1

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BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR

DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO

POLIMORFISMOS EM GENES ENVOLVIDOS NO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E O RISCO DE

DESENVOLVIMENTO DA LEUCEMIA INFANTIL

RAFAELA MARIA SEABRA SILVA

RECIFE

2010

2

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO

CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS

DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA

PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR

DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO

POLIMORFISMOS EM GENES ENVOLVIDOS NO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E O RISCO DE DESENVOLVIMENTO DA LEUCEMIA

INFANTIL

RAFAELA MARIA SEABRA SILVA

RECIFE

2010

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE

Orientador: Dra. Maria Tereza Cartaxo Muniz

3

Silva, Rafaela Maria Seabra Polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo do ácido fólico e o risco de desenvolvimento da leucemia infantil / Rafaela Maria Seabra Silva. – Recife: O Autor, 2010. 73 folhas : fig., tab.

Orientadora: Rafaela Maria Seabra Silva. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCB. Genética e Biologia molecular, 2010. Inclui bibliografia e anexos.

1. Leucemia 2. Leucemia em crianças 3. Polimorfismo

genético I. Título. 616.99419 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-217

4

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO

PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM

GGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR

Parecer da comissão examinadora da dissertação de:

Rafaela Maria Seabra Silva

Intitulada: Polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo do ácido fólico e o risco

de desenvolvimento da leucemia infantil

A comissão examinadora considera o presente trabalho [ APROVADA ]

Portanto, cumpridas todas as exigências regimentais, Rafaela Maria Seabra Silva faz jus ao grau de Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFPE.

Recife, 05/03/2010

__________________________________________ 1º Examinador: Antônio Carlos de Freitas

Universidade Federal de Pernambuco __________________________________________

2º Examinador: Neide Santos Universidade Federal de Pernambuco

__________________________________________

3º Examinador: Rita de Cássia de Moura Universidade de Pernambuco

__________________________________________

Orientador: Maria Tereza Cartaxo Muniz Universidade de Pernambuco

5

RREESSUUMMOO Leucemia é a neoplasia hematológica mais comum na infância. Sua etiologia

não está elucidada sendo provável uma interação gene-ambiente. O ácido

fólico é uma vitamina do complexo B transportado para a célula pela proteína

carreadora de folato reduzido. Enzimas importantes no metabolismo do ácido

fólico são: A metilenotetrahidrofolato redutase, metionina sintase, e timidilato

sintase. Este foi um estudo exploratório com caso-controle. A população

amostral foi diferente para cada um dos polimorfismos estudados sendo

constituída de amostras oriundas do CEONHPE/HUOC e INCa. A detecção dos

genótipos foi realizada através PCR–RFLP para os polimorfismos MTHFR 677,

MS 2756 e RFC1, seguida de digestão enzimática, por PCR para as repetições

em tandem no gene TS e PCR alelo-específica para o polimorfismo MTHFR

1298. Não observamos diferença estatisticamente significante na freqüência

genotípica dos polimorfismos A2756G MS e nas repetições em tandem 2R/3R

no promotor do gene TS. O genótipo mutante RFC 80AA foi relacionado a

diminuição do risco de desenvolvimento de leucemias agudas e LLA no

CEONHPE, LMA no INCa e leucemias agudas e LMA, na análise CEONHPE e

INCa. A presença do alelo 677T foi associada ao aumento do risco de

leucemias agudas e LLA. Enquanto a presença do genótipo MTHFR 1298CC

foi associado a uma significativa redução do risco. O resultado deste estudo

sugere a associação dos polimorfismos RFC G80A, MTHFR A1298C e MTHFR

C677T com a susceptibilidade a LA infantil.

Palavras-Chave: Polimorfismo. Leucemia infantil. RFC. MTHFR. TS. MS.

6

ABSTRACT

Leukemia is the most common hematologic malignancy in childhood. Its

etiology is not elucidated and is likely a gene-environment interaction. Folic acid

is a vitamin B complex transported to the cell by binding protein of reduced

folate. Important enzymes in the metabolism of folic acid are: The

methylenetetrahydrofolate reductase, methionine synthase, and thymidylate

synthase. This was an exploratory study with case-control. The sample

population was different for each of the polymorphisms studied was made up of

samples from CEONHPE / HUOC and Cancer Institute. Genotype detection

was performed by PCR-RFLP for the polymorphisms MTHFR 677, MS 2756

and RFC1, followed by enzymatic digestion, by PCR for the tandem repeats in

the TS gene and allele-specific PCR for the MTHFR 1298 polymorphism. No

statistically significant difference in genotype frequency of polymorphisms

A2756G MS and tandem repeats in the 2R/3R TS gene promoter. The mutant

RFC 80AA genotype was related to decreased risk of developing acute

leukemia and in CEONHPE ALL, AML and INCa in acute leukemias and AML,

and the analysis CEONHPE Cancer Institute. The presence of 677T allele was

associated with increased risk of acute leukemia and ALL. While the presence

of the MTHFR 1298CC genotype was associated with a significant reduction in

risk. The result of this study suggests the association of polymorphisms G80a

RFC, MTHFR A1298C and MTHFR C677T with susceptibility to AL's.

Key-words: Acute Leukemia. Polymorphisms. MTHFR. RFC. TS. MS.

7

AAggrraaddeecciimmeennttooss

Agradeço primeiramente e acima de tudo a Deus. Na vida aprendi

muitas coisas, e uma delas foi que acasos e coincidências não existem, o que

há de verdade são momentos e relações, únicos por excelência, que

contribuíram de alguma forma, cada um, para que eu me tornasse o que sou

hoje.

Agradeço, claro, aos meus pais, Rosa e Marcos, e a minha irmã Rebeca

(Bel). A família é o início de tudo, e graças a Deus eu posso dizer que a minha

família é a minha base, minha sustentação, meu alicerce. Sem eles eu não

conseguiria nada, e de fato, nada que eu conquistasse teria sabor de vitória

sem que eles estivessem ao meu lado. São meus amores incondicionais.

Agradeço aos meus Amigos, em especial a Luana Peretti (Lú), Lais

Carvalho (Lala), Alide Lima (Lid), Flavio Ramos (Flavinho) e Renan Carlos. Por

tudo, alegrias, choro, apoio, conversas, discussões, brigas, conciliações,

brincadeiras, conselhos... Mas acima de tudo, pela amizade e afeto que a mim

dedicaram. Aprendi mais com essas cinco pessoas, no “mestrado da vida”, do

que jamais imaginei. Nem preciso dizer que os amo e que para sempre estarão

no meu coração. Obrigada, por ter sido eterno!

Agradeço também aos meus amigos de turma, em especial a Amanda

Arcanjo, Jefferson e Giordani. Pelo companheirismo e apreço. Foi incrível

estudar com vocês.

Agradeço aos meus companheiros de laboratório Maíra (Mah),

Alexandre (Xande), Helker, Elker Lene, Hildson, Felipe, Filipe, Jaqueline,

Karina, Vanessa e Dayse. Em especial a Maíra e ao Hildson. Mas acima de

tudo, a todos, pela paciência e ensinamentos. Foi um prazer trabalhar com

vocês.

Agradeço a minha orientadora Tereza Cartaxo, pela oportunidade, pelos

puxões de orelha, e muito mais por ter acreditado que eu seria capaz.

Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) pelo auxilio financeiro.

E em especial a alguns professores que despertaram em mim o

verdadeiro espírito científico (Elizabete Malaquias, Raquel Coimbra, Tercilio,

Marcos Morais e Valdir), aqui fica o meu muito obrigado!!!

8

LLiissttaa ddee aabbrreevviiaattuurraass LLiissttaa ddee aabbrreevviiaattuurraass

A Adenina C Citosina CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CEOHNPE Centro de Oncohematologialogia Pediátrica cDNA

Complementar Desoxyribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico complementar

DFH Dihidrofolato DHFR Dihidrofolato redutase DMSO Dimetilsufóxido DNA Desoxiribonucleic Acid

Ácido Desoxirribonucléico dNTP Dinucleotideo Trifosfatado dTMP Timidina monofosfato dUMP Uridina monofosfato EDTA Ácido etilenodiaminotetracético FR Folate Receptors

Receptor de folato G Guanina Hcy Homocisteína HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz IC Intervalo de confiança INCA Instituto Nacional de Câncer Kb kilo bases (mil pares de bases) LA Leucemia Aguda LLA Leucemia Linfóide Aguda LLC Leucemia Linfóide Crônica LMA Leucemia Mielóide Aguda LMC Leucemia Mielóide Crônica

μg Micrograma

L Microlitro

MgCl2 Cloreto de magnésio

MS Metionina sintase MTHFR Metilenotetrahidrofolato redutase NaCl Cloreto de sódio OAT Organic Anion Transporters

Transportadores de Ânions Orgânicos

OR Odds ratio Pb Pares de Bases PCFT Proton-Coupled Folate Transporter

Transportadores de Folato Próton–Associado

PCR Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase

RFC Reduced Folate Carrier Carreador de folato reduzido

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição

9

RNA Ribonucleic Acid Ácido Ribonucléico

SAM S-adenosil metionina

SDS Sodium Dodecyl Sulfate Dodecil Sulfato de Sódio

SHMT Serinahidroximetil transferase

T Timina Taq Thermophylus aquaticus TBE Tris-borato-EDTA THF Tetrahidrofolato TS Timidilato sintase UFPE Universidade Federal de Pernambuco UPE Universidade de Pernambuco UTR Untransleted Region

Região não traduzida UV Ultra-violeta 5-FU 5-fluorouracil

5-metil THF 5-metil tetrahidrofolato

10

LLiissttaa ddee FFiigguurraass

Página Figura 1. Visualização da molécula de ácido fólico com destaque

para as posições N5, N10 nas quais podem existir ligações com os grupos metil (CH3), metileno (CH2), formil (-CHO-) ou formimino (-CHNH-). Adaptado de Assaraf, 2007

11

Figura 2. Via metabólica do ácido fólico em humanos. Adaptado de

Urich et al., 2005. 13

Figura 3. Estrutura esquemática da topologia do Carreador de

Folato Reduzido Humano (RFCh). Matherly. et al., 2007. 16

Figura 4. Estrutura do gene de RFC-1 em humano. Adaptado de

Tolner et al., 1998 16

Figura 5. Esquema estrutural do gene MTHFR e localização das

mutações que provocam diminuição da atividade da enzima. Adaptado de Gos e Szpecht-Potocka 2002.

18

Figura 6. Esquema do gene TS. Adatado de Gibson et al., 2006. 21

11

LLiissttaa ddee TTaabbeellaass

Página Tabela 1. Classificação FAB 09 Tabela 1. Análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg e freqüências

alélicas para os polimorfismos RFC-1 G80A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MS A2756G e para as repetições em tandem no promotor do gene TS.

32

Tabela 2. Características demográficas dos pacientes e controles

analisados para o gene RFC-1. 34

Tabela 3. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

dos pacientes e controles analisados para o gene RFC-1. 35

Tabela 4. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o gene RFC-1.

36

Tabela 5. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

para controles e pacientes portadores de LMA analisados para o gene RFC-1.

38

Tabela 6. Características demográficas dos pacientes e controles

analisados para polimorfismo MTHFR C677T. 39

Tabela 7. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.

40

Tabela 8. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.

41

Tabela 9. Características demográficas dos pacientes e controles

analisados para polimorfismo MTHFR A1298C. 42

Tabela 10. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.

43

Tabela 11. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

para controles e pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.

45

Tabela 12. Características demográficas dos pacientes e controles

analisados para as repetições em tandem no promotor do 46

12

gene TS. Tabela 13. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

dos pacientes e controles analisados para as repetições em tandem no promotor do gene TS.

47

Tabela 14. Qui-quadrado de heterogeneidade dos casos analisados

para as repetições em tandem no promotor do gene TS. 48

Tabela 15. Características demográficas dos pacientes e controles

analisados para o polimorfismo MS A2756G. 48

Tabela 16. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio

dos pacientes e controles analisados para o polimorfismo MS A2756G.

49

13

SUMÁRIO

1 Introdução 15

2 Revisão da Literatura 17

2.1. Leucemia: aspectos gerais 17

2.1.1. Leucemia Linfóide Aguda 19

2.1.2. Leucemia Mielóide Aguda 21

2.2. Ácido fólico 23

2.3. O Carreador de Folato Reduzido humano (RFCh) 28

2.4. A enzima Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR) 31

2.5. A enzima Timidilato Sintase (TS ou TYMS) 34

2.6. A enzima Metionina Sintase (MS ou MTR) 36

3 Objetivos 39

4 Materiais e Métodos 40

4.1. Tipo de estudo 40

4.2. Local do estudo 40

4.3. População do estudo 40

4.4. Critérios de Inclusão 41

4.5. Critérios de exclusão 41

4.6. Considerações éticas 41

4.7. Metodologias para Identificação dos Polimorfismos 42

4.7.1. Extração de material biológico 42

4.7.2. Determinação do polimorfismo RFC G80A 42

4.7.3. Determinação do polimorfismo MTHFR A1298C 43

4.7.4. Determinação do polimorfismo MTHFR C677T 44

4.7.5. Determinação do polimorfismo para TS 44

4.7.6. Determinação do polimorfismo MS A2756G 45

4.7.7. Processamento e análise dos dados 45

5 Resultados 47

5.1 Análise dos dados do gene RFC-1 47

5.2 Análise dos dados do gene MTHFR 52

5.3 Análise dos dados do gene TS 60

14

5.4 Análise dos dados do gene MS 63

6. Discussão 65

7. Conclusões 70

8. Referências 71

9. Anexos 86

15

11..IInnttrroodduuççããoo

As neoplasias hematológicas compreendem um grande número de

distúrbios cujas origens são atribuídas a alterações genéticas de células

hematopoéticas. Estas alterações modificam o padrão de divisão celular,

maturação/diferenciação e apoptose, determinando vantagem proliferativa das

células alteradas. Dentre as neoplasias hematológicas destacam-se as

leucemias nas suas mais variadas formas.

A leucemia é uma desordem no padrão de diferenciação e maturação

das células progenitoras do sistema hematopoiético que modifica o ciclo celular

conferindo às células leucêmicas uma vantagem proliferativa sobre as células

normais. Esta neoplasia corresponde a 30% dos casos de câncer em crianças,

sendo as leucemias agudas responsáveis por 95% dos casos de leucemias

infantis.

Nas últimas décadas, têm sido realizadas inúmeras investigações a fim

de identificar os fatores de risco genéticos e ambientais relacionados ao evento

leucêmico. Alguns destes fatores como radiações ionizantes, agentes químicos

e vírus foram bem descritos e outros, como a deficiência de certos nutrientes

essenciais ao metabolismo normal são alvo de estudos atualmente.

O ácido fólico é uma importante vitamina do complexo B, vital para a

divisão celular e manutenção da homeostase. Produtos do seu metabolismo

participam de processos de metilação gênica, e atuam na síntese e reparo de

DNA, um mecanismo vital para prevenção de rearranjos cromossômicos

comuns em quadros leucêmicos.

Esta vitamina entra na célula via carreador de folato reduzido (RFC) e

estudos recentes sugerem que a alteração no mecanismo de entrada,

resultante de um polimorfismo no loco gênico para o transportador (RFC), pode

contribuir para uma diminuição dos substratos necessários para atividade das

enzimas envolvidas no metabolismo do ácido fólico. A enzima chave nesse

metabolismo é a metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) que converte

irreversivelmente o 5,10 metilenotetrahidrofolato (5,10-MTHF) a 5-

metiltetrahidrofolato (5-MTHF). O loco gênico da MTHFR tem se mostrado

polimórfico exibindo diferentes alelos responsáveis pela diminuição da

16

atividade enzimática e conseqüente acúmulo de 5,10-MTHF. A redução da

atividade enzimática da MTHFR está associada ao aumento do risco de

doenças cardiovasculares, defeitos no tubo neural e desenvolvimento de

determinados tipos de câncer. Em contra partida, esta diminuição da atividade

enzimática da MTHFR também está associada à melhoria da síntese e reparo

do DNA.

Polimorfismos representados por locos que codificam a síntese de

outras enzimas envolvidas no metabolismo de folatos também podem conduzir

a alterações metabólicas significativas, como no caso da metionina sintase

(MS) que é responsável pela remetilação da homocisteína a metionina,

utilizando como co-substrato o 5-MTHF; e da timidilato sintase (TS) que

participa da biossíntese de nucleotídeos e da conversão de dUMP (uridina

monofosfato) a dTMP (timidina monofosfato).

