Utvärdering av snabb resistensbestämning för ...lnu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1333704/FULLTEXT01.pdf · Streptococcus pyogenes och Streptococcus pneumoniae (5). Snabb och

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap

Examensarbete

Utvärdering av snabb

resistensbestämning för Staphylococcus

aureus och Streptococcus pneumoniae

direkt från positiv blododlingsflaska

Författare: Rebecka Aniansson

Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Nivå: Grundnivå

Utvärdering av snabb resistensbestämning för Staphylococcus aureus och

Streptococcus pneumoniae direkt från positiv blododlingsflaska

Rebecka Aniansson

Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng

Filosofie Kandidatexamen

Handledare:

Examinator:

Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet.

Sammanfattning Sepsis är ett livshotande tillstånd som orsakas av bakterier i blodbanan. Tidig och

korrekt antibiotikabehandling är viktig, antibiotikaresistens är ett ökande problem och

resistensbestämning är därför essentiell. Vid sepsisdiagnostik med blododling krävs ofta

minst två dygn innan resistensbesked kan ges. Antibiotikabehandling måste därför

påbörjas innan odlingssvar. Rutinmetod för resistensbestämning vid svenska

mikrobiologiska laboratorier är diskdiffusionsmetoden som är standardiserad av

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Vid

diskdiffusion odlas bakterier på agarplattor och hämningszoner kring pappersdiskar med

antibiotika används som mått på antibiotikaeffekt. Metoden kräver framväxta

bakteriekolonier på agarplattor som ursprungsmaterial och utförandet tar 16-20 timmar.

EUCAST har vidareutvecklat diskdiffusionsmetoden för snabb resistensbestämning

(Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing, (RAST)). Resistensbestämning med

diskdiffusion utförs då direkt från positiv blododlingsflaska och hämningszoner mäts

redan efter 4, 6 och 8 timmar. I metoden används olika brytpunkter för

känslighetskategorisering vid de olika tidpunkterna. Syftet med studien var att

Annika Wistedt

Överläkare, specialist i klinisk

Klinisk mikrobiologi

Länssjukhuset Hus 17, plan 4

bakteriologi, Medicine doktor 391 85 Kalmar

Monika Filipsson

Universitetslektor

Linnéuniversitetet, Institutionen för

biologi och miljö

Hus Vita

392 31 Kalmar

Britt-Inger Marklund

Universitetslektor

Linnéuniversitetet, Institutionen för

kemi och biomedicin

Hus Vita

392 31 Kalmar

undersöka hur väl RAST fungerade för Staphylococcus aureus och Streptococcus

pneumoniae genom att undersöka bakterieisolat inokulerade i blododlingsflaskor. Totalt

31 isolat; 23 S.aureus och 8 S.pneumoniae undersöktes varav en hög andel med

betalaktamresistens. Till båda bakteriearterna användes 5 sorters antibiotika.

Zondiametrar mättes av två personer oberoende av varandra och resultaten jämfördes

med de från standardiserad diskdiffusion. För S.aureus var vid 4 timmar 102/184 (55 %)

avläsningar kategoriseringsbara, vid 6 timmar 164/184 (89 %) och vid 8 timmar

174/184 (95 %). Sammanlagt inträffade 7 felkategoriseringar varav 5 gällde

underskattning av klindamycinresistens vid 4 timmar. S.pneumoniae hade sämre tillväxt

och metoden var därför svårare att tillämpa. För S.pneumoniae var vid 4 timmar 74/80

(92 %) avläsningar kategoriseringsbara, vid 6 timmar 73/80 (91 %) och vid 8 timmar

77/80 (96 %). Resistens överskattades vid 21 zonmätningar vid 4 timmar. RAST

fungerade väl för S.aureus efter 6 timmar. För S.pneumoniae kan sannolikt bedömning

av penicillinresistens efter 6 timmar fungera men ytterligare undersökningar krävs.

Nyckelord: MRSA, PNSP, diskdiffusion, blododling, antibiotikaresistens, RAST

Abstract Bacteria in the bloodstream may cause sepsis, therefore early and correct treatment is

important. Antibiotic resistance is an increasing problem and antimicrobial

susceptibility testing (AST) is essential for the patients survival. In sepsis with diagnosis

based on blood culture, at least two days are required for results from AST.

Routine AST-method in Swedish microbiological laboratories is the disc diffusion

method standardized by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility

Testing (EUCAST). In disc diffusion, bacteria are grown on agar plates and inhibition

zones around paper disks with antibiotics are used to measure the antibiotic effect. The

method requires bacterial colonies as source material and takes 16–20 hours. EUCAST

has further developed the method for Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing

(RAST). RAST is performed directly from positive blood culture bottles and inhibition

zones are measured at 4, 6 and 8 hours. The method uses different breakpoints for

categorization at the different timepoints. The purpose of the study was to evaluate

RAST for Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae by examining

bacterial isolates inoculated into blood culture bottles. Zone diameters were measured,

and results were compared with those of standardized disk diffusion. For S.aureus, at 4

hours 102/184 (55%) readings were categorizable, at 6 hours 164/184 (89%) and at 8

hours 174/184 (95%). A total of 7 error categorizations occurred, 5 of which were

underestimation of clindamycin resistance at 4 hours. For S.pneumoniae at 4 hours,

74/80 (92%) readings were categorizable, at 6 hours 73/80 (91%) and at 8 hours 77/80

(96%). Resistance was overestimated at 21 zone measurements at 4 hours.. RAST

showed good results for S.aureus after 6 hours. For S.pneumoniae, further studies are

required but RAST may work after 6 hours for penicillin resistance assessment.

Förkortningar

APB Adsorbent Polymeric Beads

AST Antimicrobial Susceptibility Testing

ATP Adenosintrifosfat

ATU Area of Technical Uncertainty

CCUG Culture Collection University of Gothenburg

erm Erytromycin Ribosomal Methylase

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass

Spectrometry

ME Major Error

MH-agar Mueller Hinton-agar

MHF-agar Mueller Hinton Fastidious-agar

MLSB Makrolid-Linkosamid-Streptogramin B

MRSA MeticillinResistent Staphylococcus aureus

PBP PenicillinBindande Protein

PCR Polymerase Chain Reaction

PNSP Penicillin-Non-Susceptible Pneumococci

R Resistent

ROS Reaktiva syreföreningar

RAST Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing

S Sensitiv

VME Very Major Error

Innehållsförteckning

1 Introduktion _________________________________________________________ 1 1.1 Sepsis __________________________________________________________ 1 1.2 Blododlingsprocess ________________________________________________ 2

1.3 Staphylococcus aureus _____________________________________________ 2 1.4 Streptococcus pneumoniae __________________________________________ 3 1.5 Antibiotika ______________________________________________________ 4 1.6 Resistensbestämning eller Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) _______ 5 1.7 Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing _____________________________ 7

1.8 Syfte ___________________________________________________________ 8

2 Material och metod ___________________________________________________ 8

2.1 Stammar ________________________________________________________ 8 2.2 Förberedelser ____________________________________________________ 9 2.3 Rapid antimicrobial susceptibility testing _____________________________ 10 2.4 Viable count ____________________________________________________ 13

2.5 Avläsningsvariation ______________________________________________ 13 2.6 Standardiserad diskdiffusion _______________________________________ 13 2.7 Etik ___________________________________________________________ 14

3 Resultat ____________________________________________________________ 14 3.1 Staphylococcus aureus ____________________________________________ 14

3.1.1 Kontroller __________________________________________________ 14

3.1.2 Kliniska isolat _______________________________________________ 16

3.2 Streptococcus pneumoniae _________________________________________ 17 3.2.1 Kontroller __________________________________________________ 17

3.2.2 Kliniska isolat _______________________________________________ 19

3.1 Avläsningsvariation ______________________________________________ 20

4 Diskussion __________________________________________________________ 21 4.1 Avläsningsvariation ______________________________________________ 21

4.2 Staphylococcus aureus ____________________________________________ 22 4.3 Streptococcus pneumoniae _________________________________________ 23

4.4 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans _____________________________ 24 4.5 Slutsats ________________________________________________________ 25

Referenser ___________________________________________________________ 26

Bilaga I Rådata Staphylococcus aureus kontrollstammar

Bilaga II Rådata Staphylococcus aureus mätvärden

Bilaga III Rådata Streptococcus pneumoniae kontrollstammar

Bilaga IV Rådata Streptococcus pneumoniae mätvärden

1

1 Introduktion Bakterier kan orsaka flera olika typer av infektioner (1). Ett exempel är sepsis

(blodförgiftning) som utan en snabb och korrekt behandling kan vara dödligt (2). Dagens

behandling vid bakterieinfektion är antibiotika, men resistens mot antibiotika hos bakterier

är ett allt mer ökande problem (1). För att avgöra om en bakterie i blodet är resistent

används vanligen metoder som ofta tar minst två dygn från att patienten provtagits för

sepsis (3). Då mortaliteten vid sepsis ökar med varje timme utan korrekt behandling är det

viktigt med en snabb utredning (2). I detta arbete kommer därför en ny alternativ metod

utvärderas och jämföras mot en standardmetod, och dess tillämpbarhet kommer diskuteras.

1.1 Sepsis

Vid vissa allvarliga infektioner kan bakterier nå blodbanan (bakteriemi). I många fall

innebär det mycket allvarliga symptom (sepsis) och en risk för septisk chock med en

livshotande organdysfunktion som följd av infektionen och immunsvaret på denna (2).

Sepsis orsakar årligen runt 6 miljoner dödsfall i världen. Organdysfunktion som uppstår

vid sepsis orsakas av syrebrist i organen på grund av ett flertal reaktioner från

immunförsvaret. Exempel på organ som påverkas är lungorna, njurarna, magtarmkanalen,

levern och dessutom ses nedsatt funktion hos blod-hjärnbarriären (4). Bakterierna kan

komma från bland annat lungorna, urinvägarna eller via en hudinfektion och några av de

vanligaste patogenerna som orsakar sepsis är Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes och Streptococcus pneumoniae (5).

Snabb och korrekt behandling i ett tidigt skede vid sepsis är mycket viktigt. Om korrekt

antibiotikabehandling sätts in inom den första timmen av septisk chock är

överlevnadschanserna ca 80 % och enligt flera studier ökar mortaliteten för varje timme

med fördröjd antibiotikabehandling (2). Riskerna vid försenad behandling är högre ju mer

allvarligt sjuk patienten är, och det är inte enbart den första antibiotikadosen som kan vara

livsavgörande utan även de efterföljande (6). För att ställa sepsisdiagnosen görs odlingar

från patientens blod. Direkt efter att blodprovet tagits sätts en bred antibiotikabehandling in

utan att invänta odlingsresultatet (7).

