Bachelorproef  Methodeontwikkeling  en  validatie  van  de  bepaling  van  methylmalonzuur  in  plasma  op  UPLC-­‐MS/MS    UZ  BRUSSEL  Laarbeeklaan  101  1090  Jette  Dr.  Wet.  Nik  De  Brabanter  Adjunct  –  hoofdlaborant  Stefaan  Vanneyghem  Adjunct  –  hoofdlaborante  Gerda  Winckelmans    Goovaerts  Silke    Departement  GEZ-­‐LA  Bachelor  Biomedische  Laboratoriumtechnologie  Afstudeerrichting  Farmaceutische  en  Biologische  Laboratoriumtechnologie  2014-­‐2015  

II

III

 

Bachelorproef  Methodeontwikkeling  en  validatie  van  de  bepaling  van  methylmalonzuur  in  plasma  op  UPLC-­‐MS/MS    UZ  BRUSSEL  Laarbeeklaan  101  1090  Jette  Dr.  Wet.  Nik  De  Brabanter  Adjunct  –  hoofdlaborant  Stefaan  Vanneyghem  Adjunct  –  hoofdlaborante  Gerda  Winckelmans    Goovaerts  Silke    Departement  GEZ-­‐LA  Bachelor  Biomedische  Laboratoriumtechnologie  Afstudeerrichting  Farmaceutische  en  Biologische  Laboratoriumtechnologie  2014-­‐2015  

IV

 

V

Voorwoord  In  het  kader  van  het  behalen  van  mijn  diploma  in  de  Farmaceutische  en  Biologische  Laboratoriumtechnologie  aan  Erasmushogeschool  Brussel  heb  ik  mijn  eindwerk  mogen  uitvoeren  op  de  dienst  Metabole  Stoornissen  van  het  laboratorium  Klinische  Biologie  UZ  Brussel.  Ik  wil  alvast  Nik  De  Brabanter  bedanken  om  mijn  stage  op  deze  dienst  te  mogen  uitvoeren.  Ook  Gerda  Winckelmans,  Stefaan  Van  Neyghem,  Jacques  De  Molder  en  alle  andere  laboranten  van  Metabole  Stoornissen  en  Toxicologie  wil  ik  bedanken  voor  hun  uitleg  en  hulp  tijdens  het  uitvoeren  van  mijn  stage.  Mevrouw  Van  Beneden  wil  ik  ook  bedanken  bij  het  nakijken  en  verbeteren  van  mijn  eindwerk.  Als  laatste  bedank  ik  mijn  ouders  om  mij  bij  te  staan  tijdens  deze  stageperiode  en  bij  het  nalezen  van  mijn  eindwerk.      

VI

Organigram  Metabole  Stoornissen    

   

Prof.  Dr.  Martens    

Gerda  Winckelmans  Adjunct  -­‐  

hoofdlaborante  

Stefaan  Vanneyghem  Adjunct  -­‐  

hoofdlaborant  

Nik  De  Brabanter  Wetenschappelijk  medewerker  

VII

 

Inhoudsopgave  Voorwoord   V  Organigram  Metabole  Stoornissen   VI  Inhoudsopgave   VII  Lijst  met  afkortingen   VIII  Samenvatting   XI  Abstract   XIII  I.   Inleiding   1  II.   Literatuurstudie   2  1.   Methylmalonzuur   2  2.   Methylmalonacidemie   4  3.   Vitamine  B12   6  4.   Therapie   9  5.   Detectie   10  6.   Chromatografie  –  Massa  spectrometrie   13  7.   SPE   18  III.   Experimenten   19  1.   Materiaal  en  methode   19  1.2   Apparatuur   22  1.3   Methode  ontwikkeling   24  1.4   Methodevalidatie   32  2.   Resultaten   34  2.1   Methodevalidatie   34  3.   Discussie   38  IV.   Besluit   41  V.   Bibiliografie   42  VI.   Bijlagen   45  1.   Methodevalidatie   45  

VIII

Lijst  met  afkortingen    3-­‐OH-­‐prop:   3  –  Hydroxy  –  propionzuur    Ado-­‐cbl:   Adenosylcobalamine  ACN:       Acetonitrile  C2:     2  Koolstoffen  CAH:     Congenitale  bijnierschorshyperplasie    cbl:     Cobalamine  cblA:       Cobalamine  deficiëntie  type  A  cblB:       Cobalamine  deficiëntie  type  B  cblC:       Cobalamine  deficiëntie  type  C      cblD:       Cobalamine  deficiëntie  type  D  cblF:       Cobalamine  deficiëntie  type  F  cblH:       Cobalamine  deficiëntie  type  H  cbl-­‐IF:     Cobalamine  –  intrinsic  factor  CHT:     Congenitale  hypothyreoïdie  CID:     Collision-­‐Induces  Dissociation  CO2:     Koolstofdioxide  CoA:       Coenzyme  A  CV:       Variatiecoëfficiënt  D3:     3  Deuteriums    Dx:     Deuterium  DAU:     Daughter  Ion  Analysis  DC:       ‘Direct  Current’,  gelijkspanning  EC:     Europese  Commissie    EDTA:     Ethyleendiaminetetra  -­‐  azijnzuur  ESI:     Elektrospray  Ionisatie  EV:     Elektronvolt  FA:     Formic  Acid,  Mierenzuur  FBT:     Farmaceutische  en  Biologische  Laboratoriumtechnologie    GA:     Glutaaracidemie  GC  –  MS:   Gaschromatografie  –  Massa  Spectrometrie  H:       High,  hoog  H+:     Waterstof  H2O:       Water  Holo  TC:     Holotranscobalamine    HP:     Humaan  Plasma  HSS:     High  Strength  Silica  IQC:     Intern  Quality  Control,  Interne  Kwaliteitscontrole  IEC:       ‘Ion  Exchange  Chromatography’  IF:     Intrinsic  Factor  Ile:     Isoleucine  IS:     Interne  Standaard  IVA:     Isovaleriaanzuuracidemie  KS:     Kalfserum  kV:       Kilovolt  

IX

L:       Low,  laag  LC-­‐MS/MS:     Liquid  Chromatography  –  Tandem  mass  spectrometry    LMCD:     Biotinidase  deficiëntie  MADD:     Multiple  acyl  –  CoA  dehydrogenase  deficiency  MCAD:     Medium  –  chain  acyl  –  CoA  dehydrogenase  deficiency  MCM:     Methylmalonyl  –  CoA  -­‐  mutase  MeOH:     Methanol  Met:     Methionine    MF:       Mobiele  Fase  MMA:       Methylmalonzuur  MMAd3:   Gedeutereerd  methylmalonzuur  MQ:     MilliQ  water  MRM:     Multiple  Reaction  Monitoring  MS:     Massa  Spectrometer  MSUD:     Maple  syrup  urine  disease  mut0:       Mutatie  type  0    mut-­‐:       Mutatie  type  -­‐  m/z:       Massa/ladingsverhouding      N2:     Stikstof  Na+:     Natrium  NBS:       ‘Newborn  Screening’,  neonatale  screening  NH4

+:     Ammonium  OH  –  cbl:   Hydroxocobalamine  PA:     Propionzuuracidemie  Pa:     Pascal  PAR:     Parent  Ion  Scan  PKU:     Fenylketonurie  en  hyperfenylalaninemie  PSI:     Pound-­‐force  per  square  inch  Q:     Quadrupool  RF:     Wisselspanning  RRT:     Relatieve  Retentietijd  RSD:     Relatieve  Standaarddeviatie  RT:     Retentietijd  SA:     Succinic  Acid;  Succinaat  SAS:     Serum  Assay  Sample  SD:     Standaarddeviatie  SEP:     Sample  Extraction  Products  SF:     Stationaire  fase  SIR:       Selected  Ion  Recording  SN:     Supernatans  SPE:     Solid  Phase  Extraction  T:     toeren  per  minuut  tHcy:     Totaal-­‐homocysteïne  Thr:     Threonine  TQ:     Triple  Quadrupool  TQD:       Triple  Quadrupool  Detector  TV:     Tussenverdunning  

X

UPLC:     Ultra  Performance  Liquid  Chromatography    UTAK:       UTAK  Laboratories  UZ(B):       Universitair  Ziekenhuis  (Brussel)  V:     Volt  Val:     Valine  v/v:       Volumeverhouding    

XI

   

Samenvatting    

Methodeontwikkeling  en  validatie  van  de  bepaling  van  methylmalonzuur  in  plasma  op  UPLC-­‐MS/MS    

Silke  Goovaerts  (co)promotor:  Dhr.  N.  De  Brabanter,  dhr.  S.  Vanneyghem,  mevr.  G.  Winckelmans  contactpersoon  hogeschool:  Mevr.  K.  Van  Beneden    Achtergrond  Methylmalonzuur  is  een  belangrijk  intermediair  in  het  katabolisme  van  bepaalde  aminozuren,  cholesterol  en  vetzuren.  Methylmalonzuur  wordt  verder  omgezet  in  succinaat,  dat  wordt  verwerkt  in  de  Krebscyclus.  Methylmalonacidurie  kan  voorkomen  door  een  deficiëntie  van  het  enzyme  methylmalonyl-­‐CoA  Mutase.  Dit  mutase  gaat  de  omzetting  van  methylmalonyl  –  CoA  in  succinyl  –  CoA  kataliseren.  Indien  er  problemen  optreden  met  methylmalonyl  –  CoA  mutase,  zal  methylmalonzuur  accumuleren.  Dit  enzyme  heeft  voor  deze  omzetting  vitamine  B12  nodig  als  cofactor.  Tekort  aan  vitamine  B12  zal  eveneens  een  verhoging  van  de  methylmalonzuur  concentraties  verzoorzaken.  Daarom  is  methylmalonzuur  een  sensitieve  en  specifieke  vroege  biomarker  om  intracellulair  functioneel  vitamine  B12  deficiëntie  te  detecteren.  De  spiegels  van  methylmalonzuur  zijn  bij  een  klinisch  (met  gezondheidsklachten)  vitamine  B12  tekort  in  95-­‐98%  van  de  gevallen  verhoogd.  Enkele  voorbeelden  van  pathologieën  van  vitamine  B12  tekort  zijn  bloedarmoede,  alzheimer,  osteoporose  en  nierfalen.      Doel  Een  snelle  methode  ontwikkelen  om    methylmalonzuur  accumulatie  en  vitamine  B12  deficiëntie  op  te  sporen  in  een  klein  volume  plasma,  via  UPLC-­‐MS/MS.    Methode  Voor  de  methodeontwikkeling  zijn  we  vertrokken  van  een  artikel  van  het  Wilhelmina  ziekenhuis  te  Nijmegen  die  een  eenvoudige  procedure  beschrijft  voor  zowel  staalvoorbereiding  als  chromatografische  scheiding  en  detectie,  maar  we  zijn  enkele  obstakels  tegen  gekomen  zoals  dat  enkel  proteïneprecipitatie  met  acetonitrile  onvoldoende  is.  De  extracten  waren  nog  te  vuil  (troebel,  wit,  …)  en  dit  is  niet  ideaal  voor  een  LC-­‐MS/MS.  Het  Wilhelmina  ziekenhuis  maakt  gebruik  van  mobiele  fases  met  hoge  concentraties  zuur.  We  hebben  gemerkt  dat  dit  een  aanslag/afzetting  geeft  op  de  ionisatie  bron  van  de  MS.  We  hebben  de  auteur  gecontacteerd  en  die  bevestigt  inderdaad  het  probleem.  Daarom  hebben  we  deze  procedure  aangepast:  

XII

Om  meer  onzuiverheden  uit  de  matrix  te  verwijderen  werd  gekozen  om    een  solid  phase  extraction  (SPE)    uit  te  voeren.  Verder  werden  mobiele  fases  met  lagere  concentraties  mierenzuur  uitgestest  om  vervuiling  van  de  bron  te  vermijden.    Voor  de  methodevalidatie  werden  verschillende  paramaters  uitgestest:  de  stabiliteit/reproduceerbaarheid  van  de  relatieve  retentietijd,  carry  over,  ion  ratio’s,  recovery,  precisie  en  bias,  lineariteit  en  de  detectielimiet  en  kwantificeringslimiet.  Er  werd  voor  elk  van  deze  testen  nagegaan  of  dit  binnen  de  vooropgestelde  criteria  ligt  die  men  kan  terugvinden  in  de  literatuur.      Resultaten  De  methodeontwikkeling  heeft  de  meeste  tijd  in  beslag  genomen,  maar  uiteindelijk  is  de  SPE  methode  een  korte  en  makkelijke  extractiemethode.  Eer  we  hiertoe  gekomen  zijn,  hebben  we  eerst  een  aantal  validatietesten  uitgevoerd  met  de  methode  die  we  in  de  literatuur  hadden  gevonden.  Deze  bleek  echter  geen  goede  werkwijze,  want  de  resultaten  waren  niet  reproduceerbaar.  Hieruit  is  dan  zoals  eerder  vermeld  de  SPE  methode  gerealiseerd.    De  methodevalidatietesten  geven  met  de  SPE  methode  goede  resultaten,  maar  er  zijn  nog  een  aantal  zaken  die  moeten  bijgesteld  worden.      Conclusie  We  concluderen  dat  het  vooropgestelde  volume  van  100  µL  voldoende  is  om  methymalonzuur  (MMA)  te  detecteren  in  plasma  en  dat  de  staalvoorbereiding  nog  steeds  vrij  kort  is.  SPE  hebben  we  wel  moeten  introduceren,  maar  dit  is  nog  te  automatiseren.    Het  is  dus  mogelijk  om  MMA  op  UPLC/MS-­‐MS  kwantitatief  te  bepalen,  maar  er  moeten  nog  enkele  verbeteringen  uitgevoerd  worden.  Dit  was  echter  wel  een  eerste  stap  om  de  bepaling  van  organische  zuren  in  plasma  mogelijk  te  maken  in  het  labo  Metabole  Stoornissen  te  UZ  Brussel.    

XIII

Abstract    Method  development  and  validation  of  the  assay  of  methylmalonic  

acid  in  plasma  by  UPLC-­‐MS  /  MS  Silke  Goovaerts  (co)promotor:  Dhr.  N.  De  Brabanter,  dhr.  S.  Vanneyghem,  mevr.  G.  Winckelmans  Mentor  school:  Mevr.  K.  Van  Beneden    Background  Methylmalonic  acid  is  an  important  intermediary  in  the  catabolism  of  certain  amino  acids,  cholesterol  and  fatty  acids.    Methylmalonic  acid  is  further  converted  into  succinate  that  is  processed  in  the  Krebscycle.  Methylmalonic  aciduria  can  occur  by  a  deficiency  of  the  enzyme  methylmalonyl  –  CoA    Mutase.  This  mutase  will  catalyse  the  conversion  of  the  methylmalonyl  –  CoA  into  succinyl  –CoA.  If  problems  occur  with  methylmalonyl  –  CoA  mutase,  methylmalonic  acid  will  accumulate.  This  enzyme  needs  vitamin  B12  as  a  cofactor  for  its  conversion.  A  lack  of  vitamin  B12  will  also  cause  an  increase  of  methylmalonic  acid  concentrations.  That  is  why  methylmalonic  acid  is  a  sensitive  and  specific  early  biomarker  for  detecting  intracellular  functional  vitamin  B12  deficiency.  Within  a  clinically  vitamin  B12  deficiency  the  levels  of  methylmalonic  acid  (with  health  problems)  are  increased  in  95-­‐98%  of  the  cases.  Some  examples  of  pathologies  of  vitamin  B12  deficiency  include  anemia,  Alzheimer's  disease,  osteoporosis  and  kidney  failure.    Goal  To  develop  a  rapid  method  in  order  to  detect  accumulation  of  methylmalonic  acid  and  vitamin  B12  deficiency  in  a  small  amount  of  plasma  using  UPLC-­‐MS/MS.    Methods  For  the  method  development,  we  started  from  an  article  of  the  Wilhelmina  Hospital  in  Nijmegen  which  describes  a  simple  procedure  for  both  sample  preparation  as  chromatographic  separation  and  detection,  but  we  have  encountered  some  obstacles  such  as  single  protein  precipitation  with  acetonitrile  is  insufficient.  The  extracts  were  still  too  dirty  (cloudy,  white,…)  and  this  is  not  ideal  for  a  LC-­‐MS/MS.  The  Wilhelmina  Hospital  uses  mobile  phases    with  high  concentrations  of  acid.  We  have  noticed  that  this  gives  a  deposit  on  the  ionization  source  of  the  MS.  We  contacted  the  author  and  he  indeed  confirmed  the  issue.  Therefore,  we  have  adapted  this  procedure:  In  order  to  remove  more  matrix  and  impurities  before  the  injection  we  have  chosen  to  use  a  solid  phase  extraction  (SPE).  Further,  mobile  phases  with  lower  concentrations  of  formic  acid  

XIV

were  tested  to  avoid  contamination  of  the  source.      For  the  method  validation,  various  parameters  were  tested:  the  stability  /  reproducibility  of  the  relative  retention  time,  carry  over,  ion  ratios,  recovery,  precision  and  bias,  linearity,  and  the  limit  of  detection  and  limit  of  quantitation.  It  was  established  for  each  of  these  test  whether  this  is  within  the  criteria  that  can  be  found  in  the  literature.    Results  The  method  development  took  most  of  the  time,  but  eventually  the  SPE  method  is  a  quick  and  easy  extraction  method.  Before  we  have  come  to  this  end,  we  first  carried  out  a  number  of  validation  tests  with  the  method  that  we  had  found  in  the  literature.  This  turned  out  not  to  be  a  good  method  because  the  results  were  not  reproducible.  It  is  then  achieved  as  previously  stated,  the  SPE  method.  The  method  validation  tests  indicate  the  SPE  method  good  results,  but  there  are  still  some  issues  that  need  to  be  adjusted.    Conclusion  We  can  conclude  that  the  intended  volume  of  100  µl  is  sufficient  to  detect  methylmalonic  acid  (MMA)  in  plasma  and  that  the  sample  preparation  is  still  relatively  short.  We  have  had  to  introduce  SPE,  but  this  can  be  automated.  So,  it  is  possible  to  determine  MMA  quantitatively  on  UPLC/  MS-­‐MS,  but  there  are  still  some  improvements  to  be  carried  out.  However,  this  was  a  first  step  in  the  determination  of  organic  acids  in  plasma  in  the  lab  Metabolic  Disorders  at  UZ  Brussel.    

