UNTZ Akademska godina: 2011/12 Fakultet: Tehnološki fakultet Odjek: Hemijsko-tehnološki Smijer: Ekološko inženjerstvo Nastavni predmet: Odabrana poglavlja Biohemijskog inženjerstva

Utjecaj aeracije, brzine miješanja i uvećanja mjerila („scale up“) na koeficijent prenosa kisika a u proizvodnji eksopolisharida („exopolysharide“) primjenom bakterije

Enterobacter Cloacae WD7

Predmetni nastavnik: Student:

dr. sc. Ivan Petric, vanr. prof. Alen Agić ______________________________ __________________

Tuzla, april 2012. godine

2

Sadržaj

1. Uvod _______________________________________________________________________ 4

2. Materijali i metode ____________________________________________________________ 7

2.1. Rast Mikroorganizama i medijum _______________________________________________ 7

2.2. Fermentori _________________________________________________________________ 7

2.3. Analitičke metode ___________________________________________________________ 7

2.4. Fermentacijske studije _______________________________________________________ 8

2.4.1. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na produkciju biopolimera na laboratorijskom mjerilu _ 8

2.4.2. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na OUR, OTR i vrijednosti ____________________ 8

2.4.3. Scale-up studij ____________________________________________________________ 9

2.5. Studija o svojstvima fluida kod WD7 biopolimera __________________________________ 9

3. Rezultati i diskusija ___________________________________________________________ 10

3.1. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na DOT vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu _________ 10

3.2. Utjecaj aeracije i stope miješanja na DCW vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu _________ 12

3.3. Utjecaj aeracije i stope miješanja na biopolimernu produkciju, na laboratorijskom mjerilu __ 14

3.4. Utjecaj aeracije i stope miješanja na viskoznost, na laboratorijskom mjerilu ______________ 14

3.5. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na OTR i OUR vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu ____ 15

3.6. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na a vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu __________ 18

3.7. Utjecaj a vrijednosti na produktivnost biopolimera, na laboratorijskom mjerilu ________ 19

3.8. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na a vrijednosti, kod postrojenja u pilot mjerilu ______ 20

3.9. Biopolimerna fermentacija kod postrojenja u pilot mjerilu ___________________________ 21

3.10. Uvećanje mjerila (scale-up) promjenom a vrijednosti ___________________________ 22

3.11. Studij o svojstvima smjese kod WD7 biopolimera _______________________________ 24

4. Zaključci ___________________________________________________________________ 26

Literatura _______________________________________________________________________ 27

3

Sažetak

Pri proizvodnji eksopolisaharida primjenom bakterije Enterobacter Cloacae WD7 pod aerobnom fermentacijom, biopolimerni prinos se povećava sa aeracijom i brzinom miješanja kod postrojenja u pilot mjerilu, ali se smanjuje kada se brzina miješanja povećava na laboratorijskom mjerilu (“bench scale”) zbog smanjivanja smicanja (od 3.07 do 2.28 g/g u rasponu 200- 800 rpm). Kako god ono se povećava sa povećanjem aeracijske stope (od 2.79 do 3.07 g/g u rasponu 0.5.-1.25. vvm). Putem dinamičke tehnike ispuštanja plina („gassing- out tehnika“) proučavani su efekti aeracijske stope, brzine miješanja, smicanja i njegovih dodatnih utjecaja na volumni koeficijent prijenosa kisika a. Vrijednost a u

eksponencijalnoj i stacionarnoj fazi se povećava sa aeracijom i stopom mješanja na 9.97 i 9.72 . Uvećanje mjerila (“scale up”) u pilot postrojenju se izvelo “prepravljanjem” a

vrijednosti, kontrolisanjem količine kiseonika u fermentoru kao i održavanjem vrijednost a

na jednako dobivenoj vrijednosti iz malog fermentatora, rezultirajući prinosom biopolimera od 3.20 g/g c.f. 3.07 g/g na laboratorijskom mjerilu (“bench scale”).

Ključne riječi: aeracija, brzina miješanja, uvećanje mjerila, koeficijent prijenosa kisika, eksopolisaharidi, Enterobacter Cloacae WD7.

4

1. Uvod

U aerobnom bioprocesu kiseonik je ključni substrat. Zbog svoje niske topljivosti u vodenoj otopini, potrebna je kontinuirana opskrba istog. Količina uvedenog kiseonika u sistem (OTR) mora biti poznata, i ako je moguće predvidljiva kako bi se postigao optimalni dizajn rada i uvećanja mjerila biorekatora. Mnoge studije su obavljene kako bi se unaprijedila efikasnost prijenosa kiseonika. Koncentracija otopljenog kiseonika u otopini uz prisustvo aerobnih mikroorganizama ovisi o stopi prijenosa kiseonika od gasovite do tekuće faze, na razini na kojoj je kiseonik transportovan u ćelije (gdje se i konzumira) i na razini utroška kiseonika (OUR) od strane mikroorganizmima, za rast, održavanje i proizvodnju. Gasovito-tečna relacija u bioprocesu je pod snažnim utjecajem hidrodinamičkih uslova u bioreaktoru. Ti procesi su poznati kao procesi gubljenja energije koji ovise o radnim uvjetima, fizičko-hemijskim osobinama kulture, geometrijskim parametrima bioreaktora ali isto tako ovise i o prisutnosti stanica koje troše kiseonik.

Bioreaktori (različitih vrsta) su naširoko korišteni u velikom broju različitih bioprocesa (kao što su aerobna fermentacija i biološki tretman otpadnih voda, između ostalog). Bioreaktor sa miješanjem osigurava visoke vrijednosti transfera mase i topline, kao i odlično miješanje. U ovim sistemima, velik broj varijabli utječe na prijenos tvari i mješanje, ali najvažniji među njima su brzina miješanja, vrsta i protok plina. U kolonama sa mjehurićima i zračnim potiskom, nepoticajna okolina u poređenju sa spremnicima sa mješanjem je omogućila uspješnu kultivaciju stanica osjetljivih na pojavu smicanja, kao i nitastih stanica. Transfer kiseonika je često limitirajući korak u aerobnim bioprocesima zbog niske topljivosti kiseonika u medijumu. Tačno mjerenje i/ili predviđanje volumentričnog koeficijenta transfera mase ( a), je krucijalan korak u dizajnu, radu i uvećanju mjerila bioreaktora.

Ovaj rad je prilično usmjeren na razmatranje stope prijenosa kiseonika (OTR) u bioprocesima da bi obezbjedili veće znanje o selekciji, dizajnu, omjeru, uvećanju mjerila i razvoju bioreaktora. Najučestalije mjerne metode su tokom rada ponovljene, zatim glavne empirijske jednačine, uključujući one koje koriste bezdimenzionalne brojeve, su takođe razmatrane. Mogući porast OTR vrijednosti zbog konzumacije kiseonika od strane ćelija se uzima u obzir kroz povećanje biološkog faktora. Različiti kriteriji za uvećanje mjerila bioreaktora su razmatrani u odnosu na utjecaj na OTR i OUR vrijednosti koji utiču na koncentraciju otopljenog kiseonika u stvarnim bioprocesima.

5

Biopolomerna sinteza se generalno pojavljuje jedino kada mikroorganizmi rastu aerobno i obično pod nelimitirajćim uslovima kiseonika, polimer sa većom molekularnom težinom se prozvodi (Sutherland, 1988.). Povećana viskoznost mješavine na površini ćelije se ponaša kao difuzna barijera, gdje prijenos kisika do stanica postaje sve teži. Koncentracija otopljenog kiseonika (DO) postaje limitirani nutrient u procesu visoke potrošnje kiseonika (brzo rastući mikroorganizmi, velika biomasa i produkcija biopolimera) ili kada reološka svojstva smjese ponude visoku rezistenciju pri transferu mase, kao što je ekosustav plastične proizvodnje (Casas, Santos, and Gracia – Ochoa, 2000; Lo, Hsu, Yang and Min, 2001).