2

1.2 Blododlingsprocess

Vid misstanke om sepsis görs vanligtvis blododlingar i fyra flaskor om två par där varje

par består av en aerob och en anaerob flaska (8). Vid det kliniskt mikrobiologiska

laboratoriet vid länssjukhuset i Kalmar län används blododlingssystemet BacT/ALERT

Virtuo från bioMérieux. I botten på blododlingsflaskorna finns en pH-indikator som ändrar

färg vid en pH-sänkning. Då mikroorganismer tillväxer produceras koldioxid vilket leder

till en pH-förändring. Flaskorna placeras i ett så kallat blododlingsskåp där de inkuberas i

värme. I blododlingsskåpet läses färgförändringen på pH-indikatorn av och flaskan

indikeras som positiv då en pH-förändring registrerats. Om ingen förändring registreras

efter ett bestämt antal dagar bedöms flaskan som negativ (9). I flaskorna finns det

”Adsorbent Polymeric Beads” (APB) som binder och hämmar vissa typer av antibiotika

(10). Flaskorna innehåller dessutom bland annat peptonextrakt, antikoagulanter, vitaminer,

kolkällor och spårelement (11, 12) samt en blandning av gaserna koldioxid, syre och kväve

i den aeroba flaskan (11) och koldioxid och kväve i den anaeroba flaskan (12).

Vid det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på länssjukhuset i Kalmar län utförs en

gramfärgning på material från den positiva blododlingsflaskan för att bedöma

gramreaktion och morfologi. Innehåll från flaskan appliceras även på agarplattor som

inkuberas (13). När tillväxt skett på agarplatta (ofta inom 4-8 timmar) görs en

artbestämning av bakterien med instrumentet Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

– Time of Flight Mass Spectometry (MALDI-TOF MS) och beroende på resultatet utförs

en antibiotikaresistensbestämning med diskdiffusionsmetoden eller gradienttest (se avsnitt

1.5) av bakterien (14). Resistensbestämningen läses av dagen därpå (3) men för vissa

snabbväxande gramnegativa stavar kan gradienttest användas för en snabb bedömning av

resistensen inom 4-8 timmar (15).

1.3 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus är en grampositiv kock som växer i klasar (1). Bakterien

koloniserar ca 10–40 % av alla vuxna (5). S.aureus kan bland annat orsaka hudinfektioner,

sepsis och pneumoni (lunginflammation) (1).

För att diagnostisera en S.aureus-orsakad infektion görs bakterieodlingar. I Sverige består

3

behandling av isoxazolylpenicilliner eller andra betalaktamasstabila antibiotika som

förstahandsalternativ (5). Anledningen till att de ska vara betalaktamasstabila är att ca

90 % av alla S.aureus producerar betalaktamas (16) som binder till betalaktamringen som

finns i alla penicilliner, karbapenemer och cefalosporiner, vilket leder till nedbrytning av

antibiotika (se avsnitt 1.5). Om patienten är allergisk mot penicillin kan exempelvis

klindamycin ges (5).

Meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) upptäcktes i början av 1960-talet.

Genen som ger meticillinresistens kallas för mecA (16). De betalaktamasstabila

penicillinerna som är verksamma mot vanliga S.aureus verkar genom att binda till

penicillinbindande protein (PBP) i bakteriens membran. mecA kodar för en annan typ av

PBP (PBP2a) som de flesta betalaktamantibiotika inklusive isoxazolylpenicilliner inte kan

binda till (5). År 2017 upptäcktes 37 fall med MRSA per 100 000 invånare i Sverige och i

Kalmar län 72 fall per 100 000 invånare (17). Enligt lokal statistik vid kliniskt

mikrobiologiska laboratoriet på länssjukhuset i Kalmar län var det år 2018 158 patienter

som diagnosticerats med S.aureus i blodet varav 2 MRSA.

1.4 Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae är en grampositiv kock som ofta växer i par (diplokocker) eller

kedjor (1, 5). Bakterien koloniserar främst yngre barn (18). Den kan bland annat orsaka

svåra sjukdomar som lunginflammation, öroninflammation, meningit

(hjärnhinneinflammation), endokardit (inflammation i hjärtklaffarna) och sepsis (1).

Behandlingen vid pneumokockinfektioner består vanligtvis av penicilliner.

Pneumokockerna kan utveckla en penicillinresistens och då kan behandlingen istället ske

med erytromycin eller klindamycin (5). Då pneumokockerna utvecklat en resistens mot

penicillin kallas de för pneumokocker med nedsatt känslighet för penicillin (PNSP,

Penicillin-Non-Susceptible Pneumococci). År 2017 upptäcktes 0,6 fall med resistenta

S.pneumoniae per 100 000 invånare i Sverige och i Kalmar län 0,82 fall per 100 000

invånare (19). Enligt lokal statistik vid kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på

länssjukhuset i Kalmar län hade år 2018 39 patienter S.pneumoniae i blodet varav 2 PNSP.

4

1.5 Antibiotika

Vid behandling av bakteriella infektioner används antibiotika eller så kallade

antimikrobiella medel (1). Det finns en stor variation av antibiotika med olika breda

spektrum och olika verkningsmekanismer. De kan bland annat påverka DNA-syntesen på

olika sätt, påverka RNA-syntesen, hämma proteinsyntesen och blockera cellväggssyntesen

(20).

β-laktamantibiotika är ett exempel på antibiotika som blockerar cellväggssyntesen hos

bakterier. Till gruppen β-laktamantibiotika hör bland annat penicillinerna och

cefalosporiner. Vid bakteriernas cellväggssyntes är ett membranbundet

transmembranprotein aktivt som katalysator. Detta protein är ett PBP och hämmas av

β-laktamantibiotika där en β-laktamring är den aktiva komponenten. Hämningen av

proteinet leder till att vissa reaktioner som ska ske vid cellväggssyntesen hämmas,

cellväggen blir då instabil och bakterien lyserar (20). β-laktamantibiotika är ofta

förstahandsvalet för behandling vid infektioner av bland annat S.aureus och S.pneumoniae

(5).

Vid penicillinallergi är behandling med klindamycin ett alternativ (5). Klindamycin tillhör

antibiotikagruppen makrolid-linkosamid-streptogramin B (MLSB) (21) som verkar genom

att binda till ribosomen och stoppa proteinsyntesen (22).

Att bakterierna utvecklar resistens mot antibiotika är ett ökande problem (5). Olika typer

av resistensmekanismer har utvecklats hos bakterier, bland annat flera mekanismer som

leder till en nedsatt känslighet för β-laktamantibiotika (23). Exempelvis kan de ibland

producera enzymet β-laktamas. Enzymet binder till β-laktamringen i β-laktamantibiotika

och spjälkar β-laktamringen och inaktiverar därmed antibiotikan. Detta är den vanligaste

resistensmekanismen mot β-laktamantibiotika (20). En annan resistensmekanism mot β-

laktamantibiotika är att PBP förändras vilket förekommer hos både S.aureus och

S.pneumoniae. Förändringen hos PBP leder till en låg affinitet för betalaktamer (20).

S.aureus får en förändring av PBP genom att genen mecA kodar för en annan typ av PBP

(5). Hos S.pneumoniae utvecklas resistensen med flera stegvisa punktmutationer istället

(20).

5

Som svar på β-laktamasorsakad resistens utvecklades isoxazolylpenicilliner som har en

isoxazolylgrupp som skyddar β-laktamringen och därmed gör antibiotikan mer

betalaktamasstabil. Dock fungerar dessa antibiotika inte om bakterien utvecklat ett nytt

eller förändrat PBP (20).

Vissa bakterier kan ha en så kallad inducerbar klindamycinresistens. Det ser då ut som att

den är känslig för klindamycin vid resistensbestämning in vitro, samtidigt som den är

resistent mot makroliden erytromycin (21). Detta beror på att en förändring skett på

ribosomerna tack vare en erytromycin ribosomal metylas (erm)-gen. När en makrolid

(exempelvis erytromycin) binder till bakterien uttrycks erm-genen och en resistens mot

bland annat klindamycin uppstår då bindningsstället på ribosomen förändras (22). För att

upptäcka denna resistensmekanism måste resistensbestämningen anpassas (24) (se avsnitt

1.6).

1.6 Resistensbestämning eller Antimicrobial Susceptibility Testing (AST)

”Antimicrobial Susceptibility Testing” (AST) är metoder för att undersöka

antibiotikaresistensmönstret hos olika bakterier. Exempel på en metod för detta är

diskdiffusionsmetoden.

Diskdiffusionsmetoden baseras på att pappersdiskar impregnerats med en känd mängd

antibiotika. Disken placeras på en agarplatta med nyutstrukna bakterier och antibiotika

diffunderar ut i agarn och bildar en koncentrationsgradient. Om bakterien är känslig mot

antibiotikan kan den inte växa nära disken (1). Detta ses som en klar zon där bakterierna

inte växer. Zonen mäts och zondiametern jämförs med bestämda SIR-brytpunkter (sensitiv,

intermediär, resistent) för att klassificera om bakterien är möjlig att behandla eller inte

(25). Sensitiv innebär att bakterien är känslig, intermediär står för att bakterien är känslig

vid ökad exponering och att bakterien är resistent innebär att den inte är känslig trots höga

antibiotikakoncentrationer (26). EUCAST (EUropean Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing) har tagit fram en standardiserad metod med bestämda brytpunkter

6

för diskdiffusion. Metoden är kalibrerad mot referensmetoden buljongspädning (25).

Den standardiserade diskdiffusionsmetoden innebär att bakteriekolonier från en

övernattskultur slammas i 0,9 % NaCl tills suspensionen, som mäts turbidimetriskt når 0,5

± 0,1 McFarland. Suspensionen sprids tätt på Mueller–Hinton (MH) agar eller Mueller–

Hinton fastidious (MHF) agar för hand eller med rotator helst inom 15 min och absolut

inom 60 min. Inom 15 minuter ska antibiotikadiskarna appliceras på plattan och då detta

har gjorts ska plattan inom 15 minuter placeras i 35 ± 1° C i 16–20 h. MH-plattorna

inkuberas i luft och MHF-plattorna i 5 ± 1 % CO2 i inkubator. Vid avläsning bör en tydlig

matta med bakterier ses så att zonerna runt diskarna är tydliga (25). Vid felaktiga resultat

används uttrycken ”major error” (ME) som innebär att isolatet felaktigt bedöms som

resistent och ”very major error” (VME) som innebär att isolatet felaktigt bedöms som

känsligt (27).

