Vergelijking van het expressieprofiel van enkele tumor suppressor … · 2012. 12. 5. · de kern bevindt heeft het een functie als tumor suppressor door de inhiberende effecten

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2011 – 2012

'Vergelijking van het expressieprofiel van enkele tumor suppressor genen in mammatumoren tussen mens en hond'

door

Kirsten MEIJER

Promotor: Prof. dr. G. Van De Walle Literatuurstudie in het kader Medepromotor: dr. K. Caestecker van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar

te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht,

in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen

van gegevens uit deze studie.

Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het

auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft

benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de

individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren.

De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele

doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

Voorwoord

Ik had graag een woord van dank gericht tot alle personen die mij hebben geholpen bij het tot stand

komen van deze literatuurstudie. Graag wil ik mijn promotor Prof. dr. G. Van de Walle en mijn co-

promotor dr. K. Caestecker bedanken voor alle tijd die ze aan deze literatuurstudie hebben besteed en

daarnaast ook voor de structurele en inhoudelijke begeleiding. Mijn vader wil ik ook bedanken voor het

nalezen en het maken van kritische opmerkingen die er mede voor hebben gezorgd dat deze

literatuurstudie is geworden tot wat het nu is. En aan Robert, mijn vriend, en alle andere mensen die

me hielpen om deze literatuurstudie tot een goed einde te brengen: een welgemeend dank je wel.

Tot slot wil ik ook graag mijn moeder nog bedanken omdat ze indirect hulp heeft geboden door mij te

steunen door het bieden van een luisterend oor tijdens het maken van deze literatuurstudie.

Inhoudsopgave

VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING p. 1 LITERATUURSTUDIE 1. Inleiding. p. 2 2. Het tumor suppressor gen p21 p. 3

2.1. Situering en functiebeschrijving p. 3 2.2. Expressieprofiel van p21 in humane mammatumoren p. 3 2.3. Expressieprofiel van p21 in caniene mammatumoren p. 4

3. Het tumor suppressor gen p27 p. 5 3.1. Situering en functiebeschrijving p. 5 3.2. Expressieprofiel van p27 in humane mammatumoren p. 5 3.3. Expressieprofiel van p27 in caniene mammatumoren p. 6


5. Het tumor suppressor gen PTEN p. 9 5.1. Situering en functiebeschrijving p. 9 5.2. Expressieprofiel van PTEN in humane mammatumoren p. 11 5.3. Expressieprofiel van PTEN in caniene mammatumoren p. 11

6. Het tumor suppressor gen SLIT2 p. 13 6.1. Situering en functiebeschrijving p. 13 6.2. Expressieprofiel van SLIT2 in humane mammatumoren p. 14 6.3. Expressieprofiel van SLIT2 in caniene mammatumoren p. 14

7. Het tumor suppressor gen BRCA1 p. 15 7.1. Situering en functiebeschrijving p. 15 7.2. Expressieprofiel van BRCA1 in humane mammatumoren p. 16 7.3. Expressieprofiel van BRCA1 in caniene mammatumoren p. 16

8. Het tumor suppressor gen BRCA2 p. 17 8.1. Situering en functiebeschrijving p. 17 8.2. Expressieprofiel van BRCA2 in humane mammatumoren p. 18 8.3. Expressieprofiel van BRCA2 in caniene mammatumoren p. 19

9. Het tumor suppressor gen retinoblastoma gen (RB) p. 19 9.1. Situering en functiebeschrijving p. 19 9.2. Expressieprofiel van RB in humane mammatumoren p. 20 9.3. Expressieprofiel van RB in caniene mammatumoren p. 21


DISCUSSIE p. 24 REFERENTIELIJST p. 26

1

Samenvatting

Mammatumoren zijn de meest voorkomende tumoren bij de mens en de hond en verschillende genen

spelen een belangrijke rol tijdens tumorigenese. In deze literatuurstudie wordt aandacht besteed aan

een aantal tumor suppressor genen namelijk de genen p21, p27, p53, PTEN, SLIT2, BRCA1, BRCA2,

RB en p63.

In deze literatuur studie worden de expressieprofielen van deze tumor suppressor genen in

mammatumoren vergeleken bij de mens en bij de hond. De genen p21, p27, SLIT2 en RB vertonen in

mammatumoren verschillen in het expressieprofiel tussen mens en hond. De genen p53, PTEN,

BRCA1 en BRCA2 vertonen in mammatumoren overeenkomsten in het expressieprofiel tussen mens

en hond. Van sommige genen, onder andere p63 en SLIT2, is de functie nog niet volledig bekend en

is nader onderzoek nodig.

Het doel van deze literatuurstudie is tweeledig. Ten eerste werd gekeken of therapieën die

aangewend worden voor het behandelen van humane mammatumoren ook gebruikt zouden kunnen

worden bij caniene mammatumoren. Ten tweede werd gekeken of de aanwezigheid van een mutatie

in een gen, dan wel de aan- of afwezigheid van het proteïne waar dit gen voor codeert, kan dienen als

een marker met voorspellende waarde omtrent de ontwikkeling van mammatumoren .