Opskrba kiseonika (OTR) može biti kontrolirajući faktor u indusutrijskim bioprocesima, uvećanju mjerila kod aerobnih biosintetičkih sistema. (Al- Masry, 1999; Elibol and Ozer, 2000; Flores, Peres and De la Torre, 1997; Gibbs and Seviour, 1996; Weuster- Botz, hannekes and Hartbrich, 1988 ).

OTR je najvažniji parametar koji počiva na dizajnu i sustavu aeracije, brzine miješanja i uvećanja mjerila (“scale up”) kod bioreaktora. DO vrijednost u mješavini je limitirana svojom stopom potrošnje od strane ćelija, odnosno stopom utroška kiseonika (OUR) kao i OTR vrijednosti. Na OTR vrijednosti mogu utjecati mnogi faktori, kao što su geometrija i karakteristike spremnika, osobine tečnosti (viskoznost, površnska napetost itd.), utrošak energije u tečnosti, biokatalitične osobine, koncentracija i morfologija mikroorganizama. OTR vrijednosti prvenstveno ovise od brzine protoka zraka, kao i brzine i vrste miješanja . U drugu ruku, OUR je limitiran povećanjem viskoznosti koja proizlazi od osobina polimera. (Eickenbusch, Brunn and Schumpe, 1995; Kobayashi, Okamoto and Nishinari, 1994; Kwon et al.,1996.)

Transfer kiseonika može igrati važnu ulogu budući da je često limitirani faktor, kako bi dobili odgovarajući volumeni koeficijent prenosa kiseonika ( a) koji korelira sa

poduktivnošću u određenim medijima, (Montes, Catalan i Galan, 1988; Tuffile i Pinho, 1970). Postoje mnogobrojne metode za određivanje a vrijednosti koje su bile prijavljene od

strane više autora, ali većina a vrijednosti su ozbiljno pod utjecajem geometrijskog

sistema. Dinamičko biološki metod (“dynamic biological method”) je najrađe korišten i uključuje fizičku apsorpciju kiseonika kombniranu sa potrošnjom kiseonika od strane ćelija iz kulture. Metoda sulfitne oksidacije (“sulphite oxidation method”) je snažno odbijana i pretrpjela je brojne kritike (Galaction, Cascaval, Oniscu i Turnea, 2004). Kritike se uglavnom odnose na konstantu brzine reakcije koja može varirati u nepoznatim uvjetima, ali takođe može biti pogodna u slučajevima slobodne ćelijske fermentacije (“cell-free fermentation”). Kako bi se smanjile komplikacije različitih varijabli i faktora baziranih na teoretskim modelima i principima sličnosti, uvećanje mjerila za biopolimernu proizvodnju, treba proučavati uzimajući u obzir parametre transfera kiseonika. (Diaz nad Acevedo, 1999; Nakayama, 1981; Winkler, 1983; Yuh-Lih i Wen- Teng, 2002).

6

Prepravljanje a vrijednosti je uobičajeno korišteni kriterij za uvećanje mjerila

(“scale up”) kod aerobne fermentacije. (Garcia- Ochoa, Gomez - Castro and Santos, 2000; Gibbs and Seviour, 1996; Miura et al.,2003).

Smisao a vrijednosti je osigurati određeni transfer potrebne mase koja se može

nositi sa potrebom za kiseonikom koju ima kultura, i obično služi za usporedbu efikasnost bioreaktora i uređaja za miješanje. Predstavlja važan faktor kod uvećanja mjerila. Enterobacter Cloacae WD7 bila je izolirana od sedimentacijskog spremnika od recikliranog mulja iz postrojenja za preradu plodova mora. Proizveden je biopolimer, rezultiran kao viskozna smjesa, sa prinosom od 4.69 g/L poslije tri dana šaržne kultivacije u fermentoru kapaciteta 3L pod optimalnim uslovima (30 °C, pH 7.0, na 2.0 vvm i 200 rpm). Ovaj rad fokusiran je na uvećanje mjerila (“scale up”) sa prepravljanjem vrijednosti za

biopolimernu fermentaciju uz Enterobacter Cloacae WD7 kod fermentora kapaciteta 5 i 72 L. Utjecaji različitih stopa aeracije i brzine miješanja na OTR i OUR vrijednosti tokom fermenracije su istraživani, kao i ponašanje i strujanje fluida.

Cilj ovog naučnog rada je proučavanje masene produkcije biopolimera u fermentoru pilot postrojenja i prevazilaženje problema fermentacije na različitim mjerilima. Stopa aeracije, brzina miješanja kao i vrijednosti su takođe proučavane a zatim su prinosi EPS-a

(eksopolisharida) uspoređivani pod sličnim vrijednostima na oba mjerila.

7

2. Materijali i metode

2.1. Rast Mikroorganizama i medijum Enterobacter cloacae WD7 održavana je u hranljivom agaru na temperaturi 4°C. Inokulum je bio pripremljen inokulacijuom jedne petlje (u vremenskom interval od 24 h) kulture u 200 mL mediuma (pH 7.0 ) u tikvici od 500 mL i kultiviran na rotacijskoj mješalici (200 rpm) na 30°C. Inokulum sa koncentracijom ćelija od 105 CFU/mL korišten je na početku (5%) procesa fermentacije. Medij sadrži 3% saharoze, 0.05% ekstrakta kvasca, 0.05% K2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.05% MgSO4 × 7H2 i 0.01% NaCI, pH je prilagođen na 7.0 i steriliziran na 121 °C na 20 minuta (Wichienchot, 2000), saharoza je sterilizirana odvojeno.

2.2. Fermentori Dvije različite veličine fermentatora sa kontinuiranim mješanjem su korištena u ovoj studiji (CSTR), sa visinama spremnika 0.25 i 1.00m, visinom tekućeg medija unutar fermentora 0.23 i 0.70 m, promjerima odnosno dijametrima spremnika 0.15 i 0.40 m, promjerima kola odnosno rotora 0.08 i 0.10 m i brojem unutrašnjih pregrada 3 i 4 za laboratorijsko i pilot postrojenje procesa fermentacije. Fermentacija kod laboratorijskog mjerila je izvedena u fermentoru kapaciteta 5L (marubishi Co.,Ltd, Japan) opremljenim sa DO elektrodama i kontrolerima procesa. Miješalica se sastoji od dva propelera na jednoj osovini, sa šest ravnih lopatica na svakom propeleru. Stopa miješanja je kontrolisana putem elektormagnetskih impulsa. Aeracijski sistem dovodi zrak putem prstenastih prskalica sa mjeračom protoka zraka, filterom, i mjerčom otopljenog kiseonika putem napetosti otopljenog kiseonika, % DOT.

Postrojenje u pilot mjerilu je vođeno u 72 L reaktoru od nehrđajućeg čelika (Biostat- M of B.Braun, Germany), opremljenim sa temperaturnim izolatorom, pH elektrodama, neprobojnim sondama i DO (dissolve oxygen) elektrodama. Mješalica je sastavljena od tri propelera (sa šest ravnih lopatica na svakom) na jednoj osovini, kontroliranoj preko kontrolora. Zrak je puštan putem paučne prskalice, filtera i mjerača protoka zraka koje je zabilježen kao % DOT.