För att upptäcka inducerbar klindamycinresistens kan en klindamycindisk och en

erytromycindisk placeras nära varandra på agarplattan. Erytromycinet inducerar då

klindamycinresistensen och på agarplattan kan en skarp kant ses mellan erytromycin och

klindamycin (”D-zon”) (24) se figur 1.

Figur 1 Inducerad klindamycinresistens där en "D-zon" kan ses med en kant på klindamycinzonen på den

sida som är mot erytromycindisken. Bild tagen under det laborativa arbetet.

7

Ett annat exempel på en resistensbestämningsmetod är gradienttest. Metoden baseras likt

diskdiffusionsmetoden på att antibiotika diffunderar ut i agarn på en platta med

nyutstrukna bakterier. Istället för pappersdiskar med antibiotika används en plastremsa

som är impregnerad med en antibiotikagradient och bakteriens känslighetsnivå kan

bedömas genom att avläsa vid vilken antibiotikakoncentration bakterieväxten tangerar

plastremsan. Detta jämförs med förutbestämda värden för att avgöra om bakterien är

resistent eller känslig (1).

1.7 Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing

Det finns även snabba metoder för resistensbestämning, exempelvis ”Rapid Antimicrobial

Susceptibility Testing” (RAST). EUCAST har tagit fram en snabb metod för

resistensbestämning direkt från blododlingsflaskor och metoden innebär att 100–150 μl av

innehållet i blododlingsflaskan droppas på en MH- eller MHF-platta och stryks ut tätt över

hela plattan. Utvalda antibiotikadiskar beroende på bakterieart placeras på plattan.

Plattorna inkuberas i samma miljöer som vid den standardiserade diskdiffusionsmetoden

och efter 4 timmar ± 5 minuter avläses plattorna. De får enbart vara ute i rumstemperatur i

10 minuter och zonerna ska ha tydliga avgränsningar för att kunna mätas. Om avläsning

inte kan ske återinkuberas plattorna och de kan då läsas av efter 6 eller 8 timmar istället.

För varje avläsningstillfälle (4, 6 och 8 timmar) och art finns specifika brytpunkter

framtagna. Brytpunkterna blir något större för varje avläsningstillfälle, dvs att en ökning av

zonstorleken ses under de första timmarna. Dessa brytpunkter är för tillfället endast

bestämda för 8 olika bakteriearter och bara vissa specifika antibiotika. Plattorna ska

avläsas framifrån utan lock, med ljus reflekterande i plattan och i ca 45 graders vinkel,

MH-plattan mot mörk bakgrund och MHF-plattan mot ljus bakgrund (28). Mellan

brytpunkterna för känslighet och resistens finns “Area of Technical Uncertainty” (ATU)

där resultatet är osäkert och inget resultat kan lämnas ut vid den aktuella tidpunkten (25).

En annan variant av snabb resistensbestämning direkt från positiva blododlingsflaskor är

PCR (Polymerase Chain Reaction) för specifika resistensgener (29). Det finns också en

snabb resistensbestämningsmetod direkt från positiva blododlingsflaskor för enbart

gramnegativa stavar som redan används vid det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet på

8

länssjukhuset i Kalmar län. Metoden som används är gradienttest på en agarplatta där

blodkulturen strukits ut och resultatet avläses efter tidigast 4 timmar (15).

1.8 Syfte

Syftet med undersökningen var att utvärdera EUCAST’s metod ”Rapid Antimicrobial

Susceptibility Testing” (RAST) för Staphylococcus aureus samt Streptococcus

pneumoniae och jämföra resultaten med de från den standardiserade

diskdiffusionsmetoden. Arbetet avser att besvara följande frågeställningar:

1. Är resultaten från EUCAST’s metod RAST likvärdiga med resultat från standardiserad

diskdiffusionsmetod?

2. Kan metoden tillämpas på ett säkert och effektivt sätt i klinisk rutindiagnostik på det

kliniskt mikrobiologiska laboratoriet vid Länssjukhuset i Kalmar?

2 Material och metod

2.1 Stammar

Under det praktiska arbetet användes två kontrollstammar till försöken med S.aureus.

Stammarna kom från Culture Collection University of Gothenburg (CCUG). CCUG15915

är en S.aureus från sår, vilken ofta rekommenderas som känslig referensstam (30).

CCUG35600 är en S.aureus som är resistent mot meticillin/oxacillin, tetracyklin,

erytromycin, klindamycin och känslig för gentamicin (31). För kontrollstammen

CCUG15915 fanns bestämda målvärden och målintervall för zonstorlekarna bestämda av

EUCAST.

Andra stammar som användes var från patientprover tagna från olika lokaler (sår, blod m

fl.) samt stammar som skickats till laboratoriet för kvalitetskontroll. Av isolaten var det 16

kända MRSA-stammar som användes samt 7 känsliga S.aureus. De resistenta stammarna

hämtades från -80°C frys och de känsliga stammarna hämtades från den dagliga rutinen på

laboratoriet. Samtliga stammar var sedan tidigare bekräftade S.aureus samt

resistensbestämda med diskdiffusion. Samtliga MRSA-stammar var verifierade med mecA-

9

PCR. Av stammarna var 1 gentamicinresistent, 3 norfloxacinresistenta samt 7

klindamycinresistenta varav 5 hade inducerbar klindamycinresistens.

Kontrollstammarna som användes vid försöken med S.pneumoniae var CCUG33638 som

är en penicillinresistent S.pneumoniae från sputum (32) samt en stam som tidigare erhållits

som extern kontroll på laboratoriet. Den var alltså inte inköpt utan skickad till laboratoriet

som kontroll och hade sedan sparats och saknade därför stambeteckning. Den var känslig

för penicillin. För kontrollstammen CCUG33638 fanns bestämda målvärden och

målintervall för zonstorlekarna bestämda av EUCAST. Kliniska isolat utgjordes av 6

penicillinresistenta stammar samt 2 penicillinkänsliga stammar. Stammarna var frysta i

-80°C och bestod av isolat från patientprover samt stammar som skickats till laboratoriet

för kvalitetskontroll. Av stammarna var 2 resistenta mot trimethoprim-sulfamethoxazol, 1

stam var klindamycinresistent, 4 erytromycinresistenta och alla stammar var känsliga för

norfloxacin.

2.2 Förberedelser

De frysta stammarna som skulle användas togs från frys och spreds på blodagarplattor

(Columbia Blood Agar Base, Acumedia 7125, NEOGEN Lansing, USA) med

bomullspinne medan de stammar som hämtades från den dagliga rutinen spreds med 1 µl

platinös. Kolonier av kontrollstammarna plockades från blodagarplattor i en kyl på

laboratoriet. Isolaten spreds på blodagarplattor med 1 μl-platinös. Alla plattor placerades i

termostat 34-36ºC över natt.

Kolonier från stammar som inkuberats över natt slammades i 1,5 ml NaCl 0,9 % tills 0,5

McFarland uppnåtts, vilket kontrollerades med DensiCheck plus (bioMérieux, Inc,

Durham, USA). Tre rör per stam fylldes med 1,089 ml NaCl 0,9 %. Av de slammade

bakterierna pipetterades 11 μl till ett av dessa rör för att uppnå en spädning på 1:100. Röret

vortexades (Vortex-Genie 2, Scientific Industries, New York, USA) och 11 μl togs från

detta rör och tillfördes till nästa rör vilket gav en spädning på 1:10 000. Detta upprepades

till det sista röret vilket gav en slutlig spädning på 1:1 000 000. Mellan varje spädning

vortexades rören noggrant.

10

Aeroba blododlingsflaskor (BACT/ALERT FA Plus, lot 4052283, bioMérieux, Inc,

Durham, USA) till S.aureus och anaeroba blododlingsflaskor (BacT/ALERT FN Plus

Anaerob, lot 4051919, bioMérieux, Inc, Durham, USA) till S.pneumoniae märktes upp.

Gummimembranet på flaskorna steriliserades genom att 99,9 % etanol droppades på det

och brändes av. Spruta 5 ml Omnifix S med “kanyl, injektion 1,2 x 50 mm rosa, Sterican

18 G x2” användes för att dra upp 5 ml defibrinerat hästblod (Håtunalab AB; Håtunaholm,

Sverige). Blodet sprutades ner i flaskorna. Gummimembranet på flaskorna desinficerades

igen. Spruta 1 ml MX Omnifix S med kanyl användes för att dra upp och spruta ner 1 ml

av de spädda bakteriesuspensionerna i flaskorna. Gummimembranen desinficerades och

brändes av igen och placerades i instrumentet BacT/ALERT Virtuo (bioMérieux, Inc,

Durham, USA).

Metoden ovan följde rekommenderad Quality control (QC) -metod från EUCAST (27).

Första dagen ympades enbart dubbelprover av de två kontrollstammarna av S.aureus, där

det sista spädningssteget utfördes i två rör för att uppnå en tillräcklig mängd. Under första

perioden av studien analyserades S.aureus och därefter S.pneumoniae; 2–4 av de kliniska

isolaten samt de två kontrollstammarna av samma art som de kliniska isolaten analyserades

varje dag.

2.3 Rapid antimicrobial susceptibility testing

De positiva flaskorna togs ur blododlingsskåpet på morgonen, flaskorna hade indikerats

positiva 5–11 timmar innan de hämtades. Gummimembranet på flaskorna steriliserades

genom att 99,9 % etanol droppades på det och brändes av. En steril ventilationsnål (sterile

airway needle/subculture units) stacks i flaskorna och ca 6 droppar blod blandat med

flaskinnehåll droppades på en MH-platta (agarbas från OXOID, Basingstoke, UK) för

S.aureus och på en MHF-platta för S.pneumoniae. Antalet droppar från de positiva

blododlingsflaskorna som skulle användas beräknades genom att ett visst antal droppar

från en blododlingsflaska droppades i ett rör. Innehållet i röret sögs upp med en 1 ml spruta

och volymen noterades. Målet var volymen 100–150 µl.