Key words: cancer, dog, human, mammary tumors, tumor suppressor genes

2

1. Inleiding

Mammatumoren zijn bij honden, net zoals bij de mens, de meest voorkomende tumoren. De

ontwikkeling van caniene mammatumoren is vaak hormoonafhankelijk1,2. Dit blijkt onder andere uit het

feit dat het risico voor de ontwikkeling van zowel benigne als maligne mammatumoren stijgt met 26%

bij honden die gesteriliseerd worden na hun 2e loopsheid, dit in vergelijking met honden die

gesteriliseerd worden voor hun 1e loopsheid3. Niet-gesteriliseerde vrouwelijke honden van middelbare

leeftijd hebben een grotere kans op de ontwikkeling van mammatumoren4. Langdurige synthetische

progestageen toediening als oestruspreventie leidt tot proliferatie van de epitheelcellen van de

melkklier. Potentieel kan deze proliferatie van de epitheelcellen leiden tot genetische afwijkingen,

bijvoorbeeld in tumor suppressor genen, wat mogelijks kan leiden tot het ontstaan van zowel benigne

als maligne mammatumoren. Ook mannelijke honden kunnen mammatumoren ontwikkelen: ongeveer

1% van de mammatumoren komt voor bij mannelijke honden. Mammatumoren bij de mannelijke hond

worden vaak geassocieerd met hormonale abnormaliteiten zoals oestrogeen secreterende Sertoli cel

tumoren4.

De verschillende soorten mammatumoren manifesteren zich klinisch als één of meerdere nodules in

het melkklierweefsel2,4. De tumoren kunnen geassocieerd zijn met de tepel, maar meestal is de tumor

geassocieerd met het klierweefsel. De hond heeft 5 paar melkklieren en in ongeveer 70% van de

gevallen zijn het de caudale melkklieren die tumoraal ontaarden. Een mogelijke verklaring is dat dit

verband houdt met de omvang van de melkklieren: de caudale melkklieren zijn bij de hond groter dan

de craniale melkklieren2. Ongeveer 50% van de mammatumoren zijn maligne en ongeveer 50%

daarvan vormen metastasen. Tumoraal weefsel kan zowel benigne als maligne cellen bevatten4. Een

onderscheid maken tussen benigne en maligne tumoren is niet eenvoudig maar in het algemeen zijn

benigne tumoren kleiner, goed omschreven en voelen bij palpatie vaster aan dan maligne tumoren.

Klinische tekenen van maligne tumoren zijn de snelle groei, de fixatie aan huid of onderliggende

weefsels en ulceratie of inflammatie2. De helft van de maligne tumoren zullen al gemetastaseerd zijn

voordat deze tumoren gediagnosticeerd worden3. Carcinomen kunnen metastaseren naar de inguinale

lymfeknopen van waaruit ze verder kunnen metastaseren naar de interne iliacale lymfeknopen. Op

deze plaats kunnen ze druk en compressie uitoefenen op het colon. Carcinomen kunnen daarnaast

ook metastaseren naar de longen, de lever, de nier en minder frequent naar de beenderen2.

Onder normale omstandigheden zijn er twee soorten genen die de celgroei en de celdifferentiatie

reguleren, namelijk de proto-oncogenen en de tumor suppressor genen. In het geval dat er sprake is

van een stimulerende werking op de celcyclus, spreekt men van proto-oncogenen. Wanneer er sprake

is van een inhiberende werking op de celcyclus, spreekt men van tumor suppressor genen. De

vorming van tumoren (tumorigenese) kan veroorzaakt worden door een mutatie in een proto-oncogen

waardoor er een oncogen gevormd wordt. Dit oncogen gaat de celcyclus meer stimuleren. Een andere

oorzaak van tumorvorming is een mutatie in een tumor suppressor gen, met als gevolg een verlies

van het inhiberende effect op de celcyclus. Mutaties in proto-oncogenen gedragen zich anders dan

mutaties in de tumor suppressor genen. Mutaties in een (proto-)oncogen zijn meestal dominant over

het wild-type gen en zorgen daarom voor activatie van het oncogen. Mutaties in tumor suppressor

3

genen zijn meestal recessief waardoor een mutatie in het allel geen effect heeft zolang er nog een

wild-type allel aanwezig is5.

Er wordt veel onderzoek verricht naar het ontstaan, de erfelijkheid en de mogelijke therapieën van

humane mammatumoren. Hierbij komt de rol van tumor suppressor genen en hun proteïnen in de

tumorigenese duidelijk naar voor. Steeds vaker wordt dit gezien als een aangrijpingspunt voor nieuwe

therapieën bij mammatumoren. Door een literatuurstudie naar de verschillende tumor suppressor

genen en de tumor suppressor proteïnen in humane en caniene mammatumoren zou het mogelijk

moeten zijn om na te gaan of deze therapieën, toegepast bij humane mammatumoren, ook

toepasbaar kunnen zijn bij caniene mammatumoren. In de discussie zal hier verder op in worden

gegaan. Daarnaast zal in de discussie ook nog aandacht besteed worden of de tumor suppressor

genen als prognostische markers gebruikt kunnen worden.

