Fakultas Farmasi Universitas Airlanggayuwono05@yahoo.com

Prof. Dr.rer.nat. Mochammad Yuwono, MS. Apt

Validasi dan Verifikasi

Metode AnalisisKuliah Anfar II, FFUA, 2012

2

TUJUAN MATA KULIAH VALIDASI METODE

2

1

Pokok BahasanDefinisi, acuan dan klasifikasi validasi metode; Tahapan validasi metode analisis; Macam-macam parameter validasi, rumus, cara uji dan kriteria penerimaan validasi metode

Mahasiswa memahami prinsip dasar validasi metode dan mampu melakukan validasi metode analisis

Setelah Kuliah

3

Quality is important in every product or service, but it is vital in medicines as it

involves life.

ValidasiValidasi Proses Validasi Metode Analisis

Raw Materials

Production Process

Finished Products

Produksi Obat, Makanan, Kosmetik

Validated

Process

4Validated Analytical Method

Specification Testing

In Process Control

Product Specification

Testing

Analysis of Pharmaceutical Products

Physical testingChemical Testing

Microbiology testing

5

Active Pharmaceutical Ingredient (API)Pharmaceutical ProductsIntermediates, Packaging materials

• Identity• Purity• Strength• Other characteristics

ChecksValid analytical Method

Analisis Data & Laporan Hasil

Laboratory

Quality Assurance:

Preparasi Sampel dan Analisis Lab

ISO/IEC 17025:2008G L PPen

gemba

ngan

Meto

de Validasi/Verifikasi metode

Sampel

Prosedur Analisis

Penyediaan bahan dan Kualifikasi alat/instrumen

Metode Analisis Kimia

GC-MS GC-FTIR/MSLC-MS/MS LC-NMR

Hyphenated Instruments

Metode Analisis

Optimasi

Validasi

Implementasi (rutin)

Pengembangan

Revalidasi

Pre-validasi

R&D

(Andev)

QC

Metode StandarMetode yang dikembangkan dan

ditetapkan oleh suatu organisasi atau badan standardisasi nasional suatu negara

Metode standar diterima secara luasContoh metode standar:

ISO; ASTM (American Society for Testing Material); BSN (Badan Standardisasi Nasional)

Metode ResmiDipublikasi atau ditetapkan oleh

lembaga/pemerintah negara tertentuWajib digunakan oleh organisasi

pemerintah atau swasta untuk kesesuaian dengan peraturan/standar

Dirumuskan dan ditetapkan oleh suatu komisi atau badan hukum

Contoh: Farmakope (USP, BP, FI)

11

Kenapa perlu validasi metode?

1. Agar dihasilkan data yang ajeg dan terpercaya

2. Untuk memenuhi persyaratan GLP cGMP ISO 17025 FDA dll.

Menjamin mutu produk Dapat diterima oleh badan internasional

12

Definisi Validasi Metode (USP) Validation of an analytical method is the process by which it is

established, by laboratories studies, that the performance characteristics of the method meet the requirements for the intended analytical applications.

Term

inol

ogi

Verifikasi

Validasi

Kualifikasi

• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan sebelumnya

Kualifikasi instrumen:DQ, IQ, OQ dan PQ

• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis baku/standar pada kondisi nyata di laboratoriumnya

Metode

Metode

Instrumen

Metode baku/Standar Compendial Method

(USP, FI, AOAC, ISO dll.)

Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup

Verifikasi

Validasi

Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah yang dilakukan untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang sesuai dengan tujuan pengunaannya.

konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi.

