovanih iz

Harbin suve kobasice (Han et al., 2017). Rezultati su pokazali veliku varijabilnost među

izolatima. Najveći stepen autoagregacije posle inkubacije od 24h uočen je kod sojeva

Lb.brevis R4 (80,5%) i Lb.acidophilus (77,8%). Lb.curvatus, Lb.pentosaceus, Lb.fermentum

R6, i Lb.plantarum pokazali su manji stepen autoagregacije (<20%). Druga istraživanja su

potvrdila da se inkubacijom u trajanju od 24h povećava stepen autoagregacije (García-

Cayuela et al., 2014; Gil-Rodríguez et al., 2015; Peres et al., 2014). Divya i saradnici (2012.)

su ispitivali autoagregacionu sposobnost 5 izolata, gde je najveći stepen autoagregacije uočen

kod vrste E.faecium (61%).

4.4. Površinska hidrofobnost

Jedno od bitnijih probiotskih svojstva BMK jeste njihova sposobnost vezivanja za

druge ćelije i ciljne lokacije u digestivnom sistemu. Hidrofobne reakcije su najjače ne-

kovalentne interakcije dugog dometa. Površinska hidrofobnost može da ponudi kompetitivnu

prednost prilikom vezivanja BMK, i jako je poželjno svojstvo kod probiotskih

mikroorganizama, jer omogućava vezivanje za intenstinalne epitelne ćelije (García-Cayuela et

al., 2014). Mikrobna sposobnost vezivanja za ugljovodonike se koristi za merenje sposobnosti

hidofobnosti. Vezivanjem probiotskih mikroorganizama se omogućava odbrana od patogenih

mikroorganizama, jer se blokiraju ćelijski receptori za koje se vezuju patogeni.

Metoda kojom je ispitivana površinska hidrofobnost BMK iz peglane kobasice dala je

sledeće rezultate prikazane u Tabeli 7. i na Slici 7. Procenat hidrofobnosti je izračunat po

formuli : Hidrofobnost (%) = (1-At/A0) x 100%, na osnovu razlike u apsorbanci pre i posle

Master rad


27

mešanja suspenzije ćelija BMK sa hloroformom. Stepen hidrofobnosti je meren usled

interakcije BMK sa hloroformom, čime se zapravo određuje mera baznih (elektronskih

donora) i kiselih (elektronskih akceptora) karakteristika ćelijske površine (Martin et al.,

2005).

Tabela 7. Stepen površinske hidrofobnosti BMK

A0 At Hidrofobnost

(%)

Lb.sakei

M14 0,085 0,064 25%

PK17 0,079 0,047 41%

PF18 0,063 0,047 25,4%

PF19 0,071 0,053 25,4%

Lb.curvatus

PK4 0,104 0,094 10%

PK5 0,100 0,131 -31%

PF17 0,113 0,104 8%


dextranicum

PK15 0,105 0,106 -0,9%

W.viridescens

M18 0,093 0,102 -9,67%

C.maltaromaticum

M2 0,083 0,051 39%

Master rad


28

25%

41,00%

25% 25%

10,00%

-31%

8%

-0,9%-9,67%

39,00%

-40%

-20%

0%

20%

40%

60%

Lb.sakei M14 Lb.sakei PK17 Lb.sakei PF18Lb.sakei PF19 Lb.curvatus PK4 Lb.curvatus PK5Lb.curvatus PF17 L.mesent.dextr Pk15 W.viridescens M18C.maltaromaticum M2

Slika 7.Stepen površinske hidrofobnosti BMK

Na osnovu prikazanih rezultata može se uvideti variranje u stepenu hidrofobnosti

izolata BMK izolovanih iz peglane kobasice. Negativan stepen površinske hidrofobnosti

uočen je kod vrsta Lb.curvatus PK5 (-31%), i kod W.viridescens M18 (-9,67%). Svi ostali

izolati pokazuju pozitivan stepen hidrofobnosti, gde se najmanji javlja kod vrsta Lb.curvatus

PF17 (8%) i L.mesenteroides ssp. dextranicum PK15 (0,9%), a najveći kod Lb.sakei PK17

(41%) i C.maltaromaticum M2 (39%).

Površinsku hidrofobnost kod izolata BMK su ispitivali Divya i saradnici (2012.)

Lb.plantarum B6 je pokazao veći afinitet prema rastvaračima koji su se koristili u istraživanju

(etil-acetat, heksadekan, ksilen, toluen i hloroform) od ostalih. E. faecium pokazao je veliki

afinitet ka hloroformu (89%), dok su ostali izolati sem Lb.plantarum G1 pokazali stepen

hidrofobnosti <40%. Han i saradnici (2017.) su istraživanjem došli do rezultata koji su

pokazali da vrednosti stepena hidrofobnosti ispitivanih BMK variraju, polazeći od 12.1%

(Lb.fermentum) do 85.7% (Lb.brevis R4). Lb.brevis R4, Lb.acidophilus i Lb.sakei pokazali su

veliki stepen hidrofobnosti.

4.5. Rast u podlozi sa teškim metalima

Kontaminacija teškim metalima je jedan od ozbljnijih problema kako iz zdravstvene

perspektive tako i iz šireg ekološkog stanovišta. Najčešći put unošenja teških metala u ljudski

organizam je preko vode i hrane. Najbolji način sprečavanja njihove akumulacije u živim

organizmima je uklanjanje istih iz zemljišta, vode i hrane. Postoji niz istraživanja koja

potvrđuju toleranciju mikroorganizama na teške metale, i sposobnost mikroorganizama koji

Master rad


29

žive u zemljištu, da ih apsorbuju i mobilišu ih iz zemljišta (Gadd 1990; Idris et al. 2004).