1

I. Inleiding    Eiwitten  zijn  één  van  de  voedingsstoffen  die  het  lichaam  nodig  heeft,  ze  zijn  terug  te  vinden  in  voedingsmiddelen  zoals  eieren,  melk,  vis,  vlees,  en  kaas.  De  eiwitten  afkomstig  uit  vlees  of  melk  worden  afgebroken  tot  twintig  afzonderlijke  aminozuren,  zoals  serine.  Aminozuren  worden  getransporteerd  in  het  bloed  en  afgeleverd  aan  cellen  afgeleverd  waar  nodig.  Meestal  eten  we  veel  meer  eiwit  dan  we  nodig  zouden  hebben.  Als  het  lichaam  de  nodige  aminozuren  heeft  opgenomen,  wordt  de  overschot  in  de  lever  afgebroken  door  enzymen  zoals  methylmalonyl-­‐CoA  Mutase.  Zo  worden  er  onschadelijke  stoffen  gevormd,  die  uitgescheiden  kunnen  worden.  Indien  één  van  deze  enzymen  niet  goed  werkt,  worden  er  organische  zuren  gevormd  die  schadelijk  kunnen  zijn  voor  het  lichaam.  (Gick)    Methylmalonzuur  behoort  tot  deze  voorgenoemde  organische  zuren,  welke  meestal  zwakke  zuren  zijn.  Afhankelijk  van  de  omgevingszuurtegraad  gaat  een  deel  van  het  zure  molecule  een  waterstofatoom  afsplitsen,  en  dissociëren.  Enkele  voorbeelden  van  organische  zuren  zijn  mierenzuur,  citroenzuur,  azijnzuur.  (DAAVISION)    Osteoporose,  progressief  nierfalen,  intellectuele  onbekwaamheid  (mentale  retardatie),  verstoorde  coördinatie  van  bewegingen  door  een  aandoening  aan  de  motorische  zenuwbanen  vatten  het  ziektebeeld  van  methylmalonylacidemie  samen.  Ook  metabole  acidose,  d.w.z.  een  te  lage  pH  (<  7,35)  veroorzaakt  door  een  overschot  aan  zure  (in  dit  geval  methylmalonzuur  en  metabolieten)  of  een  tekort  aan  basische  componenten  in  het  bloed,  kan  een  gevolg  zijn  van  methylmalonacidemie.  (Hoffmann & Zschocke, 2014)    Methylmalonzuur  is  een  belangrijke  biomarker  om  vitamine  B12  deficiëntie  te  detecteren.  Vitamine  B12  deficiëntie  heeft  geen  opmerkende  symptomen  en  is  moeilijk  te  detecteren.    Het  is  ook  belangrijk  om  de  plasmaconcentraties  van  methylmalonzuur  te  bepalen  bij  diagnose  en  opvolging  van  patiënten  met  methylmalonacidurie.  In  deze  thesis  wordt  onderzocht  of  het  mogelijk  is  een  LC-­‐MS/MS  methode  te  ontwikkelen  en  te  valideren  voor  de  bepaling  van  methylmalonzuur  met  minimale  staalvoorbereiding  in  een  kleine  hoeveelheid  plasma.  Methylmalonzuur  zal  een  verhoogde  concentratie  geven  in  95  –  99%  van  de  gevallen  bij  een  tekort  aan  vitamine  B12,  vandaar  is  dit  een  belangrijke  biomarker.      

2

II. Literatuurstudie    

1. Methylmalonzuur    Methylmalonzuur  of  2-­‐methyldipropaanzuur,  C4H6O4,  is  een  belangrijk  intermediair  in  het  katabolisme  van  bepaalde  aminozuren,  cholesterol  en  vetzuren.    

 Figuur 1: MMA is een dicarbonzuur met 4 koolstofatomen    In  geval  van  een  overschot  aan  aminozuren  in  het  lichaam,  of  een  periode  van  vasten  worden  in  de  mitochondriën  aminozuren  geoxideerd  om  de  energiebehoefte  van  de  cel  te  dekken  (Metabolisme,  Schuit).  Bij  de  afbraak  van  threonine,  methionine  en  de  vertakte  aminozuren  valine  en  isoleucine  wordt  daarbij  propionzuur  gevormd.  In  mindere  mate  zijn  ook  vetzuren  met  oneven  aantal  koolstofatomen  en  cholesterol  precursoren  van  propionzuur.  Dit  propionzuur  wordt  via  methylmalonzuur  omgezet  in  succinaat  om  zo  de  citroenzuurcyclus  (Krebs-­‐cyclys)  binnen  te  gaan  (anaplerose,  zie  figuur  2).  Succinaat  is  een  isomeer  van  methylmalonzuur.  In  deze  Krebs-­‐cyclus  wordt  via  9  enzymatische  stappen  telkens  een  C2-­‐eenheid  verbrand  tot  CO2  en  H2O,  waarbij  energierijke  verbindingen  voor  de  cel  gevormd  worden.        

         

3

 Figuur 2: Metabole wegen van valine-isoleucine metabolisme tot Krebscyclus  

Leucine   Valine  

...  

...  

…  

3-­‐OH-­‐3-­‐methyl-­‐  glutaryl-­‐CoA  

2-­‐methyl-­‐  acetoaceytl-­‐CoA  

Methylmalonic    semialdehyde  

Acetoacetaat  

Acetyl-­‐CoA  

Propionyl-­‐CoA  

Methylmalonyl-­‐CoA  

Succinyl  -­‐  CoA  

Krebs  Cyclus  

Homocysteïne  

Methionine  

Ado-­‐cbl  

cbl  (I)  

cblB  

cbl  (III)  

cblA  

OH-­‐cbl  

3-­‐hydroxy-­‐propionzuur  Methyocitraat  

Isoleucine  

4

2. Methylmalonacidemie      Aangeboren  metabole  ziekten  maken  deel  uit  van  een  grote  groep  zeldzame  ziekten  en  worden  veroorzaakt  door  een  mutatie  in  een  enzymcoderend  gen.  Deze  mutatie  wordt  geërfd  van  de  ouders  en  zorgt  voor  een  tekort  van  het  enzyme  in  kwestie.  Hierdoor  wordt  de  normale  metabole  flux  onderbroken  en/of  gewijzigd.  Zulke  blokkades  in  metabole  paden  zorgen  typisch  voor  opstapeling  van  de  metabolieten  stroomopwaarts  en  een  tekort  aan  producten  stroomafwaarts  van  het  defect.  Zowel  de  opstapeling  van  producten  in  de  cel  als  het  tekort  ervan  kunnen  aanleiding  geven  tot  diverse  lichamelijke  problemen.  Dit  is  te  zien  in  figuur  3.    Deficiëntie  van  een  bepaald  enzym,  in  dit  voorbeeld  nummer  3  in  figuur  3,  is  het  gevolg  van  een  aangeboren  metabole  ziekte.  Hierbij  ontstaat  er  een  opstapeling  van  metabolieten  (A,  B  en  C),  een  alternatieve  uitweg  voor  de  metabolieten  stroomopwaarts  van  het  defect  en  een  tekort  aan  metabolieten  stroomafwaarts  (vanaf  D).  De  zwarte  staafdiagrammen  stellen  metabolietenconcentraties  voor  in  het  betrokken  weefsel  bij  normale  gezondheid.  De  rode  staafdiagrammen  geven  de  concentraties  bij  een  aangeboren  metabole  ziekte  weer.  Metaboliet  C  vindt  een  andere  uitweg.   (Schuit, 2010)  

Figuur 3: Principe van een metabole ziekte: onderbreking en wijziging van metabole paden Een  klassieke  methylmalonacidurie  wordt  veroorzaakt  door  een  deficiëntie  van  het  enzyme  methylmalonyl-­‐CoA  Mutase  (MCM),  dat  de  omzetting  van  methylmalonyl-­‐CoA  in  succinyl-­‐CoA  kataliseert,  zie  figuur  4.    

A   B   C   D   E   F   G   H  

Alternatieve  weg  

1   2   3   4   5   6   7  

5

Figuur 4: Vorming van methylmalonzuur.    In  het  geval  van  problemen  met  MCM  zal  vooral  methylmalonzuur  (MMA)  accumuleren,  men  spreekt  dan  van  een  methylmalonacidemie  (bloed)  en/of  een  methylmalonacidurie  (urine).  Naast  methylmalonzuur  kunnen  ook  andere  intermediairen  stroomopwaarts  beginnen  opstapelen  en/of  andere  uitwegen  zoeken  (zie  figuur  3).  In  geval  van  een  MCM  deficiëntie  vindt  de  cel  een  uitweg  via  3-­‐hydroxypropionzuur  en  methylcitraat  om  de  stijgende  concentraties  propionzuur  weg  te  werken  zoals  te  zien  is  in  figuur  4.    Men  maakt  onderscheid  tussen  mut0,  een  volledige  deficiëntie  van  methylmalonyl  CoA  mutase  en  mut-­‐,  een  partiële  deficiëntie  van  methylmalonyl  CoA  mutase.De  incidentie  van  methylmalonacidemie  ligt  tussen  1  op  25.000  voor  een  volledige  deficiëntie  en  1  op  48.000  voor  een  partiële  deficiëntie.  (Orphanet; Helgeson, Magera, Matern, & Rinaldo, 2000; Beukema)    

Propionyl-­‐CoA  

D-­‐methylmalonyl-­‐CoA    

Succinyl-­‐CoA    

Biotine  

L-­‐methylmalonyl-­‐CoA    

Methylcitraat  

Methylmalonzuur  

Methylmalonyl-­‐CoA-­‐mutase  

Ado-­‐cbl  

cblA  

Mitochondrion  

Cytoplasma  

6

3. Vitamine  B12   Naast  het  gendefect  kunnen  ook  problemen  met  de  cofactor  zorgen  voor  een  minder  goede  werking  van  een  enzyme.  Methylmalonyl-­‐Coa  mutase  is  een  van  de  twee  enzymen  in  het  menselijk  lichaam  die  cobalamine  (Cbl,  vitamine  B12)  nodig  hebben  voor  hun  activiteit.  Dit  vitamine  B12  is  aanwezig  in  voeding  van  dierlijke  oorsprong  en  wordt  geabsorbeerd  in  verschillende  stappen.  cblA,  cblB  en  cblH  zijn  geassocieerd  met  abnormaliteiten  van  de  adenosylcobalamine  syntheseweg  zie  figuur  4.    Na  vrijstelling  uit  de  voeding  in  de  maag  wordt  cobalamine  gebonden  aan  intrinsic  factor(IF),  een  glycoproteïne  dat  gesecreteerd  wordt  door  de  maag.  Het  Cbl-­‐IF  complex  wordt  dan  door  receptoren  opgenomen  in  het  ileum.  Cobalamine  wordt  hier  losgekoppeld  van  IF  en  afgegeven  gebonden  aan  transcobalamine  II  voor  transport  door  de  bloedbaan.  Na  opname  door  de  cel  via  endocytose  zal  het  Cbl  terug  vrijgesteld  worden  en  omgezet  worden  in  adenosylcobalamine,  de  cofactor  van  MCM,  zie  figuur  5.      

Figuur 5: Afgelegde weg van cobalamine    Naast  MCM  wordt  cobalamine  ook  gebruikt  als  cofactor  voor  de  synthese  van  methionine  uit  homocysteïne.  Bijgevolg  zullen  problemen  met  Cbl  gevolgen  hebben  voor  zowel  de  omzetting  van  methylmalonzuur  als  homocysteïne,  zie  figuur  2.      Een  kleine  fractie  (6-­‐20%)  van  de  totale  hoeveelheid  circulerend  vitamine  B12  is  aan  transcobalamine  II,  een  transporteiwit,  gebonden.  Dit  is  het  actieve  B12  en  deze  is  beschikbaar  voor  synthesereacties  op  celniveau.  In  de  lysosomen  wordt  het  vitamine  B12  losgemaakt  van  transcobalamine  II  en  indien  nodig  omgezet  naar  methyl-­‐  of  adenosylcobalamine.    Het  inactieve  B12,  het  overige  deel,  80%,  is  aan  haptocorrine,  transcobalamine  I,  gebonden  en  wordt  gebruikt  voor  transport  en  opslag.  Hierdoor  mist  de  meting  van  totaal  vitamine  B12  (referentie-­‐interval  150-­‐700  pmol/l  vanuit  het  artikel  van  het  Wilhelmina  Ziekenhuis  te  Nijmegen)  de  nodige  sensitiviteit,  het  correcte  gemeten  actieve  B12,  en  specificiteit,  de  geschiktheid  om  een  onderscheid  te  maken  tussen  het  actieve  B12  en  inactieve  B12.  Het  is  mogelijk  dat  de  totale  vitamine  B12  concentratie  normaal  is  (>  150  pmol/l)  terwijl  het  actief  B12  te  laag  is.  Totaal  vitamine  B12  kan  ook  te  laag  blijken  door  

7

verzadiging  aan  het  haptocorrine  zonder  een  functioneel  tekort.  Methylmalonzuur  is  dus  de  meest  gevoelige  en  specifieke  marker  voor  de  vitamine  B12  status  op  cellulair  niveau  en  indien  methylmalonzuur  in  bloed  verhoogd  is,  duidt  dit  op  een  vitamine  B12  deficiëntie.      (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, 2011; Allen, Keyes, Pedersen, Shahab-Ferdows, & Newman, 2011; Stichting Orthokennis, 2014)   Bij  DNA-­‐synthese,  cellulaire  herstelprocessen,  bloedaanmaak  en  hersenfunctie  speelt  vitamine  B12,  een  essentiële  voedingsstof,  een  belangrijke  rol.  Verscheidene  gezondheidsklachten  kunnen  ontstaan  indien  men  een  verlaagde  actieve  vitamine  B12  status  heeft.  Het  is  dus  belangrijk  om  vitamine  B12-­‐tekort  te  voorkomen,  vroeg  op  te  sporen  en  juist  te  behandelen.  Indien  dit  niet  gebeurt  is  er  kans  op  irreversibele  neurologische  schade  en  beenmergfalen  en  dit  wil  men  voorkomen.    Vitamine  B12  is  een  wateroplosbare  molecule  met  in  het  centrum  een  kobaltatoom.  Afhankelijk  van  de  restgroep  die  gekoppeld  is  aan  het  centrale  kobaltatoom,  komt  vitamine  B12  in  verschillende  vormen  voor.  De  restgroepen  kunnen:  methyl-­‐,  adenosyl-­‐,  hydroxy-­‐  en  cyanocobalamine  zijn.  Indien  cobalamine  zonder  restgroep  voorkomt,  is  dit  op  zichzelf  geen  stabiele  molecule.      

