Validação de métodos analíticos em toxicologia

ValidarVALIDAR um método analítico é estar com o objetivo

voltado para a confiabilidade analítica do método escolhido ou desenvolvido para se obter o resultado.

A validação de um método é um dos elementos básicos de sistemas de qualidade de laboratórios:- BPL (Boas Práticas de Laboratório)-GLP- ISO17025

Por que validar?A validação visa diminuir ou controlar os fatores que

levam a imprecisão ou inexatidão de um dado gerado.

Erros sistemáticos:

São erros que a princípio pode-se “aliviá-los nas medidas”,

ou seja, eliminá-los ou aplicar fatores de correção, desde

que constantes. Ex: erros instrumentais, erros devido à

presença de impurezas, erros de operação, erros pessoais,

erros de método.

Erros indeterminados:

São erros devido a variações ao acaso, de causas não

conhecidas exatamente, em geral irregulares e pequenas e

de difícil controle do operador como: umidade,

temperatura, iluminação, etc.

Parâmetros avaliados em validação de métodos

• Precisão

• Exatidão

• Linearidade

• Recuperação

• Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação

(LOQ)

• Especificidade

• Robustez

• Estabilidade do analito

PrecisãoA precisão é o parâmetro que avalia a proximidade entre

várias medidas efetuadas em uma mesma amostra.

A medida de precisão deve levar em conta: condições de

repetibilidade e/ou reprodutibilidade

Condições de repetibilidade: são condições em que resultados

independentes são obtidos usando:-o mesmo método;-para a mesma amostra;-o mesmo operador;-o mesmo laboratório;-usando o mesmo equipamento;-em um curto intervalo de tempo

Condições de reprodutiblidade: são condições onde resultados são obtidos usando:

-o mesmo método;-para a mesma amostra;-em diferentes laboratórios;-por diferentes operadores;-usando equipamentos diferentes.

ExatidãoA exatidão é a diferença entre o valor real presente na

amostra e o valor obtido na análise. É avaliada

através da inexatidão, ou seja, o afastamento entre os

valores esperado e obtido.

Exatidão x precisão

Linearidade

A linearidade é a capacidade de um método analítico gerar

resultados proporcionais à concentração da espécie em

análise, dentro de uma faixa analítica especificada. A

linearidade é determinada pela análise de uma série de

calibradores (amostras adicionadas com diversas

concentrações conhecidas do analito), abrangendo a faixa

de concentração de interesse no trabalho. Com essas

análises realiza-se a curva de calibração.

RecuperaçãoA recuperação avalia a eficiência do método de tratamento da

amostra. Toda amostra que recebe tratamento de análise

indireta (extração) deve ter calculado experimentalmente a

perda do analito decorrente desse tratamento. A recuperação

expressa a variação de resposta obtida entre a quantidade de

analito adicionada antes da extração e aquela decorrente da

adição da mesma quantidade do analito após o processo de

extração.

LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO

Limite de detecção (LOD) é a menor concentração ou

quantidade de uma substância (analito) que pode ser

identificada por um método analítico com um nível de

confiança especificado ou ainda, que pode ser

estatisticamente diferenciada do ruído.

Limite de quantificação (LOQ) é a menor concentração do

analito que pode ser quantificada com uma precisão

especificada.

SensibilidadeA sensibilidade de um método indica sua capacidade de

discriminar, com uma fidelidade estabelecida,

concentrações próximas de um analito.

Sensibilidade ≠ LOD

SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE

A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar o analito na presença de outras substâncias prováveis de interferirem na determinação.

O termo especificidade se refere a um método específico para um único analito, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.

RobustezA robustez é a capacidade do resultado de um método

permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura do ambiente, pH, concentração da fase móvel (HPLC), materiais de diferentes procedências etc.

EstabilidadeA estabilidade da substância em teste poderá ser feita

em relação a matriz de trabalho nas seguintes condições:

Durante armazenamento-temperatura ambiente-temperatura de geladeira (4°C)-temperatura de congelamento (-20°C)Ciclos de congelamento e descongelamento (3ciclos)Após a extração