UZIMANJE I SLANJE MATERIJALA NA

MIKROBIOLOŠKU OBRADU

Doc.dr Gordana Mijović

specijalista mikrobiologije sa parazitologijom

Institut za javno zdravlje Crne Gore

Medicinski fakultet Univerziteta Crne Gore

Postavljanje etiološke dijagnoze infekcije:

-utvrđivanjem prisustva mikroorganizama u ljudskom organizmu-izolovanjem

mikroorganizama

-dokazivanjem patogenosti mikroorganizama, njihove virulentnosti,

toksičnosti i sl.

Mikrobiološka dijagnostika obuhvata:

• uzimanje materijala

• transport materijala

• obradu materijala sa izolovanjem i identifikacijom uzročnika

• tumačenje rezultata

Šta je uzorak?

Uzorak je svaki materijal koji se uzima od bolesnika i analizira u

mikrobiološkoj laboratoriji.

Opšta pravila uzimanja, pakovanja i slanja materijala na

mikrobiološki pregled

Uzimanje kliničkog uzorka

• uzimanje odgovarajućeg materijala

• uzimanje uzorka u pravo vrijeme

• tehnički pravilno uzimanje materijala

• ako bolesnik aktivno učestvuje u davanju uzorka treba mu strpljivo objasniti šta treba da radi, a šta ne smije da radi

• posude za uzimanje materijala treba da su sterilne i hemijski čiste

• u istu posudu nikada ne stavljati dva različita materijala istog bolesnika

• klinički uzorak uzeti prije primjene antimikrobnih lijekova

• posude sa materijalom treba propisno označiti i poslati u laboratoriju sa sprovodnim listom

Pakovanje kliničkog uzorka

• posude sa kliničkim materijalom dobro i bezbjedno zatvoriti (gumeni zapušači)

• kod dužeg transporta:- posude umotati u materijal koji apsorbuje tečnost, staviti u metalnu, pa u drvenu kutiju

• oko epruvete sa materijalom se omota sprovodni list prije nego se spakuje u metalnu kutiju

• kod slanja poštom: drvenu kutiju zaviti u čvrstu hartiju i zapečatiti; pored adrese crvenom olovkom napisati:”Zarazan materijal, ne otvaraj!”

Transport materijala• klinički uzorak što prije poslati u

mikrobiološku laboratoriju

• ako je brz transport nemoguć, zaštiti klinički uzorak kako bi se u njemu sačuvali mikroorganizmi do trenutka obrade materijala u laboratoriji (transportne podloge)

• briseve nakon uzimanja materijala natopiti sa 1-2 kapi fiziološkog rastvora (sušenje!!!)

• Oprez! Kontaminacija fizološkog rastvora!

• Transportni medijum (Stewart ili Amies)

Uzimanje i slanje materijala na bakteriološki pregled

• uzorak mora biti materijal uzet iz mjesta aktuelne infekcije

• izbjeći kontaminaciju uzorka fiziološkom mikroflorom sa susjednih tkiva, organa ili sekreta

• uzeti uzorak u pravo vrijeme i u dovoljnoj količini

• koristiti sterilnu opremu, pridržavati se aseptične tehnike rada

• kad god je moguće uzeti uzorak prije antibiotske terapije

• uzima se brisom kroz nosni spekulum i to ispod i iznad donje nosne školjke

• paziti da se ne dotaknu brisom otvori i zidovi atrijuma

Bris nosa

• <Picture>

Bris ždrijela

• uzima se pomoću brisa pritiskajući korjen jezika špatulom

• bris se uvodi u ždrijelo iznad jezika i rotirajući ga u ruci , lagano pritiskajući prebriše se prostor iza uvule i između tonzilarnih lukova

Bris nazofarinksa

• uzima se specijalnim žičanim brisom lučno savijenim

• najbolje da bris uzima ljekar specijalista ili osoba sa iskustvom

Bris iz ušnog kanala (bris uva)

• Uzima se tankim brisom koji se uvlači u ušni kanal kroz sterilan ušni lijevak

• ušna školjka se povlači nagore i unazad kod odraslih, a kod djece dole i naprijed

• kod sumnje na Otitis media- uzimati bris jedino ako postoji supuracija (perforacija bubne opne)

Materijal iz oka (bris oka)• odstraniti suvišan sekret

sterilnom gazom• preostali sekret uzeti sterilnim

brisom• kod sumnje na hlamidijalnu ili

virusnu infekciju oka, materijal se uzima skrepingom konjunktive (oftalmolog!!!)