(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)

Verifikasi Metode Adopsi metode baku/standar Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium mampu melakukan analisis di laboratoriumnya untuk menunjukkan bahwa kinerja metode

dapat ditiru atau diulang oleh laboratorium yang bersangkutan dengan hasil yang sama

Panduan validasi metode analisis

ICH Q2A : Text on validation of analytical ProcedureICH Q2B Validation of analytical procedures

methodologyFDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)a. Reviewer guidance validation of

chromatographic methodsb. Submitting sample and analytical data for

method validationc. Analytical procedure and method validation

for human studies d. Bioanalytical method validation for human

studiesUSP: Validation of compendial method

Contoh Acuan Verifikasi Metode

23

Kategori Metode Analisis

Metode analisis untuk identifikasi

Penetapan cemaran atau hasil Degradasi Penetapan kuantitatif (II a) dan uji batas/kualitatif (II b)

Penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif dalam sediaan farmasi

Penetapan karakteristik sediaan (disolusi, pelepasan obat, dll)

I

II

III

IV

24

Prosedur analisis

Pengambilan Sampel

Preparasi Sampel

Analisis

Evaluasi data dan pelaporan hasil

Validasi melibatkan

keseluruhan prosedur analisis

(mulai dari pengam-bilan sampel sampai pelaporan hasil

Permintaan Validasi

Literature searchTelaah karakteristik AnalitPenyiapan bahan dan alat

Pengembangan/optimasi Metode

Pembuatan protokol Validasi

Percobaan laboratorium sesuai

protokol validasi

Analisis DataPenyusunan Laporan Validasi

Penyerahan dokumen

Tahapan Validasi Metode

ValidasiMetode

Protokol Validasi/Verifikasi Metodologi atau prosedur bagaimana

percobaan atau pengujian parameter validasi direncanakan

Disusun secara rinci Penting dibuat sebelum pelaksanaan uji

parameter validasi Pelaksanaan validasi metode menjadi terarah

dan sistematis Disusun dalam format yang telah ditetapkan

Contoh Isi Protokol Validasi/Verifikasi Cover Halaman Pengesahan Ruang lingkup Tujuan Bahan dan Alat Aspek Keamanan lab Prosedur percobaan

akurasi presisi dll.

Kriteria keberterimaan Daftar Rujukan

28

Karakteristik kinerja metodeUSP and ICH

PresisiAkurasi

Batas DeteksiBatas Kuantitasi

Linearitas

Selektivitas/Spesifisitas

Rentang

Validasi Metrode

Robustness/RuggednessSystem Suitability Test

29

Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi rendah Presisi tinggi

Akurasi tinggi Presisi tinggi

Akurasi tinggi Presisi rendah

Akurasi rendah Presisi rendah

Karakteristik kinerja metode (parameter validasi/verifikasi)

yang dibuktikan harus berdasarkan pada tujuan

kegunaan dan kategori metode tersebut.

31

USP Data Elements Required For Assay Validation

Analytical Performan

ceParameter

Assay Category 1

Assay Category 2Assay

Category 3Quantitati

ve Limit Tests

Accuracy Yes Yes * *Precision Yes Yes No YesSpecificity Yes Yes Yes *LOD No No Yes *LOQ No Yes No *Linearity Yes Yes No *Range Yes Yes * *Ruggedness Yes Yes Yes Yes* May be required, depending on the nature of the specific test.

32

ICH Validation Characteristics

Type of Analytical Procedure

Identification

Impurity testingAssayQuantitativ

e Limit Tests

Accuracy No Yes No YesPrecision Repeatability

No Yes No Yes

Interm. Prec. No Yes No Yes

Specificity Yes Yes Yes YesLOD No No Yes NoLOQ No Yes No NoLinearity No Yes No YesRange No Yes No Yes

1. Confirmation of Identity, a method that ensures a material is what it purports to be or confirms

the detection of the target analyte.2. Quantifying an analyte at a low concentration.3. Determining if an analyte is present above or below a 4. specified, low concentration (often called a Limit Test). The

specified concentration is close to the LOQ.4. Quantifying an analyte at a high concentration.5. Determining if an analyte is present above or below a specified, high concentration (often called a Limit Test). The specified concentration is substantially above the LOQ.6. Qualitative test.