2.3. Analitičke metode Rast ćelija je određen kroz težinu suhe ćelije (DCW) pomoću centrifuge smjese od 7600g za 15 minuta na 4 °C, dok se oprane ćelije suše se na 105 °C preko noći i vagaju. (Yokoi et al.,1997). Biopolimer je talog iz supernatanta sa 4 volumena od 95% hladnog etanola, čuvanog u frižideru na (-20 °C) i nakon centrifuge kod 7600g za 15 minuta. Neobrađeni odnosno sirovi polimer je osušen na 50 °C i izvagan. % DOT je mjeren putem oxygen electrode. Trenutna viskoznost (cp ili mPa·s) je određena Brookfield-ovim viskometrom (model LVDV- I+).

8

2.4. Fermentacijske studije

2.4.1. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na produkciju biopolimera na laboratorijskom mjerilu Šaržna fermentacija primjenom E. cloacoe WD7 u 5 L spreminku fermentatora, koji sadrži 4L mediuma je provedena na 30 °C sa kontoliranim pH na 7.0 (koristeći 0.1 N NaOH) tokom tri dana sa varirajućom stopom aeracije (0.5, 0.75, 1.00 i 1.25 vvm) i brzine miješanja (N) (200, 400, 600 i 800 rpm). Uzorci su uzimani svakih 6 sati za određivanje DCW, % DOT vrijednosti, biopolimernog prinosa i viskoznosti.

2.4.2. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na OUR, OTR i vrijednosti

Dodatno, tokom kultivacije, OUR, OTR i vrijednosti su određene dinamičkom

tehnikom ispuštanja plina (“gassing-out technique”) prema metodi Garcie–Ochoa (2000). Iz balansa mase, jednačina promjene odnosno varijacije rastvorenog kiseonika kod šaržne fermentacije se može utvrditi kao:

/ = OTR – OUR = · ( - C ) – ( · ) (1)

gdje su :

· ( - C ); i ( · ) - volumetrični OTR i OUR.

Za određivanje OUR vrijednosti, ulazni protoka zraka je prekinut, odnosno OTR = 0, gdje se vrijednost DOT-a povećava zbog ćelijske respiracije, vrijednost OUR = nagib na grafiku (DOT nasuprot vremena ).

Prema tome slijedi da je:

/ = OTR = - ( · ) (2)

Za određivanje OTR-a, ulazni tok zraka ponovno je pokrenut, što je prouzrokovalo i povećanje % DOT i OTR-a, čija se vrijednost može izraziti preko slijedeće jednačine:

OTR = / + OUR (3)

Određivanje vrijednosti, može se postići integriranjem jednačine (1) na kojoj je proces

aeracija i počeo (t = ; = ) i drugo vrijeme (t = ; = ), gdje slijedi:

( · ) · ( - ) + ( - ) = · dt (4)

9

Koeficijent prenosa kisika izračunava se rješavanjem jednačine (4) uz

eksperimentalne vrijednosti dobivene iz grafičkog prikaza (DOT nasuprot vremena). OUR, OTR i vrijednosti u eksponencijalnoj i stacionarnoj fazi (na 12 i 36 h kultivacije) su

istraživane na različitim stopama aeracije i brzine miješanja na laboratorijskom mjerilu ( 0.5 - 1.25 vvm i 200- 800 rpm ) i postrojenja u pilot mjerilu ( 1.25 – 2.00 vvm i 200-800 rpm).

vrijednosti za oba mjerila su poredane kako bi se našli kontrolisani uslovi koji bi dali jednak rezultat za scale-up studije.

2.4.3. Scale-up studij Šaržna kultivacija kod postrojenja u pilot mjerilu provedena je u 72 L fermentatoru sa 50 L radnog volumen na 30 °C, pH 7.0 i tri dana kultivacije uzimajući aeracijsku stopu i stopu mješanja koja je dala jednake ili veoma slične vrijednosti dobivene na laboratorijskom

mjerilu. Time naravno, OTR, OUR i vrijednosti kao i njihovi efekti kod fermentacijskog

pilot postrojenja su istraženi, gdje je EPS prinos oba mjerila uspoređen.

2.5. Studija o svojstvima fluida kod WD7 biopolimera Tok varijabli neprerađenog WD7 biopolimera raspršenog u destilovanoj vodi (pri 0 - 0.5 % w/v) proučavan je pomoću Brookfield-ovog viskometra. Smično naprezanje (τ, Pa) prema brzini smicanja (γ, ) predstavljeni su u log formi na x osdnosno y osi. Korelacija

između τ i γ je objašnjena sa Ostwald- de Waele jednačinom, odnosno:

τ = K (5)

gdje je vrijednost K indeks konzistencije (mPa·s ili cp), dok vrijednost n predstavlja index tečenja (flow index).

10

3. Rezultati i diskusija

Budući da je uloga kiseonika na rast mikroorganizama i njihov metabolizam jako važana, DO (otpljeni kiseonik) se transferira s obzirom na potrošnju od strane ćelija (OUR) kao i trasnfer kiseonika (OTR) u sistem, tokom procesa fermentacije gdje treba da se istražuje. Fermentacija primjenom bakterije E.cloacoe WD7 izvedena je na laboratorijskom mjerilu variranjem vrijednosti aeracije (0.5, 0.75, 1.0 i 1.25 vvm) i brzine miješanja (200, 400, 600 i 800 rpm) za određivanje vrijednosti, posebno u eskponencijalnoj i stacionarnoj

fazi.

3.1. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na DOT vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu Utjecaj aeracije i brzine miješanja na fermentaciju primjenom bakterije E. Cloacoe WD7 na laboratorijskom mjerilu ilustrirani su na Sl. 1 i 2. Na Sl. 1a i 2a , sve DOT vrijednosti uzete od oba eksperimenta dramatično su smanjene na minimalni stupanj u okviru 24 sata kultivacije, a zatim održavane na konstanti između 10-30%. Preostali stepeni DOT vrijednosti u fazi mirovanja (nakon fermentacije 24 h) se povećavaju sa povećanjem stope aeracije, koja nije ovisila od stope brzine miješanja. Otkriveno je da se viskoznost obično povećava kada mikroorganizmi rastu brzo sa visokom potrošnjom kiseonika. Kako god, DOT vrijednosti u svim ispitivanjima nikada nisu bile manje od 10%, što indicira da je prisutnost kiseonika dovoljna za potrebe potrošnje ćelija. Aeracija jedino utječe na vrijeme zadržavanja kisika sa odgovarajućim povećanjem ili smanjivanjem brzine strujanja plina u smjesi/mješavini. Kako god, brzina miješanja kao što je već i poznato, utječe na distribuciju mjehurića zraka ali i samo miješanje u sistemu.

Iako se miješanjem može održavati prisutni otopljeni kiseonik u fermentatoru, ipak neprilagođena brzina miješanja rezultira slabim prijenosom kiseonika posebno u visoko viksoznim smjesama/mješavinama. Na previsokim i premalim brzinama, difuzija otopljenog kiseonika u viskoznim smjesama, bila je sve osim optimalna.

11

Slika 1. Utjecaj stope aeracije (0.5–1.25 vvm) na DOT vrijednosti (a), težinu suhe stanice (b), prinos biopolimera (c) i viskoznost (d) tokom kultivacije primjenom bakterije E. cloacae WD7 u fermentoru kapaciteta 5L pri optimalnim uslovima medijuma na 30 °C, pH 7.0 i vremenskom intervalu 3 dana.

