Embed Size (px)
Citation preview
HƯỚNG DẪN QUỐC GIA VỀ XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM HIV
Dự thảo 12/2009
1
MỤC LỤC
Ban sọan thảo
1. LỜI GIỚI THIỆU :2. MỤC TIÊU3. NGUYÊN TẮC CHUNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM
3.1 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM GIÁN TIẾP
3.1.1. Kỹ thuật miễn dịch gắn men ( Enzyme-Linked ImunoSorbent assay: ELISA)
3.1.2. Kỹ thuật đơn giản/ xét nghiệm nhanh
3.1.3 Kỹ thuật xác định Wester-Blot
3.2 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP
3.2.1. Xét nghiệm phát hiện kháng nguyên virút
3.2.2. Xét nghiệm phát hiện các axit nucleotit DNA/RNA HIV
3.3. CÁC YÊU CẦU TIÊU CHUẨN CỦA SINH PHẨM DÙNG TRONG CHẨN ĐÓAN HIV
4. XÉT NGHIỆM TẠI VIỆT NAM
4.1 TIÊU CHÍ XÉT NGHIỆM HIV
4.2 CHIẾN LƯỢC XÉT NGHIỆM TẠI VIỆT NAM
5 . LỰA CHỌN SINH PHẨM, QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM, TRẢ KẾT QUẢ
5.1 CẤP PHÉP VÀ THEO DÕI SINH PHẨM XÉT NGHIỆM. LỰA CHỌN SINH PHẨM TRONG PHƯƠNG CÁCH XÉT NGHIỆM
5.2 TƯ VẤN KHÁCH HÀNG TRƯỚC XÉT NGHIỆM
5.3 THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM
5.4 TƯ VẤN KHÁCH HÀNG SAU XÉT NGHIỆM
6. HỆ THỐNG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM HIV
6.1. GIỚI THIỆN CHUNG
6.2 BẢO ĐẢM CHẤT LƯỢNG TRONG QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM
6.3 BẢO ĐẢM CHẤT LƯỢNG TRONG THEO DÕI ĐÁNH GIÁ PHÒNG XÉT NGHIỆM
7. YÊU CẦU AN TÒAN SINH HỌC2
8. HỆ THỐNG TỔ CHỨC TRONG CÁC HỌAT ĐỘNG XÉT NGHIỆM
8.1 PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM CHIẾU
8.2 PHÒNG XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH
8.3 PHÒNG XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC
8.4 TIÊU CHUẨN CÔNG NHẬN VÀ CẤP CHỨNG NHẬN CHO PHÒNG XÉT NGHIỆM
8.5 TIÊU CHUẨN CÁN BỘ LÀM CÔNG TÁC XÉT NGHIỆM HIV
PHỤ LỤC 1 : QUÁ TRÌNH LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN .
TÁC GIẢ:
BẢN HƯỚNG DẪN ĐƯỢC NHÓM KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CỤC PHÒNG CHỐNG HIV/AIDS VIỆT NAM SỌAN THẢO
THÀNH VIỆN NHÓM KỸ THUẬT :
3
I. LỜI MỞ ĐẦU
Xét nghiệm nhiễm HIV có vai trò đặc biệt quan trọng, là khâu khởi điểm để phát hiện người nhiễm và giúp họ tiếp cận với các dịch vụ y tế, tư vấn, chăm sóc và điều trị HIV/AIDS đồng thời góp phần giảm nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng. Tuy nhiên, hiện tại tiếp cận dịch vụ xét nghiệm HIV vẫn còn hạn chế. Tại các nước có thu nhập thấp và trung bình chỉ 10% tổng số người cần tư vấn xét nghiệm tự nguyện, người có thể đã bị phơi nhiễm tiếp cận được dịch vụ này. Vấn đề kỳ thị và phân biệt đối xử vẫn tiếp tục ngăn cản người dân đến với xét nghiệm HIV. Nhiều người nhiễm HIV không biết được tình trạng nhiễm của mình do đó không tiếp xúc được các dịch vụ chăm sóc, tư vấn, dự phòng, tiếp tục làm lây truyền HIV cho người khác. Đa số người nhiễm HIV được phát hiện khá muộn, do đó chậm tiếp cận với các dịch vụ chăm sóc, điều trị và làm giảm hiệu quả điều trị ARV. Tỷ lệ phụ nữ mang thai được xét nghiệm HIV còn thấp, số lượng thai phụ tham gia chương trình dự phòng lây truyền từ mẹ sang con còn hạn chế ảnh hưởng đến tỷ lệ lây truyền từ mẹ sang con. Xét nghiệm chẩn đoán sớm nhiễm HIV cho trẻ em dưới 18 tháng để có thể điều trị sớm là một trong những vấn đề cần được triển khai. Độ bao phủ thấp của các xét nghiệm HIV làm ảnh hưởng đến dự phòng lây nhiễm , tiếp cận dịch vụ chăm sóc y tế cũng như ành hưởng hiệu quả của điều trị.
Ngòai ra, xét nghiệm HIV là yêu cầu bắt buộc trong an tòan truyền máu, các sản phảm của máu, ghép nội tạng . Xét nghiệm giám sát nhiễm HIV là rất cần thiết để theo dõi đánh giá xu hướng phát triển và góp phần định hướng các chiến lược phòng chống đại dịch HIV/AIDS của mỗi quốc gia và tòan cầu.
2. MỤC TIÊU :
Hướng dẫn này được sọan thảo nhằm hỗ trợ các phòng xét nghiệm HIV, bảo đảm chất lượng, góp phần mở rộng và hòan thiện các dịch vụ xét nghiệm nhiễm HIV.
3. NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HIV
Có nhiều kỹ thuật xét nghiệm nhiễm HIV. Việc lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm phụ thuộc vào mục đích, đối tượng, thời điểm phơi nhiễm và tỷ lệ nhiễm HIV trong quần thể.
4
Dựa trên sự biến động của các thông số sinh học trong quá trình nhiễm bệnh, các kỹ thuật xét nghiệm có thể phát hiện kháng thể kháng HIV, kháng nguyên virút, các chất liệu di truyền HIV-RNA hoặc HIV-DNA tiền virus (provirus)
Sơ đồ 1: Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị
Về nguyên tắc các xét nghiệm phát hiện nhiễm HIVđược chia thành hai phương pháp chính:
Phương pháp gián tiếp: phát hiện sự hiện diện của kháng thể kháng HIV trong máu hoặc các dịch tiết để xác định tình trạng nhiễm HIV
Phương pháp trực tiếp: Tìm trực tiếp thành phần tác nhân gây bệnh:
Phát hiện các axit nucleotit của virút:
- HIV-DNA provirut (tế bào nhiễm)
- HIV-RNA (virút tự do trong huyết tương)
Phát hiện kháng nguyên virút trong máu (p24).
3.1 PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP
5
Là phương pháp phát hiện kháng thể kháng HIV để xác định tình trạng nhiễm HIV.
Tìm kháng thể kháng HIV để là phương pháp thông thường được sử dụng trong an toàn truyền máu, giám sát dịch tễ và chẩn đoán nhiễm virut HIV ở người lớn và trẻ em trên 18 tháng tuổi.
Kháng thể kháng HIV có thể được phát hiện trong máu bệnh nhân từ 1 -3 tháng sau khi nhiễm virút.
3.1.1 CÁC KỸ THUẬT ELISA (Enzyme- Linked Immuno-Sorbent Assay)
ELISA gián tiếp Kháng thể kháng HIV có trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên
virút HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (các giếng phản ứng trên phiến nhựa).
Phức hợp kháng nguyên -kháng thể này được nhận biết đặc hiệu bởi một cộng hợp là một kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử.
ELISA cạnh tranhNguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng thể kháng HIV có trong
mẫu thử với cộng hợp là kháng thể kháng HIV đã gắn với enzyme để được gắn lên các kháng nguyên đã cố định trên giếng. Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể trong mẫu thử.
6
ELISA Sandwich Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định
trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virút gắn enzyme. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử.
Kỹ thuật ELISA phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể
Một số sinh phẩm dùng kỹ thuật ELISA phát hiện đồng thời kháng nguyên virút (P24) và kháng thể kháng HIV cho phép phát hiện sớm nhiễm HIV trước giai đoạn chuyển đổi huyết thanh. Kháng thể kháng P24 và các kháng nguyên virút được gắn trên giếng sẽ gắn đặc hiệu với kháng nguyên P24 hoặc các kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử và sẽ được phát hiện bằng phản ứng hiện màu sau khi cho cộng hợp gắn men và cơ chất.
Các sinh phẩm phát hiện đồng thời kháng nguyên P24 và kháng thể kháng HIV thường được dùng trong xét nghiệm an tòan truyền máu.
7
Các thế hệ sinh phẩm:
Sinh phẩm thế hệ thứ nhất sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với HIV. Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế.
Sinh phẩm thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp hoặc protein tổng hợp. Sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.
Sinh phẩm thế hệ ba xử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp và các proteine tổng hợp nhưng kháng thể được phát hiện theo nguyên tắc ELISA sandwich. Độ nhạy và độ đặc hiệu được cải thiện rõ rệt.
Sinh phẩm thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu thử. Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyền máu.
Các sinh phẩm ELISA ngày càng được hoàn thiện để có thể phát hiện sớm và chính xác kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết thanh. Các sinh phẩm dùng các kháng nguyên có các epitop tạo ra các kháng thể sớm và có các loại kháng nguyên cho phép phát hiện kháng thể kháng virút HIV 1 & 2, các thứ type virút và các virút HIV nhóm O.
Các ưu điểm của kỹ thuật ELISA:
- Cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu. Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm.
- Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan của người làm xét nghiệm.- Có thể lưu các bảng kết quả và các thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra
đánh giá chất lượng xét nghiệm.- Giá thành xét nghiệm tương đối rẻ.
Các hạn chế của kỹ thuật ELISA :
- Cần có sự đầu tư cho trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡng máy móc.- Các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-80C)- Thời gian thực hiện xét nghiệm 2-3 giờ
8
- Không thích hợp cho những nơi số lượng mẫu ít do phải làm nhiều chứng.