2. Het tumor suppressor gen p21

2.1. Situering en functiebeschrijving

De cycline-afhankelijke kinase inhibitor p21, ook bekend als cycline-afhankelijke kinase inhibitor 1

(CDKIN1A), is een nucleair proteïne dat een rol speelt in de regulatie van de celcyclus, het DNA

herstel, celdifferentiatie en apoptose (geprogrammeerde celdood). Het p21 proteïne kan

bovenstaande rollen vervullen na transport naar de kern waarna het interageert met het cyclinA-

cycline afhankelijke kinase 2 (CDK2) en het cyclinD-CDK4 complex (enzymen die de celcyclus

reguleren door activatie of deactivatie van andere proteïnen)6,7,8,9. Via deze interactie inhibeert het p21

de functie van bovenstaande cycline-afhankelijke kinase complexen, waardoor cellen de G1-fase niet

meer verlaten en de groei van normale cellen beheerst wordt8,10,11.

Het p21 werd eerst beschreven als een cycline kinase inhibitor maar recent is ook waargenomen dat

p21 een rol speelt in de celcyclusvoortgang en dat p21 de cel tegen apoptose beschermd. Door Dong

et al. wordt opgemerkt dat het mechanisme van deze dubbele functie van p21 onduidelijk blijft. Er

wordt aangegeven dat dit wellicht te maken heeft met de lokalisatie van p21 in de cel. Als p21 zich in

de kern bevindt heeft het een functie als tumor suppressor door de inhiberende effecten op het cycline

kinase. Als het p21 zich voornamelijk in het cytosol bevindt dan speelt het een rol in de celcyclus

voortgang en beschermt het de cel ook tegen apoptose. Ook wordt beschreven dat er een negatieve

correlatie gevonden is tussen de lokalisatie van p21 in het cytosol en de prognose van

mammatumoren12.

2.2. Expressieprofiel van p21 in humane mammatumoren

In het algemeen wordt een onderverdeling gemaakt tussen p53-afhankelijke en p53-onafhankelijke

expressie van p21. Bij p53-afhankelijke expressie wordt de expressie van p21 hoofdzakelijk

geïnduceerd door het tumor suppressor proteïne p53 als respons op stress stimuli zoals DNA

beschadiging6,10,11. Bij p53-onafhankelijke expressie wordt de expressie van p21 geïnduceerd door

andere tumor suppressor proteïnen, zoals het genproduct van het retinoblastoma-gen (RB) of van het

4

Fig. 1: Expressie niveau van p21 in melkklier adenomen, adenocarcinomen en metastasen in vergelijking

met niet-tumoraal melkklierweefsel van dezelfde hond. (naar Klopfleish et al., 2009)

breast cancer susceptibility 1 gen (BRCA1)6,8,9,13,14. Bij mammatumoren is tot nu toe geen directe

relatie aangetoond tussen p21 en p536. Toch lijkt een directe betrokkenheid tussen p21 en p53 op z’n

minst belangrijk bij een deel van de humane mammacarcinomen waarbij een gemuteerd p53 of een

abnormaal expressieprofiel van p53 geassocieerd kon worden met een verminderde expressie van

p216,10. Alhoewel p21 als een tumor suppressor gen wordt beschouwd, wordt bij humane

borstkankerpatiënten zowel een verminderde expressie als een overexpressie van p21 geassocieerd

met een kortere levensverwachting van de patiënt6,15,16.

2.3. Expressieprofiel van p21 in caniene mammatumoren

Uit onderzoek blijkt dat bij honden een significant verschil in p21 expressie bestaat tussen normale en

tumoraal ontaarde cellen. Bij maligne tumoren is in alle gevallen sprake van een verhoogde expressie

(overexpressie) van het p21, maar ook bij 40% van de benigne tumoren wordt een verhoogde

expressie van het p21 waargenomen (figuur 1). Omdat een verhoogde expressie van het p21 gen

zowel in maligne als benigne tumoren voorkomt is het daarom niet mogelijk om op basis van een

verhoogde p21 expressie adequaat een klinisch onderscheid tussen benigne en maligne tumoren te

maken6. Uit hetzelfde onderzoek blijkt dat p53-onafhankelijke overexpressie van p21 voorkomt in

primaire adenocarcinomen en dat een verhoogde p53-onafhankelijke expressie minder vaak voorkomt

bij metastasen in de lymfeknopen (figuur 1) 6.

Bij de hond is over p53-afhankelijke expressie van p21 nog niets beschreven in de literatuur. De hoge

p21 mRNA levels in adenocarcinomen suggereren dat p21 vermoedelijk betrokken is bij de vorming

van maligniteiten uit caniene melkklierepitheel. Het p21 is een inhibitor van de celproliferatie en

overexpressie in caniene primaire tumoren wordt gezien als een beschermingsmechanisme bij de

proliferatie van tumorcellen. Echter een verhoogde expressie van p21 alleen verhindert niet het

metastaseren naar de regionale lymfeknopen. Eén van de verklaringen hiervoor is dat p21 zijn functie

5

heeft verloren door een missense mutatie6. Bij de mens is tot op heden nog niet aangetoond dat zo

een missense mutatie aan de basis zou liggen van de p21 overexpressie17. Een andere verklaring zou

kunnen zijn dat accumulatie van extranucleair p21 kan leiden tot een oncogene werking van het

proteïne6,18.



