Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 39
Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reproduk ční biotechnologie
Autoři
Ing. Marie Machatková, CSc
Ing. Michal Ješeta, Ph.D.
MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová
Mgr. Kateřina Hanzalová
ISBN 978-80-86895-32-1
2013
.
Uplatněná certifikovaná metodika
Diferencované zrání bovinních oocytů využitelných pro reprodukční biotechnologie
Autoři
Ing. Marie Machatková, CSc
Ing. Michal Ješeta, Ph.D.
MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová
Mgr. Kateřina Hanzalová
2013
1
OBSAH
I) Úvod 2
II) Cíl metodiky 3
III) Vlastní popis metodiky 3
IV) Srovnání novosti postupů 5
V) Ekonomické přínosy 6
VI) Popis uplatnění metodiky 6
VII) Seznam použité literatury 7
VIII) Seznam publikací předcházejících metodice 8
IX) Dedikace metodiky 9
X) Návrh oponentů 9
2
I) Úvod
Aplikace biotechnologií v oblasti šlechtění hospodářských zvířat umožňují efektivněji
využít genetický potenciál chovatelsky cenných jedinců, rozšířit kombinace rodičovských
párů a modifikovat populaci zvířat požadovaným směrem pomocí nových šlechtitelských
strategií. V rámci probíhajících šlechtitelských programů jsou embrya skotu získávána
především opakovanou superovulací geneticky cenných donorek a přenášena do geneticky
bezcenných příjemkyní (MOET).
Relativně novou biotechnologickou metodou, která však již našla v oblasti šlechtění
skotu své specifické uplatnění, je metoda zrání (IVM), fertilizace (IVF) a kultivace (IVC)
oocytů in vitro a produkce in vitro embryí (IVP). Tato metoda umožňuje produkovat
geneticky cenná embrya v laboratoři z oocytů získaných buď v průběhu života donorky
technikou transvaginální aspirace (OPU) nebo post mortem po vyřazení donorky z důvodu
stáří, neplodnosti nebo jiných poruch zdraví (Machatková et al 2000, 2006, 2008). Z
celkového počtu embryotransferů, které jsou každoročně provedeny v Evropě, představují
přenosy embryí získaných metodou OPU/IVF více než 10% (Knijn, 2012). V chovatelsky
vyspělých zemích, především v Nizozemsku, Francii, Německu nebo Itálii, je metoda
OPU/IVF úspěšně kombinována s metodou hormonální superovulace dárkyní.
Předpokládá se, že produkce OPU/IVF embryí v budoucnu nahradí embrya získaná
superovulací, poněvadž umožňuje vyloučit negativní dopady superovulace na zvířata i životní
prostředí. Proto se většina subjektů, které chovatelům v EU poskytují služby v oblasti
reprodukce a šlechtění skotu, metodami produkce embryí in vitro intenzivně zabývá a ve
spolupráci s výzkumnými pracovišti je dále rozvíjí (Smidt a Niemann 1999, Merton et al
2003, Heyman 2005). Ve srovnání s embryi produkovaných pro experimentální účely je však
vývoj embryí požadovaného genotypu do přenosuschopných stádií stále málo efektivní.
Nezralé oocyty získané od hormonálně neošetřených krav jsou vysoce heterogenní
populací z hlediska meiotické a vývojové kompetence, to je schopnosti dokončit zrání a
vyvíjet se po oplození. Relativně malá část oocytů (průměrně 25%), které pocházejí z folikulů
o velikosti 6 - 10 mm, je schopna za standardních podmínek kultivace dosáhnout jaderné i
cytoplazmatické zralosti a poskytnout vyšší podíl embryí. Převážná část oocytů (průměrně 75
%), které jsou získány z folikulů o velikosti 3-5 mm, vykazuje relativně nízkou úroveň
cytoplazmatického zrání a produkce embryí.
3
Jedním z důvodů je nižší energetický potenciál vývojově méně kompetentních oocytů,
které nejsou schopny během svého zrání dostatečně aktivovat své mitochondrie, zajistit
mitochondriální reorganizaci a vyprodukovat potřebné zásoby adenosin-trifosfátu (ATP).
V naší nedávné studii jsme potvrdili, že zralé, vývojově méně kompetentní oocyty jsou
deficitní z hlediska některých mitochondriálních funkcí a produkce ATP (Machatková et al
2012). Přitom obsah ATP v cytoplazmě fertilizovaných oocytů je velmi významný pro
úspěšný průběh oplození a nástup embryonálního vývoje. Relativně nízký podíl
cytoplazmaticky zralých oocytů s nedostatečnými zdroji energie patří mezi základní
problémy, které limitují využití metody IVP embryí , jak v oblasti šlechtění skotu, tak i
v dalších oblastech reprodukčních biotechnologií. Aby bylo možno získat požadovaný počet
embryí od geneticky cenných rodičů, je nezbytné zvýšit kvalitu cytoplazmy zralých oocytů.