BMK se danas široko proučavaju na ovom polju. Jedno od dosadašnjih istraživanja je

pokazalo sposobnost BMK da apsorbuju cijanotoksine iz vode, kao i mikotoksine iz hrane

(Meriluoto et al. 2005; Nybom et al. 2007). Pored ovog dokazana je i sposobnost BMK da

apsorbuju teške metale iz vode (Halttunen et al. 2007).

Ovo istraživanje ima za cilj da ispita tolerantnost izolata BMK iz peglane kobasice na

povećane koncentracije metala u podlozi. Inhibitorne koncentracije metala na izolate BMK

prikazane su preko MIC vrednosti metala (Tabela 8).

Tabela 8. Antimikrobna aktivnost metala izražena preko MIC vrednosti (mg/l)

Pb Cd Cu Ni Zn

Lb.sakei

M14 >1000 31,25 1000 >1000 ≥1000

PK17 >1000 31,25 250 1000 250

PF18 / 31,25 500 >1000 ≥1000

PF19 / 31,25 500 >1000 ≥1000

Lb.curvatus

PK4 >1000 31,25 1000 >1000 1000

PK5 >1000 31,25 500 >1000 1000

PF17 / 31,25 1000 >1000 ≥1000


dextranicum

PK15 >1000 31,25 250 >1000 1000

W.viridescens

M18 >1000 31,25 250 >1000 500

C.maltaromaticum

M2 >1000 31,25 500 >1000 1000

Na osnovu rezultata može se zaključiti da su svi izolati rasli u sredini koja je sadržala

olovo na koncentraciji 1000 mg/l. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) za Cd iznosi

Master rad


30

31,25 mg/l kod svih izolata. Minimalna inhibitorna koncentracija Cu je 1000 mg/l kod

Lb.sakei M14, Lb.curvatus PK4 i PF17 dok je kod ostalih uglavnom manja. MIC za Cu kod

izolata Lb.sakei PF18, PF19, Lb.curvatus PK5 i C.maltaromaticum M2 iznosi 500 mg/l, dok

za izolate poput Lb.sakei PK17, L.mesenteroides ssp.dextranicum PK15 i W.viridescens

iznosi 250 mg/l. Što se tiče nikla, većina BMK je rasla na koncentraciji od 1000 mg/l, izuzev

Lb.sakei PK17. Skoro svi izolati su rasli na najvećoj koncentraciji Zn, izuzev Lb.sakei PK17

čija je MIC vrednost 250 mg/l i W.viridescens M18, čija je MIC za Zn 500 mg/l.

Istraživanjem koje je vršeno od strane Haltunnena i saradnika (2007) , došlo se do

rezultata da soj Lb.casei Shirota inkubacijom od 5 minuta dobro adsorbuje jone Cd2+ i Pb2+,

dok se nekon 4h inkubacije sposobnost adsorpcije jona teških metala povećava. Lb.fermentum

ME3 vremenom smanjuje sposobnost adsorpcije. Takođe je dokazano da pH vrednost sredine

u kojoj se nalaze BMK igra bitnu ulogu u vezivanju jona teških metala. Isto istraživanje

pokazalo je da svi ispitani bakterijski sojevi uspešno uklanjaju Pb (97% iz finalne

koncentracije od 1000 μg/l ) i Cd (99% iz finalne koncentracije od 100 μg/l ) iz vode. Slični

rezultati objavljeni su i za druge bakterije kao što su Bacillus subtilis (Fein et al.,1997) i

Pseudomonas putida (Pardo et al., 2003). Soj Enterococcus faecium se pokazao

najdelotvornijim u vezivanju Cu, a u vezivanju Zn L.mesenteroides (Mrvčić et al., 2012).

Lb.brevis se pokazao najotpornijim na uticaj bakra u sredini (Mrvčič et al,. 2011). Archibald i

saradnici (1981) otkrili su da bakterija Lb.plantarum ima veliku sposobnost akumulacije jona

Mn.

4.6. Rezistencija na antibiotike

BMK se danas koriste sve više za pravljenje probiotiskih proizvoda i ovo je jedan od

razloga zbog kog je značajno ispitati njihovu rezistentnost na određene antibiotike. Otpornost

na dejstvo antibiotika je jako bitno pitanje koje se odnosi na zdravlje ljudi, jer je DNK

materijal koji nosi informaciju za otpornost na antibiotike mobilan, i kao takav može se

prenositi na patogene bakterije. U ovom radu osetljivost na antibiotike ispitivana je za sva 10

izolata, izolovanih iz mesa, i dva uzorka peglanih kobasica.

Dobijeni rezultati metodom disk difuzije prikazani su u Tabeli 9. i na Slici 8.

Master rad


31

Tabela 9. Zone inhibicije rasta izolata BMK u prisustvu antibiotika (mm)

Antibiotici

Ime izolata SXT

25µg

AM

10µg

AMC

3µg

AK

30µg

VA

30µg

CIP

5 µg

E

15µg

IMP

10µg

Lb.sakei

M14 0 25 12 17 0 18 27 0

PK17 0 27 16 11 0 17 34 0

PF18 0 24 18 9 13 18 30 14

PF19 0 26 18 7 9 16 36 0

Lb.curvatus

PK4 0 29 16 16 0 18 35 0

PK5 0 29 20 0 0 12 38 0

PF17 0 34 20 20 0 23 38 0


dextranicum

PK15 0 27 15 16 0 18 33 0

W.viridescens

M18 0 33 30 13 0 20 - 20

C.maltaromaticum

M2 0 26 20 9 14 14 34 13

Trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT), Ampicilin (AM), Amoxicillin/clavicular acid (AMC), Amikacin (AK),