3.1.2 Các kỹ thuật xét nghiệm đơn giản / xét nghiệm nhanh
Các thử nghiệm nhanh thường xử dụng trong xét nghiệm phát hiện nhiễm HIV ở Việt Nam gồm:
- Các thử nghiệm ngưng kết hạt vi lượng (agglutination)
- Các thử nghiệm miễn dịch chấm-thấm (immunodot)
- Các thử nghiệm miễn dịch lọc (Immunofiltration)
- Các thử nghiệm miễn dịch sắc ký (Immunochromatography)
Đặc điểm chung của các thử nghiện nhanh là tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi máy móc chuyên biệt. Một số loại thử nghiệm nhanh có thể dùng huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần. Các thử nghiệm nhanh cho kết quả trong một thời gian tương đối ngắn và đọc được bằng mắt thường. Tuy nhiên, một số xét nghiệm nhanh có độ nhạy kém hơn so với kỹ thuật ELISA trên các mẫu máu trong giai đoạn chuyển đổi huyết thanh.
Các sinh phẩm chẩn đoán nhanh thường được dùng ở những phòng thí nghiệm tuyến dưới với số lượng mẫu ít, chưa được trang bị các dàn máy ELISA, trong các trường hợp cần chẩn đoán khẩn cấp cần trả kết quả ngay và phải được khẳng định lại với các kỹ thuật khác.
9
Các thử nghiệm ngưng kết hạt vi lượng (agglutination)- Những hạt hữu hình (gelatin , latex, hồng cầu) được gắn với các thành phần kháng
nguyên của virút HIV ½ sẽ cho phản ứng ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với HIV trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân nhiễm HIV.
- Trong phản ứng ngưng kết, mẫu thử được tiến hành đồng thời với hạt hữu hình không gắn kháng nguyên (giếng chứng âm) và các hạt có gắn kháng nguyên virút HIV 1/HIV2 (giếng phản ứng). Kết quả chỉ được biện luận khi giếng chứng âm không có hiện tượng ngưng kết. Trong trường hợp chứng âm cũng có sự ngưng kết cần xử lý mẫu để lọai trừ yếu tố không đặc hiệu gây phản ứng giả.
- Phản ứng âm tính (không có kháng thể kháng HIV) khi không có hiện tương ngưng kết
- Phản ứng dương tính (có kháng thể kháng HIV) khi có sự ngưng kết tạo thành một mạng liên kết
Các thử nghiệm miễn dịch chấm-thấm (immunodot)- Là kỹ thuật dựa trên nguyên tắc ELISA trên màng lọc.- Màng phản ứng chứa những hạt vi lượng bao phủ từng loại kháng nguyên HIV-1 và
HIV-2 khác nhau, đồng thời có một ô chứng để kiểm tra phản ứng.- Kháng thể kháng HIV nếu có có trong huyết thanh bệnh nhân sẽ gắn với kháng
nguyên trên màng lọc. Sau đó, phức hợp kháng nguyên - kháng thể này được gắn với cộng hợp có gắn men rồi được phát hiện bằng phản ứng hiện màu với cơ chất
- Các thử nghiệm miễn dịch sắc ký (Immunochromatography)- Trên một băng giấy nitrocellulose đã gắn sẵn ở những vị trí cố định phía trên vùng nhỏ mẫu
lần lượt cộng hợp colloid gắn kháng nguyên virút, vùng phản ứng có ga91n kháng nguyên peptit tái tổ hợp và trên cùng là vùng chứng đã cố định kháng thể đơn dòng kháng HIV.
- Mẫu xét nghiệm sẽ được nhỏ lên vùng nhỏ mẫu ở vị trí phía dưới băng giấy. Huyết thanh/ huyết tương sẽ thấm qua vùng có chứa cộng hợp là kháng nguyên virút đã gắn với một chất colloid và tiếp tục dịch chuyển qua vùng phản ứng đã cố định kháng nguyên là các peptit tái tổ hợp virút. Nếu mẫu thử có kháng thể đặc hiệuvới HIV sẽ cho phản ứng dương tính là một vạch màu ở vị trí này. Cộng hợp kháng nguyên virút gắn colloid tiếp tục bị đẩy lên vùng chứng phía trên là vị trí đã cố định sẵn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với HIV và cho một vạch phản ứng màu (vạch chứng của phản ứng).
Xét nghiệm dương tính khi có hai vạch màu ở vùng phản ứng và vùng chứng
Xét nghiệm âm tính khi chỉ có vạch màu ở vùng chứng
Xét nghiệm không được biện luận nếu không có vạch màu ở vùng chứng
- Ưu điểm của các xét nghiệm nhanh :- Thuận lợi khi thực hiện số lượng mẫu ít
10
- Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh,có thể đọc kết quả bằng mắt thường- Không đòi hỏi các trang thiết bị.- Dễ bảo quản sinh phẩm- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở- Cán bộ xét nghiệm có thể được đào tạo nhanh- Nhược điểm - Giá thành cao- Không thuận lợi khi số mẫu xét nghiệm nhiều - Không lưu được dữ liệu kết quả- Một số sinh phẩm có độ nhạy thấp hơn so với ELISA
3.1.3 XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH (WESTERN BLOT)
Xét nghiệm Western Blot có độ đặc hiệu rất cao dùng khẳng định các trường hợp dương tính với xét nghiệm sàng lọc. Xét nghiệm khẳng định được chỉ định sau khi đã có kết quả dương tính với hai thử nghiệm sàng lọc. Đây là một kỹ thuật giá thành cao, nên hiện nay, Tổ chức y tế thế giới không khuyến cáo bắt buộc thực hiện các xét nghiệm khẳng định ở những nước đang phát triển mà có thể dùng phối hợp nhiều thử nghiệm phát hiện khác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên để xác định một trường hợp huyết thanh dương tính. Xét nghiệm khẳng định Western blot được thực hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc không phù hợp hoặc khó biện luận.
- Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy, cho phép xác định kháng thể kháng các thành phần khác nhau của proteins vi rút. Có Western blot riêng cho HIV 1 và HIV 2.
- Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy. Nếu trong mẫu thử có các kháng thể kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các proteine là kháng nguyên tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng Immunoglobuline người đánh dấu bằng enzyme cho phản ứng màu với cơ chất
- Vị trí các băng màu tương ứng với thành phần protein virút gắn với kháng thể đặc hiệu.
Kết quả:
- Western blot âm tính: không có băng màu đặc hiệu.- Western blot dương tính:
Có ít nhất 2 băng màu tương ứng với thành phần gen ENV
HIV 1: gp160, gp120, gp41.
HIV 2 : gp140, gp 125, gp36.
Đồng thời còn có các băng màu tương ứng với thành phần của gen GAG, POL.
- Western blot nghi ngờ (indéterminé): có một hay nhiều băng màu không phù hợp với tiêu chuẩn của Western blot dương tính.
11
Trong trường hợp Western blot nghi ngờ cần lấy máu và làm lại phản ứng sau 2-4 tuần. Nếu bệnh nhân nhiễm HIV sẽ xuất hiện thêm các băng dương tính.
3.2 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP
Phương pháp phát hiện trực tiếp tác nhân virút HIV (hay còn gọi chung là xét nghiệm virút học) : kháng nguyên virút, các axit nucleic, hoặc phân lập virút.
Phương pháp xét nghiệm trực tiếp được dùng để phát hiện nhiễm HIV ở trẻ dưới 18 tháng tuổi. Đối với trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm virut HIV, kháng thể kháng HIV của mẹ có thể tồn lưu trong máu trẻ cho đến 18 tháng tuổi do đó xét nghiệm phát hiện kháng thể dương tính ở trẻ chưa thể kết luận trẻ có bị nhiễm HIV không mà cần thực hiện các xét nghiệm trực tiếp phát hiện virút HIV. Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HIV cho trẻ sinh từ mẹ có huyết thanh dương tính nên được tiến hành từ tuần 4-6 sau khi sinh hoặc sau đó càng sớm càng tốt với các kỹ thuật phát hiện DNA / RNA hoặc kháng nguyên P25 của virút HIV. Kỹ thuật PCR phát hiện HIV- DNA thường được chỉ định do có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng giọt máu khô lấy trên giấy thấm (DBS) dễ bảo quản và vận chuyển ở những nơi xa phòng xét nghiệm. Trẻ cần được khẳng định sớm tình trạng nhiễm HIV để được điều trị sớm không cần chờ có các dấu hiệu lâm sàng hoặc suy giảm miễn dịch.
Các phương pháp trực tiếp phát hiện tác nhân virút còn được dùng trong các trường hợp chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở người lớn trong giai đoạn cửa sổ chưa có sự chuyển đổi
12
huyết thanh hoặc khi xét nghiệm bằng phương pháp gián tiếp tìm kháng thể có kết quả không rõ ràng.
3.2.1. PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN P24 (antigénémie p24)
Kháng nguyên p24 là protein cấu thành của lõi virut, bao bọc các chất liệu di truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của virut. Kháng nguyên p24 tồn tại dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên -kháng thể.
Phát hiện kháng nguyên p24 thông thường được sử dụng trong.
Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh: đây là một kỹ thuật kém nhạy nhưng rất đặc hiệu. Hiện nay các sinh phẩm phát hiện kháng nguyên p24 đã được hoàn thiện để nâng cao độ nhạy.
Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV: Trong giai đoạn đầu mới nhiễm HIV, kháng nguyên p24 có thể được phát hiện trước khi có sự biến đổi huyết thanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa có kháng thể.
Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV: Kháng nguyên p24 có thể được phát hiện rất sớm ở giai đoạn mới nhiễm. Cùng với sự xuất hiện kháng thể, nồng độ kháng nguyên p24 tự do trong máu giảm. Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm kháng thể kháng p24, sự tái xuất hiện và gia tăng nồng độ p24 tự do là một tiên lượng chuyển sang AIDS
Theo dõi đáp ứng điều trị với thuốc kháng virút. Phát hiện có sự nhân lên của virút trong nuôi cấy tế bàoNguyên tắc : kỹ thuật ELISA sandwich
Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên p24 được gắn sẵn trong các giếng phản ứng. Kháng nguyên p24 nếu có trong mẫu thử sẽ gắn đặc hiệu với các kháng thể cố định trên giếng và các kháng thể đa dòng kháng p24 (Ac 1). Phức hợp này được phát hiện với một cộng hợp (kháng thề 2 kháng kháng thể kháng p24) có gắn enzyme cho phản ứng màu với cơ chất.
Nồng độ kháng nguyên p24 trong mẫu thử có thể được lượng giá nhờ đường chuẩn dựa trên các mẫu chuẩn có các nồng độ p24 đã xác định
Các kháng nguyên p24 có thể tồn tại trong máu dưới dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể cần phải xử lý để tách kháng nguyên và kháng thể.
13
3.2.2. PHÂN LẬP VI RÚT BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
Phương pháp nuôi cấy phân lập virut rất đặc hiệu nhưng giá thành cao và chỉ được thực hiện tại các phòng xét nghiệm có đủ trang bị kỹ thuật cần thiết. Ngày nay các kỹ thuật nuôi cấy phân lập virút chủ yếu được dùng cho mục đích nghiên cứu các đặc tính sinh học của virút, xác định tính kháng thuốc kiểu hình.