Poucos estudos acerca dos marcadores analisados neste trabalho foram

realizados na população brasileira. Estes trabalhos envolveram doenças como

doença arterial coronariana (Faria- Neto et al., 2006, Muniz et al., 2006),

leucemia linfóide aguda (LLA) (Franco et al., 2001, Pereira et al., 2006,

Zanrosso et al., 2005) e leucemia mielóide aguda (LMA) (da Costa Ramos et

al., 2006). O estudo de polimorfismos em genes envolvidos no metabolismo de

nutrientes essenciais visa contribuir para a identificação de potenciais fatores

de susceptibilidade gênica para o desenvolvimento do câncer. Um maior

conhecimento destes marcadores possibilitará um melhor entendimento dos

mecanismos de metilação, síntese e reparo do DNA. Além disso, contribuirá

para o esclarecimento dos mecanismos que conduzem a rearranjos

cromossômicos, um dos fatores determinantes da leucemogênese.

17

22.. RReevviissããoo ddaa LLiitteerraattuurraa

2.1 Leucemias agudas: aspectos gerais

A hemocitopoese é um processo complexo regulado pela expressão

coordenada de diversos fatores de transcrição, que são ativados ou inibidos

durante o processo. A expressão desregulada e o desequilíbrio desses fatores

resultam em transformações malignas. Em vertebrados, a hemocitopoese é

intensamente ativa durante o desenvolvimento fetal e os primeiros anos de

vida, não sendo surpreendente o fato de ser a leucemia, o principal câncer

infantil (Pui et al., 2004).

O sistema hemocitopoético é composto por células pluripotentes

indiferenciadas que podem originar duas linhagens celulares: a linhagem

linfóide, que irá produzir os linfócitos T e B; e a linhagem mielóide, responsável

pela formação de eritrócitos, plaquetas, monócitos e granulócitos (Colby-

Graham e Chordas, 2003).

As neoplasias hematológicas, decorrentes de proliferação anormal

descontrolada de células indiferenciadas, compreendem um grande número de

distúrbios cujas origens são atribuídas a alterações genéticas de células

hemocitopoéticas, nas quais se destacam as leucemias nas suas mais variadas

formas.

O termo leucemia é originário do grego (leucos = branco, hema =

sangue) e refere-se a um grupo de doenças malignas dos glóbulos brancos

(Colbi-Graham e Chordas, 2003). São subdivididas de acordo com o grau de

diferenciação da célula anormal, em agudas (baixo nível de diferenciação) e

crônicas (alto nível de diferenciação), e considerando a natureza dos blastos,

em linfóide e mielóide. Dentre as neoplasias da linhagem mielóide observa-se

às leucemias mielóides agudas, as mieloproliferações crônicas e as síndromes

mielodisplásicas (pré-leucemias). E entre as neoplasias da linhagem linfóide,

ocorrem as linfoproliferações agudas, os linfomas de células precursoras e as

linfoproliferações crônicas (Cole e Rodu, 2001). As quatro principais formas de

leucemias são, portanto: a leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia mielóide

aguda (LMA), que correspondem respectivamente a cerca de 80% e 15-20%

18

dos casos de leucemias infantis; e a leucemia linfóide crônica (LLC) e a

leucemia mielóide crônica (LMC) mais comum em adultos (Cole e Rodu, 2001,

Colbi-Graham e Chordas, 2003, Krajinovic et al., 2004a).

Na década de 70 as leucemias agudas foram classificadas levando em

consideração critérios morfológicos determinados pelo comitê FAB (Franco-

Americano-Britânico). Segundo estes critérios a LLA é classificada em L1, L2 e

L3, com base no diâmetro celular, na forma do núcleo, no número e

protuberância dos nucléolos e na quantidade e aspectos relativos do

citoplasma, porém essa classificação não consegue refletir a grande

diversidade biológica da doença; a LMA em M1, M2, M3, M4, M5 e M6, com

base nas características nucleares e citoplasmáticas e no grau de maturação

das células blásticas (Bennett et al., 1997; Bennett et al., 1985a). Em seguida,

foram descritos dois novos grupos de LMA - M0 (definido por marcadores

imunológicos, em pacientes que não apresentam critérios morfológicos) e M7

(Bennet et al., 1985b; Bennet et al., 1991).

O preciso evento patogênico que leva ao aparecimento da leucemia

aguda infantil é desconhecido. Apenas pouco mais de 5% dos casos estão

associados a hereditariedade, predisposições genéticas tais como a síndrome

de Down, síndrome de Bloom, ataxia-telangiectasia, e síndrome de Nijmegen,

ou ainda exposição à radiação ionizante e a drogas quimioterápicas. Dentre os

fatores genéticos, estão associadas às leucemias mais de 200 alterações,

incluindo mutações pontuais, deleções gênicas, e inversões. Como resultado

destas alterações podem surgir alterações cromossômicas numéricas e/ou

estruturais. A ocorrência de anomalias cromossômicas é variável, como o fato

de algumas aberrações serem relacionados a particulares subtipos

morfológicos ou fenotípicos (Lightfoot, 2005). Crianças com desordem

genética, como anemia de Fanconi, tem um aumento do risco para leucemia

aguda. Nos primeiros 5 anos de vida, crianças com síndrome de Down têm 36

vezes maior risco para leucemia (Bjorge et al., 2008). Existe, ainda, uma

extensiva lista de fatores ambientais, que confere aumento do risco de

desenvolvimento da doença, sendo os principais: exposição a pesticidas ou

solventes, exposição a campos magnéticos de alta freqüência, ocupação dos

pais, uso de álcool ou tabaco durante a gestação, dieta e histórico reprodutivo

19

materno, uso de vitaminas pré-natal. (Ahlbom et al., 2000, Hjalgrim et al., 2003,

Buffler et al., 2005).

A observação da media de idade das crianças, quando do surgimento da

doença (de 2 a 5 anos), associado ao aumento da prevalência, principalmente

em áreas de alta renda, possibilitou ao pesquisador M. Greaves, formular uma

hipótese sobre a origem da doença: a hipótese de infecção tardia. Segundo

Greaves 2006, há dois momentos importantes para o surgimento da doença: O

primeiro seria ainda in utero, quando o indivíduo, exposto a fatores de risco,

adquiriria células potencialmente leucêmicas. As linhagens linfóides do fígado e

da medula óssea ficam particularmente susceptíveis devido ao estágio de pré-

diferenciação (Gruhn et al., 2008, Cobaleda e Busslinger 2008). Igualmente, as

células da linhagem mielóide ficam susceptíveis, devido principalmente a

grande quantidade de hormônios e fatores de crescimento, que aumentam o

pool de células tronco, aumentando o número de replicação celular e então, a

possibilidade de conversão dessas células em tumorais (Tower e Spector

2007). Os indivíduos portadores do clone pré-leucêmico teriam pouca ou

nenhuma infecção no início da vida, por viverem em um ambiente rico em

higiene. Tal “isolamento” predisporia o sistema imunológico do indivíduo a

respostas anormais ou patológicas quando este fosse exposto a infecções

comuns da idade (segundo momento). A identificação de fusões gênicas

específicas da leucemia (TEL-AML1, por exemplo), hiperploidia, rearranjos

cromossômicos e estudos sobre a origem das leucemias em gêmeos

monozigóticos indicaram, claramente, a origem pré-natal de algumas leucemias

infantis, e confirmaram a teoria de Greaves (Wiemels et al., 1999, Maia et al.,

2003, Greaves, 2006, Hong et al., 2008).

2.1.1 Leucemia linfóide aguda

A leucemia linfoblástica (ou linfóide) aguda (LLA) é o câncer mais comum

na infância, compreendendo cerca de 30% de todos os cânceres pediátricos e

80% das leucemias infantis (Krajinovic et al., 2004b, Karathanasis et al., 2009).

É mais comum entre os meninos (1,3 masculino : 1 feminino) e 60% dos casos

20

são diagnosticados nos primeiros cinco anos com picos de incidência entre

dois e quatro anos de vida (Parkin et al., 1998, Oliveira et al., 2004).

Atualmente, além dos critérios FAB, as LLA são classificadas segundo a

presença de antígenos de superfície, sendo possível detectar com bastante

precisão: a linhagem celular (T ou B) e o nível de diferenciação em que se

encontra o processo leucêmico (Bene et al., 1995; Cavalcanti Jr., 1997). A LLA

do tipo B ocorre em cerca de 80-85% dos pacientes pediátricos, enquanto a

LLA tipo T representa 15% dos casos (Sinnett et al., 2006).

A leucemia linfóide aguda é uma neoplasia maligna dos linfócitos,

caracterizada pelo acúmulo de células linfóides imaturas na medula óssea. As

aberrações na proliferação e diferenciação destes elementos são comuns e a

hemocitopoese normal é suspensa. Estas células anormais encontram-se

paralisadas em diferentes estágios de maturação (Kebriaei e Larson 2003).

As manifestações clínicas da LLA decorrem da inibição da hematopoiese

pelas células leucêmicas e dos efeitos da infiltração destas células em diversos

órgãos e sistemas. A inibição do crescimento e diferenciação das células

hematopoiéticas normais não ocorre somente pela ocupação física da medula

óssea e competição nutricional por parte das células neoplásicas. Várias

evidências experimentais sugerem que as células neoplásicas secretam

substâncias inibidoras da mielopoiese (Oliveira et al., 2004). A infiltração

tecidual pelas células leucêmicas pode resultar em linfadenomegalias,

esplenomegalia e hepatomegalia, que estão presentes em aproximadamente

50% dos pacientes. Aumento do volume mediastinal é encontrado em 14% dos

casos, principalmente na LLA de células T. A maioria dos pacientes com

leucemia apresenta blastos leucêmicos no sangue periférico e o envolvimento

do baço, fígado e linfonodos. Manifestações com comprometimento do sistema

nervoso central como cefaléia, vômitos, letargia, rigidez de nuca, dentre outros

sintomas neurológicos, são freqüentes em 4-7% dos pacientes (Sinnett et al.,

2006, Pieters e Carroll, 2008).

O diagnostico de LLA é confirmado pela punção aspirativa da medula

óssea. O estudo desse tecido revela a substituição do tecido hematopoiético

normal por células leucêmicas imaturas. O diagnostico é então firmado quando

mais de 25% das células nucleadas são blastos (Oliveira et al., 2004).

21

Apesar de a LLA ser responsável pela maioria dos casos de LA infantil, a

LMA é significativamente mais mortal (Brown e Smith 2008). Porém, ainda que

a taxa de sobrevida livre de evento, para crianças com LLA, seja acima de

80%, quase 20% dos pacientes tratados não respondem ao tratamento e uma

considerável proporção dessas crianças continua recaindo ou morrendo,

durante ou após o fim da terapia (Robien e Ulrich, 2003, Ashton et al., 2009).

Este dado parece estar relacionado à presença de polimorfismos que alteram a

atividade de enzimas responsáveis pelo metabolismo de drogas, influenciando,

dessa forma, a eficácia e a toxicidade do tratamento (Karathanasis et al.,

2009).

Embora os aspectos clínicos, patológicos e imunofenotípicos, da

doença, sejam bem documentados, pouco é conhecido sobre o preciso

mecanismo leucemogênico (Krajinovic et al., 1999). A causa da maioria das

leucemias agudas pediátricas é, portanto, desconhecida. Porém, sabe-se que o

surgimento dessa malignidade hematológica está associado à interação

combinada da susceptibilidade genética à exposição ambiental durante o

desenvolvimento fetal e infância (Krajinovic et al., 2004a, Gemmati et al., 2004).

Alterações cromossômicas e moleculares, tais como translocações, inversões e

deleções em genes reguladores do desenvolvimento celular e homeostase,

também aumentam o risco de desenvolvimento da doença (Little 1999,

Krajinovic et al., 2004b, Gruber et al., 2009). O risco de aberrações

cromossômicas também pode ser aumentado devido à deficiência de folatos,

que vem sendo associada à missincorporação de uracil e a quebra da dupla fita

de DNA durante o mecanismo de excisão e reparo (Giovannucci, 2002).

Defeitos e polimorfismos gênicos em enzima folato-dependentes e deficiência

de micronutrientes vem sendo documentado por influenciar a susceptibilidade

ao câncer (Zingg e Jones, 1997, Lucock, 2000, Kamel et al., 2007).

2.1.2 Leucemia mielóide aguda

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma desordem hematológica

caracterizada pela aquisição de mutações somáticas em progenitores

hemocitopoéticos que leva a interrupção no processo de diferenciação,

22

resultando no crescimento da população clonal de células neoplásicas, pela

proliferação de células da linhagem mielóide. Esta alteração maligna nas

células tronco hemocitopoéticas leva a perda da função normal

(hemocitopoese), o que, se não tratada, tipicamente acarreta em morte do

indivíduo em poucas semanas ou meses após a apresentação clinica da

doença. A exposição do DNA a agentes danosos exercem um importante papel

na patogênese da LMA, posto que de 10 a 20% dos casos de LMA estão

associados a pacientes que receberam quimio e/ou radioterapia provenientes

do tratamento de outra malignidade anterior (Tenen, 2003, Voso et al., 2007,

Shipley e Butera, 2009).

A LMA é a leucemia aguda mais comum em adultos, sendo

relativamente rara em crianças. Ocorre em aproximadamente um em cada

130.000 indivíduos menor de 20 anos, correspondendo a cerca de 15-17% dos

casos de leucemia infantil (Pui et al., 2004, Da Costa Ramos et al., 2006). Os

subtipos de LMA são caracterizados por alterações genéticas e alterações

cromossômicas, tais como translocações, inversões e deleções (Tenen, 2003).

Todavia, cerca de 40% a 50% dos pacientes com leucemia mielóide aguda

apresenta cariótipo normal, o que representa o maior subgrupo da patologia

(Mrozek e Bloomfield, 2006). Não obstante, nem todos os pacientes neste

subgrupo apresentam a mesma resposta ao tratamento. Sendo esta,

provavelmente uma conseqüência da grande variabilidade das mutações

genéticas e expressão gênica diferenciada nas populações (Shipley e Butera,

2009).

Existem oito diferentes subtipos de LMA, e identificar o tipo é essencial

para prever o curso da doença e tratar o paciente de forma eficaz.

Tradicionalmente, a classificação está baseada na morfologia das células

blásticas, seguindo critérios da classificação Franco-Americano-Britânica (FAB)

(Tabela 1). A imunofenotipagem é considerada essencial para o correto

diagnostico dos subtipos (Bennett et al., 1991). Segundo a classificação FAB,

os subtipos de LMA são igualmente representados através dos grupos étnicos

e raciais, com exceção da leucemia promielocítica aguda (M3), que tem uma

maior incidência entre as crianças de ascendência latina e hispânica (Rubnitz,

2008).

23

Tabela 1. Classificação FAB

Subtipo FAB Descrição

M0 LMA com diferenciação mínima

M1 Leucemia mieloblástica sem maturação

M2 Leucemia mieloblástica com maturação

M3 Leucemia promielocítica aguda

M4 Leucemia mielocítica aguda

M5 Leucemia monoblástica aguda

M6 Leucemia eritroblástica aguda

M7 Leucemia megacarioblástica aguda

Adaptado de Pui et al., 2004

O prognóstico e a genômica tumoral estão intimamente ligados. Da

mesma forma, há uma relação muito próxima entre citogenética e idade ao

diagnóstico. Anomalias citogenéticas aumentam com o aumento da idade. A

estratificação de risco baseada em citogenética divide os pacientes em três

grupos principais, aqueles com citogenética favorável, intermediário e

desfavorável. Dentro do grupo de risco (citogenética desfavorável) prognóstico

e padrão de tratamento pioram com o aumento da idade (Shipley e Butera,

2009).

2.2. Ácido Fólico

Ácido fólico, folato ou folacina é o nome genérico dado a uma família de

compostos, que exibem atividade biológica, derivados do ácido

pteroilglutâmico, a forma mais estável da vitamina B9 (Godbole et al., 2009). O

nome folato surgiu do termo em Latim folium, que significa folha, pois foi

isolada pela primeira vez a partir de folhas verdes (Mitchell et al., 1941). Agem

como co-fatores para síntese de precursores de nucleotídeos (biossíntese de

purinas e pirimidinas), catabolismo de histidina e ácido fórmico, síntese de

aminoácidos (serina, metionina e glicina) nas reações de transferência de um

carbono, assim como para metilação de ilhas CpG do DNA (Stokstad, 1990;

Assaraf, 2007). A recuperação da metionina é importante, porque seu

24

precursor imediato S-adenosilmetionina (SAM) atua como doador universal dos

radicais metil, em várias reações biológicas que envolvem metilação (Selhub e

Miller, 1991; Goyette et al., 1994).