(C. Bandaiphet i P. Prasertsan, 2006) Fermentor sa potpunim mješanjem i efektivnim rotorom učinkovit je na transfer mase i topline pod reološkim ponašanjem tečnosti kod proizvodnje EPS-a. Dakle, tip rotora može utjecati na različite fenomene transporta kroz fermentor.

12

3.2. Utjecaj aeracije i stope miješanja na DCW vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu U eksponencijalnoj fazi, DCW vrijednosti nisu varirale u ispitivanim rangovima aeracije (0.75, 1.00, 0.75, i 0.98 g/L na 0.5., 0.75, 1.00., i 1.25 vvm) (Sl. 1b), ali povećavaju se kada se i sam stepen miješanja povećava (0.98., 0.85., 0.76 i 0.67 g/L na 200, 400, 600 i 800 rpm), (Sl. 2b). U fazi mirovanja odnosno stacionarnoj fazi, DCW vrijednost se povećava sa povećanjem stope aeracije (0.81, 1.12., 1.00., i 1.28 g/L na 0.5, 0.75. i 1.00 i 1.25 vvm)(Sl. 1b), ali bitno je naglasiti da opada na visokoj brzini miješanja (1.28, 1.03, 0.91 i 0.89 g/L na 200, 400, 600 i 800 rpm, odnosno), (Sl. 2b). Prema tome, što se više povećava aeracijska stopa to je veća DCW vrijednost, dok kod povećane brzine miješanja ima se kontra efekat, odnosno DCW vrijednost opada.

Slika 2. Utjecaj stope miješanja (200-800 rpm) na DOT vrijednost (a), težinu suhe stanice (b), prinos biopolimera (c), i viskoznost (d) tokom kultivacije primjenom bakterije E. cloacae WD7 u fermentoru

kapaciteta 5L pri optimalnim uslovima medijuma na 30 °C, pH 7.0 i vremenskom interval 3 dana. (C. Bandaiphet i P. Prasertsan, 2006)

13

Uzimajući u obzir Sl. 2b, najveća DCW vrijednost pronađena je pri mješanju na 200 rpm, ali bitno je naglasiti da je vrijednost DCW na najvećoj brzini (400 - 800 rpm) smanjena (opada) zbog pojave smicanja i negativnog efekta miješanja. U eksponencijalnoj fazi, neke rastuće ćelije postaju razdvojene od medija odnosno lijepe se na zid posude iznad smjese pri previsokoj stopi mješanja, što je prouzrokovalo heterogeno miješanje (neadekvatno miješanje). Kako god, ovo pojava se nije dogodila u stacionarnoj fazi, budući da su ćelije striktno ograničene na kretanje zbog visoke vikoznosti smjese. Energično miješanje na visokoj brzini miješanja uvijek rezultira smanjenjem transfera kiseonika što prouzrokuje rast ćelija i djelovanje inhibitora. Područja visokog tlaka koja proizilaze iz fizikalnih i hidromehaničkih svojstava fluida uzrokuju oštećenja kod osjetljivih mikroorganizama što umanjuje nastajanje produkta (Al- Masry, 1999 ). Bitno je naglasiti, da neprilagođena stopa miješanja, može spriječiti sam rast ćelija. Hewitt, Caron, Axelsson, Mcfarlane i Nienow (2000) su otkrili da mali fermentori sa dobrim mješanjem daju najveće prinose biomase, ali iznenađujuće, najmanju ćelijsku održivost za Escherichia coli. Na konstatnoj brzini miješanja (200 rpm), povećavanjem stope aeracije, dobivene su veće DCW vrijednosti kao što je i pokazano na Sl. 2b. Najveći DCW prinos (1.55 g/L), dobiven je pri maksimalnoj stopi aeracije (1.25 vvm). Sadržaj kiseonika pri kultivaciji trebao bi biti dovoljan za opskrbu potražnje ispitivanih mikroorganizama, ali može biti isporučen i u većoj količini ako nema efekta na mikroorganizmima i ako ne postaje toksičan za njih zbog previsoke koncentracije kiseonika. Prema tome, bez velikog iznenađenja, rast i produkcija biopolimera uz E. Cloacoe WD7 nađena je na 1.25 vvm (maksimalna stopa u ovom radu), odnosno 2 vvm (maksimalna stopa u 3L fermentatoru sa 1.8 L radnog volumena, pri istim uslovima, medijumom i kontrolom) po Wichienchot-u (2000).

Rast ćelija i formirani produkti trebali bi biti povezani sa aeracijskom stopom i stopom miješanja na različitim levelima, posebno u viskoznim uvjetima, kako bi se postigli veći prinosi. Galaction et al. (2004) su istražili da aeracija sa optimalnim turbulentnim miješanjem može kočiti povećanje „blokorajućih efekata“ (blocking effect) i ujedinjenje biomase u visoko viskoznoj smjesi. Prevelika biomasa može utjecati na rast i transfer kiseonika, tako što smanjuje topljivost kiseonika u mediju. Doprinos površinske aeracije na ukupnu masu transferiranog kiseonika, za neke bakteriološke fermentacije bio je oko 15-20 puta manji nego za viksozne smjese bez biomase.

14

3.3. Utjecaj aeracije i stope miješanja na biopolimernu produkciju, na laboratorijskom mjerilu U ovom naučnom radu, formiranje biopolimera na laboratorijskom mjerilu, kod svih provedenih eksperimenata, povećava se sa povećanjem stope aeracije ( 3.85, 4.43, 4.60 i 4.76 g/L na 0.5, 0.75, 1.00 i 1.25 vvm), (Sl. 1c). U drugu ruku, primjetno je opadanje kada je stopa miješanja povećana (4.76, 3.80, 3.67 i 3.00 g/L na 200, 400, 600 i 800 rpm), (Sl. 2c). Povećanje aeracije i smanjenje stope miješanja primjetno je povećalo biopolimerni prinos, esktrapoliranjem rezultata DCW vrijednosti. Ovo je tipična veza koja pokazuje da što je veći napredak u rastu ćelija, veće je povećanje u pogledu stvaranju produkta. Maksimalni biopolimerni prinos (4.76 g/L ili 3.07 g/g DCW) je pronađen na 1.25 vvm i 200 rpm (maksimalna aeracijska stopa i minimalna stopa miješanja u opsegu ispitivanja). Ovo je sličan izvještaj onome od Wichienchot-a (2000) odnosno, najviši biopolimerni prinos (4.80 g/L) od kultivacije uz E. cloacoe WD7 dobiven je na 2.0 vvm i 200 rpm (maksimalna aeracijska stopa i mimalna stopa miješanja). Međutim, dobiveni rezultati su očigledno različiti od onih kod Wichienchot-a (2000) gdje je proučavana stopa aeracije u 3 L fermentatoru (usp. 5 i 72 L fermentatoru u ovom radu). To je prvenstveno zbog razlike u veličinama spremnika i radnih volumena kod fermentacije sa različitim rasponima aeracijske stope. Tako, sa istim aeracijskim sistemima i sistemima miješanja, maksimalna aeracijska stopa proučavana je kontroliranjem na maksimalnoj stopi od 1.25 vvm za kapacitet fermentora od 5L, odnosno 2 vvm za kapacitet fermentora od 3L, Wichienchot (2000). Transfer kiseonika u mikrobne ćelije u procesu aerobne fermentacije, jako utječe na stvaranje proizvoda utjecajem na metaboličke puteve i i metaboličke promjene strujanja (Calic et al., 2000). Zbog toga, transfer kiseonika u fermentatore ovisi od fiziologije mikroorganizama i učinkovitosti bioreaktora.

