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VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
NORMA ISABEL GALEANO ROJAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007
2
VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
NORMA ISABEL GALEANO ROJAS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
4
VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
NORMA ISABEL GALEANO ROJAS
APROBADO
______________________________ ____________________________
Viviana Peña Paez, Cindy Fernández, Microbióloga Industrial Microbióloga Industrial
DIRECTOR ASESOR ______________________________ ____________________________
Gineth Fajardo, Jeinny Romero, Microbióloga Industrial Microbióloga Industrial
JURADO JURADO
5
VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
NORMA ISABEL GALEANO ROJAS
APROBADO
______________________________ ______________________________ Angela Umaña Muñoz. M. Phil. David Gómez Mendez M. Sc. DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
6
A Dios y
A mis padres por su apoyo y amor incondicional.
7
AGRADECIMIENTOS
A Viviana Peña, directora del trabajo por su tiempo, colaboración, apoyo y
compromiso durante la ejecución del proyecto, al igual que por su amistad.
A Cindy Fernández por su compromiso, responsabilidad, y aportes realizados para
la elaboración de éste trabajo de grado
A la Doctora Blanca Cecilia Suárez, gerente de AQM Ltda., por el préstamo de las
instalaciones y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo.
A AQM Ltda., especialmente al área de microbiología por su colaboración y apoyo.
viii
TABLA DE CONTENIDO
PÁG1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEORICO 2
2.1. VALIDACIÓN 2
2.1.1. Protocolo de validación 4
2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN 5
2.1.2.1. Validación prospectiva 5
2.1.2.2. Validación concurrente 5
2.1.2.3. Validación retrospectiva 5
2.1.2.4. Revalidación 6
2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE
METODOLOGIAS
6
2.1.3.1. Precisión 6
2.1.3.2. Especificidad 7
2.1.3.3. Selectividad 7
2.1.3.4. Exactitud 7
2.1.3.5. Límite de detección 7
2.1.3.6. Límite de cuantificación 7
2.1.3.7. Linealidad 8
2.1.3.8. Robustez 8
2.1.4. CALIFICACIÓN 8
2.1.4.1. Tipos de calificación 8
2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ 8
2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ 9
2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ 9
ix
2.2. FILTROS DE MEMBRANA 10
2.2.1. Tipos de filtros de membrana 11
2.2.1.1. Filtros de profundidad 11
2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana 12
2.2.1.2.1. Membrana nitrato de celulosa 13
2.2.1.2.2. Membrana de acetato de celulosa 14
2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD 16
2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO 16
2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato 16
2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja 18
2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para la filtración por membrana 19
2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 20
2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo 20
2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios,
anaerobios y hongos
20
2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD 22
2.3.3.1. Filtración por membrana 22
2.3.3.2. Inoculación directa 24
2.3.4. Interpretación de resultados 25
2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo 28
2.4. ESPECTROFOTOMETRÍA 31
2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción: Ley de Beer-
Bouguer-Lambert
31
2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotométricos 32
2.4.2.1. Curvas espectrales 32
2.4.2.2. Curvas de calibrado 32
3. JUSTIFICACIÓN 33
x
4. OBJETIVOS 35
4.1. Objetivo general 35
4.2. Objetivos específicos 35
5. MATERIALES Y MÉTODOS 36
5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN 36
5.1.1. Población de estudio y muestra 36
5.1.2. Materiales utilizados durante la validación 37
5.1.2.1. Pruebas preliminares 37
5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 37
5.1.2.1.2. Prueba de promoción de crecimiento 38
5.1.2.2. Técnica de filtración por membrana 38
5.1.2.2.1. Controles para el proceso 38
5.1.2.2.2. Control negativo 38
5.1.2.2.3. Filtración por membrana 39
5.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN 40
5.2.1. Recopilación de la información 40
5.2.2. Calibración y mantenimiento de los equipos 41
5.3. Pruebas preliminares 41
5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42
5.3.2. Prueba de promoción de crecimiento 42
5.4. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA
PRUEBA DE ESTERILIDAD
45
6. RESULTADOS 50
6.1. Calibración y mantenimiento de equipos 50
6.2. Pruebas preliminares 51
6.2.1. Prueba organoléptica 51
6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 52
6.2.3. Prueba de promoción de crecimiento 52
6.2.3.1. Método turbidimétrico 56
6.3. Técnica de filtración por membrana utilizada en la prueba de esterilidad 80
xi
6.3.1. Controles para el proceso 80
6.3.1.1. Control ambiental y de personal 80
6.3.1.2. Control negativo de la prueba 81
6.3.2. Técnica de filtración por membrana 81
6.3.3. Líquido filtrado 84
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 87
8. CONCLUSIONES 94
9. RECOMENDACIONES 96
10. BIBLIOGRAFÍA 97
11. ANEXOS 101
xii
LISTA DE TABLAS
PÁG
Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato 17
Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja 18
Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la
prueba de promoción de crecimiento
20
Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para técnica de
filtración por membrana
23
Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria
farmacéutica 30
Tabla Nº 6. Límites microbiológicos para el área aséptica manejados por
AQM Ltda. 30
Tabla Nº 7. Límites microbiológicos para el control de personal. 30
Tabla Nº 8. Programa de calibración y mantenimiento de los equipos
utilizados en la validación 50
Tabla Nº 9. Análisis organoléptico de los medios de cultivo 51
Tabla Nº 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de
cultivo líquidos 52
Tabla Nº 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promoción de
crecimiento 52
Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento
para medios de cultivo líquidos en los tres ensayos realizados 55
Tabla Nº 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium
sporogenes en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometría
56
Tabla Nº 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium
sporogenes en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante
espectrofotometría
58
Tabla Nº 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus
aureus en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometría
60
xiii
Tabla Nº 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus
aureus en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante
espectrofotometría
62
Tabla Nº 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas
aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometría
64
Tabla Nº 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas
aeruginosa en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante
espectrofotometría
66
Tabla Nº 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 68
Tabla Nº 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en
medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría 70
Tabla Nº 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans
en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 72
Tabla Nº 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans
en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría 74
Tabla Nº 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría 76
Tabla Nº 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en
medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría
78
Tabla Nº 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de
esterilidad 80
Tabla Nº 26. Resultados del control de personal durante la prueba de
esterilidad 80
Tabla Nº 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la técnica de
filtración de membrana durante los 5 montajes realizados.
81
Tabla Nº 28. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 1, abril 14 de 2007 81
Tabla Nº 29. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 2, abril 21 de 2007 82
xiv
Tabla Nº 30. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 3, abril 28 de 2007 82
Tabla Nº 31. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 4, mayo 12 de 2007
83
Tabla Nº 32. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 5, mayo 19 de 2007 84
Tabla Nº 33. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del
líquido filtrado del montaje 1 84
Tabla Nº 34. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del
líquido filtrado del montaje 3 85
Tabla Nº 35. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del
líquido filtrado del montaje 5 86
xv
LISTA DE FIGURAS
PÁG
Figura Nº 1. Filtro de profundidad 12
Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana 12
Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa 13
Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa 15
Figura Nº 5. Medio Fluido de Tioglicolato 17
Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja 18
Figura Nº 7. Equipo de filtración 23
Figura Nº 8. Interpretación del ensayo de esterilidad. 27
Figura Nº 9. Validación de procedimientos. 40
Figura Nº 10. Pruebas preliminares 41
Figura Nº 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42
Figura Nº 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de
promoción de crecimiento.
43
Figura Nº 13. Prueba de promoción de crecimiento. 45
Figura Nº 14. Controles para el proceso en la técnica de filtración por
membrana.
48
Figura Nº 15. Control negativo de la técnica de filtración por membrana. 48
Figura Nº 16. Técnica de Filtración por membrana. 49
Figura Nº 17. Bacillus subtilis en agar Casoy 53
Figura Nº 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy 53
Figura Nº 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy 54
Figura Nº 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy 54
Figura Nº 21. Candida albicans en agar HC 54
Figura Nº 22. Aspergillus niger en agar HC 55
Figura Nº 23. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio
Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
57
Figura Nº 24. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio
Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
59
xvi
Figura Nº 25. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio
Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
61
Figura Nº 26. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio
Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
63
Figura Nº 27. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio
Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
65
Figura. Nº 28. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio
Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de
crecimiento
67
Figura Nº 29. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Fluido de
Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento 69
Figura Nº 30. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Digerido
Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento 71
Figura Nº 31. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Fluido de
Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento 73
Figura Nº 32. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Digerido
Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento 75
Figura Nº 33. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Fluido de
Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento
77
Figura Nº 34. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Digerido
Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento 79
xvii
RESUMEN
La validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa
en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad tuvo como
propósito la eficacia de los filtros de membrana para optimizar esta técnica en el
laboratorio de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., siguiendo los
parámetros establecidos por la USP 29 y basándose en la necesidad de realizar un
montaje que garantice resultados confiables y la disminución de los riesgos de
repetición que aumentan el tiempo de análisis y los costos.
Al inicio de la validación se verificó la calibración y mantenimiento de los equipos
para así garantizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos.
Luego se realizaron las pruebas preliminares en las cuales se evaluó la calidad de
los medios de cultivo Fluido de tioglicolato, Digerido caseína-soja, agar Casoy y
agar HC. Se verificó en los medios de cultivo líquidos que contienen los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos mediante la prueba de
promoción de crecimiento inoculados con cepas ATCC de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Bacillus
subtilis y Aspergillus niger; estos resultados se complementarón por
espectrofotometría determinando para cada microorganismo su curva de
crecimiento en un tiempo de 100 horas.
Después de obtener resultados satisfactorios en las pruebas preliminares que
indican la ausencia de resultados falsos negativos o positivos, se realizó la
metodología de filtración por membrana en la cual se determinó la retención de los
microorganismos contaminantes en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un
tamaño de poro de 0,45 µm.
Con los resultados obtenidos se ajustó el procedimiento de la prueba de esterilidad
mediante la técnica de filtración por membrana para el laboratorio AQM Ltda., como
fundamento para obtener resultados confiables, oportunos y con calidad que logren
la satisfacción del cliente.
xviii
ABSTRACT
The validation of the microbial retention in the cellulose acetate filters and cellulose
nitrate filters in the filtration technique used in sterility testing had the purpose to
verified the effectiveness of membrane filters to optimize this technique in the
laboratory Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., following the established
parameters by the USP 29 and based on the necessity to do a test with guarantee of
reliable results, and the diminution of repetition risk which increases the analysis
time and the cost.
At the beginning of the validation the machine calibration and maintenance was
verified to guarantee the process and results.
Later the preliminaries tests was done to evaluate the quality of media, Fluid
Thioglycolate medium, Soybean-casein digest medium, Casoy agar and HC agar.
For the liquid media it was observed they had the necessary nutrients for the growth
of microorganism by the growth promotion test inoculating microorganisms ATCC of
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes,
Candida albicans, Bacillus subtilis y Aspergillus niger. Furthermore this test
complemented by spectrofotometric method determining for each microorganism its
growth curve in a time of 100 hours.
After obtaining satisfactory results in the preliminary test that indicated the lack of
false negative or false positive results, the membrane filtration methodology was
done which determined the satisfactory retention of microorganism in cellulose
nitrate filters and cellulose acetate filters with a pore size of 0,45 µm.
With the results was fitted the process of sterility testing by membrane for the
laboratory AQM Ltda., like fundament to obtain reliable results with quality to obtain
the client satisfaction.
1
1. INTRODUCCIÓN
El control de calidad de productos farmacéuticos garantiza la seguridad y eficacia de
cada uno, certificando que estos cumplen con los parámetros y normas reguladas
por organizaciones nacionales e internacionales. Estas especificaciones constituyen
un elemento importante para asegurar la calidad de los productos y sirven de base
para el análisis de éstos en el laboratorio.
Este control de calidad se debe realizar desde el inicio, durante y al final de la
elaboración del producto para asegurar que el proceso se ha realizado bajo estrictas
normas y controles. Al final del proceso de producción se deben realizar pruebas
microbiológicas de acuerdo a la naturaleza y finalidad del producto, dentro de estas
se encuentra la prueba de esterilidad, la cual demuestra la calidad de un producto
referido a la ausencia de contaminantes microbianos, permitiendo su uso para
humanos y animales sin ningún riesgo de infección.
Dada la necesidad de optimizar la técnica para desarrollar la prueba de esterilidad,
obtener resultados confiables, realizar un buen montaje que garantice los
resultados, la disminución de los riesgos de repetición que aumentan el tiempo de
análisis y la reducción de costos, este proyecto que tiene como finalidad validar la
retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la
técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, y así asegurar que
la efectividad de la filtración como principal proceso de esta técnica en el laboratorio
de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., logre obtener resultados
confiables, oportunos y con calidad para la satisfacción del cliente.
2
2. MARCO TEORICO
2.1. VALIDACIÓN
Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia
documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y
permanente productos que reunirán las características de calidad predefinidas.
(CORTES, A. et al. 2003) Mediante el proceso de validación se demuestra que el
método es lo suficientemente fiable para producir el resultado; proporcionando
confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico, así como
también en la calidad de los resultados. (GARCIA, et al. 2005)
La validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante
estudios de laboratorio, que las características de desempeño del método cumplen
los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas (USP 29, 2006); teniendo
como objetivo confirmar y documentar que los resultados producidos son confiables.
(CORTES, A. et al. 2003)
El principal objetivo de una validación analítica es asegurar que el procedimiento
analítico seleccionado va a dar resultados reproducibles y confiables que son
adecuados para el propósito deseado. De esta manera es necesario definir
apropiadamente las condiciones en las cuales va a ser realizado el procedimiento y
su objetivo. Estos objetivos aplican a todos los procedimientos descritos o no en una
Farmacopea los cuales son usados en una compañía manufacturera. (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1997)
Igualmente establece las características de desempeño y las limitaciones de un
método, la identificación de variables que influyen y pueden cambiar estas
características determinado hasta que punto pueden ser cambiadas. (FDA, 2005)
Para llevar a cabo una validación se debe tener clara la metodología analítica, la
cual va de lo general a lo particular, se inicia con la valoración de la técnica, que es
el principio científico que puede ser útil para suministrar información sobre la
composición de una muestra; seguida del método que es la adaptación de la técnica
3
para un propósito específico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito
en un procedimiento y finalmente a partir de la información recopilada se obtiene el
protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas
que deben seguirse si se quiere que los resultados analíticos se acepten, este es la
evidencia objetiva de la validación. (BARRAGÁN y GARCÍA, 2001)
Dentro de un proceso de validación se deben validar:
- Método analítico en el cual se evalúan y analizan parámetros como
sensibilidad, exactitud, linealidad, selectividad, etc.
- Sistema analítico incluye instrumentos, ordenador y método, con este se
concluye que el conjunto funciona como se espera.
- Análisis de la muestra donde se evidencia por medio de la documentación la
comprobación de los datos primarios. (USP 29, 2006)
La importancia de la validación radica en la obtención de métodos estándar los
cuales son parte integral del sistema de calidad de un laboratorio. Los métodos
estándar son usados siempre que sea posible a menos que se especifique su no
uso. (FDA, 2005)
Además tiene ventajas como la optimización y estandarización de los procesos, el
incremento de la productividad, la reducción de costos, la reducción de la
probabilidad de fallas en el proceso y así la reducción de repeticiones y rechazos.
Para realizar validaciones en microbiología es importante:
- Conocer los métodos compatibles con los requerimientos, la compatibilidad
de los métodos es revisada y confirmada por comparación con
requerimientos típicos para realizar la prueba.
- Incluir un medio control sin inocular para evaluar la contaminación a partir del
laboratorio y no de la prueba. Este control es considerado un blanco y no
muestra crecimiento.
4
- Preparar y analizar visualmente controles positivos y negativos. Un control
negativo no presenta crecimiento y el control positivo muestra crecimiento
microbiano.
- Evaluar interferencias. Esto asegura la selectividad y la especificidad del
método.
- Realizar documentación de la validación. (FDA, 2005)
De esta forma después de la validación se demuestra que el laboratorio es capaz de
repetir con un nivel aceptable de ejecución el método estándar. Esto en condiciones
específicas establecidas por el método, además de la demostración de exactitud y
precisión o de otros parámetros dependiendo el tipo de método. (FDA, 2003)
2.1.1. Protocolo de validación
Los protocolos de validación incluyen la definición clara del sistema a validar, la
identificación de las variables operativas y los probables parámetros de control. En
ellos se describe el proceso a validar, los objetivos de la validación, los métodos y el
personal responsable de la validación, además de indicar el número de réplicas que
se consideran adecuadas para la evaluación de un determinado parámetro para que
los resultados sean estadísticamente confiables. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
Dentro de un protocolo de validación también se encuentra el procedimiento
operativo estándar (POE) del sistema validado, donde se describe el procedimiento
de cómo deben realizarse determinados métodos analíticos, cómo deben manejarse
los instrumentos o realizarse otras actividades de laboratorio cuyo seguimiento
puntual es de obligatorio cumplimiento. (MEDINA y QUINTANA, 2002)
Los laboratorios documentan sus protocolos, las características y medidas de
ejecución y los límites aceptables para la validación de sus métodos. La magnitud
de la validación depende de las limitaciones que se imponen como lo son el tiempo,
el costo, la cantidad de muestras o estándares, el uso posterior del método o el tipo
de información (cuantitativa, cualitativa).
