Untreue Enzyme in der Biokatalyse: mit alten Enzymen zu neuen Bindungen und Synthesewegen

Reaktionsspezifit t von Enzymen

Untreue Enzyme in der Biokatalyse: mit alten Enzymenzu neuen Bindungen und SynthesewegenUwe T. Bornscheuer* und Romas J. Kazlauskas*

Stichw�rter:Biosynthese · Biotransformationen · Enzymkatalyse ·Molecular Modeling · Proteine

1. Einleitung

Die Beobachtung, dass viele Enzyme eine breite Sub-stratspezifit�t aufweisen, f�hrte in den letzten 20 Jahren zueiner stark wachsenden Zahl von Arbeiten auf dem Gebietder Biokatalyse, vor allem im Bereich der organischenSynthese. Die Identifizierung einiger Enzyme mit hoherStereoselektivit�t in Bezug auf eine große Menge pr�parativn�tzlicher Verbindungen f�hrte zu neuen Anwendungen inder Synthese.

Eine aktuelle Fragestellung auf dem Gebiet der Biokata-lyse betrifft die Reaktionsspezifit�t von Enzymen: Kann eineinzelnes aktives Zentrum mehr als nur eine bestimmtechemische Umsetzung katalysieren? K1nnen kleine 2nde-rungen im aktiven Zentrum den Ablauf anderer chemischer

Prozesse an dieser Stelle erm1glichen?In den letzten Jahren ist immer deut-licher geworden, dass diese „katalyti-sche Promiskuit�t“ (catalytic promis-cuity) bei Enzymen sehr h�ufig auf-tritt.[1] Dieser Kurzaufsatz behandeltdie katalytische Promiskuit�t im Zu-

sammenhang mit der Biokatalyse, d.h. mit enzymkatalysier-ten Reaktionen, die f�r die organische Synthese n�tzlich sindoder sein k1nnen. Wir stellen Proteine vor, die mehrerekatalytische Eigenschaften aufweisen, sowie Proteine, beidenen kleine 2nderungen (meist ein Austausch von Metall-ionen oder eine positionsgerichtete Mutagenese) zu neuenkatalytischen Eigenschaften f�hren. Zu den beeindruckends-ten Beispielen geh1ren Reaktionen zur C-C-Bindungskn�p-fung, Oxidationen mithilfe hydrolytischer Enzyme und Gly-cosyltransferreaktionen.

2. Einteilung der katalytischen Promiskuit t

Die katalytische Promiskuit�t von Enzymen beruht aufder Eigenschaft ihrer aktiven Zentren, mehrere eindeutigechemische Umsetzungen zu katalysieren. Diese k1nnen sichbez�glich der Art der gebildeten oder gespaltenen Bindungund/oder des Katalysemechanismus unterscheiden – meistensunterscheiden sie sich in beidem. So wird z.B. durch Zugabevon Vanadiumionen eine Phosphatase zu einer Oxidase, diein der Lage ist, enantioselektive Oxidationen von Sulfiden zukatalysieren (dies wird in Abschnitt 4.2 im Detail diskutiert).An diesen beiden Reaktionen sind unterschiedliche funktio-nelle Gruppen beteiligt (anstelle der P-O-Bindung in einemPhosphatester wird die O-O-Bindung in Wasserstoffperoxidgespalten) und die Reaktionsmechanismen unterscheidensich deutlich (Hydrolyse bzw. Oxidation).

Mit der Entdeckung hochstereoselektiver Enzyme mit breiter Sub-stratspezifit#t hat sich die Biokatalyse in den letzten Jahrzehnten ra-sant entwickelt. Ein neues Forschungsgebiet besch#ftigt sich mit En-zymen, die eine breite Reaktionsspezifit#t bei der Katalyse alternativerReaktionen aufweisen. Oft untersch#tzt, spielt diese katalytische Pro-miskuit#t (catalytic promiscuity) eine nat*rliche Rolle in der Evolu-tion und in manchen F#llen auch in der Biosynthese von Sekund#r-metaboliten. In diesem Kurzaufsatz werden Beispiele f*r katalytischePromiskuit#t mit aktuellen und m,glichen Anwendungen in derSynthese vorgestellt. Kombiniert mit Protein-Engineering k,nntendank dieser Eigenschaft die Verwendungsm,glichkeiten von Enzymenin der organischen Synthese deutlich erweitert werden.

[*] Prof. Dr. U. T. BornscheuerInstitut f!r Chemie und BiochemieAbteilung Technische Chemie und BiotechnologieErnst-Moritz-Arndt-Universit't GreifswaldSoldmannstraße 16, 17487 Greifswald (Deutschland)Fax: (+49)3834-86-80066E-mail: [email protected]

Prof. Dr. R. J. KazlauskasUniversity of MinnesotaDepartment of Biochemistry, Molecular Biology & Biophysics1479 Gortner Avenue, 174 Gortner Lab, St. Paul, MN 55108 (USA)Fax: (+1)612-625-5780E-mail: [email protected]

U. T. Bornscheuer und R. J. KazlauskasKurzaufs tze

6156 � 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim DOI: 10.1002/ange.200460416 Angew. Chem. 2004, 116, 6156 –6165

In Abbildung 1 ist die katalytische Promiskuit�t anhandder Unterschiede in den beteiligten funktionellen Gruppenund bez�glich des Katalysemechanismus veranschaulicht (f�rausgew�hlte Beispiele siehe Tabelle 1). Die Lage der Reak-tionen in dieser Graphik folgt einer subjektiven Einsch�t-

zung, da die 2hnlichkeit von funktionellen Gruppen undReaktionswegen, deren Details oft unbekannt sind, ebenfallsnur subjektiv beurteilt werden kann. Dennoch hilft dieseEinteilung, die Typen der katalytischen Promiskuit�t zuunterscheiden.

