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USO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA EL SEGUIMIENTO DE

DIGESTORES A ESCALA INDUSTRIALNombre: Rolando Chamy, Oscar FranchiInstitución: Núcleo Biotecnología Curauma-PUCV

3er curso RED TRITÓNValparaíso (Chile) 26-julio-2017

Digestión anaerobia


Biogás

Energía (electricidad, calor)

Residuos orgánicos- Municipales- Industriales

Digestor anaerobioDigestato

Partículas orgánicas100% DQO

Hid

róli

sis

Ferm

en

tac

ión

Oxi

da

ció

nA

na

ero

bia

Acetotróficas Hidrogenotróficas

carbohidratosproteínas lípidos

aminoácidos, azúcares ácidos grasos

Productos intermedios

propionato, butirato...alcoholes

hidrógeno, CO2acetato

metano

An

tece

de

nte

s



Parámetros en Control de ProcesoParámetros en Control de Proceso

•Ácidos Grasos intermedios

•Presión parcial de Hidrogeno

•Relaciones DQO v/s AGV

•Relaciones C/N

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Ácidos Grasos Intermedios

Ácidos Grasos Volátiles

(AGV)

Productos mayoritarios del proceso anaerobio

Parámetro eficaz para indicar la evolución del proceso

Parámetro de rápida respuesta ante variaciones del sistema

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Ácidos Grasos Intermedios

Acumulación AGV

Velocidad degradación por

alguna causa adversa

Siempre Significa Desestabilización del

proceso

Producción Biogás

•Sobrecarga

•Variación pH

•Falta de nutrientes

•Presencia substancias tóxicas

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



DIFERENCIAS ENTRE REACTOR RILES Y

REACTOR LODOS



Líquido Sólido

VCO Kg DQO/m3 d Kg SV/m3 d

TRH horas días

TRS meses TRH=TRS

Sólido mg DQO/lt Kg SV/m3

V reactor unitario

100-500 m3 1000-10000 m3

Carga continua Semi-continua

Agitación externa

Innecesario Necesaria

Reciclo En general necesario ocasional



Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Presión Parcial de Hidrógeno

Debe mantenerse baja para permitir ladegradación de algunos compuestos intermediariosque de otra forma no sería posible por tratarse dereacciones termodinámicamente desfavorables en

condiciones estándar.

(10-4, 10-5 atm)Presión Parcial H2≈ P

arám

etro

s d

e p

roce

so



Principal inhibidor de la Acetogénesis

Presión Parcial H2

Acumulación sustratos intermediarios

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Presión Parcial de Hidrógeno

Relaciones C/N

� Una de las ventajas de Digestión Anaerobia es la baja necesidad de nutrientes

� Una relación teórica aceptable es C/N entre 15-30/1

� Un exceso de compuestos nitrogenados puede afectar el proceso

Acumulación Amoniaco

Desestabilización de la Digestión

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Aspectos HidrodinámicosAspectos Hidrodinámicos

Influyen en el desempeño de los procesos que se llevan acabo durante el tratamiento. Por tanto, el conocimiento dela hidrodinámica del sistema permitirá mejorar su eficienciay estabilidad.

• Características de flujo

• Régimen de mezcla

• Tiempos de residencia

• Geometría del reactor

Par

ámet

ros

de

pro

ceso



Reactores Mezcla Completa Reactores Mezcla Completa

F F

Del balance de células y dado que se opera a volumen cte:

( ) XXXV

F

dt

dX µ+−= 0

V

FD =

•Velocidad de dilución cte

•Velocidad de crecimiento microorganismos cte

µ=

µ=

Re

acto

res



“Ecología Microbiana” herramienta en

bioprocesos

Abrir “black box”

� Fundamental interés

� Interés aplicado: Herramienta de gestiónde operación (previsión , diagnostico, control)

Técn

icas

mo

lecu

lare

s

Estudio de microorganismos en bioprocesos


Microorganismos

Aproximadamente se

conocen solo 7000

Técnicas moleculares

Escala laboratorio

Escala industrial



En plantas de tratamiento de aguas:

- Floculos (lodos activos)

- Biofilms, tratamientos aerobios

- Sistemas anaerobios

Microorganismos

Técnicas moleculares



En la digestión anaerobia participan bacterias y arqueas


Materia orgánicasuspendida

Orgánicos solubles

Ácidos grasos volátiles

Acetato H2, CO2

CH4 + CO2

Hidrólisis

Acidogénesis

Acetogénesis

Metanogénesis

Bacterias fermentativas

Bacteriasacetogénicas

• Methanosarcinaceae

• Methanosaetaceae

• Methanobacteriales

• Methanomicrobiales

Arqueas metanogénicas

Técnicas moleculares para el estudio de Digestores anaerobios


¿Por qué es importante el estudio de los microorganismos en el proceso de digestión anaerobia?