Het tumor suppressor gen p27 is een cycline-afhankelijke kinase remmer en is net zoals p21 een

belangrijke regulator van de celcyclus. Het p27 voert zijn functie uit tijdens de celcyclus in de G0-fase

en in het begin van de G1-fase, met als gevolg dat het E-type cycline/cdk2 complex van de G1-fase

geïnhibeerd wordt. Vermindering van p27 expressie kan worden veroorzaakt door signalen die de

celdeling stimuleren. Daarentegen verhoogt de expressie van p27 in respons op differentiatie

signalen, verlies van adhesie aan de extracellulaire matrix en door signalen van extracellulaire anti-

proliferatieve factoren zoals transforming growth factor ß (TGF-ß)6,19. Verlies van functie door een

mutatie in p27 leidt tot ongecontroleerde celcyclus voortgang en celproliferatie6. Alhoewel het verlies

van één p27 allel niet ongewoon is in humane maligne tumoren, is het zeldzaam dat er een mutatie

optreedt in beide allelen. Een verlies of verminderde vorming van het p27 proteïne wordt daarentegen

veel gezien in diverse humane tumoren19.

Studies suggereren dat in verschillende weefsels, zoals melkklierweefsel, tijdens de vroege

tumorigenese moleculaire processen voorkomen die p27 gaan dereguleren en vooraf kunnen gaan

aan tumor invasie19.


In 60% van de humane mammacarcinomen blijkt een verminderde expressie van p27 aanwezig te

zijn6,19. Uit onderzoeksresultaten van Fredersdorf et al. komt naar voor dat er een omgekeerde

correlatie bestaat tussen de expressie van nucleair p27 en de mate van maligniteit. De hoogste p27

expressie wordt waargenomen in tumoren met de laagste maligniteit. Afwezigheid van p27 expressie

wordt voornamelijk gezien bij mammatumoren met de hoogste maligniteit. Door de omgekeerde

correlatie tussen de expressie van p27 en de graad van maligniteit, waargenomen in humane

mammatumoren, zou p27 expressie als een prognostische marker gebruikt kunnen worden6,20,21. In

verschillende humane tumoren zijn mutaties van het p27 gen onderzocht. Gebleken is dat deleties en

mutaties in het p27 gen in humane mammatumoren zelden voorkomen. Het is mogelijk dat de

expressie van het p27 gen in tumorcellen onvoldoende is, waardoor de groei-inhiberende activiteit van

het p27 proteïne niet tot uiting komt. Recente studies hebben aangetoond dat p27 expressie vaak

gereguleerd wordt op posttranscriptioneel niveau door proteïne translocatie en degradatie20. In

sommige sterk geprolifereerde humane mammatumorcellen wordt een hoge expressie van p27

waargenomen. Dit wijst bij sommige groeiende tumoren op het bestaan van een tolerantie

mechanisme voor deze inhibitor van de celcyclus20. Een recente studie over de ontwikkeling van

6

Fig. 2: Expressie niveau van p27 in melkklier adenomen, adenocarcinomen en metastasen in vergelijking

met niet-tumoraal melkklierweefsel van dezelfde hond. (naar Klopfleish et al., 2009)

borstkanker bij vrouwen legt een verband tussen mutaties die voorkomen in de genen BRCA1 of

BRCA2 van geslachtscellen (kiemcellijnmutaties) en een verminderde expressie van het p27 gen.

Daarnaast zijn mutaties in één van de BRCA genen (zie verder pagina 15-19) en in het p27 gen elk

onafhankelijk geassocieerd met een verhoogde kans op mammatumor recidieven19.


Uit het onderzoek van Klopfleish et al. bij honden, blijkt dat er tussen normale en tumoraal ontaarde

cellen een significant en consistent verschil in expressie wordt gevonden van het celcyclus

regulerende proteïne p27. In 90% van de caniene maligne tumoren was de expressie van p27

significant verminderd. Daarnaast werd in 80% van de gevallen waarbij er lymfeknoop metastasen

aanwezig waren, een significant verminderde expressie van p27 gevonden. Daarnaast blijkt echter

ook dat in 40% van de benigne tumoren de expressie van p27 verminderd is (figuur 2), waardoor het

niet mogelijk is om p27 als een prognostische marker te zien voor toekomstige metastasen van

caniene mammatumoren. De verminderde expressie van p27 geeft wel aan dat p27 een rol heeft in

verhoogde celdeling en maligne tumorvorming6. De oorzaak van de verminderde expressie van p27 is

onduidelijk, maar kan veroorzaakt worden door een gereduceerde expressie van TGF-ß 6,22 of door

een mutatie in het p27 gen6. In beide gevallen zal dit leiden tot een verminderde controle van de

celcyclus en tot ongecontroleerde celdeling met als het gevolg tumorvorming (tumorigenese)6.