Die gr1ßte Gruppe bilden die Umsetzungen von Verbin-dungen mit �hnlichen funktionellen Gruppen. Beispielsweisekatalysieren viele Proteasen auch die Hydrolyse von Estern.In beiden F�llen unterscheiden sich die gespaltenen Bindun-gen (C-N vs. C-O), der Katalysemechanismus ist aber sehrwahrscheinlich �hnlich. Mehrere Metalloproteasen katalysie-ren auch die Hydrolyse von P-O-[2] oder P-F-Bindungen.[3]

Umgekehrt spalten einige Esterasen die C-N-Bindung in b-Lactamen,[4] und Proteasen k1nnen die S-O-Bindung[5] inSulfiten oder die S-N-Bindung in Sulfinamiden spalten.[6] Imindustriellen Maßstab nutzt die BASF AG eine Lipase, dienormalerweise die C-O-Bindung in Triglyceriden spaltet, um

Amine durch enantioselektive Acylierung – inder eine C-N-Verkn�pfung entsteht – mithilfeeiner Racematspaltung zu trennen.[7] Asparagi-nase, die das prim�re Amid in der Seitenkettevon Asparagin spaltet, spaltet auch das Nitril ineinem analogen Substrat, b-Cyanalanin.[8] Pyru-vatkinase, die den Transfer von Phosphorylgrup-pen katalysiert, kann auch Sulfurylgruppen�bertragen.[9] Einige Phosphatasen katalysierenauch die Hydrolyse von Sulfatestern.[10] Enzym-inhibitoren von Serinhydrolasen, z.B. Phospho-nate, fallen nicht hierunter, da hier nur selteneine katalytische Umsetzung stattfindet.

Bei anderen Reaktionstypen muss eine Ver-�nderung des Mechanismus stattfinden. Bei-spielsweise f�hrt die Entfernung eines f�r dieKatalyse essenziellen Aminos�urerestes zu ei-ner enormen Verlangsamung der Reaktion, aberdiese wird nicht ganz aufgehoben. Die verblei-bende, wenig effiziente Reaktion muss alsoeinem anderen Weg folgen. So bleibt auch nacheiner Mutation, bei der ein Cystein- gegen einenAsparaginrest ausgetauscht wurde, in einerPhosphatase etwas Aktivit�t erhalten.[11] Einweiterer Reaktionstyp ist die substratunterst�tz-te Katalyse, bei der nur Substrate umgesetztwerden, die eine fehlende funktionelle Gruppeim Protein ersetzen, die dann aktiv an derKatalyse beteiligt ist.[12] Bei einigen Reaktionen

deutet der stereochemische Verlauf auf unterschiedlicheReaktionswege hin: Zum Beispiel setzen Epoxidhydrolasenein Enantiomer unter Inversion des Stereozentrums und dasandere Enantiomer unter Retention um.[13] Die Wege m�ssensich folglich unterscheiden, auch wenn die Details nochungekl�rt sind.

Selbst die Bindung von Proteinen kann mitunter Reak-tionen katalysieren, was eindeutig eine 2nderung des Me-chanismus bedeutet – fand vorher keine Substratspaltungstatt, so wird nun zumindest ein gewisses Maß an Spaltungbeobachtet. Beispielsweise katalysiert Rinderserumalbumindie Ring1ffnung von Benzisoxazolen (Kemp-Eliminierung),

Romas Kazlauskas, geboren 1956, studierteChemie am Massachusetts Institute of Tech-nology, wo er auch promovierte. Nach ei-nem Postdoc-Aufenthalt bei GeorgeWhitesides an der Harvard-Universit,t arbei-tete er bei der General Electric Company(1985–88) und an der McGill University inMontreal (1988–2003). Zurzeit ist er Assoc-iate Professor f6r Biochemie, Molekularbio-logie und Biophysik an der University ofMinnesota, Twin Cities. Sein Spezialgebietist die enantioselektive organische Syntheseunter Verwendung von Enzymen.

Uwe Bornscheuer, geboren 1964, studierteChemie an der Universit,t Hannover, wo er1993 am Institut f6r Technische Chemiepromovierte. Nach einem Postdoc-Aufent-halt in Nagoya, Japan, wechselte er an dasInstitut f6r Technische Biochemie der Uni-versit,t Stuttgart, an der er sich 1998 habi-litierte. Seit 1999 ist er Professor f6rTechnische Chemie und Biotechnologie ander Universit,t Greifswald. Er interessiertsich f6r die Anwendung von Biokatalysato-ren bei der Synthese optisch aktiver Verbin-dungen und bei Lipidmodifizierungen.

Abbildung 1. Einteilung katalytischer Promiskuit't. Diese kann mit einer Reaktion an ei-ner anderen funktionellen Gruppe und/oder einer Enderung im Katalysemechanismusverbunden sein. Die Kreise verdeutlichen den Typ der katalytischen Promiskuit't (kur-siv). Tabelle 1 listet ausgew'hlte Beispiele auf.

EnzymkatalyseAngewandte

Chemie

6157Angew. Chem. 2004, 116, 6156 –6165 www.angewandte.de � 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

http://www.angewandte.de

die b-Eliminierung von 3-Ketobutyl-Umbelliferylethern (ei-ne n�tzliche Reaktion in Enzymtests[14]) und die (schwach)enantioselektive Oxidation von Aminen zu Aminoxiden mitNatriumperiodat.[15] Myoglobin (ein sauerstofftragendesH�mprotein) katalysiert langsameOxidationen in Gegenwartvon Wasserstoffperoxid.[16] Eine positionsgerichtete Mutage-nese zur Verschiebung eines distalen Histidins (Leu29His/His64Leu) erh1hte die Reaktionsgeschwindigkeit um mehrals das 20-fache und f�hrte zu einer deutlich h1herenEnantioselektivit�t. Die Oxidation von Thioanisol ergab dasentsprechende Sulfoxid mit 97% ee, und die Oxidation voncis-b-Methylstyrol lieferte das Epoxid mit 99% ee.[17] Allekatalytischen Antik1rper sind Beispiele f�r bindende Mole-k�le, die auch Reaktionen katalysieren k1nnen. Interessan-terweise katalysiert ein Antik1rper, der eine Aldoladdition�ber nucleophile Katalyse erm1glicht (Bildung einer Imin-gruppe zwischen der Carbonylgruppe des Substrats undeinem Lysinrest), auch eine Kemp-Eliminierung. Dazu mussdas Lysin auch als Base fungieren.[18] Ein anderer katalyti-scher Antik1rper, der eine Decarboxylierung katalysiert,erm1glicht auch eine Esterhydrolyse.[19]

