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Vantaggi e limiti della NIPT
Convegno. “Sindrome di Down dalla Diagnosi alla Terapia”
Napoli, 19-20 Ottobre 2018
Simona CavaniS.C. Laboratorio di Genetica Umana – E.O. Ospedali Galliera
Rosaliartbook
Materiale genetico fetale nel sangue materno
Anomalie cromosomiche
Incompatibilita’ Rh - MEN
Malattie geniche
Determinazione Sesso fetale
Cellule fetali circolanti nel sangue materno
•Cellule del trofoblasto
•Cellule nucleate della serie rossa del sangue
•Leucociti
•Cellule staminali mesenchimali
1970 - 1996
•Scarsa quantita’ 1/107 cellule nucleate materne – n°1-3/ml di sangue
•Difficolta’ di isolamento -per via meccanica (es: gradients, single cell manipulation, high specificity sorting)
-per via biochimica (es: antigens, mRNA, fetal specific protein)
•Lunga permanenza nella madre anche anni
•Difficolta’ di analisi Fish, Cariotipo, QF-pcr, CGH-SNP, NGS
Bassa Sensibilita’ e Specificita’NIFTY = National Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell Isolation Study
multicenter clinical project to develop non-invasive methods of PD
DNA fetale libero circolante nel sangue materno (cffDNA)
1997
•origina dalla placenta (apoptosi cellule del citotrofoblasto)
•rilevabile dalla 5°-7° settimana
•aumenta nel corso della gravidanza
•~10% del DNA libero circolante totale
•970 volte di piu’ rispetto a DNA fetale cellulare
•frammenti 145-200 paia di basi
•assente a 24h dal parto (emivita 20’)
2008
Taglauer et a., Placenta,2014, 36, S64-68
2011 Commercializzazione primi test NIPT per aneuploidieGennaio - Cina
Dicembre - USA
NIPT per le piu’comuni aneuploidie fetali(Non Invasive Prenatal Testing per trisomie 13, 18, 21)
NO LEA
NIPT – Test Commerciale
NIPT – Test Prenatale Non Invasivo
Isolamento
plasma
Prelievo di sangue
(5-10ml)Estrazione DNA
libero circolante(madre + feto)
Amplificazione cfDNA(madre + feto)
NGS•Sequenziamento
•Allineamento
•Conta sequenze
Analisi bioinformaticaReferto
2 – 14 giorni
NGS
Illumina Ltd
NGS
•576 marcatori SNP NON polimorfici (13, 18, 21)
•192 marcatori SNP polimorfici (cr. 1-12)
NGS – DANSR (Digital Analysis of Selected Regions)
Analisi NGS
5% del DNA genomico
Analisi NGS
Conta
1ml plasma = cfDNA equivalente a 100 cellule (~90% materno – ~10% fetale)
Gravidanza normale
Cr.21 materni
2x90=180
Cr.21 fetali
2x10=20
Totale cr.21= 200
Gravidanza tri 21
Cr.21 materni
2x90=180
Cr.21 fetali
3x10=30
Totale cr.21= 2100,05%
(Paerinatal)
No gravidanza
Gravidanzanormale
GravidanzaTri 21
cfDNA feto
cfDNA madre
Analisi NGS
Analisi bioinformatica
N° di “READS”
cfDNA – Quantita’
cfDNA = ~90% materno – ~10% fetale
10ml di sangue
5.5ml di siero
6ng – 50ng cfDNA
10ml di sangue in toto 300ng – 1.500ng DNA
cffDNA – Settimane di gestazione
(Wang et al, Prenat Diag. 2013)
NIPT >10° sett. di gestazione
www.depositphoto.com
cffDNA - BMI
(data from Labor Enders, Stuttgart, Harmony Test)