Navrhovaná metodika je založena na dvoustupňové izolaci oocytů a diferenciaci
podmínek zrání na základě jejich vývojové kompetence. Umožňuje zvýšit energetický status
vývojově méně kompetentních oocytů a zlepšit kvalitu jejich cytoplazmy na základě aktivace
jejich mitochondrií pomocí specifického stimulans. Stav zralých oocytů je významný pro
zvýšení účinosti normálního oplození, vývoje oplozených oocytů do přenosuschoných
embryonálních stádií a zachování vývojové schopnosti embryí po embryotransferu.
II) Cíl metodiky
Záměrem předložené metodiky bylo zlepšit kvalitu vývojově méně kompetentních
oocytů skotu na úroveň vývojově více kompetentních oocytů. Finálním cílem metodiky bylo
vyvinout efektivnější postup zrání pro vývojově méně kompetentních oocyty, které budou
využitelné pro produkci embryí od geneticky cenných rodičů i v dalších oblastech
reprodukčních biotechnologií.
III) Vlastní popis metodiky
1.1 Příprava donorek oocytů
Před odběrem oocytů je nezbytné nejdříve ověřit reprodukční status donorky
sonografickým vyšetřením. Podle nálezu na ováriích indukovat říji, využít lze i říji spontánní.
Nástup říje potvrdit rutinní kontrolou, ovulaci a růst folikulární vlny je vhodné opět ověřit
sonograficky. Oocyty mohou být aspirovány opakovaně, 5 - 6 krát v jednom cyklu.
4
U březích krav je možno využít folikulární vlny vznikající na ováriích spontánně mezi
60. - 90. dnem březosti.
Pokud jsou jako donorky oocytů používány vyřazené krávy post mortem je vhodné
pohlavní cyklus synchronizovat.
1.2 Odběr a izolace oocytů
1.2.1 Technika OPU
Folikuly o velikosti od 3 mm do 5 mm jsou punktovány a oocyty jsou aspirovány do
zkumavky s ekvilibrovaným Tyrodovým médiem. Aspirační médium s folikulární tekutinou
je filtrováno přes nylonový filtr (Uhelon 130 extra) o porezitě 100 μm, na kterém jsou
aspirované oocyty zachyceny.
1.2.2 Post mortem
Vaječníky jsou transportovány do laboratoře v termosce při teplotě mezi 30-35°C.
Ovária jsou nejdříve dekontaminována opakovaným oplachem sterilní redestilovanou vodou a
následně fyziologickým roztokem PBS-Dulbecco s antibiotiky.
Nejdříve jsou punktovány folikuly o velikosti 6-10 mm, ze kterých jsou aspirovány
vývojově více kompetentní oocyty. Následně jsou technikou disekce ovariálního cortexu
otevřeny folikuly o velikosti 3-5 mm, ze kterých jsou vyplaveny vývojově méně kompetentní
oocyty. Obě subpopulace jsou zachyceny na filtru a uchovávány odděleně po celou dobu
manipulace.
1.3. Selekce nezralých oocytů
Izolované oocyty jsou přeneseny do média TCM-199, a hodnoceny na základě své
morfologické kvality. Pro zrání jsou selektovány oocyty s ukončeným růstem, o velikosti 130
μm, bez výraznějších defektů v cytoplazmě, obklopené intaktní zonou pellucidou a coronou
radiatou a nejméně jednou vrstvou buněk cumulu.
1.4 Diferencované zrání oocytů
Oocyty jsou přeneseny do jamek mikroplotny, ve které jsou kultivovány při teplotě
38,5°C, v atmosfeře vzduchu s 5 % CO2 po dobu 24 hodin.
Vývojově více kompetentní oocyty zrají za standardních podmínek. U vývojově méně
kompetentních oocytů je zrací médium nejdříve ekvilibrováno po dobu 1 hodiny, kdy je
5
přidáno mitochondriální stimulans a pH média je upraveno na hodnotu 7,1. Následně je
médium ekvilibrováno po dobu 2 hodin.
1.5 Optimalizace oplození oocytů
Před oplozením je nezbytné testovat fertilizační schopnost spermií potenciálních otců
embryí a optimalizovat podmínky oplození pomocí oocytů běžné populace jatečných krav
(Machatková et al 2009).