Het tumor suppressor gen p53 speelt een belangrijke rol in de tumorigenese van verschillende

organen door de regulatie van celproliferatie, genstabiliteit en apoptose 23. Daarnaast zou p53 indirect

het metastaseren van tumoren inhiberen door het blokkeren van de angiogenese (het aantrekken van

7

vasculaire endotheelcellen om nieuwe bloedvaten te vormen in de tumormassa)11. Door mutaties in

het p53 gen kunnen er meer cytogenetische afwijkingen ontstaan met tumorvorming als gevolg24.

Cellen met een verlies of een verminderde expressie van het p53 gen hebben een verhoogde

proliferatie snelheid, een hogere genetische instabiliteit en ze verliezen hun G1/S-checkpoint in de

celcyclus. Daarnaast worden de cellen ook ongevoelig voor apoptose. Wanneer p53 zijn functie niet

meer kan uitoefenen resulteert dit in een agressievere tumorigenese en een minder goede prognose

voor patiënten met borstkanker. Deze prognose is onafhankelijk van de tumorgradatie11.

De hoeveelheid van het p53 proteïne wordt in normale cellen op een laag niveau gehouden door

murine double minute 2 (MDM2)-gemedieerde proteolyse. MDM2 wordt actief na binding met proteine

kinase B (PKB (= AKT)) waarna MDM2 gefosforyleerd kan worden op een serine deel van het

proteïne. Dit zorgt voor MDM2-gemedieerde p53 afbraak. De suggestie bestaat dat een interactie van

PTEN met het C-terminaal negatieve regulatie domein van p53 een conformatie wijziging van het p53

molecule veroorzaakt. Hierdoor kan geen binding tussen MDM2 en p53 optreden. Dit moet echter nog

worden aangetoond via verder onderzoek25.


Afwijkingen in het p53 gen behoren tot de meest voorkomende genetische afwijkingen in humane

tumoren26,27. In ongeveer 25% van de humane borstkanker patiënten is een mutatie in het p53 gen

waargenomen24,27. Inactivatie van het p53 gen door mutaties wordt vaker aangetroffen in

vergevorderde vormen van mammatumoren dan in recent ontwikkelde mammatumoren. De inactivatie

van p53 bedraagt tussen de 0% en 40% bij niet-invasieve borstkanker en tussen de 20% en 50% bij

invasieve mammatumoren. Inactivatie van het p53 resulteert in een verhoogde proliferatie, resistentie

tegen apoptose en een verhoogde kans op metastasering door angiogenese11. Omdat inactivatie van

p53 meer wordt waargenomen in vergevorderde vormen van mammatumoren wordt deze inactivatie

van p53 geassocieerd met een slechte prognose en een verkorting van de levensverwachting van de

patiënt11,24.

In het p53 gen zijn er vier tot vijf geconserveerde domeinen (hot spots) in de exons 5 tot 8 die

ogenschijnlijk een belangrijke rol spelen in de tumorigenese van melkklierweefsel. Dit is zowel bij de

mens als bij de hond aangetroffen23,27.

Het is aangetoond dat puntmutaties, deletie of insertie binnen het p53 gen direct bijdragen aan tumor

ontwikkeling in meer dan de helft van alle humane kankers24. In verschillende humane tumoren, onder

andere mammatumoren, is een puntmutatie in één p53 allel geassocieerd met een volledig functie

verlies van het andere p53 allel28. Naast bovenstaande oorzaken van inactivatie kan de activiteit van

p53 ook geïnhibeerd worden doordat sommige virale oncoproteïnen een binding aangaan met p53

waardoor de interactie van p53 met andere cellulaire proteïnen voorkomen wordt29.

8

Tabel 1. Mutaties in de exons 5-8 van p53 in caniene mammatumoren: benigne tumoren

(n=38) en carcinomen (n=25) (uit Muto et al., 2000). Adc = adenocarcinomen; Ad =

adenomen; † komt overeen met humane p53; ‡ CD: geconserveerde humane domeinen


Recent zijn soortgelijke p53 mutaties ook geïdentificeerd in primaire mammatumoren bij honden. De

bij honden waargenomen frequentie van mutaties in p53 (30%) komt ongeveer overeen met wat wordt

waargenomen bij humane borstkanker patienten24. Uit onderzoeksresultaten blijkt dat deze

afwijkingen in het p53 gen een belangrijke rol spelen in het ontstaan van mammatumoren bij

honden23,27. Het is mogelijk dat de veranderingen in het p53 gen al in een vroeg stadium van de

caniene melkklier tumorigenese kunnen optreden23.

In een studie werden veranderingen gevonden in de exons 5 tot 8 van het p53 gen bij zowel benigne

als maligne caniene mammatumoren. Hoewel er meer mutaties voorkomen in mammacarcinomen

dan in benigne mammatumoren is dit verschil niet significant23.