> diluizione con aumento della massa corporea> rilascio cfDNA materno dalle celule adipose (Bianchi et.al.,2012)
colourbox.com
Altri Fattori che influenzano la Frazione Fetale
Materni:
-anomalie cromosomiche
-trapianto allogenico d’organi
-terapia con cellule staminali allogeniche
-emotrasfusione
-tumori
Della gravidanza:
-Fecondazione assistita mediante ovodonazione
-Gravidanze gemellari
-Vanishing twin
Fetali:
-Trisomia 21: aumento FF
-Trisomie 13/18: < cffDNA per riduzione volume placentare (Rava et al.,2014 – Wegrzyn et al.,2005)
2% NIPT nel I trimestre NO RISULTATO per bassa Frazione Fetale
Quantificazione cffDNA
SNPsValutazione
polimorfismi di singoli nucleotidi
FrammentiValutazione
quantita’ frammneti 145-200bp
Nessuna
Report
Mosaicismo
Casistica Casi Mosaici (%)
II trimestre
USA (1984)
Europa(1984)
Canada (1984)
62.279
44.170
12.386
0,25
0,10
0,30
I trimestre
Vejerslev (1989)
C.E.S.C.A. (1988)
11.855
3.354
1,18
1,20
1% mosaicismo
Cromosoma Sensibilita’ Falsi negativi Specificita’ Falsi positivi
21 99,7% 0,3% 99,96% 0,04%
18 97,9% 2,1% 99,96% 0,04%
13 99,0% 1,0% 99,96% 0,04%
NIPT per trisomie 21, 18, 13
Gil et al., 2017
Trisomia 21
In pratica……
NIPT per trisomie 21, 18, 13
Cromosoma Sensibilita’ Falsi negativi Specificita’ Falsi positivi
21 99,7% 0,3% 99,96% 0,04%
18 97,9% 2,1% 99,96% 0,04%
13 99,0% 1,0% 99,96% 0,04%
VANTAGGI
•SICURO = prelievo di sangue (non invasivo)
•ACCURATO = sensibilita’ e specificita’ elevate
•PRECOCE = dalla 10° sett. di gestazione
•RAPIDO = risultato in 2-14gg
LIMITI•LIMITATO ai crom. analizzati (% anomalie CC)
•FALSI NEGATIVI/POSITIVI
•NO RISULTATO ~2%
•GEMELLARITA’ = no analisi singolo gemello
•RISULTATI ALTERATI da det. condiz. materno/fetali
Gil et al., 2017Popolazione a basso rischio < VPP
NIPT per trisomie 21, 18, 13
NIPT per trisomie 21, 18, 13
NIPT per altra anomalie cromosomiche
DR FPR
Monosomia X 90.3% 0.23%
Altra Anom. Cr.Sex (XXX, XXY, XYY) 93.0% 0.14%
Gil et al., 2015
DR VPP
Microdelezioni 62-95% 7%
Wapner et al., 2014Sequenom, 2014
Studio cffDNA – Altre applicazioni
• Determinazione del sesso fetale (ricerca SRY)
-malattie legate all’X (es:DMD)
-iperplasia congenita dei surreni (sindrome adreno-genitale)
-gestione feti con ambiguita’ genitali
• Determinazione Rh-D fetale (in madri Rh- con partner Rh+)
• Malattie Autosomiche Dominanti ad insorgenza de novo o ereditate dal
padre (es: acondroplasia, displasia tanatofora, S. di Apert)
• Malattie Autosomiche Recessive con ricerca della mutazione paterna (es:
fibrosi cistica, talassemia)
NIPT – Altre applicazioni?????
NIPT – Altre applicazioni?????
NIPT – Altre applicazioni?????
Unita di Fisiopatologia Fetale – E.O. Ospedali Galliera
Ubaldo Passamonti
Bianca Rocca
Gloria Fondacaro
Michela Malacarne
Roberto Ferrari
Chiara Cavallini
Ilaria Russo
Guido Zerega
Lorella Stagni
Giuseppe Piombo
Antonella Pandullo
Domenico Coviello
Grazie per l’attenzione
Laboratorio di Genetica Umana – E.O. Ospedali Galliera