Variantes polimórficas del ... - Universidad de Chilerepositorio.uchile.cl/tesis/uchile/2012/qf-garay_ji/pdfAmont/qf... · Reacción en cadena de la polimerasa PCR larga Polimorfismos

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

“VARIANTES POLIMÓRFICAS DEL CITOCROMO P450

2D6 Y SU INFLUENCIA SOBRE SU ACTIVIDAD

CATALÍTICA DEBRISOQUINA 4-HIDROXILASA IN VIVO”

Tesis para optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica

Área de Especialización: Toxicología y Diagnóstico Molecular

y

Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímica

JOSELYN IVONNE GARAY CORTESI

Directores de Tesis

Dr. Luis Quiñones Sepúlveda, B.Q.

Dr. Iván Saavedra Saavedra, Q.F.

Santiago de Chile

2012

Variantes polimórficas del citocromo P450 2D6 y su influencia sobre la actividad catalítica

debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo

I

Dedicatoria

A mis padres y hermanas…



II

Agradecimientos

Nadie dijo que sería fácil… La universidad nos pone a prueba, no tan sólo en el ámbito educacional, sino también familiar y emocional. El paso por la carrera de bioquímica me enseñó que no existen diferencias económicas que se traduzcan en diferencias intelectuales, sino que todos tenemos las mismas posibilidades y sólo depende de cada uno. Mami, siempre me has apoyado aunque muchas veces no estemos de acuerdo. Tu amor es incondicional y sin tí, no habría llegado hasta donde estoy. Te admiro infinitamente como madre, mujer y persona. Papi, gracias por tus consejos, tus charlas, siempre eternas pero llenas de experiencia. Gracias por apoyarme en mis peores momentos y ayudarme a levantarme cada vez que lo he necesitado. Me enseñaste lo que es la responsabilidad y la organización, creo que esta tesis es el mejor ejemplo de tus enseñanzas. Janita y Conita, mis hermanas. No existió un día en que no me preocupara o hablara de ustedes. Me apoyaron en cada prueba y en cada locura que se me ocurría. Son incondicionales conmigo y mi cariño es incondicional hacia ustedes. Recién están comenzando a vivir y quiero ser estar ahí día a día. Gracias por tan sólo por existir, son mi vida entera. Las adoro. A mis amigos de bioquímica, Anita, Panchi, Dani, Pablo, Xime, a mis compañeros y tantos amigos más que hice durante la carrera. Gracias por transformarse en mi familia cada vez estudiamos y compartimos juntos. A mis compañeros del colegio, Carla, Anita, Cristina y especialmente a Jesús, jamás entendieron lo que estudiaba, pero siempre estuvieron presentes y me apoyaron. Hemos vividos muchas etapas juntos y les agradezco por seguir a mi lado. A mis tutores de tesis, Dr. Iván Saavedra y Dr. Luis Quiñones, gracias por creer en mí y ayudarme a realizar mi tesis. Gracias a la comisión evaluadora, por su apoyo y críticas constructivas. Gracias a la Dr. Daniela Seelenfreund por sus consejos e infinita disposición hacia mi persona, siempre sentí en sus palabras una muestra de cariño. Gracias especialmente a la Dr. Amalia Sapag, esta tesis no sería lo que es sino es gracias a su preocupación y dedicación, nunca esperé que un docente me dedicaría tanto tiempo y me enseñaría de la forma que Usted lo hizo. Gracias.

Al laboratorio IFT y a todos los integrantes que alguna vez pasaron por el laboratorio, me vieron reír, llorar, caerme, enojarme, pelear, siempre me apoyaron y se rieron conmigo ,y de mí. Los quiero. Gracias a mi pololo, hemos vivido un largo proceso, pero hemos vencido todas las adversidades y seguimos juntos, esta es una etapa cumplida para mí y para nosotros. Espero tener tu apoyo y amor en todas las etapas que me quedan por cumplir. Te amo

Este logro no es solo mío, sino de todas las personas que me apoyaron y me animaron a seguir cuando me sentí derrotada, infinitamente gracias.



III

III

Índice

Pág.

Índice de figuras...……………………………………………………………………………………………………...v

Índice de tablas…………………………………………………………………………………………..……………vii

Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………….……viii

Resumen…………………………………………………………………………………………...……………………...ix

Summary…………………………………………………………………………………………………………………...x

1. Introducción……………………………………………………………………………………….………………….…1

2. Hipótesis……………………………………………………………………………………………….………………..20

3. Objetivos………………………………………………………………………………………………………………..21

3.1. Objetivo general……………………………………………………………………………………………………...21

3.2. Objetivos específicos…………………………………………………………………………………….………..21

4. Materiales y Metodología…………………………………………………………………………………....22

4.1. Materiales…………………………………………………………………………………………….………………….22

4.2. Metodología………………………………………………………………………………………………….…………24

4.2.1 Determinación del tamaño muestral ………………………………………….………….24

4.2.2. Reclutamiento de voluntarios sanos………………………………………………….….24

4.2.3. Análisis de las muestras según grupo sanguíneo (ABO)……………………..24

4.2.4. Extracción y purificación de DNA………………………………………………….……….25

4.3. Análisis genotípico……………………………………………………………………………………………........25

4.3.1. Identificación del alelo CYP2D6*2 (C2850T) mediante una

PCR-RFLP…………………………………………………………………………………………......24

4.3.2. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una PCR

alelo específica semianidada.………………………………………………………….…....27

4.3.3. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una

PCR-RFLP…………………………………………………………………………………………..…30

4.3.4. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCR

alelo específica semianidada……………………………………………………..………....32

4.3.5. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una

PCR-RFLP……………………………………………………………………………………….….…35

4.3.6. Identificación de la duplicación y multiplicación génica del gen

CYP2D6 mediante una PCRL………….………………………………………….….…..…37

4.3.7. Estimación del porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)…...39

4.4. Análisis farmacocinético: CYP2D6 in vivo………….………….………..….………….………….……41

4.4.1. Análisis de control de calidad del comprimido Declinax………….….………...41

4.4.2. Reclutamiento de voluntarios………….………….………….………….…………...………41



IV

IV

4.4.3. Recolección de muestras de orina………….………….………….………….….……….42

4.4.4. Determinación de debrisoquina y 4-hidroxidebrisoquina en orina…….….43

4.4.5. Equipamiento/ Instrumentación………….………….………….………….…………...…...43

4.4.6. Preparación de soluciones madres de debrisoquina………….……….….…….43

4.4.7. Curvas de calibración………….………….………….………….………….…………..……….45

4.4.8. Procesamiento de muestras de voluntarios sanos.………….……….….….…….45

4.4.9. Determinación de la razón metabólica………….………….………….…………..…….46

4.5. Análisis estadístico………….………….………….………….………….………….………….………..…….…..46

5. Resultados………….………….………….………….………….………….………….………….………….……...48

5.1. Análisis genotípico………….………….………….………….………….………….………….…………..……….48

5.1.1. Voluntarios sanos………….………….………….………….………….………….…………..….48

5.1.2. Frecuencias alélica y genotípica de C2850T (CYP2D6*2)…….……..…….. 48

5.1.3. Frecuencias alélica y genotípica de A2549del (CYP2D6*3)……..…….……48

5.1.4. Frecuencias alélica y genotípica de G1846A (CYP2D6*4)…….……...……. 48

5.1.6. Frecuencia genotípica de la duplicación o multiplicación

génica de CYP2D6*1xN………….……………………………………….….…………...…….58

5.1.7. Resumen de las frecuencias alélica y genotípica de CYP2D6.….......…….58

5.1.8. Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)………….…………...……58

5.2. Análisis farmacocinético………….………….………….………….………….………….………….……..…...63

5.2.1. Prueba de identidad y uniformidad de contenido del comprimido

Declinax………….………….………….………….………….………….………….………….….…..63

5.2.2. Genotipos de los voluntarios sanos………….………….………….………….…….…..63

5.2.3. Determinación de la razón metabólica de debrisoquina

4-hidroxilasa……………………………………………………………………………………….….64

5.2.4. Análisis estadístico………….………….………….………….………….………….……...…......65

6. Discusión………….………….………….………….………….………….………….………….………….…………79

7. Conclusiones………….………….………….………….………….………….………….………….……………...86

8. Bibliografía………….………….………….………….………….………….………….………….…………….……87

9. Anexos

Anexo 1: Consentimiento informado para análisis genético………….…….…….95

Anexo 2: Consentimiento informado para estudio farmacocinético de

debrisoquina………….………….………….………….………….………….…….…….96

Anexo 3: Acta de aprobación del Comité de Ética………….………….…………..….99

Anexo 4: Criterios de inclusión y exclusión de voluntarios para estudio

farmacocinético………….………….………….…….….………….………….………101

Anexo 5: Instructivo para el estudio farmacocinético de debrisoquina…...102



V

V

Índice de figuras

Pág.

Figura 1: Farmacogenética………….………….………….………….………….…………………….....2

Figura 2: Medicina personalizada: del genotipo al fenotipo………….…………..…........8

Figura 3: Ubicación génica del gen CYP2D6……………….…………………………….……...9

Figura 4: Metabolismo del tamoxifeno….……….………….…………………..……….…………14

Figura 5: Estructura alélica funcional y no funcional de CYP2D6…………………..18

Figura 6: Ruta de transformación de la debrisoquina mediada por

la enzima CY2PD6………….………….………….……………………………………….....19

Figura 7: Esquema de corte del producto de la PCR con la enzima

HhaI para la detección de C2850T

(asociada al alelo CYP2D6*2)..……….………….………….…………………………26

Figura 8: Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada

para la detección del polimorfismo A2549del

(asociado al alelo CYP2D6*3).………….………………………….….……………….29

Figura 9: Digestión con la enzima MspI del producto de la PCR para la

detección del polimorfismo A2549del.………….…………..………….……………31

Figura 10: Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada

para la detección del polimorfismo G1846A

(asociado al alelo CYP2D6*4)………….………….………….……….….……………33

Figura 11: Digestión con la enzima MvaI del producto de la PCR para la

detección del polimorfismo G1846A…………….………………….…...………….36

Figura 12: Duplicación génica o multiplicación génica del gen CYP2D6*1

y su detección mediante la PCRL………………………………………….………...38

Figura 13: Estructura molecular del sulfato de debrisoquina………….…………………40

Figura 14: Patrones electroforéticos de C2850T (CYP2D6*2)………….…………..…...50



VI

VI

Figura 15: Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través

de la PCR alelo específica semianidada…………………….….………...............52 Figura 16: Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través de la PCR RFLP…………………………………………………………………..…………….53

Figura 17: Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través

de la PCR alelo específica semianidada………….………..................................55

Figura 18: Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través

de la PCR RFLP………….……………………………………………………………..….......56

Figura 19: Patrones electroforéticos de CYP2D6*1xN………….…………………...………60

Figura 20: Espectro característico de sulfato de debrisoquina……………………........63

Figura 21: Cromatogramas representativos de los fenotipos ME, MI y MP………69

Figura 22: Relación entre genotipos y razones metabólicas………….………………….76

Figura 23: Comparación de los promedios de la razones metabólicas según

genotipo….……….……….……….……….……….……….……….……….……….……...........77

Figura 24: Fenotipos esperados y fenotipos observados……….………….………………79



VII

VII

Índice de tablas

Pág.

Tabla 1: Sustratos, inhibidores e inductores de CYP2D6………….………….…..…….11

Tabla 2: Variables alélicas de CYP2D6………….………….………….……..…….……..……..15

. Tabla 3: Oligonucleótidos………………………………………………………….…..…….……..….…23

Tabla 4: Concentraciones de las soluciones madres de debrisoquina….…..…...44

Tabla 5: Razones metabólicas de debrisoquina………….………….…………………...…..47 Tabla 6: Características de la población del estudio………….……................................49

Tabla 7: Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CY2D6*2 (C2850T)………………………………………………………………..…….…….51

Tabla 8: Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CYP2D6*3 (A2549del)………….………………………………………………...…….......54

Tabla 9: Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CYP2D6*4 (A1846A)………….………………………………………………….……......…57

Tabla 10: Frecuencia genotípica de CYP2D6*1xN………….……………………….............60

Tabla 11: Resumen de frecuencias genotípica y alélica de CYP2D6*2, *3 y *4………….………………………………………………………………....61

Tabla 12: Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica de la población del

estudio………….………….………….………….………….………….………….………...……...62 Tabla 13: Test de uniformidad……………………………………………………………….…..………64 Tabla 14: Características de los voluntarios sanos…………………………………......……66

Tabla 15: Número de voluntarios por cada polimorfismo estudiado de CYP2D6………….………………………………………………………………………..…...67

Tabla 16: Genotipos teóricos y genotipos posibles.……..……….………….……………….67

Tabla 17: Genotipos posibles y sus fenotipos metabolizadores

esperados………….………….……………………………………………….………..………....71 Tabla 18: Razones metabólicas obtenidas según genotipo y

su clasificación metabólica………….………….………….…..….………….…………..72 Tabla 19: Estadísticas descriptivas de los datos………….………….……………………..…75

Tabla 20: Frecuencias alélicas de CYP2D6………….……………………………...….….……..80



VIII

VIII

Abreviaturas

%MA-C

A

ACN

AS

BPC

C

CYP

DEPC

DE

dNTPs

EDTA

G

HPLC

IFT

IMC

ME

MI

MP

MR

MU

P450

PCR

PCRL

RFLP

SNC

SNP

T

TBE

wt o *1

wt/wt

Porcentaje de mezcla amerindio-caucásica

Adenina

Acetonitrilo

Alelo específica

Buenas prácticas clínicas

Citosina

Citocromo P450

Dietilpirocarbonato

Desviación estándar

Desoxinucleótidos

Ácido etilendiamino tetra acético

Guanina

Cromatografía líquida de alta resolución

Laboratorio de Investigaciones Farmacológicas y

Toxicológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

Índice de masa corporal

Metabolizador extensivo

Metabolizador Intermedio

Metabolizador pobre

Razón metabólica

Metabolizador ultrarrápido

Citocromo P450

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR larga

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción

Sistema nervioso central

Polimorfismo de nucleótido único

Timina

Tris Borato EDTA

Alelo silvestre

Genotipo silvestre



IX

IX

Resumen

Los médicos prescriben fármacos sobre la base de sus características

farmacológicas y sobre la posibilidad de obtener resultados clínicamente reproducibles.

Sin embargo, muchos de los fármacos son eficaces en sólo 25% a 60% de los

pacientes, por lo tanto, muchos pacientes no responden a los tratamientos e incluso

experimentan reacciones adversas e intoxicaciones. Existen variaciones individuales

en las respuestas a fármacos que pueden deberse a diversos efectos, pero en la

actualidad se sabe que muchas de estas variaciones se encuentran predeterminadas

genéticamente; éste es el blanco de estudio de la farmacogenética.

La debrisoquina-4-hidroxilasa (CYP2D6) es una de las enzimas más importante del

metabolismo de fármacos que actúan tanto a nivel del sistema nervioso central (SNC)

como del sistema circulatorio. Los polimorfismos de CYP2D6 presentan grandes

diferencias en las frecuencias alélicas según la población y etnia. En este estudio se

analizaron a través de PCR-AS semianidada, PCR RFLP y PCRL las variables

CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4 y la duplicación del gen CYP2D6 en 321

voluntarios sanos. Las frecuencias alélicas encontradas son muy similares a las

registradas para la población española: para *2 un 40,5%, para *3 un 1,09%, para *4

un 11,8%. No se encontraron duplicaciones del gen CYP2D6 en un subgrupo de 20

voluntarios analizados.

Para determinar con exactitud la influencia de los polimorfismos del gen CYP2D6 en

su actividad debrisoquina hidroxilasa, se seleccionaron 23 voluntarios del grupo en

estudio que presentaban genotipos relevantes, los cuales debieron ingerir el marcador

metabólico debrisoquina. Se recolectaron las muestras de orina de 0-8 horas y se

analizaron a través de HPLC. Presentaron el fenotipo esperado 18 voluntarios, de los

cuales el más relevante es el genotipo *4/*4 que presentó una actividad catalítica muy

disminuida en comparación al grupo wt/wt. Se obtuvo una correlación genotipo-fenotipo

para algunos voluntarios logrando el objetivo fundamental que busca un estudio

farmacogenético, es decir, la determinación de la respuesta individual.



X

X

Summary

“Polymorphic variants of cytochrome P450 2D6 and its influence on in

vivo catalytic activity debrisoquine 4-hydroxylase”

Physicians prescribe drugs based on their pharmacological characteristics and the

possibility of clinically reproducible results. However, many drugs are effective only in

25% to 60% of patients, therefore, many patients do not respond to treatments and

even suffer adverse reactions and intoxications. There are individual variations in drug

response which may be due to various effects; many of these variations are genetically

predetermined, and are the target of a pharmacogenetic study.

Debrisoquine-4-hydroxylase (CYP2D6) is one of the most important enzymes in the

metabolism of drugs which have effects in the central nervous system (CNS) and the

circulatory system. CYP2D6 polymorphisms present large differences in allele

frequencies based on population and ethnicity. In this study we analyzed the variants of

CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4 and CYP2D6 gene duplication by PCR-AS nested,

RFLP and PCRL in 321 healthy subjects. The allelic frequencies found were very

similar to those reported for the Spanish population (40,5% for *2, 1,09% for *3 and

11,8% for *4). There were no CYP2D6 gene duplications in the 20 volunteers tested.