Figuur 6: Structuurformule vitamine B12 (Co+ = Kobaltatoom; R = Restgroep)    Vitamine  B12  komt  in  het  lichaam  voornamelijk  voor  onder  de  vorm  van  actieve  co-­‐enzymvormen  methylcobalamine  (in  het  bloedplasma,  celcytoplasma  en  cerebrospinale  vloeistof)en  adenosylcobalamine  (in  de  weefsels  en  celmitochondriën).    Ca.  2  tot  5  mg  vitamine  B12  heeft  het  lichaam  in  voorraad.  Het  grootste  deel  hiervan  wordt  in  de  lever  opgeslagen.  Via  urine  en  gal  verdwijnt  er  dagelijks  0,1  –  0,2  %  van  de  totale  lichaamsreserve.  Doordat  de  voorraad  onvoldoende  aangevuld  wordt,  door  onvoldoende  inname  of  absorptie,  of  het  verlies  toegenomen  is,  door  oxidatieve  stress  of  verstoorde  heropname  van  vitamine  B12  uit  gal  (enterohepatische  recirculatie),  kan  zich  langzaam  een  vitamine  B12-­‐tekort  ontwikkelen  over  een  periode  van  jaren.  Vitamine  B12  uit  voedingssupplementen  is  makkelijker  op  te  nemen  dan  vitamine  B12  uit  voeding,  want  het  loskoppelen  van  voedingsgebonden  vitamine  B12  kan  gebrekkig  verlopen.  (Stichting Orthokennis, 2014)    

8

De  meest  voorkomende  reden  voor  een  tekort  aan  cobalamine  is  onvoldoende  opname  via  de  voeding,  bijvoorbeeld  bij  vegetariërs  en  veganisten.  Ook  bij  kinderen  die  lange  tijd  uitsluitend  borstvoeding  krijgen  van  een  vegetarische  moeder  kunnen  tekorten  optreden.  Daarnaast  kunnen  ook  (genetische)  problemen  met  opname/transport  aanleiding  geven  tot  een  te  lage  beschikbaarheid  van  cobalamine  als  cofactor  voor  het  MCM  enzyme,  zoals  bv  een  defect  in  de  secretie  van  IF.   (Chan, Fu, Pattengale, & Xu, 2013)  Markers  voor  Vit  B12  deficiëntie:  Methylmalonzuur  en/of  homocysteïne?    Het  mutase  heeft  ook  adenosylcobalamine  nodig  welke  een  essentiële  rol  speelt  in  deze  omzetting.  Bij  vitamine  B12  deficiëntie  stijgt  de  concentratie  methylmalonzuur,  maar  niet  in  dezelfde  mate  als  bij  een  volledige  deficiëntie  van  het  methylmalonyl-­‐Coa    mutase  (The  Monitor,  2008).  Methylmalonzuur  en  totaal-­‐homocysteïne  (tHcy)  zijn  aanvullende  bepalingen  in  serum  bij  een  lage  vitamine  B12  spiegel  (<350  pmol/l  volgens  het  artikel  van  het  Wilhelmina  Ziekenhuis  te  Nijmegen).  Vanaf  waarden  hoger  dan  350  pmol/l  is  de  patiënt  positief  voor  vitamine  B12  deficiëntie  volgens  het  artikel.  Dit  is  een  richtwaarde  voor  het  Wilhelmina  Ziekenhuis,  want  het  UZ  Brussel  gaat  een  eigen  referentiewaarde  opstellen  naar  de  toekomst  toe.  Dit  is  noodzakelijk  omdat  in  de  literatuur  sommige  bronnen  een  hogere  waarde  of  een  lagere  waarde  gebruiken.  Methylmalonzuur  en  tHcy  zijn  essentieel  bij  het  vaststellen  van  het  functioneel  (intracellulair)  vitamine  B12  tekort.  De  spiegels  van  methylmalonzuur  en  tHcy  zijn  bij  een  klinisch  (met  gezondheidsklachten)  vitamine  B12  tekort  in  95-­‐98%  van  de  gevallen  verhoogd.  De  meest  specifieke  merker  om  vitamine  B12  na  te  gaan  is  methylmalonzuur  in  bloed,  maar  deze  kan  bij  een  tekort  normaal  zijn  bij  antibioticagebruik  (vals  negatief)  en  bij  een  normale  vitamine  B12  status  verhoogd  zijn  door  nierinsufficiëntie  of  uitdroging  (vals  positief).  Indien  dit  het  geval,  patiënten  met  nierinsufficiëntie,  kan  de  bepaling  van  methylmalonzuur  uitgevoerd  worden  in  urine.  (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort, 2011)  Naast  nierinsufficiëntie  kunnen  ook  hypovolemie,  laag  circulerend  bloedvolume  en  bacteriële  overgroei  van  de  dunne  darm  oorzaken  zijn  van  een  te  hoge  waarde  van  methylmalonzuur  in  plasma  en/of  urine.  (Helgeson, Magera, Matern, & Rinaldo, 2000) (Allen, Keyes, Pedersen, Shahab-Ferdows, & Newman, 2011)      Naast  vitamine  B12-­‐tekort  kan  ook  bij  familiaire  hyperhomocysteïnemie,  foliumzuurtekort,  roken,  hypothyroidie,  gebruik  van  levodopa  en  nierinsufficiëntie  de  homocysteïnespiegel  verhoogd  zijn,  daarom  is  deze  parameter  minder  specifiek.   (Stichting Orthokennis, 2014)  Een  voordeel  van  methylmalonzuur  t.o.v.  homocysteïne  is,  naast  de  hogere  specificiteit  voor  het  aantonen  van  vitamine  B12  deficiëntie,  dat  dezelfde  serumbuis  kan  gebruikt  worden  om  vitamine  B12  te  bepalen  als  methylmalonzuur.  Voor  homocysteïne  dient  een  nieuwe  bloedafname  plaats  te  vinden  onder  specifieke  afnamecondities,  afname  op  ijs  e.d.  (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort, 2011)    In  geval  van  een  chromatografische  bepaling  van  methylmalonzuur  is  de  volledige  scheiding  van  het  isomeer  succinaat  (SA)  zeer  belangrijk,  co-­‐elutie  kan  aanleiding  geven  tot  vals  verhoogde  methylmalonzuur  spiegels.  (RECIPE, 2010; El-Khoury, Gabler, Spatholt, Wang, & Yuan, 2012)

9

4. Therapie    

Als  therapie  voor  MMA  kan  een  dieet  met  het  beperken  van  inname  van  de  aminozuren  isoleucine,  valine,  methionine  en  threonine  of  het  toevoegen  van  carnitines  (om  de  excretie  te  stimuleren:  MMA  kan  binden  aan  carnitine  om  zo  het  systeem  te  verlaten)  opgestart  worden.  (Hoffmann & Zschocke, 2014)    Vitamine  B12  deficiëntie  heeft  voornamelijk  een  hematologisch  (megaloblastaire  anemie)  en  neurologisch  ziektebeeld  (demyeliniserende  ziekte:  veranderende  mentale  toestand).  Vitamine  B12  geeft  ook  energie,  want  in  de  apotheek  zijn  verschillende  energiestimulerende  producten  beschikbaar,  zoals  gelullen  met  foliumzuur,  Neo  Genyl®  Action.  (Stichting Orthokennis)      Oudere  patiënten  kunnen  te  maken  hebben  met  onomkeerbare  neurologische  schade,  anemie,  osteoporose  en  cerebrovasculaire  en  cardiovasculaire  aandoeningen.   (El-Khoury, Gabler, Spatholt, Wang, & Yuan, 2012)    

10

5.  Detectie  Neonatale  screening  Het  belang  van  neonatale  screening  is  dat  ze  vroegtijdig  aandoeningen  kunnen  opsporen.  Vroeger  was  er  nog  geen  neonatale  screening  met  als  gevolg  dat  de  aandoening  veel  te  laat  ontdekt  werd  om  nog  te  behandelen.  In  tabel  1  staan  alle  aangeboren  aandoeningen  die  kunnen  opgespoord  worden  via  de  hielprik.      Tabel 1: Lijst van aangeboren aandoeningen opgespoord in de neonatale screening (via hielprik)  Lijst  van  aangeboren  aandoeningen  in  hielprik-­‐screening    Fenylketonurie  en  hyperfenylalaninemie  (PKU)  Congenitale  hypothyreoïdie  (CHT)  Congenitale  bijnierschorshyperplasie  (CAH)  Biotinidase  deficiëntie  (LMCD)  Medium-­‐chain  acyl-­‐CoA  dehydrogenase  deficiëntie  (MCAD)  Multiple  acyl-­‐CoA  dehydrogenase  deficiëntie  (MADD)  Isovaleriaanzuuracidemie  (IVA)  Propionzuuracidemie  (PA)  Methylmalonzuuracidemie    Maple  syrup  urine  disease  (MSUD)  Glutaaracidemie  (GA)    

-­‐ Guthrie  kaartje    

Figuur 7: Guthrie kaartjes  

11

 Een  Guthriekaartje,  zie  figuur  7,  bestaat  uit  een  aantal  delen:  een  gedeelte  met  cirkels  waarin  het  bloed  wordt  verzameld,  een  gedeelte  waarin  de  essentiële  gegevens  worden  opgeschreven  en  een  strookje  als  bewijs  voor  de  moeder  dat  er  een  neonatale  screening  is  uitgevoerd.    De  hielprik  moet  worden  uitgevoerd  bij  een  voldragen  baby  minstens  72  uur  na  de  geboorte,  maar  liefst  niet  langer  dan  na  dag  vijf.    (Wouters, 2014)  

 Confirmatie:      Confirmatie  van  positieve,  te  hoge,  resultaten  van  de  neonatale  screening  kan  onder  andere  gebeuren  via  de  bepaling  van  organische  zuren  in  urine  met  gebruik  van  GC-­‐MS/MS.    Een  andere  methode  is  om  in  plasma  of  op  guthriekaartjes  acylcarnitines  te  bepalen  met  UPLC_MS/MS.    Hierbij  gaat  men  kijken  of  de  waarden  van  bepaalde  carnitines  per  aandoening  verhoogd  zijn.  In  het  geval  van  methylmalonacidemie  kan  men  ook  volgende  organische  zuren  bepalen  via  het  guthriekaartje:  methylmalonzuur,  3-­‐OH-­‐propionzuur  en  methylcitraat.  In  UZ  Brussel  worden  momenteel  4  patiënten  met  methylmalonacidemie  gevolgd.    De  confirmatie  kan  ook  gebeuren  via  aminozuren  in  plasma,  waarbij  glycine  en  alanine  concentraties  gaan  gestegen  zijn.  Ook  via  acylcarnitines  kan  men  positieve  resultaten  confirmeren  voor  de  verschillende  aandoeningen.  Voor  methylmalonzuuracidurie  wordt  de  C3-­‐carnitine  concentratie  gemeten.  Acylcarnitines  zijn  essentiële  componenten  in  het  metabolisme  van  vetzuren.  Deze  gaat  men  meten  bij  een  NBS,  diagnose  van  organische  aciduriën  of  vetzuur  oxidatiestoornissen,  hypoglycemie  en  bij  controle  van  de  behandeling.  De  gebruikte  methode  om  deze  elf  aandoeningen  op  te  sporen  is  Electrospray  tandem  MS  of  ‘fast  atom  bombardment  tandem  MS’.  Het  monster  dat  men  hiervoor  kan  gebruiken  zijn  dried  blood  spot  (Guthrie  kaartje),  plasma/serum  en  urine.  Hieruit  kan  men  a.d.h.v.  tandem  MS  dan  bepalen  welke  acylcarnitine  verhoogd  is  en  is  dit  C3-­‐carnitine,  dat  duidt  dit  op  methylmalonzuur.  (Hoffmann & Zschocke, 2014)  

 Vitamine    B12  Vitamine  B12  werd  vroeger  gedetecteerd  door  een  serum  vitamine  B12  bepaling  uit  te  voeren  of  een  Schilling  test.  Met  de  Schillingtest  kan  er  nagegaan  worden  of  er  malabsorptie  is  van  vitamine  B12  in  het  distale  deel  van  het  ileum.  Er  wordt  intramusculair  een  overmaat  aan  vitamine  B12  toegediend  die  de  bindingsplaatsen  in  de  lever  verzadigen.  Daarna  neemt  de  patiënt  radioactief  gelabelde  vitamine  B12  in.  De  hoeveelheid  radioactieve  vitamine  B12  uitgescheiden  in  de  urine  wordt  gemeten.  Het  percentage  van  de  in  de  urine  uitgescheiden  vitamine  B12  zal  verlaagd  zijn  t.o.v.  de  orale  dosis  bij  een  malabsorptie,  normaal  bedraagt  die  10%.  Bij  deze  test  kwamen  te  veel  foutieve  testresultaten  voor  door  bijvoorbeeld  een  onvolledige  verzameling  van  urine.   (de Rooij, Huijmans, Hoekstra, Fischer, & Wiersinga, 2005)    Bepaling  van  methylmalonzuur  kan  gebeuren  in  zowel  serum  als  in  plasma  als  in  urine.  De  bepaling  zal  meestal  in  bloed  gebeuren,  omdat  de  methylmalonzuur  niveaus  minder  beïnvloed  zijn  door  te  diëten  e.d.  dan  als  men  de  bepaling  gaat  uitvoeren  in  urine.  Deze  zijn  in  urine  meer  geconcentreerd  dan  in  plasma.  (Hoffmann & Zschocke, 2014)  

12

De  detectie  en  bepaling  van  methylmalonzuur  wordt  uitgevoerd  op  een  LC-­‐MS/MS  toestel  van  Waters.  Er  wordt  bij  de  kwantitatieve  methode  gebruik  gemaakt  van  gedeutereerd  methylmalonzuur  (d3)  als  interne  standaard  voor  elk  monster,  deze  laat  toe  te  corrigeren  voor  variabiliteit  tijdens  zowel  de  staalvoorbereiding  al  de  analyse  op  het  toestel.   (RECIPE, 2010)  GC-­‐MS  werd  gebruikt  als  gouden  standaard  voor  de  methylmalonzuur  bepaling  in  urine  voor  vele  jaren.  Correcte  resultaten  werden  bekomen,  maar  het  vergde  veel  handelingen  voor  analytische  extracties  en  derivatisatie.  GC-­‐MS  vergt  ook  veel  tijd  op  vlak  van  chromatografische  scheidingen.  Daarom  heeft  LC-­‐MS/MS  de  GC-­‐MS  vervangen  omwille  van  zijn  relatieve  methodologische  eenvoud  en  hogere  gevoeligheid (Carvalho & Kok, 2008)  

13

6. Chromatografie  –  Massa  spectrometrie    Chromatografie  is  een  scheidingstechniek.  Deze  is  gebaseerd  op  de  distributie  tussen  twee  fasen,  die  t.o.v.  elkaar  in  tegenstroombeweging  zijn.  De  stationaire  fase,  SF,  is  een  stilstaande  laag  die  ofwel  gecoat  is  op  de  kolom  (capillaire  GC)  ofwel  op  zeer  fijne  partikels  waarmee  de  kolom  gevuld  is  (LC)  en  de  mobiele  fase,  MF,  wordt  continu  voortgestuwd  doorheen  de  SF.  De  MF  dient  als  transportmiddel  tijdens  de  analyse.    Chromatografie  is  een  techniek  die  zowel  voor  kwalitatieve  als  kwantitatieve  bepalingen  kan  gebruikt  worden.  Afhankelijk  van  de  MF  kan  dit  ingedeeld  worden  in  twee  hoofdgroepen.  Indien  de  MF  een  gas  is,  spreekt  men  van  gaschromatografie.  Is  de  MF  een  vloeistof,  dan  spreekt  men  van  vloeistofchromatografie,  waarop  we  ons  concentreren  in  deze  thesis.    