5
De esta forma la buena documentación es una parte esencial del sistema de
garantía de calidad y por lo tanto es importante en un proceso de validación.
2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN 2.1.2.1. Validación prospectiva
Se basa en la información obtenida antes de implantar el proceso de validación.
Utiliza información generada durante todas las etapas de desarrollo del proceso y se
puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad que un proceso específico producirá
consistentemente una forma farmacéutica que lleva las especificaciones
predeterminadas y los atributos de calidad y que se basa en el análisis de los datos
obtenidos a través del diseño y desarrollo de un protocolo de validación.
(HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.2. Validación concurrente
La información se obtiene durante la implementación del proceso, se debe tener en
cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que demuestre que el
proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en
estado productivo. (CORTES, A. et al. 2003)
Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá
consistentemente una forma farmacéutica que lleva las especificaciones
predeterminadas y atributos de calidad y que se sustentan en datos o información
obtenidos a partir de un proceso que se encuentra en marcha o en el cual se haya
introducido alguna variación. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.3. Validación retrospectiva
Es aquella donde se trabaja con los antecedentes históricos, obtenidos a partir de
registros del proceso y control de calidad. Con esta recopilación de datos históricos
6
se obtiene documentación útil para la determinación de la reproducibilidad de dicho
proceso. Por esto, para la obtención de información no es necesario aplicar ensayos
analíticos o supervisión del proceso en forma explícita. (GONZALES, 2005)
Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá
consistentemente una forma farmacéutica que lleva las especificaciones
predeterminadas, atributos de calidad y que se sustenta en el análisis de datos de
lotes que han sido elaborados con anterioridad. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.4. Revalidación
Este tipo de estudio se utiliza cuando se ha introducido alguna variable en algún
procedimiento o metodología ya validado anteriormente, por lo que se alteran las
características finales. (GONZALES, 2005)
2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS
No todas las características analíticas son aplicables a todos los procedimientos o a
todos los materiales; depende del objetivo requerido.
2.1.3.1. Precisión
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando
se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del
mismo lote de material homogéneo. (USP 29, 2006) El parámetro estadístico que
caracteriza a este estudio es la desviación estándar o preferiblemente el coeficiente
de variación (desviación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la
incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que
corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y
GONZÁLES, 1996)
Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del método
analítico en condiciones normales de operación. (USP 29, 2006)
7
Reproducibilidad es la medida de la precisión de los resultados de ensayos
realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes
analistas, en días diferentes y con diferentes instrumentos.
Repetibilidad: refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las
mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista,
en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma
sesión de trabajo en un período corto. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996)
2.1.3.2. Especificidad
Es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el compuesto de interés en
presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como
impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. (USP 29, 2006)
2.1.3.3. Selectividad
Un método selectivo aporta resultados para todos los analitos de interés, mientras
que uno específico produce resultados exactos para un analito, al tiempo que los
otros analitos de interés se pueden interferir los unos con los otros. (CORTES, A. et
al. 2003)
2.1.3.4. Exactitud
Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos
posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio,
la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (CASTILLO Y
GONZÁLES, 1996)
2.1.3.5. Límite de detección
Es la cantidad mínima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no
necesariamente detectarse, en las condiciones experimentales indicadas.
2.1.3.6. Límite de cuantificación
Es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se
encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra. Es la mínima
8
cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y
exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. (USP 29, 2006)
2.1.3.7. Linealidad
Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente
proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un intervalo definido. Se
determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el
análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. (CASTILLO Y
GONZÁLES, 1996)
2.1.3.8. Robustez
Es la medida de la capacidad del método para no resultar afectado por pequeñas
pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proporciona una
indicación de su confiabilidad durante su uso normal. (USP 29, 2006)
2.1.4. CALIFICACIÓN
Consiste en la realización de pruebas que determine si un componente de un
proceso de fabricación posee los atributos requeridos para obtener un producto con
una calidad determinada. (JAIME, 2002)
2.1.4.1. Tipos de calificación 2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ
Verificación documentada de que todos los aspectos claves de la instalación están
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y corresponden a las
especificaciones aprobadas en el diseño. (CORTES, A. et al. 2003)
Se incluyen todos los equipos, instrumentos y aparatos que son utilizados en
proceso productivo y en los métodos de análisis. Además es necesario considerar
que éstos se encuentran localizados en instalaciones físicas que deben ser
evaluadas. Otros aspectos son la calibración de equipos y el mantenimiento
preventivo de los equipos.
9
Calibración de equipos: La calibración es la comparación de un estándar de medida
o instrumento de exactitud conocida con otro estándar o instrumento, sirve para
detectar, correlacionar y/o reportar por ajuste cualquier variación en la exactitud del
instrumento que está siendo comparado. (JAIME, 2002)
2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ
Demostrar la efectividad y reproducibilidad del proceso, bajo condiciones normales
de operación y bajo condiciones límite de operación. (JAIME, 2002)
2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ
Verificación de que los equipos funcionan en la forma esperada y son capaces de
operar satisfactoriamente los parámetros operacionales para los que han sido
diseñados. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
10
2.2. FILTROS DE MEMBRANA
Los filtros de membrana son un avance consecuente de los desarrollados por el
premio Nóbel Richard Zsigmondy en 1925. La primera producción comercial en el
mundo se llevó a cabo en Göttingen en 1927, el uso de los filtros de membrana se
conoce desde los años cuarenta, cuando fueron utilizados para el control de agua
potable. (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cerámica y de
ésteres de celulosa. Las membranas están compuestas por ésteres de celulosa
biológicamente inertes. Los poros varían desde 0.025 µm a 25 µm de diámetro,
siendo los de 0.22 µm los más utilizados ya que son lo suficientemente pequeños
para retener a todas las bacterias. Dado que las membranas son inertes,
proporcionan un buen medio para retener microorganismos, por ejemplo para
cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen
de líquido.
El mecanismo de acción es bastante simple: retienen todas las partículas que
posean un tamaño mayor que los poros. Estos poros quedan formados por los
espacios que resultan de la superposición de las fibras de las distintas capas que
forman la membrana. Así, algunas partículas de menor tamaño son retenidas por
otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partículas
retenidas previamente. (PEARCE, 2007)
Los filtros de membrana son utilizados para el control microbiológico de diversos
productos, por ello requieren un control de calidad que se obtiene con una excelente
uniformidad de un lote a otro manteniendo una técnica de producción
cuidadosamente elaborada y por controles rígidos como:
a) El examen de la materia prima con cromatógrafo de gas.
b) Control durante el proceso de producción.
c) Control de calidad:
- Comportamiento de autoclavado.
- Punto de burbuja.
d) Control óptico de los rollos de membrana.
11
e) Control microbiológico (Prueba de desafío). (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Para realizar la prueba de esterilidad es necesario usar filtros de membrana con un
tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm y un diámetro de aproximadamente
50mm.
Se utilizan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo
contenido alcohólico y filtros de acetato de celulosa para soluciones con alto
contenido alcohólico. (USP 29, 2006)
Los filtros de membrana con este tamaño de poro han sido reconocidos como un
estándar para el crecimiento de microorganismos. Este tamaño de poro es usado
para recuperar bacterias y otros microorganismos de muchas muestras y ambientes.
(MILLPORE, 2000)
2.2.1. Tipos de filtros de membrana
Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que más se usan son los filtros de
profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana.
2.2.1.1. Filtros de profundidad Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de
vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean
vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes
presentes.
Entre sus ventajas se encuentran su alta capacidad de retención de partículas sobre
su superficie y a través de toda su estructura y que permiten filtrar grandes
volúmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que no presentan un tamaño de
poro uniforme y existe la posibilidad de liberación, hacia el material filtrado, de
partículas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro.
Dadas sus características los filtros de profundidad se usan principalmente como
prefiltros, ya que permiten eliminar las partículas grandes pero no la eliminación total
de los microorganismos.
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
12
Figura Nº 1. Filtro de profundidad.
2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana
Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y
contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que al
conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar
filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una
solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través
de ellos es lenta. Para la filtración esterilizante se pueden usar combinaciones de un
filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro de
0.22µm. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en
autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo. http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana
13
2.2.1.1. Membrana de nitrato de celulosa
La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricación de
filtros de membrana.
Estas membranas son de naturaleza hidrofílica, con una microestructura muy
uniforme lo que permite excelentes niveles de retención de partículas y un
comportamiento perfecto en pruebas microbiológicas. En esos casos pueden ser de
utilidad membranas cuadriculadas con el fondo de color verde o negro, así mediante
contraste, mejorar la visualización y el conteo de colonias.
Otra característica importante de estas membranas es su elevada adsorción. Por
ello, y en combinación con papeles de cromatografía FILTERLAB serie PC están
especialmente indicados en procedimientos de identificación de los componentes en
muestras de ácidos nucleicos y proteínas mediante técnicas de transferencia.
http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente
retención y un óptimo crecimiento microbiológico en muestras de agua, bebidas,
fármacos. (PEARCE, 2007)
Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa Fuente: www.whatman.com
14
Aplicaciones de los filtros de nitrato de celulosa
Filtración de aguas.
Análisis microbiológico.
Análisis gravimétricos.
Análisis cualitativos de partículas.
Esterilización de muestras.
Determinación de proteínas.
Identificación de ácidos nucleicos.
Prefiltración de muestras.
Clarificación de muestras.
2.2.1.2. Membrana de acetato de celulosa
Los filtros de membrana de celulosa son de naturaleza hidrofílica. Presentan una
excelente estabilidad térmica y una bajo nivel de adsorción, por lo que son
especialmente indicados para la esterilización de soluciones biológicas., además
estas membranas permiten gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo,
por lo que resultan apropiados para la esterilización y clarificación de soluciones
acuosas, alcohólicas y aceites.
Es un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad
química frente a soluciones acuosas con pH entre 4 y 8, la mayoría de los alcoholes,
hidrocarburos y aceites. El tamaño de poro en la superficie de la mayoría de las
membranas es altamente uniforme, existen de 0.20, 0.45, 0.65 y 0.80µm, en color
blanco, con superficie lisa y no estéril. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
Las partículas más grandes que el tamaño del poro son rechazadas por la superficie
de la membrana y el remanente permanece o se concentra allí. El volumen del fluido
y otras partículas finas de menor tamaño del poro pueden pasar a través de la
membrana al sitio de filtrado. (PEARCE, 2007)
15
Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa Fuente: Levy R. y Jornitz M., 2006.
Aplicaciones
Filtración de muestras de aguas.
Esterilización de muestras de proteínas.
Esterilización de fluidos biológicos.
Filtración de alcoholes.
Filtración de aceites.
16
2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD
Se puede definir esterilidad como la total ausencia de toda vida viable. A partir de
1940 la definición de esterilidad aplicada a las industrias farmacéuticas fue
“incapacidad de un producto de generar turbidez al ser adicionado a un medio de
crecimiento estéril.” (ALLISON, 1999)
La prueba de esterilidad es básicamente una prueba en la cual se evalúa si un
producto médico o farmacéutico esterilizado está libre de microorganismos
contaminantes, mediante la incubación de todo o parte del producto con un medio
nutritivo. (HUGO y RUSSEL 1998) En esencia, se añade una muestra del material a
analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de signos de
crecimiento. Si existe crecimiento, se supondrá que la contaminación procede de la
muestra que, por tanto, no pasará la prueba. (HUGO y RUSSEL, 1998)
El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento
para valorar la ausencia/presencia de microorganismos aerobios y anaerobios
viables (bacterias, hongos y levaduras) (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002); en
sustancias, preparaciones y objetos que según la farmacopea deben ser estériles.
Las Farmacopeas y las autoridades reguladoras exigen que el nivel de garantía de
esterilidad para los productos esterilizados acabados sea de 10-6 o superior. Esto
significa que la probabilidad de que un producto seleccionado al azar a partir de un
lote no sea estéril debe ser inferior a 1 en 1 millón. (HUGO y RUSSEL 1998)
2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO
Según la USP 29, 2006 los siguientes medios de cultivo son adecuados para la
prueba de esterilidad.
2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato
Se utiliza principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo
también detecta bacterias aerobias.
17
Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato
L-cisteina 0.5 g
Cloruro de sodio 2.5 g
Dextrosa 5.5 g
Extracto de levadura (soluble en agua) 5.0 g
Digerido pancreático de Caseína 15.0 g
Tioglicolato de sodio o Ácido tioglicólico 0.3 mL
Rezarsurina sódica 1.0 mL
Agua purificada 1000 mL
Fuente: USP 29, 2006
Después de la esterilización, el pH del medio debe ser de 7,1 +/- 0,2. El Medio
Fluido de Tioglicolato debe incubarse a 32,5 +/- 2,5 º.
Figura Nº 5. Medio Fluido Tioglicolato.
Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.
Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteina, los cuales proporcionan una
anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. La elevada viscosidad
del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno. El eventual
aumento del contenido en oxígeno se pone de manifiesto por un viraje a rojo del
indicador redox Resarzurina sódica. (MERCK, 1998)
La dextrosa, peptona, L-cisteina, y el extracto de levadura proveen los factores de
crecimiento necesarios para la replicación de los microorganismos. El cloruro de
sodio da iones esenciales. El tioglicolato de sodio es un agente reductor que
previene la acumulación de peróxidos que son letales para los microorganismos.
18
Después de incubación, el crecimiento es evidente por la presencia de turbidez
comparada al control sin inocular. Los aerobios estrictos tienden a crecer en la
superficie del medio, los anaerobios obligados pueden crecer solamente en la
porción del medio por debajo de la parte oxidada. (ZIMBRO y POWER, 2003)
2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja
Este medio es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias
aerobias. Es un medio de cultivo versátil y altamente nutritivo que se recomienda
para el crecimiento de hongos y levaduras.
Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja
Digerido Pancreático de Caseína 17.0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja 3.0 g
Dextrosa 2.5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2.5 g
Agua purificada 1000 mL
Fuente: USP 29, 2006
Después de la esterilización, el pH debe ser de 7,3 +/- 0,2. El Medio de Digerido
Caseína-Soja debe incubarse a 22,5 +/- 2,5 º.
Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja
Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.
19
El digerido pancreático de caseína y el digerido papaínico de harina de soja proveen
aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas. La dextrosa es una fuente de energía.
El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico, y el fosfato dibásico de potasio
actúa como buffer para controlar el pH. (ZIMBRO y POWER, 2003)
2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para filtración por membrana
Estas soluciones son empleadas para disolver y acondicionar la muestra a evaluar e
inhibir sustancias bacteriostáticas y fungistáticas que puedan contener la muestra.
(USP 29, 2006)
Los líquidos contienen digerido péptico de tejido animal, que provee una fuente de
nitrógeno para los microorganismos. (ZIMBRO y POWER, 2003)
Liquido A
Contiene digerido péptico de tejido animal en una concentración de 1g/L y un pH de
7,1 +/- 0,2. Se utiliza para sustancias líquidas miscibles en agua. (USP 29, 2006)
Es un diluyente general o solución de lavado utilizado para evaluar antibióticos y
sustancias que contienen preservativos. (MILLPORE, 2005)
Líquido D
Contiene digerido péptico de tejido animal y tween 80 en una concentración de
1ml/L y un pH de 7,1 +/- 0,2 se usa este líquido para artículos que contengan
lecitina o aceite. (USP 29, 2006)
Los líquidos A y D ayudan en el completo enjuague de los filtros de membrana y no
son tóxicos para los microorganismos. Además el tween 80 actúa como un
surfactante para romper la lecitina o aceites presentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)
Líquido K
Contiene digerido péptico de tejido animal, extracto de carne bovina y tween 80, con
un pH de 6,9 +/- 0,2. (USP 29, 2006)
Es generalmente utilizado como solución de lavado cuando se evalúan sustancias
que contienen petrolato. (MILLPORE, 2005)
20
2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo
Se confirma la esterilidad del medio para cada partida de esterilización, incubando
una porción del medio a la temperatura de incubación especifica, durante 14 días.
No se debe producir crecimiento de ningún organismo. (USP 29, 2006). Estos
medios sirven como controles negativos durante la realización de la prueba de
esterilidad.