• materijal sa rožnjače uzima ljekar oftalmolog u specijalističkoj ambulanti

• posebno uzeti materijal iz desnog i lijevog oka

Materijal iz vagine i cerviksa(vaginalni i cervikalni bris)

• uzima se sterilnim brisom kroz spekulum

• vaginalni bris se uzima iz zadnjeg forniksa vagine

• cervikalni bris uzimati iz endocervikalnog kanala nakon uklanjanja sluzi sa površine grlića materice

• sekret ili gnoj kao i menstrualna krv se mogu uzeti tupferom koji se uvlači sterilnom pincetom, pa se tupfer stavlja u sterilnu bocu sa širim otvorom

Materijal iz uretre (uretralni bris)• Pacijentu reći da ne treba da mokri najmanje

2 h prije uzimanja brisa• obrisati okolinu uretralnog otvora brisom

natopljenim fiziološkim rastvorom• za izolovanje gonokoka uzima se kap

uretralnog sekreta• za hlamidije i ostale bakteriološke preglede

sterilan bris se uvlači u uretru 2-4 cm i rotira 10-tak sekundi

Gnoj• uzima se brisom, punkcijom ili poslije incizije

• poslije punkcije gnoj stisnuti iz brizgalice u epruvetu

• ukoliko se sumnja na anaerobnu infekciju, materijal treba ostaviti u brizgalici, ukloniti iglu i transportovati u laboratoriju u roku koji zavisi od količine uzetog materijala:

< 1ml ----------------------< 10 min 1ml --------------------- < 30 min

>2 ml ----------------------< 3 h

Sputum• prvi jutarnji ispljuvak• ispiranje usta mlakom vodom (bez

dezinficijensa), nekoliko dubokih udisaja (provokacija kašlja), sačekati nadražaj na kašalj, jako se nakašljati i sadržaj ispljunuti u sterilnu posudu sa širokim otvorom

• transport unutar 2 h • kod sumnje na tuberkulozu 3 x jutarnji

ispljuvak (tri uzastopna jutra)• Dobra praksa-davanje pisanog uputstva

pacijentima

Feces

• uzima se neposredno poslije defekacije• defekacija u noćnu posudu, opranu deterdžentom i

dobro ispranu (ne mora sterilna)• u sterilnu posudu, hemijski čistu -1-2 gr fecesa

(veličina lješnika), sluzavi, gnojavi i krvavi dijelovi• transport do 2 h, u protivnom konzerviše se

puferisanim glicerolom ili čuvanje na + 4ºC • rektalni bris uzimati - samo izuzetno• u slučaju negativnog nalaza - ponoviti još 2 x

Urin

• uzima se na tri načina: mikcijom (najčešće) katetrizacijom (nije preporučljivo) suprapubičnom punkcijom -na slici (rijetko se izvodi, najpouzdaniji nalaz)

Urin (nastavak)• Uzimanje urina mikcijom:

uzima se prvi jutarnji urin, nakon pranja genitalija vodom i sapunom, bez upotrebe dezinficijensa; prvi mlaz se izmokri van posude, a srednji uzima u sterilnu posudu sa širokim otvorom i adekvatnim zatvaračem

• urin odmah odnijeti u laboratoriju kako bi bio zasijan na odgovarajuće podloge u roku od 1 h od momenta uzimanja uzorka

• Dobra praksa –davanje pisanog uputstva pacijentima

Krv• za bakteriološki pregled krv se uzima iz

kubitalne vene pod uslovima najstrože asepse (kod odojčadi i male djece iz temporalnih vena)

• prije venepunkcije kožu dezinfikovati alkoholom, pa jodom i ostaviti da se osuši

• venepunkciju obavezno obavljati koristeći sterilne rukavice

• uzima se 10-30 ml za odrasle, 1-5 ml za djecu• krv zasijati uz postelju bolesnika, a ako je to

nemoguće, dodati u epruvetu sa krvlju sterilan antikoagulans odmah po uzimanju, a prije transporta do laboratorije