Vancomycin (VA), Ciprofloxacin (CIP), Erythromycin (E), Imipenem (IMP)

Na osnovu rezultata može se videti da izolati pokazuju veliku rezistentnost na

Trimethoprim/sulphamethoxazole. Većina izolata je rezistentna i na Vancomycin sem

Lb.sakei PF18 (13 mm), PF19 (9 mm) i C.maltaromaticum-a M2 (14 mm). Na Imipenem su

osetljivi samo Lb.sakei PF18 (14 mm), W.viridescens M18 (20 mm), C.maltaromaticum M2

(13 mm). Na osnovu podataka prikazanih u tabeli, izračunata je aritmetička sredina i

standardna devijacija zone inhibicije datih izolata, korišćenjem statističkog programa SPSS

(verzija 22.0.0.0). Posmatrajući vrednosti aritmetičkih sredina inhibicija rasta koje su

prikazane na Slici 8, može se zaključiti da postoje varijacije u osetljivosti između izolata

Master rad


32

Slika 8. Aritmetička sredina zona inhibicije pri delovanju različitih antibiotika na rast BMK ± standardna

devijacija

izolovanih iz peglane kobasice. Izolati svih vrsta pokazuju veliku osetljivost na Erythromycin

(srednja vrednost zone inhibicije od čak 33,89 mm), sem izolata W.viridescens čija osetljivost

na ovaj antibiotik nije ispitana u ovom radu. Velika osetljivost je uočena i na dejstvo

Ampicilina, gde je srednja vrednost zona inhibicije 28 mm. Srednje vrednosti zona inhibicije

su malo manje za Amoxicilin/clavicular acid (18,5 mm), Ciproflaxacin (17,4 mm) i Amikacin

(11,8 mm), ali bakterije pokazuju osetljivost i na ove antibiotike.

Trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT), Ampicilin (AM), Amoxicillin/clavicular acid (AMC), Amikacin (AK),

Vancomycin (VA), Ciprofloxacin (CIP), Erythromycin (E), Imipenem (IMP)

Generalno se smatra da su bakterije mlečne kiseline otporne na Vancomycine (Zhou et

al., 2000). U istraživanju koje je rađeno od strane Divye i saradnika (2012.) ustanovljeno je da

su dva soja Lb.plantarum (B6 i C9), kao i W.cibaria G4 otporni na Vancomycine (30 μg).

Plessas i saradnici su dokazali rezistentnost dva soja Lactobacillus K14 i K39 izolovanih iz

Feta sira, na Erythromycin (2017). Istraživanje rađeno od strane Patil-a i saradnika (2010),

ispitivanjem BMK izolovanih iz semena i krastavca, je pokazalo da su određeni sojevi vrsta

Lb.plantarum, Lb.fermentum, W.cibaria, W.paramesenteroides, Ped.acidilactici i

Ped.pentosaceous senzitivni na Amoxycillin 10μg kao i na Ampicillin 25μg. Jedno od

istraživanja je rađeno sa bakterijama mlečne kiseline koje su izolovane iz mesa, i rezultati su

Master rad


33

pokazali da svih 67 sojeva BMK pokazuju senzitivnost na Penicillin, Ampicillin,

Cephaloridine i Erythromycin (Vidal & Collins-Thompson, 1986).

4.7. Sinteza biogenih amina

Dosadašnjim istraživanjima su otkrivene sposobnosti BMK da sintetišu biogene amine

u mnogim proizvodima kao što su mesni i mlečni fermentisani, u povrću, vinu, itd. Biogeni

amini su organske baze, male molekulske mase sa alifatičnim, aromatičnim i heterocikličnim

strukturama (Lorenzo et al., 2007). Najčešći biogeni amini koji su pronađeni u hrani su

histamin, tiramin, kadaverin, spermin, spermidin, triptamin, 2-feniletilamin. U mesu i mesnim

proizvodima kao i u ribama nalaze se oktopamin i dopamin (Hernandez-Jover et al., 1996).

Formiranje biogenih amina u hrani mikrobiološkom dekarboksilacijom aminokiselina može

da dovede do alergijskih reakcija kod potrošača. Proizvodnja biogenih amina u hrani zavisi od

prisustva prekursora (aminokiselina) kao i od mikroorganizama koji poseduju sposobnost da

vrše dekarboksilaciju. Sprečavanje nastanka biogenih amina u hrani se tradicionalno sprovodi

ograničavanjem mikrobnog rasta u hrani stalnim hlađenjem ili zamrzavanjem proizvoda.

Drugi načini podrazumevaju primenu zračenja (Kim et al., 2003), promene hidrostatičkog

pritiska (Bolton et al., 2009), upotrebu aditiva (Mah & Hwang, 2009), itd. Rezultati dobijeni

ovim istraživanjem imali su za cilj da ispitaju sposobnost proizvodnje biogenih amina od

strane BMK izolovanih iz peglane kobasice, i prakazani su u Tabeli 19.

Nakon inkubacije u trajanju od 24h na 30° C primećeno je da su svi izolati sem izolata

Lb.sakei PK17 i Lb.sakei PF19 snižavali pH podloge, što je dovodilo do menjanja boje

podloge od plave i tamno zelene ka žutoj. Može se zaključiti da jedino dve pomenute vrste

imaju delimičnu sposobnost sinteze biogenih amina od korišćenih aminokiselina.