Naturalmente o ácido fólico é composto por três componentes

estruturais: (1) anel de pteridina, (2) p-ácido aminbenzóico e o (3) resíduo

glutamato (Assaraf, 2007) (Figura 1). A forma mais estável dos folatos é o

ácido fólico, porém este não é encontrado naturalmente em tecidos vivos; para

tornar-se biologicamente ativo, é preciso que este seja reduzido in vivo, o que

resulta em dihidrofolato (DHF) e tetrahidrofolato (THF), pela adição de átomos

de hidrogênio no anel pizarina da pteridina, nas posições 7, 8, e 5, 6, 7, e 8

respectivamente (Baluz et al., 2002, Melo, 2004). O ácido fólico, pode ainda se

ligar a unidades de carbono, que inclui grupos metil (CH3), metileno (CH2),

formil (-CHO-) ou formimino (-CHNH-) nas posições N5, N10 ou N5,10 conferindo

ao folato a função de coenzima, em diferentes sistemas enzimáticos, como

carreador dessas unidades de carbono em diferentes graus de oxidação (figura

1).

Figura 1. Visualização da molécula de ácido fólico com destaque para as posições N5, N

10

nas quais podem existir ligações com os grupos metil (CH3), metileno (CH2), formil (-CHO-)

ou formimino (-CHNH-). Adaptado de Assaraf, 2007

Fora da célula, o ácido fólico é transportado sob a forma de 5-metil-

tetrahidrofolato (5-metilTHF), ligado inespecificamente a proteínas ligantes de

baixa afinidade, principalmente a albumina (Baluz et al., 2002) ou ainda (uma

pequena parte do folato plasmático) ligado à proteína ligante específica de alta

anel de pteridina

p-ácido aminobenzóico

resíduo glutamato

Ácido Fólico

25

afinidade (folate binding proteins) (Steinberg, 1984; Brody, 1994) encontradas

no soro, no fluído cérebro-espinhal, no leite e no sangue do cordão umbilical.

Porém, por serem ânios moleculares hidrofílicos não podem cruzar a

membrana plasmática apenas por difusão, necessitando para isso de sistemas

sofisticados de transporte (Matherly et al., 2007), tais como: Receptores de

Folato (FRs – Folate Receptors), que possuem afinidade por folato oxidado;

Famílias de Transportadores de Ânios Orgânicos (OATs – Organic Anion

Transporters); Transportadores de Folato Próton–Associado (PCFT – Proton-

Coupled Folate Transporter) e o Carreador de Folato Reduzido (RFC –

Reduced Folate Carrier) (Matherly e Goldman, 2003).

Os folatos podem ser absorvidos ao longo de todo o intestino delgado,

preferencialmente no jejuno. Para isto, os poliglutamatos precisam ser

hidrolisados a monoglutamatos pela enzima intestinal pteroilpoliglutamato

hidrolase ou glutamil hidrolase, que é uma enzima zinco-dependente (Gómez,

1997). Em seguida são estocados principalmente no fígado sendo

posteriormente secretado na bile, onde a circulação entero-hepática poderá

reabsorvê-lo e reutilizá-lo, minimizando dessa forma as perdas orgânicas e

garantido a manutenção do nível sérico (Lorenzi et al., 2003; Födinger et al.,

2003; Melo, 2004).

Uma vez que as células de mamíferos não podem sintetizar folato de

novo, a assimilação de folatos a partir da dieta é essencial para o crescimento

e regeneração dos tecidos (Sirotnak e Tolner, 1999), pois este componente é

um nutriente indispensável para a manutenção da mecânica celular

(Krumdieck, 1990; Brody, 1994; Mcnulty, 1995).

Estudos epidemiológicos e experimentais indicam que a deficiência de

ácido fólico em seres humanos induz a extensivas quebras cromossômicas

(Menzics et al., 1966), formação de micronúcleos (Everson et al., 1988),

hipometilação genômica (Jacob et al., 1998), diminuição da capacidade de

reparo do DNA (Choi e Manson, 1998), além do aumento dos níveis de uracila

no DNA das células da medula óssea (Wickramasinghe e Fida, 1994). Outros

estudos ainda associam a deficiência de folato com várias neoplasias, tais

como câncer de pulmão, de esôfago, de pâncreas, de mama, de cérebro e

câncer colorretal (Mason e Levesque, 1996; Duthie et al., 2002). Também já foi

verificado que a suplementação de ácido fólico, pode reduzir o risco do

26

aparecimento de defeitos do tubo neural (Berry et al., 1999; Melo, 2004),

retardo mental (Krishnaswamy e Nair, 2001), doenças vasculares (Chen et al.,

2001), câncer (Kim, 2000) e, em especial, leucemia linfóide aguda em crianças

cujas mães fizeram suplementação de ácido fólico durante a gestação

(Krajinovic et al., 2004b). Por outro lado, uma meta-análise realizada na Nova

Zelândia não detectou o efeito protetor do folato para o risco de

desenvolvimento de LLA em crianças (Dockerty et al., 2007).

O ácido fólico é, portanto, essencial para o fornecimento de grupos metil,

e metilação do DNA, que é importante na regulação epigenética e

silenciamento gênico. A conexão entre a metilação do DNA e o risco de câncer

pode ser compreendida da seguinte maneira: metilação do DNA pode ocorrer

em promotores, bem como em seqüências repetitivas do genoma (Laird, 2005).

Este processo de metilação pode hiperexpressar determinados grupos gênicos

quando realizado de forma ineficiente. A hiperexpressão de protooncogenes

poderá conduzir grupos celulares normais a células alteradas, sendo este um

evento crucial para a oncogênese (Ulrich, 2008).

Alterações no suplemento de folato têm sido associadas com errônea

incorporação de uracil no DNA, levando a quebra na dupla fita durante o reparo

por excisão de uracil (Krajinovic et al., 2004a). Estas quebras são resultantes

da ação de enzimas de reparo de DNA, uracil DNA glicosilase (Blount et al.,

1997). Em condições normais, as glicosilases removem a base do nucleotídeo

mal pareado (uracil) na fita de DNA. Após a ação da uracil DNA glicosilase,

enzimas de reparo genômico removem a ribose ainda presa à fita, causando

ruptura transitória na molécula de DNA (Reidy, 1997). Este processo de

reparação do filamento pode levar a deleções de sequências chave no

processo de regulação do metabolismo celular alterando o crescimento, a

divisão e a síntese protéica podendo assim contribuir para o risco de câncer

(Ulrich, 2008).

A recomendação dietética diária de folatos para homens adultos é de

200 μg, mulheres adultas de 180 μg, gestantes de 400 μg e nutrizes de 280 μg.

Os folatos são facilmente destruídos por agentes físicos e químicos, como

oxidação, calor, cozimento e luz ultravioleta (Lorenzi et al., 2003). Porém

baixos níveis no organismo são resultantes de ingesta nutricional insuficiente

ou deficiências da assimilação no seu metabolismo. A Figura 2 mostra as

27

principais etapas do metabolismo do ácido fólico, desde sua assimilação (pelo

carreador de folato reduzido) a sua participação na síntese de purinas e

pirimidinas, assim como no processo de metilação.

Figura 2: Via metabólica do ácido fólico em humanos. Adaptado de Urich et al., 2005.

A partir da figura 2 é possível observar que o ácido fólico intracelular, é

substrato para três importantes processos enzimáticos: Uma das enzimas

envolvidas é a timidilato sintase (TS) que está implicada na biossíntese de

nucleotídeos (pirimidinas) pela conversão de dUMP (uridina monofosfato) a

dTMP (timidina monofosfato). Ela desempenha um papel crítico em manter um

nível equilibrado de desoxinucleotídios, porque esta é a única fonte de novo de

timidilato, uma condição essencial para a biossíntese de DNA. Portanto,

prejuízos à enzima TS têm sido associados com danos nos cromossomos e

indução de sítios frágeis (Ayusawa et al., 1986, Zhuang et al., 2009). Sendo

assim, a TS é uma importante enzima na manuntenção da integridade gênica

(Ulrich et al., 2005).

Outra enzima importante é a metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

que reduz, irreversivelmente, o 5,10 metilenotetrahidrofolato a 5-metil

tetrahidrofolato (5-metilTHF) (Frosst et al., 1995), tornando este disponível para

a ação de outro processo enzimático mediado pela metionina sintase (MS).

Uma menor disponibilidade de 5-Metil-THF pode diminuir a síntese de

metionina e, conseqüentemente, de S-adenosil metionina (SAM), o principal

doador de radicais metil dos mamíferos.

28

A metionina sintase utiliza o 5-metilTHF como doador de radical metil

para metilação da homocisteína (Hcy) em metionina tendo como co-fator para

esta reação a vitamina B12. Essa reação resulta, também, na produção de S-

adenosilmetionina (SAM) (Ulrich et al., 2000, Goode et al., 2004). Outra

enzima também importante é a dihidrofolato redutase, DHFR, responsável pela

redução, intracelular, do dihidrifolato (DHF) a tetrahidrofolato (THF) (Johnson et

al., 2005).

Sob condições de deficiência de folato, a quantidade de SAM é limitada,

podendo provocar hipometilação genômica. Essa ausência de metilação

conduz à ativação e transcrição inadequada de proto-oncogene e conversão

dos mesmos a oncogenes, iniciando dessa forma o processo carcinogênico

(Zingg e Jones, 1997, Narayanan et al., 2004).

2.3 O Carreador de Folato Reduzido humano (RFCh)

O carreador de folato reduzido humano (RFCh) é expresso em todas as

células e foi caracterizado como principal responsável pelo transporte de ácido

fólico e drogas quimioterápicas antifolato, como o metrotexato (MTX), o

permetrexed (Alimta®) e o raltitrexed (Tomudex®), em células de mamíferos,

mesmo quando múltiplos outros sistemas de assimilação estão presentes

(Sirotnak et al., 1999 e Matherly et al., 2003). Este transporte ocorre

bidirecionalmente através da membrana plasmática, utilizando como carga

negativa o glutamato (Hooijberg et al., 2006, Drodzik et al., 2007).

Esse carreador transporta o ácido fólico reduzido principalmente sob as

formas 5-metil THF e 5-formil THF, necessitando de temperatura ótima, sendo

sódio independente e sensível à inibição competitiva por outros substratos de

RFC (Matherly et al., 2007). Apesar da onipresença do carreador, a absorção

de folato ocorre principalmente no jejuno, através de uma reação dependente

de pH (pH ótimo 5,0) (Melo, 2004).

A proteína carreadora de folato reduzido (RFC) é uma glicoproteína

transmembrana de 65 kDa compreendendo 591 resíduos de aminoácidos,

(Nguyen et al., 1997). O cDNA do gene RFC-1 foi clonado pela primeira vez em

1995 e hoje sabe-se que ele está localizado no cromossomo 21 (21q22.2-

29

q22.3) apresenta 22,5 kb e um cDNA com 1,8 Kb (Chango et al, 2000; Moscow

et al, 1995). Essa localização do gene de RFCh pode, ao menos em parte,

explicar o maior número de casos de toxicidade por MTX em pacientes com

sindrome de Down, pelo aumento do número de copias do gene e consequente

maior expressão do mesmo (Peeters et al., 1987).

O papel fisiológico da glicoproteína RFC pode ser compreendido pela

análise da estrutura da molécula (figura 3). Esta possui 12 domínios

transmembranas (TMD) hélicos (Dixoz et al, 1994) que por sua estrutura

simétrica, apresenta seis segmentos transmembranares em cada uma das

duas metades (Hou et al., 2006), que formam canais na membrana plasmática,

através dos quais o 5-metiltetrahidrofolato atinge o citoplasma da célula

(Hresko et al., 1994). Ambos os domínios, N- e C- terminais, e uma grande

alça, entre os domínios 6 e 7, estão localizados no citoplasma. Os domínios

citoplasmáticos não parecem ser essenciais para o transporte do substrato,

mas são importantes para a biogênese e localização da molécula (Sadlish et

al., 2002, Hou et al., 2006).

Figura 3: Estrutura esquemática da topologia do Carreador de Folato Reduzido

Humano (RFCh). Matherly. et al., 2007.

A partir do gene RFC-1 (figura 4), são gerados transcritos RFC múltiplos,

com terminais UTR (Untransleted Region) 5´heterogêneos. Dos 8 exons

identificados, 5 são primários (2 a 6) e o éxon 1 se apresenta em três formas

30

alternativas distintas (formas 1ª, 1b e 1c), cada qual com um terminal

5´diferente. A ocorrência de formas alternativas do éxon 1, incorporando

diferentes terminais 5´, indica que a transcrição de RFC-1 está sob controle de

múltiplos promotores, o que significa que o gene apresenta vários sítios de

início de transcrição (o principal está numa região de 109 a 135 pb, no início do

exon 1) e os transcritos sofrem splicing alternativos de éxons não codificantes

(Tolner et al, 1998; Williams e Flintoff, 1998; Zhang et al, 1998).

Figura 4: Estrutura do gene de RFC-1 em humano. Adaptado de Tolner et al., 1998.

A região 5´ do gene RFC-1 não apresenta seqüências como TATA box

ou CAAT box. Uma região rica em GC nos éxons 1 alternativos parece

funcionar como promotor e incorpora elementos cis-atuantes envolvidos na

regulação da transcrição. O promotor 1 (éxon 1ª) tem três vezes mais atividade

basal do que o promotor 2 (éxon 1b). As regiões flanqueadoras 5´ dos éxons 1

e 2 são especialmente ricas em GC (Pro-43 = 996pb; Pro32 = 342pb,

respectivamente) (Tolner et al, 1998).

Recente estudo tem investigado o papel funcional da proteína RFC,

assim como caracterizado alterações no gene do carreador de folato reduzido,

e identificado mutações presentes em domínios essenciais. Seqüências

gênicas variantes que resultam em baixos níveis de expressão ou perda da

função de transporte podem exacerbar quadros clínicos associados com a

deficiência de folatos inclusive o câncer (Matherly et al., 2007).

Em 2000, Chango et al. identificaram o polimorfismo G80A no gene

RFC-1. Este, consiste da transição de uma guanina por uma adenina no

nucleotídeo 80 do éxon 2. A substituição promove, então, a troca do

aminoácido arginina (CGC) por uma histidina (CAC), na posição 27 da

proteína. O polimorfismo tem sido associado a concentrações alteradas de

produtos derivados da via metabólica do folato (Fillon-Emery et al., 2004).

Entretanto, a importancia fisiologica e farmacologica do polimorfismo G80A em

31

RFCh permanece obscura, pois achados clinicos e epidemiologicos têm se

mostrados controversos (Chango et al., 2000 e Shaw et al., 2002).

Em relação ao câncer, resultados têm demonstrado aparente associação

do genótipo AA com o aumento do risco de câncer gástrico e esofágico (Wang

et al., 2007) e com aumento do nível de folato plasmático em pacientes com

linfoma não Hodgkin (Skibola et al., 2004). Pacientes LLA pediátricos, tratados

com MTX, portadores do alelo 80A (homozigotos e heterozigotos),

apresentaram maior risco de efeito adverso ao tratamento quando comparados

com pacientes portadores do genótipo 80GG (Laverdiere et al., 2002).

Entretanto, quando o transporte via RFC foi caracterizado, em ensaios usando

a proteína com histidina ou arginina, na posição correspondente ao

polimorfismo, nenhuma alteração significativa do transporte foi observada

(Whetstine et al., 2001).

Por isso, acredita-se que polimorfismos representados por locos que

codificam a síntese de enzimas envolvidas no metabolismo de ácido fólico

podem conduzir a alterações metabólicas significativas. As interações gene-

gene, bem como suas inter-relações com a dieta, exposição ambiental e função

imune individual, podem ser os maiores determinantes na susceptibilidade para

as leucemias.

2.4 A enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

A metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) é a enzima critica no

metabolismo do ácido fólico (Schnakenberg et al., 2005). Ela pode ser

encontrada no citoplasma sob a forma de estruturas homodiméricas. A proteína

humana tem duas isoformas com peso molecular de 77KDa e 70KDa, sendo a

última forma, apenas observada no tecido do fígado de adultos e nos tecidos

dos rins e do fígado de fetos (Rozen, 1998).

A MTHFR converte, irreversivelmente, o 5,10 metilenotetrahidrofolato

(5,10-metilenoTHF) em 5-metiltetrahidrofolato (5-metilTHF) e dessa forma

fornece radical metil para: 1. Formação do principal doador de metil primário,

nas reações de metilação intracelular, S-adenosilmetionina (SAM); 2. Produção

de metionina a partir de homocisteína (Yi et al., 2002).