11

Provet spreds tätt på plattorna med bomullspinne när plattorna stod på en plattrotator

(Retro C80, bioMérieux, Marcy-l'Étoile, Frankrike). Antibiotikadiskar i tabell I

applicerades på MH-plattan enligt figur 2 och antibiotikadiskarna i tabell II applicerades på

MHF-plattorna enligt figur 3. För att detektera MRSA användes cefoxitin (33) och för att

detektera PNSP användes oxacillin (34). Klockslaget för inkubering antecknades och MH-

plattorna placerades i termostat 34-36ºC och MHF-plattorna placerades i 34-36ºC i en

inkubator (BINDER, Tuttlingen, Tyskland) med 5 % CO2 atmosfär.

Tabell I De antibiotikadiskar som använts för resistensbestämning av S.aureus.

Antibiotika Styrka (µg) Förkortning Tillverkare Lot

Cefoxitin 30 FOX OXOID, Basingstoke, UK 2369739

Norfloxacin 10 NOR OXOID, Basingstoke, UK 2307141

Gentamicin 10 CN OXOID, Basingstoke, UK 2384907

Klindamycin 2 DA OXOID, Basingstoke, UK 2127202

Erytromycin 15 E OXOID, Basingstoke, UK 2322760

Figur 2 Schema för antibiotikadiskarnas placering på Mueller-Hintonplattorna S.aureus odlades på. NOR

står för norfloxacin, DA står för klindamycin, E står för erytromycin, FOX står för cefoxitin och CN för

gentamicin.

12

Tabell II De antibiotikadiskar som använts för resistensbestämning av S.pneumoniae.

Plattorna togs ut från termostaten och eventuella zoner runt diskarna mättes av två personer

oberoende av varandra. Till hjälp i detta arbete användes den personal på laboratoriet som

för dagen var placerad på arbetsstationen för blododlingar. Detta innebar att totalt 8 olika

personer med behörighet för resistensavläsning deltog vid zonregistreringarna. Således

erhölls 2 zonregistreringar för varje platta efter 4 timmars inkubering ± 5 min. Inom 10

min återinkuberades plattorna. Proceduren upprepades efter 6 och 8 timmar.

Zondiametrarna jämfördes med brytpunkterna för bedömning vid RAST enligt tabell från

EUCAST (35). För S.aureus-isolaten mättes inte zonerna runt erytromycindisken då

brytpunkter inte är framtagna. Erytromycin användes enbart för att upptäcka inducerbar

klindamycinresistens (28).

Antibiotika Styrka (µg) Förkortning Tillverkare Lot

Oxacillin 1 OX OXOID, Basingstoke, UK 1836707

Norfloxacin 10 NOR OXOID, Basingstoke, UK 2307141

Klindamycin 2 DA OXOID, Basingstoke, UK 2127202

Erytromycin 15 E OXOID, Basingstoke, UK 2322760

Trimethoprim-sulfamethoxazole 25 SXT OXOID, Basingstoke, UK 2412888

Figur 3 Schema för antibiotikadiskarnas placering på Mueller-Hinton-fastidiousplattorna

S.pneumoniae odlades på. NOR står för norfloxacin, DA står för klindamycin, E står för

erytromycin, OX står för oxacillin och SXT för trimethoprim-sulfamethoxazol.

13

Alla uppmätta zondiametrar registrerades i ett diagram i Excel för att kunna ställa resultatet

från RAST mot resultaten från standardiserad diskdiffusion.

2.4 Viable count

Vid ett tillfälle per bakterieart kontrollerades tätheten i inokulatet vid bakterietillsats till

blododlingsflaskorna. Vid korrekt spädning skulle det vara 100-200 colony forming units

(CFU)/ml. Spädning utfördes på samma sätt som då bakterier skulle sättas till

blododlingsflaskor. Från röret med spädningen 1:1 000 000 pipetterades 100 μl upp med

automatpipett och spreds på blodagarplatta. Plattorna inkuberades i termostat 34-36ºC över

natt och därefter räknades kolonierna på plattan. Det skulle vara 10–20 kolonier på plattan

för att spädningen skulle kunna godkännas.

2.5 Avläsningsvariation

Avläsningsvariationen mellan personal på laboratoriet kontrollerades genom att ytterligare

en platta för snabb resistensbestämning inokulerades. Denna platta användes för

obereoende zonavläsning av 6 personer efter 6 timmars inkubering. Uppmätta

zondiametrar antecknades.

2.6 Standardiserad diskdiffusion

Standardiserad diskdiffusion enligt EUCAST’s metod användes för att bestämma

bakteriernas resistens eller känslighet. Kolonier från blodagar av stammar som odlats över

natt slammades i 1,5 ml NaCl 0,9 % tills 0,5 ± 0,1 McFarland uppnåtts, vilket

kontrollerades med DensiCheck plus. En steril bomullspinne användes för att jämnt stryka

ut de slammade S.aureus på en MH-platta och S.pneumoniae på en MHF-platta med hjälp

av plattrotator (24). Antibiotikadiskarna i tabell I placerades enligt schemat i figur 2 på

MH-plattorna, antibiotikadiskarna i tabell II placerades enligt figur 3 på MHF-plattorna.

MH-plattorna placerades i termostat i 34-36ºC och MHF-plattorna i 34-36ºC med 5 % CO2

i 16–20 h.

14

2.7 Etik

Under hela försöket har de isolat som använts inte kopplats till någon patientinformation.

Detta leder till att patientens integritet skyddas. Vid tillfällen där patientdata varit synlig,

exempelvis vid kontroll av tidigare resultat gäller sekretessen (offentlighets- och

sekretesslagen, ((2009:400 OSL) kap 25, 1§). Etikprövning krävs inte för

laboratorieundersökningar med enbart bakterier.

3 Resultat


3.1.1 Kontroller

Mätvärden från RAST av kontrollstammen CCUG15915 (känslig S.aureus) jämfördes med

av EUCAST bestämda målvärden och målintervall. Sammanlagt 5 gånger var resultat

utanför målintervallet, norfloxacin efter 4 timmar och klindamycin vid alla mättillfällen.

30 mätningar utfördes per mättillfälle och antibiotikadisk. Av de beräknade medianerna var

klindamycin under målvärdet efter 4 timmar och gentamicin under målvärdet efter 6

timmar, se tabell III. För rådata se bilaga I tabell X, XI och XII.

15

Tabell III Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen

CCUG15915 (S.aureus) vid de dagliga mätningarna efter 4, 6 och 8 timmar samt av EUCAST bestämda

målvärden och målintervall. Röd färg indikerar att medianen inte stämde överens med målvärdet eller att

högsta/lägsta värden inte låg inom målintervallet.

Antibiotika

Målvärde

(mm)

Zondiameter

(median,

mm)

Målintervall

(mm)

Lägsta uppmätta

värde (mm)

Högsta uppmätta

värde (mm)

4h

Cefoxitin 17 17 15–19 15 18

Norfloxacin 15 15 13–17 13 18

Gentamicin 16–17 16 14–19 14 19

Klindamycin 17–18 16 15–20 14 18

6h

Cefoxitin 19–20 20 17–22 18 21

Norfloxacin 16–17 17 14–19 14 19

Gentamicin 18 17 15–21 15 19

Klindamycin 20 19,5 17–23 16 23

8h

Cefoxitin 21–22 22 19–24 21 23

Norfloxacin 17–18 18 15–20 15 20

Gentamicin 18 18 15–21 16 20

Klindamycin 21 21 18–24 17 22

För kontrollstammen CCUG35600 (MRSA) saknas bestämda målvärden och målintervall

vid RAST-metoden. Av 30 mätningar per mättillfälle och antibiotika skedde en

felkategorisering för cefoxitin efter 4 timmar. För beräknad median, högsta och lägsta

värde efter 4, 6 och 8 timmar se tabell IV. För rådata se bilaga I tabell XIII, tabell XIV och

tabell XV.

16

Tabell IV Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen

CCUG35600 (MRSA) vid de dagliga mätningarna efter 4, 6 och 8 timmar. Till höger visas EUCAST’s

brytpunkter. Röd färg innebär att en felkategorisering skett.

Antibiotika Zondiameter

(median,

mm)

Lägsta

uppmätta

värde (mm)

Högsta

uppmätta

värde (mm)

S ≥ ATU R <

4h

Cefoxitin 14 12 16 16 15 15

Norfloxacin 14 11 16 13 ≤12 -

Gentamicin 13 11 16 14 12–13 12

Klindamycin 7 7 7 16 ≤15 -

6h

Cefoxitin 14,5 13 16 18 17 17

Norfloxacin 16 14 18 14 13 13

Gentamicin 14,5 13 16 15 13–14 13

Klindamycin 7 7 7 19 16–18 16

8h

Cefoxitin 15 13 16 19 18 18

Norfloxacin 18 16 20 15 14 14

Gentamicin 15 14 17 16 14–15 14

Klindamycin 7 7 7 19 16–18 16

3.1.2 Kliniska isolat

Resultatet från RAST-metoden visar att inga av de testade kliniska stammarna

felkategoriserades för norfloxacin, cefoxitin eller gentamicin efter sammanlagt 414

mätningar (tabell V). För klindamycin har 5 mätningar visat VME efter 4 timmar, och en

mätning efter 6 timmar. En stam hade även ett ME efter 6 timmar. För rådata från RAST

samt den standardiserade diskdiffusionsmetoden se bilaga II tabell XVI.

Efter 4 timmar var det sammanlagt 63 av 184 avläsningar på 23 plattor som inte kunde

bedömas. Efter 6 och 8 timmar kunde samtliga zoner läsas av. 92 zoner bedömdes av två

personer vid tre tidpunkter. Vid 4 timmar var 102/184 (55 %) avläsningar

kategoriseringsbara (utanför ATU). Vid 6 timmar var 164/184 (89 %) avläsningar

17

kategoriseringsbara. Vid 8 timmar var 174/184 (95 %) kategoriseringsbara. Av de

sammanlagt 552 mätningarna var alltså 440 kategoriseringsbara. Samtliga MRSA kunde

detekteras redan vid 6 timmar.

Tabell V Resultatet för 23 S.aureus-stammar med 4 antibiotikadiskar som lästes av vid 3 avläsningstillfällen.

Vid varje avläsningstillfälle har 2 separata registreringar av varje zon gjorts av 2 oberoende avläsare. Gul

färg innebär att avläsning inte kunnat utföras eller att zonen hamnat i ATU-zonen och därmed inte ger ett

rapporteringsbart resultat. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. ”D” står för ”D-zon”. Siffrorna

visar antalet mätningar.