Mnoge bakterije mlečne kiseline koje pripadaju rodovima Lactobacillus, Enter-

ococcus, Carnobacterium, Pediococcus, Lactococcus i Leuconostoc mogu da sintetišu

biogene amine (Maijala et al., 1993; Edwards and Sandine,1981; de Llano et al., 1998; Bover-

Cid & Holzapfel, 1999; Lonvaud-Funel, 2001). Suve fermentisane kobasice mogu akumulirati

sintetisane biogene amine. Velike količine proteina prisutnih u proizvodu, kao i proteolitička

aktivnost tokom procesa zrenja su glavni prekursori za dekarboksilaznu aktivnost starter

kultura i prirodne mikroflore. Tiramin i putrescin su biogeni amini koji su najobimniji u

mnogim vrstama suvih kobasica proizvedenih u Finskoj (Eerola et al., 1998). Straub i

Master rad


34

saradnici (1995) su otkrili da BMK poput Streptococcus thermophilus, Leuconostoc oenos

(Oenococcus oeni) ne poseduju sposobnost sinteze biogenih amina. Neki sojevi laktobacila

koji su pripadali vrstama Lb.buchneri, Lb.alimentarius, Lb.plantarum, Lb.curvatus,

Lb.farciminis, Lb.bavaricus, Lb.homohiochii, Lb.reuteri i Lb.sakei su pokazali sposobnost

produkcije biogenih amina, od kojih je najviše bilo sintetisanog tiramina (Masson et al., 1996;

Montel et al., 1999; Bover-Cid et al., 2001; Pereira et al., 2001). Masson i saradnici (1996) su

dokazali da pojedini sojevi iz roda Carnobacterium (C.divergens, C.piscicola i C.gallinarum)

imaju sposobnost sinteze tiramina (Suzzi & Gardini, 2003). Visok potencijal produkcije

tiramina u vinu pronađen je kod vrste L.mesenteroides (Moreno-Arribas et al., 2003).

Tabela 10. Sinteza biogenih amina od strane BMK

Tirozin Histidin Lizin

Lb.sakei

M14 - - -

PK17 +/- +/- +/-

PF18 - - -

PF19 +/- +/- +/-

Lb.curvatus

PK4 - - -

PK5 - - -

PF17 - - -


dextranicum

PK15 - - -

W.viridescens

M18 - - -

C.maltaromaticum

M2 - - -

+(rast), +/-(delimičan rast), -(negativan rast)

Master rad


35

5. Zaključak

Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:

1) Većina sojeva posle inkubacije u trajanju od 2h pokazuje negativnu stopu

preživljavanja, izuzev sojeva Lb.sakei PF19 i W.viridescens M18. Negativna stopa

preživljavanja u pH3 sredini posle 2h inkubacije uočena je kod sojeva Lb.sakei M14, PK17,

L.mesenteroides ssp. dextranicum PK15 i C.maltaromaticum M2. Jedino soj Lb.sakei M14 u

pH4 sredini pokazuje negativnu stopu preživljavanja.

3) Lb.curvatus PF17 kao i W.viridescens M18 smanjuju svoju stopu preživljavanja u

medijumu sa tripsinom. Soj Lb.sakei PF18 je pokazao slab rast, dok sojevi Lb.sakei PF19 i

Lb.curvatus PK4 povećavaju stopu preživljavanja.

4) Skoro svi izolati pokazuju visok stepen autoagregacije posle inkubacije od 24h, a

najveći stepen autoagregacije je izmeren kod sojeva Lb.curvatus PF17, L.mesenteroides ssp.

dextranicum PK15, W. viridescens M18 i C.maltaromaticum M2.

5) Negativan stepen površinske hidrofobnosti uočen je kod sojeva Lb.curvatus PK5 i

W.viridescens M18. Svi ostali izolati pokazuju pozitivan stepen hidrofobnosti, a najveći je

kod sojeva Lb.sakei PK17 i C.maltaromaticum M2.

6) Svi BMK sojevi ispitivani u ovom radu mogu da rastu u sredini koja sadrži olovo i

nikl. Svi sojevi su osetljivi na prisustvo kadmijuma. Na bakar su najotporniji sojevi Lb.sakei

M14, Lb.curvatus PK4 i PF17. Većina izolata je otporna na cink, izuzev Lb.sakei PK17 i

W.viridescens M18.

7) Svi izolati su rezistentni na Trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT), i svi su

osetljivi na Ampicilin (AM), Amoxicillin/clavicular acid (AMC), Ciprofloxacin (CIP) i

Erythromycin (E). Na Amikacin (AK) je rezistentan samo Lb.curvatus PK5. Na Vancomycine

(VA) su osetljivi samo Lb.sakei PF18 i C.maltaromaticum M2, dok su na Imipenem (IMP)

osetljivi samo Lb.sakei PF18, W.viridescens M18 i C.maltaromaticum M2 .

8) Biogene amine mogu delimično produkovati jedino sojevi vrste Lb.sakei PK17 i

PF19.

Master rad


36

6. Literatura

Adams, C.A., 2010: The probiotic paradox: live and dead cells are biological response

modifiers. - Nutrition Research Reviews 23: 37–46.

Afzal, I.M., Jacqueta, T., Delaunayb, S., Borgesa, F., Millièrea, J-B., Revol-Junellesa, A-M.,

& Cailliez-Grimal, C., 2010: Carnobacterium maltaromaticum:Identification, isolation

tools,ecology and technological aspects in dairy products. - Food Microbiology 27:

573-579.

Ammor, M. S., Dufour, E., Chevallier, I., Zagorec, M., Chaillou, S., 2005: Characterization

and selection of Lactobacillus sakei strains isolated from traditional dry sausage for

their potential use as starter cultures. - Food Microbiology 22: 529–538.

Anadón, A., Larrañaga, RMM., & Martínez A.M., 2006: Probiotics for animal nutrition in the

European union, regulation and safety assessment.- Regul Toxicol Pharmacol 45: 91–

95.