Kategori Analisis

Percobaan Laboratorium pada Validasi Metode

Ketegaran(Robustness/Ruggedness)

1

2

3

4

Linearitas/Rentang; LOD dan LOQ

Presisi dan Akurasi

Uji Selektivitas/Spesifisitas

Uji terhadap senyawa pengganggu dari matriks, cemaran, hasil degradasi

38

Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH menggunakan istilah Specificity

IUPAC dan AOAC menggunakan istilah Selectivity

AOAC: Specificity “highest selectivity”

Kuliah Anfar

II, 2008 FFUA

39

Specificity (ICH/USP)Specificity (USP/ICH): The ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components to expected to be present, such as impurities, degradation products, and matrix components.

Selectivity describes the ability of an analytical method to differentiate various substances in a sample.

40

Spesifik dan SelektifSelektif:Mampu membedakan antara senyawa analit dengan derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu lainnyaSpesifik:Mampu mengenal respons untuk analit tunggal/murni

41

Spesifisitas/Selektivitas:

Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan:Blanko sampel/Placebo (Sampel minus analit)Zat Hasil degradasi (degradants)Zat yang memiliki struktur mirip (Related

substancesZat metabolit (untuk bioanalisis)

42

Spesifisitas/Selektivitas: Blanko sampel/Placebo

tidak menghasilkan peak/noda dengan waktu retensi/Rf yang sama dengan analit

Peak/noda analit terpisah dari peak/noda lainnya

(Rs ≥1,5)

42

Placebo

Sampel

(Rs ≥1,5)

Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)

45

Specificity/Selectivity:

Lakukan forced degradation studies (studi degradasi paksa)

Sampel disimpan pada suhu/kelembaban tertentu atau penambahan oksidator

Bandingkan profil pemisahan peak

sebelum dan sesudah perlakuan

Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

46

Forced Degradation Studies

Heat Temperature (50 - 60 oC) Humidity Kelembaban (70 to 80%) Acid Hydrolysis HCl 0.1 N Base Hydrolysis NaOH 0.1 N Oxidation H2O2 (3 to 30%) Light UV/Vis

Spesifisitas: Uji kemurnian analit Menggunakan Detektor Diode array Teknik Spiking

Peak hasil spiking menunjukkan satu peak/noda dan memiliki tR/Rf sama

Pada TLC menggunakan sistem pengembang berbeda-

beda GC-MS LC-MS; LC-MS/MS

Contoh studi degradasi paksa (HPLC-DAD)

PENETAPAN KADAR PAROXETINE DALAM SEDIAAN TABLET

Overlay spectra UV - analit

Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine 20 mg

Condition Time (h)

% Recovery

RRT* of degradation products

Acid 0.1 N HC1, 80°C 50 98.0 None detected Base 0.1 , 80°C 50 96.5 1.65 Hydrogen peroxide 0.3%, 80°C

2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27

0.31, 0.35, 0.39, 0.43 0.45, 0.49, 0.52, 0.55 0.59, 0.63, 0.71, 0.76 1.13, 1.36, 1.64

Heat dry, 80°C 72 99.2 None detected Heat wet, 80°C 72 96.2 1.65 Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected

Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42

0.44, 0.55, 0.82, 0.88 1.13, 1.60

* RRT, relative retention time.

51

Spot Identity test: TLC Scan spektra in situ UV/Vis analit dan zat

standar Evaluasi korelasinya r > 0.999

[mv]

[nm]

52

Linearitas (Linearity)

Kemampuan suatu metode untuk menunjukkan hubungan secara langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit.