• Establecer correlaciones entre la dinámica microbiana y la dinámica funcional de los digestores

• Encontrar indicadores tempranos de inestabilidad en el sistema

• Establecer nuevos parámetros de monitoreo y control

• Diseñar estrategias operacionales que mejoren la eficiencia del proceso en base a una configuración microbiana específica



• Representativa (lugar y homogénea, UASB, CSTR)• Bien preservada (transporte en frío/hielo seco, congelada,

N2 líquido, RNA later)

• Con reactivos estandarizados (kits)• Si no es en fresco, extraer muestras el

mismo día

• Integridad • Concentración de ADN/ARN• Pureza (inhibidores de PCR)

Muestreo de lodo del digestor

Extracción de ácidos nucleicos

Determinación calidad y cantidad

ADN/ARNFijación

Procedimiento general para estudiar microorganismos en lodos

• Secuenciación(16S ARNr, WGS)

• qPCR(microorganismoso genes funcionales)• FISH



Extracción de ácidos nucleicos

Muestra de lodo

(buffer de lisis, esferas)

3- Retención de ADN/ARN

4- Eliminación de materia orgánica e inorgánica remanente (etanol)

5- Elución con buffer TE o agua libre de nucleasas

1- Lisis de células

(columna de sílice en ambiente salino)

2- Precipitación de sustancias húmicas y proteínas

ADN/ARN

Fenol/cloroformo

Precipitación Ac. nucleicos con isopropanol

Adicionalmente para extraer ARN



• Extracciones más eficientes al combinar ruptura química y física (Lebuhn et al., 2016)

UltraClean® Soil DNA Isolation Kit

QIAamp DNA Stool Mini Kit

FastDNA™ SPIN Kit for Soil88.24%

60.58%

37.48% Buffer de lisis

Buffer de lisis + esferas

Eficiencias de extracción

• Los métodos enzimáticos sin disrupción mecánica tienen baja recuperación de bacterias gram positivas (Kennedy et al., 2014)



Determinación de la calidad del material genético

Posible degradación de ADN o ARN debido a presencia de nucleasas

ADN ARN (gel desnaturalizante)

23S

16S

Electroforesis en gel de agarosa

Razón de intensidad 23S/16S ~ 2



RIN: Número de integridad del ARN

Intacto

Degradación parcial

Degradación alta

RIN = 10

RIN = 5

RIN = 3

Bioanalyzer



• Valores bajos = proteínas, fenoles, etc.

Pureza del material genético:

Nanodrop

• Razones de absorbancia

- 260/280 nm: ADN puro ~ 1.8 ARN puro ~ 2.0

- 260/230 nm: Usualmente mayores que 260/280 nm.

• Valores bajos = contaminantes (Trizol, guanidina, ácidos húmicos)



Las tecnologías de secuenciación avanzan de forma exponencial

Las más utilizadas actualmente



Tecnología Ion Torrent Illumina 454

Tiempo de secuenciación (h)1 3 24 8

Largo de sequencia1 400 300 700

Cantidad datos generados (Mb)1 1.000 1.500 35

Tasa de error (%)2 1,47 0,92 1,06

1. Liu et al. (2012)

2. D´Amore et al. (2016)

Cada tecnología tiene sus ventajas y desventajas



Tecnologías de tercera generación

MinION (Oxford nanopore tech.)



Tecnologías de tercera generación

PacBio



Secuenciación

Gen 16S ARNr

Todo el material genético

• Abundancia relativa de los microorganismospresentes

• Abundancia relativa de los genes y microorganismos presentes

Extracto de ADN

Configuración poblacional

Configuración poblacional y funcional

El producto final del proceso de secuenciación



Secuenciación

16S ARNr

Todo el material genético(WGS)

• Nivel de actividad de los microorganismospresentes

• Nivel de actividad de los genes y microorganismos presentes

Extracto de ARN

Tanscripción reversa

ADNc



Secuenciación del amplicon 16S ARNr

Hasta el día de hoy el más utilizado en estudios de D.A.- Más económico, procesamiento de datos menos complejo.- Sesgo asociado a PCR, sin información funcional.

Región hipervariable % Publicaciones 2016-2017

V1-V2 8

V1-V3 8

V3-V4 16

V3-V5 8

V4 42

V4-V5 9

V5-V6 8

Tremblay et al. (2015): Región V4 describe con mayor exactitud la comunidadmicrobiana en muestras de lodo anaerobio



qPCR

DNA polimerasa

dNTPs (A, T, C, G)

Partidores

ADN o ADNc

reactantes

catalizador

Sybr Green o sonda fluorescente

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

Utilidad: Determinar la dinámica de microorganismos (bacterias y arqueas) mediante la cuantificación del número de copias de un gen.

Señal fluorescente de producto



qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

• El número de copias del gen en la muestra es determinado por interpolación del Cqen una curva estándar (cuantificación absoluta).