Andoh, A. & Fujiyama, Y., 2006: Therapeutic approaches targeting intestinal microflora in

inflammatory bowel disease. - World Journal of Gastroenterology 12 (28): 4452–

4460.

Archibald, F.S. & Fridovich, I., 1981: Manganese and defenses against oxygen toxicity in L.

plantarum.- J Bacteriol 145 (1): 442–451.

Axelsson, L., 1998: Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology, In Lactic Acid

Bacteria-Microbiology and Functional Aspects, Marcel Dekker, USA, 1-72.

Bai, A.P. & Ouyang, Q., 2006: Probiotics and inflammatory bowel diseases. -Postgraduate

Medical Journal 82 (968): 376–382.

Beijerinck, M.W., 1901: Sur les ferments lactiques de l'industrie. - Néerlandaises des

Sciences Exactes et Naturelles (2) 6: 212–243.

Bernardeau, M., Vernoux, J.P., Henri-Dubernet, S., & Guéguen, M., 2008: Safety assessment

of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus.- International Journal of Food

Microbiology 126: 278-285.

Master rad


37

Bezirtzoglou, E., & Stavropoulou, E., 2011: Immunology and probiotic impact of the

newborn and young children intestinal microflora. - Anaerobe 17: 369–374.

Bohm, S.K. & Kruis, W., 2006: Probiotics: do they help to control intestinal inflammation? -

Annals of the New York Academy of Sciences 1072: 339–350.

Bolton, G.E., Bjornsdottir, K., Nielsen, D., Luna, P.F., & Green, D.P., 2009: Effect of high

hydrostatic pressure on histamine forming bacteria in yellow fin tuna and mahi-mahi

skinless portions. - Institute of Food Technologists (IFT) Conference 2009; USA.

2009. Abstract nr 006-05.

Bover-Cid, S. & Holzapfel, W.H., 1999: Improved screening procedure for biogenic amine

production by lactic acid bacteria. - International Journal of Food Microbiology, 59:

391–396.

Bover-Cid, S., Hugas, M., Izquierdo-Pulido, M., & Vidal-Carou, M.C., 2001: Amino acid-

decarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages. -

International Journal of Food Microbiology 66: 185–189.

Champomier-Verge`s , M.-C., Maguin , E., Mistou, M.-Y., Anglade, P., & Chich, J.-F., 2002:

Lactic acid bacteria and proteomics: current knowledge and perspectives. - J.

Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 771: 329-342.

Choudhari, S., Mopgar, V., Sakhare, S., & Pati, N., 2011: Probiotic way of dental caries

prevention. – Int. Journal of Cotemporary Dentistry 2(1).

Collins, M.D., Farrow, J.A.E., Phillips, B.A., Ferusu, S., & Jones, D., 1987: Classification of

Lactobacillus divergens, Lactobacillus piscicola, and some catalase- negative,

asporogenous, rod-shaped bacteria from poultry in a new genus, Carnobacterium.-

International Journal of Systematic Bacteriology 37: 310-316.

Collins, M.D., Samelis, J., Metaxopoulus, J., & Wallbanks, S., 1993: Taxonomic studies on

some leuconostoc‐like organisms from fermented sausages: description of a new genus

Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. - Journal of

Applied Bacteriology 75: 595-603.

Comi, G., Urso, R., Iacumin, L., Rantsiou, K., Cattaneo, P., Cantoni, C., & Cocolin, L., 2005:

Characterisation of naturally fermented sausages produced in the North East of Italy. -

Meat Science 69: 381−392.

Master rad


38

Cvetković, V.N., 2015: Soybean milk fermentation with probiotic starter culture Master

Thesis - Faculty of Sciences and Mathematics, University of Niš.

Del Re, B., Sgorbati, B., Miglioli, M., & Palenzola, D., 2000: Adhesion, autoaggregation and

hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. - Letters in Applied

Microbiology 32: 438-442.

de Llano, D.G., Cuesta, P. & Rodriguez, A., 1998: Biogenic amine production by wild

lactococcal and leuconostoc strains.- Letters in Applied Microbiology 26: 270–274.

Di Cagno, R., Lopez, C.C., Tofalo, R., Gallo, G., De Angelis, M., Paparella, A., Hammes, W.,

& Gobbetti, M., 2008: Comparison of the compositional, microbiological, biochemical

and volatile profile characteristics of three Italian PDO fermented sausages.- Meat

Science 79: 224−235.

Divya, B.J., Varsha, K.K., & Nampoothiri, M.K., 2012: Newly Isolated Lactic Acid Bacteria

with Probiotic Features for Potential Application in Food Industry.- Appl Biochem

Biotechnol 167: 1314-1324.

Edwards, S.T., Sandine, S.L., 1981: Public health significance ofamine in cheese. - Journal of

Dairy Science 64: 2431–2438.

Eerola, S., Roig-Sague ́s, A.X., Hirvi, T.K., 1998: Biogenic amines in Finnish dry sausages. -

Journal of Food Safety 18: 127–138.

Falagas, M.E., Betsi, G.I., Tokas, T., Athanasiou, S., 2006: Probiotics forprevention of

recurrent urinary tract infections in women: a review of the evidence from

microbiological and clinical studies.- Drugs 66 (9): 1253–1261.

FAO/WHO, 2002: Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a joint

FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in

Food. London, Ontario, Canada.

Fein, J.B., Daughney, C.J., Yee, N. & Davis, T.A., 1997: A chemical equilibrium model for

metal adsorption onto bacterial surfaces.-Geochimica et Cosmochimica 61: 3319–

3328.

Fontana, L., Brito, MB., Diaz, JP., Quezada, SM., Gil, A., 2013: Sources, isolation,

characterisation and evaluation of probiotics. - Br J Nutr 109: 35–50.