 UPLC  of  Ultra  Performance  Liquid  Chromatography  maakt  snellere  en  meer  efficiënte  chromatografische  analyses  mogelijk  door  kolommen  te  gebruiken  met  kleine  partikels  (bv.  1,7  µm)  bij  zeer  hoge  druk  (15.000  psi).  Door  de  kleine  partikels  gaat  de  scheiding  efficiënter  verlopen,  ook  bij  hogere  snelheden  van  de  mobiele  fase.  Er  moet  dan  wel  meer  druk  gestoken  worden  op  die  mobiele  fase  om  die  aan  een  bepaalde  snelheid  door  de  dichtgepakte  kolom  te  laten  lopen.  Hierdoor  moeten  de  kolommen  de  hogere  drukken  kunnen  verdragen.  T.o.v.  een  HPLC  kolom  is  een  kolom  bij  UPLC-­‐MS/MS  gevuld  met  kleinere  partikels  om  de  hogere  snelheden  te  kunnen  gebruiken  zonder  enig  verlies  van  de  resolutie.     (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) (www.chromacademy.com)    Een  interne  standaard,  IS,  wordt  gebruikt  voor  de  kwantificatie.  Een  gepaste  IS  gaat  fouten  in  de  staalvoorbereiding,  de  chromatografie  en  de  ionisatie  in  de  MS  opvangen  en  minimaliseren.  Het  is  dus  belangrijk  een  geschikte  IS  te  kiezen,  meestal  wordt  er  één  gekozen  die  analoog  is  aan  de  structuur  van  het  component.  Hier  werd  gebruik  gemaakt  van  een  gedeutereerde  IS,  Dx,  waarbij  x  staat  voor  het  aantal  deuteriums.  Deuterium  is  een  stabiele  isotoop  van  waterstof  en  heeft  naast  een  proton  ook  een  neutron  in  de  atoomkern.  Aangezien  de  massa  van  het  gelabelde  molecule  verschilt  met  de  massa  van  de  niet  gelabelde  molecule,  kan  met  massaspectrometrie  deze  van  elkaar  onderscheiden  worden  op  vlak  van  hun  massa.  Deze  doet  chemisch  hetzelfde.     Bij  een  gedeutereerde  IS  worden  een  aantal  waterstoffen (De Brabanter, 2014)  vervangen  door  deuterium  atomen,  waardoor  de  IS  een  grotere  m/z  heeft  dan  zijn  overeenkomstige  niet  gedeutereerde  vorm.  Teveel  deuteriums  kunnen  echter  een  verandering  in  de  fysico  –  chemische  eigenschappen  van  de  component  veroorzaken.    (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009)  

Figuur 8: Principe UPLC-MS/MS

Particles: 1-5 µM

14

1. Massaspectrometrie:  principe    

Een  massaspectrometer  is  een  detector  die  in  staat  is  ionen  te  filteren  en  vervolgens  te  detecteren  volgens  hun  massa  over  lading  verhouding  (m/z).  De  detector  werkt  onder  hoog  vacuüm,  10-­‐3  tot  10-­‐6  Pa  zodat  de  ionen  niet  kunnen  interfereren  met  nog  aanwezige  luchtmoleculen.  Ze  kunnen  botsen  met  het  te  detecteren  ion  en  fragmentatie  veroorzaken  en/of  het  traject  wijzigen.  Hierdoor  kan  het  ion  zijn  lading  verliezen  door  te  botsen  met  de  wanden  van  de  MS.    Een  massaspectrometer  bestaat  typisch  uit  een  ionisatiebron,  waarin  het  monster  wordt  geïntroduceerd,  een  massa  –  analysator  en  een  detector  zoals  te  zien  is  in  figuur  9. (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009)      

Figuur 9: Schematisch overzicht van Massaspectrometrie 1.1 Ionisatiebron    Bij  vloeistofchromatografie  vormt  de  ionisatiebron  de  interface  tussen  de  LC  (op  atmosferische  druk)  en  de  MS  (onder  vacuüm).  In  de  bron  zullen  de  moleculen  die  de  LC-­‐kolom  verlaten,  geïoniseerd  worden  bij  atmosferische  druk.    In  deze  oppuntstelling  wordt  vertrokken  vanuit  een  vloeistoffase  en  maakt  men  gebruikt  van  elektrospray  ionisatie,  ESI.  Het  ionisatieproces  kan  ingedeeld  worden  in  drie  stappen:  aërosolvorming,  druppelverkleining  en  ionenvorming.    Het  eluens  wordt  door  een  smalle  stainless  steel  capillair  gestuurd  waar  de  ionisatie  gebeurt  door  het  aanleggen  van  een  sterk  elektrisch  veld  (2  tot  6  kV)  op  het  capillair.  Hierdoor  ontstaat  een  aerosol  van  geladen  druppels  die  kleiner  worden  als  de  oplossing  evaporeert  van  de  oppervlakte.  Dit  desolvatatieproces  wordt  versneld  door  een  temperatuursverhoging  en  door  desolvatatiegas  (N2).  Hierdoor  stijgt  de  ladingsdichtheid,  waardoor  de  afstotingskrachten  (repulsiekrachten)  van  deze  ladingen  toenemen.  Indien  de  repulsiekrachten  op  een  bepaald  moment  groter  worden  dan  de  oppervlaktespanning  van  de  druppels,  vallen  de  druppels  uiteen  in  netto  positief  of  netto  negatief  geladen  deeltjes.  Afhankelijk  van  de  polariteit  en  de  aangelegde  potentiaal  worden  positieve  of  negatieve  ionen  in  de  massa  analyzer  getrokken.   (De Brabanter, 2014)    

Ion

Source Mass

Analyzer

Detector

228 m

/z

162 m

/z

Minutes1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

198 m

/z

Data

Liquid from LC

Sample Introduction

15

Figuur 10: Uitvergrote weergave van het capillair en druppelvorming bij positieve elektronspray ionisatie        

            Negative Electrospray Ions

Figuur 11: Vorming van ionen in positieve en negatieve ionisatiemode    Een  positief  electrospray  ion  wordt  geproduceerd  op  het  moment  dat  een  positief  ion  of  een  adduct,  een  component  gevormd  door  een  additiereactie,  wordt  toegevoegd  aan  een  molecule,  bijvoorbeeld:  H+,  NH4

+,  Na+.  Dit  komt  vooral  voor  bij  basische  componenten.    Een  negatief  electrospray  ion  wordt  geproduceerd  wanneer  een  proton  (waterstof  ion)  van  een  molecule  wordt  verwijderd,  deprotonatie.  Dit  komt  vooral  voor  bij  zure  substanties.  

- - - Liquid

+ + + +

High Voltage

+ + + +

+ + +

+ + -

+ + +

+

+ +

+ + + - +

+ +

+ + - -

+ + +

+ + - - +

+ + + + - - +

+ + + + - - +

+ + - -

- + - - - - + - - - +

- + - - - + - - + - + - - - + -

- + - - + - -

-

+

Taylor Cone

More Negative Ions than Positive Ions

More Positive Ions than Negative Ions

Positively Charged Droplets

N N C H 3 O

C H 3

H

+ H+

Lidocaine

N N C H 3 O

C H 3

H

+

H

Positive Electrospray Ions

C H 3

OH

OH

C H 3

C H 3

C H 3

O

O C H 3

C H 3

+ H+ Ibuprofen

16

Hoe  groter  de  molecule,  hoe  groter  de  kans  dat  er  meerdere  plaatsen  beschikbaar  zijn  voor  (de)protonatie  doordat  er  meerdere  basische  en/of  zure  functionele  groepen  op  staan.    Het  vormen  van  meervoudig  geladen  moleculen  is  een  belangrijke  en  unieke  eigenschap  van  ESI.  Het  grootste  nadeel  aan  ESI  is  de  gevoeligheid  aan  matrixeffecten  die  de  ionisatie  tegenwerken  of  juist  versterken.  De  matrixeffecten  zijn  effecten  van  co  –  eluerende  componenten  op  de  ionisatie  van  targetmoleculen.  Deze  kunnen  veroorzaakt  worden  door  de  monstervoorbereiding,  additieven  in  de  MF  en  matrixcomponenten  zoals  lipiden,  zouten  en  anticoagulantia  zoals  lithiumheparine  en  natrium  –  EDTA.   (De Brabanter, 2014)  

 1.2 Massa  –  analysator  :    In  de  massa  –  analysator  worden  de  gevormde  ionen  gescheiden  volgens  hun  m/z  waarde.  D.m.v.  een  elektrisch  of  magnetisch  veld  worden  de  gevormde  ionen  naar  de  massa  –  analysator  toegetrokken.  Er  bestaan  verschillende  types  zoals  een  triple  quadrupool,  een  ion  trap  of  een  time  of  flight.  In  deze  thesis  werd  gebruik  gemaakt  van  de  triple  quadrupool,  TQ.  Één  quadrupool  bestaat  uit  vier,  onderverdeeld  in  twee  paar,  evenwijdige  staven  met  cirkelvormige  doorsnede.  De  staven  die  tegenover  elkaar  staan,  zijn  elektrisch  verbonden  en  hebben  dus  dezelfde  potentiaal,  maar  de  ene  is  positief  en  de  andere  is  negatief.  Er  wordt  een  paar  positief  ingesteld  en  een  ander  paar  negatief  ingesteld.    Er  wordt  een  combinatie  van  gelijkspanning  (DC)  en  wisselspanning  (RF)  op  elk  paar  aangebracht.  Deze  combinatie  zorgt  voor  de  ionenscheiding  met  een  grote  selectiviteit,  enkel  de  ionen  met  een  specifieke  m/z  verhouding  worden  doorgelaten  en  bereiken  de  detector.  De  andere  ionen  gaan  door  botsing  met  de  staven  verloren.   (De Brabanter, 2014)    1.3 Triple  Quadrupool  (TQ)    De  combinatie  van  twee  of  meer  massa  –  analysatoren  is  typisch  voor  een  tandem  massaspectrometer.  De  meest  gebruikte  analysator  voor  kwantitatieve  analyses  is  de  TQ.  Deze  is  opgebouwd  uit  twee  quadrupolen  die  verbonden  zijn  via  een  botsingscel.  Deze  botsingscel  kan  gevuld  zijn  met  botsingsgas  (argon).  De  precursor  ionen  worden  in  de  eerste  quadrupool  selectief  doorgelaten  waarna  ze  in  de  botsingscel  gefragmenteerd  worden  door  botsing  met  een  inert  gas.  De  tweede  quadrupool  selecteert  dan  de  gewenste  fragmenten  die  nadien  tenslotte  gedetecteerd  worden  door  impact  op  een  fotonvermenigvuldiger.   (De Brabanter, 2014)    De  TQ  MS  kan  in  verschillende  scan  modi  opereren:  product  ion  scan,  parent  ion  scan,  multiple  reaction  monitoring  (MRM)  modus  en  neutral  loss  scan.  Alle  fragment  ionen  van  een  welbepaald  precursor  ion  worden  gemeten  in  de  product  ion  scan  mode.    Alle  precursor  ionen,  die  een  specifiek  fragment  produceren,  worden  gemeten  in  de  parent  ion  scan  mode.    Bij  MRM  wordt  de  transitie  gevolgd  van  één  precursor  ion  naar  één  karakteristiek  fragment  ion.  De  MRM  modus  is  de  aangewezen  methode  voor  kwantitatieve  en/of  gevoelige  analyses.  Om  een  groep  componenten  te  analyseren  die  allemaal  een  specifiek  neutraal  fragment  verliezen,  wordt  er  in  de  neutral  loss  scan  gemeten.   (De Brabanter, 2014)

17

Figuur 12: Schematische weergave principes verschillende MS/MS modes            

18

7. SPE  ‘Solid  Phase  Extraction’,  SPE,  is  een  monstervoorbereiding  waarbij  vaste  partikels  worden  gebruikt.  SPE  wordt  gebruikt  voor  opzuivering,  het  selectief  verwijderen  van  interferenties  en  opconcentratie,  aanreiken,  van  het  monster.  (Lanckmans, Procedure: Rapidtrace, 2014)  Voor  een  ‘Ion  Exchange  Chromatography’,  IEC,  moeten  het  analiet  en  sorbent  tegenovergesteld  geladen  zijn.  ‘Anion  exchange’  wordt  gebruikt  om  negatief  geladen  ionen  tegen  te  houden  op  een  positief  oppervlak.  (Arsenault, 2012)    Een  typisch  SPE  protocol  bestaat  uit  4  stappen  (zie  figuur  13):  

 -­‐ ‘Conditioning  the  packaging’:  Methanol  of  acetonitrile  wordt  doorheen  de  cartridge  

gestuurd.  Het  verwijdert  elke  onzuiverheid  afkomstig  van  het  productieproces  of  toevallige  vervuiling  uit  de  omgeving.  Het  laat  ook  toe  het  sorbent  te  solvateren  indien  nodig.    

-­‐ ‘Sample  application’  (‘loading’):    Het  monster  wordt  indien  nodig  opgelost  in  een  zwak  solvent  en  op  de  kolom  gebracht.  Voor  ion  exchange  is  het  zwakke  solvent  water  of  buffer  waaraan  bv.  10%  organisch  zuur  is  aan  toegevoegd.  

-­‐ ‘Washing  the  packing’  (‘rinsing’):  verwijderen  van  zoveel  mogelijk  interferenties  door  de  cartridge  te  wassen  met  een  solvent  van  gemiddelde  sterkte.  De  wasstap  wordt  stop  gezet  net  voordat  het  analiet  loskomt  van  de  cartridge  zodat  geen  verlies  van  het  analiet  optreedt.    

-­‐ ‘Elution  and  recovery  of  the  analyte’:  in  deze  stap  wordt  het  analiet  geëlueerd  en  de  fractie  van  het  analiet  wordt  gecollecteerd.    

   

Figuur 13: Schematisch overzicht van Ion-exchange chromatografie

19

III. Experimenten  

1. Materiaal  en  methode   1.1 Materiaal    Tabel 2: Gebruikte commerciële controles Commerciële  controles  Kalibratoren   ClinCal®  -­‐  Calibrator  (Serum  

Calibrator  Set  lyophilised)  Methylmalonic  Acid  RECIPE    Level  0:    <  21.0  nmol/L  Level  I:  223  nmol/L  Level  II:  803  nmol/L  Level  III:  1468  nmol/L  

 

ClinCal®  -­‐  Calibrator  (Serum  Calibrator  Set  lyophilised)    Methylmalonic  Acid  RECIPE    Level  0:  <  25.4  nmol/L  Level  I:  220  nmol/L  Level  II:  770  nmol/L  Level  III:  1431  nmol/L  

 QC   ClinChek®  -­‐  Control  (Serum  

Control  lyophilised)    Methylmalonic  Acid  RECIPE    Level  I:  208  –  312  nmol/L  Level  II:  467  –  700  nmol/L  

 

 

UTAK   BI  –  Level  Methylmalonic  Acid  –  Serum  Toxicology  Control  van  UTAK  Laboratories  Inc.    Level  I:  Target  value:  200  nmol/L  Verified  value:  202  nmol/L  Expected  range:  170  –  230  nmol/L  Level  II:    Target  value:  1000  nmol/L  Verified  value:1020  nmol/L  Expected  range:  870  –  1170  nmol/L  

 

 

SAS   Special  Assays  Serum  –  ErndimQA    Sample  127:  Mean:  244  nmol/L  Median:  230  nmol/L  Sample  131:  Mean:  243  nmol/L  Median:  240  nmol/L  

 

 

 

20

Methylmalonzuur,  met  pKa  van  3,07,  en  de  gedeutereerde  standaard  MMA-­‐d3  werden  aangekocht  bij  de  firma  ISOTEC  Sigma  Aldrich.  Er  werden  stockoplossingen  bereid  van  10  mmol/l  voor  methylmalonzuur  en  de  gedeutereerde  standaard  MMA-­‐d3  en  een  werkoplossing  van  0,01  mmol/L  door  100  µl  van  de  MMA  stockoplossing  op  te  lossen  in  100  ml  milliQ  water.      Voor  de  oppuntstelling  werd  kalfsserum  gebruikt  (leverancier  Bovogen  Biologicals),  met  een  concentratie  van  ongeveer  2000  nmol/L  methylmalonzuur,  drie  keer  gemeten  op  UPLC-­‐MS/MS.  Hiervan  hebben  we  volgende  verdunningen  gemaakt:  vier  keer  verdund  tot  een  MMA  concentratie  van  om  en  bij  500  nmol/L  en  tien  keer  verdund  tot  een  concentratie  van  ongeveer  200  nmol/L.      De  patiëntenmonsters  werden  afgenomen  van  vrijwilligers  in  lithium  heparine  SARSTEDT®  oranje  buizen  van  9  ml.  Deze  tubes  bevatten  een  gel  die  toelaat  om  de  cellen  makkelijker  te  scheiden  van  het  plasma.  Deze  monsters  worden  gecentrifugeerd  en  het  plasma  wordt  afgepipetteerd  en  bewaard  bij  -­‐20°C.      SPE  staalvoorbereiding  werd  uitgevoerd  op  Sep-­‐Pak®  Accell™  Plus  QMA  Cartridges  kolommen  van  Waters.  Dit  type  kolom  is  een  gebaseerd  op  silica,  hydrofiel,  sterke  anionenuitwisselaar  met  grote  poriën  die  gebruikt  wordt  om  anionische  analieten  in  waterige  en  niet-­‐waterige  oplossingen  te  extraheren.    Volgende  buffers  werden  gebruikt  voor:    

-­‐ Conditioneren  en  wassen:    o Methanol  (CH4O  )ULC/MS  van  de  firma  Biosolve  BV  met  een  zuiverheid  van  

99,98%  o MQ  water  van  de  MQ  waterkraan  

-­‐ Monster  laden:  o Fosfaatbuffer,  0,05  mol/l  met  een  pH  van  6,5  door  31,5  ml  Na2HPO4  op  te  

lossen  met  68,5  ml  NaH2PO4  -­‐ Elueren  

o Formic  Acid  (CH2O2,  mierenzuur)  van  de  firma  Emsure®  met  een  concentratie  van  98-­‐100%,  maar  hiervan  werd  een  werkoplossing  van  5%  FA  in  methanol  gemaakt  om  te  gebruiken  als  eluens.    