3.4. Utjecaj aeracije i stope miješanja na viskoznost, na laboratorijskom mjerilu Vrijednost viksoznosti se povećava ako se povećava i stopa aeracije (48.40, 50.70, 57.00, i 59.20 mPa ·s na 0.5., 0.75., 1.00, i 1.25 vvm) kao što je prikazano na Sl. 1d, ali se smanjuje sa povećanjem brzine miješanja (59.20, 48.80, 43.80, i 24.30 mPa ·s na 200, 400, 600 i 800 rpm) kao što je i predstavljeno na Sl. 2d. Ako je kiseonik limitirani nutrient u procesu i ako je otežan transfer kiseonika od tečne faze do ćelije, prinos proizvoda i rast mikroorganizama će utjecati izravno.

Količina zalihe otopljenog kiseonika bi trebala u najmanju ruku biti podjedanaka sa stopom potrebnog kiseonika. Parametre traba proučavati kako bi se dobio maksimalni biopolimerni prionos. Stoga parametri OTR i OUR, proučavani su u ovom radu prvenstveno da bi dobili maksimalni biopolimerni prinos. Brzina miješanja ima direktan utjecaj na miješanje a to je važan faktor u reduciranju efekata visoke viskoznosti te povećavanja topljivost i transfera kiseonika, uključujući povećanje ćelijske asimilacije otopljenog kiseonika i formiranje produkta na optimalnoj stopi miješanja.

15

U nekim CSTR, budući da je distanca između nekih dijelova volumena smjese i rotora prilično velika, homogeno miješanje bilo je teško postići u visoko viskoznim smjesama dalje od rotora, (Kouda, et al., 1997). Pojava turbulentnog strujanja na visokoj stopi miješanja sa visokom viskoznošću u zoni rotora, je bila veća nego u glavnoj zoni. U ovom istraživanju, najveća stopa smicanja pronađena je na dnu posude; brzina smicanja je najveća u zoni rotora, a mala u najudaljenijoj zoni od rotora. Sporo strujanje visoko viskozne smjese je nađeno na miješanju jačem od 600 rpm. Zona mirovanja (Stagnant zones) je također poznata po primjeni u mnogim biopolimernim kultivacijama, kao što je bakterijska fermentacija celuloze (Kouda et al.,1997), Monascus sp. J101 biopolimer (Kim, Kim, Ohi Shin, 2002) i td.

Stopa smicanja je važan faktor koji utječe na sistem viskoznosti, stoga snažno miješanje na visokoj brzini miješanja je uvijek korišteno u viskoznim kultivacijama kako bi povećali transfer kiseonika te prouzrokovali inhibiciju rasta ćelija i aktivnosti s učinkom smicanja, (Al-Masry, 1999). Zbog toga, previsoka stopa aeracije i mješanja uzrokuje fenomen poplave (smanjenje viskoznosti s porastom smicanja) oko rotora, uništivajući pseudoplastične produkte (pseudoplastic product). Visoka viskoznost uzrokuje ujedinjenje mjehurića i pogoršava svojstava transfera mase, dok prijenos mase kiseonika može postati stopa kontroliranja u aerobnim kultivacijama, (Eickenbusch et al., 1995; Kim et al., 2002). Prema tome, aeracija i miješanje imaju mnogo uticaja na prijenos kiseonika kod proizvodnje EPS-a (exopolysharide) zbog posjedovanja visoke viskoznosti i pesudoplastičnih karakteristika.

3.5. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na OTR i OUR vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu Primjer eksperimentalnog grafikona dobivenog tehnikom dinamičkog ispuštanja plina (gassing-out technique) tokom eksponencijalne faze kod fermentacije na 1.25 vvm, 200 rpm, kultivacijom E. Cloacoe WD7 u fermentoru kapaciteta 5L, prikazan je na Sl. 3. Opadanje početne krivulje prikazuje smanjenje otopljenog kiseonika u fermentoru (uslijed potrošnje kisika od strane ćelija/OUR vrijednost) kada je dotok zraka zaustavljen. Drugi dio krivulje predstavlja povećanje sadržaja otopljenog kiseonika u fermentoru uslijed pokretanja ponovne opskrbe kiseonikom, dok se u isto vrijeme koristio od strane ćelija, indicirajući tako na promjene sadržaja kiseonika u fermentatoru (dCo/dt vrijednost). Smanjivanje otopljenog kiseonika u fermentoru tokom ćelijske konzumacije istog, potrošilo je manje vremena nego difuzija kiseonika nakon ponovne opskrbe kiseonikom, gdje su obje vrijednosti na eksponencijalnoj fazi oduzele manje vremena nego one u stacionarnoj fazi. Ovo indicira da je transfer kiseonika u viskoznu smjesu relativno težak. Efektivnost transfera kiseonika (OTR) može biti uzeta u razmatranje od OUR i dCo/dt određenih vrijednosti po relaciji (3).

Ovi parametri su važni za određivanje efikasnosti transfera kiseonika i naširoko su korišteni kao faktori kontrole za aeraciju i jačinu miješanja u aerobnim procesima.

16

Slika 3. Eksperimentalni grafikon dobiven tehnikom dinamičkog ispuštanja plina (gassing-out technique) za utvrđivanje OUR i OTR vrijednosti tijekom eksponencijalne faze primjenom bakterije E.

cloacae WD7 za fermentaciju pri 1.25 vvm, 200 rpm u fermentoru kapaciteta 5L. (Felix Garcia-Ochoa i Emilio Gomez, 2008)

OUR i OTR vrijednosti u eksponencijalnoj i stacionarnoj fazi na različitim stopama aeracije i mješanja prikazane su na Sl. 4. Na različitim aeracijskim stopama (0.5- 1.25 vvm), ispitivane OUR vrijednosti su bile između 6.47-6.90 i 4.67-5.07 (x mol/L·h), dok su OTR

vrijednosti iznosile 9.70-10.70 i 6.17-6.98 (x mol/L·h), u eksponencijalnoj i stacionarnoj

fazi. OTR vrijednosti kod obje faze su bile veće nego OUR vrijednosti, što indicira da je zaliha kiseonika bila dovoljna za kultivaciju.

OUR i OTR vrijednosti tokom eksponencijalne faze su bile blago veće nego kod stacionarne faze zbog toga što je zaliha kiseonika korištena za rast ćelija i za nastajanje produkta, i nije bila ometana od strane viskoznosti, kao što je slučaj u stacionarnoj fazi. OUR i OTR vrijednosti su povećane sa aeracijskom stopom, najveće vrijednosti su bile 6.90 i 5.07 (x mol/L·h) za OUR, odnosno 10.69 i 6.9 (x mol/L·h) za OTR u eksponencijalnoj i

stacionarnoj fazi, nađene na maksimalnoj aeracijskoj stopi (1.25 vvm).

17

Slika 4. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na OTR, OUR (a i b) i a vrijednosti (c i d) u procesu fermnetacije primjenom bakterije E. cloacae WD7 na laboratorijskom mjerilu ( 5 L fermnetor), kao i

usporedba u odnosu na exponencijalnu, e (□) i stacionarnu, s ( ) fazu. (C. Bandaiphet i P. Prasertsan, 2006)

Prema Sl.4, na različitim ispitivanim stopama miješanja (200-800 rpm), OUR vrijednosti u eskponencijalnoj i stacionarnoj fazi su iznosile 6.79 x – 11.90 x i 4.07

x – 7.14 x (mol/L ·h). OUR i OTR vrijednosti su povećane sa povećanjem brzine

miješanja. Najveće OTR i OUR vrijednosti pronađene su na maksimalnoj brzini miješanja (800 rpm).