• komercijalne podloge i podloge za aparate za hemokulture (na pr. BACTEC)

Krv za serološke analize• uzima se na isti način kao za hemokulturu u

količini 5-10 ml• ne dodaje se antikoagulans• ukoliko je potrebno transportovati krv, epruveta se

ostavi na sobnoj temperaturi 30 minuta da spontano koaguliše, odlije se serum koji se šalje u laboratoriju

• do 48 h serum se može čuvati na +4 C (u frižideru)• ukoliko je za transport do laboratorije potrebno

više od 48 h, serum se zamrzava na -20 C

Uzimanje i slanje materijala na virusološki pregled

• uzorci za virusološku analizu uzimaju se na isti način kao i za bakteriološku analizu poštujući sva pravila uzimanja uzoraka za mikrobiološku analizu

• transport uzoraka ima neke specifičnosti

Transport uzoraka

• što hitnije dostaviti u laboratoriju• briseve, aspirate vezikula, isječke tkiva i

stolicu - u posudama sa transportnim medijumom za viruse

• tečni uzorci (urin, likvor, nazofaringealni aspirat, bronhoalveolarni lavaž, nekoagulisana krv) ne zahtjevaju transportni medijum

OSNOVNI PRINCIPI PRAVILNOG UZIMANJA UZORAKA

1.Uzorak treba uzeti u pravo vrijeme –u akutnoj fazi bolesti, 1-3 dana od pojave prvih

simptoma. Uzorke treba uzeti prije primjene antivirusne

terapije!Za serološku analizu se uzima parni uzorak

seruma: na početku bolesti i 10-14 dana kasnije.

2.Uzorak treba uzeti sa pravog mesta –što zahtjeva dobro poznavanje patogeneze bolesti i

tropizma virusa.

3.Uzorak treba uzeti na pravi način –što podrazumjeva pravilan izbor tehnike uzimanja, koja treba da bude najbolja za postavljanje

dijagnoze i najkomfornija za pacijenta.

OSNOVNI PRINCIPI PRAVILNOG UZIMANJA UZORAKA

4. Uzorci se mogu uzeti uz :• aktivno učešće pacijenta (urin, sputum,

stolica...)• pasivno učešće pacijenta (krv, brisevi,

punktati...)Uzimanje treba obaviti pod sterilnim uslovima! Instrumenti moraju biti hemijski čisti i sterilni,

najbolje oni za jednokratnu upotrebu.

5. Potrebno je uzeti dovoljnu količinu materijala -

za sve analize koje se žele izvršiti.

6. Posude koje se koriste za uzimanje uzoraka moraju biti:

hemijski čiste, sterilne, sa adekvatnim zapušačem ili zatvaračem na

zavrtanje, najbolje one predviđene za jednokratnu upotrebu.

OSNOVNI PRINCIPI PRAVILNOG UZIMANJA UZORAKA7.Uzorak je neophodno pravilno i jasno

obilježiti što podrazumjeva da na njemu mora pisati:

• ime i prezime pacijenta i/ili identifikacioni broj• vrsta uzetog uzorka• vrijeme i datum uzimanja uzorka

Propratna lista treba da sadrži sljedeće podatke:• pol i godište pacijenta• naziv ustanove koja šalje materijal i ime ljekara

koji ga je uzeo• dijagnozu (na koju se sumnja)• virusološke analize koje se traže (precizno

naznačene)• kliničke i epidemiološke napomene: datum početka bolesti, klinički nalazi, primjenjena

terapija, podaci o izloženosti virusnim uzročnicima, ujedima životinja

ili insekata, skorija putovanja i skorije vakcinacije

TRANSPORTNI MEDIJUMI ZA VIRUSE (TMV)

Transportni medijumi za viruse (TMV) imaju za cilj da očuvaju infektivnost virusa, sprečavaju sušenje uzorka i onemogućavaju razmnožavanje bakterija i gljivica.

Sadrže:- rastvor soli (odgovarajuća jonska koncentracija)- proteine (najčešće albumin ili želatin)- pufer (održanje pH)-antibiotike i fungicide

* MEM, Hank-ov rastvor, Stjuart-ov,......