Cefoxitin 4h 6h 8h

R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar Totalt

Förväntat

resistenta 25 0 0 5 30 0 0 0 30 0 0 0 30

Förväntat

känsliga 0 1 10 5 0 1 15 0 0 0 16 0 16

Norfloxacin 4h 6h 8h

R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar Totalt

Förväntat

resistenta 0 1 0 5 6 0 0 0 6 0 0 0 6

Förväntat

känsliga 0 3 23 14 0 2 38 0 0 0 40 0 40

Gentamicin

4h 6h 8h

R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar R ATU S

Ej

läsbar Totalt

Förväntat

resistenta 0 0 0 2 2 0 0 0 2 0 0 0 2

Förväntat

känsliga 0 7 27 10 0 2 42 0 0 3 41 0 44

Klindamycin

4h 6h 8h

R D ATU S

Ej

läsbar R D ATU S

Ej

läsbar R D ATU S

Ej

läsbar Totalt

Förväntat

resistenta 1 0 3 5 5 5 8 0 1 0 4 10 0 0 0 14

Förväntat

känsliga 0 0 4 11 17 1 0 16 16 0 0 0 7 25 0 32


3.2.1 Kontroller

För kontrollstammen CCUG33638 (PNSP) var medianen vid 9 tillfällen lägre än

målvärdet. Detta gällde all testad antibiotika efter 4 timmar och alla utom oxacillin efter 8

timmar. Sammanlagt 10 mätvärden var lägre än målintervallet efter 4 timmar, varav 5 för

18

erytromycin (se tabell VI). För rådata se bilaga III tabell XVII, XVIII och XIX.

Tabell VI Tabellen visar medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för kontrollstammen

CCUG33638 (PNSP) från 30 mätningar per antibiotika på 15 plattor efter 4, 6 och 8 timmar i relation till

angivet målvärde och accepterat målintervall från EUCAST. Röd färg indikerar att medianen inte stämde

överens med målvärdet eller att högsta/lägsta värden inte låg inom målintervallet.

Antibiotika

Målvärde

(mm)

Zondiameter

(median,

mm)

Målintervall

(mm)

Lägsta

uppmätta

värde

(mm)

Högsta

uppmätta

värde

(mm)

4h

Oxacillin 10 9 8–12 8 10

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

16 14 13–19 12 16

Norfloxacin 14–15 12 12–17 10 13

Klindamycin 17–18 15 15–20 14 16

Erytromycin 19 14,5 16–22 12 16

6h

Oxacillin 11 11 9–13 10 11

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

17 16,5 14–20 15 18

Norfloxacin 15–16 15 13–18 14 15

Klindamycin 18–19 18 16–21 17 19

Erytromycin 21 20,5 18–24 20 21

8h

Oxacillin 11–12 11 9–14 10 12

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

17 16 14–20 14 19

Norfloxacin 16 15 13–19 14 16

Klindamycin 19 17,5 16–22 16 18

Erytromycin 22 20,5 19–25 19 22

Den känsliga kontrollstammen saknar bestämda målvärden och målintervall. Efter 4

timmar gjordes vid 10 tillfällen felkategoriseringar med överskattning av resistens för

framförallt klindamycin men även erytromycin och norfloxacin. För lägsta och högsta

värde samt median se tabell VII. För rådata se bilaga III tabell XX, tabell XXI och tabell

XXII.

19

Tabell VII Tabellen visar den medianen och de högsta och lägsta värdena från resultatet för den känsliga

kontrollstammen (S.pneumoniae) från 30 mätningar per antibiotika på 15 plattor efter 4, 6 och 8 timmar. Till

höger visas EUCAST’s bestämda brytpunkter. Röd färg innebär att en felkategorisering skett.

Zondiameter

(median,

mm)

Lägsta

uppmätta

värde (mm)

Högsta

uppmätta värde

(mm)

S ≥ ATU R <

4h

Oxacillin 16 14 16 16 14–15 14

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

14,5 11 15 12 10–11 10

Norfloxacin 11,5 6 13 11 9–10 9

Klindamycin 14 12 16 17 15–16 15

Erytromycin 16,5 14 20 19 17–18 17

6h

Oxacillin 18 18 19 19 17–18 17

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

18 17 19 12 10–11 10

Norfloxacin 13,5 12 15 12 10–11 10

Klindamycin 18 17 20 17 15–16 15

Erytromycin 21,5 19 22 19 17–18 17

8h

Oxacillin 20,5 19 22 20 18–19 18

Trimethoprim-

sulfamethoxazol

21 17 22 12 10–11 10

Norfloxacin 15 13 16 12 10–11 10

Klindamycin 20 18 22 17 15–16 15

Erytromycin 24 21 25 19 17–18 17

3.2.2 Kliniska isolat

Resultatet för RAST-metoden visar att inga av de testade kliniska stammarna uppvisat

VME eller ME för oxacillin. För Trimethoprim-sulfamethoxazol var det efter 4 timmar och

80 avläsningar en felkategorisering, för norfloxacin 2, klindamycin 13 och erytromycin 5.

Det var sammanlagt 21 felkategoriseringar vid 224 kategoriseringsbara mätningar på 8

stammar.

40 zoner bedömdes av två personer vid tre tidpunkter. Vid 4 timmar var 74/80 (92 %)

avläsningar kategoriseringsbara (utanför ATU). Vid 6 timmar var 73/80 (91 %) avläsningar

kategoriseringsbara. Vid 8 timmar var 77/80 (96 %) kategoriseringsbara. Samtliga PNSP

kunde detekteras efter 4 timmar. För rådata från RAST samt den standardiserade

diskdiffusionsmetoden se bilaga IV tabell XXIII.

20

Tabell VIII Resultatet för 8 S.pneumoniae-stammar med 5 antibiotikadiskar som lästes av vid 3

avläsningstillfällen. Vid varje avläsningstillfälle har 2 separata registreringar av varje zon gjorts av 2

oberoende avläsare. Gul färg innebär att avläsning inte kunnat utföras eller att zonen hamnat i ATU-zonen

och därmed inte får svaras ut. Röd färg innebär att en felkategorisering skett. Siffrorna visar antalet

mätningar.

Oxacillin 4h 6h 8h

R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar R ATU S Ej läsbar Totalt

Förväntat resistenta 12 0 0 0 12 0 0 0 12 0 0 0 12

Förväntat känsliga 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 0 4

Trimethoprim-

sulfamethoxazol 4h 6h 8h




Norfloxacin

4h 6h 8h




Klindamycin 4h 6h 8h




Erytromycin

4h 6h 8h





Variationen i avläsningen undersöktes genom att personal på laboratoriet efter 6 timmar

läste av samma platta. Avläsningsvariationen var olika för olika antibiotika (tabell IX).

Variationen var överlag liten men var störst för norfloxacin som gav en dubbel zon och

klindamycinzonen som hade något otydlig zonkant.

21

Tabell IX Tabellen visar resultatet från undersökningen av avläsningsvariationen. Sex personer i personalen

som har behörighet för resistensbestämning mätte zonerna på samma platta efter 6 timmars inkubering.

4 Diskussion Syftet med studien var att undersöka hur väl RAST-metoden fungerade på S.aureus och

S.pneumoniae jämfört med EUCAST’s standardiserade diskdiffusionsmetod. Resultaten

var varierande då metoden fungerade relativt väl för S.aureus när resultaten jämfördes med

de från standardiserad diskdiffusion medan det för S.pneumoniae skedde ett stort antal

felkategoriseringar.


Avläsningsvariationen bland laboratoriepersonalen kan påverka resultat. Under studien var

det mycket få tillfällen där endast en av avläsarna felkategoriserat. Den undersökning av

avläsningsvariation som utfördes visade att personalen som mest mätte med 5 mm skillnad

på en disk medan skillnaderna var mycket små på två av diskarna. På laboratoriet finns

dokument där kontrollstammar resistensbestämts med diskdiffusion vid upprepade

tillfällen och då är den största variationen 4 mm för S.aureus. Zonerna är svårare att läsa av

vid RAST då bakterien haft kort tid att växa och för att kunna se zoner kan det vara

nödvändigt att hitta en väldigt exakt vinkel i förhållande till ljuset. Detta är något

personalen inte är vana vid vilket kan ha bidragit till variationen. Vid vissa tillfällen

inträffade det att en av avläsarna tolkade det som att bakterierna växte intill disken även då

Antibiotika Uppmätta zondiametrar (mm) Intervall (mm)

Cefoxitin 12 11 11 11 11 11 11–12

Norfloxacin 9 6 8 9 8 8 6–9

Gentamicin 12 11 11 11 11 11 11–12

Klindamycin 19 24 20 19 21 19 19–24

22

ingen växt var synlig. Materialet från blododlingsflaskan misstolkades alltså som tillväxt

vilket ledde till felkategorisering.

Under första försöksdagen upptäcktes det att rotator till spridning på agarplatta var

nödvändigt då zonerna var svårare att tyda om spridning gjordes för hand. Det var även

viktigt att sprida proverna på agarplattorna snabbt då blodet rann ut från mitten av plattan

och sjönk ner i agarn och färgen störde avläsningen.


Resultaten för S.aureus visade att 35 % av zonerna inte kunde mätas efter 4 timmar. Av

dessa var majoriteten de där ingen av de två avläsarna kunde se några zoner. Vid de övriga

tillfällen då zon inte kunnat läsas av var det bara en person som inte kunde se en zon.

Majoriteten av dessa gällde klindamycinzonen. Efter 4 timmar var det dessutom 5 resultat

med felkategoriseringar med underskattning av resistens för klindamycin.

Alla resultat kunde läsas av efter 6 och 8 timmar även om det var 21 mätvärden av 184 i

ATU-zonen efter 6 timmar och 10 mätvärden av 184 i ATU-zonen efter 8 timmar. Detta

innebär att resultatet inte skulle kunna svaras ut om metoden användes i rutinarbetet på

laboratoriet.