To determine the influence of CYP2D6 polymorphisms on the debrisoquine

hydroxylase activity, 23 volunteers having relevant genotypes were chosen from the

study group to determine their capacity to metabolize debrisoquine, a metabolic marker

for CYP2D6. Urine samples of 0-8 hours were collected and analyzed by HPLC. Only

18 volunteers presented the expected phenotype, of which the most relevant genotype

is *4/*4, with a reduced catalytic activity compared to the wt/wt group. A genotype-

phenotype correlation was observed for some volunteers, thus echieving the

fundamental aim of a pharmacogenetic study, that is, the determination of the individual

response.



1

1

1. Introducción

El éxito de la medicina moderna es, en parte, el resultado de un tratamiento

farmacológico eficaz. Un hecho bien conocido es que los individuos responden en

forma diferente a una terapia de fármacos y que ningún medicamento es 100% eficaz

en todos los pacientes. En consecuencia, el margen de respuesta a un tratamiento

farmacológico es diverso, ya que algunos individuos pueden obtener los efectos

esperados, mientras otros no obtienen un resultado terapéutico e incluso pueden

experimentar efectos adversos (Figura 1) (Zhou y cols., 2008).

Los médicos prescriben fármacos sobre la base de las características

farmacológicas del medicamento y sobre la probabilidad de obtener resultados

clínicamente reproducibles. Sin embargo, muchos de los fármacos son eficaces en sólo

25 a 60 % de los pacientes. En los países desarrollados al menos el 6% de las nuevas

admisiones en los hospitales se deben a eventos de reacciones adversas. En Estados

Unidos más de dos millones de personas son hospitalizadas debido a reacciones

adversas, con un número de muertes que excede los 100.000 casos anualmente,

representando la quinta causa de muerte (Wilkinson, 2005; Xie y cols., 2005). Además,

cerca del 3% de las hospitalizaciones al año ocurridas en Estados Unidos se deben a

interacciones entre medicamentos. Los costos hospitalarios relacionados con

medicamentos exceden los 177 billones de dólares anualmente en Estados Unidos.

Muchos de estos medicamentos han sido retirados del mercado porque causan una

toxicidad severa a un número pequeño de personas (Xie y cols., 2005), por lo que se

considera necesario conocer el metabolismo de un medicamento como prerrequisito

para prevenir los efectos adversos de su administración (Wijnen y cols., 2007).

La variabilidad en la respuesta a los medicamentos en los pacientes es

multifactorial. Esta respuesta incluye factores extrínsecos como el medio ambiente, y

factores intrínsecos entre los que se incluyen aspectos genéticos que influyen en la

respuesta a cierto medicamento. La variabilidad en el metabolismo de los fármacos

contribuye a la variabilidad individual en la respuesta a los medicamentos por

alteración de la concentración plasmática en estado estacionario (Evans & McLeod,

2003; Wijnen y cols., 2007).



2

2

Figura 1

Farmacogenética

Los tratamientos farmacológicos provocan variabilidad de respuesta en pacientes

tratados con la misma dosis. Algunos responden de la manera deseada al tratamiento,

mientras otros no responden y algunos incluso llegan a desarrollar reacciones

adversas.

Pacientes que reciben el mismo

tratamiento

Responden al tratamiento

No responden al tratamiento

Sufren efectos adversos



3

3

La amplia diferencia de respuesta entre poblaciones, aparejada de una menor

variabilidad interpaciente, es coherente con la herencia como el principal factor

determinante de la respuesta a fármacos. Se estima que entre 20 y 95% de la

variabilidad en la disposición y efectos de fármacos corresponden a la herencia

genética, aunque muchos factores no genéticos influyen en la eficacia de los

medicamentos, incluyendo la edad, función del órgano, terapia concomitante,

interacción de medicamentos y la naturaleza de la enfermedad. Existen numerosos

ejemplos en los cuales la diferencia interindividual en respuesta a medicamentos se

debe a las variables genéticas de los genes que codifican enzimas metabolizadoras,

transportadores o receptores de medicamentos (Evans & McLeod, 2003). Estas

variaciones genéticas pueden corresponder a repeticiones nucleotídicas, inserciones,

deleciones o polimorfismos de un nucleótido (SNP), lo cual modifica la secuencia

aminoacídica de las proteínas codificadas y la expresión génica (Zhou & cols., 2008).

Farmacogenética

La relación entre las reacciones adversas de fármacos y las variaciones

determinadas genéticamente fue demostrada por primera vez en los años 50. Friedrich

Vogel fue el primero en usar el término farmacogenética en 1959, pero no fue hasta

1962 cuando la farmacogenética fue definida como el estudio de las variaciones

genéticas que causan la variabilidad en la respuesta a los fármacos. Los estudios de

farmacogenética se basan en la investigación de genes candidatos seleccionados por

su importancia biológica, ya sea en la cinética o por su relación en la acción

farmacológica; el objetivo final es identificar individuos con riesgo de experimentar

efectos adversos o con probabilidad de ser resistentes al tratamiento (Figura 1)

(Vesell, 2000).

El campo de la farmacogenética comenzó con un enfoque basado en el

metabolismo de fármacos, pero con los años ha logrado abarcar un amplio espectro de

factores que afectan la biodisponibilidad de fármacos, incluyendo los transportadores

que influyen en su absorción, distribución y excreción. Existen más de 30 familias de

enzimas metabolizadoras de fármacos en humanos, como son las enzimas del sistema

citocromo P450, la glutatión S-transferasa y la tiopurina metil-transferasa. La gran

mayoría de ellas presentan variantes genéticas que se traducen en cambios



4

4

funcionales de las proteínas codificadas (Evans & McLeod, 2003; Weinshilboum, 2003;

Gutiérrez, 2004).

El ser humano está constantemente expuesto a moléculas extrañas o compuestos

xenobióticos, los cuales están presentes en la naturaleza como alcaloides o toxinas

producidas por hongos, o bien como sustancias químicas sintetizadas por el hombre,

como compuestos químicos industriales y fármacos. La gran mayoría de estas

moléculas son lipofílicas, es decir, son absorbidas fácilmente a través de la piel,

mucosas intestinales y respiratorias, alcanzando de esta manera la circulación

sistémica. Los organismos vivos han desarrollado sistemas enzimáticos que les

permiten metabolizar sustancias lipofílicas en compuestos hidrofílicos facilitando su

excreción. Además, pueden convertir los profármacos en compuestos activos con

efecto terapéutico e incluso podría resultar la formación de compuestos tóxicos

(Weinshilboum, 2003).

Las enzimas involucradas en el metabolismo de fármacos se encuentran

principalmente en el hígado, pero también se pueden expresar en otros tejidos como el

riñón, el cerebro, la piel, la sangre, los pulmones y la mucosa gastrointestinal

(Wilkinson, 2005; Wolf & Smith, 1999). El gran número de compuestos químicos

encontrados en el medio ambiente que son metabolizados puede explicar por qué

estas enzimas pertenecen a familias multigénicas de proteínas (Wolf & Smith, 1999).

Los farmacólogos clasifican las rutas de metabolización de fármacos en Fase I y

Fase II. La primera corresponde a las reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis,

convirtiendo el fármaco en un compuesto soluble en agua o en un metabolito más

reactivo adecuado para las reacciones de Fase II, que son principalmente

conjugaciones con sustancias endógenas como el ácido glucurónico, aminoácidos,

ácidos grasos, glutatión, grupos metilo, sulfato o acetato, provocando la inactivación de

los metabolitos y facilitando de esta manera su excreción. Estas transformaciones

químicas que permiten convertir sustancias lipofílicas en compuestos hidrofílicos se

han denominado rutas de biotransformación asociadas usualmente a una pérdida de

actividad y a un aumento del carácter polar de las moléculas, lo que favorece su

excreción renal (Ioannides, 2002).



5

5

Las reacciones de Fase I son catalizadas por proteínas de naturaleza diversa, entre

las que se incluyen las enzimas con actividad monooxigenasa como el sistema

citocromo P450 o la flavín monooxigenasa, diversas oxidasas (alcohol deshidrogenasa,

aldehído deshidrogenasa, aminooxidasas, aromatasas), la epóxido hidrolasa o

esterasas y amidasas hepáticas y plasmáticas. El sistema citocromo P450 es sin duda

el integrante más destacado de este grupo de enzimas y el que ha sido más

ampliamente estudiado. Corresponde a una superfamilia de monooxigenasas

responsables del metabolismo oxidativo de un gran número de compuestos endógenos

y xenobióticos, incluyendo más del 60% de los medicamentos; por lo tanto, se ha

convertido en un foco de estudio para elucidar los factores que contribuyen a la

variabilidad de la respuesta a fármacos (Weinshilboum, 2003; Zhou y cols., 2008).

Sistema citocromo P450

Precisar la fecha exacta en que fue descubierto el sistema citocromo P450 es difícil;

los primeros conocimientos se remontan a estudios desarrollados por diversos grupos

de investigación durante los años 50 en tejidos hepáticos de mamíferos. Transcurrieron

varios años hasta que en 1964 se identificó la naturaleza hemo-proteica de un

pigmento presente en los microsomas hepáticos de diferentes especies, el cual era

capaz de unirse a CO (monóxido de carbono) tras ser reducido por NADPH

(nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) o por ditionito. El complejo exhibía una

absorbancia máxima a 450 nm y por eso recibió el nombre de sistema citocromo P450

(Omura & Sato, 1964).

Las oxidaciones catalizadas por el sistema citocromo P450 son reacciones de

monooxigenación dependientes de NADPH y para las cuales se utiliza oxígeno

molecular; también es capaz de catalizar reducciones, hidrataciones o hidrólisis. Las

oxidaciones catalizadas por el sistema citocromo P450 incluyen hidroxilaciones

aromáticas y alifáticas, N- y S-oxidaciones, epoxidaciones, O- y S-desalquilaciones,

desaminaciones, desulfuraciones, deshalogenaciones y deshidrogenaciones. Se trata

de monooxigenaciones en las que sólo uno de los átomos de oxígeno es incorporado

en la molécula de sustrato, mientras que el otro es reducido a agua.



6

6

La diversidad de la superfamilia citocromo P450 surgió de un extenso proceso de

duplicación génica y, probablemente, aunque no tan bien documentado, de situaciones

de amplificación génica, conversiones génicas, duplicaciones génicas, pérdida de

genes y transferencias laterales (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).

La nomenclatura estándar de las enzimas del citocromo P450 utiliza la raíz CYP

seguida de un número arábigo que designa la familia de enzimas sobre la base de una

identidad aminoacídica de más del 40%, una letra para designar la subfamilia con una

identidad de más del 55% y otro número que denota la enzima individual, por ejemplo:

CYP2D6*4. Para cada enzima el alelo silvestre se designa con *1 y las variaciones

alélicas se enumeran de manera secuencial según han sido identificadas (es decir, *2,

*3, etc.).

Las enzimas del sistema citocromo P450 son importantes tanto en la biosíntesis

como en la degradación de compuestos endógenos (esteroides, lípidos y vitaminas,

etc.); además, metabolizan muchas sustancias químicas presentes en la dieta, en el

ambiente y también los fármacos.

La secuenciación del genoma humano reveló la existencia de 115 genes CYP

humanos (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html), de los cuales 57 son

activos y 58 son seudogenes, pero sólo un pequeño número codifica proteínas,

principalmente las familias CYP1, CYP2 y CYP3 (Frye, 2004; Weijnen y cols., 2007;

Zhou y cols., 2008). Colectivamente, las enzimas de las familias 1-3 son responsables

del 70-80% de la oxidación de fármacos y, en cerca de un 50%, de la eliminación de

los medicamentos utilizados usualmente. Casi todos los miembros de las subfamilias

de CYP son polimórficos (ver: http://www.imm.ki.se/CYPalleles), lo cual afecta el

metabolismo de fármacos que son sustratos particulares para cada enzima,

determinando diferencias en la respuesta a medicamentos y, por ende, un alto riesgo

de experimentar efectos adversos e intoxicaciones (Meijerman y cols., 2007; Wijnen y

cols., 2007; Wilkinson, 2005; Zhou y cols., 2008).

Existen inhibidores de algunas enzimas del sistema citocromo P450, como por

ejemplo la naringina, que es un compuesto flavonoide extraído de las cáscaras del

pomelo que inhibe al CYP3A4. En cambio, otras sustancias son inductoras y pueden

aumentar la actividad de una enzima específica del citocromo P450, como por ejemplo

http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html

http://www.imm.ki.se/CYPalleles



7

7

el benzo[a]pireno del humo del cigarrillo, que induce la acción del CYP1A2 (Wijnen y

cols., 2002). Sin embargo, son varios los factores que afectan la actividad enzimática

de los CYP, incluyendo polimorfismos genéticos, edad, género, enfermedades y

exposición a compuestos químicos contaminantes ambientales (Quiñones y cols.,

2006).

Los polimorfismos del sistema citocromo P450 pueden incluir variantes que

conducen a ausencia de la enzima, disminución o aumento de sus niveles o una

especificidad alterada. En base a la composición de los alelos, los individuos pueden

dividirse en cuatro grandes grupos: metabolizadores pobres (MP) que presentan dos

alelos no funcionales o un alelo no funcional y otro delecionado; metabolizadores

intermedios (MI), que son individuos con dos alelos con actividad catalítica deficiente o

un alelo funcional y otro nulo; metabolizadores silvestres o extensivos (ME), que

presentan dos copias del alelo silvestre o un alelo deficiente y otro funcional; y

metabolizadores ultrarrápidos (MU), que tienen tres o más copias de alelos activos

(Figura 2) (Higgins y cols., 2010; Rodriguez-Antona & Ingelman-Sundberg, 2006; Xie y

cols., 2005).

CYP2D6

Entre los años 1997 y 1979, Mahgoub y Eichelbaum descubrieron de manera

independiente que el metabolismo de la debrisoquina y la esparteína tenía naturaleza

polimórfica; después se demostró que ambos fármacos eran metabolizados por la

misma enzima, CYP2D6. El gen CYP2D6 se ubica en el cromosoma 22q13.1 y abarca

nueve exones y ocho intrones, con un marco de lectura abierto de 1383 pares de

bases que codifica 461 aminoácidos. En la Figura 3 se muestra que CYP2D6

pertenece a una agrupación génica que abarca cerca de 45 kb junto a los seudogenes

CYP2D7 y CYP2D8, con una identidad del 97% y 92%, respectivamente.

El gen CYP2D8 contiene varias inserciones que interrumpen el gen, deleciones y

codones de término dentro de exones, por lo cual es considerado un seudogen. Sin

embargo, el gen CYP2D7 (ubicado entre CYP2D8 y CYP2D6) tiene una estructura

similar al gen funcional CYP2D6, excepto por una inserción nucleotídica en el primer

exón (T138) que provoca un cambio en el marco de lectura y término prematuro de la



8

8

Figura 2

Medicina personalizada: del genotipo al fenotipo

Se muestran las diferentes dosis de nortriptilina que se deben administrar a pacientes

luego de realizar la determinación de su genotipo, la relación genotipo-fenotipo, su

farmacocinética y las consecuencias clínicas. Los alelos funcionales de CYP2D6 son

ilustrados en barras de color burdeo, los alelos deficientes (*9, *10, *17, *41) de color

naranja, los alelos no funcionales (*3, *4, *6) de color amarillo y la deleción del gen

completo (*5) con una línea segmentada. Adaptado de Frueh y colaboradores (2005);

Zanger y colaboradores (2003). MU: Metabolizador ultrarrápido; ME: Metabolizador

extensivo; MI: Metabolizador intermedio y MP: Metabolizador pobre.

Frecuencia en la

población Caucásica

5-10% 65-68% 10-15% 5-10%

Nortriptilina

Genotipo

Fenotipo MU ME MI MP

o o o



9

9

Figura 3

Ubicación génica del gen CYP2D6

A) CYP2D6 (rectángulo amarillo) y sus polimorfismos más comunes se ubican en una

agrupación génica (rectángulo amarillo) junto a los seudogenes CYP2D8 y CYP2D7

(rectángulos burdeo y verde, respectivamente). B) Representación de los 9 exones

de CYP2D6 (cuadrados amarillos) y sus polimorfismos más comunes. Adaptado de

Koch y colaboradores (2004).

G31A C100T

C1023T C1039T

G1659A G1661C 1707del G1758A G1758T

G1846A 1863bp rpt

2549del 2613AGA del

C2850T A2953C

G4042A G4180C

CYP2D8

CYP2D7

CYP2D6

A)

B)



10

10

traducción. Se cree que las conversiones génicas y entrecruzamientos desiguales

dentro de esta familia de genes repetidos en tándem podrían explicar el alto grado de

polimorfismos del sistema citocromo P450 en humanos (Cascorbi, 2005; Panserat y

cols., 1995; Zanger y cols., 2004).

Desde que se descubrieron los polimorfismos de CYP2D6, se ha demostrado que

cerca de 100 medicamentos son sustratos de esta enzima (Pirmohamed y cols., 2003).

La enzima CYP2D6 metaboliza principalmente fármacos antidepresivos, neurolépticos,

β-bloqueadores y antiarrítmicos (Linder y cols., 1997), los que actúan tanto a nivel del

sistema nervioso central como a nivel circulatorio (Tabla 1). Además, presentan una

gran variabilidad en su actividad catalítica entre individuos, principalmente debido a los

polimorfismos genéticos. Hasta la fecha se han encontrado más de 82 variantes

alélicas de CYP2D6 y cerca de 20 SNPs sin haplotipos determinados a la fecha

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).