Master rad


39

Fusco, V., Quero, G.M., Cho, G.S., Kabisch, J., Meske, D., Neve, H., Bockelmann, W., &

Franz, C.M., 2015: The genus Weissella: taxonomy, ecology and biotechnological

potential. – Frontiers in Microbiology 6(155).

Gadd, G.M., 1990: Heavy metal accumulation by bacteria and other microorganisms.

Experientia 46: 834–840.

García-Cayuela, T., Korany, A.M., Bustos, I., Gomez de Cadiñanos, L.P., Requena, T.,

Peláez, C., & Martínez-Cuesta, M., 2014: Adhesion abilities of dairy Lactobacillus

plantarum strains showing an aggregation phenotype. - Food Research International

57: 44-50.

Garvie, E.I., 1984: Separation of species of the genus Leuconostoc and differentiation of the

leuconostocs from other lactic acid bacteria.- Meth. Microbiol. 16: 147–178.

Gil-Rodríguez, A. M., Carrascosa, A. V., & Requena, T, 2015: Yeasts in foods and beverages:

In vitro characterisation of probiotic traits. - LWT-Food Science and Technology. 64:

1156–1162.

Goh, Y.J., & Kleanhammer, T.R., 2010: Funcional roles of aggregation-promoting- like factor

in stress tolerance and adherence of Lactobacillus acidophillus NCFM. - Applied and

Enviromental Microbiology 76: 5005-5015.

Halttunen, T., Salminen, S. & Tahvonen, R., 2007: Rapid removal of lead and cadmium from

water by specific lactic acid bacteria. - Int J Food Microbiol 114: 30–35.

Hammes, W.P., Bantleon, A. & Min, S., 1990: Lactic acid bacteria in meat fermentation. -

FEMS Microbial. Rev., 87: 165-74.

Han, Q., Kong, B., Chen, Q., Sun, F., & Zhang, H., 2017: In vitro comparison of probiotic

properties of lactic acid bacteria isolated from Harbin dry sausages and selected

probiotics. - Journal of Functional Foods 32: 391-400.

Hernandez-Jover ,T., Izquierdo-Pulido, M., Veciana-Nogues, M.T., Vidal-Carou, M.C., 1996:

Ion-pair high-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines

in meat and meat products. - J Agric Food Chem 44(9): 2710–2715.

Master rad


40

Huang, Y., & Adams, M.C., 2004: In vitro assessment of the upper gastrointestinal tolerance

of potential probiotic dairy propionibacteria. - International Journal of Food

Microbiology 91: 253–260.

Huebner, E.S. & Surawicz, C.M., 2006: Probiotics in the prevention and treatment of

gastrointestinal infections. - Gastroenterology Clinics of North America 35(2): 355–

365.

Idris, R., Trifonova, R. & Puschenreiter, M., 2004: Bacterial communities associated with

lowering plants of the Ni hyperaccumulator Thaspi goesingense. - Appl Environ

Microbiol 70: 2667–2677.

Kim, J.H., Ahn, H.J., Kim, D.H., Jo, C., Yook, H.S., Park, H.J., & Byun, M.W., 2003:

Irradiation effects on biogenic amines in korean fermented soybean paste during

fermentation. - J Food Sci. 68(1): 80–84.

Kos, B., Susković, J., Vuković, S., Simpraga, M., Frece, J., & Matosić, S., 2003: Adhesion

and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. - Journal of

Applied Microbiology 94: 981-987.

Korhonen, J., 2010: Antibiotic resistance of Lactic acid bacteria, PhD thesis - Faculty of

Science and Forestry, University of Eastern Finland.

Kramer, S., & Bischoff, S.C., 2006: Therapeutic possibilities of probiotics inantibiotic-related

diarrhea. - MMW, Fortschritte der Medizin 148 (35–36): 28–30.

Lewis, G., 2006: Probiotics: a better way to treat infections during pregnancy. - Midwifery

Today with International Midwife 79: 30–31.

Li, J., Zhang, W., Wang, C., Yu, Q., Dai, R., & Pei, X., 2012: Lactococcus lactis expressing

food-grade b-galactosidase alleviates lactose intolerance symptoms in post-weaning

Balb/c mice. - Applied Microbiology and Biotechnology 96: 1499–1506.

Limdi, J., K., O'Neill, C., McLaughlin, J., 2006: Do probiotics have a therapeutic role in

gastroenterology? - World Journal of Gastroenterology 12 (34): 5447–5457.

Lonvaud-Funel, A., 2001: Biogenic amines in wines: role of lactic acid bacteria. - FEMS

Microbiology Letters 199: 9–13.

Master rad


41

Lorenzo, J.M, Martinez, S., Franco, I., & Carballo, J., 2007: Biogenic amine content during

the manufacture of dry-cured lacón, a Spanish traditional meat product: Effect of some

additives. - Meat Sci 77(2): 287–293.

Lücke, F.K., 2000: Utilization of microbes to process and preserve meat. - Meat Sci. 56: 105–

115.

Mac Farlane, G.T., & Cummings, J.H., 2002: Probiotics, infection and immunity.- Current

Opinion in Infectious Diseases 15: 501–506.

Mah, J.H., & Hwang, H.J., 2009: Effects of food additives on biogenic amine formation in

Myeolchi-jeot, a salted and fermented anchovy (Engraulis japonicus).- Food Chem.

114(1): 168–173.

Maijala, R., Eerola, S., Aho, M., Hirn, J., 1993: The effect of GDL-induced pH decrease on

the formation of biogenic amines in meat. - Journal of Food Protection 56: 125–129.