De 5 mätvärden som efter 4 timmar gjorde att stammarna bedömdes som känsliga trots att

de var resistenta berodde på inducerbar klindamycinresistens. Efter 4 timmar var ”D-

fenomenet” inte synligt vilket ledde till felaktig bedömning. Efter 6 timmar var det vid ett

mättillfälle där den inducerbara klindamycinresistensen inte upptäcktes. Att mäta zoner

efter 4 timmar kan efter denna studie bedömas osäkert då den inducerbara

klindamycinresistensen inte upptäcks samt att flera zoner inte kan läsas av. Vid 36 tillfällen

kunde cefoxitinzonen läsas av redan efter 4 timmar och vid endast 10 tillfällen var den inte

avläsningsbar. Därför skulle det eventuellt vara möjligt att använda RAST för enbart

cefoxitin efter 4 timmar.

23


För S.pneumoniae var det större problem än för S.aureus med felkategoriseringar. Detta

gällde både kontrollstammarna och de kliniska isolaten. Vid mätningar efter 4 timmar

skedde 20 ME vid 80 mätningar för de kliniska isolaten. Av dessa 80 mätningar skulle 26

mätvärden påvisa resistens och ME kan därmed inte uppstå för dem. Detta innebär att 20

av 54 mätningar resulterade i felkategoriseringar med överskattning av resistens. Efter 6

timmar skedde inga felkategoriseringar och efter 8 h erhölls ett enstaka avvikande resultat

som inte kontrollerats vidare.

Det är oklart varför så många fel uppstått för RAST vid analys av S.pneumoniae men

bakterien har varit något mer problematisk än S.aureus under arbetet. S.aureus i

blododlingsflaskor har varit i blododlingsskåpen i ca 19 timmar innan de resistensbestämts

med RAST. Odlingarna har larmat positiva efter 9–11 h men plockats ur ytterligare 10 h

senare då de blivit positiva under natten. När S.pneumoniae hanterades på samma sätt

överlevde de inte till morgonen och inget kunde växa vid RAST. För att öka

överlevnadschanserna placerades flaskorna i blododlingsskåpet senare på dagen i aeroba

flaskor och då ökade överlevnaden men tillväxten var fortfarande så dålig att inget kunde

avläsas efter 4 timmar. Nya försök utfördes med anaeroba flaskor istället för aeroba som

sattes ännu senare på eftermiddagen och togs ur tidigare på morgonen. De befann sig då

enbart ca 3–5 timmar i blododlingsskåpet efter larmtid och zoner kunde läsas av efter 4

timmar. Endast dessa resultat med urladdning max 3-5 timmar efter positivt larm har

redovisats i studien.

En möjlighet är att bakterierna i den positiva blododlingsflaskan påverkats negativt av den

förlängda inkubationstiden i flaskan. Det är välkänt på laboratoriet att Streptococcus

pneumoniae har en sämre återväxt jämfört med de flesta andra bakteriearter efter en tids

förvaring på fasta eller i flytande medier (36). Något som stärker teorin men inte bekräftar

den är att det sista provet (se rådata i bilaga IV) är det enda som uppvisat en känslig

klindamycinzon redan efter 4 h. Detta specifika prov kom från en flaska som till skillnad

från alla andra inte var positiv då de skulle tas ur på morgonen utan blev positiv senare och

därmed kunde hanteras direkt efter positivt larm.

24

Inga felkategoriseringar gjordes för oxacillin. Oxacillin används för att upptäcka PNSP

(35) och det skulle därför vara önskvärt att kunna använda metoden för enbart oxacillin

men då endast två oxacillinkänsliga stammar samt kontrollstammen använts finns inte

tillräckligt mycket data för att säkerställa att felkategoriseringar inte kan ske för oxacillin.

Med fortsatta undersökningar kan metoden förhoppningsvis användas för

oxacillinresistensbestämning efter 6 timmar.

4.4 Ekonomiska aspekter och klinisk relevans

Då mortaliteten ökar varje timme efter att septisk chock uppstått (2) kan det vara

livsavgörande att en resistens upptäcks så pass mycket tidigare som den gör vid RAST än

med standardmetoden. Det kan också tilläggas att en sepsispatient som intensivvårdas

kostar ca 300 000 kr (5) vilket innebär att en snabbare vård som leder till ett tidigare

tillfrisknande även är positivt ur ett ekonomiskt perspektiv.

Under 2018 var det enligt lokal statistik endast 4 fall av MRSA och PNSP, vilket innebär

att metoden i många fall kommer vara onödig för att en korrekt behandling ska ges i tid

eftersom den primära sepsisbehandlingen då fungerar. Men metoden är viktig för de

patienter som är drabbade, även om Sverige har relativt få fall. Infektioner av resistenta

bakterier är det betydligt vanligare i andra länder där det ibland kan vara över hälften av

alla S.aureus-infektioner som orsakas av MRSA (5). Om det blir lika vanligt i Sverige kan

det vara viktigt att redan ha en väl fungerande metod för snabb diagnostik.

Under studien användes en stor mängd engångsmaterial i form av blododlingsflaskor,

sprutor och kanyler. Då de kontaminerades med bakterier kunde de inte sorteras

miljövänligt enligt material utan i gula avfallsbackar för smittförande material samt

stickande/skärande material. Övrigt material sorterades som plast och papper. Vid

användning av metoden kliniskt används endast en liten mängd material (agarplattor och

antibiotikadiskar).

Fortsatt undersökning av metoden skulle förutom att inkludera fler oxacillinkänsliga

S.pneumoniae kunna innefatta ytterligare försök för att se skillnaderna mellan aeroba och

25

anaeroba odlingsflaskor. 35 % av zonerna för S.aureus kunde som tidigare nämnts inte

läsas av efter 4 timmar, men enbart aeroba flaskor användes. Skillnaderna mellan flaskorna

var stora då S.pneumoniae odlades i dem och det är därför möjligt att samma skillnader

skulle ses för S.aureus efter 4 timmar. Det skulle även vara möjligt att undersöka hur tid

mellan positivt larm för flaskorna och utodling påverkar zondiametrarna samt att utvärdera

metoden även för andra bakterier.

4.5 Slutsats

Sammanfattningsvis kan det konstateras att RAST fungerade väl för S.aureus, speciellt

efter 6 och 8 timmar och skulle därmed kunna användas i rutinarbetet vid klinisk

mikrobiologi i Kalmar. En hög andel av mätningarna gav samma resultat som med

standardiserad diskdiffusion. Metoden bör däremot utvärderas vidare för S.pneumoniae då

flertalet felkategoriseringar skedde av de kliniska stammarna och inte ens

kontrollstammarna uppfyllde kraven, denna bör i nuläget därför inte användas i rutinarbete.

Tack Ett stort tack till kliniskt mikrobiologiska laboratoriet i Kalmar för att jag fick göra mitt

examensarbete där. Jag vill tacka personalen som tålmodigt har hjälpt mig att utföra dubbla

mätningar varje dag och anpassat sina lunch- och fikatider efter mitt arbete, samt svarat på

mina frågor och hjälpt mig när jag bett om hjälp. Jag vill även tacka min externa

handledare Annika Wistedt som hjälpt mig mycket med upplägg av både det praktiska

arbetet och rapportskrivandet samt min interna handledare Monika Filipsson som gett

feedback på min rapport.

26

Referenser

1. Bauman WR. Microbiology with Diseases by Taxonomy. 5 uppl. Essex: Pearson

Education Limited; 2016.

2. Andersson M, Brink M, Cronqvist J, Furebring M, Gille-Johnson P, Ljungström L, et al.

Vårdprogram Sepsis och septisk chock – tidig identifiering och initial handläggning.

Skapad 2008. Reviderad 2018.

3. Klinisk mikrobiologi, Kalmar län. Frölander K. Arbetsplatsbeskrivning Blodavdelningen

[Lokal arbetsplatsbeskrivning] Reviderad 2018-05-15.

4. Gyawali B, Ramakrishna K, Dhamoon AS. Sepsis: The evolution in definition,

pathophysiology, and management. SAGE Open Med. 2019;7:1-13.

5. Melhus Å. Klinisk mikrobiologi för sjuksköterskor. 2 uppl. Lund: Studentlitteratur AB;

2013.

6. Andersson M, Östholm-Balkhed Å, Fredrikson M, Holmbom M, Hällgren A, Berg S, et

al. Delay of appropriate antibiotic treatment is associated with high mortality in patients

with community-onset sepsis in a Swedish setting. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2019

Mar;25:1-12.

7. Ericsson E, Ericsson T. Klinisk mikrobiologi. 4 uppl. Stockholm: Liber; 2009.

8. Gonsalves WI, Cornish N, Moore M, Chen A, Varman M. Effects of volume and site of

blood draw on blood culture results. J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3482-5.

9. Totty H, Ullery M, Spontak J, Viray J, Adamik M, Katzin B, et al. A controlled

comparison of the BacT/ALERT(R) 3D and VIRTUO microbial detection systems. Eur J

Clin Microbiol Infect Dis. 2017 Okt;36(10):1795-800.

10. Doern CD, Mirrett S, Halstead D, Abid J, Okada P, Reller LB. Controlled Clinical

Comparison of New Pediatric Medium with Adsorbent Polymeric Beads (PF Plus) versus

Charcoal-Containing PF Medium in the BacT/Alert Blood Culture System. J Clin

Microbiol. 2014 Jun;52(6):1898-900.

27

11. Bipacksedel, bioMérieux. BacT/ALERT FA Plus (2016–04).

12. Bipacksedel, bioMérieux. BacT/ALERT FN Plus (2017–11).

13. Klinisk mikrobiologi, Kalmar län. Frölander K. Utodling av positiva flaskor [Lokal

metodbeskrivning] Reviderad 2018-05-16.

14. Klinisk mikrobiologi, Kalmar län. Frölander K. Blododlingsdiagnostik (B). [Lokal


15. Klinisk mikrobiologi, Kalmar län. Frölander K. Åtgärder vid positiv flaska. [Lokal


16. Lowy FD. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. J Clin

Invest. 2003 May;111(9):1265–73.

17. Folkhälsomyndigheten. Meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) [internet].

Stockholm: Folkhälsomyndigheten; 2017. [citerad 2019-05-14] Hämtad från

https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-

och-visualisering/sjukdomsstatistik/meticillinresistenta-gula-stafylokocker-mrsa/

18. Steen M, Degré M. MIKROBIOLOGI. 1 uppl. Lund: Studentlitteratur; 2011.

19. Folkhälsomyndigheten. Pneumokocker med nedsatt känslighet för penicillin G (PNSP)

[internet]. Stockholm: Folkhälsomyndigheten; 2017. [citerad 2019-05-14] Hämtad från

https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-

och-visualisering/sjukdomsstatistik/pneumokockinfektion-penicillinresistent-

pnsp/?t=county

20. Sköld O. Antibiotika och antibiotikaresistens. 1 uppl. Lund: Studentlitteratur AB; 2006.

21. Delialioglu N, Aslan G, Ozturk C, Baki V, Sen S. Emekdas, G. Inducible Clindamycin

Resistance in Staphylococci Isolated from Clinical Samples. Jpn. J. Infect. Dis.