Prinzipiell f�hren kleine 2nderungen in der Substratspe-zifit�t eines Enzyms zu subtilen Ver�nderungen der Elektro-

nenverteilung im Obergangszustand und k1nnen somit eben-falls als Beispiele f�r katalytische Promiskuit�t verstandenwerden. Diese Unterschiede sind aber meist deutlich kleinerals bei den hier ber�cksichtigten Beispielen.

3. Katalytische Promiskuit t innerhalb des gleichenProteins

Ein klassisches Beispiel f�r katalytische Promiskuit�t istdie Pyruvatdecarboxylase aus Hefe, die nicht nur die De-carboxylierung von Pyruvat, sondern auch die Verkn�pfungvon Acetaldehyd mit Benzaldehyd zu (R)-Phenylacetylcarbi-nol, einer Zwischenstufe der Ephedrinsynthese, katalysiert(Schema 1) und folglich auch eine Lyaseaktivit�t aufweist.[20]

Diese Acyloinkondensation l�uft �ber einen zus�tzlichenSchritt ab (die Bildung einer C-C-Bindung), der nicht in dernat�rlichen Reaktionsfolge vorkommt. Obwohl Neuberg undHirsch diese Reaktion bereits 1921 in ganzen Hefezellenentdeckten,[21] wurde erst k�rzlich Pyruvatdecarboxylase alshierf�r verantwortliches Enzym identifiziert.[22] Diese Reak-tion zeigt auch, dass die alternativen Substrate (Acetaldehydund Benzaldehyd) deutlich gr1ßer als das nat�rliche Substrat

Tabelle 1: Ausgew'hlte Beispiele f!r katalytische Promiskuit't in einem einzelnen Enzym.

Enzym Enzymklasse Normale Aktivit't Promiskuitive Aktivit't Lit.

Prolin- Aminopeptidase Metallohydrolase(zwei Mn2+)

C-N-Hydrolyse in Prolinamiden P-F-Hydrolyse in Diisopropylfluorphosphat [3]

Aminopeptidase Metallohydrolase(zwei Zn2+)

C-N-Hydrolyse in Amiden P-O-Hydrolyse in Bis(p-nitrophenyl)phosphat [2]

Pyruvatkinase Metalloenzym (Mn2+,K+, Mg2+)

Phosphoryltransfer von Phospho-enolpyruvat

Sulfuryltransfer von Sulfoenolpyruvat; auch Phos-phoryltransfer auf Fluoride, Hydroxyamine oder a-Hydroxycarbons'uren

[9]

o-Succinylbenzoat-Syn-thase

Metalloenzym(Mn2+)

Dehydratisierung von 2-Hydroxy-6-succinyl-2,4-cyclohexadiencarboxy-lat

Racemisierung von N-Acylaminos'uren [35]

Methanmonooxygenase H'm-frei, Dieisen Hydroxylierung von Methan Epoxidierung, N-Oxidbildung, Dehalogenierung,Desaturation benzylischer Substrate

[47]

pflanzl. Steroyl-Acylcar-rier-Protein-D9-Desatu-rase

H'm-frei, Dieisen Desaturation von C9-C10-Bindun-gen in Stearins'ure zu Jls'ure

Sulfoxidierung von 9-Thia- oder 10-Thiaanaloga vonStearat und Hydroxylierung von 9-Fluoranaloga

[45, 46]

Cephalosporin-C-Syn-thase

Metalloenzym (H'm-frei Fe, 2-Oxogluta-rat-abh'ngig)

Oxidative Ringerweiterung desF!nfrings zum Sechsring, Hydroxy-lierung einer Methylgruppe

Eine der beiden normalen Aktivit'ten [42]

Lipase, Esterase Serinhydrolase Esterhydrolyse b-Lactamhydrolyse [4]Lipase, Chymotrypsin Serinhydrolase Triglycerid oder Peptidhydrolyse Aldoladdition oder Michael-Addition [27, 30]Subtilisin Serinhydrolase Peptidhydrolyse Sulfinamidhydrolyse [6]Lipase, Trypsin Serinesterase Triglycerid oder Peptidhydrolyse Oligomerisierung von Si(CH3)2(OEt)2, Dimerisie-

rung von Si(CH3)3OCH3

[31, 32]

Pepsin Aspartathydrolase Amidhydrolyse Sulfithydrolyse [5]Asparaginase Thr-Lys-Asp-Triade C-N-Hydrolyse in Asparagin zu As-

partatC�N-Hydrolyse in b-Cyanalanin zu Aspartat [8]

Epoxidhydrolase Asp-His-Asp-Triade Hydrolyse von Epoxiden unter In-version der Konfiguration

Hydrolyse von Epoxiden unter Retention der Konfi-guration

[13]

Oxynitrilase Ser-His-Asp-Triade Addition von Cyanid an Aldehyde Addition von Cyanid an Imine [34]Aldolase-katalytischerAntikKrper

Lys Aldolreaktion Kemp-Eliminierung [18]

Serin-Hydroxymethyl-Transferase

Pyridoxal-abh'ngig Transfer von Cb von Serin auf Te-trahydropteroylglutamat

Threonin-Retroaldolreaktion, Decarboxylierung vonAminomalonat, Racemisierung von Alanin, Trans-aminierung von Alanin und Pyruvat