32

O gene MTHFR está localizado no cromossomo 1 (1p36.32) e apresenta

11 éxons (figura 5) com tamanhos variando de 103 a 432 pb (Goyette et al.,

1998). A região promotora possui vários sítios de ligação a fatores de

transcrição, mas não apresenta seqüência TATA-Box (Homberger et al., 2000).

A enzima tem dois domínios: o catalítico (N-terminal) que liga FAD-NADPH e

metilenotetrahidrofolato, e o domínio regulatório (C-terminal) (Matthews et al.,

1998).

Figura 5: Esquema estrutural do gene MTHFR e localização das mutações que provocam

diminuição da atividade da enzima. Adaptado de Gos e Szpecht-Potocka 2002.

Dois polimorfismos no gene MTHFR têm sido reportados por reduzirem

a atividade da enzima, um na posição 677 e outro na posição 1298 (Botto e

Yang 2000). Essa menor atividade da enzima MTHFR leva a um aumento dos

níveis plasmáticos de homocisteína e diminuição da formação de 5-metilTHF. E

a redução da disponibilidade de 5-metilTHF contribui para o pool de 5,10-

metilenoTHF, que é doador de radical metil para conversão de dUMP à dTMP

pela timidilato sintase. Por isso acredita-se que a menor atividade da MTHFR

poderia favorecer a síntese de DNA, pela redução da taxa de incorporação de

uracila, uma potencial causa de quebra da dupla fita, durante a excisão de

uracil pelo mecanismo de reparo (Frosst et al., 1995, Blount et al., 1997,

Gemmati et al., 2004, Kim et al., 2004).

O polimorfismo na posição 677 (éxon 4), constitui da transição de uma

citosina por uma timina, o que provoca a substituição de uma alanina por uma

valina no aminoácido 222 do domínio catalítico da enzima (Schwahn et al.,

2001, Castro et al., 2003). Essa substituição altera sítio de ligação para a

33

flavina adenina dinucleotídeo (FAD), um co-fator importante para MTHFR

(Guenther et al., 1999).E pode ser detectada funcionalmente por causa da

redução da estabilidade da enzima durante a incubação, in vitro, de extratos

celulares a 46°C por 5 minutos. Indivíduos que são homozigotos para a

mutação têm uma drástica redução da atividade da enzima, que é menos

estável in vitro, por isso sendo chamada termolabil (Chiusolo et al., 2004).

Indivíduos com o genótipo MTHFR 677TT produzem uma enzima com

30% de atividade enzimática em relação à encontrada nos indivíduos com

genótipo selvagem (677CC), enquanto os indivíduos heterozigotos (CT)

produzem uma enzima com aproximadamente 60% da atividade da dos

homozigotos selvagem (Frosst et al., 1995). Indivíduos com o genótipo TT,

especialmente se combinado com uma dieta deficiente em folato,

apresentaram níveis plasmáticos elevados de homocisteína, ilustrando a

importância fisiológica deste genótipo (Ulrich et al., 2000).

Na posição 1298 (éxon 7), o polimorfismo constitui da transversão de

uma adenina por uma citosina o que determina a substituição de um glutamato

por uma alanina no aminoácido 429, domínio regulatório da enzima

(Homberger et al., 2000). Essa substituição também gera uma enzima com

atividade diminuída. No entanto, em contraste com a variante 677T,

observações bioquímicas indicam que indivíduos homozigotos para o alelo

1298C não parecem ter níveis séricos mais elevados de homocisteína ou

qualquer alteração no status de folato quando comparado com o genótipo

selvagem, provavelmente devido as posições distintas dos dois polimorfismos

(Van Der Put et al., 1998).

Os efeitos da mutação 1298A→C sobre as concentrações plasmáticas

de homocisteína permanecem controversos. Castro et al. (2003) relataram que

esta mutação do gene MTHFR apresentou um efeito significativo sobre os

níveis de homocisteína total no plasma, mas outros não observaram influência

significante dos polimorfismos MTHFR C677T e A1298C com os níveis

plasmáticos de Hcy (Meisel et al., 2001; Biselli et al., 2009).

Estudos da distribuição geográfica e étnica da mutação C677T em 16

áreas do globo, incluindo a Europa, Ásia, Américas, Oriente Médio e Austrália

determinaram uma freqüência para o genótipo TT em torno de 20% na China,

de 20-26% na Itália e 32% no México. A freqüência do genótipo TT foi baixa

34

entre recém-nascidos de Afro descendentes, intermediária entre os recém-

nascidos de origem européia, e alta entre recém-nascidos de ascendência

latino-americanos. Entre os africanos e afro-descendentes a freqüência deste

genótipo é baixa (3%). Na Europa a prevalência do genótipo TT aumenta em

direção ao sul, 4-7% na Finlândia, 16% no Reino Unido, 8-10% na França, 11%

na Alemanha e 20-26% na Itália (Wilcken et al., 2003,Kamel et al., 2007).

O alelo 1298C apresenta faixas de freqüência entre 0,17-0,19 nas

populações asiáticas e entre 0,27-0,36 na Europa Ocidental (Robien and Ulrich

2003). Entre populações da América do Sul, o alelo 1298C apresentou uma

freqüência entre 0,23 – 0,26, e a freqüência alélica para 677T entre 0.30 - 0.31

(Da Costa Ramos et al., 2006).

2.5 A enzima Timidilato sintase (TS ou TYMS)

A Timidilato sintase exerce um importante papel no metabolismo de

nucleotídeos. Esta enzima é requerida para síntese de novo de pirimidinas,

juntamente com o co-fator metil (Candelaria et al., 2005). Ela catalisa a

metilação redutiva de 2’-deoxiuridina 5’-monofosfato (dUMP) em 2’-

deoxitimidina 5’-monofosfato (dTMP) utilizando, o co-fator 5,10-

metilenotetrahidrofolato (CH2H4folato) como doador de metil e hidrato, e

produzindo dihidrofolato (H2folato). É importante observar que há uma

competição entre as enzimas TS e MTHFR pelo 5,10-metilenotetrahidrofolato

como substrato para esta conversão (Jackson et al., 1983). Não obstante, essa

reação é a única fonte de timidilato no interior da célula (Kanaan et al., 2009,

Zhuang et al., 2009). A inibição dessa enzima resulta na diminuição da

quantidade de deoxitimidina trifosfato (dTTP), quebras cromossômicas e morte

celular (Marsh, 2005).

O gene TS (figura7) apresenta um produto de 313 aminoácidos e seu

peso aproximado é de 35,7KD, possui um cDNA com 1,6 Kb de comprimento e

está localizado no braço curto do cromossomo 18 (18p11.32). (Hishida et al.,

2003). O gene possui uma única seqüência repetida em tandem na região

promotora, mais especificamente, na região 5’ não traduzida (5’-UTR),

imediatamente anterior ao códon de iniciação ATG (Kaneda et al., 1987). Tal

35

seqüência tem se mostrado polimórfica consistindo de 28pb repetidos duas

(2R) ou três (3R) vezes (Horie et al., 1995). Existe ainda, uma repetição

invertida a montante da região promotora que parece estar relacionada à

estrutura secundaria do peptídeo (Marsh, 2005).

Figura 6: Esquema do gene TS. Adatado de Gibson et al., 2006.

A variante alélica 3R é mais comum em asiáticos (80%) do que em

caucasianos (60%). E alguns alelos raros contendo quatro (4R), cinco (5R) ou

nove (9R) repetições, também já foram descritos (Marsh et al., 1999, Luo et al.,

2002).

Outros dois polimorfismos também já foram descritos no gene: um

polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na segunda repetição do alelo 3R, G

C. Esse polimorfismo também parece afetar a expressão do gene, pois

provoca a abolição de um sítio de ligação ao fator de transcrição 1 (USF-1)

(Mandola et al., 2003). E uma deleção de 6pb localizada na região 3’ não

traduzida (3’-UTR), 447 pb a jusante do códon de parada. Essa deleção parece

estar relacionada com a diminuição da estabilidade do RNAm de TS e

conseqüente menor disponibilidade do mesmo (Lenz et al., 2002, Mandola et

al., 2004).

Seqüências repetidas na TS são supostamente responsáveis pela auto-

regulação da expressão gênica através da formação de estruturas secundárias

no domínio terminal 5' do seu RNAm, que podem inibir ou acentuar a sua

tradução (Chu e Allegra, 1996; Kawakami et al., 1999). A presença destas

repetições no sítio do promotor pode aumentar a conversão de dUMP a dTMP,

reduzindo a chance de incorporação inadequada de uracila ao DNA (Horie et

al., 1995; Hishida et al., 2003). Teoricamente, isto limitaria o dano ao DNA em

tecidos que se dividem rapidamente, como aqueles envolvidos na

hematopoiese e reduzindo a chance de problemas estruturais nos

36

cromossomos, diminuiria o risco do desenvolvimento leucemia (Skibola, et al.,

2002).

Estudos têm demonstrado que a presença dessas repetições (3R versus

2R) atua como um acentuador da expressão gênica, aumentando

concomitantemente a atividade da enzima (Kawakami et al., 1999, Pullarkat et

al., 2001, Krajinovic et al., 2002). Indivíduos homozigotos 3R/3R, portadores de

câncer colo-retal, apresentaram até 3,6 mais RNAm de TS do que aqueles que

eram homozigotos 2R/2R e 1,7 vezes mais do que os heterozigotos para as

repetições (2R/3R) (Pullarkat et al., 2001).

Danos à enzima TS têm sido associados com quebras cromossômicas e

indução de sítios frágeis (Ayusawa et al., 1986, Zhuang et al., 2009). Pode-se

dizer, portanto, que a enzima é essencial ao metabolismo celular. Por isso, a

TS é também alvo da maioria das drogas quimioterápicas anti-câncer, incluindo

fluoropirimidinas e vários análogos anti-folatos, como o 5-fluor-desoxiuridina (5-

FdUMP), um metabólito ativo do 5-Fluorouracil (5-FU) e MTX (Danenberg,

1977, Costea et al., 2006). O FdUMP tem maior afinidade pelo sítio de ligação

da TS do que o substrato natural dUMP, e ao se ligar à enzima, inibe sua

atividade, bloqueando a síntese de dTMP e conseqüentemente, o fornecimento

de timina (Pinedo e Peters, 1988; Diasio e Harris, 1989; Longley et al., 2003). A

eficácia terapêutica do tratamento de tumores com 5-FU está correlacionada

com o nível de expressão da TS (Takeishi et al., 1989; Hishida et al., 2003,

Zhuang et al., 2009).

Por estar associada à maior disponibilidade da enzima, a presença do

alelo 3R poderia atuar como fator protetor ao desenvolvimento do câncer.

2.6 A enzima Metionina sintase (MS ou MTR)

A enzima metionina sintase (5-metiltetrahidrofolato-homocisteína S-

metiltransferase) é responsável pela remetilação da homocisteína (Hcy) em

metionina utilizando como co-substrato a metilcobalamina (vitamina B12) e o 5-

metiltetrahidrofolato (5-MTHF) que serve como doador de grupamentos metil.

Essa reação produz simultaneamente tetrahidrofolato (THF) que é, então,

37

reduzido novamente pela serinahidroximetil transferase (SHMT) à 5,10

metilenotetrahidrofolato (Li et al., 1996, Nicot et al., 2006).

A atividade da metionina sintase depende da presença de uma segunda

proteína: a metionina sintase redutase (MTRR), que mantém a MS ligada

cobalamina em seu estado ativo totalmente reduzido. Quando a cobalamina

está oxidada, a metionina sintase redutase catalisa a metilação redutiva desta,

utilizando S-adenosilmetionina como um doador de metil, para regenerar

metilcobalamina (Olteanu e Banerjee, 2001).

A metionina sintase é conservada entre diferentes espécies. A forma

humana da enzima apresenta 55% de homologia com a enzima de E. coli e

66% com a proteína de Caenorhabditis elegans (Li et al., 1996). O gene MTR

apresenta um cDNA com 3,8 Kb de comprimento e 33 éxons. Localiza-se na

região telomérica do cromossomo 1 (1p42.3-q43) e codifica uma proteína com

1265 aminoácidos e peso molecular de 140 kDA (Leclerc et al., 1996; Chen, et

al., 1997; Ma et al., 1999; Watkins et al., 2002). A enzima tem três domínios: o

domínio N-terminal, que se liga a substrato na reação, o domínio central,

altamente conservado e onde ocorre a ligação à cobalamina e o domínio C-

terminal que constitui o domínio regulatório da enzima e interage com SAM.

(Chen et al., 1997; Matthews et al., 1998).

A perfeita atividade da enzima é importante para manter os níveis

adequados de metionina e prevenir o acúmulo de homocisteína. Aumento dos

níveis sanguíneos de homocisteína tem sido associado à maior probabilidade

de desenvolver doenças cardiovasculares, defeitos congênitos e síndrome de

Down, além de afetar o desenvolvimento de diversos tipos de câncer (Carmel e

Jacobsen 2001; Watkins et al., 2002). A metionina sintase é também crítica

para o ciclo de metilação, por manter satisfatório, os níveis de S-

adenosilmetionina (SAM) e derivados de metionina. Tais moléculas atuam

como doadora de grupo metil em uma grande variedade de processos

celulares, incluindo a metilação do DNA e RNA e síntese de

neurotransmissores (Watkins et al., 2002).

O polimorfismo mais comum no gene MS é a substituição A2756G, que

acarreta na troca de um ácido aspártico por uma glicina. O ácido aspártico é

um aminoácido fortemente polar e neste caso estaria localizado na α-hélice,

entre os domínios: central (domínio de ligação a cobalamina) e C-terminal

38

(domínio regulatório). Essa região é também responsável por se ligar a

proteínas que reduzem o co-fator. A troca por um aminoácido não polar

(glicina, chamada de quebradora da hélice) leva a perturbações na estrutura

tridimensional e na função da proteína (Leclerc et al., 1996, Chen et al., 1997,

Van der Put et al., 1997).

A freqüência do genótipo GG está em torno de 8% na Holanda, 2% na

Irlanda do Norte e 4% nos Estados Unidos e Canadá. O alelo mutante G varia

entre 15-24% na Europa e 15-18% nos Estados Unidos e Canadá (Watkins et

al., 2002).

Estudos têm relatado um papel controverso dessa transição no

metabolismo celular. Matsuo el al (2001) observou que a mutação A2756G

pode atuar como fator de risco no desenvolvimento de linfomas malignos

enquanto que Skibola et al (2002) sugere que a mutação em questão tem um

efeito protetor ao desenvolvimento de LLA quando os resultados são

analisados simultaneamente com mutações no gene para serina

hidroximetiltransferase (SHMT).

O que se sabe é que, a deficiência severa de vitamina B12 ou de MS

causa hipometioninemia, hiperhomocisteinemia e homocistinúria (Watkins e

Rosenblatt, 1989). Isto pode resultar em acúmulo de 5-metiltetrahidrofolato e

diminuição de derivados intracelulares de folato incluindo, 5,10-

metilenotetrahidrofolato requerido para a biossíntese de timidilato, ocasionando

acúmulo de desoxiuridilato no DNA.

39

33.. OObbjjeettiivvooss

3.1 Geral:

Determinar os polimorfismos MTHFR C677T e A1298C, RFC G80A e

MS A2756G e as repetições em tandem 2R/3R no promotor do gene TS e sua

relação com a etiopatogênese das leucemias agudas (LLA e LMA) da infância,

em pacientes, atendidos no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital

Universitário Oswaldo Cruz - UPE (CEONHPE/HUOC/UPE) e no Instituto

Nacional de Câncer (INCa).

3.2 Específicos:

Determinar as freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos

MTHFR C677T e A1298C, RFC G80A e MS A2756G de pacientes com

LLA, LMA e controles.

Detectar as repetições em tandem 2R e 3R no promotor do gene TS e

determinar as freqüências alélicas e genotípicas de pacientes com LLA,

LMA e controles;

Verificar se existe associação destes polimorfismos com o risco de

desenvolvimento de leucemia aguda;

Estimar o risco conferido por estes polimorfismos caso a relação seja

confirmada.

40

44.. MMaatteerriiaaiiss ee MMééttooddooss

4.1 Tipo de estudo

Estudo exploratório de freqüências alélicas e genotípicas com caso-

controle.

4.2 Local do estudo

O estudo foi realizado no Centro de Oncohematologia Pediátrica do

Hospital Universitário Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC, da Universidade de

Pernambuco – UPE e no Instituto Nacional do Câncer (INCa).

4.3 População do estudo

Foram incluídos pacientes com diagnóstico de leucemias agudas

atendidos no Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital Universitário

Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC - Recife/PE e no Instituto Nacional de

Câncer (INCa), durante o período de janeiro de 2003 a dezembro de 2009. O

grupo controle foi formado a partir de amostras de DNA obtidas de crianças da

mesma faixa etária oriundas de um laboratório de identificação humana da

cidade do Recife e de crianças sem histórico familiar de câncer, residentes no

estado do Rio de Janeiro.