2005;58:104-106.

22. Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Påvisning av inducerbar

MLSB-resistens hos stafylokocker och streptokocker. [Metoddokument]. Reviderad 2015-

03-20.

https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-och-visualisering/sjukdomsstatistik/meticillinresistenta-gula-stafylokocker-mrsa/

https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-och-visualisering/sjukdomsstatistik/meticillinresistenta-gula-stafylokocker-mrsa/

https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-och-visualisering/sjukdomsstatistik/pneumokockinfektion-penicillinresistent-pnsp/?t=county



28

23. Norrby R, Cars O. Antibiotika och kemoterapi, behandling av infektioner i öppen vård.

8 uppl. Stockholm: Liber; 2003.

24. Fiebelkorn KR, Crawford SA, McElmeel ML, Jorgensen JH. Practical disk diffusion

method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and

coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol. 2003 Oct;41(10):4740-4.

25. Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion

antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology

laboratories. Clin Microbiol Infect. 2014 Apr;20(4):O255-66.

26. Giske CG, Hanberger H, Kahlmeter G, SIR-systemet för att beskriva bakteriers

resistens ändras »I« betyder nu »känslig vid ökad antibiotikaexponering« Läkartidningen.

2019;116.

27. Matuschek E, Ahman J, Webster C, Kahlmeter G. Antimicrobial susceptibility testing

of colistin - evaluation of seven commercial MIC products against standard broth

microdilution for Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and

Acinetobacter spp. Clin Microbiol Infect. 2018 Aug;24(8):865-70.

28. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Methodology -

EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood

culture bottles. version 1,1; 2019.

29. Blaschke AJ, Heyrend C, Byington CL, Fisher MA, Barker E, Garrone NF, et al. Rapid

identification of pathogens from positive blood cultures by multiplex polymerase chain

reaction using the FilmArray system. Diagn Microbiol Infect Dis. 2012 Dec;74(4):349-55.

30. Culture Collection University of Gothenburg. CCUG15915 – Staphylococcus aureus

subsp. aureus. [Internet] [citerad 2019-05-06] Hämtad från

https://www.ccug.se/strain?id=15915

31. Culture Collection University of Gothenburg. CCUG 35600 - Staphylococcus aureus

subsp. aureus. [Internet] [citerad 2019-05-06] Hämtad från




29

32. Culture Collection University of Gothenburg. CCUG 33638 - Streptococcus

pneumoniae. [Internet] [citerad 2019-05-06] Hämtad från


33. Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Screening for Methicillin

resistant Staphylococcus aureus (MRSA). [Metoddokument]. Skapad 2017-08-01.

34. Nordic Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Streptococcus pneumoniae.

Påvisning av nedsatt penicillinkänslighet. [Metoddokument]. Skapad 2013-05-14.

Reviderad 2015-11-13.

35. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Zone diameter

breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood

culture bottles. Version 1.1, 2019.

36. Vasallo F, Lopez-Miragaya I, Ridriquez A, Torres J. Apparently false-positive blood

cultures due to autolyzed Streptococcus pneumoniae. Clin Microbiol Infect.

2000;6(12):688-689.


Bilaga I Rådata Staphylococcus aureus kontrollstammar

Tabell X Alla mätvärden för kontrollen CCUG15915 (S.aureus) vid 4h. Grön färg innebär ”känslig”, gul färg innebär ”ATU” och grå innebär att avläsning inte varit

möjlig. Ljusblå färg innebär att mätning inte utförts av annan anledning än att zoner inte varit synliga.

Tabell XI Alla mätvärden för kontrollen CCUG15915 (S.aureus) vid 6h. Grön färg innebär ”känslig”, gul färg innebär ”ATU” och ljusblå färg innebär att mätning inte

utförts av annan anledning än att zoner inte varit synliga.

Tabell XII Alla mätvärden för kontrollen CCUG15915 (S.aureus) vid 8h. Grön färg innebär ”känslig” och ljusblå färg innebär att mätning inte utförts av annan

anledning än att zoner inte varit synliga.

8h CCUG15915

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 21 22 22 21 22 22 22 21 22 22 23 22 23 21 22 21 21 23 21 22 22 21 23 23

Norfloxacin 19 18 18 18 19 19 17 18 18 19 19 20 18 18 17 16 17 18 18 17 18 19 19 18 17 15 17 16 19 19

Gentamicin 17 19 18 18 18 18 19 20 19 18 18 19 19 18 18 16 18 19 20 20 18 18 20 19 18 16 18 16 19 19

Klindamycin 20 20 22 21 20 19 22 22 20 21 21 21 21 19 21 17 21 21 20 19 20 20 22 22 18 17 21 22 22 21

4h CCUG15915

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 17 17 16 18 15 18 16 18 16 18 17 18 17 18 16 17 17 18 17 17 18 18

Norfloxacin 14 16 14 16 14 17 13 16 16 17 15 17 15 15 14 14 15 15 15 15 15 15 16 15 13 14 17 18

Gentamicin 15 16 16 17 14 14 14 17 15 16 17 17 16 15 14 14 14 16 16 19 15 16 16 15 14 14 17 17

Klindamycin 17 17 17 17 16 18 16 16 16 15 14 15 15

6h CCUG15915

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 18 20 20 20 18 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 19 18 20 20 20 21 21 20 21

Norfloxacin 16 17 15 16 16 17 16 17 17 17 17 18 18 18 16 15 16 17 17 17 17 16 17 17 16 14 16 15 17 19

Gentamicin 17 17 18 18 17 17 18 18 17 18 19 19 18 17 17 17 17 16 19 19 17 18 18 17 16 15 16 16 17 19

Klindamycin 18 19 19 17 20 20 18 19 20 20 21 19 22 22 19 17 19 20 20 20 19 20 18 17 17 16 20 22 23 23

Tabell XIII Alla mätvärden för kontrollen CCUG35600 (MRSA) vid 4h. Grön färg innebär ”känslig”, röd färg innebär ”resistent”, gul färg innebär ”ATU” och grå

innebär att avläsning inte varit möjlig. Ljusblå färg innebär att mätning inte utförts av annan anledning än att zoner inte varit synliga.

Tabell XIV Alla mätvärden för kontrollen CCUG35600 (MRSA) vid 6h. Grön färg innebär ”känslig”, röd färg innebär ”resistent”, gul färg innebär ”ATU” och ljusblå

färg innebär att mätning inte utförts av annan anledning än att zoner inte varit synliga.

6h CCUG35600

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 13 14 14 15 14 15 15 16 13 15 16 15 14 13 15 14 14 15 15 14 13 14 15 16

Norfloxacin 14 17 16 18 17 17 16 17 16 18 17 18 17 17 15 16 15 16 16 17 16 17 15 15 15 15 16 15 16 17

Gentamicin 13 15 14 15 15 15 15 15 13 15 15 15 15 13 14 13 14 14 14 15 14 15 14 15 13 14 13 14 15 16

Klindamycin 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

Tabell XV Alla mätvärden för kontrollen CCUG35600 (MRSA) vid 8h. Grön färg innebär ”känslig”, röd färg innebär ”resistent”, gul färg innebär ”ATU” och ljusblå

färg innebär att mätning inte utförts av annan anledning än att zoner inte varit synliga.

8h CCUG35600

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 13 15 13 16 15 16 14 16 15 16 15 15 15 15 14 15 14 15 15 15 14 14 15 16

Norfloxacin 16 19 18 18 18 19 18 20 19 18 17 19 19 19 16 18 17 18 17 19 18 18 18 17 18 17 17 17 17 18

Gentamicin 14 15 15 17 16 16 15 16 16 17 15 15 16 17 14 16 14 16 15 15 15 15 16 17 15 16 15 15 15 15

Klindamycin 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

4h CCUG35600

Antibiotika 190404 190405 190409 190410 190411 190412 190416 190417 190424 190425 190502

Cefoxitin 12 12 14 14 14 12 12 14 13 12 13 14 14 14 14 16

Norfloxacin 14 15 16 15 16 16 14 15 14 15 14 16 14 14 14 14 14 14 14 13 15 16 14 11 15 15

Gentamicin 13 16 13 15 12 12 13 12 13 13 13 11 13 14 11 14 14

Klindamycin 7 7 7 7 7 7 7

Bilaga II Rådata Staphylococcus aureus mätvärden Tabell XVI Till vänster visas resultat från standardiserad diskdiffusion med datum och prov angivet. Till

höger visas resultaten för RAST-metoden på samma stammar. Grön färg innebär ”känslig”, röd färg innebär

”resistent”, gul färg innebär ”ATU” och grå innebär att avläsning inte varit möjlig. ”D” innebär att D-zon ses.