[25]

Pyruvat-Decarboxylase Thiamin-abh'ngig Decarboxylierung von Pyruvat Acyloinkondensation von Acetaldehyd und Benzal-dehyd

[21–23]

AngewandteChemie U. T. Bornscheuer und R. J. Kazlauskas

6158 � 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.de Angew. Chem. 2004, 116, 6156 –6165


(Pyruvat) sein k1nnen. Vor wenigen Jahren konnte gezeigtwerden, dass durch denAustausch einer einzigenAminos�urein der stabileren Pyruvatdecarboxylase aus Xymomonasmobilis, die diese Lyasereaktion nicht katalysiert, eine Ly-aseaktivit�t erzeugt werden kann.[23]

Pyridoxal-abh�ngige Enzyme sind ein weiteres klassischesBeispiel f�r katalytische Promiskuit�t. In den meisten Pyrid-oxal-abh�ngigen Enzymen f�hrt diese zus�tzliche funktionel-le Gruppe im aktiven Zentrum zur Bildung eines Aldimin-Intermediates, dass nur �ber einen Weg abreagiert.[24] Ineinigen F�llen kann dieses Aldimin aber �ber unterschiedli-che Pfade weiterreagieren: So katalysiert die Serinhydroxy-methyltransferase auch eine Threonin-Retroaldolreaktion,die Decarboxylierung von Aminmalonat und die Racemisie-rung von Alanin.[25] Die positionsgerichtete Mutagenese einerAlanin-Racemase verringerte deren Racemaseaktivit�t undsteigerte die sonst nur geringe Transaminase-Aktivit�t.[26]

Eine weitere Reaktion zur C-C-Bindungskn�pfung ist dieAldoladdition von Hexanal, die durch Lipase B aus Candi-da antarctica katalysiert wird.[27] Die Reaktion verlief zwarnicht enantioselektiv, aber mit einer anderen Diastereoselek-tivit�t als die spontane Reaktion (Schema 2). Die Autoren

vermuteten, dass die Aldoladdition kein Serin im aktivenZentrum ben1tigt – tats�chlich f�hrte ein Austausch vonSerin gegen Alanin (Ser105Ala) zu einer etwa zweimalh1heren Aldoladditions-Aktivit�t.

Eine Reaktion, durch die mehrere unterschiedliche Bin-dungen gekn�pft werden k1nnen, ist die durch eine O-Acetylserin-Sulfhydrylase katalysierte Michael-Addition vonNucleophilen (Schema 3). Die nat�rliche Aufgabe diesesPyridoxal-haltigen Enzyms ist die Cystein-Biosynthese aus

O-Acetylserin durch Eliminierung von Acetat unter Bildungeines Acrylat-Intermediates. Eine Michael-Addition des Sul-fidnucleophils f�hrt dann zu Cystein, jedoch reagieren auchandere Nucleophile wie Thiole, Selenole, Azide, Cyanide undeinige aromatische N-Heterocyclen mit diesem Intermediat,wobei nicht-nat�rliche Aminos�uren gebildet werden. Folg-lich katalysiert dieses Enzym bei gleichem Mechanismusnicht nur die Bildung von C-S-Bindungen, sondern auch dievon C-Se-, C-C- und C-N-Bindungen.[28] K�rzlich gelang esMaier, einen E.-coli-Stamm f�r die Durchf�hrung diesernicht-nat�rlichen Reaktion zu erzeugen. Eine normale Kul-tivierung lieferte die Ausgangsverbindung O-Acetylserin unddas Enzym; die Addition von Nucleophilen ergab nicht-nat�rliche Aminos�uren in 45–91% Ausbeute.[29] Lipasenkatalysieren auch die Michael-Addition unterschiedlicherNucleophile an 2-(Trifluormethyl)propens�ure.[30]

Unter Bildung von Si-O-Si-Bindungen katalysierten Li-pasen[31] oder Trypsin[32] die Kondensation von Silanolen bzw.Alkoxysilanen. Trypsin katalysierte die Hydrolyse und dieKondensation von Trimethylethoxysilan zu Hexamethylsil-oxan in Wasser (Schema 4). Silanole und Alkoxysilane sind

zwar bereits von Natur aus sehr reaktiv und gehen einespontane oder peptidvermittelte Kondensation ein,[33] dietrypsinkatalysierte Reaktion war jedoch noch mindestens 10-mal schneller als die spontane Reaktion. Das aktive Zentrumvon Trypsin muss an der Kondensation beteiligt sein, da inGegenwart von trypsinspezifischen Inhibitoren keine Kata-lyse auftrat und auch nicht alle Trypsine diese Reaktionkatalysieren: Trypsin aus Schweinen war aktiv, Trypsin ausdem atlantischen Kabeljau inaktiv.

Schema 1. Pyruvatdecarboxylase, ein Thiamin-abh'ngiges Enzym, kata-lysiert auch die enantioselektive Acyloin-Kondensation von Acetaldehydund Benzaldehyd.

Schema 2. Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B) katalysiert eine Al-doladdition von Hexanal. Diese Nebenreaktion ist zwar >105-mallangsamer als die nat!rliche Reaktion (die Hydrolyse eines Triglyce-rids), allerdings mindestens 10-mal schneller als die durch einen kata-lytischen AntikKrper mit Aldolase-Aktivit't vermittelte Reaktion. Rechtsist der berechnete Mbergangszustand f!r die Enolatbildung gezeigt.

Schema 3. Die Michael-Addition alternativer Nucleophile durch O-Ace-tylserin-Sulfhydrylase an ein Aminoacrylat-Intermediat erzeugt nicht-na-t!rliche Aminos'uren.

Schema 4. Trypsinkatalysierte Hydrolyse und Kondensation von Trime-thylethoxysilan zu Hexamethyldisiloxan in Wasser.


