Validação de métodos analíticos em toxicologia
ValidarVALIDAR um método analítico é estar com o objetivo
voltado para a confiabilidade analítica do método escolhido ou desenvolvido para se obter o resultado.
A validação de um método é um dos elementos básicos de sistemas de qualidade de laboratórios:- BPL (Boas Práticas de Laboratório)-GLP- ISO17025
Por que validar?A validação visa diminuir ou controlar os fatores que
levam a imprecisão ou inexatidão de um dado gerado.
Erros sistemáticos:
São erros que a princípio pode-se “aliviá-los nas medidas”,
ou seja, eliminá-los ou aplicar fatores de correção, desde
que constantes. Ex: erros instrumentais, erros devido à
presença de impurezas, erros de operação, erros pessoais,
erros de método.
Erros indeterminados:
São erros devido a variações ao acaso, de causas não
conhecidas exatamente, em geral irregulares e pequenas e
de difícil controle do operador como: umidade,
temperatura, iluminação, etc.
Parâmetros avaliados em validação de métodos
• Precisão
• Exatidão
• Linearidade
• Recuperação
• Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação
(LOQ)
• Especificidade
• Robustez
• Estabilidade do analito
PrecisãoA precisão é o parâmetro que avalia a proximidade entre
várias medidas efetuadas em uma mesma amostra.
A medida de precisão deve levar em conta: condições de
repetibilidade e/ou reprodutibilidade
Condições de repetibilidade: são condições em que resultados
independentes são obtidos usando:-o mesmo método;-para a mesma amostra;-o mesmo operador;-o mesmo laboratório;-usando o mesmo equipamento;-em um curto intervalo de tempo
Condições de reprodutiblidade: são condições onde resultados são obtidos usando:
-o mesmo método;-para a mesma amostra;-em diferentes laboratórios;-por diferentes operadores;-usando equipamentos diferentes.
ExatidãoA exatidão é a diferença entre o valor real presente na
amostra e o valor obtido na análise. É avaliada
através da inexatidão, ou seja, o afastamento entre os
valores esperado e obtido.
Exatidão x precisão
Linearidade
A linearidade é a capacidade de um método analítico gerar
resultados proporcionais à concentração da espécie em
análise, dentro de uma faixa analítica especificada. A
linearidade é determinada pela análise de uma série de
calibradores (amostras adicionadas com diversas
concentrações conhecidas do analito), abrangendo a faixa
de concentração de interesse no trabalho. Com essas
análises realiza-se a curva de calibração.
RecuperaçãoA recuperação avalia a eficiência do método de tratamento da
amostra. Toda amostra que recebe tratamento de análise
indireta (extração) deve ter calculado experimentalmente a
perda do analito decorrente desse tratamento. A recuperação
expressa a variação de resposta obtida entre a quantidade de
analito adicionada antes da extração e aquela decorrente da
adição da mesma quantidade do analito após o processo de
extração.
LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO
Limite de detecção (LOD) é a menor concentração ou
quantidade de uma substância (analito) que pode ser
identificada por um método analítico com um nível de
confiança especificado ou ainda, que pode ser
estatisticamente diferenciada do ruído.
Limite de quantificação (LOQ) é a menor concentração do
analito que pode ser quantificada com uma precisão
especificada.
SensibilidadeA sensibilidade de um método indica sua capacidade de
discriminar, com uma fidelidade estabelecida,
concentrações próximas de um analito.
Sensibilidade ≠ LOD
SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE
A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar o analito na presença de outras substâncias prováveis de interferirem na determinação.
O termo especificidade se refere a um método específico para um único analito, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.
RobustezA robustez é a capacidade do resultado de um método
permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura do ambiente, pH, concentração da fase móvel (HPLC), materiais de diferentes procedências etc.
EstabilidadeA estabilidade da substância em teste poderá ser feita
em relação a matriz de trabalho nas seguintes condições:
Durante armazenamento-temperatura ambiente-temperatura de geladeira (4°C)-temperatura de congelamento (-20°C)Ciclos de congelamento e descongelamento (3ciclos)Após a extração