A população amostral estudada diferiu para cada polimorfismo analisado

como segue na tabela abaixo:

Polimorfismo Casos Controles

CEONHPE INCa Total CEONHPE INCa Total

RFC G80A 118 187 306 93 44 137

MTHFR C677T 182 24 206 111 113 224

MTHFR

A1298C

172 24 196 135 113 248

41

MS A2756G 157 - 157 141 - 141

TS (2R/3R) 176 180 356 208 184 392

4.4 Critérios de Inclusão

Os indivíduos selecionados para a pesquisa estão ou estiveram em

acompanhamento no Centro de Oncohematologia Pediátrico do Hospital

Universitário Oswaldo Cruz e no Instituto Nacional de Câncer (INCa).

Foi considerado caso para inclusão, pacientes com idade igual ou

inferior a dezoito anos ao diagnóstico; diagnosticados para LLA ou LMA,

estabelecido e confirmado através de mielograma, citologia, imunofenotipagem

e características clínicas observadas no atendimento ambulatorial, revisados

pelo hematologista responsável, podendo estar fora de terapia, em tratamento

ou em vias de iniciá-lo.

4.5 Critérios de exclusão

Foram excluídos os pacientes com material biológico inadequado ou

insuficiente ou aqueles que não concordaram em participar do estudo.

4.6 Considerações éticas

Todos os pacientes e/ou responsáveis receberam informações

elucidativas sobre a natureza e objetivos deste estudo, e foram incluídos nele

após consentimento assinado, livre e esclarecido (anexo). Ressalta-se a

adoção de medidas que assegurarão a confidencialidade e a privacidade dos

pacientes, bem como o sigilo e a segurança dos dados obtidos.

Este projeto foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa em Seres

Humanos do Hospital Universitário Oswaldo Cruz n° 94 em reunião de 25 de

setembro de 2007.

42

4.7 Metodologias para Identificação dos Polimorfismos

4.7.1 Extração de material biológico

O Material Biológico – DNA de pacientes e controles foi extraído pelo

método Salting Out (Miller et al, 1988) e armazenado a -20 oC no Laboratório

de Biologia Molecular do CEONHPE.

Extração do Material Biológico – Na primeira etapa do processo de

extração, 1mL de solução de lise de membrana plasmática foi adicionada a

300L de sangue total. O material foi homogenizado por inversão do tubo e

incubado a temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, centrifugou-

se a 13.000 rpm por 4 minutos e em seguida descartou-se o sobrenadante. O

procedimento foi repetido por 2 ou mais vezes, até que o pellet estivesse

translúcido. Na segunda etapa, foi adicionado ao tubo 200L de solução de lise

de núcleo e 50l de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%, com agitação

vigorosa, incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente; após esse

tempo, adicionou-se mais 150L de solução de lise de núcleo. A digestão

protéica foi realizada adicionando-se ao tubo 10L de proteinase K (20mg/mL)

com posterior transferência para banho-maria a 65°C por 2 horas ou a 37°C por

24 horas. Na etapa de precipitação, a amostra foi tratada com 175l de NaCl

5,3M, centrifugada a 13.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido

para outro tubo onde foi adicionado 1.000L de etanol 100%. Foi realizada

homogenização do tubo por inversão e nova centrifugação a 13.000 rpm por 10

minutos. O sobrenadante então, foi descartado e ao pellet de DNA, adicionado

1.000l de etanol 70%, com posterior centrifugação a 13.000 rpm por 5

minutos. Finalmente, descartou-se o sobrenadante e foi adicionado ao pelet

150L de solução de reidratação a base de tris 10mM e 1 mM de EDTA; pH

8,0.

4.7.2 Determinação do polimorfismo RFC G80A

A PCR do DNA genômico foi realizada no volume total de 24L,

contendo 14µL de H2O milliQ autoclavada, 2,5µL de PCR Buffer (10X) [50 mM

kCl, 10 mM Tris-HCl ( pH 8.3)], 1µL de MgCl2 a 50mmol, 2µL de DNTP a

200µmol, 1,5µL de primer forward (5’-AGT GTC ACC TTC GTC CCC TC-3’) e

43

reverse (5’-CTC CCG CGT GAA GTT CTT-3’), 1,3µL de DMSO

(dimetilsufóxido) e 0,2µL da enzima DNA Taq Polimerase (Invitrogen) a 5U/µL,

por amostra. As condições dos ciclos térmicos são: 2 minutos a 94º, seguido

por 37 ciclos de 94º por 30 segundos (para desnaturação da dupla fita de

DNA), 60º por 30 segundos (para o pareamento dos primers), 72º por 45

segundos (para extensão da cadeia nascente de DNA) e uma extensão final de

7 minutos a 72º (Chango, et al., 2000).

Posteriormente, os produtos amplificados foram digeridos pela

endonuclease de restrição HhaI em uma reação contendo todo o produto

amplificado, 2,5 µL do Buffer HhaI e 0,3 µL de HhaI, a 30ºC por 48 horas. O

produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose 3% em

solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol, corados por

brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial de 100 v/cm

por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta (Ultralum).

Os fragmentos resultantes da digestão foram de 125, 62 e 37pb para o

alelo G e de 162 e 62pb para o alelo A. Heterozigotos produzem bandas para

cada alelo.

4.7.3 Determinação do polimorfismo MTHFR A1298C

O polimorfismo A1298C do gene MTHFR foi investigado pela técnica de

PCR alelo-específica. Os componentes e volumes para a amplificação

constaram de 14,2l de água, 3,75l de tampão, 0,75l MgCl2 (50mM), 2,0l

dNTPs (200mol), 2,0l (5pmol) de primers sense e antisense para cada alelo

e 0,3l de taq polimerase, totalizando um volume final de 23,0l em cada

microtubo, acrescentando em média 2l de DNA genômico.

Os primers utilizados foram: (Alelo A) sense 5'- GGA GCT GAC CAG

TGA AGA -3' e anti-sense 5'-TGT GAC CAT TCC GGT TTG -3'; (Alelo C) sense

5'- CTT TGG GGA GCT GAA GGA -3' e anti-sense 5'-AAG ACT TCA AAG ACA

CTT G -3'. A amplificação foi realizada com desnaturação inicial de 2 minutos a

94ºC, seguida de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC e 50

segundos a 72ºC. O produto da amplificação foi separado por eletroforese em

gel de agarose a 4% em uma solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com

EDTA a 1mmol, corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à

44

diferença de potencial de 100 v por trinta minutos e visualizados em

transiluminador de ultravioleta (Ultralum) (Ranjith et al., 2003).

O alelo A apresenta fragmento de 77 pb e o alelo C amplifica um

fragmento de 120 pb.

4.7.4 Determinação do polimorfismo MTHFR C677T

Os componentes e volumes para a amplificação do gene MTHFR,

constarão de 13,5l de água, 2,5l de tampão, 1,0l MgCl2 (50mM), 2,0l

dNTPs (200mol), 1,5l (5pmol) de primers (direto e reverso) e 0,2l de taq

polimerase, totalizando um volume final de 24,2l em cada microtubo, sem

contar com o DNA genômico.

Os primers utilizados para genotipagem do polimorfismo C677T da

MTHFR serão: (forward) 5’-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3’ e

(reverse) 5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’ O programa de

amplificação consiste em um ciclo de 95ºC por 6 minutos e 40 ciclos de 95ºC

por 1 minuto, 62,5ºC por 1 minuto e 30 segundos, 72ºC por 1 minuto e um ciclo

de 72ºC por 7 minutos. O produto amplificado será digerido pela enzima de

restrição Hinf I (0,3 L da enzima e 1,5 L de seu respectivo tampão na

concentração de 10X), após permanecer em banho-maria a 37ºC por 48 horas

(Frosst et al., 1995).

O produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose

3% em solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol,

corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial

de 100 v por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta

(Ultralum).

O polimorfismo C677T do gene MTHFR apresentou fragmentos, após

digestão enzimática, de 198 pb para o genótipo CC (homozigoto selvagem);

175 pb e 23 pb para o genótipo TT; 198 pb,175 pb e 23 pb para o genótipo CT.

4.7.5 Determinação do polimorfismo para TS

A genotipogem foi feita por PCR. Foram usados 16,8l de água, 2,5l de

tampão, 0,75l de MgCl2 (1,5mM), 0,5l de dNTPs (10mM), 1,25l de DMSO,

1,0l de primers (10pmol) e 0,2l de Taq polimerase, com o microtubo

45

comportando 24l, sem a amostra de DNA. A quantificação de DNA genômico

para a reação foi de 200ng/µl, podendo o volume ter variado para se adequar

ao valor ideal. O par de primers utilizado foi (forward) 5’-CGT GGC TCC TGC

GTT TCC-3’ e (reverse) 5’-GAG CCG GCC ACA GGC AT-3’ em ciclo de 94ºC

por 5 minutos e 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 66ºC por 1 minuto, 72ºC por 2

minutos e um ciclo de 72ºC por 7 minutos. Não foi utilizada enzima de restrição

para identificação das repetições em tandem (Hishida et al., 2003).

Os produtos da amplificação foram separados, eletroforeticamente, em gel

de agarose 3%, usando solução tampão de Tris-Borato a 40 mmol com EDTA a

1mmol, corados por brometo de etídio a 0.5g/ml e visualizados em

transiluminador de ultravioleta (Ultralum).

4.7.6 Determinação do polimorfismo MS A2756G

Para a genotipagem do polimorfismo MS A2756G, foram utilizados os

primers (direto) 5’-TGT TCC CAG CTG TTA GAT GAA AAT C-3’ e (reverse) 5’-

GAT CCAAAG CCT TTT ACA CTC CTC-3’. O programa de amplificação

consiste de um ciclo de 94ºC por 5 minutos, 40 ciclos de 95ºC por 1 minuto,

62ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto e um ciclo de 72ºC por 7 minutos. Os

produtos amplificados foram digeridos pela enzima de restrição HaeIII (0,3 L

da enzima e 1,0 L de seu respectivo tampão na concentração de 10X), depois

de 48 horas em banho-maria a 37ºC (Matsuo et al., 2001).

O produto da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose

3% em solução tampão de Tris-acetato a 40 mmol com EDTA a 1mmol,

corados por brometo de etídio a 0.5g/ml, submetidos à diferença de potencial

de 100 v por 50 minutos e visualizados em transiluminador de ultravioleta

(Ultralum). Os fragmentos resultantes da digestão são de 211 pb para o alelo A

e de 131 e 80 pb para o alelo G. Heterozigotos produzem bandas para cada

alelo.

4.7.7 Processamento e análise dos dados

A análise dos dados foi realizada utilizando o programa BioEstat 5.0. O

estudo foi do tipo caso controle com amostras independentes constando de

dados nominais (genótipo). A influência de cada polimorfismo sobre o risco de

46

leucemias agudas foi estimada pelo teste de Odds Ratio (OR) utilizando

intervalo de confiança de 95% para os parâmetros. O teste de Odds Ratio é um

teste para duas amostras dicotomizadas, mensuradas a nível nominal, o qual

calcula a vantagem (ou desvantagem) de um evento – sucesso – em relação

ao outro. Com esse teste é possível, também, obter a probabilidade de

ocorrência e o intervalo de confiança de 95%. Quando o índice é igual à

unidade não há vantagem para quaisquer dos eventos. Acima de um, é

constatado risco e inferior a um, diz-se que determinado critério “protege” o

desenvolvimento do evento analisado. Para obter o valor da proteção, basta

inverter os valos de “sucesso” e “insucesso”.

A hipótese nula será aceita caso a distribuição genotípica não apresente

diferença significativa ao nível de p = 0,05 nos grupos teste e controle. As

freqüências dos alelos foram estimadas pelo método de contagem gênica.

Através do princípio de Hardy-Weinberg, a estimação das freqüências

genotípicas esperadas pôde ser calculada, determinando-se se há aderência

entre os valores observados e aqueles esperados, com base na determinação

da freqüência gênica. A prevalência dos diferentes genótipos nos pacientes e

controles foi analisada pelo teste do 2 em tabelas de contingência. Este teste

estatístico objetiva verificar se há diferença na distribuição dos genótipos entre

diferentes populações (pacientes e controles). Neste teste é necessário que o

valor de “p” seja inferior ao nível de significância (5%). Isso implica dizer que a

decisão tomada aceita um erro tipo I (rejeitar H0 quando é verdadeira) de no

máximo 5%. Ou seja, o valor de “p” precisa estar abaixo de 0,o5 para que se

possa afirmar, com 95% de certeza, que a distribuição diferencial dos

genótipos entre pacientes e controles é estatisticamente significante.

Todos os cálculos estatísticos foram realizados, nas amostras

provenientes dos ambos os centros de pesquisas, em separado e

conjuntamente.

47

55.. RReessuullttaaddooss

A população amostral analisada foi diferente para cada um dos

polimorfismos estudados. As distribuições alélica de pacientes e controles

mostraram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg .

5.1 Análise dos dados do gene RFC-1

Para o gene RFC-1, foram analisados 306 casos e 137 controles

oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, a saber: 118 e 188

pacientes e 93 e 44 controles atendidos no CEONHPE e no INCa

respectivamente. Dos pacientes, 54% (164, sendo 55 do CEONHPE/HUOC -

Recife/PE e 109 do INCa) eram do sexo masculino e 46% (142, sedo 63 do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 79 do INCa) do sexo feminino (2=1,582;

GL=1; p=0,2085). Dos controles 51% (70, sendo 52 CEONHPE/HUOC -

Recife/PE e 18 do INCa) são do sexo feminino e 49% (67, sendo 41

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 26 do INCa) do sexo masculino (2=0,066;

GL=1; p=0,7977) (Tabela 2). A análise dos grupos de pacientes e controles

quanto ao sexo apresentou 2=0,834; GL=1; p=0,3611. Nesse caso os valores

do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível de 5%, tornando

possível afirmar que não há diferença estatisticamente significante, quanto à

distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e controles e dentro dos

grupos.

Quanto ao tipo de leucemia dos pacientes analisados para o gene RFC-1,

85% (262, 95 do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 167do INCa) foram

classificados como portadores de leucemia linfóide aguda; 14% (42, 21 do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 21 do INCa) possuía leucemia mielóide aguda

e em 1% dos caso não foi possível estabelecer o diagnóstico específico

(Tabela 2).

48

Tabela 2. Características demográficas dos pacientes e controles analisados para

o gene RFC-1.

Características Casos Controles

CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL

Sexo

Masculino 55 109 164 41 26 67

Feminino 63 79 142 52 18 70

Tipo de leucemia

LLA 95 167 262 - - -

LMA 21 21 42 - - -

Não identificado 2 - 2 - - -

Conjuntamente, as amostras de pacientes e controles do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, apresentaram a distribuição genotípica

condizente com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Contudo, a análise separada

dessas amostras revelou que a população de controles procedente do Instituto

Nacional do Câncer não se adequava ao equilíbrio de Hardy-Weinberg

(2=8.9101; GL=2).

As freqüências obtidas para o alelo mutante (80A) em pacientes,

analisados para o polimorfismo no gene RFC-1, e controles foram 0,52 e 0,44

respectivamente. Porém esse dado não reflete a realidade das duas

populações de forma independente. O alelo mutante foi observado em 43% dos

controles oriundos do CEONHPE e 45% dos controles do INCa e em 58% dos

pacientes atendidos no CEONHPE e 49% dos pacientes do INCa.

Essas discrepâncias são refletidas, diretamente, no teste de qui-quadrado

(de aderência ou heterogeneidade). O teste de X2 (de aderência) das

populações analisadas conjuntamente, para o gene RFC-1, não indicou

diferença estatisticamente significante entre as distribuições dos perfis

genéticos de pacientes e controles (2=0.0852; GL=2; p=4.926). Não sendo,

dessa forma, possível estimar o risco que a presença de determinado alelo

pode conferir para o desenvolvimento da doença.

Todavia, a análise separada das populações revelou que para o grupo

(pacientes e controles) oriundo do CEONHPE existe aderência quanto à

49

distribuição dos genótipos. Ou seja, entre os grupos de pacientes e controles,

há distribuição diferencial do perfil genético (2=8.675; GL=2; p=0.0131).

Esse resultado fornece a base necessária para a estimativa do risco

calculado pelo teste de Odds Ratio (OR) (Tabela 3).

Tabela 3. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e

controles analisados para o gene RFC-1.