Chemie



Oxynitrilase katalysiert normalerweise die Addition vonCyaniden an Aldehyde, kann aber auch mit moderaterStereoselektivit�t (3–4:1) die Addition von Cyaniden anImine vermitteln.[34]

Eine falsche Zuordnung der Enzymfunktion aufgrund vonkatalytischer Promiskuit�t erfolgte bei einem urspr�nglich alsN-Acylaminos�ure-Racemase identifizierten Enzym.[35] Gerltund Mitarbeiter konnten k�rzlich zeigen, dass dieses Enzymum den Faktor 1000 effizienter eine Dehydratisierung unterBildung von o-Succinylbenzoat katalysiert. Dies l�sst denSchluss zu, dass die Bildung eines Succinylbenzoates dieeigentliche Aufgabe des Enzyms ist (Schema 5). Ein Wechselder N-Acylaminos�ure von N-Acetylmethionin (dem bislangbesten Substrat f�r die Racemaseaktivit�t) zu N-Succinyl-phenylglycin, das der Succinylbenzoatvorstufe n�her kommt,f�hrte zu einer 1000-fachen Steigerung der Geschwindigkeit

der Racemisierungsreaktion, vergleichbar mit jener der Suc-cinylbenzoat-Reaktion.

Die katalytische Aktivit�t von Esterasen und Lipasen, diedie Hydrolyse von Estern katalysieren, �berlappt mit jenervon H�m-freien Haloperoxidasen. Diese katalysieren Oxida-tionen durch Wasserstoffperoxid �ber eine Peroxocarbon-s�ure-Zwischenstufe (Schema 6). So zeigen eine Esterase aus

Pseudomonas fluorescens,[36] eine Lactonase[37] undviele Lipasen[38] niedrige Peroxidaseaktivit�t in Ge-genwart von Wasserstoffperoxid und einer Carbon-s�ure. Im umgekehrten Fall weist zumindest eineHaloperoxidase auch eine niedrige Esteraseaktivit�tauf.[39] Die Oberlappung der katalytischen Aktivit�tdieser Enzyme ist auf �hnliche Obergangszust�ndeund Acyl-Enzym-Intermediate in beiden Reaktionenzur�ckzuf�hren (Schema 7). In Esterasen wird dasAcyl-Enzym-Intermediat durch Hydrolyse gespalten,w�hrend in Haloperoxidasen eine Perhydrolyse zurPeroxocarbons�ure f�hrt. Die nachfolgende Oxidationeines Halogenids zu Hypochlors�ure durch diese Per-

Schema 5. Ein Enzym, das als N-Acylaminos'ure-Racemase beschrieben wurde, ist 1000-mal effizienter bei der Dehydratisierung von o-Succinylbenzoat. Beide Reaktionsmecha-nismen verlaufen !ber ein 'hnliches anionisches Intermediat.

Schema 6. H'm-freie Haloperoxidasen katalysieren die Bildung vonPeroxocarbons'uren !ber einen esterase'hnlichen Mechanismus. Dienachfolgende Oxidation des Substrates mit der Pers'ure erfolgt mKgli-cherweise nicht enzymkatalysiert.

Schema 7. Die Mechanismen der Ester-Hydrolyse durch Esterasen und der Ester-Peroxidation durch H'm-freie Haloperoxidasen verlaufen beide!ber ein Acyl-Enzym-Intermediat. In Esterasen (X=H) wird dieses Intermediat durch H2O angegriffen, um die Hydrolyse zu vervollst'ndigen. InHaloperoxidasen (X=OH) entsteht dieses Acyl-Enzym-Intermediat durch dem Reaktionsgemisch zugesetztes Acetat. Wasserstoffperoxid greift die-ses Intermediat unter Bildung einer Pers'ure an. R=Ph f!r Esterase, H f!r Haloperoxidase.




oxocarbons�ure ist m1glicherweise nicht Enzym-katalysiert.Dennoch sind Esterasen und Lipasen effizienter bei derEsterhydrolyse und Haloperoxidasen effizienter bei der Er-zeugung von Peroxocarbons�uren. Detaillierte Strukturana-lysen einer Haloperoxidase[40] und einer verwandten Estera-se[41] ergaben nur geringe Unterschiede in beiden aktivenZentren – die Gr�nde f�r die unterschiedliche Effizienz derbeiden Enzyme blieben offen.

Die katalytische Promiskuit�t spielt eine nat�rliche Rollebei der Synthese einer Reihe von Sekund�rmetaboliten:Beispielsweise erfolgt die Synthese des Antibiotikums Ce-phalosporin C in Eukaryoten durch ein einziges Enzym miteinem einzigen aktiven Zentrum. Dieses katalysiert zweiunterschiedliche Oxidationsreaktionen – die oxidative Ring-erweiterung des F�nfrings zum Sechsring und die Hydroxy-lierung einer Methylgruppe (Schema 8). Der Austausch ein-

zelner Aminos�uren kann zum Verlust der jeweiligen Akti-vit�ten f�hren.[42] Dagegen sind bei der Cephalosporinsyn-these in Prokaryoten f�r beide Schritte unterschiedlicheEnzyme verantwortlich. Diese beiden Enzyme sind aber naheVerwandte des bifunktionellen Enzyms aus Eukaryoten.Diese H�m-unabh�ngigen, Eisen(ii)- und 2-Oxoglutarat-ab-h�ngigen Enzyme k1nnen sogar drei Funktionen �berneh-men: Gibberellin-20-Oxidase katalysiert drei nachgeschalteteOxidationen der C-20-Methylgruppe: zu einem Alkohol,dann zu einem Aldehyd und schließlich zu einem Carboxy-lat.[43] Eine Clavamins�ure-Synthase katalysiert eine Hydro-xylierung, eine oxidative Cyclisierung und eine Desaturie-rung.[44]