En relación al alelo silvestre de CYP2D6, los perfiles catalíticos de las variantes

polimórficas pueden resultar en una ausencia completa de la actividad enzimática,

actividad reducida, actividad normal o incluso un incremento de la actividad (Zhou y

cols., 2008). Los cocientes metabólicos para CYP2D6 están distribuidos de manera

bimodal en las poblaciones caucásicas, existiendo individuos con una actividad

deficiente (MP) y otros con una elevada actividad enzimática (MU) (Ingelman-

Sundberg, 2005). Fenotípicamente, existe una gran variabilidad en la capacidad de

metabolización de CYP2D6 que se puede explicar por los polimorfismos del gen, ya

que los cocientes metabólicos de un individuo son estables en el tiempo, indicando una

influencia limitada de los factores medioambientales o fisiológicos en la actividad de

esta enzima, a diferencia de CYP3A4 que presenta una importante influencia de los

factores ambientales (Baker y cols., 2004; Eichelbaum y cols., 2001).

El CYP2D6 es una de las isoenzimas CYP más estudiadas, aunque se expresa a

niveles más bajos comparados con otras enzimas citocromo P450 humanas. Es una de

las enzimas más importantes considerando el número de rutas metabólicas de

medicamentos y xenobióticos que cataliza. Se estima que entre 20 y 25% de los

medicamentos usados clínicamente por humanos, entre los cuales algunos poseen un

rango terapéutico muy estrecho lo cual dificulta el tratamiento, son metabolizados por

http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm



11

11

Tabla 1

Sustratos, inhibidores e inductores de CYP2D6

Se indican los sustratos más comunes de CYP2D6, principalmente de uso siquiátrico,

además de los inhibidores más potentes. Aún no se han encontrado inductores de la

enzima. Adaptado de Linder y colaboradores (1997); Lynch y colaboradores (2007).

Sustratos

Antiarrítmicos Antidepresivos Beta-bloqueadores Neurolépticos Misceláneos

Amiodarona

Imipramina

Propranolol

Perfenazina

Codeína

Encainida Desipramina Timolol Tioridazina Debrisoquina

Flecainida Amitriptilina Bufuralol Anfetamina

Mexiletina Nortriptilina Metroprolol Indoramina

Propafenona Clomipramina Fenformina

Esparteína

Inhibidores potentes Inductores potentes

Amiodarona

No existen inductores

Cimetidina

Difenhidramina

Fluoxetina

Paroxetina

Quidina

Ritonavir

Terbinafina



12

12

esta enzima (Mejerman y cols., 2007; Zanger y cols., 2004; Zhou y cols., 2008). Para

muchos fármacos, especialmente los sicotrópicos, se considera que el CYP2D6 tiene

una capacidad enzimática de alta afinidad/ baja concentración, lo cual implica que

metaboliza fármacos preferentemente a bajas concentraciones (Wijnen y cols., 2007).

Muchos casos médicos y estudios clínicos han demostrado que algunas de estas

oxidaciones polimórficas tienen consecuencias terapéuticas, haciendo que ciertos

individuos sean muy propensos a desarrollar efectos adversos a dosis convencionales

y a presentar efectos terapéuticos disminuidos de ciertos medicamentos.

Implicancias clínicas de polimorfismos en CYP2D6

Los medicamentos más afectados por los polimorfismos de CYP2D6 son

comúnmente aquellos en los cuales esta enzima representa una ruta metabólica

fundamental, ya sea en la activación o eliminación del medicamento (Zhou y cols.,

2008).

Los polimorfismos están usualmente relacionados con una variación en la actividad

enzimática: cuando se encuentra reducida puede producir un aumento de la

concentración plasmática del medicamento administrado que no ha sido observado

previamente en la población con genotipo silvestre (codifica una enzima con función

normal) y, por el contrario, aquellos pacientes con polimorfismos asociados a un

aumento de la actividad enzimática podrían tener una respuesta menor si son tratados

con un fármaco que es sustrato de esta enzima, es decir, tendrían una concentración

plasmática menor comparada con la de individuos que tienen la enzima silvestre.

Se estima que entre 15 y 20% de las fallas en los tratamientos farmacológicos se

deben a polimorfismos de las enzimas del sistema citocromo P450 (Ingelman y cols.,

2005). Un ejemplo de la importancia clínica de estos polimorfismos lo constituye el uso

del antidepresivo tricíclico nortriptilina cuya degradación depende del CYP2D6: los

metabolizadores pobres (MP) necesitan 30 a 50 mg comparados con los

metabolizadores ultrarrápidos (MU) que requieren 500 mg para obtener los mismos

niveles plasmáticos; por lo tanto la dosis estándar de 150 mg no es apropiada para los

grupos de MP y MU (Ingelman-Sundberg, 2007).



13

13

Otro ejemplo relevante es el fármaco tamoxifeno, el cual es activado por el sistema

CYP a metabolitos antiestrogénicos que son más potentes que el compuesto original.

Los metabolitos claves del tamoxifeno son el 4-hidroxitamoxifeno y el endoxifeno,

formados principalmente por el CYP2D6, y el N-desmetiltamoxifeno, formado

principalmente por el CYP3A4 (Figura 4).

En pacientes tratados con tamoxifeno, los compuestos más abundantes en el

plasma son el N-desmetiltamoxifeno y el endoxifeno. Se ha demostrado que el

endoxifeno presenta una afinidad aproximadamente 100 veces mayor por el receptor

de estrógeno que el tamoxifeno y el N-desmetiltamoxifeno. Debido a que el endoxifeno

es formado principalmente por el CYP2D6, pacientes con alelos deficientes de

CYP2D6 podrían obtener menores beneficios de una terapia de tamoxifeno que

aquellos que tienen alelos funcionales. Los MP podrían desarrollar los efectos

adversos a la exposición a tamoxifeno que incluye trombosis y cáncer endometrial

(Rodriguez-Antona & Ingelman-Sundberg, 2006; Scripture & Figg, 2006; Zhou y cols.,

2008).

Variantes polimórficas del CYP2D6

Los polimorfismos del CYP2D6 identificados en el genoma humano presentan

grandes diferencias en sus frecuencias alélicas según la población (Ingelman-

Sundberg, 2007). En la población caucásica los metabolizadores ultrarrápidos pueden

presentar duplicaciones y multiplicaciones del gen y sus variantes y están presentes en

un 7% de la población. En cambio, los metabolizadores pobres presentan mutaciones

en una sola base (*4,*6 y *10), deleciones parciales (*3) o deleciones totales (*5) y

tienen gran importancia clínica, puesto que 7-10% de esta población presenta alelos no

funcionales (Ingelman-Sundberg, 2007; Steijns y cols., 1998). En Hispanoamérica, la

frecuencia de la población MP es de 6,6% en colombianos, 3,2% en mexicanos, entre

2,2% y 4,4% en panameños y 3,6% en nicaragüenses. Según la literatura encontrada,

el fenotipo de la población chilena debería ser similar a la población caucásica, debido

a la migración española a estas tierras (Tabla 2) (Bernard y cols., 2006).



14

14

Figura 4

Metabolismo del tamoxifeno

Se indican las reacciones que conforman las rutas de biotranformación del tamoxifeno y

las principales enzimas del sistema citocromo P450 involucradas. Adaptado de Higgins

y colaboradores (2010). TAM: Tamoxifeno.



15

15

Tabla 2

Variables alélicas de CYP2D6

Alelos más comunes de CYP2D6 encontrados en la población española, alteración

génica más relevante, función enzimática, frecuencia alélica y número rs. Secuencia de

referencia (rs) y función* enzimática designada en SNPedia

(http://www.snpedia.com/index.php/CYP2D6). Actividad medida en relación a

debrisoquina, esparteína y dextrometorfán.

Alelo Mayor alteración génica Función* Frecuencia (%) Número rs

*1 Silvestre Actividad normal 31,00 rs16947

*2 C2850T Actividad normal 40,50 rs1135840

*3 A2549del Enzima inactiva 0,95 rs35742686

*4 G1846A Enzima inactiva 13,80 rs3892097

*5 Deleción génica No hay enzima 3,33 -----------

*6 T1707del Enzima inactiva 0,95 rs5030655

*10 C100T Actividad disminuida 1,90 rs1065852

*1xN Duplicación génica Actividad elevada 1,90 -----------

*2xN Duplicación génica Actividad elevada 1,90 -----------

*4xN Duplicación génica Enzima inactiva 0,47 -----------

http://www.snpedia.com/index.php/CYP2D6

http://www.snpedia.com/index.php/Rs5030655

http://www.snpedia.com/index.php/Rs1065852



16

16

Uno de los polimorfismos más ampliamente estudiados es el del CYP2D6*2

(G2850T) (rs1135840), que es considerado un alelo funcional cuya actividad

enzimática es 20% menor con respecto a individuos que poseen el genotipo silvestre

CYP2D6*1 (Figura 5A) (Sachse y cols., 1997). Se ha visto que tiene una alta

incidencia en nuestro país, con una frecuencia alélica de 37,7% (Pinto, 2009). El

CYP2D6*2 representa un fenotipo ME en el caso de encontrarse en ambos alelos, sin

embargo, podría presentar un fenotipo MI si se encuentra como heterocigoto junto con

alelos no funcionales (*3, *4 y *5). En 1993, se descubrió una familia suiza en la cual

tanto el padre como sus hijos presentaban 12 copias adicionales del alelo CYP2D6*2;

estos sujetos eran MU con una razón metabólica de 0,01-0,02, por ende, la duplicación

del gen CYP2D6*2 está asociada a una actividad enzimática extremadamente alta al

igual que la duplicación o multiplicación del gen CYP2D6*1 (rs16947) (Neafsey y cols.,

2009; Pirmohamed y cols., 2003).

La duplicación o multiplicación del gen CYP2D6*1 (rs16947) también ha sido

detectada en la población caucásica con una frecuencia de 7% en individuos que

tienen una capacidad metabólica elevada (Lovlie y cols., 1996). Los individuos que

portan esta variante tanto en su forma homocigota como heterocigota son

considerados MU, ya que en ellos se observan bajas concentraciones plasmáticas de

ciertos medicamentos (Figura 5C) (Meijerman y cols., 2007).

Se postula que el análisis de tres polimorfismos de CYP2D6 (que definen los alelos

*3, *4 y *5) puede predecir entre el 93 y 97 % de los fenotipos metabolizadores pobres

en la población caucásica, donde la frecuencia de éstos fluctúa entre 5 y 10% (Zhou y

cols., 2008; Hersberger y cols., 2000; Steiner y cols., 1988). Los alelos *3 y *4 son los

más comunes (Meijerman y cols., 2007), pero CYP2D6*4 (G1846A) (rs3892097) fue el

primer alelo defectuoso descubierto en el locus CYP2D en 1990 (Cascorbi, 2003) y es

la variante polimórfica más común. Se encuentra con una frecuencia de 20-25% en

estas poblaciones y es responsable del 70-90% de todos los MP (Figura 5B). Se debe

a una transición G1846A que genera un cambio en el lugar de corte y empalme entre el

intrón 3 y el exón 4, generando una proteína inactiva. CYP2D6*4 es un alelo no

funcional de CYP2D6, al encontrarse en su forma homocigota determina un fenotipo

MP; lo mismo ocurre si se encuentra de manera heterocigota junto con otros alelos no

funcionales, como por ejemplo CYP2D6*3.



17

17

El segundo alelo más común entre los MP es CYP2D6*3 (rs35742686). Se

caracteriza por la deleción de un nucleótido (A2549del) en el exón 5 del gen, que lleva

a un cambio en el marco de lectura y a obtener una enzima inactiva (Figura 5B)

(Nagata y cols., 2002). En su forma homocigota determina un fenotipo MP, al igual que

CYP2D6*4.

Las primeras frecuencias alélicas de CYP2D6 descritas en la población chilena

fueron determinadas por Pinto y colaboradores (2009), quienes realizaron una

comparación entre poblaciones de diferente estrato socioeconómico, estudiando las

frecuencias alélicas de las variantes polimórficas CYP2D6*1, *2, *4, *5, *9, *10 y *1xN

en 120 individuos de la Clínica Las Condes (estrato socioeconómico alto) y 120

individuos del Hospital San José (estrato socioeconómico bajo). Entre los resultados de

esta investigación solamente se encontraron diferencias significativas entre las

frecuencias alélicas para la variante CYP2D6*2 (C2850T) (CLC: 43,3%; HSJ: 32,1%).

Sin perjuicio de lo anterior, los resultados globales de las frecuencias encontradas para

las variantes alélicas CYP2D6*4 (G1846A) (CLC: 12,5%; HSJ: 10%) y CYP2D6*1xN

(CLC: 2,08%; HSJ: 2,08%) se utilizaron como referencia para este trabajo de tesis.

Actividad debrisoquina 4-hidroxilasa

El genotipo CYP2D6 ha sido asociado a la variabilidad interindividual en la actividad

de su enzima in vivo, la cual ha sido evaluada sobre la base de la razón metabólica

urinaria (RM: compuesto original/ metabolito en orina) de marcadores metabólicos. Se

han utilizado la esparteína, la debrisoquina, el metroprolol y el dextrometorfán para

determinar la actividad catalítica del CYP2D6 in vivo, sin embargo, la debrisoquina ha

sido el compuesto más utilizado, debido a que es capaz de discriminar los fenotipos

ME de los MI y los MU (Eiermann y cols., 1998; Frank y cols., 2007; Neafsey y cols.,

2009; Zhen y cols., 2006).

La debrisoquina es un agente antihipertensivo metabolizado principalmente por el

CYP2D6 a 4-hidroxidebrisoquina; también se generan los metabolitos 3-OH

debrisoquina y 1-OH debrisoquina, aunque en una baja proporción (Figura 6). La razón

metabólica (RM) de debrisoquina/4-hidroxidebrisoquina en muestras de orinas de 0-8

horas permite obtener los fenotipos metabólicos de los individuos (ME, MI, MP y MU).



18

18

*1

Cromosoma 22q13.3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 *2

B) Alelos no funcionales:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 *3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 *4

A2549del

G1846A

C) Alelos con incremento de función:

CYP2D8

CYP2D7

CYP2D6

CYP2D6

*1xN N-1

CYP2D8

CYP2D7

CYP2D6

1 2 3 4 5 6 7 8 9

C2850T

A) Alelos con función normal:

Figura 5

Estructura alélica funcional y no funcional de CYP2D6

Se indican los 9 exones de CYP2D6 y la denominación de los polimorfismos más

comunes al inicio de cada diagrama. A) Alelos con función normal (extensiva):

corresponden al alelo silvestre CYP2D6*1 y al alelo CYP2D6*2, para el cual se indica

la mutación C2850T. B) Alelos no funcionales: CYP2D6*3 y *4, y sus respectivas

mutaciones, A2549del y G1846A. C) Alelos con actividad incrementada: corresponden

a la duplicación y multiplicación génicas del alelo silvestre CYP2D6*1. Adaptado de

Zanger y colaboradores (2004).



19

19

El fármaco antihipertensivo debrisoquina ya no es de uso clínico debido a su bajo

potencial terapéutico, pero es comercializada para su utilización en investigación como

marcador metabólico de la actividad del CYP2D6. La debrisoquina es metabolizada

también por el CYP1A1, enzima metabólica que se expresa en el hígado, aunque se ha

demostrado que sus niveles hepáticos son menores a los del CYP2D6. El CYP1A1

puede contribuir a la metabolización de la debrisoquina in vivo, pero su rol es limitado y

se estima una contribución relativa no mayor al 2% (Zanger y cols., 2004).

Figura 6

Ruta de transformación de la debrisoquina mediada por la enzima CYP2D6

La 4-OH debrisoquina es el metabolito más abundante de la hidroxilación de la

debrisoquina mediada por la enzima CYP2D6, mientras que los metabolitos 3-OH

debrisoquina y 1-OH debrisoquina se producen en una baja proporción. Adaptado de

Eiermann y colaboradores (1998).



20

20

2. Hipótesis

―Los polimorfismos genéticos del citocromo P450 2D6 (CYP2D6) afectan su

actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa, por lo que constituyen la base de un

estudio molecular para determinar perfiles genéticos en la población chilena que

sirven como herramienta diagnóstica de individuos metabolizadores extensivos (ME),

metabolizadores intermedios (MI), metabolizadores pobres (MP) y metabolizadores

ultrarrápidos (MU) de la debrisoquina.‖



21

21

3. Objetivos

3.1. Objetivo general

Estudiar la presencia de las variantes genéticas *2 (C2850T), *3 (A2549del), *4

(G1846A) y *1xN (duplicación del gen CYP2D6), en voluntarios sanos de la población

chilena, para identificar los perfiles genéticos más relevantes en relación a la

actividad catalítica del citocromo CYP2D6, y validar la genotipificación de estas

variantes como descriptores del metabolismo de los fármacos metabolizados por la

enzima.

3.2. Objetivos específicos

1. Implementar métodos de detección de las variantes de CYP2D6*2, *3, *4 y *1xN

basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

2. Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos de CYP2D6

en un grupo de 156 individuos sanos (mujeres y hombres) de la población chilena.

3. Implementar la determinación de la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa

del CYP2D6, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con

detector de fluorescencia.

4. Determinar la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo, en subgrupos

de individuos con diferentes genotipos y comparar la de individuos de genotipo

silvestre con la de portadores de los polimorfismos estudiados (*2, *3, *4 y *1xN).

5. Relacionar mediante métodos estadísticos apropiados, las diferentes variantes

polimórficas del CYP2D6 y su actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa.



22

22

4. Materiales y metodología

4.1. Materiales

Para la extracción de sangre periférica se utilizaron tubos con EDTA como

anticoagulante (BD vacutainer, EE.UU.). La determinación de grupos sanguíneos se

realizó con un sistema comercial (BioClone, ABO Pharmaceuticals, Mission Viejo, CA,

EE.UU.). Para la purificación del DNA se utilizó un sistema comercial de purificación de

DNA genómico de sangre periférica (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche

Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania).