18

Ovim je pokazano da povećanjem brzine miješanja ne samo da se povećava OTR, nego se povećavaju i OUR vrijednosti. To znači, što je veći transfer kiseonika u sistem to je više vezan u stanicama. Stoga je, OTR također imao utjecaja na OUR. U ovoj studiji su mnoge OTR vrijednsti bile veće od OUR vrijednosti u svim istraživanjima, što rezultira dovoljnom zalihom kiseonika za kultivaciju, pošto DOT nije pao niže od 10%. OUR i OTR vrjednosti u svim operacijama su blago povećane, kada se povećavala aeracija i brzina miješanja, iako se biopolimerni prinos u stacionarnoj fazi reducira sa povećanjem brzine miješanja.

OUR i OTR vrijednosti u eksponencijalnoj fazi bile su veće nego u stacionarnoj fazi, sa povećanjem aeracijske stope i brzine miješanja (Sl. 4a i 4b). Povećanje brzine smicanja, utiče na povećanje OTR vrijednosti, ali uzrokuje pad rasta ćelija i bopolimernog prinosa putem mehaničkih oštećenja. Kako god, OUR vrijednosti su postale uvećane za preživljavanje ćelija, iako se koncentracija ćelija smanjila, što je nađeno u aerobnoj kultivaciji primjenom bakterije Aureobasidium pullulans (Gibbs i Seviour, 1996).

3.6. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na a vrijednosti, na laboratorijskom mjerilu

a vrijednost se povećava sa povećanjem aeracije i brzine miješanja (Sl. 4c i 4d). Na različitim stopama aeracije (0.5- 2.0 vvm, sa brzinom strujanja 0.0018–0.0047 m/s), a vrijednosti su bile oko 2.63-9.72 i 2.71-9.97 u eksponencijalnoj i stacionarnoj fazi. Na

različitim brzinama miješanja, a vrijednost je iznosila 9.72- 19.10 i 9.97- 21.54 u

eksponencijalnoj i stacionarnoj fazi. Bitno je naglasiti da se a vrijednost više povećava sa jačim miješanjem, nego što se povećava sa povećanjem stope aeracije. Povećanje brzine miješanja (500- 1200 rpm) je dalo povećanje a vrijednosti (približno od 10 do 90 ),

istraženo primjenom statičke gassing-out tehnike, tokom fermentacije za produkciju celuloze primjenom Acetobacter xylinum bakterije u posudi (3L) sa 1.8L radnog volumena, (Kouda et al., 1997). a vrijednost pri fermentaciji sa Monascus sp., postepeno se povećavala od 0.003 do 0.029 sa pevećavanjem brzine od 200 do 700 rpm, (Kim et al 2002 ). a vrijednosti

na optimalnim uslovima (1.25 vvm i 200 rpm) iznose 9.72 i 9.97 u eksponencijalnoj i

stacionarnoj fazi. a vrijednost se povećava sa povećanjem aeracijske stope u obje faze (Sl. 4d).

Međutim, ovi rezultati pokazuju da jačina mješanja ima većeg utjecaja na a vrijednost nego aeracija, posebno tokom eksponencijalne faze. Pored aeracije i jačine mješanja, mnogi drugi faktori su utjecali na a vrijednost tokom fermentacije, kao što su tip miješanja, viskoznost, nastanak produkta, sadržaj biomase, itd. Takođe, postoje mnogi faktori koji utječu na OTR, OUR, i a vrijednosti, a koji nisu uzeti u obzir u ovoj studiji (npr. distribucija i veličina mjehurića zraka, poprečna sila, pritisak itd.) na što bi svakako u budućem istraživanju trebalo obrtatiti pozornost.

19

3.7. Utjecaj a vrijednosti na produktivnost biopolimera, na laboratorijskom mjerilu

Pri ovoj studiji, a vrijednost na laboratorijskom mjerilu se povećava sa povećanjem stope miješanja i aeracije, dok se rast ćelija i biopolimerni prinos smanjuje sa povećavanjem stope miješanja. Tako, pozitivni utjecaj a vrijednosti na biopolimernu produktivnost je potvrđen sa aeracijskim efektima, dok negativni utjecaj a vrijednosti se javlja sa efektom miješanja. Ovi predhodno spomenuti utjecaji su tipični i za mnoge druge studije fermentacije za produkciju biopolimera. Velika stopa miješanja utiče na strukturu i osobine biopolimera (npr. viskoznost) i deprimira rast i aktivnost ćelija. Prema tome, DCW vrijednost i prinos biopolimera su relativno mali zbog visoke stope miješanja odnosno heterogenog miješanja, što rezultira malom viskoznošću.

U osnovi, biopolimerna produktivnost mnogih aerobnih procesa se povećava sa povećanjem aeracije i stope miješanja, gdje je negativni efekat brzine miješanja jači od stope aeracije. DO koncentracija direktno je vezana sa OTR i a vrijednostima. Podaci za a pod različitim aeracijskim stopama i brzinama miješanja, indiciraju na jaču zavisnost OTR-a na jačinu miješanja nego na aeraciju; zbog toga je produktivnost sa povećanjem a zadovoljavajuća veza. Miješanje je samo još jedan važan faktor za transfer kiseonika i aktivnosti ćelija u bioprocesu. Intenzivnije miješanje može voditi prema reduciranju a, i ovaj efekat je izraženij na nižim aeracijskim stopama i nižoj koncnetraciji biomase, što rezultira dobrom disperzijom zraka, kao i posljedično lakše apsorpcije ćelija na mjehuričastu površinu (Galaction et al. 2004). Povećanje a vrijednosti je rezultat mjehuričaste površine koja je blokirana apsorpcijom ćelija, fenomen koji se može opisati omjerom između a vrijednosti za viskoznu suspenziju sa i bez biomase. Veličina efekta blokiranja na a vrijednost prvenstveno ovisi od vrste mikroorganizama. Zbog toga, vrijednost a oko rotora je visoka jer je miješanje odgovarajuće, dok je a vrijednost mala gdje je prisutno heterogeno miješanje, (Kouda et al., 1997). Heterogeno miješanje je takođe pronađeno tokom WD7 biopolimerne produkcije na previsokoj razini brzine miješanja (>600 rpm), što je utjecalo na vrijednost a.

20

3.8. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na a vrijednosti, kod postrojenja u pilot mjerilu

Kada se mjerilo rada povećava, smjesa postaje sve više i više heterogena te se kiseonik može potrošiti u nekim dijelovima reaktora, (Thiry i Cingolani, 2002). Zaliha kiseonika za rastuće ćelije obično je ograničavajuća operacija kod uvećanja mjerila. U ovoj studiji, DOT vrijednosti u svim istraživanjima kod postrojenja u pilot mjerilu se smanjuju u eksponencijalnoj fazi, a zatim se povećavaju i ostaju konstantne u stacionarnoj fazi. Ostatak DOT vrijednosti, bio je visok na viskoj stopi aeracije i velikoj brzini miješanja, sa više od 10% DOT-a u svim istraživanjima gdje postoji dovoljna podrška zalihe kiseonika u sistemu. Utjecaji aeracije (0.5 , 1.0, 1.5 i 2.0 vvm) i brzine miješanja (200, 400 i 600 rpm) na OUT, OTR i a

vrijednosti su također proučavani na postrojenju u pilot mjerilu. Putem dinamičke tehnike ispuštanja plina (dynamic gassing-out technique), OTR i OUR vrijednosti su povećane sa povećanjem aeracije i brzine miješanja. Brzina miješanja je ipak imala veći efekat na te parametre, nego stopa aeracije, dok su a vrijednosti na različitim stopama aeracije i brzinama miješanja predstavljene na Sl. 5.

a vrijednost se povećava sa povećavanjem aeracije i brzine miješanja, u obje faze. Na različitim stopama aeracije (1.25-2.00 vvm), a vrijednost na 200 rpm kreće se u intervalu od 9.25 – 10.67, odnosno 9.09 - 10.18 na 400 rpm, dok je maksimalna

vrijednost a (21.16 i 18.11 ) pronađena na 2.00 vvm i 600 rpm, u eskponencijalnoj i

stacionarnoj fazi.