Andere H�m-freie oxidative Dieisenenzyme katalysierenebenfalls ein breites Spektrum von Oxidationen. Beispiels-weise katalysiert eine pflanzliche Steroyl-Acyl-Carrierprote-in-D9-Desaturase nicht nur im Rahmen ihrer nat�rlichenFunktion die Desaturierung von Stearins�ure zu Qls�ure,sondern auch die Sulfoxidation von 9-Thia- oder 10-Thias-tearatanaloga[45] und die Hydroxylierung von 9-Fluorstearat-analoga.[46] Methanmonooxygenase, ein weiteres H�m-freiesDieisenenzym, katalysiert außer der Hydroxylierung vonMethan auch ein breites Spektrum weiterer Oxidationen,unter anderem Epoxidierungen, N-Oxidbildungen, Dehalo-genierungen und die Desaturatierung benzylischer Substra-te.[47] Degradationsenzyme wie Cytochrom P450, die eineEisenh�mgruppe enthalten, katalysieren ebenfalls ein breitesSpektrum an Oxidationen.

4. Katalytische Promiskuit t in modifiziertenProteinen

4.1. Nat*rliche Evolution neuer katalytischer Aktivit ten

Die divergente Evolution ist ein nat�rlicher Prozess, derunterschiedliche Spezies aus gleichen Vorfahren erzeugt.Dieser Vorgang findet auch auf der molekularen Ebene beider Generierung von Enzymen mit neuen katalytischenEigenschaften statt. Neue Enzymaktivit�ten entstehen durchGenduplikation, gefolgt von einer Evolution der neuenAktivit�t f�r die so erzeugte Kopie.[48] Zwei Vertreter f�reine divergente Evolution sind die Superfamilie der a/b-Hydrolase-Faltungsenzyme[49] und die der Enolasen.[50] DieEnzyme mit a/b-Hydrolase-Faltung basieren generell aufeiner nucleophilen Katalyse, umfassen aber ein breites Spek-trum an Substraten und Reaktionstypen. Hierzu geh1renEster- oder Peptidhydrolyse (Serin-Nucleophil), Dehaloge-nierung und Epoxidhydrolyse (Aspartat-Nucleophil). AlleEnolase-Enzyme haben �hnliche aktive Zentren und kataly-sieren mithilfe eines divalenten Metallions generell diebasenkatalysierte Abstrahierung eines Protons in a-Stellungzu einer Carbons�uregruppe unter Bildung eines Enolinter-mediates. Beispiele f�r unterschiedliche Reaktionen, die vonEnzymen der Enolase-Superfamilie katalysiert werden, sindRacemisierungen (Mandels�ure, N-Acylaminos�uren) und b-Eliminierungen (o-Succinylbenzoat-Synthase). Ein Beispielf�r ein falsch zugeordnetes Enzym ist bereits in Abschnitt 3erw�hnt.

Ein Beispiel f�r eine erstaunliche schnelle nat�rlicheEvolution einer neuen katalytischen Aktivit�t liefert eineAtrazin-Chlorhydrolase (Schema 9).[51] Urspr�nglich wurdebeobachtet, dass Atrazin – ein Herbizid, das seit den sp�tenf�nfziger Jahren verwendet wurde – im Boden nicht vollst�n-dig abgebaut wird. Seit 1953 finden sich jedoch eine Reihevon Berichten, die dessen raschen Abbau beschreiben. DasSchl�sselenzym f�r diese Biodegradation – Atrazin-Chlorhy-drolase, welche die C-Cl-Bindung spaltet – unterschied sichnur durch acht Aminos�uren von Melaminhydrolase, welchedie Hydrolyse der C-N-Bindung in Melamin katalysiert.Melaminhydrolase weist eine niedrige Atrazin-Chlorhydro-lase-Aktivit�t auf, das neue Enzym zeigt jedoch keine nach-weisbare Melaminhydrolase-Aktivit�t mehr. Durch gerichte-te Evolution konnte das Substratspektrum dieser Atrazin-Chlorhydrolase auf Substrate mit C-S- und C-O-Bindungenerweitert werden.[52] Ein weiteres Beispiel f�r eine raschenat�rliche Evolution ist die Entstehung einer Phosphotries-terase, die das Insektizid Paraoxon abbaut.[53]

Schema 8. Eine eukaryotische H'm-unabh'ngige, Eisen(ii)- und 2-Oxoglutarat-abh'ngige Cephalosporin-C-Synthase katalysiert zwei un-terschiedliche Reaktionen am selben aktiven Zentrum.

Schema 9. Atrazin-Chlorhydrolase ist in j!ngster Zeit durch nat!rlicheEvolution aus Melaminhydrolase entstanden. Die „'ltere“ Melaminhy-drolase (C-N-Bindungsspaltung) zeigt niedrige Atrazin-Chlorhydrolase-Aktivit't (C-Cl-Bindungsspaltung), aber die neue Atrazin-Chlorhydrola-se hat die F'higkeit zur Spaltung von Melamin verloren.


Chemie



4.2. Substitution des Metallions

Die Substitution eines Metallions kann ebenfalls diekatalytische Aktivit�t ver�ndern. Eines der �ltesten Beispieleaus dem Jahr 1976 zeigt, dass der Austausch des Zn2+-Ions imaktiven Zentrum einer Carboxypeptidase gegen ein Cu2+-Iondieses Enzym in eine langsame Oxidase �berf�hrt.[54] EinAustausch des Zn2+-Ions im aktiven Zentrum von Thermo-lysin gegen deutlich gr1ßere Ionen wie Wolfram-, Molybdat-oder Selenationen generiert Enzyme, die die Oxidation vonThioestern zu Sulfoxiden mit Wasserstoffperoxid erm1gli-chen.[55] Ein Austausch von Serin im aktiven Zentrum vonSubtilisin gegen Selenomethionin f�hrt zu Peroxidase-Akti-vit�t.[56]