UZIMANJE UZORAKA

BRISEVI/SCRAPINGASPIRAT VEZIKULEMALI UZORCI TKIVA

TEČNI UZORCI:NEKOAGULISANA KRV,URIN, LIKVOR, BAL,NAZOFARINGEALNI ASPIRAT

ČVRSTI UZORCI:STOLICA I TKIVA

STAVLJAJU SE U EPRUVETE SA1-2 mL TMV

STAVLJAJU SE U STERILNE POSUDE SAZATVARAČEM. TMV NIJE POTREBAN

STAVLJAJU SE U STERILNE POSUDE.DODAJE SE 5-10 mL TMV

TRANSPORT DO LABORATORIJE NA 2-80C

BRISEVI

Brisevi u virusološkoj dijagnostici treba da budu:• Od rejona ili dakrona

Ne treba da budu od kalcijum alginata ili prirodne vate (pamuka) jer oni smanjuju infektivnost virusa.

Drške briseva treba da budu:• Od metala ili plastike

Ne treba da budu od drveta jer su smole iz drveta štetne za kulturu ćelija

KrvUzima se venepunkcijom ili kroz venski kateter (8-10 ml).virusološka dijagnostika - puna krv (Na-citrat, EDTA ili heparin),

“buffy coat” ili plazma - za PCR ne sme da bude sa heparinom!

serološka dijagnostika - serum

Kostna sržpunkcija - oko 2 ml (Na-citrat, EDTA ili heparin)

UZIMANJE UZORAKA ZA VIRUSOLOŠKA ISPITIVANJA

SalivaUzima se pomoću 1 ili 2 brisa sa sluznice prednjeg dela poda usne duplje i predela oko otvora Stenonovog kanala.Bris se stavlja u epruvetu sa TMV i dobro zatvori.

Urin10-20 ml, srednji mlaz (sterilna posuda)

Likvorlumbalna punkcija (2-5 ml likvora)

Perikardna tečnostpunkcija perikarda (najmanje 2 ml)

TEČNI UZORCI

Nazofaringealni bris:Bris se uvlači kroz nozdrvu do nazofarinksa.Uzima se materijal iz obje nozdrve.Bris se stavlja u epruvetu sa TMV i epruveta se dobro zatvori.

Nazofaringelni ispirak:Pomoću posebne pumpice ili šprica u nozdrvu se uliva 3-5 mL fiziološkog rastvora dok je druga nozdrva zatvorena. Izvlači se fiziološki rastvor zajedno sa nosnim sekretom. Izvučeni sadržaj se zatim istisne u sterilnu posudu i dodaje se TMV.

UZORCI IZ GORNJEG DIJELA RESPIRATORNOG TRAKTA

Nazofaringealni aspirat:Kateter se plasira kroz nozdrvu u nazofarings, a zatim se primjeni vakuum pumpa ili špric. Kateter i posuda za prikupljanje aspirata se isperu pomoću 5-8 mL TMV i dobijena mješavina se prebaci u sterilnu posudu koja se dobro zatvara.

Bris grla:Nije optimalni izvor za izolaciju respiratornih virusa.

UZORCI IZ GORNJEG DELA RESPIRATORNOG TRAKTA

Bronhijalni ispirak i bronhoalveolarni lavat (BAL):Neophodno je plasiranje bronhoskopa.Uzima se 8-10 mL u sterilnu posudu. TMV nije neophodan.BAL je manje toksičan za ćelije u kulturi.

Sputum:Ne smatra se pogodnim uzorkom za virusološku dijagnozu.

UZORCI IZ DONJEG DIJELA RESPIRATORNOG TRAKTA

UZORCI IZ GASTROINTESTINALNOG TRAKTA

FecesUzima se 2-4 g stolice (sterilna posuda).Ako se ne može odmah transportovati do laboratorije, neophodno je dodati TMV (8-10 ml) da bi se spriječilo sušenje.

Rektalni brisBris se uvlači 4-6 cm u rektum i stavlja u epruvetu sa TMV i dobro zatvori.

Endocervikalni brisOdstrani se egzocervikalna sluz. Žičani bris se uvlači najmanje 1 cm u cervikalni kanal i rotira.Zatim se stavlja u epruvetu sa TMV.