Nguyên tắc:HIV có thể được phân lập từ tế bào đơn nhân trong máu (PBMC) hay huyết tương của bệnh nhân bằng phương pháp nuôi cấy với những tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa với PHA (phytohemagglutinine) được dùng làm tế bào đích cho virút. Sự nhân lên của virut được xác định bằng kỹ thuật phát hiện kháng nguyên p24 trong môi trường nuôi cấy tế bào bằng kỹ thuật ELISA hoặc tìm enzyme sao chép ngược của virút (RT) bằng kỹ thuật dùng đồng vị phóng xạ.
Các kỹ thuật nuôi cấy virút là những kỹ thuật chuẩn thức có độ đặc hiệu cao nhưng rất tốn kém, phức tạp, đòi hỏi nhiều thời gian và chủ yếu dùng trong nghiên cứu.
3.2.3. CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN RNA/DNA CỦA HIV.
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong xét nghiệm phát hiện sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến triển bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị thuốc, phát hiện virút kháng thuốc. Trong hướng dẫn này chỉ tập trung vào các kỹ thuật định tính nhằm xác định tình trạng nhiễm HIV trong chẩn đóan sớm. Các kỹ thuật định tính chủ yếu nhằm phát hiện DNA tiền virus trong tế bào nhiễm hoặc HIV - RNA trong huyết tương để xác định tình trạng nhiễm HIV.
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng tổng hợp chuỗi) là một kỹ thuật cho phép khuếch đại một lượng rất nhỏ phân tử DNA ban đầu với các mồi đặc hiệu nhờ hoạt động của men DNA polymerase.
Nguyên tắc kỹ thuật PCR:
- Phân tử DNA đích là các DNA được tách chiết từ các tế bào nhiễm hoặc DNAc được tổng hợp từ các RNA của virút nhờ enzyme sao chép ngược RT.
- Các cặp mồi chuyên biệt bắt cặp theo nguyên tắc bổ xung với một trình tự nucleotit ở đầu 5' của mạch xuôi và ở đầu 3' trên mạch ngược của phân tử DNA và đoạn DNA nằm giữa hai mồi được khuếch đại.
- Các deoxynucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) là nguyên liệu để tổng hợp DNA
- Taq polymerase: một enzyme DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt sẽ sử dụng các deoxynucleotit để kéo dài mồi giúp hình thành một chuỗi DNA mới.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì luân nhiệt nối tiếp nhau.
Mỗi chu kỳ gồm ba bước : 14
Bước một: biến tính (denaturation): tách rời hai chuỗi của phân tử DNA đích (thường ở nhiệt độ 94 0 - 950)
Bước hai: Bắt cặp: các cặp mồi chuyên biệt cho một trình tự DNA được bắt cặp đặc hiệu với sợi DNA. Nhiệt độ được hạ thấp đến 40-70 độ cho phép các mồi bắt cặp với sợi DNA đích.
Bước ba: tổng hợp hay kéo dài. Nhiệt độ tăng lên đến 720 cho phép Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA có trình tự bổ xung với sợi khuôn. Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp lại n lần. Sau mỗi chu kỳ số lượng bản sao DNA sẽ tăng lên 2n lần so với số lượng bản mẫu ban đầu. Sự khuếch đại theo cấp số nhân tạo nên một số lượng DNA lớn cho phép phát hiện được sau khi điện di trên gel agarose và nhuộm màu với BET (EthidiumBromide)
- Giai đoạn sao chép ngược: sợi RNA của virút được tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzyme sao chép ngược (RT) và một mồi đặc hiệu hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer) có bản chất là một hexan nucleotit.
- Giai đoạn khuếch đại: là phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại theo cấp số nhân các cDNA
Dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR kinh điển nhiều kỹ thuật khác đã được triển khai cho phép định tính, bán định lượng hoặc định lượng HIV- DNA hoặc RNA
KỸ THUẬT REAL TIME PCR PHÁT HIỆN HIV- DNA :
- Dùng trong chẩn đóan sớm nhiễm HIV.- Bệnh phẩm là máu tòan phần hoặc giọt máu khô lấy trên giấy thẩm (DBS) Nguyên tắc: Real time PCR là phương pháp cho phép khuếch đại và xác định số lượng các chuỗi
DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt.
Kết quả khuếch đại DNA với các cặp mồi đặc hiệu được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra từ đầu 5’ của mẫu dò đặc hiệu khi được men Taq polymerase cắt trong qua trình kéo dài. Nồng độ DNA trong mẫu thử sẽ được xác định dựa trên chu kỳ ngưỡng Ct của mẫu và so sánh với gamme mẫu chuẩn có nồng độ đã được xác định.
Ưu điểm của các kỹ thuật là nhanh, cho kết quả sau vài giờ. Kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và có thể sữ dụng giọt máu khô trên giấy thấm DBS.
Tuy nhiên đây là những kỹ thuật đòi hỏi phải có các trang thiết bị chuyên biệt, giá thành cao. Cần thiết kế các đoạn mồi và mẫu dò đặc hiệu phù hợp với các phân type virút lưu hành ở khu vực
KỸ THUẬT PCR – LAI PHÁT HIỆN DNA.15
- Bệnh phẩm là máu tòan phần hoặc giọt máu khô lấy trên giấy thẩm (DBS)- Là kỹ thuật định tính nhằm phát hiện HIV-1 DNA trong máu tòan phần.Nguyên tắc : Sau khi tách chiết DNA, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân
tử DNA đích với các đọan mồi đặc hiệu có gắn biotinyle. Sản phẩm PCR đã được đánh dấu với biotinyle sẽ được lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã được cố định trên các giếng của phiến bảng và được phát hiện bởi các tín hiệu cho phép đọc được với colorimetric.
ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN HIV-1 DNA TRONG CHẨN ĐÓAN SỚM NHIỄM HIV
Các kỹ thuật phát hiện HIV-DNA được thực hiện để chẩn đóan sớm nhiễm HIV cho trẻ em dưới 12 tháng tuổi trong các trường hợp :
1.Trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV hoặc sinh ra từ người mẹ có xét nghiệm kháng thể kháng HIV dương tính trong thai kỳ hoặc khi sinh.
2. Trẻ có biểu hiện và triệu chứng nghi ngờ nhiễm HIV hoặc có xét nghiệm kháng thể kháng HIV dương tính.
Kỹ thuật phát hiện HIV-DNA nên thực hiện cho trẻ từ tuần tuổi 4-6 hoặc sau đó càng sớm càng tốt để xác định tình trạng nhiễm HIV và giúp cho trẻ sớm tiếp cận với các dịch vụ chăm sóc và điều trị kịp thời.
Các xét nghiệm có thể thực hiện trên máu tòan phần lấy trong ống có chất chống đông DETA hoặc trên giọt máu khô lấy trên giấy thấm DBS
Trẻ được xác định nhiễm HIV khi có kết quả PCR dương tính trên hai mẫu máu lấy cách nhau và cần được điều trị ARV sớm mà không cần chờ có các biểu hiện lâm sàng hoặc suy giảm miễn dịch.
Trong trường hợp kết quả PCR âm tính, trẻ có thể không nhiễm nếu hòan tòan không bú sữa mẹ . Trong trường hợp trẻ có bú sữa mẹ trong vòng sáu tuần trước khi xét nghiệm PCR, trẻ vẫn có nguy cơ bị nhiễm qua sữa và cần thực hiện lại xét nghiệm PCR sau khi trẻ ngưng bú sáu tuần.
3.3 TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT VỚI SINH PHẨM DÙNG TRONG CHẨN ĐÓAN NHIỄM HIV
Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng xác định độ chính xác của một sinh phẩm. Sinh phẩm có độ nhạy cao cho kết quả âm tính giả thấp. Sinh phẩm có độ nhạy cao thường dùng trong xét nghiệm sàng lọc, đặc biệt trong sàng lọc an toàn truyền máu hoặc cấy ghép mô, phủ tạng, hoặc được sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc ban đầu trong chẩn đoán người nhiễm HIV. Một sinh phẩm có độ đặc hiệu cao cho kết quả dương tính giả thấp. Sinh phẩm có độ đặc hiệu cao thường dùng trong các xét nghiệm bổ sung thứ 2 và thứ 3 trong chuẩn đoán nhiễm HIV.
16
Các sinh phẩm phát hiện kháng thể kháng HIV bao gồm các xét nghiệm ELISA , xét nghiệm nhanh/đơn giản. Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau do đó sự lựa chọn sinh phẩm trong một phương cách xét nghiệm tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm, số lượng mẫu thử, yêu cầu thới gian trả lời kết quả, tỷ lệ nhiễm , điều kiện cụ thể và năng lực thực tế của cơ sở xét nghiệm. Lựa chọn sự phối hợp giữa các sinh phẩm trong một phương cách xét nghiệm cần bảo đảm nguyên tắc : thử nghiệm sàng lọc đầu tiên cần có độ nhạy cao, các thử nghiệm tiếp theo cần có độ đặc hiệu cao.
- Độ nhạy là khả năng một thử nghiệm cho kết quả dương tính đối với một mẫu thực sự là dương tính. Sinh phẩm dùng chẩn đóan cần có độ nhạy trên 99 %.
Độ nhạy = a/(a+b)
- Độ đặc hiệu là khả năng một thử nghiệm cho kết quả âm tính với một mẫu thực sự là âm tính. Sinh phẩm dùng chẩn đóan cần có độ đặc hiệu trên 98 %.
-Độ đặc hiệu = d/(c+d)
Kết quả XN
Tình trạng có bệnh (nhiễm HIV)
Có bệnh Không bệnh
Dương tínhDương tính thật
a
Dương tính giả
B a+b
Âm tínhÂm tính giả
c
Âm tính thật
D c+d
a+c b+d
- Âm tính giả là khả năng một thử nghiệm cho kết quả âm tính đối một mẫu thực sự là dương tính.
Âm tính giả= c/(a+c)
- Dương tính giả là khả năng một thử nghiệm cho kết quả dương tính với một mẫu thực sự là âm tính.
Dương tính giả = b/(b+d)
- Giá trị dự đoán dương là tỉ lệ người có xét nghiệm dương tính thực sự mắc bệnh.
Giá trị dự đoán dương = a/(a+b)
- Giá trị dự đoán âm là tỉ lệ người có xét nghiệm âm tính thực sự không mắc bệnh.