Slika 5. Utjecaj aeracije i brzine miješanja na a vrijednost tokom fermentacije primjenom bakterije E. cloacae WD7 kod postrojenja u pilot mjerilu (72L fermentor), u eskponencijalnoj (exp) i

stacionarnoj (sta) fazi. (C. Bandaiphet i P. Prasertsan, 2006)

21

Poređenja radi, pod istim uslovima (1.25 vvm i 200 rpm), kao optimalni uslovi na laboratorijskom mjerilu, a vrijednosti kod postrojenja u pilot mjerilu (9.25 i 9.09 ) su

bile niže nego one na laboratorijskom mjerilu (9.97 i 9.72 ), u eksponencijalnoj i

stacionarnoj fazi. Bitno je naglasiti da su a vrijednosti kod postrojenja u pilot mjerilu (9.68 i 9.50 ), pronađene na 1.75 vvm i 200 rpm, bile veoma blizu a vrijednostima na

optimalnim uslovima na laboratorijskom mjerilu (9,97 i 9.72 ), i upravo zbog toga su

izabrane za uvećanje mjerila (scale-up) kod WD7 biopolimerne produkcije.

3.9. Biopolimerna fermentacija kod postrojenja u pilot mjerilu Fermentacija kod postrojenja u pilot mjerilu je provedena zbog masivne produkcije WD7 EPS-a (exopolysharida). Tri serije kultivacija na različitim uslovima u fermentoru su bile izabrane za primjere, kao što slijedi: (a) 1.25 vvm i 200 rpm, pod optimalnim uslovima na laboratorijskom mjerilu, (b) 2.00 vvm i 200 rpm, aeracijska stopa je bila povećana dok je brzina miješanja zadržana na istom nivou kao konstanta, i (c) 2.00 vvm i 600 rpm, maksimalna stopa aeracije i brzine miješanja kod postrojenja u pilot mjerilu. Proteklo vrijeme kao i pojedini podaci procesa fermentacije kod postrojenja u pilot mjerilu, provedenih pod različitim uslovima, predstavljeni su na Sl. 6 (a, b i c). Sva protekla vremena su bila reltivno slična onima kod laboratorisjkog mjerila, dok se DCW vrijednosti, biopolimerni prinos i viskoznost još uvijek povećavaju odgovarajući vremenu kultivacije. Stoga, kada se aeracija i brzina miješanja povećava, pri DCW vrijednostima 1.58, 1.65 i 1.67 g/L, biopolimerni prinos iznosi 3.07, 3.18 i 3.20 g/g, sa odgovarajućim vrijednostima viskoznosti 66.8, 76.0 i 77.2 cp (mPa· s), na radnim uslovima (Tabela 1). Najbolji uslovi za najveću biopolimernu produkciju kod postrojenja u pilot mjerilu su bili 2.00 vvm i 600 rpm, što je različito od onih na laboratorijskom mjerilu (na 1.25 vvm i 200 rpm). Maksimalni biopolimerni prinos je pronađen na maksimalnoj aeracijskoj stopi, na oba mjerila. Utjecaj mehaničke brzine smicanja na biopolimernu produkciju (kao što je pronađeno na laboratorijskom mjerilu), nije pronađen kod postrojenja u pilot mjerilu zbog razlike u geometrijskim karakteristikama, veličine rotora, broja lopatica i td. Dakle, brzina smicanja nema utjecaja na rast ćelija i biopolimernu produkciju kod postrojenja u pilot mjerilu, u testiranim rasponima aeracije i stope miješanja.

22

3.10. Uvećanje mjerila (scale-up) promjenom a vrijednosti

Budući da su a vrijednosti na laboratorijskom mjerilu različite od onih kod postrojenja u pilot mjerilu, gdje oba fermentora posjeduju različite geometrijske karakteristike kao i sistem miješanja, uvećanje mjerila u ovoj studiji (scale-up) je izvedeno prepravljanjem a vrijednosti kod postrojenja u pilot mjerilu i laboratorijskom mjerilu, kako bi bile jednake. Izvršeno je poređenje a vrijednosti kod postrojenja u pilot mjerilu (ps) 9.50 i 9.68 na 1.76vvm i 200 rpm, sa relativno bliskim vrijednostima na laboratorijskom

mjerilu (9.97 i 9.72 ) na 1.25 vvm i 200 rpm, u eksponencijanoj i stacionranoj fazi. Ovo je

dalo a omjer od 1.03 ( / = 9.97/9.68) u eksponencijalnoj fazi, odnosno 0.98

( / = 9.50/9.72 ) u stacionarnoj fazi. Pri uspješnom uvećanju mjerila (scale-up) za

WD7 biopolimernu produkciju, biopolimerni prinos (3.20 g/g) je bio ipak blago veći od onog na laboratorijskom mjerilu (3.07 g/g), (Tabela 1.). Ovo je obično pronađeno i kod drugih uvećanja mjerila (scale-up) biopolimerne produkcije, zbog različitih geometrijskih karakteristika sa aeracijskim sistemima i sistemima mješanja (Flores et al.,1997; Galaction et al., 2004; Garcia- Ochoa et al., 2000).

U ovom naučnom radu, iako se heterogenost uobičajeno nalazila u viskoznim kulturama, takav problem nije nađen u testiranim rangovima varijabli koje se nisu mogle jednostavno riješiti korištenjem odgovarajuće brzine miješanja te kontroliranjem istog. Korištenjem odgovarajuće geometrije, odnosno, tipova miješanja i rotora mogu se povećati zalihe kiseonika te reducirati ekstreman rast. Iz ove studije, pored utjecaja brzine miješanja i aeracije, postoje još mnogi drugi faktori koji utječu na aerobni proces i uvećanje mjerila, kao što je posmično naprezanje, miješanje, rast mikroorganizama, koncentracija i viskozitet produkta, koji su direktno važni za stopu transfera kiseonika i određivanje a vrijednosti, (Hsu & Wu, 2002).

23

Slika 6. Proteklo vrijeme pri procesu odvijanja biopolimerne fermentacije primjenom bakteriji E. cloacea WD7 u fermentoru kapaciteta 72 L sa sadržajem optimalnog medija na 30°C, pH 7 i (a) 1.25 vvm i 200 rpm, optimalni

uslovi kod laboratorijskog mjerila, (b) 2.00 vvm i 200 rpm i (c) 2.00 vvm i 600 rpm ( = koncentracija ćelija, = koncentracija biopolimera, = napetost otopljenog kiseonika, i = viskoznost).