Para las PCRs se utilizaron partidores específicos indicados en la Tabla 3

(sintetizados por Invitrogen, Brasil), H2O DPC (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), dNTPs

(mezcla de dATP, dTTP, dGTP y dCTP) (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), DNA

polimerasa Taq recombinante (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil) con tampón de reacción

10X (Tris-HCl 200 mM (pH 8), KCl 500 mM), MgCl2 500 mM y BIO-X-ACT Long DNA

Polymerase (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) con su tampón de reacción 10X OptiBuffer

(Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM, glicerol 50%) y

MgCl2 1 mM.

En el estudio de la PCR-RFLP se utilizaron las enzimas de restricción HhaI, MvaI y

MspI (Genesys, Chile). Para la visualización de los fragmentos de restricción se

utilizaron los marcadores de peso molecular de 100-1000 pb Hyperladder IV y de 1000-

10000 pb MassRuler High Range (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) en geles de agarosa

y poliacrilamida (Bioline, Taunton, MA, EE.UU.) con bromuro de etidio (Invitrogen, Sao

Paulo, Brasil). Para la electroforesis en geles de agarosa se utilizó el tampón Tris-

borato (TBE) 1X (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 0,5 M pH 8 y para la

electroforesis vertical se utilizó gel de poliacrilamida (30%), Tris 1,5 M pH 8, persulfato

de amonio (Winkler, Santiago, Chile) y TEMED (Merck, Darmstadt, Alemania). Como

tampón se usó Tris 25 mM (Winkler, Santiago, Chile) – glicina 192 mM pH 8 (Winkler,

Santiago, Chile).

Para los análisis cromatográficos se utilizaron tubos con heparina (BD vacutainer,

EE.UU.). El marcador metabólico Declinax (Hoffman-La Roche, Basel, Suiza) fue

gentilmente donado por el Dr. José García-Agúndez (Universidad de Extremadura,

España). Se usaron los reactivos diclorometano, cloruro de sodio, hidróxido de sodio

(grado p.a.) y acetonitrilo (grado HPLC) de Merck (Darmstadt, Alemania).



23

23

Tabla 3

Oligonucleótidos

Se indican las secuencias (5’-3’) de los oligonucleótidos utilizados en las técnicas

moleculares para la identificación de los polimorfismos C2850T, A2549del, G1846A y la

duplicación o multiplicación génica de CYP2D6*1.

Polimorfismo Directo Inverso

C2850T

(RFLP)

GCT GGG GCC TGA GAC TT GGC TAT CAC CAG GTG CTG GTG CT

A2549del

(RFLP) GAT GAG CTG CTA ACT GAG CCC CCG AGA GCA TAC TCG GGA C

A2549del

(PCR-AS) CGG GAG CGA GAG ACC GAG GA CCG GCC CTG ACA CTC CTT CT

GCT AAC TGA GCA CA

GCT AAC TGA GCA CG

G1846A

(RFLP) GCC TTC GCC AAC CAC TCC G AAA TCC TGC TCT TCC GAG GC

G1846A

(PCR-AS) ATT TCC CAG CTG GAA TCC GAG ACT CCT CGG TCT CTC

CGA AAG GGG CGT CC

CGA AAG GGG CGT CT

CYP2D6*1xN

(PCRL) TCC CCC ACT GAC CCA ACT CT CAC GTG CAG GGC ACC TAG AT



24

24

4.2. Metodología

4.2.1. Determinación del tamaño muestral

La determinación del tamaño muestral para obtener resultados estadísticamente

significativos, de modo que permita realizar una comparación entre los fenotipos

metabólicos, se realizó considerando un tamaño que permitiera a lo menos encontrar

individuos con la variable CYP2D6*4 (G1846A), teniendo en cuenta que las otras

variables, al ser más escasas, serían difíciles de encontrar. El cálculo se realizó a

través del programa estadístico n Query Advisor 4.0, para lo cual se consideró un α de

5%, una potencia de 80%, frecuencia del gen de 11% (Pinto, 2009) y la razón de

tamaño de muestra de 1:3. El tamaño de muestra obtenido fue de un total de 156

voluntarios.

4.2.2. Reclutamiento de voluntarios sanos

Los voluntarios sanos se reclutaron a través del sitio web del Centro de

Investigaciones Farmacológicas y Toxicológicas (IFT), se les informó sobre el estudio y

firmaron un documento de consentimiento informado (Anexos 1 y 2). Este estudio

contó con la aprobación del ―Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la

Facultad de Medicina de la Universidad de Chile‖ (Anexo 3) y los procedimientos se

realizaron bajo la ―Guía de Buenas Prácticas Clínicas‖ (BPC).

4.2.3. Análisis de las muestras según grupo sanguíneo (ABO)

Las muestras se obtuvieron en la sala de toma de muestras del Laboratorio IFT por

un Tecnólogo Médico del laboratorio, se tipificaron para el sistema de grupo sanguíneo

ABO y los datos se utilizaron para la determinación del porcentaje de mezcla

amerindio-caucásico según el método de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). La

elección se fundamenta en que el sistema de grupo sanguíneo ABO presenta

frecuencias contrastantes entre las poblaciones que dieron origen a la población

chilena. Se ha descrito en la literatura que las poblaciones amerindias carecían de los

alelos ABO*A y ABO*B antes del contacto con los conquistadores, los cuales

ingresaron desde Europa al territorio americano, mezclándose con la población

amerindia que principalmente tenía el alelo ABO*O (Valenzuela y cols., 1987; Cavalli-

Sforza, 1981).



25

25

4.2.4. Extracción y purificación de DNA

Se extrajo de cada voluntario sano una muestra de sangre venosa periférica de 10

mL en tubos vaccutainer con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) como

anticoagulante y se aislaron los leucocitos mediante el método adaptado de Miller y

colaboradores (1988) o utilizando un sistema comercial de purificación de DNA

genómico de sangre periférica High Pure PCR Template Preparation Kit, en una

campana de extracción ESCO BSC – II (ESCO, Hatboro, PA, EE.UU.). El DNA

obtenido se almacenó a -20°C y se cuantificó midiendo su concentración por densidad

óptica a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1603 (Shimadzu,

Columbia, MD, EE.UU.). La concentración final ideal de DNA debía ser

aproximadamente de 0,3 µg/µL para el análisis genotípico de los polimorfismos

propuestos en el estudio.

4.3. Análisis genotípico

4.3.1. Identificación del alelo CYP2D6*2 (C2850T) mediante una PCR-

RFLP

Se utilizó el método descrito por Naveen y colaboradores (2006), con

modificaciones, el que se basa en amplificar la región que contiene la transición

2850C>T responsable del cambio aminoacídico de una treonina a una serina, y luego

digerir con la enzima de restricción HhaI el amplicón obtenido, pues contiene un sitio

de corte polimórfico y tres sitios de corte constitutivo para ellas (Figura 7A).

La PCR se llevó a cabo en un termociclador Corbett CG1-96 (Corbett Research,

Cambridge, UK) utilizando el partidor directo 2F (5’-GCTGGGGCCTGAGACTT-3’) y el

partidor inverso 2R (5’-GGCTATCACCAGGTGCTGGTGCT-3’). La reacción se realizó

en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,8 µM de cada partidor, 0,2 mM de dNTPs, 2 U de DNA

polimerasa Taq en Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM y MgCl2 2 mM.

El protocolo del termociclador constó de un paso inicial a 94ºC durante 90 segundos

seguido por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC

durante 60 segundos, apareamiento a 63ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC



26

26

Figura 7

Esquema de corte del producto de la PCR con la enzima HhaI para la detección

de C2850T (asociada al alelo CYP2D6*2)

A) Amplificación mediante la PCR de un segmento nucleotídico del exón 6 del gen

CYP2D6. B) Digestión del amplicón de 1029 pb utilizando la enzima de digestión HhaI.

Las líneas gruesas indican los fragmentos en los sitios de corte específicos para

detectar la mutación que determina CYP2D6*2 (C2850T) y las líneas delgadas indican

fragmentos generados en los sitios de corte constitutivos.

CYP2D6

A)

wt/wt *2/*2 B)

C2850T

786 111 91 41 41

111 91 41 41

414 372 Enzima de

restricción HhaI

5'...G C G^C...3' 3'...C^G C G...5'

111 91 41

786 414 372

1 2 3 4 5 6 7 8 9

wt/*2

PCR

1029 pb

Exón Intrón DNA amplificado Partidor

2R

2F



27

27

durante 40 segundos. Por último se completó la reacción con 72ºC durante 5 minutos.

Se observó el producto de la PCR mediante una electroforesis horizontal en un gel de

agarosa al 1,2 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso

molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó

utilizando una fuente de poder Bio-Rad Power PacTM HC (Bio-Rad, Hercules, CA,

EE.UU.) a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV

un amplicón de 1029 pb.

Posteriormente, el amplicón se sometió a digestión en una placa termorreguladora

Major Science MD – 01N (Major Science, Saratoga, CA, EE.UU.) durante 2 horas con

la enzima HhaI a 37°C y el tampón Tango 1X (Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de

magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a

cabo en 18 μL, usando 10 μL de producto de la PCR, 10 U de enzima HhaI, en 1 μL de

tampón Tango y 6 μL de agua. Los productos de la digestión se separaron mediante

una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1,5 % con bromuro de etidio.

Los patrones de corte, visualizados en un transluminador UV (Vilbert-Loumart,

Deutschland, Alemania), son: para el genotipo homocigoto wild type (wt/wt) se obtiene

un patrón de restricción bandas de 414, 372, 111, 91 y 41 pb; para el genotipo

heterocigoto (wt/*2), bandas de 786, 414, 372, 111, 91 y 41 pb, y para el genotipo

homocigoto mutado (*2/*2), bandas de 786, 111, 91 y 41 pb (Figura 7B). Los tres sitios

de corte constitutivos funcionan como controles internos de corte de la enzima HhaI,

asegurando la identificación correcta del genotipo (111, 91 y 41 pb).

4.3.2. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una PCR

alelo específica semianidada

La mutación puntual que define al alelo CYP2D6*3 es la deleción de un nucleótido

(A2549del) en el exón 5 que genera un cambio en el marco de lectura y, por lo tanto,

una enzima inactiva. Para la detección de este polimorfismo se utilizó la PCR alelo

específica semianidada según la técnica propuesta por Heim y colaboradores (1991)

modificada.



28

28

Se realizó una primera reacción de la PCR denominada reacción A, en la que se

utilizó el partidor DB3 (5’-GCGGAGCGAGAGACCGAGGA-3’) que se ancla en el intrón

4, desde la posición 2098 a la 2117, y el partidor DB4 (5’-

CCGGCCCTGACACTCCTTCT-3’) que se ancla en el intrón 6, desde la posición 3200

a la 3181. El amplicón A es de 1123 pb y contiene al exón 5, en el que se encuentra el

polimorfismo en estudio (Figura 8A).

La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 5µL de DNA, 2 U de DNA

polimerasa Taq, Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 3 mM; MgCl2 2 mM; dNTPs 0,2 mM y 1

µM de cada partidor. Para el control negativo se reemplazó el molde por agua tratada

con dietil-pirocarbonato (DEPC).

Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturación inicial a 94°C

durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60 segundos,

apareamiento a 69°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 90 segundos.

La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El resultado de la

amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2 % teñido

con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb

Hyperladder IV. La electroforesis se realizó a 300 volts durante 45 minutos en tampón

Tris-borato TBE 1X, observándose a la luz UV un amplicón de 739 pb.

La mutación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) se detectó llevando a cabo dos PCRs

semianidadas independientes a partir del amplicón A (Figura 8B). En una primera

reacción el producto A se amplificó usando DB4 y el partidor específico silvestre DB5

(5’-GCTAACTGAGCACA-3’). La segunda reacción se desarrolló en paralelo para

detectar la mutación en la posición 2549, amplificando el producto A con el partidor

DB4 junto con el partidor específico de la mutación DB6 (5’-GCTAACTGAGCACG-3’).

El partidor DB4 es constante, mientras que DB5 y DB6 son los partidores específicos.

Las PCRs se llevaron a cabo en un volumen de 25 µL usando: 1 µL del amplicón A,

Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM, 1 µM de cada

partidor y 2 U de DNA polimerasa Taq. Para el control negativo se reemplazó el molde

por agua.



29

29

Figura 8

Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada para la detección del

polimorfismo A2549del (asociado al alelo CYP2D6*3)

A) Representación de la amplificación de fragmentos específicos de CYP2D6 a través

de la PCR semianidada (Fragmentos A). B) Reacciones de la PCR alelo específica

utilizada para detectar la mutación A2549del.

B)

A)

*3 WT

DB4 DB3

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5 6 Fragmento A 1123 pb

Reacción A

DB6

DB4 DB5

(DB4 +DB5) (DB4 +DB6)


563 pb

3’ 5’ CYP2D7 CYP2D6 CYP2D8



30

30


durante 90 segundos, seguido de 15 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60

segundos, apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 60

segundos. La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 5 minutos. El

resultado de la amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al

1,2 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-

1000 pb Hyperladder IV y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a

300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un

amplicón de 563 pb.

De acuerdo al resultado de las amplificaciones se pueden obtener las siguientes

conclusiones: en el caso de que solo amplifique DB4-DB5 corresponde a un individuo

con genotipo homocigoto silvestre (*1/*1); si amplifican ambos juegos de partidores

(DB4-DB5 y DB4-DB6) se trata de un genotipo heterocigoto (*1/*3), mientras que si

solo amplifica el par de partidores específicos para la mutación (DB4-DB6)

corresponde a un homocigoto del polimorfismo (*3/*3) (Figura 8B).

4.3.3. Identificación del alelo CYP2D6*3 (A2549del) mediante una

PCR-RFLP

Para confirmar los genotipos de CYP2D6*3 (A2549del) obtenidos a través de la

PCR alelo específica semianidada, se utilizó el método descrito por Schur y

colaboradores (2001). La amplificación mediante una PCR convencional de una

secuencia nucleotídica del exón 5 del gen CYP2D6, permite detectar la deleción de

una adenina en la posición 2549 del exón 5, cortando el amplicón con la enzima de

restricción MspI (Figura 9A).

La PCR se llevó a cabo utilizando el partidor directo 3F (5’-

GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3’) inverso 3R (5’-CCGAGAGCATACTCGGGAC-3’).

La reacción se realizó en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,6 µM de cada partidor, 0,2 mM de

dNTPs, 2 U de DNA polimerasa Taq en Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM y MgCl2 2

mM.



31

31

Figura 9

Digestión con la enzima MspI del producto de la PCR para la detección del

polimorfismo A2549del

A) Amplificación por la PCR de un segmento nucleotídico del exón 5 del gen CYP2D6.

B) Digestión del amplicón de 270 pb utilizando la enzima de digestión MspI, para la

detección de A2549del. Las líneas gruesas indican los fragmentos en los sitios de corte

específicos para detectar la mutación de CYP2D6*3 (A2549del) y las líneas delgadas

indican fragmentos generados en los sitios de corte constitutivos.

A)

B)


3F

3R

Enzima de restricción MspI

5'...C^CG G...3' 3'...G GC^C...5'

188 168 20 82

168 20 82

CYP2D6

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3’ 5’

PCR

2549delA

188 82

wt/wt

wt/*3

270 pb

*3/*3



32

32

El protocolo del termociclador constó de un paso inicial a 94ºC durante 5 minutos

seguido por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC

durante 60 segundos, apareamiento a 60ºC durante 30 segundos y de extensión a

72ºC durante 90 segundos. Por último, se completó la reacción con una etapa de

extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Se observó el producto de la PCR mediante

una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio,

utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la

reacción. La electroforesis se realizó a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE

1X, observándose a la luz UV un amplicón de 270 pb.

Posteriormente, el amplicón se sometió a digestión durante 2 horas con la enzima

MspI a 37°C y su tampón Tango 1X (Tris-acetato 33 mM (pH 7,9), acetato de magnesio

10 mM, acetato de potasio 66 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a cabo en

18 µL, usando 5 µL del producto de la PCR, 10 U de enzima MspI, en 1 µL de tampón

Tango y 6 µL de agua. El patrón de bandeo se observó mediante una electroforesis

vertical en un gel de poliacrilamida al 16 %.

Para los individuos homocigotos para el genotipo silvestre (wt/wt) se obtuvieron dos

segmentos de 188 y 82 pb; para los homocigotos del polimorfismo (*3/*3), tres

fragmentos de 168, 82 y 20 pb; para el genotipo heterocigoto (wt/*3) se obtuvieron 4

fragmentos de 188, 168, 82 y 20 pb (Figura 9B). El corte realizado por la enzima de

restricción en el sitio de corte constitutivo (82 pb) funcionó como un control interno de

la digestión en todos los genotipos, en cambio, el corte del fragmento de 188 pb que da

bandas de 168 y 20 pb, se origina debido a la deleción de una adenina.

4.3.4. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCR

semianidada alelo específica

En la primera reacción de la PCR denominada B se utilizaron el partidor DB1 (5’-

ATTTCCCAGCTGGAATCC-3’) que se ancla en el intrón 2, desde la posición 1385 a la

1402, y el partidor DB2 (5’-GAGACTCCTCGGTCTCTC-3’) que se ancla en el intrón 4,

desde la posición 2122 a la 2105. El amplicón B es de 739 pb y contiene la unión del

intrón 3 con el exón 4, donde está la transición G1846A (Hanioka y cols., 1999) de la

secuencia de consenso del sitio de corte y empalme, que lleva a obtener una proteína

no funcional (Figura 10A).



33

33

Figura 10

Técnica de la PCR alelo específica semianidada utilizada para la detección del

polimorfismo G1846A (asociado al alelo CYP2D6*4)

A) Representación de la amplificación de fragmentos específicos del gen CYP2D6

(Fragmentos B). B) Reacciones de la PCR alelo específica para detectar la mutación

G1846A.