A B C D

●

●●

●●

Respon alat

53

Linieritas

Melalui analisis statistik Linear Regression (y = mx + b) Correlation Coefficient (r), y-intercept (b), slope (m), residual sum of squares

Disarankan menggunakan minimum 5 macam konsentrasi analit

Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan dari sampel hasil pengenceran

Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran dan/atau larutan spike

2/122 })(){())((

1 yyxxyyxx

ri

ii

54

Evaluasi terhadap LinieritasRelative process standard deviation

(Vxo)Mandel’ testResidual testANOVA-linearity testingRSD of the Plot of response factor Vs.

concentrationXp value- Funk’s et al. r value Homogeneity of the linear-curve

55

Evaluasi Linieritas

i

iiY

YXO

xoXO

bxayN

yyS

bSS

XSV

ˆ , 2

ˆ where

%100

0.05 p and

2-N ffor factor student t t , 1

11. .Y

with.

11. . 2

22

2

P

2

2

iiXX

XXtableY

XX

PtableXOP

XN

XQ

QX

NtSa

QbYY

NtSX

Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear Vxo = koefisien variansi regresi linear

Vxo = <2-5%

Koefisien korelasi Nilai r ternyata TIDAK menjamin

linieritas respons dan konsentrasi Kurva non linier dapat memiliki r

yang tinggi Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r

tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5 rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632

r membuktikan linieritas jika rentang tidak terlalu lebar dan r ≥ 0,999

Residual dan Least square

Makin kecil atau makin besar konsentrasi deviasi makin besar dikuadratkan dan diminimasi Least square

Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of variance = homoscedasticity)

Persamaan garis regresi koefisien korelasi r ≥ 0,999 Persamaan garis melewati titik 0,0 Intersep tidak berbeda secara bermakna dengan nol

lakukan uji t Slope berbeda secara bermakna dengan harga nol

lakukan uji t

Respons faktor = y/x

Uji Homogenitas digunakan untuk mengetahui

homogenitas varian pada persamaan garis regresi

Uji F menguji homogenitas batas atas dan bawah

Uji Cochran dan uji Barlett menguji keseluruhan titik pada rentang persamaan garis

61

62

Rentang (Range)

Interval antara konsentrasi terbesar dan terkecil dari analit dalam sampel

Memenuhi syarat dalam hal presisi, akurasi dan linieritas

Contoh soal

Kadar Vitamin B2

(µg/mL)

Area Vitamin B2

0,50 10,85673

1,01 16,84920

2,03 35,91708

5,08 83,20131

10,16 161,14166

20,32 322,53513

40,64 629,94366

r hitung = ????Persamaan garis regresi : ????Vx0 = ????

64

Minimum Specified Range:For Drug Substance & Drug product Assay

80 to 120% of test Concentration

For Content Uniformity Assay 70 to 130% of test Concentration

For Dissolution Test Method +/- 20% over entire Specification Range

For Impurity Assays From Reporting Level to 120% of Impurity

Specification for Impurity Assays

65

Uji Homogenitas kurva kalibrasi

Batas Deteksi

Batas Deteksi?

Batas Deteksi:Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi

67

Lowest amount of analyte in a sample that can be detected but not necessarily quantitated.

Estimated by Signal to Noise Ratio of 3:1.

Detection Limit (DL)

Lowest amount of analyte in a sample that can be quantified with suitable accuracy and precision.

Estimated by Signal to Noise Ratio of 10:1.

Quantitation Limit (QL)

68

Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)

1. Based in Visual Evaluations- Used for non-instrumental methods

2. Based on Signal-to Noise-Ratio- 3:1 for Detection Limit- 10:1 for Quantitation Limit

3. Based on Standard Deviation of the Response and the Slope menggunakan sampel konsentrasi rendah dapat digunakan SD dari residual; SD intrersep

70

Based on Signal-to Noise-Ratio

71

Based on the Standard Deviation of the Response and the Slope

where s = the standard deviation of the response ( SD of blank samples or SD of intercepts of regression line)S = the slope of the calibration curve

72

Akurasi

Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)

Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil analisis antara metode yang divalidasi dengan metode standar uji t harus tidak berbeda makna

Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap blanko atau sampel.

73

Akurasi

Persen perolehan kembali (% recovery)

Persyaratan untuk assay validation = 98-102%

Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi

Adisi standar pada blanko/plasebo

%100Re% xyasesungguhnKadar

diperolehyangKadarc

74

KURVA AKURASI menurut Funk et. al.