17
Giá trị dự đoán âm = d/(c+d)
4.XÉT NGHIỆM HIV TẠI VIỆT NAM
Bộ y tế đã ban hành quyết định 1418/QĐ-BYT ngày 4/5/2000 về chiến lược xét nghiệm HIV tại Việt nam. Tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm, việc áp dụng các phương cách xét nghiệm và quy trình phối hợp các lọai sinh phẩm chủ yếu dựa trên độ nhạy, độ đặc hiệu của sinh phẩm.
Xét nghiệm HIV nhằm xác định một người hay một mẫu bệnh phẩm có nhiễm HIV hay không .
4.1 Mục đ1ch xét nghiệm HIV:
- 4.1.1.An toàn truyền máu và cấy ghép mô, nội tạng: xét nghiệm sàng lọc máu và các chế phẩm của máu, cấy ghép mô và nội tạng, cho tinh dịch và trứng....
- 4.1.2.Giám sát dịch tễ HIV/AIDS: xét nghiệm mẫu máu trong giám sát trọng điểm HIV, trong các nghiên cứu ở một quần thể nhất định để đánh giá hoặc theo dõi tình trạng nhiễm HIV theo thời gian hoặc tại một thời điểm.
- 4.1.3. Chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS: để chẩn đoán khẳng định tình trạng nhiễm HIV của một người.
4.2 . Phương cách xét nghiệm
Tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm, tỷ lệ nhiễm và đặc điểm dịch tễ trên các nhóm đối tượng, điều kiện kinh tế của từng quốc gia, các xét nghiệm nhiễm HIV được tiến hành theo những phương cách khác nhau.
Phương cách I (áp dụng cho an toàn truyền máu): Mẫu được coi là dương tính với phương cách 1 khi cho phản ứng dương tính với một thử nghiệm có độ nhạy cao. Trong an tòan truyền máu, mẫu được xét nghiệm với phương cách 1 có kết quả dương tính hoặc nghi ngờ đều phải loại bỏ
Phương cách II (áp dụng cho giám sát trọng điểm): mẫu được coi là dương tính với phương cách II khi có kết quả dương tính với cả hai lần nghiệm bằng hai loại sinh phẩm với nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên khác nhau.
Phương cách III (áp dụng cho các trường hợp xét nghiệm phát hiện nhiễm HIV): mẫu đựơc coi là dương tính khi có kết quả dương tính với cả ba lần xét nghiệm bằng ba lọai sinh phẩm với nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên khác nhau.
QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM:
Là trình tự thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm khác nhau theo yêu cầu của các phương cách xét nghiệm.
Xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV bao gồm các kỹ thuật miễn dịch men (ELISA) và các kỹ thuật xét nghiệm nhanh. Các sinh phẩm và kỹ thuật có độ đặc
18
hiệu và độ nhạy khác nhau do đó việc lựa chọn quy trình phụ thuộc vào mục đích xét nghiệm, điều kiện thực tế, số lượng mẫu thử, năng lực của phòng xét nghiệm và thời gian phải trả lời kết quả. Phối hợp các kỹ thuật khác nhau trong các phương cách xét nghiệm cần tuân theo nguyên tắc: thử nghiệm sàng lọc đầu tiên cần có độ nhạy cao; các thử nghiệm tiếp theo có độ đặc hiệu cao.
- (1) Kết quả dương tính này không được dùng cho mục đích chẩn đoán nhiễm HIV, vì vậy không được thông báo cho người được xét nghiệm.
- Các sinh phẩm xét nghiệm SP1, SP2 khác nhau về nguyên lý hoặc cách chuẩn bị kháng nguyên.
- (1) Kết quả dương tính này không được dùng cho mục đích chẩn đoán nhiễm HIV, nên không được thông báo cho người được xét nghiệm.
19
XN SP1
SP1 phản ứng (+) hoặc không xác định
SP1 không phản ứng (-)
Sơ đồ 1: Phương cách I
Âm tínhCoi là dương tính(1)
XN SP1
SP1 +
XN SP2
SP1 -
SP1+SP2+ SP1+ SP2-
XN lại SP1, SP2 (2)
SP1+ SP2+ SP1+ SP2- SP1- SP2-
KHÔNG XÁC ĐỊNH
DƯƠNG TÍNH (1) ÂM TÍNH
Sơ đồ 2: Phương cách II
- (2) Việc xét nghiệm lại SP1, SP2 để kiểm tra xem có sai sót khi xét nghiệm bằng sinh phẩm SP1 hoặc SP2
- Các sinh phẩm xét nghiệm SP1, SP2, SP3 khác nhau
- (1) Kết quả dương tính được dùng để khẳng định tình trạng nhiễm HIV của một người với điều kiện phòng xét nghiệm được Bộ Y tế cho phép khẳng định các trường hợp nhiễm
20
XN SP1
SP1 +
XN SP2
SP1 -
SP1+SP2+
SP1+ SP2-
SP1+ SP2 + SP3 +
XN SP3
XN l¹i SP1, SP2
(2)
SP1+ SP2+ SP1+ SP2-
SP1- SP2-
SP1+ SP2+ SP3 -
SP1+ SP2- SP3 -
SP1+ SP2- SP3+
D ¬ng tÝnh (1)
¢m tÝnh
Thùc sù kh«ng cã nguy c¬ (5)
Nguy c¬ cao(4)
Kh«ng x¸c ®Þnh (3) ¢m tÝnh (6)
S¬ ®å 3: Ph ¬ng c¸ch III
HIV. Trường hợp bệnh nhân đến xét nghiệm lần đầu cho kết quả dương tính, cần lấy thêm mẫu máu lần 2 để xét nghiệm lại.
- (2) Việc xét nghiệm lại SP1, SP2 để kiểm tra xem có sai sót khi xét nghiệm bằng sinh phẩm SP1 hoặc SP2
- (3) Trường hợp không xác định, cần lấy mẫu xét nghiệm lại sau 14 ngày, nếu kết quả vẫn là không xác định, bệnh nhân này cần được theo dõi lấy máu sau 3, 6, 12 tháng, nếu sau 1 năm kết quả này vẫn không xác định khi đó mới kết luận người này không bị nhiễm HIV.
- (4) Có nguy cơ cao, qua tư vấn biết được bệnh nhân là người nghiện chích ma túy, người hành nghề mại dâm, người có quan hệ tình dục có nguy cơ không bảo vệ, mắc bệnh hoa liễu.
- (5) Thực sự không có nguy cơ, qua tư vấn thấy không có nguy cơ lây nhiễm HIV hoặc bạn tình/vợ/chồng cùng xét nghiệm có kết quả âm tính.
- (6)Kết luận âm tính cần thận trọng cân nhắc ở mục5
21
4.3 CHẨN ĐÓAN NHIỄM HIV Ở TRẺ EM DƯỚI 18 THÁNG TUỔI
Chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ em dưới 18 tháng tuổi cần theo đúng hướng dẫn quốc gia về chẩn đóan sớm nhiễm HIV cho trẻ em.
Với trẻ dưới 9 tháng tuối, có yếu tố phơi nhiễm với HIV , xét nghiệm sinh học phân tử cần được thực hiện khi trẻ từ 4 tuần tuổi
Đối với trẻ em từ 9 tháng đến 18 tháng nên làm xét nghiệm tìm kháng thể kháng HIV trước. Trong trường hợp có kháng thể kháng HIV cần thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện DNA hoặc RNA HIV.
Xét nghiệm HIV-DNA thường được chỉ định trong chẩn đóan sớm nhiễm HIV cho trẻ trong các trường hợp sau :
1. Trẻ sinh ra tử mẹ nhiễm HIV hoặc mẹ có huyết thanh dương tính được xét nghiệm lúc mang thai hoặc khi đến sinh.
2. Trẻ có các triệu chứng nghi ngờ nhiễm HIV hoặc có huyết thanh dương tính với HIV
Kỹ thuật phát hiện HIV-DNA nên thực hiện cho trẻ từ tuần tuổi thứ 4 hoặc sau đó càng sớm càng tốt để xác định tình trạng nhiễm HIV và giúp cho trẻ sớm tiếp cận với các dịch vụ chăm sóc và điều trị kịp thời.
Các xét nghiệm có thể thực hiện trên máu tòan phần lấy trong ống có chất chống đông DETA (trong điều kiện có thể gửi mẫu máu tới phòng xét nghiệm trong vòng 4-6 giờ sau khi lấy máu) hoặc trên giọt máu khô lấy trên giấy thấm DBS
Trẻ được xác định nhiễm HIV khi có kết quả PCR dương tính trên hai mẫu máu lấy cách nhau . Cần điều trị ARV sớm cho trẻ được xác định nhiễm HIV mà không cần chờ có các biểu hiện lâm sàng hoặc suy giảm miễn dịch.
Trong trường hợp kết quả PCR âm tính, trẻ có thể không nhiễm nếu hòan tòan không bú sữa mẹ . Trong trường hợp trẻ có bú sữa mẹ trong vòng sáu tuần trước khi xét nghiệm PCR, trẻ vẫn có nguy cơ bị nhiễm qua sữa và cần thực hiện lại xét nghiệm PCR sau khi trẻ ngưng bú sáu tuần.
5 . LỰA CHỌN SINH PHẨM, QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM, TRẢ KẾT QUẢ
5.1. Cấp giấy phép sinh phẩm, các quy định về xét nghiệm HIV và trả lời kết quả.
Quyết định số 4012/2003/QD-BYT ngày 30 tháng 7 năm 2003 về :” Quy định về đăng ký vaccine và sản phẩm sinh y học” đã quy định việc cấp phép và các yêu cầu của sinh phẩm chẩn đóan HIV tại Việt nam.
Tất cả các sinh phẩm chẩn đóan nhiễm HIV sử dụng tại Việt nam phải được đăng ký với Bộ y tế.
22
Phải có giấy chứng nhận về kiểm tra chất lượng do Viện kiểm định quốc gia vac xin và sinh phẩm cấp sau khi đã qua thủ nghiệm lâm sàng tại Việt nam ( mục 6 )
Giấy phép sinh phẩm có giá trị 5 năm kể từ ngày cấp (mục 8) Yêu cầu đăng ký được thực hiện cho các sinh phẫm chẩn đóan HIV sản xuất
trong nước ( mục 10) và quốc tế (mục 11) Một ủy ban xét duyệt vác xin và sinh phẩm do Bộ y tế cử để đánh giá, xem xét
và cấp giấy phép đăng ký cho các vác xin và sản phẩm sinh học trong đó có các sinh phẩm chẩn đóan HIV (mục 17).