In een melkklieradenocarcinoma van de hond werd in het p53 gen een missense mutatie CGC

CAC (arginine histidine) gevonden in codon 162 van exon 5. Deze mutatie is vermoedelijk

belangrijk omdat deze zich bevindt op een bekende hot spot die vaak getroffen wordt bij humane

kanker. Daarnaast zijn in primaire caniene mammatumoren nog meerdere voorbeelden van missense

mutaties aangetoond in bij de mens bekend hot spots23,26. (Tabel 1)

Naast bovenstaande missense mutaties werd er in een caniene melkklieradenoom ook een stille

mutatie gevonden in codon 103 (serine) van exon 4. Volgens Mayr et al. lijkt deze mutatie geen rol te

spelen in de tumorontwikkeling omdat het een stille mutatie betreft26.

Een mutatie in exon 2 en 5 en een kiemcellijn deletie in exon 3 tot 7 van het p53 gen is reeds in

verband gebracht met caniene mammatumoren. Een soortgelijk polymorfisme is ook gevonden in

exon 4 en deze speelt wellicht een rol in de ontwikkeling van humane borstkanker. Het is echter nog

onduidelijk of p53 polymorfismen zowel bij honden als bij mensen een rol spelen tijdens

tumorigenese24.

9

Fig. 3: PTEN cascade (uit Planchon et al., 2008)

Uit onderzoek komt naar voren dat zowel spontane als erfelijke veranderingen in het p53 gen

geassocieerd worden met caniene mammatumoren. De ontdekking van kiemcellijn p53 mutaties in

caniene tumoren suggereert dat p53 inactivatie een belangrijke rol speelt in de raspredispositie van

tumoren24,28. Mammatumoren bij vrouwelijk honden komen frequenter voor bij onder andere Pointers,

Poedels en Boston terriers in vergelijking met andere rassen30. Daarnaast hebben verschillende

studies aangetoond dat het caniene p53 gen gemuteerd is in tumorcellen van patiënten met spontane

tumorigenese zoals in mammatumoren24.

Door de overeenkomsten van p53 inactivatie in tumoren bij mensen en honden is het mogelijk dat

door verder onderzoek naar de moleculaire etiologie van caniene tumoren, de precieze rol van p53 in

de tumorvorming bij de mens verduidelijkt kan worden24.

5. Het tumor suppressor gen PTEN


Phosphatase and tensin homolog (PTEN) behoort tot de groep van tumor suppressor genen31,32. Dit

gen is betrokken bij verschillende beschermingsmechanismen tegen tumorvorming en progressie van

de tumor31. De functie van het PTEN is vooral afhankelijk van zijn lokalisatie in de cel en daarom

wordt er een onderscheid gemaakt tussen nucleair en cytoplasmatisch PTEN31,33. PTEN codeert voor

een proteïne van 403 aminozuren met een fosfatase activiteit34. Dit proteïne heeft meerdere

biologische functies. Ten eerste inhibeert PTEN, via zijn lipide fosfatase activiteit35, de fosforylatie van

phosphatidylinositol-2-fosfaat (PIP2) naar phosphatidylinositol-3-fosfaat (PIP3) in het cytoplasma,

zodat PTEN het phosphatidylinositol-3-kinase (PI3-K) antagoniseert. Hierdoor wordt de

signaaltransductie cascade onderbroken welke leidt tot celproliferatie31,33,35,36,37. Het verlies van de

werking van PTEN resulteert in accumulatie van PIP3 en een activatie van zijn effectoren in het

vervolg van de cascade zoals het proteïne kinase B (PKB (= AKT))25,33. AKT speelt een rol in het

verhoogde celmetabolisme, bij de celgroei, bij inhibitie van apoptose en bij invasie van cellen 25,38,39.

(Figuur 3)

10

Fig. 4: De functie van cytoplasmatisch en nucleair PTEN (uit Planchon et al., 2008)

Ten tweede draagt PTEN via zijn proteïne tyrosine fosfatase activiteit ook bij in de regulatie van

celadhesie, migratie, tumorcelinvasie, cytoskelet organisatie, mitogen-acitivated proteïne kinase

(MAPK) activiteit en bij de stabilisatie van de intercellulaire juncties31,33,35,39,40,41,42,43. Ten derde kan

worden vermeld dat PTEN een interactie aangaat met p53 waardoor de DNA binding en transcriptie

van dit proteïne wordt gestimuleerd25,31. Het aantal aanwezige p53 proteïnen is sterk gereduceerd in

cellen waar geen PTEN in zit (PTEN-/-), want PTEN stabiliseert p53 waardoor de halfwaardetijd wordt

verhoogd. PTEN en p53 zijn bij mensen frequent gemuteerd in erfelijke en spontane tumoren, maar

het tegelijk voorkomen van beide mutaties is zeldzaam25.

De functies van het PTEN proteïne wijzen op een belangrijke rol in de bescherming van cellen tegen

tumorvorming en de progressie van de tumor31,35.