Po rozmrazení inseminačních dávek ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 60 sekund
je sperma podvrstveno v množství 25 μl pod 1000 μl modifikovaného Tyrodova média (SP-
TALP). Motilní spermie jsou ze spermatu izolovány metodou swim up probíhající při teplotě
38,5°C po dobu 1 hodiny. Pro oplození oocytů je použito modifikované Tyrodovo médium
(IVF-TALP) obsahující 1x106 spermií/ml a 10 μg/ml heparinu jako kapacitační agens.
1.6 Kultivace raných embryí
Za 20 -24 hodin po oplození jsou oocyty zbaveny kumulárních buněk a potencionální
zygoty jsou přeneseny na buněčný monolayer stabilní linie BRL (Buffalo rat liver cells ATCC
USA) Pro kultivaci je používáno kultivační medium B2 Menezo s 10% estrálního bovinního
séra, ve kterém se embrya vyvíjejí do přenosuschopných stádií při teplotě 39°C, v atmosféře
vzduchu s 5% CO2.po dobu 7 -8 dnů.
IV) Srovnání novosti postupů
V současné době jsou ooocyty skotu izolovány a během zrání jsou kultivovány za
standardních podmínek nezávisle na jejich meiotické a vývojové kompetenci. Z tohoto
důvodu je účinnost oplození a embryonálního vývoje vysoce variabilní v závislosti na použité
populaci oocytů, což vede k nestandardní kvalitě zralých oocytů a nízkému podílu
vyvíjejících se embryí.
Navržená metodika řeší problém nedostatečných energetických zásob u zralých
bovinních oocytů používaných pro reprodukční biotechnologie. Její podstatou je
dvoustupňová izolace oocytů a diferenciace podmínek jejich zrání na základě meiotické a
vývojové kompetence. Vývojově méně kompetentních oocyty zrají za podmínek, kdy dochází
k aktivaci mitochondrií a následně ke zvýšené mitochondriální reorganizaci a produkci ATP.
Specifická stimulace mitochondriálních funkcí pozitivně ovlivňuje energetické zásoby zralých
oocytů, a tím zlepšuje kvalitu jejich cytoplazmy.
6
Nový způsob zrání umožňuje zlepšit energetický stav vývojově nízce kompetetních
oocytů oocytů, zvýšit efektivnost jejich fertilizace i embryonálního vývoje. Výsledkem zrání
podle navržené metodiky jsou nejen z hlediska cytoplazmy kvalitnější oocyty ale i účinnější
penetrace spermií do oocytů, rychlejší syngamie obou prvojader a nástup dělení. Podíl zralých
a normálně oplozených oocytů se zvyšuje průměrně o 10 %, podíl raných embryí stoupá o
více než 20 % a podíl embryí využitelných k embryotransferu se zvyšuje průměrně o 30 %.
Navržená metodika přispívá k efektivnějšímu využití vývojově méně kompetentních
oocytů, které v populaci oocytů získaných od nesuperovulovaných donorek převažují.
Zvyšuje se účinnost normálního oplození těchto oocytů, a tím i pravděpodobnost získání
požadovaného počtu embryí využitelných jak ke kryokonzervaci tak i přímému
embryotransferu.
V) Ekonomické přínosy
Finanční náklady na zavedení metody diferencovaného zrání bovinních oocytů nejsou
vysoké. Pokud pracoviště již disponuje laboratorním vybavením zaměřeným na přípravu IVP
embryí, zvyšují se náklady na produkci těchto embryí maximálně o 5 %. V této částce jsou
zahrnuty především náklady na jednorázové sety používané při dvoustupňové izolaci oocytů a
náklady na přípravu specifických aditiv do zracích médií.
Výsledný ekonomický přínos metodiky přípravy embryí skotu z oocytů zrajících za
diferencovaných podmínek bude záviset na intenzitě produkce embryí v laboratoři a
dosahované úrovni embryonálního vývoje.
Pokud vycházíme z předpokladu, že pomocí metodiky lze průměrně zvýšit podíl
přenosuschopných embryí až o 30 %, potom náklady na přípravu jednoho embrya se
adekvátně sníží. Celkový ekonomický přínos bude závislý na genetické hodnotě a tržní ceně
vyprodukovaných embryí.
V) Popis uplatnění metodiky
V navržené metodice je popsán efektivnější způsob zrání vývojově méně
kompetentních oocytů skotu v podmínkách in vitro pomocí aktivace jejich mitochondrií
specifickým stimulans. Zvýšení energetických zásob u zralých oocytů zvyšuje účinnost
oplození i embryonálního vývoje.