Quy trình quốc gia đánh giá sinh phẩm chẩn đóan HIV trước khi ra thị trường đang được hòan tất. Dựa trên kết quả các sinh phẩm chẩn đóan được đánh giá, sẽ xây dựng các quy trình chẩn đóan được bộ y tế khuyến cáo cho tất cả các phòng xét nghiệm HIV trong cả nước.
5.2. Các thông tin cần cung cấp cho khách hàng trước khi xét nghiệm HIV
Khi đề xuất một xét nghiệm HIV và tư vấn cho bệnh nhân, cán bộ y tế cần cung cấp tối thiểu các thông tin sau:
Lý do phải tiến hành xét nghiệm HIV và tư vấn trước xét nghiệm cho bệnh nhân.
Lợi ích của xét nghiệm trong việc điều trị và phòng chống cũng như những nguy cơ có thể xẩy ra như vấn đề kỳ thị, bị bỏ rơi cô lập ….
Các dịch vụ có được cả trong trường hợp kết quả xét nghiệm âm tính hoặc dương tính trong đó bao gồm cả vấn đề điều trị ARV khi cần thiết.
Kết quả xét nghiệm cần được giữ bí mật , do cán bộ y tế được chỉ định có trách nhiệm thông báo trực tiếp với bệnh nhân
Bệnh nhân có quyền từ chối xét nghiệm HIV và việc tiến hành xét nghiệm sẽ chỉ được thực hiện khi bệnh nhân hiểu đã đồng ý .
Bệnh nhân từ chối xét nghiệm HIV không bị ảnh hưởng đến việc tiếp cận các dịch vụ chăm sóc khác không phụ thuộc vào tình trạng nhiễm HIV.
Nếu kết quả dương tính cần động viên bệnh nhân cho những người tiếp xúc có nguy cơ bị phơi nhiễm biết đề đề phòng lây nhiễm
Người bệnh được các cán bộ y tế cung cấp những thông tin cần thiết và giảỉ đáp các câu hỏi về nhựng vấn đề lien quan
5.3 QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM CHẨN ĐÓANH NHIỄM HIV
Quy trình xét nghiệm chuẩn (SOP) cần được xây dựng cho mỗi lọai sinh phẩm sử dụng tại Việt nam. Mỗi phòng xét nghiệm cần xây dựng quy trình xét nghiệm chuẩn và các quy trình xét nghiệm cần để ở những vị trí dễ cho kỹ thuật viên đọc được trong quá trình thực hiện
23
Những điều cần lưu ý trước khi thực hiện Đọc kỹ các hướng dẫn sử dụng trước khi tiến hành các kỹ thuật Người thực hiện xét nghiệm cần được huấn luyện tốt về các kỹ thuật liên quan đến
sinh phẩm Bảo quản sinh phẩm theo đúng hướng dẫn. Tránh làm nhiễm vi sinh các hóa chất. Không dung hóa chất từ các lô kit khác nhau. Không sử dụng kit đã hết hạn sử
dụng. Các dụng cụ, thiết bị, vật liệu tiêu hao phải sạch Luôn vệ sinh khu vực xét nghiệm bằng các dung dịch khử trùng phù hợp, và tia
UV. Mang găng tay trong suốt quá trình thao tác. Thay găng tay khi cần Sử dụng vật liệu tiêu hao mới cho mỗi mẫu. Không dùng lại các ống nghiệm hay
các đầu tip. Trong quá trình thực hiện phải có đủ các chứng yêu cầu như chứng âm, chứng
dương5.3.1 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu:
Tham khảo quy trình lấy mẫu và xử lý mẫu trong phụ lục 1 và quy trình kỹ thuật trong phụ lục 2
Các bước tiến hành gồm :
Cho mã số riêng với từng mẫu máu, không sử dụng mã số của bệnh nhân làm mã số của mẫu xét nghiệm. Trường hợp có hai ống máu được lấy từ cùng một bệnh nhân trong cùng một ngày phải dùng mã số riêng cho mỗi ống đựng bệnh phẩm.
Trong trường hợp bệnh nhân không có mã số, ghi đầy đủ tên, tuổi của bệnh nhân.
Xử lý mẫu theo quy trình của nhà sản xuất đối với mỗi lọai sinh phẩm.5.3.2 Bước tiến hành xét nghiệm:
Đối với từng loại sinh phẩm cụ thể tham khảo quy trình của nhà sản xuất.5.3.3 P hân tích kết quả:
Đối với từng loại sinh phẩm cụ thể tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất.5.3.4 kết quả
Kiểm tra đối chiếu cẩn thận kết quả với thông tin bệnh nhân để tránh nhầm lẫn. Kiểm tra đối chiếu cẩn thận với các kết quả xét nghiệm khác. Nếu có sự bất thường
trong kết quả phải báo ngay với người có thẩm quyền liên quan để tìm hướng giải quyết.
Sử dụng mẫu trả lời kết quả xét nghiệm trong phụ lục 3. Các kết quả phải được kiểm tra lại bởi một người thứ hai và được người có trách nhiệm ký tên đóng dấu trước khi trả cho bệnh nhân.
Mẫu trả lời kết quả Kết quả phải được trả trực tiếp cho người xét nghiệm để được tham vấn sau xét
nghiệm. Trong trường hợp người xét nghiệm không thể đến nhận có thể trả cho người được ủy quyền hoặc bác sĩ chăm sóc và điều trị
24
Các yêu cầu sau khi thực hiện xét nghiệm Bảo quản sinh phẩm trong đúng điều kiện yêu cầu của nhà sản xuất. Bảo quản mẫu theo đúng điều kiện yêu cầu.Các mẫu dương tính hoặc nghi ngờ phải
được bảo quản ở âm 20 / 80 độ trong vòng ít nhất 2 năm. Các mẫu âm tính phải được lưu lại ít nhất lá 1 tháng Hồ sơ kết quả lưu ít nhất 5 năm5.4 Trả lời kết quả cho bệnh nhân sau xét nghiệm
Kết quả xét nghiệm được cán bộ y tế có trách nhiệm trả lời cho bệnh nhân cùng với tư vấn sau xét nghiệm.
Tư vấn sau xét nghiệm cho người có kết qủ âm tính với HIV
Tư vấn cho những người có kết quả xét nghiệm âm tính với HIV cần bao gồm những thông tin tối thiểu sau:
- Giải thích về kết quả xét nghiệm, bao gồm các thông tin về giai đoạn cửa sổ không có kháng thể HIV và khuyến cáo nên làm lại xét nghiệm trong trường hợp vừa bị phơi nhiễm.
- Các bằng chứng cơ bản về phương pháp phòng nhiễm HIV.
- Cung cấp bao cao su nam / nữ và hướng dẫn sử dụng
Tư vấn sau xét nghiệm cho người có kết quả dương tính với HIV
Trọng tâm của tư vấn sau xét nghiệm là hỗ trợ tâm lý để xử lý với những tác động về mặt tình cảm của kết quả, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tiếp cận các dịch vụ dự phòng, chăm sóc và điều trị, cũng như dự phòng lây nhiễm và việc thông báo cho những người thân vợ/chồng.
Nhân viên y tế cần:
- Giải thích kết quả một cách đơn giản và rõ ràng, dành thời gian cho người bệnh nghĩ về nó- Đảm bảo rằng người bệnh hiểu được kết quả - Cho người bệnh cơ hội để hỏi- Giúp người bệnh đối phó với những cảm xúc nảy sinh từ kết quả xét nghiệm- Thảo luận về mọi mối quan tâm trước mắt và giúp người bệnh xác định những người trong mạng lưới xã hội của họ có thể giúp họ ngay- Mô tả những hỗ trợ tiếp theo mà cơ sở y tế và cộng đồng có thể đem lại cho người bệnh- Bố trí thời gian cụ thể cho các cuộc gặp tiếp theo hoặc chuyển tuyến để được điều trị, chăm sóc, tư vấn, hỗ trợ và tiếp nhận những dịch vụ thích hợp khác (ví dụ như điều trị bệnh lao, điều trị dự phòng nhiễm trùng cơ hội, phòng khám STI, phòng khám kế hoạch hoá gia đình, phòng khám tiền sản, điều trị bằng chất thay thế ma tuý, và các chương trình trao đổi bơm kim tiêm, chương trình dự phòng lây truền từ mẹ sang con…- Cung cấp thông tin về cách phòng ngừa lây nhiễm HIV, bao gồm cả cung cấp bao cao su- Cung cấp thông tin về những biện pháp y tế dự phòng thích hợp khác như dinh dưỡng tốt và phòng dịch bệnh, dùng thuốc phòng sốt rét và màn tẩm hoá chất diệt côn trùng
25
- Thảo luận về khả năng tiết lộ kết quả, tiết lộ cho ai, khi nào, bằng cách nào - Động viên và đề nghị giúp đỡ xét nghiệm và tư vấn cho vợ/chồng/con họ - Đánh giá các yếu tố nguy cơ của bạo lực và tự tử hay thảo luận về những bước để đảm bảo an ninh thân thể cho bệnh nhân, đặc biệt là những phụ nữ.
- Thu xếp cuộc hẹn cụ thể và thời gian để tái khám hay chuyển tuyến để điều trị, chăm sóc, tư vấn và hỗ trợ và các dịch vụ khác thích hợp ( ví dụ sàng lọc lao và điều trị lao, dự phòng các nhiễm trùng cơ hội, điều trị STI, kế hoạch hoá gia đình, chăm sóc tiền sản, điều trị thuốc thay thế opiod, và tiếp cận bơm kim tiêm sạch).
- Chú ý :
Khi thông báo kết quả xét nghiệm cần giải thích về các dịch vụ dự phòng, hỗ trợ, chăm sóc điều trị có sẵn cho bệnh nhân. Các chương trình phòng chống những bệnh mạn tính khác và các dịch vụ dự phòng, điều trị, chăm sóc và hỗ trợ liên quan đến HIV tại cộng đồng là những nguồn lực đặc biệt quan trọng, và một điều quan trọng nữa là thiết lập và duy trì cơ chế hợp tác.
Khi chuyển tuyến cần cung cấp cho người bệnh thông tin về người mà họ cần tiếp xúc, nơi cần đến, thời gian đến và cách tiếp xúc. Việc chuyển tuyến bệnh nhân có hiệu quả nhất nếu nhân viên y tế liên lạc khi có mặt người bệnh, lên lịch hẹn, ghi chép về cuộc tiếp xúc và đưa vào hồ sơ bệnh án. Nhân viên trong mạng lưới chuyển tuyến cần thường xuyên thông báo cho nhau về những thay đổi về mặt nhân sự hoặc quy trình có thể tác động đến việc chuyển tuyến bệnh nhân.