Datum Stam Antibiotika Diameter (mm)

190404

CCUG15915,

Cefoxitin 31 29

Norfloxacin 22 20

Gentamicin 22 21

Klindamycin 27 25

190404

CCUG35600,

Cefoxitin 19 18

Norfloxacin 22 20

Gentamicin 20 20

Klindamycin 7 7 4h 6h 8h

190409

Isolat 1

Cefoxitin 13 13 11 12 12 12 11 12

Norfloxacin 26 23 14 14 17 17 18 18

Gentamicin 23 23 13 14 17 17 18 17

Klindamycin D D 16 16 D 20 D D

190409

Isolat 2

Cefoxitin 14 12 12 12 13 12 13 12

Norfloxacin 27 25 13 13 17 16 18 18

Gentamicin 23 23 13 14 17 16 18 18

Klindamycin D D 14 15 D D D D

190410

Isolat 3

Cefoxitin 13 12 11 11 11 11 11 13

Norfloxacin 28 28 14 15 16 18 18 21

Gentamicin 22 22 13 14 15 15 16 17

Klindamycin D D 13 D D D D

190410

Isolat 4

Cefoxitin 19 19 13 13 14 15 15 16

Norfloxacin 6 6 6 6 6 6 6

Gentamicin 22 22 15 14 16 16 18 18

Klindamycin 23 24 14 19 17 19 17

190411

Isolat 5

Cefoxitin 14 14 14 14 13 14

Norfloxacin 26 27 16 17 18 19

Gentamicin 22 22 17 17 18 19

Klindamycin 25 27 19 20 20 21

190411

Isolat 6

Cefoxitin 13 14 11 13 11 12 11 12

Norfloxacin 21 22 14 14 15 16 16 17

Gentamicin 23 24 12 13 15 15 16 15

Klindamycin 27 23 16 18 17 18 17

190412

Isolat 7

Cefoxitin 31 31 17 18 20 21 23 23

Norfloxacin 23 24 16 16 18 18 19 18

Gentamicin 22 22 17 15 16 17 18 18

Klindamycin 24 24 17 16 18 20 20 19

Datum Stam Antibiotika Diameter (mm) 4h 6h 8h

190412

Isolat 8

Cefoxitin 31 31 18 16 20 21 22 23

Norfloxacin 26 26 14 12 18 19 19 21

Gentamicin 23 23 16 16 18 18 19 18

Klindamycin 28 28 15 19 19 21 20

190416

Isolat 9

Cefoxitin 12 12 12 14 14 14 14

Norfloxacin 24 25 15 15 18 19 18 20

Gentamicin 23 24 15 15 18 18 19 19

Klindamycin 26 27 16 17 20 20 21 20

190416

Isolat 10

Cefoxitin 9 8 9 10 9 10 10 10

Norfloxacin 25 25 6 16 17 18 18

Gentamicin 22 22 15 15 16 17 16 17

Klindamycin D D 16 16 D D D D

190416

Isolat 11

Cefoxitin 14 14 12 13 13 14 14 15

Norfloxacin 22 23 17 17 17 18 19 19

Gentamicin 23 23 15 16 17 18 19 19

Klindamycin 26 28 17 16 19 20 21 21

190417

Isolat 12

Cefoxitin 11 11 9 10 10 11 11 10

Norfloxacin 26 26 13 6 16 15 17 16

Gentamicin 23 23 15 16 16 16 17 16

Klindamycin D D 18 D 15 D D

190417

Isolat 13

Cefoxitin 12 13 6 6 6 6 6 6

Norfloxacin 24 24 15 15 17 16 18 18

Gentamicin 23 23 15 14 16 16 18 18

Klindamycin 25 26 16 16 18 18 19 19

190417

Isolat 14

Cefoxitin 12 11 13 13 13 13 14 14

Norfloxacin 24 25 15 15 19 18 20 20

Gentamicin 24 23 15 16 18 17 20 19

Klindamycin 23 24 17 18 18 17 18 17

190424

Isolat 15

Cefoxitin 13 13 12 12 13 12 12 13

Norfloxacin 25 25 14 14 17 17 18 17

Gentamicin 23 22 14 13 17 17 19 18

Klindamycin 27 25 13 12 17 16 19 18

190424

Isolat 16

Cefoxitin 15 15 14 13 15 15 16 15

Norfloxacin 6 6 9 8 8 8

Gentamicin 13 12 10 9 11 10

Klindamycin 26 27 18 18 20 20

190424

Isolat 17

Cefoxitin 30 29 18 17 20 20 23 23

Norfloxacin 27 28 17 16 18 18

Gentamicin 26 22 13 17 17 19 18

Klindamycin 26 28 16 15 19 19

Datum Stam Antibiotika Diameter (mm) 4h 6h 8h

190424

Isolat 18

Cefoxitin 31 31 18 18 21 21 23 22

Norfloxacin 25 27 17 17 20 18

Gentamicin 25 23 18 17 21 20

Klindamycin 26 23 20 20 22 23

190425

Isolat 19

Cefoxitin 33 30 19 17 21 20

Norfloxacin 27 28 14 14 15 15

Gentamicin 24 24 14 14 15 15

Klindamycin 30 28 16 16 19 18

190425

Isolat 20

Cefoxitin 31 30 19 19 22 22

Norfloxacin 20 20 15 14 16 15

Gentamicin 22 22 16 15 17 16

Klindamycin 26 26 19 20 19 19

190425

Isolat 21

Cefoxitin 30 29 15 19 18 22 20

Norfloxacin 26 27 13 14 16 16

Gentamicin 21 21 14 15 15 17 16

Klindamycin 26 26 18 20 20 20

190502

Isolat 22

Cefoxitin 6 6 6 6 6 6

Norfloxacin 6 6 6 6 6 6

Gentamicin 23 23 15 14 16 18 17 17

Klindamycin 7 7 7 7 7 7

190502

Isolat 23

Cefoxitin 32 30 19 19 20 21 22 22

Norfloxacin 19 19 14 14 15 15 15

Gentamicin 25 24 17 17 17 17 19 17

Klindamycin 7 7 7 7 7 7 7

Bilaga III Rådata Streptococcus pneumoniae kontrollstammar Tabell XVII Alla mätvärden för kontrollen CCUG33638 (PNSP) vid 4h. Grön färg innebär ”känslig”, röd

färg innebär ”resistent” och gul färg innebär ”ATU”.

4h CCUG33638

Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 10 9 9 8 10 8

Trimethoprim-sulfamethoxazol 13 12 14 14 15 16

Norfloxacin 13 12 12 11 12 10

Klindamycin 15 14 16 15 15 14

Erytromycin 15 12 16 14 15 14

Tabell XVIII Alla mätvärden för kontrollen CCUG33638 (PNSP) vid 6h. Grön färg innebär ”känslig”, röd


6h CCUG33638

Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 11 11 11 10 10 11


Norfloxacin 15 15 15 15 15 14

Klindamycin 17 17 18 18 19 18

Erytromycin 20 21 20 20 21 21

Tabell XIX Alla mätvärden för kontrollen CCUG33638 (PNSP) vid 8h. Grön färg innebär ”känslig”, röd


CCUG33638

Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 11 10 12 11 11 10


Norfloxacin 15 15 15 14 16 16

Klindamycin 17 17 18 16 18 18

Erytromycin 20 19 21 20 22 21

Tabell XX Alla mätvärden för den känsliga kontrollen (S.pneumoniae) vid 4h. Grön färg innebär ”känslig”,

röd färg innebär ”resistent” och gul färg innebär ”ATU”.

4h Känslig kontrollstam

Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 14 16 16 16 16 16


Norfloxacin 13 13 12 11 11 6

Klindamycin 14 13 14 12 16 16

Erytromycin 20 15 15 14 19 18

Tabell XXI Alla mätvärden för den känsliga kontrollen (S.pneumoniae) vid 6h. Grön färg innebär ”känslig”

och gul färg innebär ”ATU”.


Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 18 18 18 19 19 18


Norfloxacin 15 15 13 12 14 13

Klindamycin 17 18 18 18 20 18

Erytromycin 22 22 22 21 20 19

Tabell XXII Alla mätvärden för den känsliga kontrollen (S.pneumoniae) vid 8h. Grön färg innebär ”känslig”

och gul färg innebär ”ATU”.


Antibiotika 190507 190509 190510

Oxacillin 19 20 21 22 21 20


Norfloxacin 13 14 16 15 16 15

Klindamycin 18 19 20 20 21 22

Erytromycin 21 21 24 24 25 25

Bilaga IV Rådata Streptococcus pneumoniae mätvärden Tabell XXIII Till vänster visas resultat från standardiserad diskdiffusionsmetod med datum och prov

angivet. Till höger visas resultaten för RAST-metoden på samma stammar. Grön färg innebär ”känslig”, röd

färg innebär ”resistent” och gul färg innebär ”ATU”

Datum Stam Antibiotika Diameter

190507 Känslig kontroll

Oxacillin 26 26

Trimethoprim-sulfamethoxazol 24 25

Norfloxacin 15 15

Klindamycin 25 26

Erytromycin 30 30

190507 CCUG33638

Oxacillin 10 10

Trimethoprim-sulfamethoxazol 26 26

Norfloxacin 20 20

Klindamycin 23 22

Erytromycin 29 29 4h 6h 8h

190507 Isolat 1

Oxacillin 10 11 11 11 11 12 12 11

Trimethoprim-sulfamethoxazol 6 6 6 6 10 10 10 9

Norfloxacin 18 17 11 6 14 15 15 15

Klindamycin 24 24 13 12 18 19 19 18

Erytromycin 28 28 14 12 21 20 22 22

190507 Isolat 2

Oxacillin 29 30 17 17 22 22 23 23


Norfloxacin 16 15 12 10 15 16 15 14

Klindamycin 23 23 14 11 18 18 18 18

Erytromycin 28 28 17 16 22 23 23 20

190507 Isolat 3

Oxacillin 6 6 6 6 9 9 9 8


Norfloxacin 18 18 12 12 14 15 14 14

Klindamycin 25 26 14 14 18 17 19 18

Erytromycin 12 12 10 10 12 12 11 11

190508 Isolat 4

Oxacillin 9 8 7 7 8 8 9 8


Norfloxacin 21 20 11 10 14 13 14 13

Klindamycin 25 26 14 14 18 17 17 16

Erytromycin 14 12 10 9 11 11 12 10

190508 Isolat 5

Oxacillin 6 6 6 6 6 6 6 6


Norfloxacin 19 19 11 10 13 12 14 13

Klindamycin 30 26 14 14 17 16 19 17

Erytromycin 32 34 16 15 20 19 21 21

Datum Antibiotika Diameter 4h 6h 8h

190510 Isolat 6

Oxacillin 6 7 6 6 6 6 6 6


Norfloxacin 20 18 12 6 14 14 16 15

Klindamycin 24 24 14 14 16 16 18 17

Erytromycin 12 14 11 11 12 12 11 11

190510 Isolat 7

Oxacillin 9 10 6 6 9 9 10 10


Norfloxacin 16 17 10 11 14 13 15 15

Klindamycin 7 7 14 13 15 15 16 17

Erytromycin 6 6 15 15 14 14 13 14

190510 Isolat 8

Oxacillin 34 35 17 20 21 22 23 24


Norfloxacin 19 20 13 15 15 15 17 16

Klindamycin 26 28 17 16 18 18 20 19

Erytromycin 33 33 20 22 20 20 22 23

Linnéuniversitetet Kalmar Växjö

Lnu.se

Documents

Utvärdering av snabb resistensbestämning för ...lnu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1333704/FULLTEXT01.pdf · Streptococcus pyogenes och Streptococcus pneumoniae (5). Snabb och