De rol van nucleair PTEN is niet hetzelfde als de rol van cytoplasmatisch PTEN. Cytoplasmatisch

PTEN heeft een rol als negatieve regulator van de PI3K/AKT cascade. Nucleair PTEN speelt een

grote rol in de regulatie van cellulaire homeostase en stabiliteit. Het draagt onder andere bij in de

chromosoomstabiliteit, DNA reparatie en de inhibitie van de celcyclus31,33. Daarnaast is PTEN ook

nodig voor de activatie van het RAD51 gen wat leidt tot dubbele breuk reparatie van DNA (figuur 4).

Veranderingen in de verhouding van nucleair en cytoplasmatisch PTEN heeft een duidelijk effect op

de tumor suppressor functie van PTEN. Dit kan in het ergste geval leiden tot de ontwikkeling van

tumoren32,33. In normale weefsels is PTEN primair gelokaliseerd in de kern, terwijl in neoplastische

weefsels het cytoplasmatische PTEN overheerst31,33. Verder onderzoek is nodig voor de

verduidelijking van de rollen van nucleair en cytoplasmatisch PTEN in de regulatie van tumorigenese 31,33.

11

5.2. Expressieprofiel van PTEN in humane mammatumoren

Het is aangetoond dat een reductie of verlies van PTEN expressie aanwezig is in humane tumoren,

waaronder mammatumoren31,44. Gereduceerde PTEN expressie is bij mensen aangetoond in 38% van

de invasieve tumoren en in 11% van de lokale tumoren44. Aangenomen wordt dat een verminderde

expressie van PTEN geassocieerd is met grotere en kwaadaardige tumoren42.

Overerfbare mutaties in het PTEN gen zijn waargenomen bij humane patiënten met het Cowden

syndroom, een autosomaal dominante afwijking geassocieerd met meerdere mucocutane

hamartomas (hyperplastische lesies)25,31,34,37. Mensen met het Cowden syndroom hebben 25% tot

50% meer kans op borstkanker in vergelijking met mensen die het Cowden syndroom niet hebben 31,34,37. De rol van PTEN is echter nog onduidelijk bij sporadische mammatumoren.

Het PTEN gen is gelegen op chromosoomband 10q23. Verlies van heterozygositeit (Loss of

Heterozygosity - LOH) in 10q23 is geobserveerd in ongeveer 30-40% van de sporadische

mammatumoren33,34,37. LOH houdt in dat wanneer het gen een mutatie heeft in 1 allel door het verlies

van het andere allel van het gen, er een tumor kan ontstaan. LOH is een indicatie dat zo een gen

codereert voor een tumor suppressor gen. In een minderheid van humane mammacarcinomen zijn

mutaties gevonden in het PTEN gen ondanks de verhoogde aanwezigheid van LOH. Vermoedelijk

spelen andere mechanismen een rol in het verlies van heterozygositeit van PTEN gen waaronder

silencing van de PTEN promotor door hypermethylatie, verhoogde afbraak of haploinsufficientie (het

diploide organisme heeft maar 1 functionele kopie van het gen en deze is niet in staat om voldoende

proteïne aan te maken) 31,32,34,37,42,44. Deze recente ontdekkingen wijzen op een verscheidenheid van

genetische en epigenetische veranderingen die de oorzaak zouden kunnen zijn van PTEN verlies in

tumorigenese32.

Het is nog onduidelijk of het verlies van de PTEN gen expressie in een vroege of late fase van de

humane mammatumorigenese een rol speelt. Uit resultaten van verschillende onderzoeken blijkt dat

dit verlies pas in de late fase een rol speelt aangezien er een groter PTEN verlies werd waargenomen

in gemetastaseerde carcinomen dan in niet gemetastaseerde carcinomen31,44. PTEN verlies lijkt dus

vooral voor te komen in de vergevorderde vormen van tumoren en als gevolg hiervan kan gesteld

worden dat een mutatie van het PTEN gen vermoedelijk niet aan de basis ligt van het ontstaan van

tumoren43.

Een vermindering van PTEN expressie in humane mammacarcinomen wordt in verband gebracht met

tumorgraad, oestrogeen en progesteron receptor negatieve status, metastasen naar lymfeknopen en

een slechte prognose31,37. Wanneer in een tumor het PTEN gen inactief wordt zal een tumor

kwaadaardig worden39.

5.3. Expressieprofiel van PTEN in caniene mammatumoren

In caniene mammacarcinomen is een significant verband aangetoond tussen het verlies van PTEN

expressie en carcinoomvorming, metastasering naar lymfeknopen en organen, tumor differentiatie,

tumor recidieven en een kortere levensverwachting31.

12

Uit het onderzoek van Ressel et al. (Tabel 2) bleek dat alle benigne tumoren en 67% van de maligne

tumoren PTEN positief zijn. De expressie van PTEN is lager in maligne tumoren dan in benigne

tumoren. Daarnaast is aangetoond dat 33% van de maligne tumoren PTEN proteïne negatief zijn31.

Deze resultaten zijn vergelijkbaar met de percentages (30-50%) die gevonden worden bij humane

mammacarcinomen31,37,44. Uit onderzoek van Kanae et al. kan worden geconcludeerd dat een

vermindering van PTEN gen expressie, vergeleken met de expressie in normaal melkklierweefsel,

geassocieerd is met kwaadaardige mammatumoren bij honden35.