6. HỆ THỐNG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM HIV
6.I. GIỚI THIỆU CHUNG
Phòng xét nghiệm cần có kết quả xét nghiệm với độ chính xác và mức độ tin cậy cao, đặc biệt là phòng xét nghiệm HIV. Chất lượng xét nghiệm không đảm bảo có thể ảnh hưởng đến uy tín của phòng xét nghiệm và có thể liên quan đến pháp lý. Kết quả xét nghiệm sai có thể dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng đến bản thân người được xét nghiệm, cũng như gia đình và xã hội. Một mẫu bệnh phẩm kể từ khi lấy đến khi có kết quả cuối cùng phải trải qua nhiều quá trình khác nhau. Mỗi quá trình đều có thể sai sót nếu không được quản lý và đảm bảo chất lượng. Do đó cần phải có hệ thống quản lý chất lượng nhằm đảm bảo các kết quả xét nghiệm là chính xác.
6.1.1.Mục tiêu- Đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả xét nghiệm HIV.- Hạn chế những sai sót trong công tác xét nghiệm.- Đảm bảo các yêu cầu về quản lý và điều hành.- Đảm bảo công việc đạt hiệu quả tốt
6.1.2. Một số khái niệm và thuật ngữ26
- Hệ thống quản lý chất lượng (Quality System): là biện pháp kiểm soát chất lượng tất cả các họat động về hành chính, kỹ thuật của toàn bộ hệ thống xét nghiệm bao gồm giai đoạn trước xét nghiệm, xét nghiệm, và sau xét nghiệm
- Quản lý chất lượng xét nghiệm (Quality Management - QM): Được xây dựng dựa trên 4 yếu tố: đảm bảo chất lượng, thực hành tốt phòng thí nghiệm, kiểm tra chất lượng và cải tiến chất lượng.
- Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA) là một quá trình tổng thể đảm bảo kết quả xét nghiệm đưa ra là chính xác nhất. Quá trình này bao gồm các quy trình trước xét nghiệm, xét nghiệm và sau xét nghiệm.
- Kiểm tra chất lượng (Quality Control- QC) là biện pháp theo dõi những mẫu chứng được làm cùng với mỗi lần xét nghiệm để kiểm tra quy trình xét nghiệm và chất lượng sinh phẩm.
- Chương trình đánh giá chất lượng (Quality Assessment Programe) là biện pháp đánh giá chất lượng xét nghiệm. Đó là sự đánh giá của phòng xét nghiệm tham chiếu về khả năng xét nghiệm của phòng xét nghiệm thành viên thông qua bộ mẫu chuẩn (panel). Chương trình này nhằm đánh giá hiệu quả của chương trình đảm bảo chất lượng của phòng xét nghiệm.
SƠ ĐỒ HỆ THỐNG QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG
Đảm bảo chất lượng phòng xét nghiệm là các hoạt động có kế hoạch mang tính hệ thống nhằm đáp ứng yêu cầu chất lượng. Mỗi phòng xét nghiệm phải thiết lập và triển khai chương trình đảm bảo chất lượng để theo dõi và đánh giá toàn bộ hoạt động phòng xét nghiệm.
27
Qu¶n lý chÊt l îng
Qu¶n lý hµnh chÝnh
Qu¶n lý kü thuËt
Chu tr×nh c¶i tiÕn (liªn tôc)
§¶m b¶o chÊt l îng
EQAS, QC, QAP
§Çu vµo XN
§Çu ra XN
Ho¹t ®éng thÈm ®Þnh
Hệ thống xét nghiệm bao gồm: giai đoạn trước xét nghiệm, xét nghiệm và giai đoạn sau xét nghiệm.
Giai đoạn trước xét nghiệm bao gồm:
- Yêu cầu xét nghiệm- Lựa chọn xét nghiệm, bệnh phẩm và dụng cụ lấy mẫu- Tư vấn trước xét nghiệm- Dán nhãn, thu thập mẫu, bảo quản và vận chuyểnGian đoạn xét nghiệm bao gồm:
- Xử lý mẫu và bảo quản- Chuẩn bị sinh phẩm, hoá chất- Kiểm tra trang thiết bị và chế độ bảo trì, bảo dưỡng trang thiết bị - Tuân thủ quy trình xét nghiệm chuẩn- Tiến hành xét nghiệm- Xét nghiệm mẫu chứng (mẫu chứng của kit và mẫu nội kiểm chứng)- Tham gia chương trình đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài- Lưu mẫuGiai đoạn sau xét nghiệm bao gồm:
- Kiểm tra lại kết quả- Sao chép kết quả- Phiên giải kết quả- Trả lời kết quả- Lưu giữ các bản ghi và sổ sách
Quy trình đảm bảo chất lượng có thể chia thành giai đoạn bảo chất lượng trong quy trình xét nghiệm và đảm bảo chất lượng bằng giám sát chất lượng xét nghiệm.
6.2. ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM TRONG QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM
6.2.1. Thu thập mẫu, chuẩn bị và bảo quản mẫu xét nghiệm
Kết quả xét nghiệm của một phòng xét nghiệm chỉ tốt khi nhận được những mẫu bệnh phẩm tốt và đạt tiêu chuẩn:
- Lấy máu xét nghiệm- Xử lý mẫu - Bảo quản và lưu trữ mẫu- Vận chuyển mẫu- Nhận mẫu
Các quy trình trên cần có và phải tuân theo quy trình chuẩn.
6.2.2. Sinh phẩm
- Các sinh phẩm phải trong thời hạn sử dụng và được bảo quản tốt.
28
- Chỉ sử dụng các sinh phẩm đã được Bộ Y tế đánh giá chất lượng và cấp phép lưu hành.
6.2.3. Xét nghiệm
Mỗi phòng xét nghiệm phải có quy trình xét nghiệm chuẩn chính xác, rõ ràng và dễ hiểu.
- Thao tác: Cần có kỹ thuật xét nghiệm chuẩn, tuân thủ quy trình chuẩn- Sổ sách xét nghiệm, phần mềm quản lý
Các kết quả xét nghiệm được lưu giữ và ghi chép vào sổ sách đầy đủ theo quy định Bộ Y tế.
6.2.4. Các trang thiết bị, điều kiện phòng xét nghiệm
- Tuân thủ quy định về sử dụng và quản lý trang thiết bị- Vận hành đúng, có hướng dẫn sử dụng- Lý lịch, nhật kí sử dụng trang thiết bị- Bảo hành, bảo dưỡng và hiệu chỉnh trang thiết bị và dụng cụ xét nghiệm định kì.
6.2.5. Nhân viên phòng xét nghiệm
- Được đào tạo tại các cơ sở mà Bộ Y tế chỉ định.- Có đủ trình độ và có kinh nghiệm, có kỹ thuật xét nghiệm tốt, tuân thủ quy trình và
các nguyên tắc phòng xét nghiệm.- Hiểu biết về các kỹ thuật xét nghiệm.
SƠ ĐỒ BẢO ĐẢM CHẤT LƯỢNG TRONG QUÁ TRÌNH XÉT NGHIỆM
THU THẬP MẪU QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM
29
- Đúng lọai ống nghiệm
- Đúng nhãn- Đúng lọai
mẫu- Bảo quản
đúng - Vận chuyển
đúng
- Đúng lọai xét nghiệm
- Xử lý mẫu đúng- Kiểm tra giấy tờ- Hiệu chỉnh máy- Nhân viên được đào
tạo- Mẫu nội kiểm - Xây dựng quy trình
thực hành chuẩn (SOP)
- An tòan trong xét nghiệm
- Kiểm tra thông tin
- Kiểm tra kết quả- Biện luận kết
quả- Sổ sách báo cáo
rõ ràng không sửa kết quả
Trả lời kết quả
Nhận mẫu
- Tiêu chuẩn chấp nhận
- Tiêu chuẩn lọai bỏ
Trước xét nghiệm Trong xét nghiệm Sau xét nghiệm
6.3. ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM BẰNG GIÁM SÁT CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM
Có hai cách kiểm tra giám sát chất lượng xét nghiệm:
6.3.1 Nội kiểm tra
Có hai cách tiến hành nội kiểm tra:
- Nội kiểm tra bằng các mẫu chứng có sẵn trong kit.
- Nội kiểm tra bằng bộ mẫu nội kiểm chứng (IQC) do phòng xét nghiệm tự sản xuất hoặc do các phòng xét nghiệm tham chiếu cung cấp.
6.3.2 Đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài30
Do phòng xét nghiệm tham chiếu quốc gia hoặc quốc tế theo dõi chất lượng của các phòng xét nghiệm thành viên thông qua bộ mẫu chuẩn. Ngày nay, việc đảm bảo chất lượng, kiểm tra chất lượng, và đánh giá chất lượng là một phần quan trọng của xét nghiệm chẩn đoán nói chung và của xét nghiệm HIV nói riêng. Đánh giá chất lượng là một bộ phận của chương trình đảm bảo chất lượng tổng thể.
6.4 Chương trình quốc gia đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài (EQAS)
Nguyên tắc chung
- Phòng xét nghiệm tham chiếu đảm nhiệm chương trình này.- Khuyến khích tất cả các phòng xét nghiệm HIV tham gia vào chương trình.- Chương trình theo dõi và đánh giá chất lượng thực hiện xét nghiệm của mỗi phòng xét nghiệm.Mục tiêu chính
- Đánh giá chất lượng các phòng xét nghiệm ở mức độ quốc gia.- Đảm bảo độ tin cậy về kết quả của phòng xét nghiệm cho bác sĩ điều trị và bệnh nhân. Mục tiêu khác
- Xác định những lỗi thông thường và khuyến cáo các biện pháp khắc phục.- Khuyến khích thực hành tốt trong phòng xét nghiệm, sử dụng các quy trình xét nghiệm đã được chuẩn hoá, các sinh phẩm hoá chất thích hợp có chất lượng tốt- Khuyến khích các phòng xét nghiệm thành viên áp dụng chương trình đảm bảo chất lượng xét nghiệm và các phương pháp đo lường kiểm chuẩn.- Tạo điều kiện cho các phòng xét nghiệm trao đổi thông tin và hình thành mạng lưới đảm bảo chất lượng xét nghiệm ở mức độ quốc gia và quốc tế.- Tư vấn và đào tạo - Cập nhật những kỹ thuật chẩn đoán HIV mới và những vấn đề liên quan.Các bước tiến hành
- Gửi công văn thông báo về chương trình cho các phòng xét nghiệm mới. - Xác nhận sự tham gia chương trình của các phòng xét nghiệm. Trước mỗi vòng của chương trình đều phải thông báo cho các đơn vị và xác nhận sự tiếp tục tham gia của các đơn vị.- Gửi bộ mẫu chuẩn cho các đơn vị. - Thu thập các kết quả từ các phòng xét nghiệm gửi về.- Gửi báo cáo sơ bộ cho các phòng xét nghiệm, thông báo về nguồn gốc mẫu, đặc điểm mẫu. Gửi báo cáo sơ bộ đến các phòng xét nghiệm trong vòng 1 tuần sau khi hết hạn nhận các báo cáo từ các đơn vị.- Nhập các kết quả từ các đơn vị gửi đến, xử lý số liệu.- Gửi báo cáo tổng hợp và báo cáo riêng của từng đơn vị. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm
- Dựa vào kết quả xét nghiệm của đơn vị, so sánh với kết quả của phòng tham chiếu và các đơn vị thành viên.