B)

A)

3’ 5’

577 pb

*4 WT

DB8

DB7 DB1

DB2 DB1

CYP2D7 CYP2D6 CYP2D8

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3 4 Fragmento B

739 pb

Reacción B

(DB1 +DB7) (DB1 +DB8)




34

34

La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 5 µl de DNA, 2 U de DNA

polimerasa Taq, Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 3 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM y 1

µM de cada partidor. Para el control negativo se reemplazó el molde por agua.


durante 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60 segundos,

apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 90 segundos.

La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El resultado de la

amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2 %, teñido

con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-1000 pb. La

electroforesis se efectuó a 300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X,

observándose a la luz UV un amplicón de 739 pb.

Para detectar la mutación CYP2D6*4 (G1846A) se llevaron a cabo dos reacciones

simultáneas a partir del amplicón B. El fragmento se reamplificó usando el partidor DB1

y el partidor específico silvestre DB7 (5’-CGAAAGGGGCGTCC-3’). En una segunda

reacción separada y en paralelo, se utilizó el partidor DB1 junto con el partidor

específico de la mutación DB8 (5’-CGAAAGGGGCGTCT-3’) para amplificar el producto

B. El partidor DB1 es constante, mientras que DB7 y DB8 son los partidores

específicos.

La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 µL usando: 1 µL del producto de PCR,

Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,2 mM, 1 µM de cada

partidor y 2 U de DNA polimerasa Taq. Para el control negativo se reemplazó el molde

por agua.


durante 90 segundos, seguida de 15 ciclos de desnaturación a 94°C durante 60

segundos, apareamiento a 52°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 60

segundos. La reacción finalizó con una extensión a 72°C durante 7 minutos. El

resultado de la amplificación se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al

1,2 %, teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso molecular de 100-

1000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a 300 volts durante

45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un amplicón de 577 pb.



35

35

De acuerdo al resultado de las amplificaciones se puede concluir lo siguiente: en el

caso de obtener el amplicón dado por DB1-DB7, corresponde a un individuo con

genotipo homocigoto silvestre (*1/*1); si ambos juegos de partidores (DB1-DB7 y DB1-

DB8) dan amplicones, se trata de un genotipo heterocigoto (*1/*4), mientras que si sólo

el par de partidores específico para la mutación (DB1-DB8) da el amplicón esperado,

corresponde a *4/*4 (Figura 10B).

4.3.5. Identificación del alelo CYP2D6*4 (G1846A) mediante una PCR-

RFLP

Para la detección de este polimorfismo se utilizó el método de Schur y

colaboradores (2006), amplificando una región que abarca la unión entre el intrón 3 y el

exón 4, la cual contiene un cambio de guanina a adenina en la posición 1846,

realizando luego una digestión del amplicón resultante utilizando la enzima de

restricción MvaI. Esta técnica (Figura 11A) se implementó como metodología de

confirmación para los genotipos obtenidos a través de la PCR anidada-AS.

La PCR se llevó a cabo utilizando los partidores directo (5’-

GCCTTCGCCAACCACTCCG -3’) e inverso (5’-AAATCCTGCTCTTCCGAGGC-3’), la

reacción se realizó en 25 μL, con 5 µL de DNA, 0,8 µM de cada partidor, 0,2 mM de

dNTPs, 2 U de DNA polimerasa Taq, en Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM y MgCl2 2

mM.

El protocolo de la PCR consta de un paso inicial a 94ºC durante 5 minutos seguido

por 30 ciclos, cada uno compuesto de tres fases: desnaturación a 94ºC durante 60

segundos, apareamiento a 67ºC durante 30 segundos y de extensión a 72ºC durante

90 segundos. Por último se completó la reacción con 72ºC durante 5 minutos. Se

observó el producto de la PCR mediante una electroforesis horizontal en un gel de

agarosa al 2,0 % teñido con bromuro de etidio, utilizando un estándar de peso

molecular de 100-1000 pb y cargando 8 µL de la reacción. La electroforesis se realizó a

300 volts durante 45 minutos en tampón TBE 1X, observándose a la luz UV un

amplicón de 355 pb.



36

36

Figura 11

Digestión con la enzima MvaI del producto de la PCR para la detección del

polimorfismo G1846A

A) Amplificación mediante la PCR de un segmento que abarca la unión del intrón 3 con

el exón 4 del gen CYP2D6. B) Digestión del amplicón de 355 pb utilizando la enzima

de restricción MvaI para la detección de la mutación G1846A.

A)

B)


CYP2D6 3’ 5’

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PCR

*4/*4

355 pb Enzima de

restricción MvaI

5'...CC^W GG...3' 3'...GG W^CC...5'

W: A o T

G1846A

250 105

wt/wt

355



37

37

A continuación, el amplicón se sometió a digestión con la enzima MvaI durante 2

horas a 37°C en su tampón su tampón R 1X (Tris-HCl 10 mM (pH 8,5), cloruro de

magnesio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y BSA 0,1 mg/mL). La reacción se llevó a

cabo en 16 µL, de los cuales 8 µL del producto de PCR, 10 U de enzima MvaI, en 1 µL

de tampón Tango y 6 µL de agua. La digestión se sometió a una electroforesis

horizontal en un gel de agarosa al 2,5 % con bromuro de etidio y los productos se

visualizaron bajo luz UV.

Los individuos homocigotos para el genotipo silvestre (wt/wt) dieron dos segmentos

de 250 y 105 pb; los homocigotos del polimorfismo (*4/*4), un segmento de 355 pb y el

genotipo heterocigoto (wt/*4), dio 3 fragmentos de 355, 250 y 105 pb (Figura 11B). El

amplicón de 355 pb no es cortado por la enzima en el alelo mutado ya que presenta

una adenina en la posición 1846, en cambio, el corte sí ocurre para el alelo silvestre

debido a la presencia de una guanina en la misma posición.

4.3.6. Identificación de la duplicación o multiplicación génica del gen

CYP2D6 mediante una PCRL

El método utilizado, adaptado de protocolos utilizados por otros investigadores

(Steijns y cols., 1998; Lovlie y cols., 1996; Pulczynska y cols., 2011), permite detectar

la duplicación o multiplicación génica basándose en la disposición de los segmentos

nucleotídicos ubicados río abajo de CYP2D7 y CYP2D6. Existe una secuencia

homóloga de 3,4 kb río debajo de ambos CYP2D6 y de CYP2D7. En el caso de éste

último, un elemento de 1,6 kb interrumpe el segmento de 3,4 kb en dos segmentos de

0,6 kb y 2,8 kb, mientras que en CYP2D6 no existe interrupción (Figura 12A). Además,

la secuencia ubicada entre el extremo 3’ del segmentos de 2,8 kb río abajo de CYP2D7

y el extremo 5’ del gen CYP2D6 es única; normalmente no se encuentra río abajo de

este gen y solamente en el caso de que exista duplicación o multiplicación génica, se

encuentra esta secuencia única en el segmento intergénico entre dos copias de

CYP2D6 (Figura 12A).

Según lo anterior, se puede utilizar una PCR especial, llamada PCR-long (PCRL)

empleando el partidor directo P17 (5’-TCCCCCACTGACCCAACTCT-3’) que se diseñó

para aparearse al segmento repetido de 0,6 kb río abajo de CYP2D6 y CYP2D7, y el



38

38

Figura 12

Duplicación y multiplicación génica del gen CYP2D6*1 y su detección mediante la

PRCL

A) Individuo silvestre. Los partidores P17 y P32 generan a través de la PCRL una

banda de 5,2 kb correspondiente a la región intergénica entre CYP2D6 y CYP2D7.

B) Duplicación del gen CYP2D6. Además de la banda de control de amplificación se

genera otra de 3,6 kb, correspondiente a la región intergénica entre dos copias del gen

CYP2D6.

A)

B)

Banda de control de amplificación Banda específica de amplificación

P17 P32 P17 P32 P17

5,2 kb 3,6 kb

5’ 3’ CYP2D6 DUP CYP2D7 CYP2D6

5,2 kb

Banda de control de amplificación

CYP2D7 CYP2D6 3’ 5’

0,6 kb 2,8 kb 0,6 kb 2,8 kb

P17 P32 P17




39

39

partidor inverso P32, que se ancla en la secuencia única presente en ambos genes.

Por lo tanto, al realizar la PCRL con esta combinación de partidores que genera una

única banda de control de amplificación de 5,2 kb, correspondiente a la región

intergénica de CYP2D7-CYP2D6. En el caso de la duplicación o multiplicación génica,

el mismo conjunto de partidores produce una banda específica de amplificación de 3,6

kb, debido a que el partidor P32 (5’-CACGTGCAGGGCACCTAGAT-3’) se ancla en la

región intergénica ubicada entre ambas copias del gen duplicado (Meijerman y cols.,

2007; Steijns y cols., 2007; Lovlie y cols., 1996).

La PCRL se realizó en 25 µL usando: 1 µL de DNA, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, (NaCl

100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM, glicerol 50%), MgCl2 1 mM, dNTPs 0,24 mM,

DMSO 5% v/v, cada partidor 0,3 µM y 0,8 U de BIO-X-ACT Long DNA polimerasa que

contiene una mezcla de dos polimerasas, una DNA polimerasa termoestable

convencional (polimerasa Taq) en mayor proporción y una DNA polimerasa con

actividad correctora 3’ --> 5’.


durante 2 minutos, luego 60 segundos a 67°C, seguido de 27 ciclos comenzando con

una desnaturación a 94°C durante 10 segundos, apareamiento a 67°C durante 30

segundos y luego extensión a 68°C durante 20 minutos, finalmente una extensión a

68°C durante 20 minutos. El resultado se visualizó mediante electroforesis en gel de

agarosa al 1% con bromuro de etidio, utilizando el estándar de peso molecular de

1500-10000 pb MassRuler High Range DNA Ladder.

En individuos con genotipo silvestre sólo se observa un amplicón de 5,2 kb,

mientras que en el caso de individuos que presentan la duplicación génica además se

observa la banda específica de duplicación de 3,6 kb (Figura 12B).

4.4. Estimación del porcentaje de mezcla amerindia-caucásica

(%MA-C)

Suponiendo que las poblaciones españolas e indígenas actuales presentan las

mismas frecuencias genotípicas y alélicas para los loci ABO y Rh que las poblaciones

que dieron origen a la población chilena actual, se estimó el porcentaje de mezcla



40

40

amerindio-caucásica según el método de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). El cálculo

de la frecuencia alélica para el sistema ABO se determina a través el equilibrio de

Hardy-Weinberg, las frecuencias de los alelos sanguíneos A, B y O se definen p, q y r

respectivamente, siendo F la frecuencia alélica de cada grupo:

Si el valor de la ecuación 4 es diferente de 1, se realiza una corrección a través de

la desviación (D) de cálculo y se obtienen los valores específicos para cada frecuencia

alélica a partir de:

Siendo p’, q’ y r’ los valores corregidos de las frecuencias de los grupos sanguíneos.

El valor obtenido para D (ecuación 5) es reemplazado en las ecuaciones 6, 7 y 8. El

resultado obtenido para la ecuación 8, corresponde a la frecuencia de la población, el

cual es reemplazado en la ecuación 9 para obtener el % MA-C.

Donde las frecuencias génicas del alelo O (sistema sanguíneo ABO) aceptadas

para las poblaciones ancestrales tanto caucásica (española) como amerindia

(mapuche) son de 0,6465 y 1,000, respectivamente (Valenzuela y cols., 1987).



41

41

4.5. Análisis farmacocinético: CYP2D6 in vivo

4.5.1. Análisis de control de calidad del comprimido Declinax

Se utilizaron comprimidos de Declinax que contienen 22,5 mg de sulfato de

debrisoquina, equivalentes a 20 mg de debrisoquina base.

Figura 13: Estructura molecular del sulfato de debrisoquina

Se comprobó la identidad del fármaco Declinax. Para esto se utilizó un método de

identificación a través de espectrofotometría-UV (Moffat y cols., 2004), el cual

establece que una solución acuosa ácida de Declinax a 270 nm determina una

absorbancia de 17,7, lo cual corresponde a 10 mg/mL de sulfato de debrisoquina.

Se molió un comprimido de 20 mg de Declinax y se transfirió a un matraz de 100

mL, se aforó con HCl 0,5 M, se sonicó durante 15 minutos y se centrifugó durante 15

minutos a 3000 rpm. El sobrenadante se utilizó para realizar la medición de

absorbancia a 270 nm en cubetas de cuarzo de 1 cm. La uniformidad del contenido de

los comprimidos de Declinax se determinó analizando 10 comprimidos de la manera

indicada, los cuales tuvieron un peso promedio de 147,37 mg.

4.5.2. Reclutamiento de voluntarios sanos

Para observar el comportamiento de las variantes polimórficas, se definió un diseño

experimental exploratorio con 5 individuos de cada variante. Éstos debían ser elegidos

al azar dentro de los individuos genotipificados. Sin embargo, no se logró encontrar el



42

42

número de voluntarios deseados, debido a la baja frecuencia de los polimorfismos de

CYP2D6 en la población en estudio; por lo tanto, se optó por la selección de

voluntarios que presentaran genotipos interesantes y relevantes para el estudio de

actividad catalítica in vivo.

Un médico del Hospital San Juan de Dios seleccionó a 25 voluntarios(as)

completamente sanos(as) a partir de los criterios de inclusión y exclusión (Anexo 4) y

los instruyó acerca del propósito del estudio explicando claramente los posibles riesgos

y beneficios. Cada voluntario debió firmar un consentimiento informado para participar

en el estudio (Anexo 2).

4.5.3. Recolección de muestras de orina

Los voluntarios fueron citados al Centro de Investigaciones Farmacológicas y

Toxicológicas (IFT) para la entrega de un instructivo (Anexo 5) con el procedimiento de

toma de muestra de orina a realizar en sus casas, junto con los recipientes adecuados

y una monodosis del comprimido de Declinax, el cual contiene 22,5 mg del sulfato de

debrisoquina.

A los voluntarios se les instruyó no ingerir alimentos desde las 19:00 horas hasta las

00:00 horas. También se les prohibió ingerir café, alcohol y realizar ejercicios violentos

durante esa noche, para no alterar los resultados del análisis. El instructivo indicaba

tomar una muestra de orina en un frasco a las 23:00 horas, la cual se designó como

―muestra blanco‖, luego se solicitaba vaciar completamente la vejiga e ingerir el

comprimido con 250 mL de agua. Luego de 8 horas o durante ellas el voluntario

recolectó toda la orina en un segundo frasco, designado como ―orina con

debrisoquina‖.

El voluntario mantuvo la orina recolectada refrigerada durante toda la noche y la

llevó al laboratorio IFT antes de las 2 horas de terminado el procedimiento de la

segunda toma de muestra de orina. De las muestras de orina se tomaron 10 mL que se

almacenaron a -20°C para su posterior utilización.



43

43

4.5.4. Determinación de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina en orina

Para determinar los niveles de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina en orina, se

utilizó un método de HPLC con detector de fluorescencia, luego de una extracción de

líquido/líquido, basados en lo descrito por Bozkurt y colaboradores en 1993.

4.5.5. Equipamiento/ Instrumentación

El sistema de cromatografía consistió en un equipo HPLC Shimadzu LC-20 AT,

desgasificador DGU – 20 As, unidad de toma de muestra automática SIL-20 A, módulo

de comunicación CBM – 20 A, detector de fluorescencia RF-10 A XL y horno de

columna CTO-20 A. Una columna ODS-3 C18 Inertsil; 250 x 4,6 mm, 5 µm (lote:

9JI86395) a 35°C. La fase móvil compuesta de amortiguador NaH2PO4 0,1 M:

acetonitrilo (87:13 v/v), se filtró antes de utilizar y se almacenó a temperatura ambiente

junto con la columna. La fase móvil se bombeó a un flujo de 1,0 mL/min a través de la

columna. El detector de fluorescencia se estableció para las longitudes de onda de 210

y 290 nm, para excitación y emisión, respectivamente. El volumen de inyección de la

muestra fue de 1µL/mL y el tiempo de corrida 30 minutos. Los tiempos de retención

bajo estas condiciones son 6 minutos para 4-hidroxidebrisoquina y 17,6 minutos para

debrisoquina.

4.5.6. Preparación de soluciones madres de debrisoquina

Se pesó un comprimido de Declinax obteniéndose 173,7 mg y se molió en un

mortero. El polvo se suspendió en HCl a 0,5 M y luego se transfirió a un matraz aforado

de 100 mL aforando con la misma solución. Se sonicó durante 15 minutos y se

centrifugó a 1509 x g durante 10 minutos a 4°C. Se midió la concentración del

sobrenadante de debrisoquina hemisulfato por espectrofotometría UV a 270 nm y se

obtuvo un resultado de 240 µg/mL.

A partir de la solución madre de debrisoquina de 240 µg/mL se preparó una solución

base de debrisoquina de 100 µg/mL y, a partir de ésta, varias soluciones con

concentraciones finales de 15-10-5-1-0,5 µg/mL (Tabla 4).



44

44

Tabla 4

Concentraciones de las soluciones madres de debrisoquina

Se indican las soluciones madres y las alícuotas que se utilizaron para obtener las

concentraciones finales, las cuales se usaron para la estandarización de la

metodología de detección de 4-hidroxidebrisoquina y debrisoquina mediante HPLC con

detector de fluorescencia. (*)Todas las soluciones se mantuvieron refrigeradas a 7 °C.