Genótipos Variantes

RFC1 G80A

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 118 (100%) 93 (100%)

GG 26 (22,03%) 31 (33,33%) 1 Referência

GA 48 (40,68%) 44 (47,31%) 0,7688 0,3963 – 1,4914 0,5420

AA 44 (37,29%) 18 (19,35%) 0,3431 0,1610 – 0,7312 0,0088*

GA+AA 92 (77,97%) 62 (66,67%) 0,5652 0,3063 – 1,0431 0,0931

INCa 188 (100%) 44 (100%)

GG 54 (28,72%) 18 (40,91%) 1 Referência

GA 84 (44,68%) 12 (27,27%) 0,4286 0,1913 – 0,9600 0,0588

AA 50 (26,6%) 14 (31,82%) 0,8400 0,3784 – 1,8645 0,8209

GA+AA 134 (71,28%) 26 (59,1%) 0,5821 0,2952 – 1,1478 0,1640

CEONHPE + INCa 306 (100%) 137 (100%)

GG 80 (26,14%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 132 (43,14%) 56 (40,87%) 0,6926 0,4314 – 1,1120 0,1609

AA 94 (30,72%) 32 (23,36%) 0,5558 0,3252 – 0,9500 0,0430*

GA+AA 226 (73,86%) 88 (64,23%) 0,6357 0,4125 – 0,9797 0,0515

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

O teste de Odds Ratio na população proveniente do CEONHPE revelou

um efeito protetor do genótipo 80AA em relação ao genótipo 80GG da ordem

de 2,9 (OR= 0,34, IC 95%= 0,16 – 0,73; P= 0,0088). A partir desse dado, pode-

se afirmar que indivíduos portadores do genótipo GG têm 2,9 mais chance de

desenvolver a doença do que aqueles que possuem o genótipo AA. Esse efeito

também foi constatado quando analisamos as duas populações (CEONHPE e

INCa), embora da ordem de 1,8 (OR= 0,56; IC 95%= 0,33 – 0,95; p= 0,043).

Contudo, devido à ausência de heterogeneidade na amostra conjunta, não é

50

possível afirmar que o efeito protetor verificado seja estatisticamente

significante.

Quando separados os tipos de leucemia nas populações analisadas para

o gene RFC-1, verificamos que, separadamente, as amostras de pacientes

portadores de LLA se adequavam ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. Porém, o

mesmo não foi observado quando analisamos as duas populações

conjuntamente (2=6,0822; GL=2).

O teste de X2 (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente

do CEONHPE havia distribuição diferencial do perfil genético entre os grupos

de pacientes e controles (2=7,525; GL=2; p=0,0232). O teste de Odds Ratio

(tabela 4) indicou que, na população analisada, a presença do alelo 80A no

gene RFC-1 exerce um efeito protetor da ordem de 2 (OR=1,9621; IC

95%=1,0796 – 3,5660; p=0,0372), quando comparado com o genótipo GG e

que indivíduos portadores do genótipo 80AA possuem 2,6 menos chance de

desenvolver a doença do que os portadores do genótipo 80GG (OR= 2,6250;

IC 95%=1,3053 – 5,2789; p= 0,0104).

Tabela 4. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e

pacientes portadores de LLA analisados para o gene RFC-1.

Genótipos Variantes

RFC1 G80A

Casos LLA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 95 (100%) 137 (100%)

GG 21 (22,11%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 38 (40%) 56 (40,87%) 0,6316 0,3276 - 1,2177 0,2257

AA 36 (37,89%) 32 (23,36%) 0,3810 0,1894 - 0,7661 0,0104*

GA+AA 74 (77,89%) 88 (64,23%) 0,5097 0,2804 - 0,9262 0,0372*

INCa 167 (100%) 137 (100%)

GG 52 (31,14%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 73 (43,71%) 56 (40,87%) 0,8141 0,4826 - 1,3734 0,5236

AA 42 (25,15%) 32 (23,36%) 0,8086 0,4423 - 1,4779 0,5909

GA+AA 115 (68,86%) 88 (64,23%) 0,8121 0,5031 - 1,3109 0,4653

CEONHPE + INCa 262 (100%) 137 (100%)

GG 73 (27,86%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 111 (42,37%) 56 (40,87%) 0,7516 0,4632 - 1,2195 0,3012

51

AA 78 (29,77%) 32 (23,36%) 0,6112 0,3533 - 1,0573 0,1034

GA+AA 189 (72,14%) 88 (64,23%) 0,6937 0,4460 - 1,0788 0,1304

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

Para os portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado

tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. O X2 (de

aderência) indicou que, diferentemente da população de portadores de LLA,

havia diferença na distribuição de genótipos nas amostras: oriunda do INCa e

na amostra resultante na junção dos dois centros. Ou seja, apenas na

população proveniente do CEONHPE o perfil genético não era diferente, entre

pacientes e controles.

O teste de Odds Ratio confirmou a tendência que foi encontrada quando

analisamos ambos os tipos de leucemia conjuntamente. Isto é, a presença do

alelo 80A confere forte proteção ao indivíduo que o possui (Tabela 5). A análise

da amostra de pacientes de LMA, proveniente do INCa, mostrou que indivíduos

portadores do genótipo 80GG possuem 6 vezes mais chance de desenvolver a

doença do que aqueles cujo genótipo é 80AA (OR=6,125; IC 95%=1,2215 –

30,7122; p=0,036). Quando comparados com portadores do alelo 80A, (80GA +

80AA), indivíduos 80GG apresentam aproximadamente 5 vezes mais chance

de desenvolver leucemia mielóide aguda (OR=5,2898; IC 95%=1,1823 –

23,6680; p=0,032).

A análise da amostra de pacientes de LMA, proveniente de ambos os

centros, revelou ainda que também os indivíduos heterozigotos (80GA)

possuem o efeito protetor conferido pela presença do alelo 80A. Os resultados

indicaram que indivíduos 80GG apresentam 3,1, 3,8 e 3,3 mais chance de

desenvolver a doença do que aqueles com genótipo 80GA (OR=3,0625; IC

95%=1,1437 – 8,2007; p=0,0376), 80AA (OR=3,8281; IC 95%=1,3445 –

10,8995; p=0,0178) e portadores do alelo 80A (GA + AA) (OR=3,3409; IC

95%=1,3152 - 8,4864; p=0,0143), respectivamente.

52

Tabela 5. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e

pacientes portadores de LMA analisados para o gene RFC-1.

Genótipos Variantes

RFC1 G80A

Casos LMA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 21 (100%) 137 (100%)

GG 4 (19,05%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 10 (47,62%) 56 (40,87%) 0,4571 0,1348 - 1,5504 0,3205

AA 7 (33,33%) 32 (23,36%) 0,3732 0,1010 - 1,3786 0,2323

GA+AA 17 (80,95%) 88 (64,23%) 0,4226 0,1346 - 1,3264 0,2066

INCa 21 (100%) 137 (100%)

GG 2 (9,52%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 11(52,38%) 56 (40,87%) 0,2078 0,0439 - 0,9836 0,0642

AA 8 (38,1%) 32 (23,36%) 0,1633 0,0326 - 0,8187 0,0360*

GA+AA 19 (90,48%) 88 (64,23%) 0,1890 0,0423 - 0,8458 0,0320*

CEONHPE + INCa 42 (100%) 137 (100%)

GG 6 (14,29%) 49 (35,77%) 1 Referência

GA 21 (50%) 56 (40,87%) 0,3265 0,1219 -0,8744 0,0376*

AA 15 (35,71%) 32 (23,36%) 0,2612 0,0917 - 0,7438 0,0178*

GA+AA 36 (85,71%) 88 (64,23%) 0,2993 0,1178 - 0,7603 0,0143*

OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança * – valor significante

5.2 Análise dos dados do gene MTHFR

Para o gene MTHFR, a população amostral estudada também foi

diferente para cada um dos polimorfismos analisados. Em relação ao

polimorfismo MTHFR C677T foram analisados 206 casos e 224 controles

oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, destes: 182 e 24 pacientes

e 111 e 113 controles atendidos no CEONHPE e no INCa respectivamente.

Quanto ao sexo apenas o grupo de pacientes e controles procedentes do

CEONHPE dispunham dessa informação. Nos pacientes observamos 51% (93)

do sexo feminino e 49% (89) do sexo masculino e entre os controles 55% (61)

do sexo feminino e 45% (50) do sexo masculino (Tabela 6). A análise dos

grupos de pacientes e controles quanto ao sexo mostrou 2=0,411; GL=1;

p=0,5214. Como os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao

53

nível de 5%, pode-se afirmar que não há diferença estatisticamente

significante, quanto à distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e

controles no grupo analisado.

Quanto ao critério tipo de leucemia, nos pacientes analisados para o

polimorfismo C677T do gene MTHFR, 79% (162, 144 do CEONHPE/HUOC -

Recife/PE e 18 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (39, 33 do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 6 do INCa) foram classificados como

portadores de leucemia mielóide aguda e em 2% (5) dos casos não foi possível

estabelecer o diagnóstico específico (Tabela 6).

Tabela 6. Características demográficas dos pacientes e controles analisados para

polimorfismo MTHFR C677T.

Características Casos Controles

CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL

Sexo

Masculino 89 - - 50 - -

Feminino 93 - - 61 - -

Tipo de leucemia

LLA 144 18 162 - - -

LMA 33 6 39 - - -

Não identificado 5 - 5 - - -

A distribuição genotípica dos pacientes e controles analisados para o

polimorfismo MTHFR C677T está resumida na tabela 8. Na amostra conjunta

(CEONHPE e INCa) foi observado, entre os casos, 111 (53,88%) com

genótipo CC, 82 (39,81%) com genótipo CT e 13 (6,31%) com genótipo TT.

Entre os controles os números foram: 95 (42,41%) 677CC, 108 (48,21%)

677CT e 21 (9,38%) 677TT. A distribuição dos genótipos, nos grupos de

pacientes e controles, provenientes de ambos os centros de pesquisa,

apresentaram-se de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. As

freqüências obtidas para o alelo mutante (677T) em pacientes e controles

foram 0,26 e 0,33 respectivamente.

54

Tabela 7. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e

controles analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.

Genótipos Variantes

MTHFR C677T

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 118 (100%) 93 (100%)

CC 104 (57,14%) 42 (37,84%) 1 Referência

CT 67 (36,81%) 59 (53,15%) 2,1805 1,3214 – 3,5981 0,0032*

TT 11 (6,05%) 10 (9,01%) 2,2511 0,8897 – 5,6959 0,1356

CT+TT 78 (42,86%) 69 (62,16%) 2,1905 1,3513 – 3,5508 0,0020*

INCa 188 (100%) 44 (100%)

CC 7 (29,17%) 53 (46,9%) 1 Referência

CT 15 (62,5%) 49 (43,36%) 0,4314 0,1623 – 1,1469 0,1390

TT 2 (8,33%) 11 (9,74%) 0,7264 0,1327 – 3,9779 0,9238

CT+TT 17 (70,83%) 60 (53,1%) 0,4661 0,1794 – 1,2109 0,1726

CEONHPE + INCa 306 (100%) 137 (100%)

CC 111 (53,88%) 95 (42,41%) 1 Referência

CT 82 (39,81%) 108 (48,21%) 1,5389 1,0348 – 2,2885 0,0421*

TT 13 (6,31%) 21 (9,38%) 1,8874 0,8970 – 3,9717 0,1320

CT+TT 95 (46,12%) 129 (57,59%) 1,5866 1,0838 – 2,3227 0,0225*

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

O qui-quadrado de heterogeneidade revelou que apenas na população

oriunda do CEONHPE, a distribuição dos genótipos ocorreu de forma diferente

entre pacientes e controles (2=10,823; GL=2; p=0,0058), Nessa amostra, o

teste de Odds Ratio (Tabela 7) indicou aumento do risco de desenvolvimento

da doença entre indivíduos portadores do genótipo 677CT e entre aqueles

portadores do alelo 677T, da ordem de 2,2 (p= 0,0032 e p=0,002,

respectivamente), quando comparados com indivíduos 677CC. Esse risco

também foi verificado quando procedemos a Análise conjunta dos dados (OR=

1,5389; p= 0,0421 e OR= 1,5866; p= 0,0225, para indivíduos 677CT e

portadores do alelo 677T, respectivamente), porém, da mesma forma como

quando analisamos o polimorfismo RFC-1, esse resultado conjunto não

encontra apoio estatístico devido a falta de aderência entre a distribuição

diferencial de genótipos no grupo de pacientes e controles.

55

A análise, separada, dos tipos de leucemia mostrou que as amostras de

pacientes portadores de LLA, oriundas de ambos os centros, se adequavam ao

equilíbrio de Hardy-Weinberg (conjunta e separadamente). O teste de qui-

quadrado (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente do INCa,

não havia distribuição diferencial do perfil genético entre os grupos de

pacientes e controles (2= 0,501; GL=2; p= 0,7786). Pelo teste de Odds Ratio

(Tabela 8) foi possível observar que, o risco estimado, nas amostras

analisadas, foi estatisticamente significante apenas quando comparamos o

genótipo selvagem (677CC) com o heterozigoto (677CT) e com a presença do

alelo mutante (677CT + 677TT). Na amostra oriunda do CEONHPE esse risco

foi da ordem de 1,8 para indivíduos heterozigotos (OR=1,7589; IC=1,1306 -

2,7364; p= 0,0163) e portadores do alelo mutante (OR=1,7589; IC=1,1306 –

2,7364; p= 0,0163). Na analise da junção das amostras o risco foi da ordem de

1,6 para indivíduos heterozigotos (OR=1,606; IC=1,0506 – 2,4552; p=0,037) e

1,7 para portadores do alelo mutante (OR=1,6555; IC=1,1015 – 2,4882;

p=0,0199).

Tabela 8. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e

pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR C677T.

Genótipos Variantes

MTHFR C677T

Casos LLA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 144 (100%) 224 (100%)

CC 82 (56,94%) 95 (42,41%) 1 Referência

CT 53 (36,81%) 108 (48,21%) 1,7589 1,1306 - 2,7364 0,0163*

TT 9 (6,25%) 21 (9,38%) 2,0140 0,8739 - 4,6415 0,1423

CT+TT 62 (43,06%) 129 (57,59%) 1,7959 1,1763 - 2,7419 0,0089*

INCa 18 (100%) 224 (100%)

CC 7 (38,88%) 95 (42,41%) 1 Referência

CT 10 (55,56%) 108 (48,21%) 0,7958 0,2914 - 2,1729 0,8467

TT 1 (5,56%) 21 (9,38%) 1,5474 0,1806 - 13,2570 0,9385

CT+TT 11 (61,11%) 129 (57,59%) 0,8641 0,3230 - 2,3116 0,9657

CEONHPE + INCa 162 (100%) 224 (100%)

CC 89 (54,94%) 95 (42,41%) 1 Referência

CT 63 (38,89%) 108 (48,21%) 1,606 1,0506 - 2,4552 0,037*

56

TT 10 (6,17%) 21 (9,38%) 1,9674 0,8781 - 4,4077 0,1415

CT+TT 73 (45,06%) 129 (57,59%) 1,6555 1,1015 - 2,4882 0,0199*

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

Para os portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado

tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. Porém, o X2 (de

aderência) não indicou diferença na distribuição de genótipos em nenhuma das

amostras analisadas. Dessa forma, não foi possível estimar o risco que a

presença de determinado alelo pode conferir para o desenvolvimento da

doença.

Em relação ao polimorfismo MTHFR A1298C foram analisados 194 casos

e 248 controles oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e do Instituto

Nacional do Câncer, destes: 170 e 24 pacientes e 135 e 113 controles

provindos do CEONHPE e do INCa respectivamente.

Quanto ao sexo apenas as amostras (pacientes e controles) procedentes

do CEONHPE dispunham da informação. Nos pacientes observamos 53% (90)

do sexo feminino e 47% (80) do sexo masculino e entre os controles 54% (73)

do sexo feminino e 46% (62) do sexo masculino (Tabela 9). A análise dos

grupos de pacientes e controles quanto ao sexo mostrou 2=0,039; GL=1;

p=0,8438. Os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível

de 5%, portanto, podemos afirmar que não há diferença estatisticamente

significante quanto à distribuição em relação entre pacientes e controles nesta

amostra.

Quanto ao critério tipo de leucemia, nos pacientes analisados para o

polimorfismo MTHFR A1298C, 79% (154, 136 do CEONHPE/HUOC -

Recife/PE e 18 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (37, 31 do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 6 do INCa) foram classificados como

portadores de leucemia mielóide aguda e em 2% (3) dos caso não foi possível

estabelecer o diagnóstico específico (Tabela 9).