31
- Dựa vào chiến lược xét nghiệm mà các đơn vị sử dụng.7 AN TÒAN SINH HỌC (nihe)
8 HỆ THỐNG TỔ CHỨC TRONG CÔNG TÁC XÉT NGHIỆM HIV VIỆT NAM
32
Bộ y tế
Cục phồng chống HIV/AIDS
Phòng xét nghiệm tham chiếu
Phòng xét nghiệm quốc tế
Phòng xét nghiệm khẳng định
Phòng xét nghiệm sàng lọc
ThÈm ®Þnh & cÊp phÐp
KiÓm tra & cÊp phÐp
KiÓm tra
Göi mÉu
Göi mÉu
§¸nh gi¸ chÊt l îng
Hệ thống phòng xét nghiệm HIV tại Việt Nam bao gồm phòng xét nghiệm tham chiếu quốc gia, phòng xét nghiệm chuẩn quốc gia và phòng xét nghiệm sàng lọc.
8.1 PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM CHIẾU Chức năng nhiệm vụ:
– Xét nghiệm và khẳng định các trường hợp nghi ngờ HIV dương tính kể cả chẩn đoán HIV cho trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
– Đưa ra các khuyến nghị giúp Bộ Y tế đưa ra các chính sách phù hợp cho chương trình phòng chống AIDS quốc gia.
– Thực hiện các xét nghiệm và nghiên cứu sinh học phân tử về HIV/AIDS – Tiến hành nghiên cứu theo dõi điều trị bệnh nhân AIDS (xét nghiệm kháng thuốc
HIV, đếm tế bào CD4, tải lượng virus, sinh hóa...)– Cung cấp chương trình Quốc gia đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài về
huyết thanh học, tải lượng vi rút, CD4, sinh hóa.– Sọan thảo các tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chuẩn cho hệ thống xét nghiệm HIV tại Việt
Nam– Hỗ trợ kỹ thuật và tổ chức tập huấn về kỹ thuật xét nghiệm HIV, đảm bảo chất lượng
xét nghiệm HIV cho hệ thống xét nghiệm HIV tại Việt Nam– Đánh giá sinh phẩm xét nghiệm HIV tại Việt Nam– Hợp tác với các tổ chức trong và ngoài nước trong phòng chống AIDS, tiến hành các
nghiên cứu khoa học, ứng dụng các xét nghiệm mới và xét nghiệm chuyên sâu.– Kiểm tra, đánh giá chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm sàng lọc và
phòng xét nghiệm chuẩn quốc gia. – Phòng xét nghiệm tham chiếu quốc gia đặt tại viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, viện
Pasteur TP Hồ Chí Minh, viện Pasteur Nha Trang
8.1.1 Yêu cầu về cơ sở xét nghiệm
8.1.2 Yêu cầu trang thiết bị
8.1.3 Yêu cầu về cán bộ ( quản lý và xét nghiệm)
8.2. PHÒNG XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH : Phòng xét nghiệm chuẩn quốc gia
Chức năng nhiệm vụ:– Xét nghiệm phục vụ cho tư vấn xét nghiệm tự nguyện HIV– Xét nghiệm sàng lọc và xét nghiệm khẳng định các trường hợp HIV dương tính. – Xét nghiệm HIV trong các chương trình giám sát HIV và nghiên cứu khoa học.– Phòng xét nghiệm chuẩn quốc gia tại các ngân hàng máu đảm bảo an toàn truyền máu – Hỗ trợ kỹ thuật cho các phòng xét nghiệm sàng lọc theo tuyến.– Xét nghiệm theo dõi điều trị AIDS (đếm tế bào CD4, tải lượng virus, sinh hóa...) (!?)
33
– Phòng xét nghiệm chuẩn quốc gia được đặt tại các bệnh viện trung ương, các cơ sở y tế tỉnh, thành phố.
8.2.1 Yêu cầu về cơ sở xét nghiệm
8.2.2 Yêu cầu trang thiết bị
8.2.3 Yêu cầu về cán bộ ( quản lý và xét nghiệm)
8.3 PHÒNG XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC :Chức năng nhiệm vụ:
– Xét nghiệm phục vụ cho tư vấn xét nghiệm tự nguyện HIV– Xét nghiệm sàng lọc HIV, chuyển mẫu nghi ngờ dương tính HIV đến các phòng xét
nghiệm chuẩn quốc gia hoặc phòng xét nghiệm tham chiếu.– Xét nghiệm HIV trong các chương trình giám sát HIV – Phòng xét nghiệm sàng lọc được đặt tại các Bệnh viện, các Trung tâm Y tế tỉnh, hệ
thống y tế các quận/ huyện, các bệnh viện và phòng khám.
8.3.1 Yêu cầu về cơ sở xét nghiệm
8.3.2 Yêu cầu trang thiết bị
8.3.3 Yêu cầu về cán bộ ( quản lý và xét nghiệm)
8.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG PHÒNG XÉT NGHIỆM VÀ CẤP CHỨNG CHỈ
Cần thiết lập các qui trình trình giám sát thực hiện có thể phát hiện những sai sót, sự cố để đảm bảo hệ thống phòng thí nghiệm làm việc tốt.
Có kế hoạch để giải quyết các sự cố, và ghi chép lưu giữ các thông tin về những hoạt động đã thực hiện để giải quyết sự cố. Xây dựng các tiêu chí để đánh giá cấp chứng chỉ cho phòng xét nghiệm các cấp cũng như thu hồi chứng chỉ khi không đạt chuẩn.8.4.1 PHÒNG XÉT NGHIỆM THAM CHIẾU
– Tham gia chương trình quốc tế đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài.– Bộ Y tế cấp quyết định công nhận các phòng xét nghiệm tham chiếu quốc gia.– Bộ Y tế và các chuyên gia quốc tế sẽ tiến hành kiểm tra đánh giá chất lượng định kỳ.– Đạt tiêu chuẩn ISO 15189
8.4.2 PHÒNG XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH– Tham gia chương trình quốc gia đánh giá chất lượng xét nghiệm từ bên ngoài và
chương trình đánh giá chất lượng quốc tế (nếu có).– Được Bộ Y tế cấp quyết định công nhận.– Chịu sự kiểm tra đánh giá của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và các Viện khu vực.– Phòng xét nghiệm khẳng định phải đạt chuẩn quốc gia và tiến tới đạt chuẩn ISO
15189
34
8.4.3 PHÒNG XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC– Tham gia chương trình đánh giá chất lượng xét nghiệm của Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương và các Viện khu vực.– Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và các Viện khu vực hỗ trợ các trung tâm AIDS
tuyến tỉnh tiến hành kiểm tra và cấp quyết định công nhận các phòng xét nghiệm sàng lọc đủ tiêu chuẩn.
8.5. ĐÀO TẠO CÁN BỘ :
Chương trình đào tạo cho những người thực hiện các xét nghiệm HIV cần hướng tới việc đào tạo lý thyết, năng lực và kỹ năng thực hành và đặc biệt quan tâm đến việc thực hành tốt trong phòng thí nghiệm, như đảm bảo an toàn, lấy và sử lý mẫu bệnh phẩm, ghi chép và quản lý những thông tin về kết quả, quản lý báo cáo và số liệu, và kiểm tra chất lượng.
Cần tổ chức đào tạo ban đầu về xét nghiệm và sau đó định kỳ đào tạo nâng cao và cập nhật các thông tin khoa học và kỹ thuật mới.
8.5.1 Đào tạo
- Cán bộ làm công tác xét nghiệm HIV cần có trình độ từ trung cấp trở lên và được đào tạo về công tác xét nghiệm HIV. Mỗi phòng xét nghiệm nên có ít nhất một cán bộ có trình độ đại học.
- Các cán bộ làm xét nghiệm HIV phải qua các lớp tập huấn lý thuyết và thực hành về chuyên môn kỹ thuật, an tòan sinh học và bảo đảm chất lượng xét nghiệm.
-Các lớp tập huấn cần có giáo trình thống nhất cho từng nhóm đối tượng đào tạo
- Đảm bảo đúng đối tượng , giáo trình và thời gian đào tạo cho từng kỹ thuật xét nghiệm
- Cán bộ làm công tác xét nghiệm cần được đào tạo để thực hiện đúng kỹ thuật xét nghiệm và lồng ghép với tất cả các nội dung tư vấn và bảo đảm chất lượng xét nghiệm.
- Mục đích và các chiến lược xét nghiệm.- Nguyên tắc và phương pháp xét nghiệm - Thực hành phòng xét nghiệm chuẩn- Dịch vụ khách hàng và giao tiếp hiệu quả- Phương pháp sử lý sự cố kỹ thuật và tai nạn nghề nghiệp- Xem xét lại các mẫu báo cáo- Chỉ dẫn thực hiện xét nghiệm bao gồm tất cả các phần của quy trình, từ khi thu thập mẫu bệnh
phẩm cho đến khi đọc, diễn giải, ghi chép và báo cáo kết qủa cũng như có thể sử dụng các tài liệu đối chứng bên ngoài.
- Các quy trình lưu giữ bảo quản mẫu và kết quả xét nghiệm- Tầm quan trọng của đảm bảo chất lượng- Tầm quan trọng của qui trình an toàn sinh học, bao gồm xử lý chất thải- Đánh giá khả năng của học viên đối với việc thực hiện xét nghiệm an toàn và chuẩn xác.
35
Cần xây dựng các giáo trình đào tạo phù hợp cho các cấp và tổ chức đào tạo cho giảng viên. Ngoài ra, cần có chương trình đào tạo cho nhân viên quản lý chương trình dù họ có thể không thực hiện xét nghiệm nhưng cần biết làm thể nào để bảo đảm chất lượng xét nghiệm
8.5.2 Kiểm tra, cấp chứng chỉ:
- Học viên cần được kiểm tra, đánh giá về lý thuyết (bài viết hoặc trắc nghiệm) với những kiến thức đã được đào tạo về nguyên lý, kỹ thuật xét nghiệm, bảo đảm chất lượng phòng xét nghiệm và an tòan sinh học...
