VALIDASI METODE

VALIDASI METODEValidasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi yaitu sbb :1. Validasi lengkap (full validation).

Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini juga penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.2. Validasi parsial (partial validation)

Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang sudah divalidasi. Beberapa tipe metode yang termasuk validasi parsial adalah:

a. Metode yang ditransfer antar laboratorium atau analis

b. Ada perubahan pada metode bioanalisis (misalnya perubahan sistem deteksi)

c. Perubahan anti koagulan

d. Perubahan matriks pada spesies yang sama (misalnya plasma manusia diganti urin)

e. Perubahan prosedur proses sampling

f. Perubahan spesies pada matriks yang sama (misalnya plasma tikus diganti plasma kelinci)

g. Perubahan kisaran konsentrasi

h. Perubahan instrumentasi

i. Volume sampel terbatas

j. Matriks jarang

3 Validasi silang (cross validation)

Validasi ini dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda-beda. Pada validasi ini digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode bioanalisis lainnya sebagai komparator.

Metode yang selektif dan sensitif untuk evaluasi kuantitatif obat dan metabolitnya yang harus ditetapakan untuk preklinik, biofarmasetika dan studi farmakologi klinik. Validasi metode bioanalisis termasuk semua prosedur analisis dalam matriks biologi seperti dalam darah, plasma, serum dan urin.

Parameter yang diuji pada validasi analisis :

1 Kecermatan (Accuracy)Kecermatan adalah kedekatan hasil penetapan yang diperoleh dengan hasil sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai hasil perolehan kembali dari analit yang ditambahkan. Syarat akurasi yang baik adalah 98-102%, sedangkan untuk sampel hayati + 10% (2).% Perolehan kembali = Kadar hasil analisis x 100% Kadar hasil sesungguhnyaDianjurkan untuk melakukan penentuan akurasi dengan 5 konsentrasi berbeda (80-120%) yaitu 80%, 90%, 100%, 110% dan 120%. 2 Keseksamaan (Precision)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata. Jika prosedur diterapkan secara berulang pada sample-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan relatif baku (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksaman metode jika dilakukan berulang kali oleh analisis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Ketertiruan adalah keseksamaa metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan pada laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut dan analisis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi dan analis yang berbeda.

Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriterian ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium.

Keseksamaa dihitung dengan cara sebagai berikut :

a. Hasil analisis adalah X1, X2, X3, X4,.......Xn maka simpangan bakunya adalah

b. Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah :

KV = SD x 100%

X3 Selektivitas (Spesifisitas)

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupan cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan dengan hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan.4 Linearitas dan Rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematika yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linearitas yang dapat diterima.Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit.

Dalam praktek digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50-150% kadar analit dalam sampel. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya 8 buah sampel.Sebagai parameter adanya hubungan linear digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau r = -1 bergantung pada arah garis. Nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang dihitung adalah simpangana baku residual (Sy). Dengan menggunakan kalkulator atau perangkat lunak komputer, semua perhitungan matematik tersebut dapat diukur.

Sy = dimana

Sxo = Sy Sxo = standar deviasi dari fungsi

bVxo = Sxo Vxo = koefisien variasi dari fungsi

X

Syarat kelinieran garis

1. Koefisien relasi (r) dimana r 0,99902. Jumlah kuadrat sisa masing-masing titik temu (ri) mendekati nol (0) (ri)2 sekecil mungkin = 0

Ri = yi- ( bxi + a)

3. Koefisien regresi fungsi (Vxo)

Vxo 2,0 % (sediaan farmasi)

5,0 % (sediaan biologi) 5. Batas Deteksi dan Batas Kuantisasi

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan blangko. Sedangkan batas kuantisasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

Cara penentuan :

Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula yang digunakan adalah

Q = k x Sb S1Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ ( batas kuantisasi)

K = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantisasi

Sb = simpangan baku respon analit dari blangko

S1 = arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope ( b pada persamaan garis y = a +bx)

Batas deteksi dan kuantisasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier

y = a = bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (Sy/x).

a. Batas deteksi (Q)

karena k = 3 atau 10

Simpangan baku (Sb) = Sy/x maka Q = 3 Sy/x S1

b. Batas kuantisasi (Q)

Q = 10 Sy/x S1

6. KETANGGUHAN METODE (RUGGEDNESS)

Adalah metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda dll.

Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab atau antar analis.7. KEKUATAN (ROBUSTNESS)

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek pada presisi dan akurasi. KUIS KIMIA FARMASI DASAR1 a. Apa yang dimaksud dengan indikator metalokrom

b. Apa yang dimaksud dengan senyawa khelat

2 a. Tuliskan prinsip reaksi pada titrasi nitritometri

b. Tuliskan cara penentuan titik akhir pada titrasi nitritometri

3 a. Tuliskan prinsip reaksi pada titrasi TEI

b. Tuliskan cara penentuan titik akhir pada TEI

4 a. Tuliskan rumus dalam penentuan kadar dalam spektrofotometri

b. Tuliskan metode penentuan spektrofotometri menngunakan one point method dan metode kalibrasi.