57

Tabela 9. Características demográficas dos pacientes e controles analisados

para polimorfismo MTHFR A1298C.

Características Casos Controles

CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL

Sexo

Masculino 80 - - 62 - -

Feminino 90 - - 73 - -

Tipo de leucemia

LLA 136 18 154 - - -

LMA 31 6 37 - - -

Não identificado 3 - 3 - - -

Os resultados representativos estão ilustrados na tabela 10. Entre os 194

pacientes e 248 controles analisados a freqüência do alelo mutante para o

polimorfismo MTHFR A1298C foi 38% e 24% para pacientes e controles,

respectivamente. A freqüência dos genótipos 1298AA, 1298AC e 1289CC foi

41,75%, 40,21%, 18,04% para o grupo de pacientes e 59,27%, 33,06%, 7,67%

para o grupo de controles, respectivamente. Ambos os grupos se adequaram

ao equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Tabela 10. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e

controles analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.

Genótipos Variantes

MTHFR A1298C

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE

AA 69 (40,59%) 81 (60%) 1 Referência

AC 67 (39,41%) 46 (34,07%) 0,5849 0,3569 – 0,9584 0,0443*

CC 34 (20%) 8 (5,93%) 0,2004 0,0870 – 0,4617 0,0001*

AC+CC 101 (59,41%) 54 (40%) 0,4554 0,2873 – 0,7220 0,0011*

INCa

AA 12 (50%) 66 (58,41%) 1 Referência

AC 11 (45,83%) 36 (31,86%) 0,5950 0,2387 – 1,4833 0,3775

58

CC 1 (4,17%) 11 (9,73%) 2,0000 0,2359 – 16,9575 0,8369

AC+CC 12 (50%) 47 (41,59%) 0,7121 0,2944 – 1,7225 0,5972

CEONHPE + INCa

AA 81 (41,75%) 147 (59,27%) 1 Referência

AC 78 (40,21%) 82 (33,06%) 0,5793 0,3837 – 0,8745 0,0123*

CC 35 (18,04%) 19 (7,67%) 0,2991 0,1608 – 0,5566 0,0002*

AC+CC 113 (58,25%) 101 (40,73%) 0,4925 0,3363 – 0,7213 0,0004*

OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança * – valor significante

Segundo o qui-quadrado de heterogeneidade a distribuição dos genótipos

ocorreu de forma diferente entre as populações de pacientes e controles

(2=17,612; GL=2; p=0,0001) quando analisamos as amostras provenientes do

CEONHPE e do INCa conjuntamente. Esse dado forneceu a evidencia

necessária para estimativa do risco, pelo teste de Odds Ratio.

O teste de Odds Ratio indicou diminuição do risco de desenvolvimento de

leucemia aguda para heterozigotos (1298AC) e homozigotos mutantes

(1298CC), assim como para portadores do alelo mutante (1298AC + 1298CC),

da ordem de 1,7, 3,3 e 2,0, respectivamente (p= 0,0123; p=0,0002; p=0,0004).

Ou seja, indivíduos portadores do genótipo 1298AA têm 1,7 mais chance de

desenvolver a doença do que aquele cujo genótipo é 1298AC ; 3,3 mais

chance do que aqueles cujo genótipo é 1298CC e 2 vezes mais chance do que

os portadores do alelo 1298C em geral.

A mesma tendência de risco foi observada na população do CEONHPE,

com o risco estimado sendo idêntico para indivíduos 1298AA, em relação aos

que possuem o genótipo 1298AC e portadores do alelo 1298C. A diferença

observada foi apenas quanto ao risco apresentado pelos indivíduos 1298AA

em relação aos 1298CC, nos quais o risco estimado para o desenvolvimento

da doença foi aproximadamente 5 vezes maior (OR=4,9891; IC 95%= 2,17 –

11,49; p=0,0001). Isoladamente, a população do INCa não apresentou

distribuição diferencial entre os genótipos de pacientes e controles. Não

sendo, desta forma, estatisticamente significante a estimativa do risco.

Quanto aos diferentes tipos de leucemia as análises revelaram que as

amostras de pacientes portadores de LLA, conjunta e separadamente, oriundas

59

de ambos os centros, se adequavam ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. O teste

de qui-quadrado (de aderência) indicou que apenas na amostra proveniente do

INCa, não foi observada distribuição diferencial do perfil genético entre os

grupos de pacientes e controles (2=3,032; GL=2; p= 0,2196). O teste de Odds

Ratio (Tabela 11) nas outras duas amostras mostrou que, como observado na

análise conjunta de ambos os tipos de leucemia, houve a diminuição do risco

de desenvolvimento de leucemia linfóide aguda para indivíduos heterozigotos

(1298AC) e homozigotos mutantes (1298CC), assim como para portadores do

alelo mutante (1298AC + 1298CC), quando comparados com portadores do

genótipo selvagem (1298AA). Esse efeito protetor, na amostra oriunda do

CEONHPE, foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7275; IC 95%= 1,0862 – 2,7475;

p=0,0278), 3,9 (OR=3,9388; IC 95%=2,0361 – 7,6193; p=0,0000) e 2,1

(OR=2,1435; IC 95%=1,4 – 3,2818; p=0,0006), para indivíduos heterozigotos,

homozigotos mutantes e portadores do alelo mutante, respectivamente. Na

amostra conjunta, o efeito protetor estimado, foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7367;

IC 95%= 1,1167 – 2,7007; p=0,0189), 3,3 (OR=3,3849; IC 95%=1,7629 –

6,4990; p=0,0003) e 2 (OR=2,0467; IC 95%=1,3603 – 3,0794; p=0,0008) para

1298AC, 1298CC e portadores do alelo mutante, respectivamente.

Tabela 11. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio para controles e

pacientes portadores de LLA analisados para o polimorfismo MTHFR A1298C.

Genótipos Variantes

MTHFR A1298C

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE 136 (100%) 248 (100%)

AA 55 (40,44%) 147 (59,27%) 1 Referência

AC 53 (38,97%) 82 (33,06%) 0,5789 0,364 - 0,9207 0,0278*

CC 28 (20,59%) 19 (7,67%) 0,2539 0,1312 - 0,4911 0,0000*

AC+CC 81 (59,56%) 101 (40,73%) 0,4665 0,3047 - 0,7143 0,0006*

INCa 18 (100%) 248 (100%)

AA 9 (50%) 147 (59,27%) 1 Referência

AC 9 (50%) 82 (33,06%) 0,5578 0,213 - 1,4607 0,343

CC 0 (%) 19 (7,67%) - - -

AC+CC 9 (50%) 101 (40,73%) 0,6871 0,2636 - 1,7909 0,6005

CEONHPE + INCa 154 (100%) 248 (100%)

60

AA 64 (41,56%) 147 (59,27%) 1 Referência

AC 62 (40,26%) 82 (33,06%) 0,5758 0,3703 - 0,8955 0,0189*

CC 28 (18,18%) 19 (7,67%) 0,2954 0,1539 - 0,5672 0,0003*

AC+CC 90 (58,44%) 101 (40,73%) 0,4886 0,3247 - 0,7351 0,0008*

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

Nos portadores de LMA o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi observado

tanto nas amostras analisadas conjunta como separadamente. Porém, o teste

de qui-quadrado de heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos

perfis genéticos em nenhuma das amostras analisadas. Sendo assim, não foi

possível estimar o risco que a presença de determinado alelo pode conferir

para o desenvolvimento da doença.

5.3 Análise dos dados do gene TS

Para o gene TS, a população amostral constituiu de 351 casos e 390

controles oriundos do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e INCa, destes: 176 e 175

pacientes e 208 e 182 controles atendidos no CEONHPE e no INCa

respectivamente.

Dos pacientes, 53% (187, dos quais 88 eram provenientes do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 99 do INCa) são do sexo masculino e 47%

(164, sedo 88 do CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 76 do INCa) do sexo

feminino (2=1,522; GL=1; p=0,2173). Dos controles 52% (201, sendo 110

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 91 do INCa) foram do sexo feminino e 48%

(184, sendo 98 CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 86 do INCa) do sexo

masculino (2=0,083; GL=1; p=0,7732) (Tabela 12). A análise dos grupos de

pacientes e controles quanto ao sexo apresentou 2=2,209; GL=1; p=0,1372.

Os valores do qui-quadrado foram inferiores ao valor crítico ao nível de 5%,

tornando possível afirmar que não há diferença estatisticamente significante,

quanto à distribuição em relação ao sexo, entre pacientes e controles e dentro

dos grupos.

Quanto ao tipo de leucemia, 80% (281, 140 do CEONHPE/HUOC -

Recife/PE e 141 do INCa) possuía Leucemia linfóide aguda; 19% (65, 31 do

CEONHPE/HUOC - Recife/PE e 34 do INCa) foram classificados como

61

portadores de leucemia mielóide aguda e em 1% (5) dos caso não foi possível

estabelecer o diagnóstico específico.

Tabela 12. Características demográficas dos pacientes e controles analisados

para as repetições em tandem no promotor do gene TS.

Características Casos Controles

CEONHPE INCa TOTAL CEONHPE INCa TOTAL

Sexo

Masculino 99 88 187 98 86 184

Feminino 88 76 164 110 91 201

Tipo de leucemia

LLA 140 141 281 - - -

LMA 31 34 65 - - -

Não identificado 5 - 5 - - -

As freqüências genotípicas de pacientes e controles analisados para as

repetições em tandem no promotor do gene TS estão dispostas na tabela 13.

Todos os grupos estavam de acordo com o equilíbrio de Hardy-weinberg. As

freqüências obtidas para o alelo 2R e 3R em pacientes foi 0,43 e 0,57, e 0,42 e

0,58 no grupo controle, respectivamente. O qui-quadrado de heterogeneidade

não revelou diferença estatisticamente significante na distribuição do perfil

genético entre pacientes e controles. O que já era esperado, devido à

proximidade das freqüências alélicas em ambos os grupos. Sendo assim, a

estimativa do risco não possui embasamento estatístico.

Tabela 13. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos pacientes e

controles analisados para as repetições em tandem no promotor do gene TS.

Genótipos Variantes

TS (2R/3R)

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE

3R3R 56 (31,82%) 74 (35,58%) 1 Referência

2R3R 89 (50,57%) 96 (46,15%) 0,8163 0,5198 – 1,2819 0,4430

2R2R 31 (17,61%) 38 (18,27%) 0,9276 0,5153 – 1,6698 0,9201

62

2R3R + 2R2R 120 (68,18%) 134 (64,42%) 0,8450 0,5521 – 1,2934 0,5046

INCa

3R3R 58 (33,14%) 56 (30,77%) 1 Referência

2R3R 86 (49,14%) 98 (53,85%) 1,1802 0,7394 – 1,8839 0,5650

2R2R 31 (17,72%) 28 (15,38%) 0,9355 0,4986 – 1,7552 0,9623

2R3R + 2R2R 117 (66,86%) 126 (69,23%) 1,1154 0,7147 – 1,7408 0,7134

CEONHPE + INCa

3R3R 114 (32,48%) 130 (33,33%) 1 Referência

2R3R 175 (49,86%) 194 (49,74%) 0,9721 0,7031 – 1,3442 0,9296

2R2R 62 (17,66%) 66 (16,93%) 0,9335 0,6083 – 1,4325 0,8371

2R3R + 2R2R 237 (67,52%) 260 (66,66%) 0,9620 0,7077 – 1,3077 0,8659

OR – Odds Ratio; IC – Intervalo de confiança; * – valor significante

Quanto aos dois tipos de leucemia (LLA e LMA) as amostras de ambos os

centros estavam condizentes com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Porém, da

mesma forma como aconteceu na análise conjunta, o teste de qui-quadrado de

heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos perfis genéticos em

nenhuma das amostras analisadas (Tabela 14). Não sendo, dessa forma,

possível estimar o risco que a presença de determinado alelo poderia conferir

para o desenvolvimento da doença.

Tabela 14. Qui-quadrado de heterogeneidade dos casos analisados para as

repetições em tandem no promotor do gene TS.

Tipo de Leucemia Procedência Qui-quadrado de

heterogeneidade GL p

LLA

CEONHPE 0,098 2 0,9522

INCa 0,11 2 0,9463

CEONHPE + INCa 0,163 2 0,9219

LMA

CEONHPE 0,12 2 0,9418

INCa 0,433 2 0,8052

CEONHPE + INCa 0,292 2 0,864

63

5.4 Análise dos dados do gene MS

Para o gene MS a população amostral foi constituída apenas com

indivíduos provenientes do CEONHPE/HUOC - Recife/PE. No total analisamos

157 pacientes e 141 controles, para o polimorfismo MS A2756G. Dos 157

pacientes, 49,7% (78) foram do sexo masculino e 50,3% (79) do sexo feminino;

dos 141 controles, 47% (66) foram do sexo masculino e 53% (75) do sexo

feminino (2=0,574; GL=1; p=0,4485) (Tabela 15). Pelo valor do qui-quadrado

ter sido inferior ao valor crítico ao nível de 5%, é possível afirmar que não há

diferença estatisticamente significante, quanto à distribuição sexual, entre

pacientes e controles na população analisada.

Quando ao tipo de leucemia, 80% (126) dos casos eram portadores de

LLA (leucemia linfóide aguda), 18% (28) LMA (leucemia mielóide aguda) e em

2% (3) dos casos, não foi possível classificar (Tabela 15).

Tabela 15. Características demográficas dos

pacientes e controles analisados para o

polimorfismo MS A2756G.

Características Casos Controles

Sexo

Masculino 78 66

Feminino 79 75

Tipo de leucemia

LLA 126 -

LMA 28 -

Não identificado 3 -

As freqüências genotípicas de pacientes e controles o polimorfismo MS

A2756G estão dispostas na tabela 16. Ambos os grupos estavam de acordo

com o equilíbrio de Hardy-weinberg. As freqüências obtidas para o alelo 2756G

foi 25% e 20% em pacientes e controles, respectivamente. Assim como

observado na Análise das repetições em tandem no promotor do gene TS, o

qui-quadrado de heterogeneidade não revelou diferença estatisticamente

significante na distribuição do perfil genético entre pacientes e controles

64

(2=2,444; GL=2; p=0,2946). Essa falta de aderência quanto à

heterogeneidade entre as distribuições do perfil genético, impossibilita a

estimativa do risco de desenvolvimento da doença.

Tabela 16. Freqüências genotípicas dos polimorfismos e Odds Ratio dos

pacientes e controles analisados para o polimorfismo MS A2756G.

Genótipos Variantes

MS A2756G

Casos LA

n (%)

Controles

n (%)

OR IC 95% p

CEONHPE

AA 87 (54,41%) 90 (63,83%) 1 Referência

AG 61 (38,85%) 46 (32,62%) 0,729 0,4497 – 1,1816 0,2453

GG 09 (5,74%) 05 (3,55%) 0,537 0,1731 – 1,6662 0,4165

AG + GG 70 (44,59%) 51 (36,17%) 0,7043 0,442 – 1,1222 0,1742

OR – Odds Ratio IC – Intervalo de confiança

Quanto aos dois tipos de leucemia (LLA e LMA) a amostra se adequou ao

equilíbrio de Hardy-Weinberg. Entretanto, o teste de qui-quadrado de

heterogeneidade não indicou diferença na distribuição dos perfis. Dessa forma,

não foi possível estimar o risco que a presença de determinado alelo poderia

conferir para o desenvolvimento da doença.

65

66.. DDiissccuussssããoo

No presente estudo, foi analisada a associação entre a suscetibilidade

de desenvolvimento de leucemias agudas e polimorfismos em genes

envolvidos no metabolismo do ácido fólico.

Em relação ao polimorfismo RFC-1G80A, o presente estudo indicou que

os indivíduos portadores do genótipo 80GG que possuem 2,9 mais chance de

desenvolver leucemia do que aqueles com genótipo 80AA. Quando a análise

foi feita apenas com portadores de leucemia linfóide aguda (LLA) encontramos

que a presença do alelo 80A no gene RFC-1 exerce um efeito protetor da

ordem de 2 (OR=1,9621; IC 95%=1,0796 – 3,5660; p=0,0372), quando

comparado com o genótipo 80GG e que indivíduos portadores do genótipo

80AA possuem 2,6 menos chance de desenvolver a doença do que os

portadores do genótipo 80GG (OR= 2,6250; IC 95%=1,3053 – 5,2789; p=

0,0104). O efeito protetor do alelo 80A também foi verificado na população de

pacientes portadores de LMA. Segundo nossos dados o risco conferido pela

presença do genótipo 80GG pode chegar a 6 vezes mais chance de

desenvolver a doença do que aqueles cujo genótipo é 80AA. Na análise dos

portadores de LMA o risco conferido pela presença do genótipo 80GG pode ser

observado quando comparado a quaisquer dos outros genótipos.