- Thực hành thao tác trên mẫu thử với các yêu cầu kỹ thuật, xử dụng và bảo dưỡng các máy móc trang thiết bị phòng xét nghiệm
- Lý thuyết và kỹ năng xử lý sự cố...- Đánh giá khả năng của người làm xét nghiệm về việc kiểm soát chất lượng và kết quả xét
nghiệm. Cách biện luận và trả lời kết quả dựa trên cơ sở phương cách xét nghiệm đã được thực hiện.
- Đánh giá sự tuân thủ với thực hành phòng xét nghiệm chuẩn và chuẩn về an toàn.
Chứng chỉ được cấp cho các học viên đạt yêu cầu do các đơn vị được bộ y tế phân công: Các viện vệ sinh dịch tễ, viện Pasteur khu vực…
- Các viện khu vực chụi trách nhiệm đào tạo, kiểm tra và cấp chứng chỉ cho các nhân viên phòng thí nghiệm tuyến tỉnh và hỗ trợ tuyến tỉnh trong công tác đào tạo nhân viên phòng thí nghiệm tuyến dưới.
- Cán bộ thực hiện xét nghiệm sàng lọc nhiễm HIV tại các phòng xét nghiệm bệnh viện, nhà hộ sinh, các cơ sở y tế tuyến dưới cần được tập huấn và cấp chứng chỉ xét nghiệm do các đơn vị cấp tỉnh được chỉ định.
- Các chứng chỉ xét nghiệm có giá trị trong 3 năm kể từ ngày cấp
8.5.3.Đào tạo lại và đánh giá.
- Cán bộ xét nghiệm cần được tập huấn , cập nhật các thông tin khoa học, kỹ thuật và kiểm tra lại về kiến thức và kỹ thuật chuyên môn ba năm một lần. Trong trường hợp không đạt yêu cầu cần thu lại chứng chỉ và phải được đào tạo lại.
36
-
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 QUY TRÌNH LẤY MẪU XÉT NGHIỆM, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN
Mỗi bộ kit của mỗi nhà sản xuất khác nhau có thể có yêu cầu riêng được hướng dẫn cụ thể trong hướng dẫn sử dụng, tuy nhiên, đa số tuân theo quy trình chung như sau:
1. Quy trình lấy mẫu xét nghiệm:
1.1 Thông tin bệnh nhân:
Điền đầy đủ các thông tin về bệnh nhân trên phiếu xét nghiệm và ngày giờ lấy mẫu: Trên ống máu cần ghi đầy đủ thông tin về họ, tên, tuổi và mã số của bệnh nhân (nếu
có).1.2 Quy trình lấy máu:
Máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất. Thể tích tuỳ theo yêu cầu của kit Chỉ được dùng găng tay không có bột tal ( trường hợp không có găng tay không bột
có thể sử dụng găng tay thường nhưng phải rửa sạch bột tal trước khi lấy máu cho bệnh nhân ).
Sát trùng nơi lấy máu bằng cồn 70ºC và để khô Lấy máu vào ống có chất chống đông sử dụng loại chất chống đông nào là do yêu cầu của
nhà sản xuất nhưng thông thường là sử dụng chống đông bằng EDTA (trường hợp sử dụng bộ lấy máu áp xuất âm gồm kim lấy máu, ống chân không có chống đông thì sử dụng bộ kim lấy máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất), sau khi lấy máu xong phải lắc nhẹ nhàng để ống máu tráng đều lên thành ống khoảng 5 - 6 lần.
Ly tâm ống chứa máu với tốc độ 2000 vòng/phút x 5 phút, thu huyết tương cho vào một tube sạch chuyên dụng, đóng nắp thật chặt.
Một số vấn đề cần lưu ý:
Hẹn người bệnh đến lấy máu theo đợt, 10 người/đợt, hạn chế gửi lẻ từng bệnh phẩm. Người lấy máu phải là nhân viên y tế đã qua đào tạo, tập huấn về kỹ thuật lấy máu xét
nghiệm. Các thông tin về người bệnh phải được giữ bí mật. Có thể lấy máu bằng bơm kim tiêm hoặc bộ dụng cụ lấy máu áp suất âm. Tuy nhiên vì
mục đích an toàn nên sử dụng bộ dụng cụ lấy máu áp suất âm. Ống lấy máu phải có chất chống đông EDTA tốt nhất là nên sử dụng chất chống đông
dạng phun sương và cần tuân thủ đúng thể tích máu do nhà sản xuất quy định trên ống. Tuyệt đối không dược dùng ống có chứa heparin (chất ức chế phản ứng PCR) để lấy
máu.Nếu đi lấy mẫu bên ngoài, phải có kế hoạch lấy mẫu với đầy đủ các thông tin về số lượng
người bệnh, thời gian, địa điểm dự kiến lấy mẫu. Thời gian lập kế hoạch tối thiểu là 02 tuần
37
và gửi kế hoạch cho cơ sở sẽ đến lấy máu tối thiểu là 01 tuần trước khi lấy mẫu. Tuân thủ các quy trình lấy và vận chuyển mẫu.
2. Quy trình vận chuyển mẫu:
Đóng gói mẫu:
Tất cả các ống bệnh phẩm phải được đóng nắp thật chặt và xếp thẳng đứng trong giá đựng mẫu tránh bị va đập trong quá trình vận chuyển.
Khi vận chuyển giá đựng bệnh phẩm phải được để trong túi nilon dán kín, sau đó đặt trong một hộp xốp cách nhiệt ( có thể thêm bình tích lạnh hoặc gel đá khô để đảm bảo nhiệt độ của mẫu bệnh phẩm trong khoảng từ 18-25ºC. Ống dựng bệnh phẩm phải được chèn chặt bởi bông hút nước phòng trừ trường hợp bệnh phẩm bị rò rỉ khi va đập trong quá trình vận chuyển. Không để đá tiếp xúc trực tiếp với ống đựng bệnh phẩm vì có thể ảnh hưởng đến chất lượng mẫu bệnh phẩm. Thùng đựng mẫu có chốt khoá lại, trường hợp không có chốt khoá thì dùng băng dính dán xung quanh.
Dán hoặc in ký hiệu nguy hiểm sinh học ( trường hợp không có nhãn nguy hiểm sinh học thì phải có ghi rõ mọi thông tin) và số điện thoại liên hệ trong trường hợp khẩn cấp bên ngoài của hộp đựng mẫu bệnh phẩm
.
Trong ngăn phụ của hộp đựng bệnh phẩm cần có một đôi găng tay dự phòng trong trường hợp người vận chuyển mẫu cần sử dụng.
Gửi kèm phiếu xét nghiệm và địa chỉ phòng xét nghiệm nhận mẫu bệnh phẩm.
Vận chuyển mẫu:
Vận chuyển máu toàn phần hoặc huyết tương phải tuân thủ các quy định của quốc gia hoặc chính quyền địa phương về vận chuyển các tác nhân có khả năng gây bệnh.
Nơi gửi mẫu cần gọi điện báo trước cho phòng xét nghiệm biết thời gian bệnh phẩm sẽ tới để phòng xét nghiệm bố trí cán bộ tiếp nhận.
38
Bệnh phẩm gửi đi phải kèm theo phiếu xét nghiệm điền đầy đủ các thông tin. Mẫu nên tách huyết tương trước khi vận chuyển, nếu chưa tách ngay, quá trình vận
chuyển không được kéo dài quá 4 giờ ở điều kiện nhiệt độ từ 2º - 25ºC. và phải thực hiện ly tâm tách huyết tương ngay sau khi nhận.
Mẫu phải được bảo quản lạnh trong suốt quá trình vận chuyển. Tốt nhất là vận chuyển mẫu bằng xe chuyên dụng. Trong trường hợp điều kiện không
cho phép, có thể sử dụng ô-tô hoặc xe gắn máy thông thường nhưng phải buộc hộp chứa mẫu bệnh phẩm thật cẩn thận vào giá chở hàng, đảm bảo gọn gàng, tránh đổ, vỡ.
Người vận chuyển mẫu bệnh phẩm phải là nhân viên của cơ sở chăm sóc, điều trị người bệnh AIDS hoặc cộng tác viên đã qua tập huấn
Chú ý : Phải tuân thủ nghiêm ngặt quy trình và hướng dẫn lấy máu, vận chuyển mẫu máu để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm.
Tiếp nhận mẫu:
Kiểm tra tình trạng mẫu, đối chiếu thông tin trên ống đựng máu, phiếu xét nghiệm và sổ vận chuyển mẫu. Thông báo cho nơi gửi xét nghiệm lấy lại mẫu và tuân thủ đúng các quy trình nếu thông tin trên ống máu và trên phiếu xét nghiệm không khớp nhau hoặc chất chống đông không phải là EDTA hoặc loại chống đông theo yêu cầu của nhà sản xuất, hoặc máu bị đông hoặc huyết thanh đã bị tiêu huyết. Mẫu không được vận chuyển đúng nhiệt độ hoặc không đủ thể tích yêu cầu hoặc được chuyển đến quá 4 giờ sau khi lấy.
Trường hợp thiếu thông tin về địa chỉ, ngày, giờ thu thập mẫu trên phiếu xét nghiệm phải thông báo cho nơi gửi xét nghiệm để bổ sung thông tin và rút kinh nghiệm cho các lần gửi sau.
Ký nhận vào sổ theo dõi vận chuyển mẫu. Điền đầy đủ các thông tin về người bệnh và mẫu bệnh phẩm vào sổ xét nghiệm. Đưa mẫu đi bảo quản theo đúng quy trình.
3. Quy trình bảo quản mẫu xét nghiệm:
Giữ mẫu huyết tương sau khi tách ở – 200C cho đến khi thực hiện xét nghiệm. Nếu chưa tách huyết tương hoặc huyết thanh ngay, phải bảo quản mẫu máu ở 2 – 80C,
và phải thực hiện tách huyết tương hoặc huyết thanh trong vòng 4 giờ sau đó. Nếu cần lưu trữ mẫu lâu, nên bảo quản ở – 700C (có thể lưu trữ được 12 tháng). Thông
thường phải lưu mẫu từ 1-3 tháng để thực hiện kiểm tra đối chiếu kết quả khi cần thiết. Các tube chứa mẫu bệnh phẩm phải được đóng nắp thật chặt xếp thẳng đứng trong giá
đựng mẫu. Phải ghi rõ thông tin về mẫu trên tube chứa mẫu, dùng bút không xóa được để ghi.
39
40