 Voor  analyse  van  de  monsters  werd  een  Waters  UPLC-­‐MS/MS  toestel  gebruikt  met  een  Waters  Acquity™  UPLC®  type  HSS=T3  als  kolom  (1,8  µm;  2,1  mm  x  100  mm).    HSS  staat  voor  High  Strength  silica.  De  silica  deeltjes  zijn  ontworpen  voor  een  hoge  mechanische  stabiliteit  en  hebben  een  passende  morfologie  voor  een  lange  levensduur  van  de  kolom  en  genoeg  efficiëntie  bij  hoge  druk.      De  mobiele  fases  die  gebruikt  worden:    

-­‐ Methode  1,  2  &  3  o A2:  1%  v/v  FA  in  1L  MQ  (10  ml  FA  in  1  L  MQ)  o B2:  0,3%  FA  in  1L  MeOH  (3  ml  FA  in  1  L  methanol)  

-­‐ Methode  4:  o A1:  0,1%  FA  in  MQ  ULC/MS  van  Biosolve  BV  (1  ml  FA  in  1  L  MQ  ULC/MS)  o B2:  0,3%  FA  in  1l  MeOH  (3  ml  FA  in  1  l  methanol)  

21

Mobiele  fases  werden  maximaal  1  maand  gebruikt.      Als  weak  needle  wash  werd  50  ml  acetonitrile  ULC/MS  (C2H3N,  concentratie  99,97%)  van  Biosolve  BV  met  950  ml  MQ  gemengd.      Voor  de  onteiwitting  van  monsters  in  alle  methodes  werd  een  mengsel  gemaakt  van  80  ml  ACN  en  20  ml  methanol  (Biosolve  BV).  Na  staalvoorbereiding  werden  monsters  opgelost  in  oplossingssolvens,  gemaakt  door  3  ml  FA  op  te  lossen  in  100  ml  MQ  ULC/MS  van  Biosolve.          

22

1.2 Apparatuur   De  analyses  van  deze  oppuntstelling  gebeuren  op  een  Acquity™  Ultra  Performance  Liquid  Chromatography  systeem.  Deze  bestaat  uit  drie  componenten:  een  Binary  Solvent  Manager  ,  een  Sample  Manager  en  Column  Manager.  Een  Waters  TQ  Detector  wordt  gebruikt  om  de  componenten  te  detecteren.    

Figuur 14: UPLC met Binary Solvent Manager (A), de Sample Manager (B), de Column Manager (C) en de TQ detector (D)  De  Binary  Solvent  Manager  bestaat  uit  een  binaire  pomp  en  een  vacuümontgasser  voor  de  vier  solventleidingen.  Twee  solventen  worden  gemengd  met  een  constante  (isocratische)  of  variabele  (gradiënt)  samenstelling  door  de  binaire  pomp  onder  hoge  druk.  In  deze  thesis  wordt  gebruik  gemaakt  van  een  gradiënt.  De  gradiënt  gaat  zorgen  voor  een  versnelde  elutie  van  componenten  die  sterk  binden  aan  de  stationaire  fase  met  een  lagere  retentietijd  en  smallere  pieken.  Hier  wordt  gebruik  gemaakt  van  twee  oplossingen  in  de  mobiele  fase,  waarbij  milliQ  water  wordt  gebruikt  als  zwakke  oplossing  en  een  sterke  oplossing,  het  organisch  component  methanol.  De  zwakke  oplossing  gaat  ervoor  zorgen  dat  de  opgezuiverde  componenten  langzaam  gaan  elueren,  de  sterke  oplossing  gaat  er  dan  weer  voor  zorgen  dat  het  monster  sneller  door  de  kolom  loopt.  Er  wordt  gebruik  gemaakt  van  een  C18,  silica,  kolom.  MMA  is  polair  en  gaat  weinig  interactie  met  de  vaste  fase  vertonen  en  met  een  waterige  mobiele  fase  van  de  kolom  lopen,  dit  duidt  op  weinig  retentie.  Apolaire  stoffen  gaan  een  veel  grotere  interactie  met  de  kolom  vertonen  en  in  dat  geval  is  een  meer  organische  mobiele  fase  nodig  om  die  interacties  te  verbreken.    De  begincondities  van  de  gradiënt  bestaan  uit  een  grotere  verhouding  van  solvent  A  en  een  kleinere  verhouding  van  solvent  B.  Naarmate  de  analyse  gaat  vorderen,  gaat  er  een  grotere  verhouding  van  solvent  B  gevormd  worden  en  een  kleinere  verhouding  van  solvent  A.    Boven  de  binaire  pomp  bevindt  zich  de  Sample  Manager  waarin  twee  compartimenten  te  vinden  zijn.  Het  monstercompartiment  bevindt  zich  aan  de  linkerkant.  Hierin  zitten  twee  uitschuifbare  monsterhouders,  een  automatische  injector  en  de  injectienaald.  Het  monstercompartiment  kan  gethermostatiseerd  worden  tussen  4°C  en  40°C.  Het  injectievolume  kan  ingesteld  worden  tussen  0,1  en  50  µl,  hier  maken  we  gebruik  van  10  µl  injectievolume  in  full  loop  modus,  wat  ook  de  maximale  hoeveelheid  is  van  de  sample  loop.  Het  needle  wash  compartiment  bevindt  zich  aan  de  rechterkant.    

A  

B  

C  

D  

23

 In  de  Column  Manager  bevindt  zicht  de  kolomoven  waarin  de  analytische  kolom  wordt  verwarmd,  want  lagere  temperaturen  leiden  tot  een  hogere  viscositeit  met  hogere  drukken  tot  gevolg.  De  temperatuur  kan  gaan  van  minstens  5°C  boven  de  omgevingstemperatuur  tot  65°C,  in  dit  geval  30°C.  Aan  de  kolom  is  een  microchip  bevestigd  die  het  serienummer  van  de  kolom  opslaat  en  het  toestel  kan  hieraan  de  gegevens  dan  linken.  Ik  heb  gebruik  gemaakt  van  de  Waters  Acquity™  UPLC®  van  het  type  HSS-­‐T3  kolom  (1,8  µm;  2,1  x  100  mm).    De  kolom  is  een  C18-­‐kolom  (18  koolstofatomen),  silicakolom.  Door  deze  vele  koolstofatomen  is  deze  soort  kolom  zeer  apolair.  Vandaar  dat  de  mobiele  fases  polair  zijn  en  vaak  bestaan  uit  een  waterige  en  een  organische  oplossing.  Indien  de  component  zeer  apolair  is,  gaat  deze  een  goede  interactie  met  de  kolom  ondervinden  t.o.v.  polaire  stoffen  die  een  moeilijke  interactie  met  de  apolaire  kolom  gaan  ondervinden.  Deze  laatste  zullen  dan  ook  snel  van  de  kolom  elueren.  Hoe  meer  apolair  de  stof  is,  hoe  hoger  de  retentietijd  gaat  zijn.      De  componenten  worden  gedetecteerd  door  een  TQ  detector  na  elutie  van  de  analytische  kolom.  Deze  detector  is  uitgerust  met  een  elektrospray  ionisatiebron,  een  tripel  quadrupool  als  analysator  en  een  fotonvermenigvuldiger  als  detector.  Op  het  chromatogram  wordt  de  absorptie  i.f.v.  de  tijd  weergegeven.      Het  softwareprogramme  MassLynx®  (Waters)  is  het  besturingssysteem  voor  de  UPLC.  In  TargetLynx®  kunnen  de  resultaten  verwerkt  worden  zoals  de  integratie,  opstellen  van  de  ijklijnen  en  het  berekenen  van  de  concentraties.  (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) De  Rapidtrace,  zie  figuur  15,  is  een  toestel  dat  gebruikt  om  SPE  analyses  mee  uit  te  voeren..  Het  toestel  te  UZ  Brussel  heeft  drie  modules,  waarbij  elke  module  geladen  kan  worden  met  10  buisjes  van  3  ml  en  10  buisjes  van  6  ml.  De  Rapidtrace  is  zeer  makkelijk  te  besturen  via  een  softwareprogramma.  Het  toestel  is  ontworpen  om  de  staalvoorbereiding    te  automatiseren  en  om  de  te  bepalen  componenten  op  te  zuiveren.    (Rapid Trace SPE Workstation, 2012)  

Figuur 15: Rapidtrace toestel met 3 modules  

24

1.3 Methode  ontwikkeling  

Eerst  hebben  we  de  UPLC-­‐MS/MS  getuned,  (zie  tabel  3),  dit  houdt  in  dat  de  juiste  ion  mode  wordt  geselecteerd,  in  dit  geval  de  negatieve  electrospray.  Deze  wordt  gebruikt  om  vanaf  basische  of  neutrale  oplossingen  de  vorming  van  negatieve  ionen  te  vergroten.  De  optimale  collisie  energie  wordt  bepaald  voor  elk  dochterion.  De  parameters  worden  allemaal  zo  optimaal  mogelijk  ingesteld  voor  de  target  molecule,  in  dit  geval  methylmalonzuur.  In  tabel  4  zijn  de  geoptimaliseerde  parameters  beschreven.  Bij  het  tunen  van  de  UPLC-­‐MS/MS  tracht  men  een  zo  hoog  mogelijke  detectorrespons  te  bekomen  voor  het  precursorion  en  de  dochterionen.    

Tabel 3: Stappen tuning UPLC-MS/MS -­‐ API  gas  inschakelen  en  collision  gas  uitschakelen  -­‐ Ion  mode  kiezen:  Electrospray  –  -­‐ Fluidics  infusion:  10  µl/min  (eerste  prime)  -­‐ Analyser  in  MS  mode  zetten  -­‐ Optimum  voor  parent  ion  bepalen  door:  cone  voltage  te  variëren  tot  maximum  

40V  -­‐ Function  =  MS  Scan  -­‐ Grafiek  instellen,  door  ‘span’  en  ‘gain’  aan  te  passen  -­‐ Nadien  daughter  ions  optimaliseren  -­‐ Collision  gas  inschakelen  -­‐ Analyser  in  MS/MS  mode  zetten  -­‐ Voor  elk  dochterion  de  optimale  collision  energie  bepalen  -­‐ Function  =  Daughter  scan  

 De  component  wordt  rechtstreeks  in  de  MS  geïnjecteerd  in  een  verdunning  in  0,1%  mierenzuur/ACN  (50/50).    

 Tabel 4: Parameters ESI-MS/MS

METHYLMALONZUUR  100  µMOL/L:  100  KEER  VERDUND  UIT  STOCK  10  MMOL    Parent  ion  m/z   Cone  V   Daugther  ion  m/z   Collision  Energy  EV  116.98   23V   73.00   10V       55.30   20V  

INTERNE  STANDAARD  METHYLMALONZUUR  d3:  STOCK  METHYLMALONZUUR  d3  =    1  MG/L  =  8.3  MM  120  µL  STOCK  IN  100  ML  0,1%  FA  ACN  =  100  µM  MMA  D3  

Parent  ion  m/z   Cone  V   Daugther  ion  m/z   Collision  Energy  EV  120.0   20V   76.00   10V        

25

1) Instellen  methode  volgens  protocol  Wilhelmina  Nijmegen    

METHODE  1:  Wilhelmina  Nijmegen    In  tabel  4  is  de  procedure  beschreven  gebaseerd  op  het  artikel  van  het  ziekenhuis  Wilhelmina  Nijmegen.  Er  wordt  50  µl  interne  standaard  gemengd  met  100  µl  monster  (plasma).  Dit  wordt  dan  even  geschud  op  de  vortex.  Dan  wordt  er  1000  µl  acetonitrile/methanol  (80/20  v/v)  toegevoegd  aan  het  mengsel  om  de  proteïnen  neer  te  slaan.  Dit  wordt  opnieuw  krachtig  gevortext.  Het  mengsel  wordt  5  minuten  gecentrifugeerd  aan  4000  rpm  op  4°C  en  het  supernatans  wordt  overgebracht  in  een  nieuwe  eppendorf  en  dit  wordt  drooggedampt  onder  stikstof  bij  50°C.  Na  droogdampen  lost  men  het  residu  op  in  100  µl  3%  mierenzuur  in  milliQ  water,  een  protisch  oplosmiddel,  om  methylmalonzuur  opnieuw  in  oplossing  te  brengen.  Aangezien  methylmalonzuur  een  zwak  zuur  is,  betekent  wanneer  deze  in  oplossing  is  altijd  een  fractie  geprotoneerd  en  een  fractie  gedeprotoneerd  is.  In  deze  thesis  wordt  er  opgelost  in  een  zuur  oplosmiddel,  3%  mierenzuur  in  milliQ  water,  waarmee  MMA  geprotoneerd  wordt.  Dit  wordt  bepaald  door  de  pKa  van  MMA  en  van  de  pH  waarin  het  opgelost  wordt.    Nadat  het  opnieuw  gevortext  en  gecentrifugeerd  is  wordt  het  in  een  vial  met  insert  overgebracht,  nogmaals  gecentrifugeerd  en  op  het  toestel  geplaatst.  De  details  van  de  procedure  zijn  terug  te  vinden  in  tabel  5.    Enkele  voordelen  van  deze  methode  zijn  dat  er  kleine  hoeveelheden  gebruikt  worden,  100  µl    monster  voornamelijk  van  het  plasma.  Dit  zou  positief  voor  de  patiënt  zijn  dat  men  niet  veel  monster  nodig  heeft  zodat  het  geen  intensieve  afname  is  voor  de  patiënt.  Het  is  ook  een  zeer  snelle  en  simpele  methode  om  uit  te  voeren.      Met  deze  methode  zijn  heel  wat  bepalingen  uitgevoerd.  In  het  begin  hebben  we  voornamelijk  humaan  plasma  gespiked  zodat  we  aan  een  concentratie  komen  van  5000  nmol/L.  Enkele  reeksen  van  kalibratoren  en  commerciële  controles  zijn  ook  uitgevoerd,  om  na  te  gaan  of  we  de  concentratie  meten  die  deze  zouden  moeten  hebben.    Nadien  zijn  de  validatietesten  uitgevoerd  met  deze  methode.  Voornamelijk  bij  lineariteit  waren  er  altijd  veel  outliers.  Hierdoor  hebben  we  de  standaardadditiemethode  geïntroduceerd  en  dit  gaf  betere  resultaten.  Van  dezelfde  monsters  die  gebruikt  werden  bij  de  standaardadditiemethode  werd  ook  een  guthriekaartje  naar  een  ander  ziekenhuis  gestuurd,  om  na  te  gaan  of  onze  concentraties  methylmalonzuur  die  we  bekwamen  hetzelfde  waren  als  deze  van  het  guthriekaartje.  Dit  was  echter  niet  het  geval,  dus  moest  er  nagedacht  worden  over  een  andere  methode.    Dit  was  niet  de  enige  reden  om  van  methode  te  veranderen,  maar  ook  dat  de  bron  van  de  UPLC-­‐MS/MS  zeer  vervuild  geraakte  door  deze  monsters.  Deze  waren  niet  altijd  helder  en  eerder  troebel,  dit  kwam  doordat  er  enkel  met  acetonitrile  geprecipiteerd  werd.      