Soluciones de Alícuota (mL)

*Concentración final

(µg/mL) debrisoquina (µg/mL)

240

2,08

100

100 0,75 15

100 1 10

10 5 5

5 1 1

5 0,5 0,5



45

45

4.5.7. Curvas de calibración

Para determinar la presencia de debrisoquina y su metabolito 4-hidroxidebrisoquina

en orina mediante cromatografía, los analitos deben extraerse de la matriz biológica.

Para ello se utilizó un método de extracción líquido-líquido adaptado de Pereira y

colaboradores (2000), que permite separar el analito utilizando la diferencia de

solubilidad de sus componentes entre dos líquidos no miscibles.

Se colocaron 180 µL de una muestra de orina blanco en un tubo de vidrio para

centrífuga, y se agregaron 20 µL de solución estándar de debrisoquina (5-10-15

µg/mL). La muestra biológica se purificó al agregar 80 mg de cloruro de sodio, luego la

orina se alcalinizó a pH 9,0 con la adición de 25 µL de hidróxido de sodio 0,4 M. La

extracción líquido/líquido se llevó a cabo agregando 1 mL de una mezcla de

diclorometano:isopropanol (6:4 v/v) y agitando durante 5 minutos a 110 x g. Luego de

la extracción y centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos a 4°C, se tomaron 0,5 mL

de la fase orgánica y se evaporó el solvente orgánico bajo una suave corriente de gas

nitrógeno a 37°C. El extracto seco se reconstituyó en 500 µL de una mezcla de

solución de NaH2PO4 0,1 M y acetonitrilo (87:13 v/v). Se mezcló en un vórtex durante

30 segundos y se puso en viales (Waters, MA, EE.UU.). Se inyectaron 10 µL en el

HPLC durante 30 minutos y se recolectaron los datos. La linealidad del método se

obtuvo en un rango de concentración de debrisoquina de 0,5 a 15 µg/mL. Para

establecer linealidad se realizaron curvas de calibración que incluían 5 puntos de

concentración (0,5 - 1 - 5 - 10 - 15 µg/mL). El valor obtenido para el coeficiente de

correlación entre la concentración de debrisoquina vs el área bajo la curva fue de

0,997.

4.5.8. Procesamiento de muestras de voluntarios sanos

Las muestras de orina obtenidas de los voluntarios correspondieron a muestras de

0 y 8 horas. Para la extracción líquido/líquido, se tomaron en duplicado 200 µL de cada

muestra y se procesaron de igual forma que las muestras de la curva de calibración.

Finalmente, se colocaron en viales y se analizaron por HPLC; se inyectó un volumen

de muestra de 10 µL.



46

46

4.5.9. Determinación de la razón metabólica

El fenotipo hidroxilador de la debrisoquina es asignado por la razón metabólica de

debrisoquina (RM) expresada en la ecuación 11, definida como la razón entre la

concentración molar de la molécula original y el metabolito 4-hidroxidebrisoquina en

muestras de orinas de 0 – 8 horas. Debido a que no se utilizó un estándar de

debrisoquina y tampoco de 4-hidroxidebrisoquina, en este estudio la razón metabólica

corresponde a la razón entre las áreas de debrisoquina y de 4-hidroxidebrisoquina.

La definición del fenotipo está establecida a modo de convención, donde se

instauran puntos de cortes que segregan la población en metabolizador ultrarrápido

(MU), metabolizador extensivo (ME), metabolizador intermedio (MI) y metabolizador

pobre (MP) (Tabla 5).

4.6. Análisis estadístico

Para relacionar las razones metabólicas con los genotipos estudiados, se realizó un

análisis descriptivo con respecto a la media, mediana y desviación estándar de los

resultados obtenidos utilizando el programa GraphPad Prism 5 (San Diego, EE.UU.

www.graphPad.com).

http://www.graphpad.com/



47

47

Tabla 5

Razones metabólicas de debrisoquina

Las razones metabólicas se obtienen a través de los fenotipos de CYP2D6 según los

puntos de cortes establecidos en la literatura. Adaptado de Neafsey y colaboradores

(2009).

Fenotipo metabolizador RM debrisoquina

Metabolizador ultrarrápido (MU) < 0,2

Metabolizador extensivo (ME) 0,2 - 1,0

Metabolizador intermedio (MI) 1 - 12,6

Metabolizador pobre (MP) > 12,6



48

48

5. Resultados

5.2. Análisis genotípico

5.2.1. Voluntarios sanos

Se reclutaron 321 voluntarios sanos a los que se les informó sobre el estudio.

Firmaron el consentimiento informado (Anexo 1) y se les tomó la muestra de sangre

periférica.

La población del estudio incluyó hombres y mujeres mayores de 18 años y menores

de 73 años. El promedio de edad fue de 31 ± 12 años, con un índice de masa corporal

de 24,4 ± 3 kg/m2 (Tabla 6).

5.2.2. Frecuencias alélica y genotípica de C2850T (CYP2D6*2)

La detección de la variable alélica CYP2D6*2 (C2850T) se hizo a través de PCR

seguida de cortes específicos utilizando la enzima de restricción HhaI. En la Figura 14

se muestran ejemplos de los patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias

alélicas y genotípicas se presentan en la Tabla 7.

5.2.3. Frecuencias alélica y genotípica de A2549del (CYP2D6*3)

La detección de la variable alélica CYP2D6*3 (A2549del) se hizo a través de PCR

semianidada AS y PCR RFLP; en las Figuras 15 y 16 se muestran ejemplos de los

patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias alélicas y genotípicas se

presentan en la Tabla 8.

5.2.4. Frecuencias alélica y genotípica de G1846A (CYP2D6*4)

La detección de la variable alélica CYP2D6*4 (G1846A) se hizo a través de PCR

semianidada AS y PCR-RFLP; en las Figuras 17 y 18 se muestran ejemplos de los

patrones electroforéticos obtenidos. Las frecuencias genotípicas y alélicas se

presentan en la Tabla 9.



49

49

Tabla 6

Características de la población del estudio

Se presenta el número de voluntarios sanos que participaron en el estudio separados

según sexo, se indican los promedios de edad, peso, altura e IMC. Los datos están

expresados como promedios ± desviación estándar. IMC: Índice de masa corporal.

Mujeres Hombres Total

Número 188 133 321

Edad (años) 31 ± 12,3 30 ± 12,2 31 ± 12

Peso (kg) 61,8 ± 9,1 74,9 ± 10,1 66,8 ± 11,4

Altura (m2) 1,60 ± 0,1 1,73 ± 0,07 1,65 ± 0,09

IMC (kg m-2) 24,4 ± 3,2 25 ± 2,9 24,4 ± 3



50

50

Figura 14

Patrones electroforéticos de C2850T (CYP2D6*2)

A) Producto de la PCR de 1029 pb en gel de agarosa al 1,2 %. B) Productos de

digestión con la enzima de restricción HhaI, se observaron fragmentos de 786, 414 y

372 pb para el genotipo heterocigoto (carril 4), 414 y 372 pb para el genotipo silvestre

(carriles 2 y 3) y de 786 pb para el genotipo homocigoto (1 y 5). PM: Peso molecular

100 – 1000 pb.

Estándar PM

1029 pb

800 pb

400 pb

786 pb

372 pb

Estándar PM

A

B

1 2 3 4 5

*2/*2 wt/wt wt/wt wt/*2 *2/*2

414 pb



51

51

Tabla 7

Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CY2D6*2 (C2850T)

A) Frecuencia genotípica del polimorfismo C2850T. B) Frecuencia alélica del

polimorfismo C2850T. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el

estudio. wt o *2: alelo silvestre o wild type , *2: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,

wt/*2: genotipo hetericogoto *2, *2/*2: genotipo homocigoto *2.

A)

Frecuencia genotípica de

CYP2D6*2

Genotipos nt 2850 N %

CYP2D6*1/*1 C/C 119 37

CYP2D6*1/*2 C/A 143 44,5

CYP2D6*2/*2 A/A 59 18,4

B)

Frecuencia alélica de

CYP2D6*2

Alelos nt 2850 N %

*1 C 381 59,3

*2 A 261 40,6



52

52

Figura 15

Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través de la PCR alelo

específica semianidada

A) Producto de la PCR, banda de 1123 pb en gel de agarosa al 1,2 %. B) Productos de

la PCR-AS de 563 pb. El primer carril corresponde a la reacción para determinar el

alelo silvestre, el segundo carril determina el alelo mutado. En la figura se muestran 4

voluntarios sanos genotipificados. Los voluntarios 1, 2 y 3 presentan un genotipo wt/wt,

el voluntario 4 presenta un genotipo heterocigoto para *3. Para CYP2D6*3 (A2549del)

no se encontraron individuos homocigotos. PM: Peso molecular 100 – 1000 pb.

A

B

Estándar PM

1123 pb

1000 pb

563 pb

Estándar PM

wt/wt wt/wt wt/wt wt/*3

700 pb

600 pb

1 2 3 4

1 2 3 4



53

53

Figura 16

Patrones electroforéticos de A2549del (CYP2D6*3) a través de la PCR RFLP


digestión del amplicón de 270 pb tratado con la enzima de restricción MspI. El patrón

de bandeo se observa en un gel de poliacrilamida al 16%, el genotipo silvestre produce

dos fragmentos de 188 y 82 pb, mientras que el genotipo heterocigoto para *3 produce

además fragmentos de 168 y 20 pb. PM: Peso molecular 50 – 1000 pb.

300 pb 250 pb 200 pb 150 pb 100 pb

wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/wt wt/*3

Estándar PM

A

B

Estándar PM

300 pb 200 pb



54

54

Tabla 8

Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CY2D6*3 (A2549del)

A) Frecuencia genotípica del polimorfismo A2549del. B) Frecuencia alélica del

polimorfismo A2549del. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el

estudio. wt o *3: alelo silvestre o wild type , *3: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,

wt/*3: genotipo heterocigoto *3, *3/*3: genotipo homocigoto *3.

A)


CYP2D6*3


CYP2D6*1/*1 A/A 259 97,8

CYP2D6*1/*3 A/del 6 2,18

CYP2D6*3/*3 del/del 0 0

B)


CYP2D6*3

Alelos nt 2549 N %

*1 A 635 98,9

*3 del 6 1,09



55

55

Figura 17

Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través de la PCR alelo

específica semianidada


la PCR-AS de 577 pb. El primer carril corresponde a la reacción para determinar el

alelo silvestre, el segundo carril determina el alelo mutado. En la figura se muestran 4

voluntarios sanos genotipificados. El voluntario 1 presenta un genotipo *4/*4, el

voluntario 2 presenta un genotipo wt/*4 y los voluntarios 3 y 4, corresponden a un

genotipo homocigoto wt/wt. PM: Peso molecular 100 – 1000 pb.

570 pb

*4/*4 wt/*4 wt/wt wt/wt

A

B

800 pb

700 pb 738 pb

Estándar PM

1 2 3 4

Estándar PM



56

56

Figura 18

Patrones electroforéticos de G1846A (CYP2D6*4) a través de la PCR RFLP


la RFLP, digestión del producto de la PCR con la enzima de restricción MvaI en un gel

de agarosa al 2,2%. En el primer y segundo carriles se observó un fragmento de 250

pb para el genotipo homocigoto silvestre, en el tercer y cuarto se observó un fragmento

de 355 pb, que corresponde al genotipo homocigoto para el alelo *4, en el quinto carril

se observaron fragmentos de 355 y 250 pb, que definen al genotipo heterocigoto para

el alelo *4. El fragmento de 105 pb no se visualizó en todas las muestras. PM: Peso

molecular 100 – 1000 pb.

400 pb

300 pb

355 pb

Estándar PM

355 pb

250 pb

wt/wt wt/wt *4/*4 *4/*4 wt/*4

A

B

Estándar PM

Estándar PM

400 pb

300 pb

100 pb 105 pb



57

57

Tabla 9

Frecuencias genotípica y alélica para el alelo CYP2D6*4 (G1846A)

A) Frecuencia genotípica del polimorfismo G1846A. B) Frecuencia alélica del

polimorfismo G1846A. nt: nucleótido, N: número de voluntarios que participaron en el

estudio, wt o *4: alelo silvestre o wild type, *4: alelo mutado, wt/wt: genotipo silvestre,

wt/*4: genotipo heterocigoto *4, *4/*4: genotipo homocigoto *4.

A)


CYP2D6*4


CYP2D6*1/*1 G/G 249 77,6

CYP2D6*1/*4 G/A 68 21,2

CYP2D6*4/*4 A/A 4 1,3

B)


CYP2D6*4

Alelos nt 1846 N %

*1 G 566 88,2

*4 A 76 11,8



58

58

5.2.5. Frecuencia genotípica de la duplicación o multiplicación génica de

CYP2D6*1xN

La detección de la duplicación o multiplicación génica de CYP2D6 se hizo a través

de PCRL; en la Figura 19 se muestran ejemplos de los patrones electroforéticos

obtenidos. La frecuencia genotípica se presenta en la Tabla 10.

5.2.6. Resumen de las frecuencias alélica y genotípica de CYP2D6

En la Tabla 11 se reúnen las frecuencias alélicas y genotípicas determinadas en el

estudio para las variantes alélicas de CYP2D6 (*2, *3 y *4) para el total de individuos

analizados.

5.2.7. Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica (%MA-C)

La estimación del nivel de mestizaje de la población de estudio se calculó a partir de

los grupos sanguíneos del conjunto de voluntarios reclutados, calculándose las

frecuencias alélicas para el sistema ABO utilizando el equilibrio de Hardy-Weinberg y la

ecuación de Bernstein (Kalmes y Huret, 2001). Las frecuencias obtenidas para la

población chilena del estudio fueron de A= 0,2093, B= 0,0797 y O= 0,7109 (Tabla 12).

Los resultados se compararon con las frecuencias alélicas de la población

caucásica y amerindia (Acuña y cols., 2000), calculándose el %MA-C (Ecuación 9) para

cada alelo. Se encontró que en la población estudiada existe aproximadamente un

18% de mezcla amerindia-caucásica.



59

59

Figura 19

Patrones electroforéticos de CYP2D6*1xN

En un gel de agarosa al 1,0% para voluntarios sin la duplicación se observó sólo la

banda de control de amplificación de 5,2 kb. Se utilizó un control positivo, para el cual

amplificaron la banda específica de duplicación de 3,6 kb y la banda de control de

amplificación de 5,2 kb. PM: 1000 – 10000 pb.

5 kb

3 kb

5,2 kb

3,6 kb

Control positivo

Estándar PM



60

60

Tabla 10

Frecuencia genotípica de CYP2D6*1xN

Se indica la frecuencia genotípica para un subgrupo de 20 voluntarios. N: Número de

voluntarios que participaron en el estudio.

Frecuencia genotípica

CYP2D6*1xN N %

Presencia 0 0

Ausencia 20 100



61

61

Tabla 11

Resumen de las frecuencias genotípica y alélica de CYP2D6*2, *3 y *4

Se indican las frecuencias genotípicas de cada genotipo encontrado de CYP2D6 y las

frecuencias alélicas de los alelos de CYP2D6.

Frecuencia genotípica

Frecuencia alélica


Alelo N %

CYP2D6*1/*1 C/C 119 37

*1 281 59,3

CYP2D6*1/*2 C/T 143 44,5

*2 261 40,6

CYP2D6*2/*2 T/T 59 8,4

nt 2549 N %

N %

CYP2D6*1/*1 A/A 259 97,8

*1 635 98,9

CYP2D6*1/*3 A/del 6 2,18

*3 6 1,09

CYP2D6*3/*3 del/del 0 0

nt 1846 N %

N %

CYP2D6*1/*1 G/G 249 77,6

*1 566 88,2

CYP2D6*1/*4 G/A 68 21,1

*4 76 11,8

CYP2D6*4/*4 A/A 4 1,3



62

62

Tabla 12

Porcentaje de mezcla amerindia-caucásica en la población del estudio

A) Se indican la cantidad de cada grupo sanguíneo de los voluntarios. B) Se indican

frecuencias alélicas de cada grupo sanguíneo de la población de estudio y las

frecuencias alélicas de las poblaciones española e indígena (*Acuña y cols., 2000). Se

presenta el porcentaje de mezcla amerindia-caucásica de la población del estudio

equivalente a un 18%.

A)

Grupo sanguíneo Chilenos

AB 8

A 112

B 41

O 160

Total 321

B)

Frecuencia alélicas Chilenos Españoles* Indígenas*

A 0,2093 0,2864 0,0678

B 0,079 0,067 0

O 0,7109 0,6465 0,9322

%MA-C 18



63

63

5.3. Análisis farmacocinético

5.3.1. Prueba de identidad y uniformidad de contenido del comprimido

Declinax

Se obtuvo el espectro ultravioleta (Figura 20) de los comprimidos de Declinax de 20

mg (sulfato de debrisoquina). El espectro ultravioleta se registró para una solución

ácida a 270 nm.

Figura 20: Espectro característico de sulfato de debrisoquina

El promedio de las absorbancias obtenidas a 270 nm fue 0,389, lo cual corresponde

a 22,02 mg en promedio para los 10 comprimidos. La United States Pharmacopeia

(USP) exige que el % RSD (desviación estándar/media) no debe exceder el 6%, lo cual

se cumplió en este ensayo (%RSD = 0,0389). Además exige que el contenido del

fármaco esté entre 85 y 115%, lo cual también se cumplió (Tabla 13).

5.3.2. Genotipos de los voluntarios sanos

Se seleccionaron 25 voluntarios sanos de la población del estudio, según los

polimorfismos que presentaron y a partir de los criterios establecidos, descritos en

la sección 4.2.3. de la metodología y en el Anexo 4. De estos voluntarios 15 fueron



64

64

Tabla 13

Test de uniformidad

Se indican los gramos de cada comprimido y su absorbancia obtenida a 270 nm. Se

presenta la conversión de los gramos del comprimido Declinax a milígramos de sulfato

de debrisoquina, promedio y el cálculo de RSD.