Ein weiteres Beispiel f�r �berlappende katalytische Ak-tivit�ten sind saure Phosphatasen und Vanadium-abh�ngigeHaloperoxidasen.[57,58] Die Aminos�uresequenzen, dreidi-mensionalen Strukturen und aktiven Zentren sind in beidenEnzymklassen sehr �hnlich. Vanadat bindet vermutlich an diegleiche Position im Protein wie ein Phosphatester, weil esleicht eine Struktur mit einer f�nffachen Koordination desVanadiumzentrums einnehmen kann, analog zumObergangs-zustand der Phosphatesterhydrolyse. Das Vanadiumion kata-lysiert die Peroxidation durch Bindung des Peroxides an dasVanadiumzentrum, wodurch die Elektrophilie des Peroxideserh1ht wird. Die 2hnlichkeit der beiden aktiven Zentrenliefert auch eine Erkl�rung f�r die F�higkeit von Vanadium-salzen, Phosphatasen zu inhibieren, oder die Beobachtung,dass Phosphate Vanadium-abh�ngige Haloperoxidasen durchAustausch des Vanadiumions inaktivieren k1nnen.

Der Austausch der aktiven Zentren f�hrt auch zu einemAustausch der katalytischen Aktivit�t dieser beiden Enzym-klassen. Mehrere saure Phosphatasen zeigen nach Zugabevon Vanadiumionen eine niedrige Haloperoxidase-Aktivi-t�t,[59] und umgekehrt zeigen Apo-Haloperoxidasen eineniedrige Phosphataseaktivit�t.[60] Sheldon und Mitarbeiterberichteten �ber die enantioselektive Oxidation von Sulfidenzu Sulfoxiden durch eine Vanadiumion-substituierte Phyta-se.[61] Jedoch war der ver�nderte Biokatalysator deutlichweniger aktiv als das echte Enzym: Die Umsatzgeschwindig-keiten bez�glich der Haloperoxidase-Aktivit�t einer vanadi-umhaltigen Phosphatase waren 103–104-mal niedriger als dieeiner echten Haloperoxidase; Entsprechendes gilt f�r diePhosphatase-Aktivit�t der Apo-Haloperoxidase im Vergleichzur der einer echten Phosphatase. Diese großen Unterschiedebelegen erwartungsgem�ß, dass jedes Enzym f�r eine be-stimmte katalytische Aktivit�t optimiert ist. Es ist allerdingstrotz verf�gbarer R1ntgenstrukturdaten, wie im Falle deroben erw�hnten Esterasen und H�m-freien Haloperoxidasenoft nicht klar, welche Struktureigenschaften f�r die unter-schiedlichen optimierten Aktivit�ten verantwortlich sind.

4.3. Enzym-Engineering

Einige Arbeitsgruppen versuchten, die divergente Evolu-tion durch positionsgerichteteMutagenese nachzuahmen. EinVergleich verwandter Enzyme mit unterschiedlichen kataly-tischen Aktivit�ten erm1glichte die Identifizierung von Res-

ten, die zu einer ver�nderten katalytischen Aktivit�t f�hrten.Die Einf�hrung solcher Reste in eines dieser Enzyme �ndertedessen Aktivit�t; beispielsweise f�hrte die Substitution vonvier Aminos�uren in einer Fetts�uredesaturase gegen dieentsprechenden Reste einer Fetts�urehydroxylase zu einereffizienten Hydroxylase (Schema 10).[62] In einem anderen

Fall f�hrte der Austausch einer einzelnen Aminos�ure ineiner l-Ala-d/l-Glu-Epimerase zur Einf�hrung von ortho-Succinoylbenzoat-Synthase-Aktivit�t oder Mucons�ure-Lac-tonisierungs-Enzym-Aktivit�t.[63] Innerhalb der Familie vonGlutathiotransferasen entstand durch die Einf�hrung vonMutationen aus einer Transferase, die eine Michael-Additionkatalysiert, ein Enzym, das eine nucleophile aromatischeSubstitution katalysiert.[64] In gleicher Weise konnte eineSteroidisomerase-Aktivit�t in einer Glutathion-Transferasemit Peroxidase-Aktivit�t durch Einf�hrung von f�nf Muta-tionen erzeugt werden, die aus einer verwandten Steroidiso-merase abgeleitet waren.[65] Mutationen in einer Oxidosqua-len-Cyclase f�hrten zur Ver�nderung einer Position, die ander Abspaltung eines Protons beteiligt war, und damit zuunterschiedlichen Steroiden.[66]

Eine wesentlich schwierigere Aufgabe ist die Oberf�h-rung eines nicht katalytisch aktiven Proteins in eine Dehy-dratase mit niedriger Aktivit�t.[67]

4.4. Glycosynthasen, Thioglycoligasen und Thioglycosynthasen

Konfigurationserhaltende b-Glycosidasen katalysierennormalerweise die Hydrolyse von b-glycosidischen Bindun-gen unter Retention der Konfiguration, katalysieren aberauch den Glycosid-Austausch in Systemen mit niedrigemWassergehalt. Die Reaktion startet ausgehend von einem b-Glycosid (Zucker-OR), das mit einem Nucleophil (HOR’)reagiert (Schema 11). Bei einer Hydrolyse ist dieses Nucleo-phil Wasser und bei Glycosidaustauschreaktionen ein zweitesGlycosid. Diese Glycosidasen verwenden einen zweifachenVerdr�ngungsmechanismus mit einer katalytischen S�ure/Base und einem katalytischen Nucleophil. Im ersten Schrittentsteht ein a-verkn�pftes, kovalent gebundenes Intermediatdurch Angriff des katalytischen Nucleophils an das b-Glyco-

Schema 10. Sowohl Desaturasen als auch Hydroxylasen haben ein Di-eisenzentrum und oxidieren Jls'ure an der C-12-Position. Vier Muta-tionen in der Desaturase !berf!hrten diese in eine Hydroxylase.




sid. Die katalytische S�ure unterst�tzt diesen Schritt durchProtonierung der Abgangsgruppe. Im zweiten Schritt wirddieses kovalent gebundene Intermediat durch einen basen-unterst�tzten Angriff des eintretenden Nucleophils – Wasseroder ein weiteres Glycosid – freigesetzt.