26

Tabel 5: Overzicht van de procedure voor bepaling van MMA volgens het artikel van Wilhelmina Nijmegen (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Methylmalonzuurmeting in serum en urine met behulp van LC-tandem massaspectrometrie, 2011) MONSTERVOORBEREIDING  IN  EPPENDORF    50  µl   16500  nM  methylmalonzuur  d3  100  µl     Monster  Vortex    1000  µl     ACN/MeOH  80/20  v/v  met  socorexpipet  +  

pasteurpipet  Vortex  krachtig    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  SN  in  nieuw  eppendorf  overbrengen     Met  pasteurpipet  Droogdampen  onder  N2  bij  50°C    Oplossen  in:    100  µl   3%  FA  in  MQ  Vortex    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  Overbrengen  in  vial  met  insert    Vial  met  insert  afdraaien   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  10  µl  injectievolume   Methode:  Wilhelmina  Nijmegem.w2200    

2) Aanpassen  staalvoorbereiding  richting  SPE  +  optimalisatie  SPE    Omwille  van  de  obstakels  die  we  hadden  met  de  methode  van  het  Wilhelmina  ziekenhuis,  zijn  we  SPE  gaan  introduceren.  Hier  zijn  we  eerst  het  monstervolume  gaan  nagaan,  namelijk  of  dat  100  µl  nog  steeds  optimaal  is  of  dat  er  overgeschakeld  moet  worden  op  200  µl,  om  na  te  gaan  of  100  µl  voldoende  is  om  een  LOD  te  halen  die  gelijk  is  aan  de  ondergrens  van  het  referentie  interval.    Dit  zijn  we  nagegaan  door  de  procedure  van  tabel  5  te  volgen  en  gebruik  te  maken  van  100  µl  monster  en  eens  200  µl  monster.  We  konden  besluiten  dan  100  µl  nog  steeds  voldoende  is,  omdat  de  resultaten  van  200  µl  en  100  µl  vergelijkbaar  waren.  De  bekomen  concentraties  bij  beide  hoeveelheden  waren  beiden  aanvaard,  omdat  ze  binnen  de  grenzen  lagen  van  de  theoretische  concentratie  van  de  kalibratoren.  Nadien  zijn  we  nagegaan  of  de  monsters  met  een  wasstap  met  methanol  betere  resultaten  gaven,  dan  de  monsters  die  zonder  de  methanol  wasstap  werden  voorbereid  op  de  Rapidtrace,  zie  tabel  6.  Hieruit  konden  we  besluiten  dat  die  zonder  methanol  redelijk  troebel  waren  door  het  aanwezige  MQ.  MMA  is  een  zwak  zuur  en  gaat  niet  volledig  ioniseren  in  water.  Deze  monsters  waren  dus  niet  te  injecteren  want  hierdoor  werd  de  bron  weer  vervuild.      

27

Tabel 6: Procedure op Rapidtrace toestel Procedure  Rapidtrace      CONDITIONEREN    3,75  ml  MeOH    3,75  ml  MQ    MONSTER  LADEN    1,5  ml  monster    WASSEN    2  ml  MQ    2  ml  MeOH    ELUEREN    2  ml  5%  FA  in  MeOH      Dit  was  ook  een  snelle  methode,  maar  aangezien  er  maar  plaats  is  voor  10  monsters  op  het  Rapidtrace  toestel,  waaronder  4  kalibratoren  en  2  controles  en  4  monsters,  is  dit  niet  optimaal  als  er  veel  monsters  moeten  behandeld  worden,  aangezien  we  maar  één  module  ter  onze  beschikking  bezitten  van  de  Rapidtrace.    De  methode  van  het  toestel,  wordt  dan  manueel  uitgevoerd  en  vergeleken.  In  tabel  7  wordt  de  volledige  procedure  getoond  met  gebruik  van  de  Rapidtrace.  Met  deze  methode  dient  enkel  de  staalvoorbereiding  manueel  uitgevoerd  te  worden,  het  conditioneren,  het  monster  laden,  het  wassen  en  het  elueren  worden  uitgevoerd  door  de  Rapidtrace.      Tabel 7: Volledige procedure met Rapidtracetoestel MONSTERVOORBEREIDING  IN  LANGE  GLAZEN  SPE  BUIZEN  50  µl   16500  nM  methylmalonzuur  d3  100  µl     Monster  Vortex    900  µl     Fosfaatbuffer  pH  6,5  Vortex  krachtig    Op  RAPIDTRACE  plaatsen    SPE  Sep  Pak  Vac  3cc  (500  mg)    Eulaat  droogdampen  onder  N2  bij  50°C    Oplossen  in:    100  µl   3%  FA  in  MQ  Vortex    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  Overbrengen  in  vial  met  insert    Vial  met  insert  afdraaien   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  10  µl  injectievolume   Methode:  Wilhelmina  Nijmegem.w2200        

28

METHODE  3:  Manuele  SPE  Methode    De  methode  met  het  toestel  gaf  als  nadeel  dat  er  maar  4  monsters,  naast  de  controles  en  kalibratoren,  konden  geëxtraheerd  worden,  dus  zijn  we  overgeschakeld  naar  een  manuele  versie  van  de  procedure  van  de  Rapidtrace.  Een  aantal  keren  wordt  wel  nog  de  manuele  methode  vergeleken  met  de  methode  via  de  Rapidtrace.  Deze  manuele  methode  gaf  betrouwbare  resultaten  en  was  ook  snel,  met  als  voordeel  dat  er  meer  monsters  kunnen  behandeld  worden.    De  centrifugestap  leek  ons  beter  om  op  een  lagere  rpm  af  te  draaien,  langer  te  laten    centrifugeren  en  op  een  hogere  temperatuur  aangezien  deze  op  de  Rapidtrace  niet  gecentrifugeerd  worden  en  daar  staan  de  monsters  op  kamertemperatuur  en  zo  gaat  het  monster  door  de  packing  van  de  SPE  buis.  Op  de  Rapidtrace  wordt  het  monster  door  de  packing  geduwd  d.m.v.  een  soort  arm.  Het  eluaat  wordt  gecentrifugeerd  om  het  zo  helder  mogelijk  op  het  UPLC-­‐MS/MS  toestel  te  plaatsen.        

29

Tabel 8: Procedure met manuele SPE methode MONSTERVOORBEREIDING  MONSTER  IN  LANGE  GLAZEN  SPE  BUIZEN  50  µl   16500  nM  methylmalonzuur  d3  100  µl     Monster  Vortex    900  µl     Fosfaatbuffer  pH  6,5  Vortex  krachtig    Werkwijze    IN  LANGE  PLASTIC  TUBES  +  SEP  PAK  VAC  3CC  (500  MG)  CONDITIONEREN    2  ml  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Waste    2  ml  MQ    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Waste    MONSTER  LADEN    Monster    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Waste    WASSEN    2  ml  MQ    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Waste    2  ml  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Waste    Nieuwe  tube  nemen    ELUEREN    2  ml  5%  FA  in  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  30  seconden  4°C  Overbrengen  in  lange  glazen  tubes    Eulaat  droogdampen  onder  N2  bij  50°C    Oplossen  in:    100  µl   3%  FA  in  MQ  Vortex    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  Overbrengen  in  vial  met  insert    Vial  met  insert  afdraaien   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  10  µl  injectievolume   Methode:  Wilhelmina  Nijmegem.w2200        

30

METHODE  4:  Manuele  SPE  Methode  bijgewerkt    De  centrifugatiestap  is  bijgewerkt,  omdat  ook  op  de  rapidtrace  de  monsters  bij  kamertemperatuur  staan  en  omdat  de  vloeistof  niet  vanzelf  door  de  kolommen  gaan  lopen.  Dit  komt  omdat  de  packing  te  dicht  is.  Door  gebruik  te  maken  van  de  centrifuge  gaat  de  vloeistof  sneller  door  de  packing  lopen.  Op  de  Rapidtrace  gebeurt  dit  door  een  soort  arm  die  het  monster  door  de  packing  duwt.    Via  deze  methode  hebben  we  ook  een  nieuwe  kolom  voor  UPLC-­‐MS/MS  geïntroduceerd,  want  de  kolom  was  vervuild  en  de  stationaire  fase  was  niet  meer  optimaal  op  een  goede  piekvorm  en  retentietijd  te  garanderen.  De  pieken  werden  asymmetrisch.  Dit  merkten  we  aan  de  resultaten  dat  de  bekomen  concentraties  van  de  kalibratoren  en  commerciële  controles  niet  meer  binnen  de  grenzen  vielen  van  de  theoretische  controle.  De  resultaten  waren  niet  meer  betrouwbaar.  Met  deze  nieuwe  kolom  zijn  we  nagegaan  of    mobiele  fase  met  0,1%  FA  in  MQ  water  even  goede  resultaten  geeft  als  1%  FA  in  MQ  water.  Hieruit  bleek  dat  0,1%  FA  in  MQ  water  ook  goede  resultaten  als  1%  FA  in  MQ  water,  dus  zijn  we  zelf  bereidde  0,1%  FA  gaan  gebruiken  als  mobiele  fase.  Dit  geeft  de  mobiele  fase  een  pH  van  ongeveer  2,6.  Hierbij  gaat  methylmalonzuur  niet  ioniseren,  omdat  de  mobiele  fase  meer  polair  is.    Met  deze  methode  zijn  de  validatietesten  dan  uitgevoerd.      

31

Tabel 9: Bijgewerkte procedure met manuele SPE methode MONSTERVOORBEREIDING  MONSTER  IN  LANGE  GLAZEN  SPE  BUIZEN  50  µl   16500  nM  methylmalonzuur  d3  100  µl     Monster  Vortex    900  µl     Fosfaatbuffer  pH  6,5  Vortex  krachtig    Werkwijze  IN  LANGE  PLASTIC  TUBES  +  SEP  PAK  VAC  3CC  (500  MG)  CONDITIONEREN    2  ml  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Waste    2  ml  MQ    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Waste    MOSTER  LADEN    Monster    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Waste    WASSEN    2  ml  MQ    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Waste    2  ml  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Waste    Nieuwe  tube  nemen    ELUEREN    2  ml  5%  FA  in  MeOH    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  1000  t  1  minuut  15°C  Overbrengen  in  lange  glazen  tubes    Eulaat  droogdampen  onder  N2  bij  50°C    Oplossen  in:    100  µl   3%  FA  in  MQ  Vortex    Centrifugeren   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  Overbrengen  in  vial  met  insert    Vial  met  insert  afdraaien   Rotina  centrifuge  4000  t  5  min  4°C  10  µl  injectievolume   Methode:  MMA150102.w2200    

32

1.4 Methodevalidatie    i. Retentietijd  

 Er  wordt  nagegaan  of  de  retentietijden  in  echte  monsters  voldoen  aan  de  opgelegde  criteria  van  de  Europese  commissie:  van  10  patiëntenmonsters  wordt  de  relatieve  retentietijden  vergeleken  met  de  relatieve  retentietijden  van  de  standaard/controle.  De  relatieve  retentietijd  van  het  monster  mag  voor  LC  maximaal  2,5%  afwijken  van  de  relatieve  retentietijd  van  de  calibratieoplossing.  De  relatieve  retentietijd  is  de  verhouding  van  de  retentietijd  van  de  standaard  op  de  retentietijd  van  het  monster.    Tijdens  het  meten  van  de  retentietijd  zijn  we  ook  nagegaan  of  bij  alle  resultaten  succinaat  gescheiden  was  van  methylmalonzuur.      

ii. Carry  over    Twee  patiëntenmonster  of  gespiked  plasma  met  hoge  en  lage  concentratie  worden  geanalyseerd    in  een  bepaalde  volgorde  om  overdracht  tussen  de  verschillende  injecties  uit  te  sluiten.  Er  wordt  hierbij  nagegaan  of  een  signaal  van  een  analiet  verschijnt  in  een  monster  met  lage  concentratie  na  een  aantal  monsters  te  analyseren  met  hogere  concentratie.    

 Tabel 10: Volgorde carry over Volgorde   Laag/Hoog  1   L1  2   L2  3   L3  4   H1  5   H2  6   L4  7   H3  8   H4  9   L5  10   L6  11   L7  12   L8  13   H5  14   H6  15   L9  16   H7  17   H8  18   L10  19   H9  20   H10  21   L11    

33

iii. Ion  ratio’s      Ion  ratio’s  zijn  de  verhouding  van  de  piekoppervlakten  voor  beide  transities  (moederion  !  dochterion).    Deze  verhouding  moet  voor  een  juiste  identificatie  van  methylmalonzuur  telkens  dezelfde  zijn,  binnen  opgelegde  grenzen.  Het  betrouwbaarheidsinterval  voor  de  ion  ratio’s  wordt  bepaald  door  10  analyses  van  een  standaard  uit  te  voeren.      

iv. Analytische  gevoeligheid    De  detectielimiet  en  kwantificeringslimiet  worden  in  het  labo  traditioneel  bepaald  door  van  eenzelfde  blanco  monster  herhaalde  metingen  uit  te  voeren.  De  detectielimiet  is  de  laagste  concentratie  van  het  analiet  dat  kan  gemeten  worden  door  het  toestel.  De  kwantificeringslimiet  is  de  laagste  concentratie  die  niet  alleen  kan  worden  gedetecteerd,  maar  ook  kwantitatief  juist  is.    Na  enkele  metingen  uit  te  voeren  van  blanco  humaan  plasma,  hebben  we  vastgesteld  dat  elk  menselijk  monster  methylmalonzuur  bevat,  want  dit  is  een  component  van  het  menselijk  metabolisme.  Deze  validatietest  wordt  dan  uitgevoerd  d.m.v.  kalibratiecurves  en  resultaten  van  lineariteit.      

v. Recovery    Om  de  recovery  te  bepalen  worden  zes  monsters  telkens  blanco  en  gespiked    met  een  gekende  concentratie  MMA  gemeten.  De  recovery  wordt  berekend  via  de  formule:    Recovery  (%)  =   (!!!!!)

!!  𝑥  100,  waarbij  C1  de  concentratie  is  van  het  verrijkte  monster,  C2  

de  concentratie  van  het  monster  dat  niet  verrijkt  is  en  C3  de  concentratie  van  de  verrijking.      

vi. Lineariteit    Het  lineair  gebied  wordt  bepaald  door  een  verdunningsreeks  van  kalibratoren  in  duplo  te  analyseren  met  concentraties  van  25  nmol/L  tot  1431  nmol/L.      

vii. Precisie  en  bias    Uit  de  driemaal  herhaalde  analyse  van  vier  controles  door  drie  personen,  worden  de  precisie  en  bias  berekend.  Precisie,  of  CV,  wordt  berekend  door  per  controle  de  standaarddeviatie  van  de  herhaalde  metingen  te  delen  door  het  gemiddelde  van  de  herhaalde  metingen.  De  bias  wordt  per  herhaling  berekend  door  van  de  gegeven  concentratie  van  de  controle,  de  bekomen  concentratie  per  meting  af  te  trekken  en  dit  delen  door  de  bekomen  concentratie.      

34

2. Resultaten  

2.1 Methodevalidatie    

i. Retentietijd   De  retentietijd  van  methylmalonzuur  is  gemiddeld  2,60  minuten  en  die  van  de  interne  standaard  methylmalonzuur-­‐d3  bedraagt  2,59  minuten.  Dit  kan  men  onderscheiden  van  elkaar  omdat  deze  elk  een  andere  massa  hebben.  Het  criterium  van  de  Europese  Commissie  is  dat  de  maximale  tolerantie  op  de  relatieve  retentietijd  2,5%  is  voor  LC  tussen  de  RRT  van  het  monster  en  die  van  de  standaard.  Over  twintig  controles  hebben  wij  een  maximale  afwijking  van  0,38,  met  een  maximum  van  0,39,  dit  is  te  zien  in  tabel  12  in  bijlage.  Dit  is  ongeveer  gelijk  voor  beide,  methylmalonzuur  als  de  IS.      De  scheiding  van  succinaat  (barnsteenzuur)  met  methylmalonzuur  zijn  we  nagegaan  tijdens  het  experiment  van  de  retentietijd.  Op  figuur  16  is  te  zien  dat  voor  beide  transities  succinaat  (witte  piek)  volledig  gescheiden  is  van  methylmalonzuur  (grijze  piek).      

Figuur 16: Scheiding van succinaat    ii. Carry  over  

 Volgens  de  bepaalde  volgorde  zoals  te  zien  is  in  tabel  13  in  bijlage  werd  dit  uitgevoerd  en  zijn  de  resultaten  aanvaardbaar,  want  er  is  geen  overdracht  tussen  de  levels,  van  de  lage  levels  naar  de  hoge  levels  en  omgekeerd.  In  de  low-­‐low  kolom  is  te  zien  dat  er  geen  overdracht  is  tussen  de  lage  levels,  in  de  high-­‐low  kolom  is  dan  weer  te  zien  dat  er  geen  overdracht  is  van  de  hoge  levels  naar  lage  levels.  De  error  limiet  is  de  toegestane  hoeveelheid  overdracht  en  is  drie  maal  de  standaarddeviatie  van  de  bekomen  concentraties  in  de  low-­‐low  kolom.  De  carry  over  bedraagt  4  nmol/L,  dit  is  het  verschil  van  het  gemiddelde  van  de  concentraties  uit  de  high-­‐low  kolom  en  het  gemiddelde  van  de  concentraties  uit  de  low-­‐low  kolom.    Van  carry  over  spreekt  men  wanneer  de  carry  over  waarde  groter  is  dan  de  error  limiet.        