2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios, anaerobios y hongos
Se evalúa cada lote de medio preparado o cada lote de medio deshidratado, para
garantizar que el medio de cultivo contiene los nutrientes necesarios para promover
el crecimiento de microorganismos presentes en el producto y para demostrar que
este medio puede sostener el crecimiento de los contaminantes habituales para los
que está diseñado. (HUGO y RUSSEL, 1998)
Para realizar esta prueba se debe inocular cada medio con un número pequeño (no
más de 100 UFC) de los microorganismos viables (ver tabla Nº 6) e incubarlos
durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5 días en el
caso de hongos. Los medios son adecuados (prueba satisfactoria) si se produce un
crecimiento claramente visible de los microorganismos. (USP 29, 2006)
Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la prueba de
promoción de crecimiento. Fuente: USP 29, 2006
Medio de cultivo Microorganismo Cepa Temperatura
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Fluido de
Tioglicolato Clostridium sporogenes ATCC19404
32,5 +/- 2,5º C
Candida albicans ATCC 10231
Bacillus subtilis ATCC 6633
Digerido de
Caseína-Soja Aspergillus niger ATCC 16404
22,5 +/- 2,5º C
21
Para realizar la prueba de promoción de crecimiento se puede emplear el patrón de
McFarland, este patrón es utilizado como estándar de turbidez en la preparación de
suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez son preparados por
la mezcla de químicos que precipitan para formar una solución de turbidez
reproducible. Son realizados adicionando ácido sulfúrico a una solución acuosa de
cloruro de bario, del cual resulta la formación de un precipitado de sulfato de bario.
(ZIMBRO y POWER, 2003)
Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2SO4
0.6M, la turbidez la da el cloruro de bario, el cual va en cantidad creciente mientras
el ácido sulfúrico va disminuyendo la proporción.
Cada uno de los tubos del patrón de acuerdo con la turbidez, representa un número
de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por
recuento de colonias. De esta forma al comparar una emulsión de bacterias con el
tubo del patrón de McFarland que más se asemeje se puede saber
aproximadamente el número de bacterias en la emulsión. (ESCOBAR, 2002)
Igualmente es importante tener en cuenta la recuperación microbiana, ya que esto
va a determinar la cantidad de microorganismos que van a crecer durante la prueba
de promoción de crecimiento y si es o no satisfactoria esta prueba. Las pruebas
microbianas no utilizan células individuales, se recolectan poblaciones de células
para su estudio. Los datos generados en estos estudios son menos variables si las
poblaciones de células son homogéneas. Los cultivos líquidos o los cultivos
confluentes en medios sólidos son más adecuados para la preparación de cultivos
reproducibles.
Las condiciones de recuperación microbiana están dentro de las más cruciales para
calcular con exactitud el número de microorganismos presentes en la solución de
prueba. Se debe considerar el medio de recuperación que permita el crecimiento,
las condiciones de incubación, las condiciones óptimas de crecimiento para así
asegurar el crecimiento completo y resultados reproducibles. (USP 29, 2006)
La prueba de esterilidad es no válida si las pruebas de aptitud no son satisfactorias.
22
2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
2.3.3.1. Filtración por membrana
Esta técnica es recomendada por la mayoría de las Farmacopeas y envuelve la
filtración de fluidos a través de un filtro de membrana estéril, cualquier
microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. También se pueden
analizar sólidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un diluyente
apropiado y procesados por medio de esta técnica. (HUGO y RUSSEL, 1998)
La técnica de filtración por membrana se basa en hacer pasar la muestra a través
de una membrana porosa delgada, elaborada con plástico de celulosa inerte, los
poros son de tamaño uniforme lo suficientemente pequeños para retener los
microorganismos. (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Esta técnica involucra la filtración a través de una membrana la cual se coloca en el
equipo de filtración, donde los microorganismos son atrapados en la superficie del
filtro. Después de lavar el filtro de membrana con el fin de eliminar los residuos de
las sustancias antimicrobianas del producto que puedan inhibir el crecimiento de los
posibles contaminantes, la membrana se transfiere a los correspondientes medios
de cultivo los cuales son incubados a 32,5 +/- 2,5ºC para bacterias en el medio
Fluido de Tioglicolato y para hongos en el medio Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/-
2,5ºC, durante el tiempo apropiado. (HUGO y RUSSEL 1998)
Se debe transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla
asépticamente en dos partes iguales y transferir una mitad a cada uno de los
medios de cultivo e incubar los medios durante no menos de 14 días.
Cuando se obtengan evidencias de contaminación microbiana en algún artículo el
resultado es concluyente para determinar que el artículo no cumple con los
requisitos de la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006)
La membrana debe sostenerse firmemente en una unidad de la filtración que
consiste en una base de apoyo para la membrana, un vaso para el fluido que va a
ser evaluado, un depósito colectivo para el fluido filtrado, y los tubos necesarios o
conexiones. El aparato se diseña de forma que la solución a ser filtrada se puede
23
introducir y filtrarse bajo las condiciones asépticas. Además permite retirar
asépticamente la membrana para transferirla al medio de cultivo o es adecuado para
llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregar el medio.
(AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
Figura Nº 7. Equipo de filtración por membrana.
Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
Existen dos tipos de sistemas de filtración por membrana: el sistema abierto y el
sistema cerrado.
Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para la técnica de
filtración por membrana.
SISTEMA ABIERTO SISTEMA CERRADO
Preparación del material: se debe
esterilizar el equipo junto con los
portafiltros y la membrana.
Preparación del material: si el equipo
es reutilizable se debe esterilizar el
manifold junto con los portafiltros y la
membrana.
Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo
en un área estéril en cabina de flujo
laminar clase 100.
Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo
en un área estéril en cabina de flujo
laminar clase 100.
24
Filtración del producto: se debe abrir
el sistema para adicionar la muestra.
(Momento en que puede presentarse
contaminación de la muestra).
Filtración del producto: no hay
manipulación de la muestra.
Adición de la membrana al medio de cultivo: se debe desmontar el equipo y
cortar la membrana por mitad para
adicionarla a los medios de cultivo.
Adición de la membrana al medio de cultivo: no hay contacto en ningún
momento con la membrana ni
manipulación, se adiciona el producto y
el medio de cultivo, para su posterior
incubación.
Fuente: Catalogo Sartorius. Sterility Testing System.
2.3.3.2. Inoculación directa
En condiciones asépticas se transfiere directamente en los medio de cultivo (Fluido
de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja) la cantidad apropiada de producto a
examinar, de modo que el volumen del producto no sea mayor de 10% del volumen
del medio, a menos que se indique algo diferente.
Se incuban los medios por no menos de 14 días a la temperatura adecuada,
32,5 +/- 2,5ºC para el medio Fluido de Tioglicolato y para el medio Digerido
Caseína-Soja a 22,5 +/- 2,5ºC. Se observan los medios de cultivo periódicamente
durante el periodo de incubación para determinar la ausencia o presencia de
microorganismos. (USP 29, 2006)
Este método es de elección para dispositivos médicos debido a que estos
dispositivos están en contacto directo con los medios de cultivo durante el periodo
de incubación. De esta forma los microorganismos viables que se pueden encontrar
en un producto después de una inadecuada o defectuosa esterilización tienen un
ambiente ideal donde pueden crecer y proliferar. (RICHTER, 2006)
25
2.3.4. Interpretación de resultados
A intervalos durante el período de incubación y al momento de su finalización,
examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento
microbiano. (USP 29, 2006)
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado
cumple con la prueba de esterilidad.
Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, los microorganismos deben aislarse
e identificarse y el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a
menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas
no relacionadas con el producto examinado. (RICHTER, 2006)
El crecimiento es determinado mediante la observación del medio, el cual es
generalmente claro y transparente, la turbidez en el medio indica el crecimiento
microbiano. Una vez la turbidez es detectada se debe confirmar que es causada por
el crecimiento de microorganismos y no por la desintegración de la muestra.
Algunas muestras producen turbidez cuando son vertidas en los medios o producen
reacciones químicas con los medios de cultivo.
La prueba puede considerarse inválida si se cumple una o más de las siguientes
condiciones:
- los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para la prueba de
esterilidad demuestran una falla.
- Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba revela una
falla.
- Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
- Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la
prueba, el crecimiento de esta especie puede atribuirse de manera
inequívoca a fallas con respecto al material o a la técnica usados al realizar
el procedimiento de la prueba de esterilidad.
Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la
prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba
26
repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no
cumple con la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006) (Ver Figura Nº 8.)
27
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28
2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo
Las áreas limpias para la manufactura y análisis de productos estériles son
clasificadas de acuerdo a las características ambientales requeridas. Cada
operación requiere un nivel de limpieza ambiental apropiado para minimizar los
riesgos de contaminación microbiana en el producto.
Un área limpia o cuarto limpio es un espacio definido en el cual la concentración de
microorganismos en el aire, en superficies y en el personal, se encuentra entre
límites o niveles específicos a una clase.
Para la fabricación normal de productos estériles pueden distinguirse cuatro
calidades de cuartos limpios:
- Grado A: es la zona para operaciones de alto riesgo, tales condiciones son
proporcionadas por un trabajo bajo cámara de flujo laminar.
- Grado B: es el ambiente de los alrededores de la zona A.
- Grado C y D: áreas limpias donde se realizan las fases menos críticas, pero
igualmente importantes, en la fabricación de productos estériles.
Esto es un punto importante que se debe tener en cuenta para que la preparación
de los productos estériles se lleve de una forma controlada, evitando riesgos de
contaminación y garantizando la calidad de estos productos para su
comercialización. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)
Para lograr las condiciones asépticas en la prueba de esterilidad, el entorno de la
prueba tendrá que adaptarse a la manera en que se realice. Se deben tomar
precauciones para evitar la contaminación de modo que no afecte a ningún
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones asépticas
para la ejecución de la prueba deben ser usadas en una cabina de flujo laminar
(cuarto limpio clase A) localizado en un cuarto limpio clase B. (Ver tabla Nº 5)
(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005)
Las condiciones de trabajo en las que se efectúan las pruebas se controlan
regularmente mediante un muestreo adecuado del área de trabajo y la realización
29
de controles adecuados para verificar que estas condiciones sean apropiadas.
(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005) El control microbiológico de las áreas
estériles se puede realizar por diferentes métodos como el método de
sedimentación, el método de impactación utilizando un equipo muestreador de aire y
también por muestreo de superficies. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)
Al realizar los análisis de esterilidad en estas condiciones y con los debidos
controles se reduce la incidencia de resultados falsos positivos debido a
contaminaciones extrañas introducidas durante la realización del análisis. (HUGO y
RUSSEL, 1998)
Las condiciones de trabajo donde se realizó la evaluación práctica, laboratorio de
microbiología de AQM Ltda., presenta especificaciones ambientales establecidas
mediante estudios previos y resultados históricos. (Ver tabla Nº 6)
Debido a que las pruebas de esterilidad constituyen un procedimiento cuya asepsia
debe garantizarse para lograr una interpretación correcta de los resultados, es
importante que el personal esté debidamente entrenado y calificado. (USP 29, 2006)
Es importante que los materiales en los que se va a analizar la esterilidad no sufran
contaminaciones procedentes de los operadores o del ambiente durante la
realización del análisis. (HUGO y RUSSEL 1998)
Por ello, estas pruebas deben llevarse a cabo en laboratorios adecuados y por
personal competente y experto usando técnicas y equipo, lo cual minimiza los
riesgos de contaminación microbiana accidental en las pruebas y en el muestreo
ambiental. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
El personal que ocupa el área aséptica durante la prueba de esterilidad debe llevar
vestimenta estéril. (Ver tabla Nº 7) Igualmente todo el material, equipo y demás
objetos que pueden entran en contacto durante el curso de la prueba deben ser
esterilizados antes de su uso. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
En conclusión el ensayo de esterilidad debe realizarse en condiciones muy estrictas,
respetando las exigencias en cuanto a los procedimientos establecidos por la
Farmacopea.
30
Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria farmacéutica.
Área grado
Denominación US
Nº máximo de partículas/m3
Nº máximo de microorganismos viables/m3
A 100 3530 < 1
B 1000 35300 5
C 10000 350000 100
D 100000 3530000 500
Fuente: USP 29, 2006.
Tabla Nº 6. Límites microbiológicos para el área aséptica manejados por AQM Ltda.
Ambiente del área aséptica Nº máximo de microorganismos viables/placa
Cabina – Clase 1001 < 1
Mesa 5
Sobre cabina 5
Puerta 8 1 Según USP 29, 2006.
Tabla Nº 7. Límites microbiológicos para el control de personal.
Área Nº máximo de microorganismos viables/guante
Clase 100 3
Clase 10000 10
Fuente: USP 29, 2006.
31
2.4. ESPECTROFOTOMETRÍA
Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante
que absorbe un sistema en función de la longitud de onda de la radiación, y a las
mediciones a una determinada longitud de onda.
La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de
cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está
asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de
energía. (FISHER, 1970)
Se puede realizar lecturas espectrofotométricas de diversas sustancias para
determinar parámetros como la absorbancia o la tramitancia, lo mismo que puede
hacerse con una emulsión de microorganismos para determinar así su
concentración.
Un cultivo bacteriano actúa como una suspensión coloidal, porque absorbe o
transmite la luz que pasa a través de él. Dentro de ciertos límites, la luz que pasa
por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de
células que hay en el cultivo. Por lo tanto al aplicar la medida de la transmisión de
los rayos de luz, o la medida del porcentaje de absorción de luz a una suspensión
bacteriana, se puede calcular el número de células presentes. (ESCOBAR, 2002)
Para estas determinaciones se utiliza el espectrofotómetro, instrumento que posee
una fuente de luz monocromática. Esta luz pasa a través de un cultivo bacteriano y
la cantidad de luz reflejada o transmitida es medida.
2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción: Ley de Beer-Bouguer-Lambert
La ley de Beer-Bouguer-Lambert rige las determinaciones espectrofotométricas, en
las cuales al incidir un rayo de luz monocromática sobre un medio absorbente de
luz, la absorbancia por el medio será directamente proporcional a la concentración
de la sustancia responsable de la absorción, al mantenerse constante la intensidad
32
del rayo incidente, la distancia recorrida por el rayo dentro de la sustancia y la
longitud de onda de ésta.
Al incidir un rayo de intensidad, la intensidad que sale del medio se denomina
intensidad transmitida. La relación entre estas dos variables se denomina tramtancia
(T). El logaritmo de la tramitancia multiplicado por menos uno es igual a la
absorbancia (A). (ESCOBAR, 2002)
La forma matemática de la ley de Beer-Bouguer-Lambert, – log T = A, muestra que
log T y A son funciones lineales de la concentración. La representación de log T
frente a la concentración es una línea recta de pendiente negativa, y la
representación de A frente a la concentración es una línea recta de pendiente
positiva. (FISHER, 1970)
2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotométricos 2.4.2.1. Curvas espectrales
Los datos obtenidos mediante espectrofotometría pueden representarse mediante
una gráfica de tramitancia o absorbancia frente a longitudes de onda. Algunas
sustancias exhiben una mayor o menor absorción en una región espectral amplia,
otras pueden mostrar una absorción específica a una longitud de onda
característica. (FISHER, 1970)
2.4.2.2. Curvas de calibrado
Después de determinar la longitud de onda a la cual deben de realizarse las
medidas, se calibra el método midiendo una serie de patrones del constituyente
evaluado. Las medidas de tramitancia (o absorbancia) se realizan comúnmente
ajustando la escala de medida del instrumento a 100% de tramitancia (absorbancia
0) cuando el rayo luminoso pasa a través de un blanco, que debe ser idéntico a la
muestra en todo, excepto que no debe contener el constituyente que se ha de
determinar. (FISHER, 1970)
33
3. JUSTIFICACIÓN
La calidad debe ser garantizada en la producción de medicamentos en la industria
farmacéutica, por lo cual la evaluación de estos productos es de gran importancia
para asegurar su calidad y su uso sin ningún riesgo.
Esta calidad se relaciona con el cumplimiento de las especificaciones, las cuales
comprenden una serie de normas seleccionadas junto con los métodos de análisis
correspondientes, utilizadas para determinar la integridad de los productos y las
materias primas. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997)
Es evidente que los puntos de calidad son características importantes en la
manufactura de los medicamentos, no solamente para el producto sino también en
el hecho que un error puede ser perjudicial para la salud y la vida. Todo esto ha
causado que la industria farmacéutica sea fuertemente regulada sobre la calidad de
los productos a comercializar. Así se dio inicio al concepto de validación como una
medida para asegurar la calidad el producto final. (ALEEM, et al. 2003)
El componente más importante de la garantía de la calidad microbiológica aplicada
tradicionalmente a los productos estériles es el análisis de esterilidad, que asegura
que un producto farmacéutico estéril se encuentra libre de microorganismos
contaminantes. (HUGO y RUSSEL 1998) Para esto se añade una muestra del
material a analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de
signos de crecimiento. (HUGO y RUSSEL 1998). Al ser esta una prueba que
necesita un largo tiempo de análisis, los laboratorios de análisis microbiológicos
enfocados hacia la industria farmacéutica, necesitan establecer un procedimiento
estándar que produzca de forma constante las mismas características y resultados
satisfactorios.