Durch die Ausschaltung von Schl�sselschritten in diesemMechanismus kreierten Withers und Mitarbeiter drei neueKatalysatortypen (Schema 12). Der erste Typ, Glycosyntha-sen, entstand durch Entfernung des katalytischen Nucleophils(z.B eine Glu-zu-Ala-Mutation).[68] Dies verhindert die Bil-dung des kovalent gebundenen Intermediates und f�hrt zu

einem stark ver�nderten Mechanismus. Normale Glycosidereagieren nicht mehr, a-Glycosylfluoride reagieren jedoch,vermutlich �ber einen direkten Austauschmechanismus. Gly-cosynthasen bilden analog zum Ausgangsenzym b-glycosidi-sche Bindungen. Allerdings katalysieren Glycosynthasen

nicht mehr die Hydrolyse des Produktes, eines nicht-aktivier-ten Glycosids, und folglich k1nnen h1here Ausbeuten erreichtwerden. F�nf verschiedene Glycosynthasen wurden beschrie-ben, die unterschiedliche Spezifit�ten und Regioselektivit�-ten (Bildung von b-1,3- oder b-1,4-Bindungen) gegen a-Glycosylfluoride zeigten. Der zweite Typ neuer katalytischerAktivit�t, die Thioglycoligase-Aktivit�t, kann durch Entfer-nung der katalytischen S�ure/Base erhalten werden.[69] EineAufgabe dieser katalytischen S�ure/Base ist die Aktivierungdes eintretenden Nucleophils. Die Entfernung dieses Aktiva-tors schließt eine Reaktion mit normalen eintretenden Nuc-leophilen aus und verlangt starke Nucleophile wie Thiole. DerAustausch einzelner Aminos�uren in einer b-Glycosidase ausAgrobacterium sp. Abg (Mutation: E171A) ergab eine Vari-ante, die S-glycosidisch-verkn�pfte Produkte in hohen Aus-beuten erzeugt (Schema 13). Mit dem Wildtypenzym konntekein Produkt gebildet werden, vermutlich aus sterischenGr�nden wegen des großen Schwefelatoms. Schließlich f�hrtedie Entfernung sowohl des katalytischen Nucleophils als auchder katalytischen S�ure/Base zu einer Thioglycosynthase, dienur ein a-Glycosylfluorid und einen Thiolacceptor umsetzt.[70]

5. Zusammenfassung und Ausblick

Katalytische Promiskuit�t in Enzymen kommt 1fter vorals allgemein angenommen. Die H�ufung katalytischer Restein einem aktiven Zentrum kann zur Akzeptanz alternativerfunktioneller Gruppen im Substrat und zu alternativen Re-aktionswegen f�hren. Kleine 2nderungen im aktiven Zen-trum k1nnen die Bandbreite alternativer Reaktionswegezus�tzlich enorm erweitern. In vielen, aber nicht in allenF�llen sind diese alternativen Reaktionswege langsamer alsdie nat�rliche Reaktion. Wir hoffen, dass dieser Kurzaufsatzdazu anregt, intensiver nach neuen Beispielen f�r katalytischeVerwandtschaft bekannter Enzyme zu suchen und die ver-f�gbaren Methoden des Protein-Engineerings und der ge-richteten Evolution f�r die Erweiterung pr�parativer An-wendungen von Enzymen zu nutzen.

Schema 11. Der Glycosidaustausch durch konfigurationserhaltende b-Glycosidasen ist charakterisiert durch einen zweifachen Austausch: EinGlycosyldonor (b-Zucker-OR) bildet ein a-verkn!pftes Glycosylenzym,das dann mit einem eintretenden Nuclophil (HOR’) unter Bildung ei-ner neuen b-glycosidischen Bindung (b-Zucker-OR’) reagiert.

Schema 12. Durch Ausschalten von Schl!sselschritten konnten neuekatalytische Aktivit'ten f!r eine konfigurationserhaltende b-Glycosidasegeschaffen werden. Die Entfernung des katalytischen Nucleophils er-zeugt eine Glycosynthase, von der nur a-Glycosylfluoride akzeptiertwerden, vermutlich !ber einen direkten Austauschmechanismus. DieEntfernung der katalytischen S'ure/Base ergab eine Thioglycoligase(nur starke eintretende Nucleophile wie Thiole reagieren). Die Entfer-nung sowohl des katalytischen Nucleophils als auch der katalytischenS'ure/Base f!hrt zu einer Thioglycosynthase (nur a-Glycosylfluorideund starke eintretende Nucleophile reagieren). DNP=2,4-Dinitrophe-nyl.

Schema 13. Eine Thioglucoligase ohne katalytische S'ure/Base kataly-siert keine Hydrolyse mehr. Bei Verwendung eines aktivierten Gly-cosyldonors kann des Fehlen des Protonendonors ausgeglichen wer-den. Der Einsatz eines nucleophilen Thiols ersetzt die fehlende Base,die das eintretende Nucleophil aktiviert. Folglich katalysiert diese Mu-tante nun die Bildung einer S-glycosidischen Bindung. pNP=4-Nitro-phenyl.


Chemie



Wir danken Bernhard Hauer (BASF, Ludwigshafen) f*rn*tzliche Hinweise und Diskussionen. U.T.B. dankt demFonds der Chemischen Industrie f*r finanzielle Unterst*tzung.

Eingegangen am 22. April 2004Online ver1ffentlicht am 2. November 2004

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Untreue Enzyme in der Biokatalyse: mit alten Enzymen zu neuen Bindungen und Synthesewegen