Makinen, K., Berger, B., Bel-Rhlid, R., & Ananta, E., 2012: Science and technology for the

mastership of probiotic applications in food products. - Journal of Biotechnology 162:

356-365.

Marsden, J., Ahmed-Kotrola, N., Saini, J., Fung, D.Y.C., Phebus, R., 2009: Cooked meats,

poultry and their products, in Meat Products, ed. Fernandes R.- Leatherhead:

Leatherhead Food International: 53–82.

Martin, R., Olivares, M., Martin, M.L., & Fernandez, L., 2005: Probiotic Potential of 3

Lactobacilli Strains Isolated From Breast Milk. - Journal of Human Lactation 21 (1):

8-17.

Masson, F., Talon, R. & Montel, M.C., 1996: Histamine and tyramnie production by bacteria

from meat products. - International Journal of Food Microbiology 32: 199–207.

Mathur, S., & Singh, R., 2005: Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria – A review. -


Menconi., A., Kallapura, G., Latorre, J.D., Morgan, M.J., Pumford, N.R., Harings, M.B., &

Tellez, G., 2014: Identification and Characterization of Lactic Acid Bacteria in a

Commercial Probiotic Culture. - Bioscience of Microbiota, Food and Health 33 (1):

25–30.

Master rad


42

Meriluoto, J., Gueimonde, M., Haskard, C.A., Spoof, L., Sjovall, O. & Salminen, S., 2005:

Removal of the cyanobacterial toxin microcystin-LR by human probiotics. -Toxicon

46: 111–114.

Meurman, J.H., 2005: Probiotics: do they have a role in oral medicine and dentistry?- Eur J

Oral Sci 113: 188-196.

Milosavljević, P. N., 2015: Lactic acid bacteria in “Pirot`s kachkaval”, Doctoral Dissetation –

Faculty of Technology, University of Niš.

Montel, M.C., Masson, F. & Talon, R., 1999: Comparison of biogenic amine content in

traditional and industrial French dry sausages. - Sciences des Aliments 19: 247–254.

Moreno-Arribas, M.V., Polo, C. M., Jorganes, F., & Muñoz, R., 2003: Screening of biogenic

amine production by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine. -


Mrvčić, J., Stanzer, D., Šolić, E., & Stehlik-Tomas, V., 2012: Interaction of lactic acid

bacteria with metal ions: opportunities for improving food safety and quality. - World

J Microbiol Biotechnol 28:2771–2782.

Mrvčić, J., Šolić, E., Butorac, A., Stanzer, D., Bačun-Družina, V., & Stehlik-Tomas, V.,

2011: The effect of metal ions supplementation on growth and binding capacity of

lactic acid bacteria/7th international congres of food technologists, biotecnologists and

nutritionist/Medić, H. (ur.). Zagreb: Baris, Zaprešić, 67–67.

Nybom, S.M.K., Salminen, S.L., & Meriluoto, J.A.O., 2007: Removal of microcystin-LR by

metabolically active probiotic bacteria. - FEMS Microbiol Lett 270: 27–33.

Pardo, R., Herguedas, M., Barrado, E. & Vega, M., 2003: Biosorption of cadmium, copper,

lead and zinc by inactive biomass of Pseudomonas putida.- Analytical and

Bioanalytical Chemistry 376: 26–32.

Pereira, C.I., Barreto Crespo, M.T. & San Roma ̃o, M.V., 2001: Evidence for proteolytic

activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and Lactobacillus

homohiochii. - International Journal of Food Microbiology 68: 211–216.

Master rad


43

Peres, C., M., Alves, M., Hernandez-Mendoza, A., Moreira, L., Silva, S., Bronze, M.R.,

Malcata, F.M., 2014: Novel isolates of lactobacilli from fermented Portuguese olive as

potential probiotics. - LWT-Food Science and Technnology 59: 234-246.

Petković, J., M., 2015: Determination of autolysis degree of the lactic acid bacteria isolated

from kajmak, Master Thesis- Faculty of Sciences and Mathematics, University of Niš.

Plessas, S., Nouska, Ch., Karapetsas, A., Kazakos, S., Alexopoulos, A., Mantzourani, I.,

Fournomiti, M., Chondrou, P., Galanis, A., & Bezirtzoglou, E., 2017: Isolation,

characterization and evaluation of the probiotic potential of a novel Lactobacillus

strain isolated from Feta-type cheese. - Food Chemistry 226: 102-108.

Rantsiou, K., Drosinos, E., Gialitaki, M., Metaxopoulos, I., Comi, G., & Cocolin, L., 2006:

Use of molecular tools to characterize Lactobacillus spp. isolated from Greek

traditional fermented sausages.- International Journal of Food Microbiology 112:

215−222.

Regal, R.E., Pham, C.Q., & Bostwick, T.R., 2006: Urinary tract infections inextended care

facilities: preventive management strategies. – Consultant Pharmacist 21 (5): 400–

409.

Rolfe, V.E., Fortun, P.J., Hawkey, C.J., & Bath-Hextall, F., 2006: Probiotics for maintenance

of remission in Crohn's disease. - Cochrane Database of Systematic Reviews 18 (4):

CD004826.

Rogelj, I., 1994: Lactic acid bacteria as probiotics. - Mljekarstvo 44 (4): 277-284.

Saarela, M., Mogensen, G., Fondén, R., Mättö, J., & Mattila-Sandholm, T., 2000: Probiotic

bacteria: Safety, functional and technological properties. - Journal of Biotechnology

84: 197–215.

Salazar-Lindo, E., Figueroa-Quintanilla, D., Caciano, M.I., Reto-Valiente, V., Chauviere, G.,

Colin, P., 2007: Effectiveness and safety of Lactobacillus LB in the treatment of mild

acute diarrhea in children. - Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 44:

571-576.