Por lo tanto, la prueba de esterilidad es uno de los pasos más importantes en el
control de un producto farmacéutico estéril, evitando falsos positivos, falsos
34
negativos, fallas en el equipo y errores humanos que pueden costar tiempo, dinero y
fundamentalmente producto. (MILLPORE, 2005)
Las técnicas analíticas de un producto farmacéutico o de ingredientes específicos
sin producto, son necesarias para garantizar la seguridad y eficacia de éstos
durante toda su vida útil, incluyendo su almacenamiento, distribución y uso; esta
evaluación debe ser llevada en concordancia con especificaciones elaboradas y
validadas durante el desarrollo del producto y su análisis. (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1997)
En este trabajo se validó la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de
celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana, esta evaluación se
realizó sin ningún producto específico para que en adelante esta técnica sirva de
soporte para la prueba de esterilidad con diferentes productos farmacéuticos,
controlando las condiciones establecidas por la validación.
El Laboratorio de análisis químico y microbiológico AQM Ltda., diariamente realiza
pruebas de esterilidad donde analiza diversos productos farmacéuticos, por lo tanto
se hace necesario obtener una técnica reproducible y con óptimos resultados. Al
optimizar esta prueba el laboratorio va a obtener resultados precisos y confiables,
disminuyendo el riesgo de equivocación y la repetición de análisis con lo cual
disminuye costos, incrementa la productividad y mejora la calidad del servicio al
cliente.
35
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Validar la retención microbiana en los filtros de membrana de acetato y nitrato de
celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm empleados en la técnica de filtración por
membrana para la prueba de esterilidad.
4.2. Objetivos específicos
Comprobar la retención de microorganismos contaminantes en los filtros de
membrana de 0,45 µm mediante la turbidez de los medios de cultivo líquidos.
Determinar la retención y la recuperación de los microorganismos
contaminantes en los filtros de membrana de acetato y nitrato de celulosa
empleados en la técnica de filtración por membrana.
Confirmar las condiciones del montaje de la técnica de filtración por
membrana siguiendo los parámetros de la USP 29.
Verificar en los medios de cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de
Caseína-Soja la prueba de promoción de crecimiento.
Determinar el tiempo de crecimiento de los microorganismos utilizados en la
prueba de promoción de crecimiento mediante turbidimetría, en los medios
de cultivo líquidos Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja.
Ajustar el procedimiento POSM0017 – P002 “PROCEDIMIENTO PARA LA
REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD” para optimizar el proceso
de la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad en el
Laboratorio AQM Ltda.
36
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Se realizó un estudio experimental donde la validación fue de tipo concurrente ya
que la información se obtuvo durante el proceso, realizando monitoreo de todo el
proceso para verificar que esta bajo control.
Igualmente en la validación se evaluaron parámetros como la linealidad, la precisión
y la especificidad.
5.1.1. Población de estudio y muestra
Se analizaron 6 microorganismos estos son:
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Candida albicans ATCC 10231
Bacillus subtilis ATCC 6633
Aspergillus niger ATCC 16404
Con estos microorganismos se realizó el montaje de la técnica de filtración por
membrana con 5 réplicas para cada microorganismo, realizando cada réplica en 5
días diferentes.
Igualmente se utilizaron dos tipos de membranas de 0,45 µm, los cuales son filtros
de nitrato de celulosa y filtros de acetato de celulosa.
Para la prueba de promoción de crecimiento se utilizaron los 6 microorganismos
mencionados anteriormente y se realizaron 3 réplicas en 3 días diferentes.
La prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realizó 5 veces en días
diferentes, sin ningún microorganismo.
Las cepas de los microorganismos utilizados se encontraban liofilizadas para luego
ser conservadas en cultivos de mantenimiento, sin embargo los microorganismos
viables empleados para la prueba no debían tener más de cinco transferencias
desde el lote original.
37
5.1.2. Materiales utilizados durante la validación
5.1.2.1. Pruebas preliminares
5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
- Medio Fluido de Tioglicolato
- Medio Digerido Caseína-Soja
- Frascos Schott de 250 mL
- Incubadora de 22,5 +/- 2,5ºC
- Incubadora de 32,5 +/- 2,5ºC
5.1.2.1.2. Prueba de promoción de crecimiento
- Agar Casoy
- Agar HC
- Medio Fluido de Tioglicolato
- Medio Digerido Caseína-Soja
- Solución salina
- Cajas de Petri desechables
- Frascos Schott de 250 mL
- Asa curva
- Incubadora de 22,5 +/- 2,5ºC
- Incubadora de 32,5 +/- 2,5ºC
- Tubos de ensayo de 13 X100
- Tubo 0,5 del patrón de Mc Farland
- Pipetas de 2mL
- Anaerogen
- Indicador de anaerobiosis
- Cámara de anaerobiosis
- Láminas
- Colorantes de Gram
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
38
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Clostridium sporogenes ATCC 19404
- Candida albicans ATCC 10231
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Aspergillus niger ATCC 16404
5.1.2.2. Técnica de filtración por membrana 5.1.2.2.1. Controles para el proceso
- Agar Casoy
- Agar HC
- Alcohol al 72 %
- Cajas de Petri desechables
- Muestreador de aire MAS-100
- Cabina de flujo laminar con filtro HEPA.
5.1.2.2.2. Control negativo
- Diluyente D estéril
- Medio Fluido de Tioglicolato
- Medio Digerido Caseína-Soja
- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious
- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore
- Frascos Schott de 250 mL
- Incubadora de 22,5 +/- 2,5ºC
- Incubadora de 32,5 +/- 2,5ºC
- Tijeras estériles
- Pinzas estériles
- Manifold
- Mangueras
- Erlenmeyer con tabuladora lateral
- Vasos de filtración
39
- Tapón
- Bomba de vacío de 420 mmHg.
- Cabina de flujo laminar con filtro HEPA.
- Autoclave
5.1.2.2.3. Filtración por membrana
- Diluyente D
- Medio Fluido de Tioglicolato
- Medio Digerido Caseína-Soja
- Solución salina
- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious
- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore
- Frascos Schott de 250 mL
- Tubos de ensayo de 13 X 100
- Incubadora de 22,5 +/- 2,5ºC
- Incubadora de 32,5 +/- 2,5ºC
- Tijeras estériles
- Pinzas estériles
- Láminas
- Colorantes de Gram
- Manifold
- Mangueras
- Erlenmeyer con tabuladota lateral
- Vasos de filtración
- Tapón
- Bomba de vacío de 420 mmHg.
- Cabina de flujo laminar con filtro HEPA.
- Autoclave
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Clostridium sporogenes ATCC 19404
- Candida albicans ATCC 10231
40
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Aspergillus niger ATCC 16404
5.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN
Figura Nº 9. Validación de procedimientos.
Fuente: CORTES, A. et al. 2003
5.2.1. Recopilación de la información
Se realizó una revisión de los factores que influyen en la validez de la prueba como
lo son técnicas, personal, equipos e instalaciones, controles ambientales, de
personal y sanitización de equipos e instalaciones del área aséptica, reactivos y
medios de cultivo utilizados para la prueba de esterilidad y procedimientos
operativos del laboratorio para el área de microbiología.
VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS
Recopilación de información
Calibración y mantenimiento de equipos
Revisión bibliográfica de la prueba en USP 29
Realización de pruebas preliminares
Realización de la prueba de esterilidad
Reporte de resultados
Optimización de procedimientos POEs
41
PRUEBAS PRELIMINARES
Prueba organoléptica
Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Prueba de promoción de crecimiento
Reportar resultados en formatos respectivos
Reporte de resultados
5.2.2. Calibración y mantenimiento de los equipos
Se verificó que los equipos utilizados en la validación se encontraban funcionando
de la forma esperada dentro de los rangos operacionales para los cuales fueron
diseñados.
Dentro de los equipos utilizados se encuentran:
- Cabina de flujo laminar horizontal del área aséptica
- Bomba de vacío del área aséptica
- Balanza Ohaus
- Autoclave Sterilof
- Incubadoras de 22,55ºC y 32,5ºC.
- Muestreador de aire MAS 100
- Microscopio
- Termómetro de cada incubadora
- Espectrofotómetro
5.3. Pruebas preliminares
Figura Nº 10. Pruebas preliminares
Fuente: USP 29, 2006
Se realizó a cada lote de medio de cultivo preparado una prueba organoléptica
donde se evaluó el color, la textura y aspecto frente a las especificaciones de la
USP 29.
42
5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Esta prueba se realizó a cada lote de medio de cultivo líquido preparado y utilizado
durante la metodología. Este ensayo se realizó 5 veces en días diferentes para
determinar así la esterilidad de los medios de cultivo durante el estudio de
validación.
Figura Nº 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo.
Fuente: USP 29, 2006
5.3.2. Prueba de promoción de crecimiento
Se realizaron 3 repeticiones en 3 días diferentes para garantizar que los medios de
cultivo utilizados durante el estudio contenían los nutrientes necesarios para
promover el crecimiento de los microorganismos evaluados y verificar así la
efectividad de estos medios.
Para realizar esta prueba fue necesario obtener las cepas de los 6 microorganismos
evaluados, los cuales se encontraban en medio de mantenimiento, por lo cual se
realizó una siembra por agotamiento en los medios de cultivo sólidos agar Casoy y
agar HC. Con las cepas obtenidas anteriormente se realizó una suspensión de cada
microorganismo en 10 mL de solución salina según el tubo 0,5 del patrón de Mc
ESTERILIDAD
Se incubaron los medios de cultivo líquidos, Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5 +/-
2,5ºC y Medio de Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/- 2,5ºC durante 14 días.
No crecimiento Crecimiento
Prueba satisfactoria Prueba no satisfactoria
Realizar coloración de Gram
43
Farland el cual corresponde a una concentración de 1X108 UFC/mL. A partir de
cada suspensión se realizaron diluciones hasta 10-6 inoculando 0.1 mL en 9,9 mL de
solución salina obteniendo así una concentración final de 1X102 UFC/ml. (Ver figura
Nº 12)
Figura Nº 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de promoción de
crecimiento.
Después de realizar las diluciones se sembró 0.1mL de la última dilución 10-6 en los
medios de cultivo líquidos (Fluido de Tioglicolato, Digerido Caseína Soja) y sólidos
(Agar Casoy, Agar HC) y éstos se incubaron durante el tiempo adecuado como se
muestra en la figura Nº 13.
En el ensayo 3 de esta prueba se inoculó 0,1mL de la dilución 10-6 de cada
microorganismo en los medios de cultivo líquidos (Fluido de Tioglicolato y Digerido
Caseína- Soja) y se incubaron durante 100 horas para observar su crecimiento
mediante un método turbidimétrico utilizando el espectrofotómetro con una longitud
de onda de 540 nm y haciendo una lectura de porcentaje de Tramitancia. Los
tiempos evaluados fueron 2, 4, 6, 8, 24, 28, 32, 48, 52, 56, 72, 78, 96 y 100 horas.
9,9 mL solución salina
10-2
1X106 UFC/mL
9,9 mL solución salina
10-4
1X104 UFC/mL
9,9 mL solución salina
10-6
1X102 UFC/mL
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
Suspensión del microorganismo según tubo 0,5 patrón Mc Farland 1X108 UFC/mL
44
Los datos de crecimiento obtenidos corresponden al parámetro de linealidad y
fueron analizados mediante el software Validation Manager, versión 2.20L.
PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO
A partir de un cultivo en medio de mantenimiento (Procedimiento para el manejo del
cepario POSM002-P002) se obtuvieron las cepas de los diferentes microorganismos
(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida
albicans, Bacillus subtilis, Aspergillus niger) realizando una siembra por agotamiento en
agar Casoy para bacterias y agar HC para hongos, incubándolos 24 horas a 32,5 +/-
2,5ºC para bacterias1 y 3 días a 22,5 +/-2,5ºC para hongos.
Se realizó una suspensión de cada microorganismo repicado en un tubo con 10 mL de
Solución Salina según el tubo 0,5 del patrón de Mc Farland correspondiente a una
concentración de 1X108UFC/mL.
Se realizaron diluciones hasta 10-6 en tubos con 9.9 mL de solución salina inoculando 0,1 mL de cada suspensión en cada una de las diluciones.
Se sembró 0,1 mL de la última dilución 10-6 (100UFC/mL) en los medios de cultivo
Fluido de Tioglicolato Digerido Caseína-Soja
Staphylococcus aureusPseudomonas aeruginosa Clostridium sporogenes
Candida albicans Bacillus subtilis Aspergillus niger
Se incubó durante 5 días a 22,5 +/- 2,5ºC
Se incubó durante 2 días a 32,5 +/- 2,5ºC
Se evaluó el crecimiento de los microorganismos por turbidimetría durante 100 horas
mediante espectrofotómetro con una longitud de onda de 540 nm.
45
1 Clostridium sporogenes se incubó en condiciones de anaerobiosis.
Figura Nº 13. Prueba de promoción de crecimiento.
Fuente: USP 29, 2006
5.4. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
Cada montaje incluyó esterilidad en los dos tipos de membrana de 0,45 µm, filtros
de nitrato de celulosa y acetato de celulosa, por cada microorganismo para un total
de 12 esterilidades, teniendo en cuenta los 6 microorganismos y realizados en 5
Se observaron los resultados en los medios líquidos y sólidos
Crecimiento No crecimiento
Prueba no satisfactoriaPrueba satisfactoria
Se realizó conteo de UFC/mL en medios sólidos el
cual era aproximadamente de 100 UFC/mL.
Se realizó coloración de Gram
Candida albicansAspergillus niger
Se sembró en profundidad por duplicado 1 mL de la dilución 10-6 en los medios de cultivo sólido, agar HC para hongos y agar Casoy para bacterias.
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Clostridium sporogenes1
Se incubó por 5 días a 22,5 +/- 2,5ºC Se incubó por 2 días a 32,5 +/- 2,5ºC
46
días diferentes, para un total de 60 pruebas de esterilidad, utilizando el líquido D
como diluyente.
Antes de los montajes de esta prueba se colocó una membrana de 0,45 µm en cada
vaso de filtración, para que éstos y los demás materiales que se utilizaron fueran
esterilizados, previamente al ensayo, en el autoclave a 121ºC y 15 lb psi durante 35
minutos.
En cada montaje se evaluaron inicialmente los controles para el proceso en donde
se realizó el control ambiental del área estéril por el método de sedimentación, en
agar Casoy y agar HC, en ambientes como la cabina de flujo laminar, sobre la
cabina, la mesa auxiliar y la puerta, igualmente se realizó el control ambiental inicial
en la cabina de flujo laminar con el muestreador de aire MAS-100 durante 2 minutos
equivalentes a 200 L.
Además se realizó el control de personal al inicio y final de cada montaje mediante
la impresión de guantes en agar Casoy y agar HC.
Después de los controles ambientales y de personal se sanitizaron los materiales
con alcohol al 72% y éstos se ubicaron dentro de la cabina de flujo laminar para
armar el equipo de filtración y así proceder a las filtraciones. (Ver figura Nº 14.)
Primero se realizó la filtración del control negativo del montaje o blanco del equipo
en donde se filtró 250 mL de diluyente D estéril, se cortó por mitad el filtro de
membrana y cada parte de la membrana se adicionó a los medio de cultivo líquidos
(Fluido de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja), los cuales fueron incubados
durante 14 días a la temperatura adecuada como se indica en la figura Nº 15. Si
después del tiempo de incubación se observa turbidez (crecimiento microbiano) del
medio de cultivo la prueba era no satisfactoria y se realizaba coloración de Gram, al
contrario si no se presentaba turbidez o crecimiento microbiano la prueba era
satisfactoria.