(C. Bandaiphet i P. Prasertsan, 2006)

24

3.11. Studij o svojstvima smjese kod WD7 biopolimera Reološke osobine smjese nude visok otpor prema transferu mase, zalihe kiseonika za rast ćelija uobičajeno su limitirane operacije kod uvećanja mjerila. Kod uvećanja mjerila, smjesa postaje sve više i više heterogena i kiseonik tada može biti potrošen u nekim dijelovima reaktora, (Thiry i Cingolani, 2002). Osobine i tijek ponašanja viskoznih smjesa su proučavani kako bi se opisali neki od fenomena pronađenih pri EPS fermentaciji. Veza između vidljive viskoznosti i brzine smicanja na različitim ispitivanim koncentracijama (0.1 – 0.5% w/v) kod WD7 biopolimera predstavljena je na Sl. 7, što indicira na smanjenje viskoznosti kada brzina smicanja raste. Tabela 2 prikazuje vrijednosti viskoziteta (3.18, 4.90, 5.43, 7.35 i 12.80 mPa.s) kod posmičng naprezanja (419.76, 648.80, 704.88, 970.20 i 1,698.60 mPa), K vrijednosti iznose između 6.92, 20.41, 26.30, 38.02 i 83.18 · Pa·s, dok n

vrijednosti posjeduju slijedeći interval 0.85, 0.74, 0.68, 0.66, i 0.63.

Tabela 1. Utjecaj različitih uvjeta na Biopolimernu fermentaciju primjenom bakterije E. Cloacae WD7 na temperaturi od 30°C, pH 7 i vremenskom intervalu kultivisanja od 3 dana u fermentorima kapaciteta 72 i 5 L.

Izvor: Naučni rad: C. Bandaiphet i P. Prasertsan (2006), Effect of aeration and agitation rates and scale-up on oxygen transfer coefficient, kLa in exopolysaccharide production from Enterobacter cloacae WD7.

Parametri Fermentori

72 L 5 L

1.25 vvm, 200 rpm 2.00 vvm, 200 rpm 2.00 vvm, 600 rpm 1.25 vvm, 200 rpm

Krajnja ćelijska koncentracija (g/L) 1.58 1.65 1.67 1.55

Koncentracija EPS-a (g/L) 4.86 5.25 5.35 4.76

EPS prinos baziran kod Biomase, Yp/x (g/g) 3.07 3.18 3.20 3.07

Vidljivi viskozitet (mPa·s) 68.8 76.0 77.2 59.20

vrijednost u eksp. fazi ( ) 9.09 9.50 18.11 9.72

vrijednost u stac. fazi ( ) 9.25 9.68 21.16 9.97

25

Slika 7. Odnos između brzine smicanja ( ) i viskoznosti (mPa·s) kod uzorka WD7 biopolimera pri različitim koncentracijama (0-0,5% w/v).

(A. Diaz i F. Acevedo, 1999)

Tabela 2. K vrijednosti (koeficijent konzistencije) i n vrjednosti (indeks tečenja) na različitim

koncentracijama WD7 biopolimera.

Koncentracija EPS-a

(%)

Viskozitet

(x Pa·s)

K, koeficijent konzistencije

(x Pa·s)

Indeks tečenja

(n)

0 1.14 4.9 1.19

0.1 3.18 6.92 0.85

0.2 4.90 20.41 0.74

0.3 5.34 26.30 0.68

0.4 7.35 38.02 0.66

0.5 12.8 83.18 0.63

Izvor: Naučni rad: C. Bandaiphet i P. Prasertsan (2006), Effect of aeration and agitation rates and scale-up on oxygen transfer coefficient, kLa in exopolysaccharide production from Enterobacter cloacae WD7.

26

4. Zaključci

Rast ćelija i biopolimerni prinos primjenom bakterije E. Cloacoe WD7 pod aerobnom fermentacijom se povećava sa povećanjem aeracije i brzine miješanja kod postrojenja u pilot mjerilu (72 L), ali se smanjuje kada se brzina miješanja povećava na laboratorijskom mjerilu (5L), zbog pojave smicanja. Najveći biopolimerni prinos na laboratorijskom mjerilu (3.07 g/g) pronađen je pri optimalnim uslovima (1.25 vvm i 200 rpm), ali povećanje biopolimernog prinosa (3.20 g/g) je pronađeno na 2 vvm i 600 rpm. OTR vrijednosti su veće od OUR vrijednosti u obje faze što indicira na adekvatnu zalihu kiseonika u oba sistema. OTR i OUR vrijednosti u eksponencijalnoj fazi su bile veće nego u stacionarnoj fazi zbog prisutnosti velike koncentracije ćelija i biopolimera sa visokom viskoznošću. a vrijednosti na oba mjerila su povećane sa povećanjem aeracije i brzine miješanja. Na 1.75 vvm i 200 rpm, a

vrijednosti u eskponencijalnoj i stacionarnoj fazi na laboratorijskom mjerilu su iznosile 9.97 i 9.72 , što je bilo veoma slično rezultatima dobivenim kod postrojenja u pilot mjerilu (9.68

i 9.50 ). Scale-up razlike u geometriji i tipovima miješanja su uspješno prevaziđene

prepravljanjem a vrijednosti (sa a omjerom od 1.03 u eksponencijalnoj, odnosno 0.98 u stacionarnoj fazi), davajući biopolimerni prinos od 3.07 i 3.20 g/g po gramu DCW-a (težina suhe ćelije) na laboratorijskom mjerilu (“bench scale”) i kod postrojenja u pilot mjerilu (“pilot plant scale”), bez grešaka u sistemu.

27

Literatura

1. Audet, J., Gagnon, H., Lounes, M., & Thibault, J. (1998); Polysaccharide production:

experimental comparison of the performance of four mixing device. Bioprocess Engineering, 45–52.

2. Felix Garcia-Ochoa, Emilio Gomez (2008); Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in

microbial processes.

3. Diaz, A., & Acevedo, F. (1999); Scale-up strategy for bioreactors with Newtonian and non-Newtonian broths. Bioprocess Engineering, 21–23.

4. Garcia-Ochoa, F., Gomez-Castro, E., & Santos, V. E. (2000); Oxygen transfer and uptake rates during xanthan gum production. Enzyme and Microbial Technology, 680–690.

5. C. Bandaiphet, P. Prasertsan (2006); Effect of aeration and agitation rates and scale-up on oxygen transfer coefficient, kLa in exopolysaccharide production from Enterobacter cloacae WD7.

6. Galaction, A.-I., Cascaval, D., Oniscu, C., & Turnea, M. (2004); Prediction of oxygen mass

transfer coefficients in stirred bioreactors for bacteria, yeasts and fungus broths. Biochemical Engineering Journal, 85–94.

7. Hewitt, C. J., Caron, G. N. V., Axelsson, B., McFarlane, C. M., & Nienow, A. W. (2000); Studies related to the scale-up of high-celldensity E. coli fed-batch fermentations using multiparameter flow cytometry: effect of a changing microenvironment with respect to glucose and dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering, 381–390.

8. Sutherland, I. W. (1998); Novel and established applications of microbial polysaccharide, TIBTECH 41–46.

9. Thiry, M., & Cingolani, D. (2002); Optimizing scale-up fermentation processes. Trends in Biotechnology 103–105.

10. Winkler, M. A. (1983); Scale-up in biotechnology. In A. Winkler (Ed.), Principles in Biotechnology (pp. 134–136). New York: Surrey University Press.

11. Wernersson, E. S., & Tragardh, C. (1998); Scaling of turbulence characteristics in a turbine-agitated tank in relation to agitation rate. Journal of Chemical Engineering, 37–45.

12. Weuster-Botz, D., Hnnekes, E., & Hartbrich, A. (1998); Scale-up and application of a cyclone reactor for fermentation processes. Bioprocess Engineering, 433–436.