Salminen, S., von Wright, A., 1998: Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional

Aspects. Marcel Dekker Inc., New York.

Master rad


44

Savić, D., 2007: Industrijska mikrobiologija I, Koncepti i anaerobni industrijski mikrobiološki

procesi. Tehnološki fakultet, Leskovac, Univerzitet u Nišu.

Senok, A.C., Ismaeel, A.Y., & Botta, G.A., 2005: Probiotics: facts and myths. - European

Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,CMI, 11: 958–966.

Stiles, M.E. & Holzapfel, W.H., 1997: Lactic acid bacteria of foods and their current

taxonomy.- International. Jouarnal of Food Microbiology 36: 1-29.

Straub, B.W., Kicherer, M., Schilcher, S.M. & Hammes, W.P., 1995: The formation of

biogenic amines by fermentation organisms. - Zeitschrift fu ̈r Lebensmittel-

Untersuchung und Forschung 201:79–82.

Suzzi, G., & Gardini, F., 2003: Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. -


Tannock, G.W., 2004: A special fondness for Lactobacilli. - Appled and Environmental

Microbiology 70 (6): 3186-3194.

Urso, R., Comi, G., & Cocolin, L., 2006: Ecology of lactic acid bacteria in Italian fermented

sausages: Isolation, identification, and molecular characterization. -Systematic And

Applied Microbiology 29: 671−680.

Vidal, A. & Collins-Thompson, D. L., 1986: Resistance and Sensitivity of Meat Lactic Acid

Bacteria to Antibiotics. - Journal of Food Protection, 9 (50):737-740.

Young, P., & Cash, B.D., 2006: Probiotic use in irritable bowel syndrome. - Current

Gastroenterology Reports 8 (4): 321–326.

Zhou JS, Shu Q, Rutherfurd KJ, Prasad J, Birtles MJ, Gopal PK, Gill HS. 2000: Safety

assessment of potential probiotic lactic acid bacterial strains Lactobacillus rhamnosus

HN001, Lb. acidophilus HN017, and Bifidobacterium lactis HN019 in BALB/c mice.

-Int J Food Microbiol 56:87–96.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јована Станковић

Ментор, МН: Наташа Јоковић

Наслов рада, НР: ПРОБИОТСКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ БАКТЕРИЈА МЛЕЧНЕ КИСЕЛИНЕ

ИЗОЛОВАНИХ ИЗ ПЕГЛАНЕ КОБАСИЦЕ

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

44 стр. ; 10 табела, 8 слика

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: микробиологија хране

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: бактерије млечне киселине, пеглана кобасица, пробиотици

УДК 637.055 + 547.472.3 ] : 637.524

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: У овом раду испитиване су пробиотске карактеристике бактерија млечне киселине

(БМК) изолованих из пеглане кобасице. Сви изолати су показали већи степен

преживљавања на pH3 и pH4 вредности киселе средине него на pH2.Трипсин је смањивао

раст једног изолата врсте Lb.curvatus као и W.viridescens, а један изолат Lb.sakei и један

изолат Lb.curvatus су повећавали стопу преживљавања у присуству трипсина.

Површинска хидрофобност се није могла уочити само код два изолата Lb.curvatus и

W.viridescens, док је степен аутоагрегације висок код свих изолата. Сви БМК изолати

испитивани у овом раду су могли да расту у средини која садржи Pb и Ni. Cd инхибира

раст свих врста. Скоро сви изолати су показали осетљивост на већину антибиотика, што

је утврђено дифузионом-диск методом.Само два изолата су имала делимичну способност

продукције биогених амина и оба припадају Lb.sakei врсти.

Датум прихватања теме, ДП: 5.9.2018.

Датум одбране, ДО: 11.10.2018.

Чланови комисије, КО: Председник: Др Татјана Михајилов-Крстев

Члан: Др Зорица Стојановић-Радић

Члан, ментор: Др Наташа Јоковић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jovana Stanković

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: PROBIOTIC CHARACTERISTICS OF LACTIC ACID BACTERIA

ISOLATED FROM IRONED SAUSAGE

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appe

ndixes)

44 p. ; 10 tables, 8 pictures

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: food microbiology

Subject/Key words, S/KW: lactic acid bacteria, ironed sausage, probiotics

UC 637.055 + 547.472.3 ] : 637.524

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The aim of this study was to examine probiotic charateristics of lactic acid bacteria

(LAB) isolated from ironed sausage. All isolates showed a higher degree of survival in acidic

environment at the values of pH3 and pH4, than at pH2. Trypsin reduced the growth of one

isolate of the species Lb. curvatus, as well as W.viridescens, while two isolates of the species

Lb.sakei and one isolate Lb.curvatus increased survival rates in the enviorment with trypsin.

Surface hydrophobicity has not beed observed only in two isolates, Lb.curvatus and

W.viridescens, while the degree of autoaggregation was high in all isolates. All LAB strains

examined in this paper grew in a medium containing Pb and Ni. Cd inhibited the growth of all

species. Almost all isloates showed sensitivity to the most antibiotics, as proved by the disc-

diffusion method. Only two strains had a partial ability to produce biogenic amines and both

belong to the Lb.sakei species.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 5.9.2018.

Defended on, DE: 11.10.2018.

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev

Member: PhD Zorica Stojanović-Radić

Member, Mentor: PhD Nataša Joković

Documents

UNIVERZITET U NIŠU - pmf.ni.ac.rs · Bakterije mlečne kiseline (BMK) mogu se definisati kao grupa gram pozitivnih koka ili bacila, koje su asporogene, nepokretne i anaerobne ili