Para realizar las filtraciones por membrana se contaminó el diluyente D con 0,1 mL
de la dilución 10-6 de cada uno de los 6 microorganismos evaluados en la prueba de
promoción de crecimiento. El diluyente contaminado fue filtrado, la membrana fue
47
cortada por mitad y cada parte fue adicionada a los medios de cultivo Fluido de
Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja, éstos medios se incubaron durante 14 días a
la temperatura adecuada. Al cabo del tiempo de incubación se realizó la lectura si
se observa crecimiento microbiano se considera una prueba satisfactoria, si no se
observa crecimiento la prueba es no satisfactoria. (Ver figura Nº 16)
Después de filtrar cada diluyente contaminado se agregó a cada medio de cultivo
líquido 10 mL del líquido filtrado, para asegurar la retención de los microorganismos
contaminantes en los filtros de membrana y el no crecimiento de éstos en el líquido
filtrado. Los medios de cultivo fueron incubados durante 14 días, si después del
tiempo de incubación se observa turbidez (crecimiento microbiano) del medio de
cultivo la prueba se considera no satisfactoria, al contrario si no se presenta turbidez
o crecimiento microbiano la prueba es satisfactoria. (Ver figura Nº 16). Esta
evaluación del líquido filtrado se realizó en los montajes 1, 3 y 5 de la técnica de
filtración por membrana.
Para realizar los controles para el proceso se utilizó por cada día:
- 5 cajas de Petri con agar Casoy para el control ambiental.
- 5 cajas de Petri con agar HC para el control ambiental.
- 2 cajas de Petri con agar Casoy para el control de personal al inicio y final de
la prueba.
- 2 cajas de Petri con agar HC para el control de personal al inicio y final de la
prueba.
Para realizar el control negativo de la prueba se utilizó por cada día:
- Un frasco con medio Fluido de Tioglicolato para el diluyente estéril.
- Un frasco con medio Digerido Caseína-Soja para el diluyente estéril.
Para realizar la filtración por membrana se utilizó por cada montaje:
- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para cada microorganismo a
evaluar.
- Dos frascos con medio Digerido Caseína-Soja para cada microorganismo a
evaluar.
- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para agregar el líquido filtrado.
- Dos frascos con medio Digerido Caseína-Soja para agregar el líquido
filtrado.
48
Se utilizaron frascos Schott de 250 mL que contenían 80 mL de medio preparado.
Figura Nº 14. Controles para el proceso en la técnica de filtración por membrana.
Figura Nº 15. Control negativo de la técnica de filtración por membrana.
CONTROLES PARA EL PROCESO
Se realizó el control ambiental en la cabina de flujo laminar, sobre la cabina, mesa
auxiliar y puerta con agar Casoy y agar HC mediante el método de sedimentación
durante el tiempo de la prueba. Igualmente se realizó el control ambiental de la cabina, al
inicio de la prueba, con el equipo MAS-100 durante 2 minuto equivalente a 200L.
Se realizó el control de personal al inicio y final de la prueba mediante la impresión de guantes en agar Casoy y agar HC.
Se sanitizaron los materiales a utilizar en la cabina de flujo laminar con alcohol al 72%
Se ubicó el material y se armó el equipo Manifold dentro de la cabina de flujo
Se cortó la membrana por mitad con tijeras y pinzas estériles
Se incubaron los medios por 14 días observándose periódicamente. Medio Fluido de
Tioglicolato a 32,5 +/- 2,5ºC y Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/-2,5ºC
Se adicionó cada parte de la membrana a los medios líquidos
Se filtró 250 mL de diluyente
CONTROL NEGATIVO
Crecimiento No crecimiento
Prueba no
satisfactoria
Prueba
satisfactoria
Coloración de Gram
49
Figura Nº 16. Técnica de Filtración por membrana.
Crecimiento No crecimiento
Prueba no satisfactoria
Prueba satisfactoria
Coloración de Gram
Se contaminó 250 mL de diluyente D
con 0,1 mL de la dilución 10-3 de
cada microorganismo evaluado en la
prueba de promoción de crecimiento
Se filtró el diluyente contaminado
Se cortó la membrana por mitad con
tijeras y pinzas estériles, se adicionó
cada parte a los medios líquidos
Se incubaron los medios durante 14
días observándose periódicamente.
Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5
+/- 2,5ºC y Digerido Caseína-Soja a
22,5 +/-2,5ºC
Se agregó 10 mL del filtrado a los
medios de cultivo líquidos y éstos se
incubaron durante 14 días.
Crecimiento No crecimiento
Prueba no
satisfactoria
Prueba
satisfactoria
Coloración de Gram
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
50
6. RESULTADOS
6.1. Calibración y mantenimiento de equipos
Tabla Nº 8. Programa de calibración y mantenimiento de los equipos utilizados en
la validación.
EQUIPO
MARCA /
MODELO
ÚLTIMA
VERIFICACIÓN
PRÓXIMA
VERIFICACIÓN
PROVEEDOR
Incubadora Nº 2 BINDER /
M1711509900312
M: febrero
2007
M: octubre 2007 Servibalanzas
Incubadora Nº 6 BINDER /
M1711509900312
M: febrero
2007
M: octubre 2007 Servibalanzas
Termómetro digital FISHER /
15-078G
C: julio 2006 C: julio 2007 Metrocal
Cabina de flujo
laminar
PAF /
PAMAS 2448
CF: julio 2006 CF: julio 2007 Técnica
Bomba de vacío MILLIPORE /
5KH33DN16X
M: julio 2006 M: julio 2007 Impresión y
plásticos
Muestreador
MAS 100
MERCK /
65792
M y C: octubre
2006
M y C: octubre
2006
Merck
Balanza OHAUS OHAUS /
2610
M: enero 2007 M: julio 2007 Vansolix
Microscopio OLYMPUS /
CHK 4E
M: abril 2007 M: abril 2008 Servibalanzas
Autoclave Sterilof STERILOF /
144-1PGrPr
CF: enero 2007
M: mayo 2007
CF: enero 2008
M: noviembre
2007
BPM Andina
Equitécnicos
Espectrofotómetro UNICAM /
UV2-100
M y C: abril 2007 M y C: abril 2007 Innovatec
M: Mantenimiento
C: Calibración
CF: Calificación
51
6.2. Pruebas preliminares 6.2.1. Prueba organoléptica
Tabla Nº 9. Análisis organoléptico de los medios de cultivo.
MEDIO ESPECIFICACIÓN RESULTADO
Fluido de
Tioglicolato
Medio líquido transparente de color
amarillo claro, translúcido, con anillo de
rezarsurina en la parte superior.
Satisfactorio
Digerido Caseína-
Soja
Medio líquido transparente de color
amarillo, translúcido.
Satisfactorio
Agar Casoy Medio sólido de color claro.
Satisfactorio
Agar HC Medio sólido de color ámbar con tonos
amarillos, ligeramente turbio y sin
precipitado significante.
Satisfactorio
52
6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Tabla Nº 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
líquidos.
MEDIO
dE
CULTIVO
Ensayo 1
14-04-07
Ensayo 2
21-04-07
Ensayo 3
28-04-07
Ensayo 4
12-05-07
Ensayo 5
19-05-07
Fluido de
Tioglicolato
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Digerido
Caseína-
Soja
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano.
6.2.3. Prueba de promoción de crecimiento
Tabla Nº 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento.
MEDIO
de
cultivo
Microorganismo Recuento 1
UFC / ML
14-04-07
Recuento 2
UFC / ML
28-04-07
Recuento 3
UFC / ML
19-05-07
216 69 20 Bacillus subtilis ATCC 6633
237 52 21
Promedio 226 60 20
23 24 71 Clostridium sporogenes
ATCC 19404 30 29 31
AGAR
CASOY Promedio 26 26 51
53
177 90 97 Staphylococcus aureus
ATCC 6538 205 118 89
Promedio 191 104 93
173 91 103 Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 197 104 96
AGAR
CASOY
Promedio 185 97 99
96 78 65 Candida albicans
ATCC 10231 101 73 48
Promedio 98 76 56
20 24 92 Aspergillus niger
ATCC 16404 23 22 60
AGAR
HC
Promedio 22 23 76
Figura Nº 17. Bacillus subtilis en agar Casoy.
54
Figura Nº 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy.
Figura Nº 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy.
Figura Nº 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy.
55
Figura Nº 21. Candida albicans en agar HC.
Figura Nº 22. Aspergillus niger en agar HC.
Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento para
medios de cultivo líquidos en los tres ensayos realizados.
MEDIO de
cultivo
MICROORGANISMO RESULTADO MORFOLOGIA
Clostridium sporogenes
ATCC 19404
Satisfactorio Bacilos Gram
positivos
Fluido de
Tioglicolato
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Satisfactorio Cocos Gram
positivos
56
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027
Satisfactorio Bacilos Gram
negativos
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Satisfactorio Bacilos Gram
positivos
Candida albicans
ATCC 10231
Satisfactorio Levaduras
Digerido
Caseína-Soja
Aspergillus niger
ATCC 16404
Satisfactorio
Hifas hialinas,
conidios globosos y
cabezas conidiales
radiales.
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano.
57
6.2.3.1. Método turbidimétrico
Los datos de % de tramitancia obtenidos durante el tiempo de incubación (100
horas) de los medios inoculados se observan en las tablas Nº 12 a la Nº 23.
Tabla Nº 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 94,159 2 94,714
Promedio 94,437 4 90,196 4 90,024
Promedio 90,110 6 89,603 6 88,497
Promedio 89,050 8 82,024 8 82,024
Promedio 82,024 24 77,967 24 76,984
Promedio 77,476 28 69,471 28 67,429
Promedio 68,450 32 59,556 32 59,821
Promedio 59,689 48 50,619 48 49,867
Promedio 50,243 52 45,736 52 41,830
Promedio 43,783 56 34,202 56 34,148
Promedio 34,175 72 17,470 72 17,459
Promedio 17,465 78 12,102 78 12,207
Promedio 12,155 96 4,552 96 4,496
Promedio 4,524 100 2,955 100 2,947
Promedio 2,951
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23. C
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2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
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56.
59
Tabla Nº 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en
medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 99,786 2 99,935
Promedio 99,861 4 99,622 4 99,605
Promedio 99,613 6 99,682 6 99,668
Promedio 99,675 8 100,091 8 98,612
Promedio 99,351 24 99,363 24 99,405
Promedio 99,384 28 98,212 28 98,184
Promedio 98,198 32 97,239 32 97,240
Promedio 97,240 48 98,544 48 98,286
Promedio 98,415 52 98,228 52 97,901
Promedio 98,065 56 97,457 56 97,499
Promedio 97,478 72 95,734 72 95,840
Promedio 95,787 78 94,983 78 95,085
Promedio 95,034 96 94,740 96 94,699
Promedio 94,720
60
100 94,818 100 94,719
Promedio 94,769
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62
Tabla Nº 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 92,443 2 92,380
Promedio 92,412 4 90,638 4 89,473
Promedio 90,056 6 87,130 6 87,077
Promedio 87,104 8 81,850 8 81,974
Promedio 81,912 24 70,702 24 71,697
Promedio 71,200 28 65,708 28 65,663
Promedio 65,686 32 60,215 32 60,442
Promedio 60,329 48 51,022 48 53,612
Promedio 52,317 52 42,057 52 42,652
Promedio 42,355 56 39,414 56 40,194
Promedio 39,804 72 28,676 72 28,667
Promedio 28,672 78 21,478 78 21,498
Promedio 21,488 96 16,336 96 17,312
Promedio 16,824
63
100 12,255 100 12,238
Promedio 12,247
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4446
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6466
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52.
65
Tabla Nº 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en
medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 95,015 2 95,002
Promedio 95,009 4 92,537 4 93,573
Promedio 93,055 6 90,666 6 90,545
Promedio 90,606 8 88,498 8 88,576
Promedio 88,537 24 81,491 24 81,485
Promedio 81,488 28 77,521 28 76,424
Promedio 76,973 32 72,766 32 70,407
Promedio 71,587 48 64,442 48 63,400
Promedio 63,921 52 58,249 52 58,039
Promedio 58,144 56 46,727 56 46,169
Promedio 46,448 72 25,725 72 25,719
Promedio 25,722 78 16,457 78 16,499
Promedio 16,478 96 5,887 96 5,857
Promedio 5,872
66
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Promedio 2,910
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56.
68
Tabla Nº 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa
en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 90,093 2 90,052
Promedio 90,073 4 86,592 4 86,165
Promedio 86,379 6 84,804 6 84,931
Promedio 84,868 8 78,415 8 78,280
Promedio 78,348 24 62,947 24 62,838
Promedio 62,893 28 60,675 28 60,484
Promedio 60,580 32 51,168 32 52,736
Promedio 51,952 48 50,601 48 50,951
Promedio 50,776 52 40,176 52 39,396
Promedio 39,786 56 41,084 56 40,906
Promedio 40,995 72 11,517 72 11,547
Promedio 11,532 78 6,678 78 6,686
Promedio 6,682 96 3,430 96 3,363
Promedio 3,397
69
100 0,294 100 0,296
Promedio 0,295
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2830
3234
3638
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4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
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8082
8486
8890
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.
71
Tabla Nº 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa
en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 98,081 2 98,070
Promedio 98,076 4 96,982 4 96,896
Promedio 96,939 6 94,207 6 94,176
Promedio 94,192 8 89,919 8 89,046
Promedio 89,483 24 79,545 24 80,648
Promedio 80,097 28 80,763 28 80,624
Promedio 80,694 32 75,993 32 73,185
Promedio 74,589 48 53,269 48 52,434
Promedio 52,852 52 42,054 52 44,894
Promedio 43,474 56 48,317 56 47,754
Promedio 48,036 72 20,253 72 23,023
Promedio 21,638 78 13,307 78 13,231
Promedio 13,269 96 1,732 96 1,675
Promedio 1,704
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Promedio 1,837
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6466
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7678
8082
8486
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ción
R2 =
0.98
3573
Fase
exp
onen
cial
a p
artir
de
las
56 h
oras
.
74
Tabla Nº 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio
Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 71,105 2 71,864
Promedio 71,485 4 65,071 4 67,557
Promedio 66,314 6 60,677 6 60,301
Promedio 60,489 8 51,784 8 52,156
Promedio 51,970 24 35,820 24 36,209
Promedio 36,015 28 31,648 28 32,052
Promedio 31,850 32 26,018 32 27,802
Promedio 26,910 48 15,871 48 15,782
Promedio 15,827 52 12,392 52 12,367
Promedio 12,380 56 10,635 56 10,663
Promedio 10,649 72 7,439 72 6,445
Promedio 6,942 78 6,681 78 6,174
Promedio 6,428 96 2,043 96 2,954
Promedio 2,499
75
100 0,659 100 0,664
Promedio 0,662
76 Fi
gura
Nº
29.
Cur
va d
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-0,8
-0,6
-0,4
-0,20,00,20,40,6
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
7678
8082
8486
8890
9294
9698
100
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0.92
2125
Fase
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de
las
24 h
oras
77
Tabla Nº 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio
Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 96,826 2 97,185
Promedio 97,006 4 96,493 4 96,877
Promedio 96,685 6 95,000 6 95,276
Promedio 95,138 8 95,695 8 94,988
Promedio 95,342 24 94,199 24 96,324
Promedio 95,262 28 90,122 28 89,231
Promedio 89,677 32 91,534 32 94,418
Promedio 92,976 48 88,956 48 89,650
Promedio 89,303 52 71,600 52 72,552
Promedio 72,076 56 80,827 56 80,565
Promedio 80,696 72 56,888 72 56,481
Promedio 56,685 78 48,836 78 48,461
Promedio 48,649 96 23,053 96 24,130
Promedio 23,592
78
100 28,232 100 27,732
Promedio 27,982
79
Figu
ra N
º 30
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-1,4
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-0,8
-0,6
-0,4
-0,20,0
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
7678
8082
8486
8890
9294
9698
100
Tiemp
o (Ho
ras)
Log A
C
oefic
ient
e de
cor
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ción
R2 =
0.93
5590
Fase
exp
onen
cial
a p
artir
de
las
66 h
oras
.
80
Tabla Nº 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio
Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 91,473 2 91,478
Promedio 91,476 4 90,439 4 90,346
Promedio 90,393 6 87,901 6 88,050
Promedio 87,976 8 79,224 8 78,753
Promedio 78,989 24 62,556 24 62,482
Promedio 62,519 28 57,607 28 58,667
Promedio 58,137 32 49,059 32 49,360
Promedio 49,210 48 39,299 48 39,488
Promedio 39,394 52 34,070 52 31,671
Promedio 32,871 56 36,184 56 36,110
Promedio 36,147 72 20,938 72 20,931
Promedio 20,935 78 8,127 78 8,155
Promedio 8,141 96 3,216 96 3,232
Promedio 3,224
81
100 0,447 100 0,448
Promedio 0,448
82 Fi
gura
Nº
31.
Cur
va d
e cr
ecim
ient
o de
Can
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-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,20,00,20,40,6
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
7678
8082
8486
8890
9294
9698
100
Tiemp
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oras
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C
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0.98
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ulac
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Fase
exp
onen
cial
a p
artir
de
las
56 h
oras
.