- Untuk mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis, Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil analisis) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)

Xf = af + bf. Xc

- Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05

QxxXc

N1 . S . ta =aCr

2

yftableff

Qxx.Stb=bCr yftable

ff

2-N)]X-b+(a-[X

=S2

iffifyf

t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %.

75

M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology, Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)

76

Analyte recovery at different concentration

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Analyte Ingred. (%)

Analyte ratio Unit Mean recovery (%)

100 1 100 % 98-102≥ 10 10-1 10 % 98-102≥ 1 10-2 1% 97-103

≥ 0.1 10-3 0.1% 95-1050.01 10-4 100 ppm 90-107

0.001 10-5 10 ppm 80-1100.0001 10-6 1 ppm 80-110

0.00001 10-7 100 ppb 80-1100.000001 10-8 10 ppb 60-1150.0000001 10-9 1 ppb 40-120

Hitung berapa % recovery?% Bahan Aktif

terhadap klaim label dalam Tablet

Berat yang ditimbang (mg)

Berat tablet yang ditemukan (mg)

50 10,02 9,9810,02 9,9910,02 9,98

100 20,04 19,9920,04 19,9920,04 19,99

150 30,05 29,9730,05 29,9630,05 22,99

78

PresisiKedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen

Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)

Meliputi: - Repeatability - Intermediate Precision - Reproducibility

79

Repeatability

Kondisi sama pada interval waktu yang singkat

Satu larutan uji disuntikkan berkali-kali pada hari yang sama, alat yang sama, analisis serta kondisi lain yang sama.

Disebut juga Intra-assay precision

80

Intermediate Precision

Disebut juga “within-laboratory varia-

tions”.

Berbeda hari, atau analis, atau in-

strument (dalam satu laboratorium)

Sebagai bagian Ruggedness menurut

USP

81

Repeatability test at different labs.

Berbeda analis atau instrument dari

laboratorium yang berbeda

Reproducibility

82

Uji Presisi :Dianjurkan menggunakan 3 macam

konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 % dari konsentrasi target

Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 replikasi

Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang berbeda dan analisis yang berbeda

Kriteria penerimaan: tergantung kategori analisis atau konsentrasi analit

Contoh: RSD < 2% (kategori I)

83

Analyte concentration vs precision

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)

100 1 100 % 1.3≥ 10 10-1 10 % 2.7≥ 1 10-2 1 % 2.8

≥ 0.1 10-3 0.1% 3.70.01 10-4 100 ppm 5.3

0.001 10-5 10 ppm 7.30.0001 10-6 1 ppm 110.00001 10-7 100 ppb 15

0.000001 10-8 10 ppb 210.0000001 10-9 1 ppb 30

Kurva Horwitz

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)

C adalah konsentrasi (fraksi desimal)

Misalnya : Untuk kadar C = 100% maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

HORRAT = SBRobs/SBRcalc

Hitung presisinyaReplikasi Kadar Paroxetine

(mg/tablet)(Analis I)

Kadar Paroxetine (mg/tablet)(Analis II)

1 19,93 19,89

2 20,03 19,823 19,91 19,914 19,86 19,935 20,02 19,92

6 19,79 19,90

86

Definition: Capacity to remain unaffected by small variations in method parameters

Determination: Comparison results under differing conditions with precision under normal conditions Variations may include: stability of analytical

solution, variation of pH in a mobile phase, different column (lot/supplier), temperature, flow rate.

Robustness

87

Ruggedness

degree of reproducibility of test results obtained by the analysis of same samples

under a variety of conditions, such as different laboratories, analysts, instruments, different lot of reagents, days etc.

88

Re-Validation

“When sponsors make changes in the analytical procedure, drug substance, drug product, the changes, may necessitate revalidation of the analytical procedures.”

“The degree of revalidation depends on the nature of the change.”

Terima Kasih!