Comprimido (gr) Absorbancia Sulfato de

debrisoquina (mg)

Contenido del

fármaco (%)

0,1746 0,365 20,62 93,64

0,1737 0,370 20,90 94,91

0,1766 0,376 21,24 96,46

0,1746 0,394 22,26 101,08

0,1762 0,402 22,71 103,13

0,1737 0,396 22,37 101,59

0,1728 0,390 22,03 100,04

0,1742 0,389 21,98 99,82

0,1731 0,407 23,00 104,45

0,1742 0,409 23,11 104,95

22,02 Promedio

0,86 Desviación

4,00 %RSD



65

65

mujeres y 10 fueron hombres, con un promedio de edad de 26 ± 9,2 años y un IMC

de 22,8 ± 2,4 kg m-2 (Tabla 14).

En la Tabla 15 se muestra el número de voluntarios elegidos para cada

polimorfismo de CYP2D6 separados en grupos según genotipo y sexo.

Los resultados de los análisis de los tres polimorfismos de nucleótido único (alelos

*2, *3 y *4) son compatibles con un total de 11 genotipos teóricos diferentes, de los

cuales 10 son genotipos posibles (Tabla 16).

5.3.3. Determinación de la razón metabólica de debrisoquina 4-hidroxilasa

Luego de administrar una monodosis de 20 mg de Declinax a cada voluntario, se

recolectaron las muestras de orina y se analizaron mediante HPLC. Los tiempos de

retención obtenidos para la 4-hidroxidebrisoquina y la debrisoquina fueron 6 y 17,6

minutos, respectivamente. En la Figura 21A se observa un cromatograma

representativo de un individuo con fenotipo ME, en la Figura 21B se observa un

cromatograma representativo de un individuo con fenotipo MI y en la Figura 21C se

observa un cromatograma representativo de un individuo con fenotipo MP.

Las razones metabólicas agrupadas según genotipo y su clasificación de acuerdo a

la capacidad metabólica, se encuentran plasmadas en la Tabla 17. Las razones

metabólicas de los individuos fueron segregadas en metabolizador pobre (MP),

metabolizador intermedio (MI), metabolizador extensivo (ME) y metabolizador

ultrarrápido (MU), según los valores establecidos en la Tabla 5. En base a estos datos

se analizó la relación genotipo-fenotipo en los 23 individuos a los que se les administró

Declinax. En la Tabla 18 se muestran los genotipos y una comparación entre los

fenotipos esperados y los fenotipos determinados.

5.3.4. Análisis estadístico

Los resultados de cada individuo del estudio se utilizaron para realizar un análisis

descriptivo. Para describir el conjunto de observaciones numéricas se calcularon

medidas de tendencia central (media y mediana) y medidas de dispersión (desviación



66

66

Tabla 14

Características de los voluntarios sanos

Se detalla el número total de voluntarios participantes. Se clasifican según sexo y se

indica la edad promedio e IMC (Índice de masa corporal) del grupo completo. Los

valores están expresados como promedios ± DE.

Características grupo de estudio

Mujeres 15

Hombres 10

Total 25

Edad (años) 26 ± 9,2

IMC (kg m-2) 22,8 ± 2,4



67

67

Tabla 15

Número de voluntarios por cada polimorfismo estudiado de CYP2D6

Se detalla el polimorfismo de cada variable alélica y el número de voluntarios por cada

genotipo clasificados según sexo.

Polimorfismo C2850T

Genotipo nt 2850 Mujeres Hombres Total

CYP2D6 *1/*1 C/C 8 6 14

CYP2D6*1/*2 C/T 3 0 3

CYP2D6*2/*2 T/T 4 4 8

Polimorfismo A2549del


CYP2D6 *1/*1 A/A 11 9 20

CYP2D6*1/*3 A/del 4 1 5

CYP2D6*3/*3 del/del 0 0 0

Polimorfismo G1846A


CYP2D6 *1/*1 G/G 7 8 15

CYP2D6*1/*4 G/A 5 2 7

CYP2D6*4/*4 A/A 3 0 3



68

68

Tabla 16

Genotipos teóricos y genotipos posibles

Se indican los 11 genotipos teóricos, de los cuales 10 son posibles, para

combinaciones de los tres polimorfismos de CYP2D6, y el número de voluntarios para

cada combinación genotípica.

Polimorfismos de CYP2D6

nt 2850 nt 2549 nt 1846 Nº de

voluntarios

Genotipos

posibles

Genotipos

teóricos

wt/wt wt/wt wt/wt 4 wt/wt wt/wt

wt/wt wt/*3 wt/wt 3 wt/*3 wt/*3

wt/wt wt/wt wt/*4 5 wt/*4 wt/*4

wt/wt wt/wt *4/*4 1 *4/*4 *4/*4

wt/*2 wt/*3 wt/wt 2 *2/*3

wt/*2-3

*2/*3

wt/*2 wt/wt wt/*4 1

wt/*2-4 wt/*2-4

*2/*4 *2/*4

*2/*2 wt/wt wt/wt 4 *2/*2 *2/*2

*2/*2 wt/wt wt/*4 2 *2/*2-4 *2/*2-4

*2/*2 wt/wt *4/*4 1 *2-4/*2-4 *2-4/*2-4



69

69

Figura 21

Cromatogramas representativos de los fenotipos ME, MI y MP

Se presentan ejemplos de cromatogramas de voluntarios sanos con tiempos de

retención de 6 minutos para 4-hidroxidebrisoquina y 17,6 minutos para debrisoquina. El

pico observado a los 24 minutos corresponde a una señal característica de la muestra

de orina. A) Cromatograma representativo de un voluntario con fenotipo metabolizador

extensivo. B) Cromatograma representativo de un voluntario con fenotipo

metabolizador intermedio. C) Cromatograma representativo de un voluntario con

fenotipo metabolizador pobre.



70

70

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mV

Detector A:Ex:210nm,Em:290nm

4-hidroxidebrisoquina/18444

debrisoquina/20746024

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mV

Detector A:Ex:210nm,Em:290nm 4-hidroxidebrisoquina/14018345


0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mV

Detector A:Ex:210nm,Em:290nm

4-


A

B

C

4-hidroxidebrisoquina/7636741



71

71

Tabla 17

Genotipos posibles y sus fenotipos metabolizadores esperados

Se indican los 10 genotipos posibles para las combinaciones de los tres polimorfismos

de CYP2D6, el número de voluntarios, el fenotipo esperado y el número de alelos

activos por cada combinación genotípica.

Polimorfismos de CYP2D6

nt 2850 nt 2549 nt 1846 Nº de

voluntarios

Fenotipo

esperado

Alelos

activos

Genotipos

posibles

wt/wt wt/wt wt/wt 4 ME 2 wt/wt

wt/wt wt/*3 wt/wt 3 MI 1 wt/*3

wt/wt wt/wt wt/*4 5 MI 1 wt/*4

wt/wt wt/wt *4/*4 1 MP 0 *4/*4

wt/*2 wt/*3 wt/wt 2 MI 1 *2/*3

wt/*2 wt/wt wt/*4 1 MI 1

wt/*2-4

*2/*4

*2/*2 wt/wt wt/wt 4 ME 2 *2/*2

*2/*2 wt/wt wt/*4 2 MI 1 *2/*2-4

*2/*2 wt/wt *4/*4 1 MP 0 *2-4/*2-4



72

72

Tabla 18

Razones metabólicas obtenidas según genotipo y su clasificación metabólica

Se indican las áreas observadas de 4-hidroxidebrisoquina y debrisoquina para cada

voluntario. Se presenta la razón metabólica correspondiente al cociente de las áreas de

debrisoquina y su metabolito. La RM de cada voluntario define su fenotipo

metabolizador observado, el cual se compara con el fenotipo metabolizador esperado.



73

73

Genotipos 4-hidroxidebrisoquina debrisoquina RM Fenotipo

encontrado

Fenotipo

esperado

wt/wt

9.036.102 2.530.048 0,28 ME ME

6.981.551 3.097.437 0,44 ME ME

12.300.439 4.057.778 0,33 ME ME

7.636.741 2.173.277 0,28 ME ME

wt/*3

5.448.394 8.270.664 1,52 MI MI

7.285.406 9.438.551 1,3 MI MI

2.388.062 6.112.580 2,56 MI MI

wt/*4

5.160.014 7.408.609 1,44 MI MI

3.703.237 2.625.384 0,71 ME MI

7.636.741 2.173.277 0,28 ME MI

14.018.345 18.858.885 1,35 MI MI

8.048.488 4.692.888 0,58 ME MI

*4/*4 164.121 20.746.024 126,41 MP MP

*2/*3 5.744.756 10.067.878 1,75 MI MI

4.471.228 497.929 0,11 ME MI

wt/*2-4 10.188.354 10.700.988 1,05 MI MI

*2/*4

*2/*2

8.238.282 2.131.913 0,26 ME ME

13.698.118 5.360.591 0,39 ME ME

5.983.320 1.561.531 0,26 ME ME

5.339.785 575.193 0,11 ME ME

*2/*2-4 6.797.418 4.601.306 0,68 ME MI

6.300.703 9.171.809 1,46 MI MI

*2/*4 110.741 13.441.410 121,38 MP MP



74

74

estándar) (Tabla 19). No se realizó un test estadístico comparativo debido a que el

número de individuos de cada subgrupo de estudio en algunos casos fue insuficiente.

Los siguientes gráficos incorporan los valores presentados en la Tabla 19. En la

Figura 22 se muestran las razones metabólicas separadas en grupos según el

genotipo. En la Figura 23 se observan las medias de las razones metabólicas de cada

genotipo, lo cual permite comparar las razones metabólicas entre genotipos.

En la Figura 24A se muestran los fenotipos metabolizadores esperados para cada

voluntario y en la Figura 24B se muestran los fenotipos metabolizadores observados

para cada voluntario según el genotipo determinado previamente.



75

75

Tabla 19

Estadísticas descriptivas de los datos

Se presentan los genotipos junto a la media de las razones metabólicas, desviación

estándar, media del logaritmo de las razones metabólicas, desviación estándar y la

mediana. N: Número de voluntarios, RM: Razón metabólica, DE: Desviación estándar.

Genotipo N Media RM DE Mediana Media Log RM DE Mediana

wt/wt 4 0,33 0,08 0,38 -0,48 0,09 -0,51

wt/*3 3 1,79 0,67 1,52 0,23 0,15 0,18

wt/*4 5 0,87 0,50 0,71 -0,13 0,29 -0,15

*4/*4 1 126,41 0,00 126,41 2,10 0,00 2,10

*2/*3 2 0,93 1,16 0,93 -0,35 0,85 -0,35

wt/*2-4

1 1,05 0,00 1,05 0,02 0,00 0,02

*2/*4

*2/*2 4 0,25 0,12 0,26 -0,64 0,24 -0,59

*2/*2-4 2 1,07 0,55 1,07 0,00 0,24 0,00

*2/*4 1 121,38 0,00 121,38 2,08 0,00 2,08



76

76

Figura 22

Relación entre genotipos y razones metabólicas

Se observan los 23 voluntarios agrupados según su genotipo y sus razones

metabólicas respectivas. Además, se muestran los promedios de las razones

metabólicas para cada genotipo. Las líneas segmentadas corresponden a los

logaritmos de los puntos de corte que clasifican las razones metabólicas en ME, MI y

MP.

Media de las razones

metabólicas del genotipo ± DE

Metabolizador Normal Metabolizador Intermedio

Metabolizador Pobre

wt/wt *2/*2 *4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4 wt/*4 *2/*2-4 wt/*3 *2/*3

*2/*4

Genotipos



77

77

Figura 23

Comparación de los promedios de las razones metabólicas según genotipo.

Se observan los promedios de los genotipos que tienen un tamaño de muestra >1. La

razón metabólica para un voluntario único de genotipo wt/*2-4 o *2/*4 (fenotipo

metabolizador intermedio) se muestra en una barra rayada. Se muestran dos

voluntarios en barras de color negro, el primero presenta un genotipo *4/*4 y el

segundo *2-4/*2-4, con los cuales se obtuvo un promedio de las razones metabólicas

observadas (barra de color gris denominada *4/*4), ya que ambas presentan el

polimorfismo G1846A (asociado al alelo CYP2D6*4). Las líneas segmentadas

corresponden a los logaritmos de los puntos de corte para separar las razones

metabólicas en ME, MI y MP.

Metabolizador Intermedio Metabolizador Pobre Media de las razones

Metabólicas del genotipo ± DE

wt/wt *2/*2 wt/*4 *2/*2-4 wt/*3 *2/*3 wt/*2-4 *4/*4 *2-4/*2-4 *4/*4

*2/*4

Genotipos



78

78

A)

B)

Figura 24

Fenotipos esperados y fenotipos observados

A) Fenotipos esperados. Se observan 23 voluntarios agrupados según su genotipo y el

fenotipo metabolizador esperado encontrar a través de la determinación de la razón

metabólica. B) Fenotipos observados. Se observan 23 voluntarios agrupados según su

genotipo y el fenotipo metabolizador observado a través de la determinación de la

razón metabólica. MP: Metabolizador pobre; MI: Metabolizador intermedio y ME:

Metabolizador extensivo.

Metabolizador Normal Metabolizador Intermedio Metabolizador Pobre

wt/wt *2/*2 *4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4 wt/*4 *2/*2-4 wt/*3 *2/*3

*2/*4

Genotipos

wt/wt *2/*2 *4/*4 *2-4/*2-4 wt/*2-4 wt/*4 *2/*2-4 wt/*3 *2/*3

*2/*4



79

79

6. Discusión

La farmacogenética trata de identificar aquellos polimorfismos genéticos que

influyen en la respuesta terapéutica de los fármacos, ofreciendo posibilidad de orientar

qué terapias farmacológicas pueden ser más eficaces y seguras para cada paciente,

en base a su perfil genético. Sin embargo, para que las pruebas farmacogenéticas

sean ampliamente aceptadas y utilizadas en el área clínica, se debe demostrar su

validez y utilidad clínica con tamaños muestrales suficientemente grandes e

independientes para cada población en estudio.

Un problema difícil de dilucidar es la correlación entre el perfil genético de un

individuo y su fenotipo metabólico, debido a que el factor genético no es el único factor

determinante del fenotipo metabolizador. Este trabajo aborda esta problemática,

esperando obtener información científica relevante que permita optimizar la toma de

decisiones frente a un tratamiento farmacológico, basándose en las características

genéticas y metabólicas de cada individuo.

Se caracterizaron tres de los polimorfismos más relevantes de la familia de

CYP2D6, correspondientes a aquellos que definen los alelos CYP2D6*2 (C2850T),

CYP2D6*3 (A2549del) y CYP2D6*4 (G1846A) en un grupo de la población chilena. El

primero corresponde a una transición 2850C>T que produce un cambio aminoacídico

de una treonina a serina, determinando una enzima con capacidad catalítica similar a

la enzima normal. El alelo CYP2D6*3 presenta la deleción de una adenina en la

posición 2549, lo cual genera una proteína no funcional, por lo tanto, no se observa

actividad catalítica de la enzima. Lo mismo ocurre con el alelo CYP2D6*4, en el cual

no se produce una enzima, producto de una transición G1846A que lleva a un codón

de término prematuro, que se traduce en una proteína no funcional.

Un aporte fundamental del presente trabajo fue determinar la frecuencia de las

variantes alélicas y genotípicas de estos polimorfismos (C2850T, A2549del y G1846A)

en un grupo de la población chilena, debido a que las frecuencias de las variantes

alélicas son diferentes en cada grupo étnico, aunque el efecto de cada variante alélica

sea idéntico en todas las poblaciones (Zanger y cols., 2004). El análisis genotípico

reunió 321 voluntarios sanos de la población general para determinar las frecuencias



80

80

alélicas del CYP2D6. Las frecuencias registradas para el CYP2D6 en la población

caucásica (España, Grecia, Portugal e Italia) se presentan en la Tabla 20. Los

resultados encontrados en este estudio son semejantes a los de la población española

caucásica, lo cual podría atribuirse a que el grupo étnico seleccionado de voluntarios

posee un porcentaje de mezcla amerindio-caucásico (%MA-C) de 18%, que es

representativo del estrato sociogenético S-II de acuerdo a lo establecido por

Valenzuela y colaboradores (1987), que corresponde al 23% de la población chilena.

Este cálculo se realizó con la finalidad de que las frecuencias genotípicas y alélicas de

los alelos CYP2D6*2 (C2850T), CYP2D6*3 (A2549del), CYP2D6*4 (G1846A) y de la

duplicación del gen CYP2D6 puedan ser comparadas con y extrapoladas a estudios

nacionales e internacionales.

Tabla 20: Frecuencias alélicas de CYP2D6

Frecuencias alélicas de CYP2D6 en países del sur de Europa y en la población

chilena (Meijerman y cols., 2007; Rodríguez Arcas & Ingelman-Sundberg, 2006). En

negrita se muestran los resultados obtenidos en el presente trabajo. Los valores que

no se muestran en la tabla no se encuentran determinados.

Gen Alelo Chile (%)

España (%)

Caucásico

Grecia (%)

Caucásico

Italia (%)

Caucásico

Portugal (%)

Caucásico

CYP2D6 *1 - 31,00 - 75,00 -

*2 40,60 40,50 - - -

*3 1,09 0,95 2,30 0,70 1,40

*4 11,80 13,80 17,80 15,30 13,30

*5 2,90 3,33 - 3,40 2,80

*1xN, *2xN 2,10 4,27 7,40 4,20 6,50

La frecuencia alélica encontrada para el polimorfismo G1846A (alelo 4) es 11,8%,

para A2549del (alelo *3) es 1,09% y para C2850T (alelo *2) es 40,6%, siendo las

frecuencias de G1846A (alelo *4) y A2549del (alelo *3) similares a las determinadas



81

81

por Pinto y colaboradores (2009) en dos grupos socioeconómicos de la población

chilena.