83
Tabla Nº 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio
Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 90,447 2 90,493
Promedio 90,470 4 90,576 4 90,559
Promedio 90,568 6 90,072 6 90,151
Promedio 90,112 8 83,141 8 83,127
Promedio 83,134 24 76,325 24 76,333
Promedio 76,329 28 76,911 28 76,965
Promedio 76,938 32 65,474 32 62,229
Promedio 63,852 48 43,391 48 43,037
Promedio 43,214 52 52,901 52 52,629
Promedio 52,765 56 47,268 56 47,010
Promedio 47,139 72 12,263 72 12,237
Promedio 12,250 78 12,228 78 12,111
Promedio 12,170 96 2,859 96 2,823
Promedio 2,841
84
100 0,853 100 0,843
Promedio 0,848
85
Figu
ra N
º 32
. Cur
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cre
cim
ient
o.
y = 0.
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x - 1.
3594
-1,6
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,20,00,20,40,6
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
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Fase
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ulac
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Fase
exp
onen
cial
a p
artir
de
las
52 h
oras
.
86
Tabla Nº 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio
Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 93,918 2 92,766
Promedio 93,342 4 90,380 4 90,425
Promedio 90,403 6 84,581 6 84,592
Promedio 84,587 8 77,329 8 77,265
Promedio 77,297 24 66,302 24 66,284
Promedio 66,293 28 57,064 28 57,171
Promedio 57,118 32 57,814 32 55,475
Promedio 56,645 48 55,346 48 53,579
Promedio 54,463 52 49,761 52 47,644
Promedio 48,703 56 34,886 56 34,647
Promedio 34,767 72 6,730 72 6,707
Promedio 6,719 78 2,417 78 2,403
Promedio 2,410 96 1,249 96 1,244
Promedio 1,247
87
100 0,448 100 0,444
Promedio 0,446
88 Fi
gura
Nº
33.
Cur
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Asp
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-0,50,00,51,0
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2022
2426
2830
3234
3638
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4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
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100
Tiemp
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Fase
exp
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artir
de
las
56 h
oras
.
89
Tabla Nº 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio
Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA 2 96,278 2 95,265
Promedio 95,772 4 94,722 4 94,728
Promedio 94,725 6 90,282 6 91,186
Promedio 90,734 8 88,492 8 88,503
Promedio 88,498 24 82,205 24 83,124
Promedio 82,665 28 85,370 28 85,427
Promedio 85,399 32 85,924 32 82,856
Promedio 84,390 48 70,321 48 70,228
Promedio 70,275 52 70,917 52 70,686
Promedio 70,802 56 65,514 56 64,777
Promedio 65,146 72 18,240 72 18,087
Promedio 18,164 78 14,531 78 14,506
Promedio 14,519 96 0,559 96 0,562
Promedio 0,561
90
100 0,973 100 0,966
Promedio 0,970
91
Figu
ra N
º 34
. Cur
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Asp
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-1,5
-1,0
-0,50,00,5
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
3638
4042
4446
4850
5254
5658
6062
6466
6870
7274
7678
8082
8486
8890
9294
9698
100
Tiemp
o (Ho
ras)
Log A
C
oefic
ient
e de
cor
rela
ción
R2 =
0.94
5140
Fase
exp
onen
cial
a p
artir
de
las
60 h
oras
.
92
6.3. Técnica de filtración por membrana utilizada en la prueba de esterilidad 6.3.1. Controles para el proceso
6.3.1.1. Control ambiental y de personal
Tabla Nº 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de esterilidad.
Ambiente
Montaje 1 14-04-07
Montaje 2 21-04-07
Montaje 3 28-04-07
Montaje 4 12-05-07
Montaje 5 19-05-07
MEDIO DE
CULTIVO
Casoy H
C
Casoy HC Casoy H
C
Casoy HC Casoy H
C
eSPECIFICACI
ÓN
ufc/ PLACA
(VIABLES
TOTALES)
Cabina con equipo MAS-100 UFC/m3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Cabina UFC/placa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Sobre cabina UFC/placa
0 0 2 1H 1L
0 0 1 0 3 0 5
Mesa UFC/placa
1 0 4 0 0 0 1 0 3 0 5
Puerta UFC/placa
1 0 4 1H
0 0 2 1H
2 0
8
H: Hongos; L: Levaduras
Los resultados obtenidos para el control microbiológico de ambientes CUMPLEN
con las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.
Tabla Nº 26. Resultados del control de personal durante la prueba de esterilidad.
Montaje 1 14-04-07
Montaje 2 21-04-07
Montaje 3 28-04-07
Montaje 4 12-05-07
Montaje 5 19-05-07
Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC MEDIO
DE
CULTIVO UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante
eSPECIFICACIÓN
ufc/GUANTE
Guantes inicial
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3
Guantes final
0 0 1 2L 0 1H 2 0 0 0 3
H: Hongos; L: Levaduras
93
Los resultados obtenidos para el control microbiológico de personal CUMPLEN con
las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.
6.3.1.2. Control negativo de la prueba
Tabla Nº 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la técnica de filtración
de membrana durante los 5 montajes realizados.
membrana acetato de celulosa nitrato de celulosa
Medio de
cultivo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
CONTROL
NEGATIVO
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano
6.3.2. Técnica de filtración por membrana Tabla Nº 28. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana
durante el Montaje 1, abril 14 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Microorganismo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis ATCC 6633
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Candida albicans ATCC 10231
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Levaduras
Aspergillus niger ATCC 16404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Hifas hialinas, conidios globosos
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Satisfactorio
No satisfactorio
Satisfactorio
No satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Staphylococcus aureus
Cocos
94
ATCC 6538 Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram positivos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano
Tabla Nº 29. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante
el Montaje 2, abril 21 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Microorganismo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis ATCC 6633
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Candida albicans ATCC 10231
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Levaduras
Aspergillus niger ATCC 16404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Hifas hialinas, conidios globosos
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Satisfactorio
No satisfactorio
Satisfactorio
1
No satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Cocos Gram positivos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano 1 Se sembró Clostridium sporogenes en medio sólido después de 14 días de
incubación del medio líquido.
95
Tabla Nº 30. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante
el Montaje 3, abril 28 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Microorganismo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis ATCC 6633
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Candida albicans ATCC 10231
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Levaduras
Aspergillus niger ATCC 16404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Hifas hialinas, conidios globosos
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Satisfactorio
No satisfactorio
Satisfactorio
No satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Cocos Gram positivos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano
Tabla Nº 31. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante
el Montaje 4, mayo 12 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Microorganismo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis ATCC
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram positivo
96
6633 s Candida albicans ATCC 10231
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Levaduras
Aspergillus niger ATCC 16404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Hifas hialinas, conidios globosos
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Satisfactorio
No satisfactorio
Satisfactorio
No satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Cocos Gram positivos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano
Tabla Nº 32. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante
el Montaje 5, mayo 19 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Microorganismo
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluido de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis ATCC 6633
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram positivos
Candida albicans ATCC 10231
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Levaduras
Aspergillus niger ATCC 16404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Hifas hialinas, conidios globosos
Clostridium sporogenes
Satisfactorio
No satisfactorio
Satisfactorio
No satisfactorio
Bacilos Gram
97
ATCC 19404 positivos
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Cocos Gram positivos
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Bacilos Gram negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano
6.3.3. Líquido filtrado
Los días de montaje 2 y 4 que corresponden a las fechas 21-04-07 y 12-05-07, no
se realizó la inoculación del líquido filtrado en los medio de cultivo.
Tabla Nº 33. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del líquido
filtrado del montaje 1, abril 14 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa
MEDIO
Microorganismo
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Candida albicans
ATCC 10231
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Aspergillus niger
ATCC 16404
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Clostridium
sporogenes
ATCC 19404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Staphylococcus
aureus
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
98
ATCC 6538
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano
Tabla Nº 34. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del líquido
filtrado del montaje 3, abril 28 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa
MEDIO
Microorganismo
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Candida albicans
ATCC 10231
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Aspergillus niger
ATCC 16404
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Clostridium
sporogenes
ATCC 19404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano
99
Tabla Nº 35. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del líquido
filtrado del montaje 5, mayo 19 de 2007.
MEMBRANA
Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa
MEDIO
Microorganismo
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Fluído de Tioglicolato
Digerido Caseína-Soja
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Candida albicans
ATCC 10231
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Aspergillus niger
ATCC 16404
Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Clostridium
sporogenes
ATCC 19404
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 9027
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los resultados y la información obtenida demostraron un monitoreo de las variables
críticas para un proceso bajo control, lo cual proporciona un alto grado de seguridad
100
a la validación realizada donde se producirán constantemente las mismas
características obteniendo resultados confiables y reproducibles.
Los resultados demuestran que la técnica de filtración por membrana para evaluar
los filtros de acetato y nitrocelulosa evaluada es precisa, reproducible al tener en
cuenta que se realizó diferentes días y es repetible ya que se realizó por el mismo
analista y con el mismo equipo.
Se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y los pasos a
seguir para el buen desarrollo de la validación con la recopilación de la información
que se realizó.
La calibración y el mantenimiento de los equipos es un paso importante dentro de la
metodología de validación; los equipos utilizados durante las diferentes pruebas
realizadas se encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos
esperados, por lo tanto se debe contar con un cronograma de mantenimiento
preventivo vigente. (Ver Tabla Nº 8)
Los resultados de la prueba organoléptica mostraron que los medios de cultivo
cumplen con las especificaciones de color, textura y aspecto según las casas
comerciales y la USP 29, indicando su calidad para la obtención de resultados en la
metodología realizada. (Ver Tabla Nº 9)
La prueba de promoción de crecimiento demostró que los medios de cultivo Fluido
de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja contienen los nutrientes necesarios para el
desarrollo y crecimiento de los microorganismos evaluados. (Ver tabla Nº 10)
El crecimiento de los microorganismos contaminantes en los medios de cultivo
líquidos en los 3 ensayos realizados se evaluó en un tiempo de 2 y 5 días de
incubación, en los medios de cultivo líquidos se observó turbidez en menor tiempo
de lo esperado, por lo cual se determinó para cada microorganismo su curva de
crecimiento en ambos medios, los resultados se obtuvieron por medo del método
espectrofotométrico.
101
Después de evaluar los medios de cultivo inoculados mediante espectrofotometría
se evidenció el crecimiento de los microorganismos contaminantes mediante
turbidez evidenciada por la disminución del porcentaje de tramitancia durante el
tiempo evaluado.
Los microorganismos crecieron en ambos medios de cultivo debido a que estos no
contienen sustancias inhibitorias y poseen sustancias nutritivas que ayudan al
crecimiento de bacterias, hongos y levaduras.
El medio Fluido de Tioglicolato es utilizado principalmente para microorganismos
anaerobios, como Clostridium sporogenes, por su contenido de sustancias
reductoras y su alta viscosidad, también crecen microorganismos aerobios y
microaerofílicos al poseer componentes como dextrosa, peptona de caseína y
extracto de levadura, los cuales proveen los factores de crecimiento necesarios para
la replicación. (ZIMBRO y POWER, 2003) Por lo cual para el trabajo realizado los
resultados de tramitancia obtenidos reflejan una disminución aproximada del 25% –
30% a las 24 horas de inoculación. Sin embargo, Clostridium sporogenes fue el
microorganismo que presentó mayor porcentaje de tramitancia en este tiempo (ver
Tabla Nº 13) es decir su crecimiento fue menor.
Esto se atribuye a que en cada tiempo evaluado al tomar la muestra se pudo
introducir oxígeno atmosférico o aumentó el oxígeno por alguna agitación del frasco
y éste es un microorganismo anaerobio que necesita total ausencia de oxígeno.
En el medio Digerido Caseína-Soja se presentó crecimiento de bacterias aerobias,
hongos y levaduras, debido a que este medio de cultivo es altamente nutritivo por la
combinación de peptonas de caseína y soya y se encuentra exento de sustancias
inhibidoras lo cual soporta el crecimiento de gran variedad de microorganismos
exigentes y no exigentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)
A las 24 horas de evaluación de los microorganismos en el medio Digerido Caseína-
Soja se obtuvo una disminución entre el 13% y 18% de tramitancia comparado con
el medio Fluido de Tioglicolato para Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,
Aspergillus niger y Staphylococcus aureus. (Ver Tablas Nº 16, 18, 22 y 24). Bacillus
subtilis presentó menor crecimiento a las 24 horas pero durante todo el tiempo
102
evaluado se observó mayor crecimiento y por lo tanto disminución del porcentaje de
tramitancia. (Ver Tabla Nº 20)
Durante las 100 horas evaluadas se encontró que Clostridium sporogenes no creció
en el medio Digerido Caseína-Soja debido a que este microorganismo es anaerobio
y el medio no posee las condiciones ni sustancias reductoras apropiadas para su
crecimiento. La falta de crecimiento se determinó al obtener por espectrofotometría
valores altos de % de tramitancia y valores cercanos al valor de tramitancia del
tiempo inicial (ver Tabla Nº 14), esto demuestra que no se presentó turbidez en el
medio de cultivo, a diferencia de los otros microorganismos evaluados en el mismo
medio.
El tiempo requerido para el crecimiento evidenciado por turbidez puede ser
considerado como la suma de dos etapas, una fase donde los microorganismos se
preparan para crecer, y el tiempo de generación requerido para un bajo nivel de
crecimiento donde éstos son visibles a la visión humana, la concentración de los
microorganismos es aproximadamente 107 UFC/mL. (MOLDENHAUER y SUTTON,
2004)
Los resultados mostraron que en las primeras horas después de la inoculación de
los microorganismos en los dos medios de cultivo los valores del porcentaje de
tramitancia disminuyeron en menor proporción con relación a las demás horas
evaluadas. Esto determina que los microorganismos tuvieron una fase de
adaptación durante las primeras seis horas aproximadamente, donde los
microorganismos empezaron a tomar los nutrientes del medio para su posterior
replicación. Para luego presentarse un crecimiento determinado por valores de %
tramitancia muy bajos y la presencia de turbidez.
La linealidad fue determinada mediante el software Validation Manager, evaluando
los datos de % de tramitancia obtenidos para cada microorganismo contaminante en
los medios de cultivo líquidos durante 100 horas evaluadas.
Para cada microorganismo inoculado en los medios de cultivo se determinó la
regresión lineal y el coeficiente de correlación, observándose que hay una relación
directa entre las dos variables, en este caso a medida que aumenta el tiempo el
103
microorganismo produce biomasa presentandose turbidez lo que provoca la
disminución del porcentaje de tramitancia del medio de cultivo.
A partir de cada regresión lineal calculada se obtuvo la ecuación de la recta la cual
puede ser utilizada para estimar porcentajes de tramitancia en valores de tiempo no
evaluados, demostrándose así una relación directamente proporcional entre las dos
variables estimadas.
El coeficiente de correlación calculado para cada curva evaluada fue superior a 0.9
valor que para crecimiento y cuantificación microbiano es óptimo, siendo los
menores valores 0,92 y 0,93 obtenidos para Bacillus subtilis en los medios Fluido de
tioglicolato y Digerido caseína-soja respectivamente (ver figuras Nº 29 y 30). Estos
coeficientes demuestran resultados para la regresión lineal donde existe un alto
grado de asociación y una relación directa entre las dos variables (tiempo vs.
crecimiento microbiano), obteniendo así un modelo lineal.
Para verificar que el recuento de los microorganismos no fuera mayor a 100
UFC/mL se sembraron en los medios sólidos agar Casoy y agar HC según lo indica
la USP 29. Esto se evidenció en los tres días de ensayo para la prueba de
promoción de crecimiento en los resultados obtenidos para Candida albicans,
Aspergillus niger y Clostridium sporogenes los cuales tuvieron recuentos entre 20 y
100 UFC/mL, y para los recuentos de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa en el segundo y tercer ensayo. (Ver Tabla Nº 11)
Los resultados obtenidos en los recuentos de Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa se relacionan con la disminución del porcentaje de
tramitancia durante el tiempo evaluado, especialmente durante las primeras 24
horas en el medio Fluido de Tioglicolato.
Por otro lado la prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realizó a cada lote
de esterilización y se incubaron los medios durante 14 días, tiempo durante el cual
se evidenciaron resultados satisfactorios ya que no existió crecimiento de ningún
microorganismo contaminante en los medios de cultivo utilizados en la técnica de
filtración por membrana, estos medios de cultivo se dejaron como controles
negativos de la prueba de esterilidad.
104
Gracias a los resultados derivados de las pruebas preliminares se continuó con los
ensayos de la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, ya
que de haber observado resultados no satisfactorios la prueba sería no válida. (USP
29, 2006)
Los resultados obtenidos a partir de los cinco días de montaje de la técnica de
filtración por membrana fueron satisfactorios ya que en los ensayos realizados con
los filtros de acetato y nitrato de celulosa evaluados se observó crecimiento de los
microorganismos inoculados en los diluyentes, los cuales fueron filtrados y la
membrana sembrada en los medios Fluido Tioglicolato y Digerido Caseína Soja,
verificando de esta forma la retención microbiana en los filtros por la presencia de
crecimiento microbiano en los medio de cultivo.