Diferentemente, Jonge et al., (2009) relatou que o genótipo 80AA

confere 2 vezes mais chance de desenvolver leucemia linfóide aguda, quando

comparado com o genótipo 80GG. Da mesma forma a presença do alelo 80A

(80GA + 80AA) também exerce esse risco, só que da ordem de 1.5.

A incompatibilidade entre os nossos resultados e os de Jonge et al.,

(2009) pode ser explicada pelo tamanho das amostras e/ou pela variabilidade

étnica entre as populações analisadas. O número de controles utilizados no

presente estudo foi significativamente menor nas análises de ambos os tipos

de leucemia e LLA (separadamente). Todavia, na análise de pacientes com

LMA esse problema foi superado devido à pequena quantidade de casos.

Quanto à diversidade étnica, o estudo citado foi realizado no Oeste da Europa,

onde a freqüência do alelo mutante (RFC 80A) está em torno de 36% a 41%

(Chango et al., 2000 e Relton et al., 2004). Na nossa população, contudo, as

66

freqüências encontradas foram: 58%, 49% e 52% nas amostras oriundas do

CEONHPE, INCa e ambos os centros, respectivamente.

Em relação ao polimorfismo MTHFR C677T, contrariando os dados

encontrados na literatura (Skibola et al., 1999, Gemmati et al., 2004, Da Costa

Ramos et al., 2006, Jonge et al., 2009), o presente estudo verificou que o

genótipo 677CT e a presença do alelo 677T (677CT + 677TT) no gene

MTHFR, conferiram aumento do risco de desenvolvimento de leucemia na

amostra oriunda do Centro de Oncohematologia Pediátrica do Hospital

Universitário Oswaldo Cruz – CEONHPE/HUOC. Apesar de o mesmo não ter

sido encontrado na amostra proveniente do Instituto Nacional do Câncer

(INCa), a analise conjunta indicou a presença de um significativo aumento do

risco. O risco estimado foi da ordem de 2,2 tanto para indivíduos heterozigotos

como para portadores do alelo 677T no CEONHPE. Já a análise conjunta

detectou risco da ordem de 1,5 e 1,6 em heterozigotos e portadores do alelo

mutante, respectivamente. Quando separamos os tipos de leucemia, apenas

nos pacientes portadores de LLA foi possível a verificação do risco, porque na

população de pacientes com LMA não houve diferença estatística na

distribuição dos perfis genéticos. A tendência ao risco conferida pela presença

do alelo mutante foi novamente confirmada entre pacientes com LLA. No

amostra do CEONHPE o risco estimado foi da ordem de 1,8 para heterozigotos

e portadores do alelo mutante e na análise conjunta de 1,6 e 1,7 em indivíduos

677CT e portadores do alelo 677T, respectivamente.

Corroborando os nossos resultados, Kim et al., (2009), analisando 110

indivíduos adultos portadores de LLA, na Coréia, observaram que o genótipo

677TT aumentava em 1,7 a chance do desenvolvimento da doença (OR = 1,77;

IC 95%= 1,02–3,09; p= 0,044). Nesse mesmo estudo, Kim et al., (2009)

verificaram que a presença do polimorfismo 677 CT conferiu tendência ao

risco de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide

crônica e síndrome mielodisplásica.

A aparente inconsistência dos nossos resultados e dos estudos

anteriores, em diferentes populações, pode ser devida, entre outras causas, a

diferença nas freqüências genotípicas do polimorfismo, as diferenças étnicas

entre as populações analisadas e ainda, a ausência de informações sobre a

ingestão de folato. Uma vez que a população brasileira é formada por diversos

67

grupos étnicos e que assim como fatores genéticos, a ingestão diária e os

níveis plasmáticos de folatos estão direta e indiretamente relacionados ao

surgimento câncer.

Apesar da contribuição da variante polimórfica MTHFR 1298CC na

redução da função enzimática não ser totalmente esclarecida, uma vez que

estudos observaram resultados contraditórios (Weisberg et al,. 1998 e

Yamada et al,. 2001), observamos uma significante diminuição do risco de

desenvolvimento de leucemia em indivíduos MTHFR 1298CC. Na análise feita

com pacientes LA, apenas na amostra proveniente do INCa não foi possível a

estimativa do risco. O resultado dessa análise revelou que, no CEONHPE, o

efeito protetor em indivíduos heterozigotos (1298AC) e homozigotos mutantes

(1298CC), assim como para portadores do alelo mutante (1298AC + 1298CC),

foi da ordem de 1,7, 5,0 e 2,0, respectivamente. O mesmo foi observado

quando da análise de ambos os centros conjuntamente, diferindo apenas

quanto ao risco apresentado pelos indivíduos 1298AA em relação aos 1298CC,

nos quais o risco estimado para o desenvolvimento da doença foi

aproximadamente 5 vezes maior (OR=4,9891; IC 95%= 2,17 – 11,49;

p=0,0001). Quando separamos os tipos de leucemia, a mesma tendência foi

observada nas amostras analisadas para LLA, enquanto no grupo de LMA não

apresentou diferença na distribuição dos perfis genéticos. Na sub-amostra de

LLA, oriunda do CEONHPE, o efeito protetor foi da ordem de 1,7 (OR= 1,7275;

IC 95%= 1,0862 – 2,7475; p=0,0278), 3,9 (OR=3,9388; IC 95%=2,0361 –

7,6193; p=0,0000) e 2,1 (OR=2,1435; IC 95%=1,4 – 3,2818; p=0,0006), para

indivíduos heterozigotos, homozigotos mutantes e portadores do alelo mutante,

respectivamente. Na amostra conjunta, o efeito protetor estimado, foi da ordem

de 1,7 (OR= 1,7367; IC 95%= 1,1167 – 2,7007; p=0,0189), 3,3 (OR=3,3849; IC

95%=1,7629 – 6,4990; p=0,0003) e 2 (OR=2,0467; IC 95%=1,3603 – 3,0794;

p=0,0008) para 1298AC, 1298CC e portadores do alelo mutante,

respectivamente.

Nossos resultados corroboram o estudo de Ulrich et al. (2005) que

encontraram associação do genótipo mutante MTHFR 1298CC com diminuição

do risco de câncer de cólon. Skibola et al., (1999) encontraram associação

desta variante MTHFR 1298C com redução no risco de desenvolver a LLA em

adultos, assim como Krajinovic et al., (2004) e Kamel et al., (2007) em crianças.

68

Contrastando com esses resultados, um estudo com pacientes diagnosticados

para tumores do sistema nervoso central, como o meduloblastoma, demonstrou

um aumento do risco para desenvolvimento da doença em portadores do

genótipo homozigoto 1298CC (Sirachainan et al., 2008). Nos trabalhos de

Chiusolo et al., (2004), Schnakenberg et al., (2005) e Gemmati et al., (2004) a

distribuição do alelo variante MTHFR 1298C entre casos de LLA infantil e

controles, não revelaram diferença estatística significante.

De acordo com Da Costa Ramos et al., (2006), que analisoram 182

crianças brasileiras tratadas para LMA atendidas no INCa, Centro Infantil

Boldrini e também no CEONHPE, os polimorfismos MTHFR 677 e 1298 foram

associados a LMA apenas em crianças não brancas. Nessa população, houve

uma diminuição do risco da doença para o alelo MTHFR 677T, e um aumento

no risco de desenvolver LMA para as crianças não brancas portadoras do alelo

1298C. Nesse caso uma possível explicação para os divergentes resultados

encontrados é o reduzido número de casos LMA na amostra analisada, por Da

Costa Ramos et al., (2006). Uma vez que o risco não pode ser estimado devido

à ausência de heterogeneidade na distribuição genotípica de pacientes e

controles.

Em relação ao polimorfismo na região promotora do gene TS, o presente

estudo não verificou associação desse polimorfismo e o desenvolvimento de

leucemia. Esse resultado é bastante expressivo devido ao tamanho amostral e

a análise de pacientes oriunda de dois centros de pesquisas em diferentes

regiões do país. Nossos resultados sugerem que a presença de variantes

alélicas na região promotora do gene TS não exerce qualquer efeito no risco de

desenvolvimento de leucemia, na população brasileira.

Entretanto, Skibola et al., (2002) observaram a redução do risco de

desenvolvimento de leucemia linfóide aguda, em adultos do Reino Unido, para

indivíduos que possuíam a variante alélica 3R, do gene TS . Nesse trabalho, o

risco estimado para indivíduos 2R2R quando parado com indivíduos 2R3R foi

de 2,6. A presença da tripa repetição, na região promotora do gene, em

homozigose (3R3R) conferiu ao seu portador um efeito protetor da ordem de 4

vezes. Da mesma forma, só que em pacientes com linfoma, Hishida et al.,

(2003) e Lightfoot et al., (2005) associaram a presença do alelo TS2R ao

aumento no risco de desenvolvimento da doença. Seguindo a mesma

69

tendência, Kim et al., (2009) verificaram associação do genótipo 2R3R a

diminuição do risco de LMA em adultos coreanos. Por outro lado, Jonge et al.,

(2009) não observou esse efeito protetor conferido pela presença do alelo

variante TS3R, em vez disso, relacionou a redução do risco a presença do

alelo TS2R (2R3R: OR= 0,7; IC 95%= 0,4-1,0; p= 0,04 e presença do alelo 2R:

OR= 0,7; IC 95%= 0,5-1,0; p=0,03).

Em relação ao gene MS, nosso resultados também não indicaram

associação de quaisquer dos genótipos com o risco de desenvolvimento de

leucemia. Da mesma forma, Skibola et al., (2002), Kamel et al., (2007), Kim et

al., (2009) e Jonge et al., (2009) não observaram nenhum impacto no

desenvolvimento da doença, provocado pela presença do polimorfismo, em

adultos ou crianças. Igualmente, Lightfoot et al., (2005) e Sirachainan et al.,

(2008) também não verificaram associação da variante polimórfica MS 2756

AG à modificações nos níveis de homocisteína e susceptibilidade a linfoma e

tumores no sistema nervos central, respectivamente.

Por outro lado, Gemmati et al., (2004) constatou uma significativa

redução do risco de LLA, em adultos italianos, provocada pela presença do

alelo mutante. Gemmati et al., (2004) observou que indivíduos portadores do

genótipo 2756AG assim como os portadores do alelo 2756G (2756AG +

2756GG) apresentaram um efeito protetor da ordem de 1,9 (2756AG: OR=0,56;

IC 95%= 0,32–0,90; p= 0,030 e portadores do alelo 2756G: OR=0,52, IC

95%=0,30–0,80; p=0,011).

Analisando pacientes com linfoma, Matsuo et al., (2001) relataram que a

presença do genótipo 2756GG conferia maior susceptibilidade para o

desenvolvimento da doença, do que o genótipo 2756AA. Esse aumento do

risco foi estimado em 3,59 vezes. Contrariamente, Niclot et al., (2006)

descreveu que os portadores do genótipo 2756AA é que estavam relacionados

ao aumento do risco de linfoma folicular.

A grande discordância dos dados da literatura só evidencia a necessidade

de mais estudos a respeito da interação gene – gene e gene – ambiente dada

a importância e a necessidade de determinar, classificar e qualificar,

verdadeiramente, os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer.

70

77.. CCoonncclluussõõeess Em relação ao polimorfismo RFC-1 G80A, foi detectado aumento do risco para

desenvolvimento de LA, LLA e LMA, em indivíduos 80GG quando comparado

com 80AA e portadores do alelo 80A .

Em relação ao polimorfismo MTHFR C677T, foi observado aumento do risco

para desenvolvimento de LA e LLA em indivíduos 677CT e portadores do alelo

677T, quando comparado com 677CC.

A presença do genótipo 1298AA no gene MTHFR foi relacionada ao aumento

do risco do desenvolvimento de LA e LLA em relação a indivíduos 1298AC,

1298CC e portadores do alelo 1298C.

O polimorfismo MS A2756G e as repetições em tandem no promotor do gene

TS não foram associados ao desenvolvimento da doença.

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86

ANEXOS

______________________________________________________

ANEXO I

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

1. Afirmação introdutória

A criança pela qual você responde frente à equipe médica está sendo

convidada a participar de um estudo de investigação clínica para decidir se

deseja ou não que ela participe, você precisa entender os benefícios e riscos

do mesmo, a fim de formar a sua opinião.

2. Objetivo do estudo

O médico diagnosticou na criança que você acompanha uma doença

conhecida como leucemia, que é caracterizada por uma produção anormal de

glóbulos brancos no sangue e acúmulo de células jovens anormais na medula

óssea. Neste estudo, não serão administrados medicamentos para esta

doença, mas através de uma coleta única de sangue, poderão ser

determinadas características genéticas (características que vem de nossos

pais) que possam estar associadas com alterações que poderão estar ligadas a

leucemia. Farão parte deste estudo crianças que apresentem leucemias

linfóide agudas. Através do estudo das características genéticas, ou seja,

relacionadas com a leucemia poderão ser reconhecidos novos fatores de risco

das mesmas.

3. Procedimentos a serem seguidos

Após você ter assinado o Consentimento Informado, será coletada uma

amostra de sangue para os exames de laboratório. Através destes exames

serão examinadas características genéticas e fenotípicas que poderão estar

associadas com as leucemias. A criança continuará a tomar todos os remédios

que vem fazendo uso, ou a critério de seu médico estes poderão ser

87

modificados no futuro se os seus exames revelarem que outros poderiam ser

mais apropriados. O estudo constará de apenas uma visita médica e coleta de

exame de sangue. A criança continuará a receber a assistência ambulatorial

que já vinha sendo oferecida, sem prejuízo ou interrupção de medicamentos

que por ventura já esteja fazendo uso.

4. Desconforto e riscos

Nenhum novo medicamento ou forma de tratamento será testado na

criança não apresentando nenhum desconforto, pois a coleta de sangue será

realizada no momento do diagnóstico ou durante o tratamento sendo

aproveitado para tanto o sangue que normalmente é coletado para

acompanhamento médico.

5. Exclusões

Se você não entender alguma palavra do texto, peça explicações ao seu

médico.

6. Benefícios aos participantes

A leucemia representa um grupo de doenças malignas que poderão

incapacitar o paciente ou mesmo levá-lo à morte. Ao deixar a criança pela qual

você é o responsável frente ao médico, enfermeiras e demais equipe participar

de estudos como este você estará colaborando para que um maior

conhecimento médico e cientifico das leucemias em nosso país seja

conseguido.

7. Confidencialidade

A menos que sejam requeridos por lei, apenas o investigador, o comitê

de revisão e a Comissão de Ética irão ter acesso a dados confidenciais que

identificam o paciente pelo nome. Os resultados desta pesquisa poderão ser

apresentados em reuniões ou em publicações, no entanto você e a criança não

serão identificadas nestas apresentações. Todo o material biológico coletado

neste estudo será exclusivamente utilizado para as pesquisas de variantes

genéticas e fenotípicas especificadas no protocolo, podendo ainda ser

examinadas e descritas novas características genéticas relacionadas às

88

leucemias. Este material não será utilizado para outros estudos ou utilizado

para outros fins.

8. Novas descobertas

Se no decorrer deste estudo ou ao seu final surgir alguma conclusão

relevante para beneficio no tratamento da leucemia você será informado a

respeito.

9. Pessoas para contato

O pesquisador ou seu substituto responderá a todas as perguntas, Se

você tiver questões adicionais no decorrer deste estudo sobre a pesquisa ou

seus direitos como um participante da pesquisa, poderá dirigi-las à professora

Maria Tereza Cartaxo Muniz, Instituto de Ciências Biológicas, Disciplina de

Bioquímica fones: 3423-8112 ou 3423-8582.

10. Participação voluntária

A criança está participando voluntariamente deste estudo. Você pode se

recusar a deixá-la participar do mesmo a qualquer momento, sem penalidades

nem perda dos benefícios que ela já tem direito.

11. Consentimento Informado

Li o texto acima e estou ciente do conteúdo deste formulário de

consentimento. Minhas perguntas foram respondidas. Autorizarei a criança que

acompanho em participar. Recebi uma cópia deste formulário de

consentimento.

Nome do paciente: ________________________________________________

Assinatura do responsável:__________________________________________

data:__/__/__

Nome do investigador:_____________________________________________

Assinatura:______________________________________________________

data:__/__/__

89

Nome da testemunha:______________________________________________

Assinatura da testemunha:__________________________________________

data:__/__/__

Pessoa que conduziu o Termo de Consentimento:

_______________________________________________________________

Assinatura:______________________________________________________

data:__/__/__