Modifikovaný způsob zrání lze využít především u oocytů získaných od geneticky
cenných donorek, které jsou oplozovány spermiemi špičkových býků, kdy podíl zralých a
7
normálně oplozených oocytů je rozhodující pro zisk embryí požadovaného genetického
původu.
Významný přínos může mít metodika také při produkci embryí uchovávaných jako
genové zdroje a ohrožených živočišných druhů, kdy zdroje oocytů jsou značně limitovány.
Efektivnější metoda zrání je aplikovatelná i v rámci vývoje technologicky
náročnějších reprodukčních metod, jako jsou klonování a transgeneze, které vyžadují kvalitní
zralé oocyty a progresivně se vyvíjející raná embrya.
Metodika je určena jak výzkumným pracovištím produkujícím experimentální embrya
skotu pro řešení svých experimentálních záměrů tak i specializovaným laboratořím, které se
zabývají produkcí embryí požadovaného genetického původu v rámci služeb chovatelům
v oblasti reprodukce a šlechtění skotu včetně embryotransferu.
VI) Seznam použité literatury
Heyman Y. Nuclear transfer: a new tool for reproductive biotechnology in cattle.
Reprod Nutr Dev, 2005, 45: 353–361.
Knijn, H. National statistical data of embryo transfer activity in Europa (2011). In:
Proceeding of the 28th A.E.T.E. Annual Meeting – Saint Malo, France, 7th-8th
September 2012; 43-53.
Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of
oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the
production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-
238.
Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In
vitro production of embryos from high performance cows and the development of
frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-
364.
Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of
the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production.
Theriogenology. 2000; 54:543-550
Merton J.S., de Roos A.P.W., Mulaart E., de Ruigh L., Kaal L., Vos P.L.A.M.,
Dieleman S.J. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application
of embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology. 2003, 59:
651-674
8
Smidt D., Niemann H. Biotechnology in genetics and reproduction. Lives Prod Sci.
1999, 59: 207-221
VII) Seznam publikací autorů, které předcházely metodice
Machatkova M., Ješeta M., Hulinska P., Knitlova D., Nemcova L., Kanka J.
Characteristics of bovine oocytes with different meiotic competence in terms of their
mitochondrial status and expression of nuclear-encoded factors. Reprod Dom Anim,
2012, 47:806 – 814.
Kanka, J., Nemcova, L., Toralova, T., Vodickova-Kepkova, K., Vodicka, P., Jeseta
M., Machatkova, M. Association of the transcription profile of bovine oocytes and
embryos with developmental potential Anim Reprod Sci 2012, 134(1-2): 29-35.
Machatková M., Ješeta M., Hulínská P., Rečková Z., Hanzalová K. (2009): Predikce
fertility býků in vitro pomocí penetračního testu, metodika certifikována MZe dne
24.8.2009
Machatkova M., Hulinska P., Reckova Z., Hanzalova K., Spanihelova J. Pospisil R. In
vitro production of embryos from high performance cows and the development of
frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Vet Med Czech, 2008, 53, 358-
364.
Machatkova, M., Hanzalova, K., Horakova, J., Reckova, Z., Hulinska, P. Collection of
oocytes from donors in the growth phase of follicular development can enhance the
production of bovine embryos for cryopreservation. Vet Med-Czech 2006, 51, 232-
238.
Machatkova M, Krausova K, Jokesova E, Tomanek M. Developmental competence of
bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular wave on in vitro
embryo production. Theriogenology. 2004; 61, 329-335.
Machatkova M, Jokesova E, Horky F, Krepelova A. Utilization of the growth phase of
the first follicular wave for bovine oocyte collection improves blastocyst production.
Theriogenology. 2000; 54:543-550
9
VIII) Dedikace
Metodika vznikla na základě metodických poznatků získaných v průběhu řešení
projektu NAZV QI91A018(50 %) a výzkumného záměru MZE 0002716202 MZe ČR (50%).
Podíl práce autorů: Ing. Marie Machatková, CSc (30%), Ing. Michal Ješeta, Ph.D. (30%),
MVDr. Drahomíra Čtvrtlíková Knitlová (20%), Mgr.Kateřina Hanzalová (20%).
IX) Návrh oponentů
MVDr. Jan Bažant
SVS ČR
Slezská 7
120 56 Praha 2
Doc. MVDr. Radko Rajmon Ph.D.
Katedra veterinárních disciplin
FAPPZ, ČZU
Kamýcká 129
Praha 6 - Suchdol