Los seis microorganismos utilizados en la prueba crecieron satisfactoriamente en los
medios líquidos (ver Tablas Nº 27, 28, 29, 30 y 31), es decir fueron retenidos en los
filtros de acetato y nitrato de celulosa y utilizaron los nutrientes de los medios de
cultivo para promover su crecimiento. En el montaje 2 correspondiente al 21 de abril
de 2007 se observó menor turbidez en los medios Fluido de Tioglicolato que
poseían los filtros de membrana contaminados con Clostridium sporogenes. El
medio que contenía la membrana de nitrato de celulosa se sembró en agar Casoy
después de los 14 días de incubación, en éste medio de cultivo sólido se evidenció
crecimiento al cual se le realizó coloración de Gram observando la presencia de
bacilos Gram positivos.
En todos los ensayos realizados por la técnica filtración por membrana los medios
Digerido Caseína-Soja adicionados con los filtros de acetato y nitrato de celulosa
contaminados con Clostridium sporogenes no presentaron turbidez, esto se debe a
que éste medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de hongos, levaduras y
bacterias aerobias (ZIMBRO y POWER, 2003), y no para bacterias anaerobias
como es el caso de Clostridium sporogenes.
Estos resultados se relacionan con la prueba de promoción de crecimiento apoyada
por espectrofotometría, donde el medio Digerido Caseína-Soja inoculado con
105
Clostridium sporogenes no presentó disminución del % de tramitancia, esto quiere
decir que el microorganismo no creció.
Al comparar los dos filtros de membrana acetato y nitrato de celulosa con un tamaño
de poro de 0,45µm se observó que éstos retienen microorganismos contaminantes,
de esta forma se puede asegurar su uso en las pruebas de esterilidad con
resultados óptimos y confiables.
A partir de cada filtración se adicionó el fluido filtrado en los medios de cultivo
obteniendo resultados satisfactorios (ver Tablas Nº 32, 33 y 34) al no presentarse
turbidez durante los 14 días de incubación. Esto demuestra que el diluyente
después de ser filtrado no contiene microorganismos contaminantes debido a que
éstos quedaron retenidos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en
la prueba de esterilidad dejando así el líquido filtrado estéril.
Para evitar falsos positivos y posibles repeticiones es importante tener en cuenta el
buen manejo del equipo de filtración ya que al desarrollarse la prueba de esterilidad
en un sistema abierto existe mayor riesgo de contaminación cruzada, por esto es
crucial el ajuste del equipo, la ubicación del filtro de membrana dentro del embudo y
la mínima manipulación, que pueden generar falsos positivos y posibles
repeticiones.
En el estudio realizado se evaluó el control negativo de cada montaje de la técnica
de filtración por membrana donde solamente se filtró el diluyente estéril y se
incubaron los medios de cultivo con los filtros de membrana. Estos resultados fueron
satisfactorios al no presentar turbidez en los medios, lo que demuestra que no se
presentaron falsos positivos que afecten la validez de la prueba.
Durante el tiempo empleado en cada ensayo de la técnica de filtración de
membrana se realizó el control ambiental y de personal, los resultados obtenidos
cumplen (ver Tablas Nº 25 y 26) según los límites microbianos manejados por AQM
Ltda. (Ver Tablas Nº 6 y 7) Estos resultados aseguran que las condiciones de
trabajo para la prueba de esterilidad fueron controladas, obteniendo resultados
satisfactorios durante todos los ensayos de la técnica evaluada.
106
Al realizar las pruebas bajo condiciones ambientales controladas se reducen falsos
positivos por contaminación microbiana cruzada y se garantiza la asepsia del área
donde se realiza la prueba de esterilidad. El proceso de limpieza y desinfección del
área de trabajo, en este caso del área estéril, fueron primordiales para obtener
buenos resultados durante la validación y a futuro para el análisis diario de la prueba
de esterilidad para la técnica de filtración por membrana.
Las pruebas realizadas mostraron resultados satisfactorios gracias al correcto
procedimiento empleado durante la validación, el personal capacitado con las
habilidades para el manejo de equipos y materiales, y el uso de equipos calificados
y validados que funcionan de la forma esperada.
8. CONCLUSIONES
Se realizó la validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y
nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45µm empleados en la
107
técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad,
obteniéndose resultados satisfactorios y reproducibles.
Se comprobó que en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un
tamaño de poro de 0,45µm utilizados en la técnica de filtración por
membrana retienen y recuperan satisfactoriamente los microorganismos
contaminantes, esto se observa por la turbidez presentada en los medios de
cultivo líquidos, los resultados se confirmaron por coloración de Gram.
La retención y recuperación de los microorganismos en los filtros de acetato
y nitrato de celulosa se determinó con el líquido filtrado que se inoculó en los
medios de cultivo; los resultados obtenidos no presentaron turbidez es decir
no hubo crecimiento microbiano.
Se confirmaron las condiciones de montaje de la técnica de filtración por
membrana siguiendo los parámetros de la USP 29 mediante la obtención de
resultados que optimizan la técnica reduciendo repeticiones y minimizando
riesgos en las pruebas.
Se verificó mediante la prueba de promoción de crecimiento que los medios
de cultivo Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja utilizados en la
prueba de esterilidad poseen los nutrientes necesarios para favorecer el
crecimiento de microorganismos contaminantes.
El crecimiento de los microorganismos utilizados en la prueba de promoción
de crecimiento se verificó mediante espectrofotometría observándose
disminución del % de tramitancia que indica el crecimiento de los
microorganismos en los medios de cultivo, este crecimiento fue determinado
en menos de 24 horas.
El crecimiento de los microorganismos presenta un modelo lineal
demostrando así una relación directamente proporcional entre las variables,
tiempo y crecimiento microbiano.
108
De acuerdo a los resultados obtenidos se actualizó el procedimiento
operativo estándar POSM0017 – P002 “PROCEDIMIENTO PARA LA
REALIZACIÓN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD” para la ejecución de la
técnica de filtración por membrana empleada en el análisis de esterilidad en
el laboratorio de Análisis Microbiológico y Químico AQM Ltda.
La capacitación oportuna de los analistas minimiza posibles errores, los
riesgos de contaminación y asegura resultados confiables durante la
validación y el transcurso habitual de las pruebas realizadas en el
laboratorio.
El funcionamiento y el mantenimiento preventivo de los equipos garantizan
que los procedimientos realizados y los resultados obtenidos son confiables
para el estudio realizado.
La calidad de los medios de cultivo trabajados presentaron una característica
importante para la recuperación de los microorganismos y la interpretación
de resultados confiables, evitando falsos positivos.
109
9. RECOMENDACIONES
Es importante el buen manejo del equipo de filtración durante el análisis de
productos estériles, mediante la técnica de filtración por membrana en un
sistema abierto, por lo que se recomienda tener en cuenta el ajuste del
equipo y los embudos, la ubicación del filtro de membrana dentro del
embudo y la mínima manipulación del equipo para evitar cualquier
contaminación cruzada.
Teniendo en cuenta los tiempos de crecimiento y recuperación de los
microorganismos se sugiere un monitoreo visual frecuente de los medios de
cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de Caseína-Soja, para una rápida
detección de microorganismos contaminantes en productos evaluados.
Al monitorear el medio de cultivo Fluido de Tioglicolato se debe evitar la
agitación para mantener las condiciones de anaerobiosis y así poder
recuperar microorganismos anaerobios contaminantes como Clostridium
sporogenes.
La actualización y revisión periódica de acuerdo a la normatividad es
importante para el éxito de la pruebas y para obtener resultados óptimos y
confiables.
Es fundamental el empleo de los microorganismos establecidos por la USP
para la evaluación de controles positivos y así verificar la efectividad de la
técnica de filtración.
110
10. BIBLIOGRAFÍA
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114
11. ANEXOS
SOPORTE ESTADÍSTICO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO OBTENIDAS EN
LA PRUEBA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO REALIZADO POR EL
SOFTWARE VALIDATION MANAGER
Anexo 1. Clostridium sporogenes en el medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de valores 33
Número de repeticiones 3
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 94.159 3.276
2 2 94.714 3.831
3 2 94.437 3.554
4 4 90.196 1.168
5 4 90.024 0.996
6 4 90.110 1.082
7 6 89.603 2.430
8 6 88.497 1.324
9 6 89.050 1.877
115
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
10 8 82.024 -3.294
11 8 82.024 -3.294
12 8 82.024 -3.294
13 28 69.471 2.703
14 28 67.429 0.661
15 28 68.450 1.682
16 32 59.556 -3.502
17 32 59.821 -3.237
18 32 59.689 -3.369
19 48 50.619 2.401
20 48 49.867 1.649
21 48 50.243 2.025
22 52 45.736 1.228
23 52 41.830 -2.678
24 52 43.783 -0.725
25 56 34.202 -6.596
26 56 34.148 -6.650
27 56 34.175 -6.623
28 96 4.552 0.855
29 96 4.496 0.799
30 96 4.524 0.827
31 100 2.955 2.968
32 100 2.947 2.960
33 100 2.951 2.964
116
1.1 Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
117
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad Nivel de confianza 97.5
t- Student 2.021
Intercepto Y 9.27380e+001
- Varianza 7.24286e-001
- Intervalo de confianza 1.71997e+000
Pendiente -9.27505e-001
- Varianza 2.72028e-004
- Intervalo de confianza 3.33329e-002
Coeficiente de correlación r 0.995134
Coeficiente de determinación r² 0.990293
Varianza de la regresión SI² 3.18011e+004
Varianza residual SR² 1.00559e+001
Suma residual de cuadrados 3.11734e+002
Varianza del error experimental SE² 4.91575e-001
Varianza del error de la regresión SL² 3.34355e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1) Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 31
F tabulado 4.080
F calculado 3162.419
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 31
t tabulado 2.021
t calculado 108.969
El intercepto-Y es diferente de cero.
118
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
InterceptoY : 9.27380e+001
Pendiente : -9.27505e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.990293
Anexo 2. Clostridium sporogenes en el medio Digerido Caseína-soja.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 30
Número de repeticiones 3
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 99.786 -0.155
2 2 99.935 -0.006
3 2 99.861 -0.080
4 4 99.622 -0.208
5 4 99.605 -0.225
6 4 99.613 -0.217
7 6 99.682 -0.036
119
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
8 6 99.668 -0.050
9 6 99.675 -0.043
10 24 99.363 0.650
11 24 99.405 0.692
12 24 99.384 0.671
13 28 98.212 -0.278
14 28 98.184 -0.306
15 28 98.198 -0.292
16 56 97.457 0.530
17 56 97.499 0.572
18 56 97.478 0.551
19 72 95.734 -0.300
20 72 95.840 -0.194
21 72 95.787 -0.247
22 78 94.983 -0.716
23 78 95.085 -0.614
24 78 95.034 -0.665
25 96 94.740 0.046
26 96 94.699 0.005
27 96 94.720 0.026
28 100 94.818 0.347
29 100 94.719 0.248
30 100 94.769 0.298
120
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
121
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t- Student 2.048
Intercepto Y 1.00053e+002
- Varianza 1.40563e-002
- Intervalo de confianza 2.42809e-001
Pendiente -5.58190e-002
- Varianza 4.01194e-006
- Intervalo de confianza 4.10211e-003
Coeficiente de correlación r 0.982446
Coeficiente de determinación r² 0.965201
Varianza de la regresión SI² 1.24509e+002
Varianza residual SR² 1.60322e-001
Suma residual de cuadrados 4.48902e+000
Varianza del error experimental SE² 1.50303e-003
Varianza del error de la regresión SL² 5.57370e-001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 97.50
Grados de libertad (1,2) 1 , 28
F tabulado 5.610
F calculado 776.620
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 28
t tabulado 2.048
t calculado 843.909
El intercepto-Y es diferente de cero.
122
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 1.00053e+002
Pendiente: -5.58190e-002
Coeficiente de determinación r² : 0.965201
Anexo 3. Staphylococcus aureus en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 42
Número de repeticiones 3
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
1 2 92.443 3.967
2 2 92.380 3.904
3 2 92.412 3.936
4 4 90.638 3.810
5 4 89.473 2.645
6 4 90.056 3.228
7 6 87.130 1.950
123
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
8 6 87.077 1.897
9 6 87.104 1.924
10 8 81.850 -1.682
11 8 81.974 -1.558
12 8 81.972 -1.560
13 24 70.702 0.353
14 24 71.697 1.348
15 24 71.200 0.851
16 28 65.708 -1.345
17 28 65.663 -1.390
18 28 65.686 -1.367
19 32 60.215 -3.543
20 32 60.442 -3.316
21 32 60.329 -3.429
22 48 51.022 0.448
23 48 53.612 3.038
24 48 52.317 1.743
25 52 42.057 -5.222
26 52 42.652 -4.627
27 52 42.355 -4.924
28 56 39.414 -4.569
29 56 40.194 -3.789
30 56 39.804 -4.179
31 72 28.676 -2.124
32 72 28.667 -2.133
33 72 28.672 -2.128
34 78 21.478 -4.378
35 78 21.498 -4.358
36 78 21.488 -4.368
124
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
37 96 16.336 5.311
38 96 17.312 6.287
39 96 16.824 5.799
40 100 12.255 4.526
41 100 12.238 4.509
42 100 12.247 4.518
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
125
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t-Student 2.021
Intercepto Y 9.01239e+001
- Varianza 8.41670e-001
- Intervalo de confianza 1.85412e+000
Pendiente -8.23947e-001
- Varianza 2.86477e-004
- Intervalo de confianza 3.42067e-002
Coeficiente de correlación r 0.991666
Coeficiente de determinación r² 0.983401
Varianza de la regresión SI² 3.03481e+004
Varianza residual SR² 1.28063e+001
126
Suma residual de cuadrados 5.12251e+002
Varianza de error experimental SE² 1.97351e-001
Varianza del error de la regresión SL² 4.22271e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significatica (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 40
F tabulado 4.080
F calculado 2369.782
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 40
t tabulado 2.021
t calculado 98.236
El intercepto-Y es diferente de cero.
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 9.01239e+001
Pendiente : -8.23947e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.983401
127
Anexo 4. Staphylococcus aureus en medio Digerido Caseína-soja.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad dió los siguientes resultados:
Número de datos 39
Número de repeticiones 1
Linealidad
# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales
1 2 95.015 -1.085
2 2 95.002 -1.098
3 2 95.009 -1.091
4 4 92.537 -1.653
5 4 93.573 -0.617
6 4 93.055 -1.135
7 6 90.666 -1.615
8 6 90.545 -1.736
9 6 90.606 -1.675
10 8 88.498 -1.873
11 8 88.576 -1.795
12 8 88.537 -1.834
13 12 81.495 -5.057
14 12 81.485 -5.067
15 12 81.488 -5.064
16 28 77.521 6.245
17 28 76.424 5.148
18 28 76.973 5.697
128
Linealidad
# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales
19 32 72.766 5.309
20 32 70.407 2.950
21 32 71.587 4.130
22 52 58.249 9.887
23 52 58.039 9.677
24 52 58.144 9.782
25 56 46.727 2.184
26 56 46.169 1.626
27 56 46.448 1.905
28 72 25.725 -3.542
29 72 25.719 -3.548
30 72 25.722 -3.545
31 78 16.457 -7.082
32 78 16.499 -7.040
33 78 16.478 -7.061
34 96 5.887 -0.467
35 96 5.857 -0.497
36 96 5.872 -0.482
37 100 2.923 0.388
38 100 2.897 0.362
39 100 2.910 0.375
129
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
130
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
T Student 2.021
Intercepto Y 9.80093e+001
- Varianza 1.27636e+000
- Intervalo de confianza 2.28325e+000
Pendiente -9.54747e-001
- Varianza 4.32147e-004
- Intervalo de confianza 4.20128e-002
Coeficiente de correlación r 0.991343
Coeficiente de determinación r² 0.982761
Varianza de la regresión SI² 4.22883e+004
Varianza residual SR² 2.00482e+001
Suma residual de cuadrados 7.41782e+002
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 37
F tabulado 4.080
F calculado 2109.334
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 37
t tabulado 2.021
t calculado 86.752
El intercepto-Y es diferente de cero.