108 107106105104103

Cq

• Cinética monitoreada en tiempo real, valor de Cq inversamente proporcional al número de copias inicial.



qPCR

16S ARNr

Genes funcionales

Grupo de arqueas1

Extracto de ADN (abundancia)

Metanógenos (mcrA)2

Acetógenos (fths)3

Degradadores de aromáticos (bamA)4

Familias: Methanosarcinaceae

Methanosaetaceae

Ordenes: Methanomicrobiales

Methanobacteriales

Extracto de ARN (actividad)

1: Yu et al. (2005) 2: Morris et al. (2014) 3: Xu et al. (2009)4: Kuntze et al. (2011)



Ventajas1- Cuantificación de muchas muestras en corto tiempo 2- Barato en comparación a la secuenciación.

Deventajas

1- La información se limita al microorganismo o gen que se quiere cuantificar.2- Puesta a punto del ensayo puede demorar (diseño de partidores, programa térmico especial, etc.)3- El número de copias incluye también el contenido en células muertas

qPCR



Otros usos

Propuesto como técnica de fingerprinting rápida para determinar cambios en las poblaciones metanogénicas (Kim y Lee, 2014)

High resolution melting:

Productos de PCR poseen un punto de melting característico



Casos prácticos de estudio de comunidades microbianas en digestores sometidos a un cambio

operacional

Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a unadisminución de temperatura


¿Qué ocurre al disminuir la T en un digestor industrial?

¿Cuál es el efecto en la comunidad microbiana?



- Volumen: 3.000 m3

- TRH: 34 d- VCO: 0,82 kg SV/m3/d - 35 °C (digestor control)

• Digestor control y experimental• Efecto de la T sobre la producción de metano

1 2 3 4 5 6 7 8



Muestras de lodo

Extracción ADN

Seq 16S ARNr (V4-V5)

FROGS

- 80 °C

CAJ, ACP (XLSTAT)

Caso práctico 1: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de temperatura


B-3B-6B-4B-5B-7A-2B-2A-1B-1A-8B-8A-5A-3A-4A-6A-7

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Bray-Curtis dissimilarity

• Las comunidades microbianas cambian con la temperatura

• Forman un clúster separado aquellas muestras tomadas a baja T



Al restaurar T en B, comunidad microbiana similar a control (resiliencia)



Pearson: algunos OTUs se correlacionan con variables operacionales



Abundancias relativas de arqueasControl Experimental



Correlación negativa Woesearchaeota (sedimentos, aguas superficiales) y Tpositiva con Methanospirillum (hidrogenotróficas)

Caso práctico 1: Conclusiones


• Esta perturbación generó un cambio en la comunidadmicrobiana del reactor, lo cual, podría explicar en parte elcambio en su desempeño

• La disminución de temperatura causa una baja en laproducción específica de metano

• La estructura microbiana en el digestor experimental se recuperaal momento de retomar la temperatura original y junto con esto,se observa una recuperación en la producción de metano.

Caso práctico 2: Seguimiento de digestor anaerobio frent e a un cambio de sustrato


¿Cambia la comunidad microbiana del digestor al cambiar el tipo de sustrato?

Lodo biológico + primario

Lodo biológico hidrolizado + primario



- Volumen: 15.000 m3

- TRH: d- VCO: kg SV/m3/d - 35 °C Alimentación con lodo hidrolizado

Cambio a lodo hidrolizado generó acidificación



Muestras de lodo

Extracción ADN

Seq 16S ARNr (V4-V5)

Pipeline externo

- 20 °C

CAJ, ACP (XLSTAT)



Pre-acidificación Acidificación Post-acidificación

SymbiobacteriumClostridium

Methanosarcina

Cambio en las abundancias relativas de los microorganismos



0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ab

un

dan

cia

rela

tiva

Methanobacteriales Methanomicrobiales

Methanosarcinaceae Methanosaetaceae

qPCR:Confirmación de dominancia de Methanosarcinaceae

después de acidificación

Pre-acidificación Acidificación Post-acidificación

Caso práctico 2: Seguimiento de un digestor anaerobio fr ente a un cambio de sustrato


Los cambios en las poblaciones microbianas asociados a los cambios de [AGVs]

Agrupamiento de las muestras según sus perfiles microbianos



Comunidades post-acidificación: Alta productividad de biogás

Caso práctico 2: Conclusiones


• Este evento de acidificación está asociado a un cambio de laspoblaciones microbianas.

• El cambio a sustrato hidrolizado generó un evento deacidificación.

• Las poblaciones microbianas alcanzaron una nueva configuraciónla cual está asociada a una estabilidad en términos de AGVs y deproductividad de biogás.

TRATAMIENTO Y RECICLAJE DE AGUAS INDUSTRIALESMEDIANTE SOLUCIONES SOSTENIBLES FUNDAMENTADASEN PROCESOS BIOLÓGICOS. RED TEMÁTICA 316RT0508

Financiado por:


Con la colaboración de:

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