35

iii. Ion  ratio’s    Op  figuur  17  is  het  resultaat  van  beide  transities  te  zien,  namelijk  117!73  en  117!55.  De  ruwe  date  van  de  ion  ratio’s  staat  in  tabel  14  in  bijlage.  De  gemiddelde  ion  ratio  bedraagt  0,0195  en  is  te  zien  op  figuur  20  in  bijlage  als  het  rode  coördinaat.    We  bekomen  0,016l  als  ondergrens  en  0,023  als  bovengrens  voor  het  betrouwbaarheidsinterval  berekend  a.d.h.v.  de  standaarddeviatie  en  de  coverage  factor  k  die  3  bedraagt.  Dit  duidt  op  dat  het  betrouwbaarheidsinterval  99,7%  moet  bedragen.      

Figuur 17: Piekoppervlakten beide transities  iv. Recovery  

 Voor  deze  validatietest  hebben  we  de  methylmalonzuurconcentratie  in  eigen  plasma  bepaald  d.m.v.  de  standaardadditiemethode.  Uit  de  formule,  y  =  ax  +  b,  kunnen  we  x,  de  concentratie  van  het  eigen  humaan  plasma,  berekenen,  wat  319  nmol/L  bedraagt,  zie  figuur  18.    Het  plasma  werd  gespiked  met  gekende  concentraties  van  methylmalonzuur  en  de  range  van  het  spiken  lag  van  50  tot  3000  nmol/L,  zie  tabel  15  in  bijlage.  In  deze  validatietest  wordt  nagegaan  of  het  toestel  effectief  deze  concentraties  ook  gaat  bekomen  alsook  de  opbrengst  van  de  staalvoorbereidingsprocedure.    Uit  de  resultaten  van  deze  metingen  werd  per  meting  de  recovery  (formule:  Recovery  (%)  =   (!!!!!)

!!  𝑥  100)  berekend,  het  gemiddelde  van  de  alle  bekomen  waarden  voor  de  

recovery,  100,33%  en  de  range  van  de  recovery  berekend,  76,1%  -­‐  122,57%.  De  ruwe  data  hiervan  staan  in  tabel  16  in  bijlage.  Uiteindelijk  wordt  er  bijna  altijd  de  concentratie  die  toegevoegd  is  teruggevonden,  vandaar  de  100,33%  recovery  wat  een  goed  resultaat  is.      

36

Figuur 18: Grafiek standaardadditie  

   v. Lineariteit  en  analytische  gevoeligheid  

 De  standaardreeks  werd  verkregen  uit  het  mengen  van  kalibratoren.  We  kunnen  uit  figuur  19  besluiten  dat  de  methode  lineair  is,  omdat  de  correlatiecoëfficiënt  0,99961  bedraagt.  Het  laagste  punt  dat  getest  werd  is  25  nmol/L.  Aangezien  een  concentratie  van  25  nmol/L  moeilijk  detecteerbaar  is,  wordt  de  ondergrens  van  het  meetbereik  verlegd  naar  50  nmol/L.  De  bovengrens,  verhoogde  MMA  waarden,  wordt  vastgelegd  op  400  nmol/L,  omdat  dit  ook  in  de  literatuur  terug  te  vinden  is.  (Stichting Orthokennis)    Een  blanco  monster  wordt  normaal  gemeten  om  na  te  gaan  of  er  enige  ruis,  onnodige  pieken  aanwezig  zijn  die  de  kwantificatie  en  de  identificatie  kunnen  bemoeilijken.  Voor  de  analytische  gevoeligheid  wordt  de  ijklijn  gebruikt  van  lineariteit,  omdat  ieder  persoon  wel  methylmalonzuur  bezit.  Hierdoor  kunnen  dus  geen  blanco  monsters  kunnen  gemeten  worden  en  worden  de  detectielimiet  en  kwantificeringslimiet  via  deze  validatietest    bepaald.  De  detectielimiet,  LOD,  is  de  laagste  concentratie  die  gedetecteerd  kan  worden.    Aangezien  er  vanaf  50  nmol/L  duidelijk  gedetecteerd  kan  worden,  wordt  de  LOD  hierop  vastgelegd.  Deze  waarde  hebben  we  ook  kunnen  bevestigen  door  tijdens  andere  testen  na  te  gaan  of  dit  effectief  zo  was.  De  kwantificeringslimiet,  LOQ,  is  de  laagste  concentratie  die  nog  kwantitatief  correct  is.      De  LOQ  wordt  vastgelegd  op  de  waarde  van  de  laagste  UTAK  controle,  namelijk  200  nmol/L.  Deze  kan  gemeten  worden  met  een  aanvaardbare  CV  van  9,6%.      

y  =  0,0001x  +  0,0319  R²  =  0,99992  

0  

0,05  

0,1  

0,15  

0,2  

0,25  

0,3  

0   500   1000   1500   2000   2500  

Signaal  

Conc  toegevoegd  (nmol/l)  

Standaardaddititie  

37

Figuur 19: Standaardreeks MMA verkregen uit mengen van commerciële controles  vi. Precisie  en  bias  

Zoals  men  kan  zien  in  tabel  11,  zijn  de  resultaten  hierbij  goed,  want  er  is  een  lage  CV  en  een  lage  bias  voor  de  vier  controles.  Hoe  lager  de  bias,  hoe  juister  er  gemeten  is.    Enig  nadeel  is  dat  er  in  de  praktijk  verschillende  outliers  waren  met  afwijkende  resultaten  voor  de  controles.  In  tabel  18  en  19  in  bijlage  worden  de  ruwe  data  weergegeven.      Tabel 11: Resultaten precisie en bias 4 controles door 3 personen   nmol/L   CV  (%)   Gemiddelde  

bias  (%)  

L1   202   5,9   -­‐1,9  

L2   260   7,5   -­‐4,6  

L3   583   5,2   -­‐4,3  

L4   1020   5,8   -­‐5,6  

 

y = 1x - 0,111 R² = 0,99961

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Expe

rimen

tele

con

cent

ratie

(nm

ol/L

)

Theoretische concentratie (nmol/L)

38

3. Discussie    Voor  de  methodeontwikkeling  zijn  we  gestart  met  het  implementeren    van  deze  van  het  ziekenhuis  Wilhelmina  Nijmegen,  beschreven  in  tabel  4.  Met  deze  snelle  en  gebruikvriendelijke  methode  kan  een  kleine  hoeveelheid  plasma  gebruikt  worden,  namelijk  100  µL.  Zoals  eerder  vermeld  is  dit  positief  voor  de  patiënt,  omdat  er  slechts  een  klein  volume  bloedstaal  nodig  is.  We  hebben  dit  protocol  geruime  tijd  getest  en  de  methode  leek  voldoende  geschikt  om  de  validatietesten  uit  te  voeren.  Dit  gaf  uiteindelijk  toch  problemen,  zoals  bij  het  uitvoeren  van  de  lineariteit  dat  er  te  veel  outliers  waren.  Lineariteit  werd  ook  in  duplo  uitgevoerd  en  ook  deze  resultaten  stemden  niet  overeen.    Er  waren  echter  nog  enkele  problemen  zoals  dat  enkel  de  proteïneprecipitatie  met  acetonitrile  onvoldoende  is.  De  extracten  waren  nog  te  vuil,  ze  waren  troebel  en  wit  en  dit  is  niet  ideaal  voor  een  LC-­‐MS/MS.  Ook  maken  ze  gebruik  van  mobiele  fases  met  hoge  concentraties  zuur.  Dit  gaf  een  vervuiling  op  de  ionisatie  bron  van  de  LC-­‐MS/MS.  De  auteur  van  het  artikel  hebben  we  gecontacteerd  en  bevestigde  inderdaad  het  probleem.    Door  deze  verschillende  nadelen  hebben  we  besloten  om  de  staalvoorbereiding  met  SPE  uit  te  voeren.  De  werkwijze  hiervan  staat  beschreven  in  tabel  5.    Ook  hier  kan  er  nog  steeds  een  minimum  aan  volume  gebruikt  worden,  namelijk  100    µL.  Dit  is  bevestigd  door  de  methode  met  zowel  200  µL  als  met  100  µL  uit  te  voeren  en  te  vergelijken.      We  zijn  bij  de  SPE  procedure  ook  nagegaan  of  het  introduceren  van  een  extra  wasstap  met  methanol  betere  resultaten  gaf,  dan  deze  die  zonder  de  methanol  wasstap  worden  voorbereid.  Deze  laatste  monsters  gaven  echter  ook  troebele  extracten  en  uit  ervaring  met  de  eerste  methode,  hebben  we  deze  niet  geïnjecteerd,  zodat  de  bron  niet  weer  vervuild  wordt.  Er  is  dus  besloten  om  de  SPE  kolommen  toch  te  wassen  met  methanol.    Deze  methode  met  de  Rapidtrace,  is  echter  wel  ook  een  snelle  en  simpele  methode.  Aangezien  MMA  een  zwak  zuur  is,    met  een  pKa  van  3,12,    is    strong  anion  exchange  in  theorie  de  beste  keuze.  Anion  exchange  kolommen  hebben  een  positieve  lading  om  anionen  aan  te  trekken.    In  het  labo  is  een  Rapidtrace  toestel  beschikbaar  die  de  volledige  SPE  procedure  automatisch  kan  uitvoeren.  Alvorens  het  plasma  op  de  kolom  wordt  aangebracht,  wordt  er  eerst  50  µL  interne  standaard  toegevoegd.  Er  wordt  gekozen  voor  een  fosfaatbuffer  met  pH  6,5,  zodat  het  monster  verdunt  wordt  dat  zorgt  voor  een  betere  verdeling  over  de  kolom.  Ook  gaat  het  de  pH  regelen,  want  rond  pH  7  is  MMA  negatief  geladen,  zodat  het  aan  de  positieve  partikels  zal  blijven  plakken.  (Pubchem)  Met  zure  methanol  wordt  er  geëlueerd,  want  door  de  lage  pH  zal  MMA  terug  een  proton  opnemen  en  zijn  lading  verliezen.  Daardoor  komt  het  los  van  de  kolom  en  kan  het  opgevangen  worden.  De  staalvoorbereiding  gaat  meer  matrix  en  onzuiverheden  verwijderen  voor  de  injectie  en  er  wordt  met  normalere  mobiele  fases  gewerkt,  namelijk  met  lage  concentraties  zuur  welke  de  pH  van  de  mobiele  fase  gaat  verlagen.  Hierbij  gaan  de  polaire  componenten  vertraagd  worden  en  gaat  de  kolom  langer  mee.  Ook  de  piekvorm  gaat  symmetrischer  zijn.    Het  nadeel  van  de  Rapidtrace  was  dat  op  het  toestel  slechts  plaats  is  voor  tien  monsters.  Er  moeten  telkens  vier  kalibratoren  en  twee  controles  mee,  dus  was  er  maar  plaats  voor  vier  monsters.  Dit  is  niet  optimaal  als  er  een  routinetest  van  gemaakt  wordt  en  meer  monsters  moeten  bepaald  worden  dan  er  op  het  toestel  konden.    

39

 Daarom  hebben  we  de  methode  via  de  Rapidtrace  vergeleken  met  een  manuele  methode  gelijkaardig  aan  de  Rapidtrace,  die  weergegeven  is  in  tabel  6.  Deze  methode  is  snel,  ook  kunnen  we  meer  monsters  behandelen  dan  met  de  Rapidtrace.    In  tabel  7  is  te  zien  dat  deze  methode  nog  verder  geoptimaliseerd  is  door  één  minuut  te  centrifugeren  op  1000  rpm  en  bij  15°C  i.p.v.  een  halve  minuut  te  centrifugeren  op  4000  rpm  bij  4°C.  Dit  omwille  van  dat  op  de  Rapidtrace  de  monsters  op  kamertemperatuur  staan  en  niet  worden  afgedraaid.    Er  werd  ook  gebruik  gemaakt  van  een  nieuwe  kolom,  omdat  de  oude  kolom  al  heel  wat  injecties  had  gekregen  en  de  retentietijden  verschoven.  Op  deze  nieuwe  kolom  zijn  we  de  zuurconcentraties  in  de  mobiele  fases  gaan  vergelijken:  of  er  een  verschil  was  tussen  1%  FA  in  MQ  water  en  0,1%  FA  in  MQ  water.  De  resultaten  met  0,1%  FA  in  MQ  water  waren  even  goed  als  deze  met  1%  FA  in  MQ  water,  dus  zijn  we  overgeschakeld  naar  het  laagste  zuurniveau,  puur  ook  om  de  bron  minder  te  vervuilen.    Met  deze  geoptimaliseerde  manuele  SPE  methode  zijn  dan  de  validatietesten  uiteindelijke  uitgevoerd.      De  retentietijd  van  methylmalonzuur  bedroeg  gemiddeld  2,60  minuten  en  deze  van  de  interne  standaard,  methylmalonzuur-­‐d3,  bedroeg  2,59  minuten,  dit  is  te  zien  in  tabel  12  in  bijlage.  Deze  twee  zijn  van  elkaar  te  onderscheiden,  omdat  ze  elk  een  andere  massa  bezitten.    Het  criterium  voor  de  relatieve  retentietijd  van  het  monster  mag  voor  LC  een  maximale  afwijking  hebben  van  2,5  %  op  de  relatieve  retentietijd  van  de  kalibratieoplossing.    Over  20  controles  bedraagt  de  maximale  afwijking  bij  ons  0,38,  met  een  maximum  van  0,39  zoals  terug  te  vinden  is  in  tabel  12  in  bijlage.    De  methode  heeft  voldaan  aan  het  criterium.    In  figuur  16  is  de  scheiding  van  succinaat  met  methylmalonzuur  duidelijk  te  zien  is  op  het  chromatogram  dus  is  dit  voldaan.      De  carry  over  is  volgens  de  bepaalde  volgorde  zoals  te  zien  is  in  tabel  13  in  bijlage  uitgevoerd.  De  resultaten  zijn  aanvaardbaar,  want  er  is  geen  overdracht  tussen  elk  monster,  dus  ook  geen  overdracht  tussen  een  laag  en  een  hoog  level  en  omgekeerd.  Aangezien  de  carry  over  4  nmol/L  bedraagt  en  deze  lager  is  dan  de  error  limiet  welke  16,757  nmol/L  bedraagt,  kan  men  niet  spreken  van  carry  over.  Deze  validatietest  heeft  uiteraard  voldaan  aan  de  eisen.      Ion  ratio’s  zijn  de  verhouding  van  de  piekoppervlakten  voor  beide  transitites.  Voor  een  correcte  identificatie  van  methylmalonzuur  moet  deze  dus  telkens  dezelfde  zijn  en  binnen  opgelegde  grenzen  liggen.  Daarom  stellen  we  een  interval  op  waarbinnen  met  99%  zekerheid  de  verhouding  moet  liggen.  Het  resultaat  is  te  zien  op  figuur  20,  met  0,016  als  ondergrens  en  0,023  als  bovengrens  waarbinnen  het  interval  moet  liggen.    Op  figuur  16  is  het  resultaat  van  beide  transities  te  zien,  namelijk  117!73  en  117!55.  De  ruwe  date  van  de  ion  ratio’s  staat  in  tabel  14  in  bijlage.  De  gemiddelde  ion  ratio  bedraagt  0,0195  en  is  te  zien  op  figuur  19  in  bijlage  als  het  rode  coördinaat.    We  bekomen  0,016  –  0,023  als  betrouwbaarheidsinterval  berekend  a.d.h.v.  de  standaarddeviatie  en  de  coverage  factor  k  die  3  bedraagt.  Dit  duidt  op  dat  het  betrouwbaarheidsinterval  99,7%  moet  bedragen.    