131
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN Análisis de la varianza de la linealidad
InterceptoY : 9.80093e+001
Pendiente: -9.54747e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.982761 Anexo 5. Pseudomonas aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 36
Número de repeticiones 3
Curva de crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 90.093 3.103
2 2 90.052 3.062
3 2 90.073 3.083
4 4 86.592 1.477
5 4 86.165 1.050
6 4 86.379 1.264
7 6 84.804 1.565
8 6 84.931 1.692
9 6 84.868 1.629
132
Curva de crecimiento
# Tiempo %T Residuales
10 8 78.415 -2.948
11 8 78.280 -3.083
12 8 78.348 -3.015
13 24 62.947 -3.410
14 24 62.838 -3.519
15 24 62.893 -3.464
16 28 60.675 -1.930
17 28 60.484 -2.121
18 28 60.580 -2.025
19 48 50.601 6.754
20 48 50.951 7.104
21 48 50.776 6.929
22 56 41.084 4.740
23 56 40.906 4.562
24 56 40.995 4.651
25 72 11.517 -9.821
26 72 11.547 -9.791
27 72 11.532 -9.806
28 78 6.678 -9.033
29 78 6.686 -9.025
30 78 6.682 -9.029
31 96 3.430 4.601
32 96 3.363 4.534
33 96 3.397 4.568
34 100 0.294 5.217
35 100 0.296 5.219
36 100 0.295 5.218
133
1.2. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.3. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
134
1.4. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
T Student 2.021
Intercepto Y 8.88661e+001
- Varianza 2.08604e+000
- Intervalo de confianza 2.91896e+000
Pendiente -9.37887e-001
- Varianza 6.69247e-004
- Intervalo de confianza 5.22829e-002
Coeficiente de correlación r 0.987312
Coeficiente de determinación r² 0.974784
Varianza de la regresión SI² 3.87839e+004
Varianza residual SR² 2.95078e+001
Suma residual de cuadrados 1.00326e+003
Varianza del error experimental SE² 8.88269e-003
Varianza del error de la regresión SL² 1.00305e+002
1.5. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 34
F tabulado 4.080
F calculado 1314.362
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.6. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 34
t tabulado 2.021
t calculado 61.528
El intercepto-Y es diferente de cero.
135
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 8.88661e+001
Pendiente : -9.37887e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.974784
Anexo 6. Pseudomonas aeruginosa en medio Digerido Caseína-soja.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 42
Número de repeticiones 3
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
1 2 98.081 -2.152
2 2 98.070 -2.163
3 2 98.076 -2.157
4 4 96.982 -1.153
5 4 96.896 -1.239
6 4 96.939 -1.196
7 6 94.207 -1.830
136
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
8 6 94.176 -1.861
9 6 94.192 -1.845
10 8 89.919 -4.020
11 8 89.046 -4.893
12 8 89.483 -4.456
13 24 79.575 2.422
14 24 80.648 3.495
15 24 80.097 2.944
16 28 80.763 7.806
17 28 80.624 7.667
18 28 80.694 7.737
19 32 75.993 7.233
20 32 73.185 4.425
21 32 74.589 5.829
22 48 53.269 1.294
23 48 52.434 0.459
24 48 52.852 0.877
25 52 42.054 -5.724
26 52 44.894 -2.884
27 52 43.474 -4.304
28 56 48.317 4.735
29 56 47.754 4.172
30 56 48.036 4.454
31 72 20.253 -6.544
32 72 23.023 -3.774
33 72 21.638 -5.159
34 78 13.307 -7.195
35 78 13.231 -7.271
36 78 13.269 -7.233
137
Linealidad
# Tiempo (horas) % T Residuales
37 96 1.732 0.114
38 96 1.675 0.057
39 96 1.704 0.086
40 100 1.877 4.455
41 100 1.797 4.375
42 100 1.837 4.415
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
138
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.021
InterceptoY 1.02331e+002
- Varianza 1.35009e+000
- Intervalo de confianza 2.34827e+000
Pendiente -1.04909e+000
- Varianza 4.59527e-004
- Intervalo de confianza 4.33233e-002
Coeficiente de correlación r 0.991753
Coeficiente de determinación r² 0.983573
Varianza de la regresión SI² 4.91995e+004
Varianza residual SR² 2.05420e+001
Suma residual de cuadrados 8.21681e+002
139
Varianza del error experimental SE² 4.74902e-001
Varianza del error de la regresión SL² 6.73653e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 40
F tabulado 4.080
F calculado 2395.067
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 40
t tabulado 2.021
t calculado 88.070
El intercepto-Y es diferente de cero.
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y: 1.02331e+002
Pendiente : -1.04909e+000
Coeficiente de determinación r² : 0.983573
140
Anexo 7. Bacillus subtilis en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 27
Número de repeticiones 3
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 6 60.677 11.020
2 6 60.301 10.644
3 6 60.489 10.832
4 8 51.784 3.276
5 8 52.156 3.648
6 8 51.970 3.462
7 24 35.820 -3.497
8 24 36.209 -3.108
9 24 36.015 -3.302
10 28 31.648 -5.371
11 28 32.052 -4.967
12 28 31.850 -5.169
13 32 26.018 -8.703
14 32 27.802 -6.919
15 32 26.910 -7.811
16 72 7.439 -4.304
17 72 6.445 -5.298
18 72 6.942 -4.801
19 76 6.681 -2.764
20 76 6.445 -3.000
141
Curva crecimiento # Tiempo %T Residuales
21 76 6.942 -2.503
22 96 2.043 4.087
23 96 2.954 4.998
24 96 2.499 4.543
25 100 0.659 5.001
26 100 0.664 5.006
27 100 0.662 5.004
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva: 97.50
142
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad Nivel de confianza 97.5
t Student 2.06
InterceptoY 5.31037e+001
- Varianza 4.04528e+000
- Intervalo de confianza 4.14325e+000
Pendiente -5.74453e-001
- Varianza 1.11474e-003
- Intervalo de confianza 6.87788e-002
Coeficiente de correlación r 0.960274
Coeficiente de determinación r² 0.922125
Varianza de la regresión SI² 1.08432e+004
143
Varianza residual SR² 3.66290e+001
Suma residual de cuadrados 9.15724e+002
Varianza del error experimental SE² 1.62282e-001
Varianza del error de la regresión SL² 1.30400e+002
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1) Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 25
F tabulado 4.240
F calculado 296.029
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 25
t tabulado 2.060
t calculado 26.403
El intercepto-Y es diferente de cero.
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la vaianza de la linealidad
InterceptoY: 5.31037e+001
Pendiente : -5.74453e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.922125
144
Anexo 8. Bacillus subtilis en medio Digerido Caseína-soja.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 30
Número de repeticiones 3
# Tiempo %T Residuales
1 2 96.826 -5.816
2 2 97.185 -5.457
3 2 97.006 -5.636
4 4 96.493 -4.590
5 4 96.877 -4.206
6 4 96.685 -4.398
7 6 95.000 -4.524
8 6 95.276 -4.248
9 6 95.138 -4.386
10 8 95.695 -2.270
11 8 94.988 -2.977
12 8 95.342 -2.623
13 24 94.199 8.707
14 24 96.324 10.832
15 24 95.262 9.770
16 32 91.534 12.279
17 32 94.418 15.163
18 32 92.976 13.721
19 72 56.888 8.816
20 72 56.481 8.409
145
21 72 56.685 8.613
22 76 34.111 -10.842
23 76 33.676 -11.277
24 76 33.894 -11.059
25 96 23.053 -6.309
26 96 24.130 -5.232
27 96 23.592 -5.770
28 100 28.323 2.080
29 100 27.732 1.489
30 100 27.982 1.739
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
146
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.048
InterceptoY 1.04201e+002
- Varianza 4.76619e+000
- Intervalo de confianza 4.47111e+000
Pendiente -7.79582e-001
- Varianza 1.49429e-003
- Intervalo de confianza 7.91676e-002
Coeficiente de correlación r 0.967259
Coeficiente de determinación r² 0.935590
Varianza de la regresión SI² 2.59922e+004
Varianza residual SR² 6.39078e+001
Suma residual de cuadrados 1.78942e+003
147
Varianza del error experimental SE² 3.88807e-001
Varianza del error de la regresión SL² 2.22705e+002
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 28
F tabulado 4.200
F calculado 406.714
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 28
t tabulado 2.048
t calculado 47.730
El intercepto-Y es diferente de cero.
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 1.04201e+002
Pendiente : -7.79582e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.935590
148
Anexo 9. Candida albicans en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de la linealidad del método dío los siguientes resultados:
Número de datos 36
Número de repeticiones 3
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 91.473 4.220
2 2 91.478 4.225
3 2 91.476 4.223
4 4 90.439 5.082
5 4 90.346 4.989
6 4 90.393 5.036
7 6 87.901 4.439
8 6 88.050 4.588
9 6 87.976 4.514
10 8 79.224 -2.342
11 8 78.753 -2.813
12 8 78.989 -2.577
13 24 62.556 -3.846
14 24 62.482 -3.920
15 24 62.519 -3.883
16 28 57.607 -5.004
149
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
17 28 58.667 -3.944
18 28 58.137 -4.474
19 52 34.070 -5.794
20 52 31.671 -8.193
21 52 32.871 -6.993
22 56 36.184 0.111
23 56 36.110 0.037
24 56 36.147 0.074
25 72 20.938 0.029
26 72 20.931 0.022
27 72 20.935 0.026
28 78 8.127 -7.096
29 78 8.155 -7.068
30 78 8.141 -7.082
31 96 3.216 5.053
32 96 3.232 5.069
33 96 3.224 5.061
34 100 0.447 6.075
35 100 0.448 6.076
36 100 0.448 6.076
150
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
151
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.021
InterceptoY 8.91481e+001
- Varianza 1.68437e+000
- Intervalo de confianza 2.62292e+000
Pendiente -9.47764e-001
- Varianza 5.34665e-004
- Intervalo de confianza 4.67312e-002
Coeficiente de correlación r 0.990032
Coeficiente de determinación r² 0.980164
Varianza de la regresión SI² 3.97415e+004
Varianza residual SR² 2.36552e+001
Suma residual de cuadrados 8.04276e+002
Varianza del error experimental SE² 1.48824e-001
Varianza del error de la regresión SL² 8.00704e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 34
F tabulado 4.080
F calculado 1680.036
The Fisher F test is satisfactory.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 34
t tabulado 2.021
t calculado 68.690
El intercepto-Y es diferente de cero.
152
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y: 8.91481e+001
Pendiente : -9.47764e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.980164
Anexo 10. Candida albicans en medio Digerido Caseína-soja
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 33
Número de repeticiones 3
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 90.447 -3.845
2 2 90.493 -3.799
3 2 90.470 -3.822
4 4 90.576 -1.799
5 4 90.559 -1.816
6 4 90.568 -1.807
7 6 90.072 -0.387
153
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
8 6 90.151 -0.308
9 6 90.112 -0.347
10 8 83.141 -5.402
11 8 83.127 -5.416
12 8 83.134 -5.409
13 24 76.325 3.111
14 24 76.333 3.119
15 24 76.329 3.115
16 28 76.911 7.530
17 28 76.965 7.584
18 28 76.938 7.557
19 52 52.901 6.514
20 52 52.629 6.242
21 52 52.765 6.378
22 56 47.268 4.713
23 56 47.010 4.455
24 56 47.139 4.584
25 78 12.228 -9.249
26 78 12.111 -9.366
27 78 12.170 -9.307
28 96 2.859 -1.372
29 96 2.823 -1.408
30 96 2.841 -1.390
31 100 0.853 0.454
32 100 0.843 0.444
33 100 0.848 0.449
154
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
155
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.021
InterceptoY 9.62078e+001
- Varianza 1.82289e+000
- Intervalo de confianza 2.72864e+000
Pendiente -9.58090e-001
- Varianza 6.14709e-004
- Intervalo de confianza 5.01073e-002
Coeficiente de correlación r 0.989779
Coeficiente de determinación r² 0.979663
Varianza de la regresión SI² 3.82289e+004
Varianza residual SR² 2.56005e+001
Suma residual de cuadrados 7.93615e+002
Varianza del error experimental SE² 3.80582e-003
Varianza del error de la regresión SL² 8.81702e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 31
F tabulado 4.080
F calculado 1493.287
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 31
t tabulado 2.021
t calculado 71.257
El intercepto-Y es diferente de cero.
156
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN Análisis de la varianza de la linealidad
InterceptoY : 9.62078e+001
Pendiente : -9.58090e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.979663
Anexo 11. Aspergillus niger en medio Fluido de Tioglicolato.
1.1 Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 36
Número de repeticiones 3
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 93.918 5.891
2 2 92.766 4.739
3 2 93.342 5.315
4 4 90.380 4.163
5 4 90.425 4.208
6 4 90.403 4.186
7 6 84.581 0.175
8 6 84.592 0.186
9 6 84.587 0.181
10 8 77.329 -5.267
157
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
11 8 77.265 -5.331
12 8 77.297 -5.299
13 24 66.302 -1.812
14 24 66.284 -1.830
15 24 66.293 -1.821
16 28 57.064 -7.430
17 28 57.171 -7.323
18 28 57.118 -7.376
19 32 57.814 -3.059
20 32 55.475 -5.398
21 32 56.645 -4.228
22 48 55.346 8.955
23 48 53.579 7.188
24 48 54.463 8.072
25 52 49.761 6.990
26 52 47.644 4.873
27 52 48.703 5.932
28 56 34.886 -4.264
29 56 34.647 -4.503
30 56 34.767 -4.383
31 96 1.249 -1.696
32 96 1.244 -1.701
33 96 1.247 -1.698
34 100 0.448 1.123
35 100 0.444 1.119
36 100 0.446 1.121
158
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza para la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
159
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.021
InterceptoY 8.98370e+001
- Varianza 1.60917e+000
- Intervalo de confianza 2.56370e+000
Pendiente -9.05122e-001
- Varianza 6.46600e-004
- Intervalo de confianza 5.13907e-002
Coeficiente de correlación r 0.986847
Coeficiente de determinación r² 0.973866
Varianza de la regresión SI² 3.08102e+004
Varianza residual SR² 2.43173e+001
Suma residual de cuadrados 8.26790e+002
Varianza del error experimental SE² 3.01608e-001
Varianza del error de la regresión SL² 8.19551e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 34
F tabulado 4.080
F calculado 1267.005
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5 Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0 Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 34
t tabulado 2.021
t calculado 70.820
El intercepto-Y es diferente de cero.
160
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 8.98370e+001
Pendiente : -9.05122e-001
Coeficiente de determinación r² : 0.973866
Anexo 12. Aspergillus niger en medio Digerido Caseína-soja
1. Resultados
El modelo usado es: bXaY +=
El test de linealidad del método dió los siguientes resultados:
Número de datos 33
Número de repeticiones 3
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 96.278 -7.052
2 2 95.265 -8.065
3 2 95.772 -7.558
4 4 94.722 -6.478
5 4 94.728 -6.472
6 4 94.725 -6.475
7 6 90.282 -8.788
8 6 91.186 -7.884
9 6 90.734 -8.336
161
Curva Crecimiento
# Tiempo %T Residuales
10 24 82.205 2.307
11 24 83.124 3.226
12 24 82.665 2.767
13 28 85.370 9.732
14 28 85.427 9.789
15 28 85.399 9.761
16 32 85.924 14.546
17 32 82.856 11.478
18 32 84.390 13.012
19 48 70.321 15.985
20 48 70.228 15.892
21 48 70.275 15.939
22 72 18.240 -10.534
23 72 18.087 -10.687
24 72 18.164 -10.610
25 78 14.531 -7.852
26 78 14.506 -7.877
27 78 14.519 -7.864
28 96 0.559 -2.653
29 96 0.562 -2.650
30 96 0.561 -2.651
31 100 0.973 2.021
32 100 0.966 2.014
33 100 0.970 2.018
162
1.1. Curva de calibración
Nivel de confianza de la curva de calibración: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza de los residuales: 97.50
163
1.3. Análisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t Student 2.021
InterceptoY 1.05460e+002
- Varianza 6.80245e+000
- Intervalo de confianza 5.27107e+000
Pendiente -1.06509e+000
- Varianza 2.12408e-003
- Intervalo de confianza 9.31433e-002
Coeficiente de correlación r 0.972183
Coeficiente de determinación r² 0.945140
Varianza de la regresión SI² 4.56060e+004
Varianza residual SR² 8.53925e+001
Suma residual de cuadrados 2.64717e+003
Varianza del error experimental SE² 2.75832e-001
Varianza del error de la regresión SL² 2.93456e+002
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)
Nivel de confianza 95.00
Grados de libertad (1,2) 1 , 31
F tabulado 4.080
F calculado 534.075
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0
Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 31
t tabulado 2.021
t calculado 40.435
El intecepto-Y es diferente de cero.
164
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN Análisis de la varianza de la linealidad
Intercepto Y : 1.05460e+002
Pendiente : -1.06509e+000
Coeficiente de determinación r² : 0.945140