Una de las limitaciones del presente estudio fue que la genotipificación de la

duplicación del gen CYP2D6 en la población se realizó en un grupo pequeño de

voluntarios debido a limitaciones de tiempo. No obstante, la técnica fue implementada

y puede ser utilizada para este análisis de manera confiable y reproducible. La

frecuencia de CYP2D6*1xN reportada anteriormente en la población chilena es de

2,08% (Pinto, 2009), mientras que en el subgrupo de este estudio no se encontraron

individuos con la duplicación del gen. Para la variante polimórfica *3 (A2549del)

tampoco se encontraron individuos homocigotos mutados (genotipo *3/*3) sino tan

solo individuos heterocigotos (genotipo wt/*3). Para los polimorfismos *2 (C2850T) y

*4 (G1846A) se encontró que la frecuencia de el alelo *4 es tres veces menor que la

frecuencia de el alelo *2.

En este trabajo se postula que las variantes alélicas de CYP2D6 (*2, *3, *4 y *1xN)

podrían explicar en parte la gran variabilidad observada en pacientes tratados con

medicamentos metabolizados por CYP2D6, sin olvidar que las variaciones también se

podrían explicar por otros factores fisiológicos, patológicos, medio ambientales y por

interacciones entre medicamentos y otros xenobióticos. Para abordar esta

problemática se analizó la actividad catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo en un

subgrupo de 23 voluntarios previamente genotipificados. Estos voluntarios se

clasificaron según los fenotipos metabólicos de CYP2D6 en base a los puntos de

cortes establecidos en la literatura. Los voluntarios que exhibieron un genotipo

homocigoto para el alelo wt presentaron el fenotipo ME.

Los 23 voluntarios sanos seleccionados para la determinación in vivo de la

actividad catalítica del CYP2D6 reunió 11 genotipos teóricos diferentes (Tabla 16), de

los cuales 10 son considerados genotipos posibles. El grupo de genotipos wt/*2 para

CYP2D6*2, wt/*3 para CYP2D6*3 y wt/wt para CYP2D6*4, presenta los genotipos

teóricos wt/*2-3 y *2/*3, sin embargo dentro del estudio genotípico de los 321

voluntarios no se encontraron individuos que presentaran en uno solo de sus alelos

los polimorfismos C2850T y A2549 (*2/*2 y wt/*3; wt/*2 y *3/*3), por ende se considera

como genotipo posible solo a *2/*3. En cambio, el grupo de genotipos wt/*2 para

CYP2D6*2, wt/wt para CYP2D6*3 y wt/*4 para CYP2D6*4, ambos genotipos teóricos



82

82

(wt/*2-4 y *2/*4) fueron considerados genotipos posibles, ya que en la población de

estudio se encontraron individuos que presentan los polimorfismos C2850T y G1549G

en uno solo de sus alelos.

El polimorfismo A2549del (alelo *3) es un alelo no funcional que al estar junto a un

alelo funcional, debería resultar en un fenotipo MI, lo cual fue respaldado por los datos

obtenidos. El polimorfismo C2850T (alelo *2) es conocido por determinar un alelo

funcional al igual que CYP2D6*1, sin embargo, presenta una disminución de un 20%

de la actividad catalítica en comparación con CYP2D6*1, lo cual se demuestra en este

estudio, ya que los cuatro voluntarios presentaron un fenotipo ME. Las Figuras 22 y

23 presentan los datos obtenidos (Media Log MR) y se observa que existe una

disminución relativa de la actividad catalítica del genotipo homocigoto para el

polimorfismo C2850T (alelo *2) con respecto al grupo control (genotipo wt/wt). Un

voluntario con genotipo homocigoto para el alelo no funcional *4 exhibió un fenotipo

MP y, a su vez, otro voluntario con genotipo *2-4/*2-4 también presentó un fenotipo

MP. Ambos resultados corresponden a lo esperado debido a que presentan dos

copias del alelo no funcional *4.

Se eligieron cinco voluntarios que presentaban el genotipo heterocigoto para el

alelo *4 (G1846A), para los que, al igual que los heterocigotos para *3 (A2549del), se

esperaba un fenotipo MI. Sin embargo, se observó cierta discordancia en los datos

obtenidos, ya que tres voluntarios cumplieron con el fenotipo esperado, mientras los

otros dos voluntarios presentaron un fenotipo ME. De acuerdo a esto, no se puede

afirmar cuál de los dos fenotipos es el asociado al genotipo heterocigoto *4. Este

resultado se puede explicar debido a que el alelo funcional (CYP2D6*1) podría suplir

la actividad catalítica del alelo nulo transformando el fenotipo MI en ME, o debido a

que la gran variabilidad polimórfica presente en CYP2D6, representada por un gran

número de otras variantes alélicas de CYP2D6 no determinadas en este estudio,

podrían provocar una disminución de la actividad metabólica.

El trabajo también se dirigió a evaluar genotipos que presentaban más de un

polimorfismo, por lo que resultó interesante y relevante determinar la actividad

catalítica debrisoquina 4-hidroxilasa in vivo. Se analizaron dos voluntarios que

presentaban el genotipo *2/*2-4. Debido a que la variante alélica *2 (C2850T) presenta

una actividad catalítica similar a la normal, no se esperaba que afectara el



83

83

metabolismo en los individuos, aún cuando la presencia del polimorfismo G1846A

(asociado al alelo *4) en su forma heterocigota, podría provocar una disminución de la

actividad clasificando a los voluntarios como MI. Un voluntario presentó el fenotipo

esperado MI, mientras el otro voluntario presentó un fenotipo ME, lo cual podría

explicarse por la presencia de otra variante polimórfica no determinada en este

estudio o incluso, por la presencia de duplicación-multiplicación del alelo *2 (C2850T),

lo que supliría la función enzimática del alelo defectuoso. Esto último no fue posible de

evaluar, ya que no se determinó la duplicación del alelo *2 en estos voluntarios. Se

analizaron dos voluntarios con un genotipo *2/*3 donde los fenotipos metabolizadores

observados no concordaron con lo esperado, ya que uno de los voluntarios es ME y el

otro MI.

En base a las razones metabólicas encontradas para el grupo heterocigoto

A2549del (alelo *3), se podría suponer que el voluntario que tiene un fenotipo ME

posee una duplicación del alelo *2 (C2850T), lo cual podría suplir la actividad nula del

alelo *3. Sin embargo, el número de voluntarios encontrados con este genotipo es

insuficiente para hacer un análisis estadísticamente significativo del fenotipo

esperado. Por otra parte, uno de los voluntarios con un genotipo heterocigoto para

C2850T (alelo *2) y para G1846A (alelo *4) presentó un fenotipo MI, lo cual concuerda

con el fenotipo esperado, según lo determinado para el alelo no funcional *4.

Los resultados obtenidos individualmente para las razones metabólicas muestran

claramente el efecto de las variantes genotípicas en la expresión fenotípica de la

enzima (Figura 22). Además, se demostró la influencia del polimorfismo G1846A

(alelo *4) en la RM de debrisoquina cuando se encuentra en ambos alelos.

La frecuencia alélica de CYP2D6*2 (C2850T) es trascendente, ya que se acerca al

50% de la población del estudio, lo cual no descarta que podría encontrarse en su

forma duplicada o incluso multiplicada, elevando sustancialmente la actividad

catalítica de la enzima determinando un fenotipo MU. Al respecto, la frecuencia de la

duplicación de CYP2D6*2 en la población española es de 0,9%, por lo que se podría

esperar que al igual que los polimorfismos estudiados, la frecuencia de *2xN también

sea similar en la población chilena. Aunque es una frecuencia relativamente baja, no

se debe descartar su estudio, puesto que son pacientes que no responderán a

tratamientos o pueden sufrir intoxicaciones con medicamentos (Menoyo y cols., 2006).



84

84

En el presente trabajo de tesis no se pudo determinar la influencia del genotipo

homocigoto para CYP2D6*3 (A2549del), dado que no se encontraron individuos que

lo presentaran. A pesar de ello, los individuos heterocigotos analizados presentaron

un perfil de MI, lo cual significa una modificación de la dosis convencional de un

fármaco para obtener las respuestas farmacológicas deseadas.

Los polimorfismos de CYP2D6 estudiados en su genotipo homocigoto,

demostraron diferencias relevantes en comparación con aquellos genotipos

heterocigoto o combinación de variantes alélicas de CYP2D6. El hecho de

presentarse la mutación en ambos alelos (genotipo homocigoto), aumenta la

correlación genotipo-fenotipo al descartar la posibilidad de existencia de otras

mutaciones en igual posición que puedan afectar la caracterización in vivo. En cambio,

en aquellos que presentan distintas variables en su forma heterocigota es más difícil

estimar el fenotipo metabólico, ya que no se sabe cuan afectada puede estar la

actividad de la enzima.

No se realizaron análisis estadísticos de tipo comparativo entre los grupos con

diversos genotipos encontrados debido a que el número de voluntarios por genotipo

fue insuficiente para efectuar las comparaciones respectivas. A pesar de ello, ya que

este estudio plantea la implementación de una farmacoterapia personalizada, se

realizó un análisis descriptivo para evaluar a cada voluntario según su genotipo y

fenotipo. Se observaron diferencias en la metabolización de debrisoquina entre los

voluntarios, aunque en algunos casos no se correlacionan con el fenotipo esperado.

De los 23 voluntarios estudiados, 18 respondieron de la manera esperada, logrando

una correlación genotipo-fenotipo, lo cual se puede observar en las Figuras 23 y 24.

El solo hallazgo de voluntarios que no metabolizan debrisoquina de manera

convencional, significa que existe una base para pensar en una modificación de las

dosis convencionales de un fármaco, debido a que pueden sufrir reacciones adversas

o no obtener respuesta terapéutica al ser tratados de manera tradicional. El hecho de

que no todos los genotipos presentaran los fenotipos esperados, hace aún más

relevante estudiar otras variables alélicas de CYP2D6 no consideradas en este

estudio y sus respectivas combinaciones.



85

85

Los resultados de esta investigación sugieren que la genotipificación y/o

fenotipificación de CYP2D6 permite predecir la capacidad de oxidación de fármacos

en un individuo. Sin embargo, hay ciertas diferencias importantes entre los dos

enfoques. La fenotipificación depende de la toma de un fármaco utilizado como

marcador metabólico, por ende, se corre el riesgo de sufrir un efecto específico del

fármaco. Una desventaja adicional es la posibilidad de inhibición de la enzima por una

coadministración con otro fármaco o constituyentes de alimentos. Varios de los

sustratos de CYP2D6 y también no sustratos, son potentes inhibidores competitivos

de la enzima. Ocasionalmente pueden ocurrir interacciones de fármacos que bloquean

completamente el metabolismo de los sustratos coadministrados con consecuencias

graves. Esto podría explicar algunos de los fenotipos no esperados observados, que

pueden resultar en un cambio del fenotipo determinado in vivo de ME a IM, o incluso

MP. En contraste, el enfoque farmacogenético requiere del desarrollo de un test

apropiado de DNA. La ventaja de la genotipificación es que se requiere aplicar sólo

una vez en la vida y el resultado no se encuentra influenciado por factores

ambientales. Sin embargo, la genotipificación también tiene un bajo pero inevitable

grado de incertidumbre, hasta no disponer del análisis de todas las variantes

genéticas relevantes de la enzima.

No se encontraron estudios en la literatura que describan la caracterización de la

actividad debrisoquina hidroxilasa in vivo en grupos de la población chilena y la

correlación con su perfil genético. Por lo tanto, este es el primer trabajo realizado en

Chile que aborda este aspecto. El tamaño reducido de la muestra de individuos que

poseen ambos alelos mutados para cada polimorfismo ha sido el principal factor para

no lograr establecer una relación estadísticamente significativa entre ciertos grupos de

genotipos con la actividad catalítica de la enzima. Sin embargo, resulta importante

destacar que el objetivo fundamental que busca un estudio farmacogenético es la

determinación de la respuesta individual, por lo que los hallazgos de individuos cuyos

fenotipos metabolizadores determinan que no pueden ingerir las dosis convencionales

o deben cambiar de medicamento, ya que no son capaces de metabolizarlo, resultan

relevantes para fundamentar la farmacoterapia personalizada.

En definitiva, se requiere aumentar el número de individuos involucrados en el

análisis fenotípico, con diversas variantes alélicas y además, incluir la

caracterización de otras variantes genotípicas relevantes de la población chilena,

para una mejor caracterización genotípica-fenotípica.



86

86

7. Conclusiones

1. Se implementaron las técnicas de PCR alelo específica semianidada y PCR RFLP para

la detección de las variantes alélicas CYP2D6*3 (A2549del) y CYP2D6*4 (G1846A). La

frecuencia genotípica del polimorfismo CY2D6*3 obtenida en 321 chilenos sanos fue

97,8% para el genotipo silvestre (wt/wt), 2,18% para individuos homocigotos mutados

(*3/*3). La frecuencia alélica fue 98,9% para el alelo silvestre (*1) y 1,09% para el alelo

mutado (*3). La frecuencia genotípica encontrada para el polimorfismo CYP2D6*4 en

321 voluntarios sanos, fue 77,57% para el genotipo silvestre, 19,0% para el genotipo

heterocigoto (wt/*4) y 1,24% para individuos homocigotos mutados (*4/*4). La

frecuencia alélica para la variante alélica *4, fue 88,16% para el alelo silvestre (*1) y

11,8% para el alelo mutado (*4).

2. Se implementó la técnica de PCR RFLP para detectar el alelo CYP2D6*2 (C2850T) y

se caracterizó un grupo de 321 voluntarios sanos. La frecuencia genotípica para el

genotipo silvestre fue 37%, para el genotipo heterocigoto (wt/*2) fue 44,5% y para

individuos homocigotos mutados (*2/*2) fue 18,4%. La frecuencia alélica para la

variante *2 fue 40,6% y para el alelo silvestre (*1) fue 59,3%.

3. Se implementó la técnica de PCR larga para la determinación de la duplicación del gen

CYP2D6 (*1xN). Se analizaron 20 voluntarios sanos, de los cuales ninguno presentó la

duplicación.

4. Se desarrolló y validó la técnica para determinar debrisoquina y 4-hidroxidebrisoquina

mediante HPLC con detector de fluorescencia en muestras de orina de 0-8 horas. Se

determinó la razón metabólica (RM) de 23 voluntarios sanos quienes se clasificaron

según su capacidad metabólica en metabolizadores extensivos (ME), metabolizadores

intermedios (MI) y metabolizadores pobres (PM). Se obtuvieron resultados similares a

descrito en la literatura científica para una monodosis de 20 mg de Declinax.

5. Se realizaron análisis estadísticos descriptivos con los cuales se observó que, en 18 de

23 casos, existen diferencias en los fenotipos metabolizadores de cada voluntario por

la presencia de una variable polimórfica, existiendo una relación genotipo/ fenotipo en

la mayoría de los casos.

6. Si bien la descripción comparativa de los grupos aún no permite establecer de manera

enfática una relación genotipo-fenotipo de los polimorfismos estudiados, el

conocimiento del genotipo y del fenotipo metabólico de un individuo puede utilizarse

para establecer una farmacoterapia personalizada en cada individuo.



87

87

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95

95

9. Anexos

Anexo 1: Consentimiento informado para análisis genético



96

96

Anexo 2: Consentimiento informado para estudio farmacocinético de debrisoquina



97

97



98

98



99

99

Anexo 3: Acta de aprobación del comité de ética



100

100



101

101

Anexo 4: Criterios de inclusión y exclusión de Voluntarios para estudio farmacocinético

Criterios de inclusión

1. Grupo de hombres y mujeres sanas de edades entre 18 y 55 años con apellidos

hispanoamericanos (as) y masa corporal (BMI) entre 19 y 30.

2. No fumadores, no consumidores de drogas de abuso ni de alcohol.

3. Sin alergias a medicamentos.

4. No estar sometidos a terapias concomitantes y no haber ingerido fármacos a lo

menos dos meses antes del estudio,

5. Con resultados de los exámenes de laboratorio en rangos normales y

declarados aptos (as) para el estudio por el médico después del examen físico.

Criterios de exclusión

1. Historia clínica de hipersensibilidad a cualquier medicamento.

2. Presencia en la historia clínica de problemas gastrointestinales, de hígado,

riñón, pulmón, hematológicos, neurológicos, psiquiátricos, endocrinos,

inmunológicos o dermatológicos significativos.

3. Presencia en la historia clínica de enfermedades que hayan afectado la

absorción, distribución y eliminación de fármacos desde el organismo.

4. Mantención de una terapia para la adicción al alcohol, tabaco, marihuana u

otras drogas de abuso.

5. Haber tenido cualquier enfermedad de importancia en los 28 días previos al

estudio.

6. Haber usado en los 28 días previos al estudio fármacos que modifiquen el

sistema de biotransformación (todos los barbitúricos, corticoesteroides,

fenilhidantoinas, etcétera).

7. Haber usado cualquier medicamento en los 7 días previos del estudio,

incluyendo medicamentos de venta directa o sin receta médica.

8. Haber participado en otro estudio similar en los 28 días previos al estudio

actual.

9. Dar positivo el análisis de drogas o VIH.

10. Presencia de historia de desmayos o miedo a la extracción de sangre.



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Anexo 5: Instructivo estudio farmacocinético de debrisoquina



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