40

 Voor  de  bepaling  van  de  recovery  werd  er  van  zes  monsters  telkens  een  blanco  en  een  gespiked  met  gekende  concentratie  methylmalonzuur  gemeten.    Dit  hebben  we  uitgevoerd  door  een  standaardadditiemethode  uit  te  voeren  en  zo  de  methylmalonzuurconcentratie  te  bepalen  in  eigen  plasma.  Hieruit  is  319  nmol/L  gekomen  als  concentratie  methylmalonzuur  in  eigen  plasma.    Hierna  werd  het  plasma  gespiked  met  gekende  concentraties  tussen  50  en  3000  nmol/L  van  methylmalonzuur.  Hieruit  kwam  dan  een  recovery  van  100,33%  als  gemiddelde  van  alle  metingen  en  de  range  van  de  recovery  bedroeg  76,1%  -­‐  122,57%.  Deze  resultaten  kunnen  we  ook  beschouwen  als  goed  en  is  deze  ook  gevalideerd.      De  methode  is  lineair,  aangezien  de  correlatiecoëfficiënt  0,99961  bedraagt.  25  nmol/L  is  het  laagste  punt  dat  we  gemeten  hebben  op  deze  manier,  maar  dit  is  moeilijk  detecteerbaar.  Dit  komt  door  grote  afwijkingen  en  lage  piekoppervlakten.  Hierdoor  werd  dus  de  ondergrens  verlegd  naar  50  nmol/L.  Op  klinisch  vlak  zijn  enkel  de  verhoogde  waarden  belangrijk.  In  de  literatuur  zijn  waarden  normaal  tot  350  à  400  nmol/L,  boven  400  nmol/L  wordt  er  gesproken  van  verhoogde  MMA  waarden.  De  bovengrens  werd  dus  gelegd  op  400  nmol/L,  wat  vanaf  die  waarde  dus  positief  wordt  beschouwd  voor  methylmalonzuuracidurie  of  vitamine  B12  deficiëntie.      Omwille  er  geen  blanco  monsters  van  methylmalonzuur  bestaan,  omdat  humaan  plasma  dit  sowieso  bezit,  hebben  we  de  analytische  gevoeligheid  niet  kunnen  uitvoeren  op  de  manier  om  op  eenzelfde  blanco  monster  herhaalde  metingen  uit  te  voeren.    De  detectielimiet  werd  a.d.h.v.  ijklijnen  en  de  experimenten  van  lineariteit  bepaald,  namelijk  50  nmol/L.  Vanaf  deze  waarde  kan  er  duidelijk  methylmalonzuur  gedetecteerd  worden.    De  kwantificeringslimiet  wordt  dan  weer  bepaald  via  de  laagste  UTAK  controle,  deze  van  200  nmol/L.  Deze  hebben  we  genomen,  omdat  na  verschillende  metingen  deze  een  aanvaardbare  CV,  niet  meer  dan  10%,  heeft  van  9,6%  wat  dus  lager  is  dan  10%.          Precisie  en  bias:  bij  dit  experiment  hebben  we  de  4  controles  laten  analyseren  door  3  personen.  Algemeen  gesproken  zijn  de  resultaten  hiervan  heel  goed.  In  tabel  19  worden  de  gemeten  waardes  weergegeven  door  de  verschillende  personen  waarvan  deze  altijd  in  de  buurt  van  de  theoretische  concentratie  die  het  monster  heeft.    Dit  zijn  de  uiteindelijke  resultaten,  maar  in  de  praktijk  met  gewone  metingen  zitten  er  in  de  verschillende  reeksen  verschillende  outliers  met  aberrante  resultaten  voor  de  controles.  Dit  zijn  dus  nog  geen  definitieve  resultaten,  de  methode  zal  eerst  verder  geoptimaliseerd  moeten  worden,  om  het  probleem  van  de  outliers  aan  te  pakken.  Nadien  dient  de  bepaling  van  precisie  en  bias  opnieuw  te  gebeuren.      Alle  validatietesten  zijn  dus  gevalideerd,  op  precisie  en  bias  na,  maar  men  kan  concluderen  dat  we  op  de  goede  weg  zitten  om  methylmalonzuur  te  introduceren  op  de  UPLC-­‐MS/MS  met  SPE  als  staalvoorbereiding.              

41

IV. Besluit    

Het  monstervolume  dat  we  voorop  gesteld  hebben  om  zo  klein  mogelijk  te  houden  is  gelukt.  Namelijk  100  µL  is  voldoende  om  methylmalonzuur  te  detecteren  in  plasma.  De  staalvoorbereiding  is  nog  steeds  vrij  kort,  maar  we  hebben  wel  SPE  moeten  introduceren  om  een  zuiver  monster  te  verkrijgen,  maar  dit  is  te  automatiseren  naargelang  er  meer  modules  van  de  Rapidtrace  kunnen  gebruikt  worden.    Het  is  dus  mogelijk  om  methylmalonzuur  op  het  UPLC-­‐MS/MS  toestel  van  UZ  Brussel  te  bepalen,  mits  nog  enkele  verbeteringen.  Dit  was  de  eerste  stap  om  de  bepaling  van  organische  zuren  in  plasma  mogelijk  te  maken  in  het  labo  Metabole  Stoornissen.    Er  zijn  nog  enkele  zaken  die  moeten  uitgevoerd  worden,  zoals  het  verbeteren  van  de  reproduceerbaarheid  van  kwantificatie.  Ook  voor  de  klinische  validatie  moeten  er  nog  referentiewaarden  opgesteld  worden  en  het  toetsen  van  patiënten  met  methylmalonacidurie  en  vitamine  B12  deficiëntie.  De  opgegeven  waarde  van  350  pmol/L  is  een  richtwaarde  voor  het  Wilhelmina  Ziekenhuis  te  Nijmegen.  In  de  literatuur  zijn  er  namelijk  sommige  bronnen  die  een  hogere  referentiewaarde  gebruiken  en  anderen  een  lagere.  Uiteindelijk  is  het  de  bedoeling  dat  de  referentiewaarden  voor  het  UZ  Brussel  in  de  toekomst  zelf  bepaald  worden  in  een  representatieve  populatie  (per  geslacht,  per  leeftijd,  e.d.).    Het  doel  is  wel  bereikt  door  een  UPLC-­‐MS/MS  methode  te  ontwikkelen  met  minimale  staalvoorbereiding  en  met  weinig  staalvolume.        

   

42

V. Bibiliografie  Agilent Technologies. (2013). In Sample Preparation Fundamentals for Chromatography. Agilent Technologies. Allen, L. H., Keyes, W. R., Pedersen, T. L., Shahab-Ferdows, S., & Newman, J. W. (2011). Methylmalonic acid quantification in low serum volumes by UPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B (879), 1502-1506. Arsenault, J. C. (2012). Beginner's guide to SPE solid phase extraction. In J. C. Arsenault, Beginner's guide to SPE solid phase extraction. USA: Waters Corporation. Beijers, A., van Daal, H., & van den Ouweland, J. (2011). Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort. Nederlands Tijdschrift Klinische Chemie Labgeneeskunde , 263-264. Beijers, A., van Daal, H., & van den Ouweland, J. (2011). Methylmalonzuurmeting in serum en urine met behulp van LC-tandem massaspectrometrie. Nederlands Tijdschrift Klinische Chemie Labgeneeskunde (36), 260-262. Beukema. (n.d.). Methylmalonzuuracidemie. Retrieved december 19, 2014, from Ziggo: http://members.ziggo.nl/b.beukema/mma.html Carvalho, V., & Kok, F. (2008). Determination of serum methylmalonic acid by alkylative extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry (381), 67-73. Chan, P., Fu, X., Pattengale, P., & Xu, Y.-K. (2013). Simple, Fast and Simultaneous Detection of Plasma Total Homocysteine, Methylmalonic Acid, Methionine and 2-Methylcitric Acid Using Liquid Chromatography and Mass Spectrometry (LC/MS/MS). Journal of Inherited Metabolic Disease , 69-78. Cuthbert, C., Gavrilov, D., Loken, P., Magera, M., Matern, D., Oglesbee, D., et al. (2010). Determination of Total Homocysteine, Methylmalonic Acid, and 2-Methylcitric Acid in Dried Blood Spots by Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 11 (56), 1686-1695. DAAVISION. (n.d.). Zuren = Antibiotica? Is dat zo? Retrieved juli 15, 2015, from DAAVISION: www.scwd.nl/sendfile.php?cat=Powerpoint&name=Buis%20Ebbinge De Brabanter, N. (2014). LC-MS/MS Principes en data interpretatie. Seminarie TM Groep. Jette: UZ Brussel. de Rooij, S., Huijmans, J., Hoekstra, J., Fischer, J., & Wiersinga, W. (2005). De diagnostiek van vitamine-B12-deficiëntie herzien. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde , 1-8. El-Khoury, J., Gabler, J., Spatholt, R., Wang, S., & Yuan, C. (2012). Highly sensitive and selective measurement of underivatized methylmalonic acid in serum and plasma by liquid chromatography-tandem mass spectroscopy. Analytical and Bioanalytical Chemistry (404), 133-140.

43

Gick, J. (n.d.). Organische zuren syndromen. Een gids voor patiënten, ouders en families. Retrieved juli 15, 2015, from European registry and network for Intoxication type Metabolic Diseases: http://www.e-imd.org/rc/e-imd/htm/Article/2011/e-imd-20110729-235456-354/src/htm_fullText/nl/aciduries_org_NL.pdf Griffiths, W. J., & Wang, Y. (2009). Mass spectrometry: from proteomics to metabolomics and lipidomics. Chemical Society Reviews , 38, 1882-1896. Helgeson, J. K., Magera, M. J., Matern, D., & Rinaldo, P. (2000). Methylmalonic Acid Measured in Plasma and Urine by Stable-Isotope Dilution and Electrospray Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 1804-1810. Hoffmann, G. F., & Zschocke, J. (2014). In G. F. Hoffmann, & J. Zschocke, Vademecum Metabolicum Diagnosis and Treatment of Inborn Errors of Metabolism 3rd Revised Edition 2011 (p. 174). Milupa Metabolics and Schattauer. Lanckmans, K. (2014). Procedure: Rapidtrace. UZ Brussel, Toxicologie - Metabole Stoornissen. Jette: UZ Brussel. Lanckmans, K. (2009). Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS. UZ Brussel, Toxicologie - Metabole Stoornissen. Jette: UZ Brussel. Lawrence, B. M. (2006). Natural and Synthetic Menthol. In B. M. Lawrence, Mint. The Genius Mentha (p. 576). Londen: CRC Press. Magera, M., Helgeson, J., Matern, D., & Rinaldo, P. (2000). Methylmalonic Acid Measured in Plasma and Urine by Stable-Isotope Dilution and Electrospray Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 11 (46), 1804-1810. Orphanet. (n.d.). Zeldzame ziekten. Retrieved december 12, 2014, from Orphanet: http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=NL&Expert=289916 Pedersen, T., Keyes, W., Shabab-Ferdows, S., Allen, L., & Newman, J. (2011). Methylmalonic acid quantification in low serum volumes by UPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B (879), 1502-1506. Pubchem. (n.d.). Methylmalonic Acid. Retrieved Augustus 17, 2015, from Pubchem Open Chemistry Database: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Methylmalonic_acid#section=Experimental-Properties Rapid Trace SPE Workstation. (2012). Retrieved juli 25, 2015, from Crescent Scientific: http://www.cspl.in/products/extraction/Rapid_Trace_SPE_Workstation.aspx RECIPE. (2010, 11 08). ClinMass . Instruction Manual for the Determination of Methylmalonic Acid in Serum, Plasma and Urine by LC-MS/MS . Munchen, Duitsland: RECIPE. Schuit, F. (2010). Metabolisme. In F. Schuit, Metabolisme (p. 470). Bohn Stafleu von Loghum.

44

Sigma Aldrich. (1998). Guide to Solid Phase Extraction. Retrieved augustus 17, 2015, from Supelco: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf Stichting Orthokennis. (n.d.). Vitamine B12 werking en toepassing. Retrieved december 19, 2014, from Stichting Orthokennis: http://www.orthokennis.nl/artikelen/vitamine-b12-werking-en-toepassing The Monitor. (2008, juni). New Feature: Interview with an organic acid. The Monitor . Wouters, M. Neonatale screening. (p. 36). Brussel: VCBMA. www.chromacademy.com. (n.d.). The Theory of HPLC Band Broadening. Retrieved augustus 25, 2015, from Chromacademy: http://www.chromacademy.com/lms/sco3/Theory_Of_HPLC_Band_Broadening.pdf    

45

VI. Bijlagen  

1. Methodevalidatie  1.1 Retentietijd  

 Tabel 12: Resultaten retentietijd en relatieve retentietijd Eenheid   RT  MMA  (min)   RT  MMA-­‐d3  (min)   %  Afwijking  

Controle  Clinchek  L1   2.6   2.59    

Controle  Clinchek  L2   2.6   2.59    

Monster  1  3000A   2.6   2.59   0.00  

Monster  2  3000B   2.6   2.59   0.00  

Monster  3  2000A   2.6   2.59   0.00  

Monster  4  2000B   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  5  1000A   2.6   2.59   0.00  

Monster  6  1000B   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  7  500A   2.59   2.58   0.00  

Monster  8  500B   2.59   2.58   0.00  

Monster  9  250A   2.59   2.58   0.00  

Monster  10  250B   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  11  100A   2.6   2.59   0.00  

Monster  12  100B   2.59   2.59   0.38  

Monster  13  75A   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  14  75B   2.59   2.59   0.38  

Monster  15  50A   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  16  50B   2.6   2.58   -­‐0.39  

Monster  17  25A   2.6   2.59   0.00  

Monster  18  25B   2.6   2.58   -­‐0.39  

     

46

1.2 Carry  over    Tabel 13: Resultaten carry over MMA  Level     Concentratie  (nmol/L)   Low  -­‐  Low   High  -­‐  Low  L1   415      L2   429   429    L3   417   417    H1   4688      H2   4624      L4   425     425  H3   4558      H4   4560      L5   436     436  L6   415   415    L7   417   417    L8   421   421    H5   4563      H6   4580      L9   409     409  H7   4584      H8   4641      L10   430     430  H9   4626      H10   4664      L11   419     419     SD 5.586   10.378  Mean 419.8   423.8   Error limit 16.757   3SD Carry over 4   Aanvaard? OK          

47

1.3 Ion  ratio’s      Tabel 14: Resultaten ion ratio’s   Conc  spike  MMA  (nmol/L)   RI  Standaard 1   415   0.02  Standaard 2   429   0.018  Standaard 3   417   0.019  Standaard 4   425   0.021  Standaard 5   436   0.021  Standaard 6   415   0.019  Standaard 7   417   0.018  Standaard 8   421   0.019  Standaard 9   409   0.02  Standaard 10   430   0.02     Gemiddelde ion ratio 0.0195  Standaarddeviatie ion ratio 0.00  

Coverage factor k 3   voor 99,7% confidence level. Betrouwbaarheidsinterval [X -k.SD ; X + k.SD] k * SD 0.00   Ondergrens 0.016   X - k x SD Bovengrens 0.023   X + k x SD

 

   

   

Figuur 20: Resultaten ion ratio’s

48

1.4 Recovery    Tabel 15: Gegevens monsters Gegevens   Identificatie   Spike  (nmol/L)  Monster  1   Monster  2   1000  Monster  2   Monster  2   100  Monster  3   Monster  plasma  Silke   2000  Monster  4   Monster  plasma  Silke   500  Monster  5   Monster  plasma  Silke   3000  Monster  6   Monster  plasma  Silke   50     Tabel 16: Resultaten LC-­‐MS/MS   Conc  (blanco)   Conc  (spike)   Recovery  (%)  Monster 1   37.5   1039.2   100.17  Monster 2   37.5   113.6   76.1  Monster 3   101.2   2208.7   105.375  Monster 4   101.2   511   81.96  Monster 5   101.2   3778.3   122.57  Monster 6   101.2   159.1   115.8    Gemiddelde Recovery 100.33   % Range recovery 76.1   - 122.57   %      

49

1.5 Lineariteit  en  analytische  gevoeligheid   Tabel 17: Resultaten lineariteit Concentratie  (nmol/L)    

Meting  1  (nmol/L)    Meting  2  (nmol/L)  

 Gemiddelde  (nmol/L)  

25   42,00   45,00   43,50  49,725   51,00   46,00   48,50  74,05   67,00   72,00   69,50  122,8   112,00   129,00   120,50  171,35   165,00   158,00   161,50  220   224,00   219,00   221,50  357,5   358,00   360,00   359,00  495   489,00   485,00   487,00  632,5   630,00   637,00   633,50  770   784,00   778,00   781,00  935,25   911,00   929,00   920,00  1100,5   1079,00   1118,00   1098,50  1431   1460,00   1418,00   1439,00      Conclusies:

50 nmol/L

Ondergrens van het meetbereik: >5000 nmol/L Bovengrens van het meetbereik:

 

   

50

1.6 Precisie  en  bias   Tabel 18: Gegevens controles Gegevens   Levels   Concentratie  (nmol/LL  Clinchek  L1   L1   260  Clinchek  L2   L2   583  UTAK  L1   L3   202  UTAK  L2   L4   1020      Criterium Precisie RSD < 2/3 RSDmax   Bias <15%

Tabel 19: Resultaten in nmol/L Levels   Herhaling  1   Herhaling  2   Herhaling  3   Herhaling  4   Herhaling  5  L1   279,6   287,8   280,5   284,8   241,1  L2   655,3   617,7   629,6   604,7   553,7  L3   217,6   218   219,3   205,9   199,8  L4   1126,6   1145,7   1616,3   1124,6   1033,2        CV   Gemiddelde   Gemiddelde bias (%)

6,95   274,76   -­‐5,68  6,15   612,2   -­‐5,01  4,13   212,12   -­‐5,01  4,56   1107,525   -­‐8,58  

 Clinchek   Level  I     mean   260  nmol/L   range  208  –  312  nmol/L       Level  II     mean     583  nmol/L   range  467  –  700  nmol/L        

51