Uretralni brisPacijent ne smije da mokri najmanje 1 sat prije uzimanja brisa!Žičani bris se uvlači 2-4 cm u uretru i rotira.Zatim se stavlja u epruvetu sa TMV.

SpermaUzorak sperme se sakuplja u sterilnu posudu.

UZORCI IZ GENITOURINARNOG TRAKTA

Bris lezijeBris se natopi fiziološkim rastvorom i rotira preko lezije.Stavlja se u epruvetu sa TMV.

Bris vezikuleVezikula se prebriše sterilnim fiziološkim rastvorom i probuši sterilnim instrumentom. Jednim brisom se pokupi tečnost iz vezikule, a drugim sadržaj dna vezikule.Brisevi se stavljaju u epruvete sa TMV.

Aspirat vezikuleVezikula se probuši sterilnom iglom i njen sadržaj aspirira špricem. Špric se ispere sa TMV.

UZORCI SA LEZIJA NA KOŽI

Bris konjuktiveBris se natopi sterilnim fiziološkim rastvorom, rotira po konjunktivi i stavi u epruvetu sa TMV.

Bris rožnjače/scrapingUzima ga isključivo oftalmolog!Stavlja se u epruvetu sa TMV.

UZORCI SA OKA

Transport uzoraka

• obezbjediti zaštitu od lomljenja, svjetlosti i adekvatnu temperaturu: do 48 h na +4 C (ručni frižider ili termos boca u kojoj su komadići leda) preko 48 h zamrznuti na -20 C, transportovati na suvom ledu

Uzimanje i slanje materijala na Uzimanje i slanje materijala na parazitološki i mikološki pregledparazitološki i mikološki pregled

• Zavisno od vrsti parazita za pregled se uzimaju :• feces (stolica)• perianalni bris (celofan bris)• krv i koštana srž• urin• vaginalni i uretralni sekret ili eksprimat prostate• sputum• aspirati, bioptati i punktati• likvor• duodenalni sok i žuč• strugotine kože, noktiju i dlake

Uzimanje stoliceUzimanje stolice• uzima se kašičicom ili špatulom (uzorak veličine

manjeg oraha), koja nije kontaminirana urinom ili vodom i smješta u odgovarajuću posudu sa zatvaračem

• cjelodnevna stolica za dokazivanje Strongyloides sp.

• vegetativni oblici crijevnih protozoa - stolica dobijena provokacijom (tečnu)

• u nekim slučajevima potrebno je ponavljati uzimanje najmanje tri puta sa intervalima 1 - 3 dana

Transport stoliceTransport stolice• materijal dostaviti u laboratoriju što je prije

moguće• ako se traže vegetativni oblici protozoa

najkasnije za 30 min. na 37C • transport duži od 2 -3 sata - materijal čuvati

na temperaturi frižidera• transport duži od 24 h - materijal

konzervirati, obično dodavanjem na 1 dio stolice 3 dijela konzervansa (5% formalin, PVA, SAF, MIF…)

Perianalni brisPerianalni bris

• ujutro, prije defekacije, bez pranja analne regije• pritiskanjem 7-8 cm dugog komada ljepljive

celofanske trake, presavijene preko kažiprsta ili epruvete, na analne nabore, a potom zalijepiti na predmetno staklo i propisno obilježi

• ako je potreban transport, najbolje je upakovati u plastičnu, drvenu ili metalnu kutijicu, uz valjanu dokumentaciju

KrvKrv

• Krv uzimati što prije i što češće kod sumnje na parazitska i gljivična oboljenja.

• iz jagodice prsta i resice uha • dezinfekcija 70% alkoholom• punkcija sterilnom lancetom ili iglom• prvu kap obrisati, a sljedeća na predmetno staklo (razmaz

ili gusta kap)• kod pregleda na malariju krv uzimati nezavisno od

napada

Strugotine kože, noktiju i dlakeStrugotine kože, noktiju i dlake

• ne tretirati antimikoticima promjene 7 dana prije uzimanja materijala

• materijal sa rubova promjene - struganje kiretom• Dlake - promijenjene, depigmentirane, bez sjaja ili

polomljene - iščupati pincetom• spakovati u plastičnu vrećicu ili kutijicu, pogodnu za

transport