Aantal honden (%) Positief Negatief Adenoma 100 0 Carcinoma 67 33

In benigne mammatumoren is de hoeveelheid PTEN mRNA verhoogd. Bij maligne mammatumoren

wordt daarentegen een vermindering van de hoeveelheid PTEN mRNA geobserveerd. De reden voor

de verhoogde PTEN mRNA in benigne mammatumoren bij honden is nog onduidelijk. Het is mogelijk

dat de verhoging van de PTEN expressie een compensatie mechanisme is om de celproliferatie te

antagoniseren in weefsels met hyperplasie en benigne tumoren. Het PTEN proteïne zorgt namelijk

voor de remming van de celproliferatie. De verminderde expressie van PTEN waargenomen in

maligne mammatumoren van honden resulteert in een reductie van de negatieve invloed van PTEN

op de groei, migratie en invasie van tumorcellen35. De gereduceerde expressie van het PTEN gen bij

honden is net zoals bij de mens een gevolg van genetische of epigenetische mutaties zoals het verlies

van heterozygositeit, hypermethylatie en vermeerdering of verliezen van microsatellieten

(microsateliet instabiliteit)45. Op dit ogenblik is het echter nog niet bekend of de promotor sequentie

van het PTEN gen gehypermethyleerd is in maligne mammatumoren bij honden35.

De combinatie van het detecteren van PTEN en vascular endothelial growth factor (VEGF), een

stimulator van angiogenese, kan gebruikt worden om een inschatting te maken omtrent het

biologische gedrag en de prognose van caniene mammatumoren. Uit resultaten blijkt namelijk dat een

verhoogde expressie van het VEGF samen gaat met een verlaagde expressie van het PTEN45.

Verminderde expressie van PTEN is betrokken in de tumorigenese en een verhoging van de VEGF

expressie wordt vooral gezien tijdens de progressie van caniene mammatumoren.

Daarenboven kan het verlies van PTEN expressie een goed bruikbare prognostische marker zijn voor

caniene mammacarcinomen31,35.

Tabel 2. Immunohistologische expressie van PTEN in tumoraal melkklierweefsel

van honden. (naar Ressel et al., 2009)

13

Fig. 5: Gereduceerde SLIT expressie in humane tumoren is gecorreleerd met een stijging

van Cxcr4. (naar Marlow et al., 2008)

6. Het tumor suppressorgen SLIT2


De SLIT familie, bestaande uit 3 leden, bevat grote extracellulaire matrix (ECM) gesecreteerde en

membraangeassocieerde glycoproteïnen die hun functie uitvoeren na interactie met Robo1

(Roundabout)-receptor46,47,48,49. De nucleotide- en aminozuursequenties van caniene SLIT zijn

homoloog met die van mensen47. De leden van de SLIT gen familie worden allemaal tot expressie

gebracht in het zenuwstelsel maar SLIT2 wordt daarnaast ook tot expressie gebracht in andere

weefsels zoals long, borst, nier en hart48,49.

In het SLIT2 proteïne kunnen 2 fragmenten worden onderscheiden: het NH2 terminaal fragment en het

COOH terminaal fragment. Het NH2 fragment is langer en membraan-geassocieerd terwijl het COOH

fragment korter is en gesecreteerd wordt. De inhibitorische effecten worden veroorzaakt door het

COOH-terminaal fragment46.

Verlies van SLIT of van zijn Robo1 (Roundabout)-receptor in het melkklierepitheel leidt tot de

ontwikkeling van hyperplastische ongeorganiseerde lesies50. Aangetoond is dat SLIT2 de tumorgroei

in vivo onderdrukt door silencing van stromal-derived-factor-1/C-X-C chemokine receptor type 4

(Sdf1/Cxcr4) in melkklierepitheel49. Verlies van SLITs of hun Robo-receptoren resulteert in humane

mammatumoren via upregulatie van de sdf1 en Cxcr4 cascade, vooral in het melkklierepitheel. Het

blokkeren van de Cxcr4 expressie of functie door SLIT remt de groei van mammatumoren. Als SLITs

er voor zorgen dat er geen expressie meer is van Cxcr4 in normale melkklieren dan zal verlies van

SLITs in tumoren overeenkomen met gestegen Cxcr4 (figuur 5).

In 68% van de tumoren met verhoogde Cxcr4 expressie was de expressie van SLIT2 of SLIT3, in

vergelijking met de expressie in normaal melkklierweefsel, significant verminderd50.

14

In humane borstkankercellijnen verhindert SLIT de SDF1-geïnduceerde chemotaxis. Verlies van SLIT

expressie resulteert in activatie van SDF150.

De groei en metastasering van tumoren worden gereguleerd door angiocriene factoren die

gesecreteerd worden door het endotheel. SLIT2 is een tumor suppressieve angiocriene factor en

wordt negatief gereguleerd door de endotheliale EphA2- receptor (ephrin type A receptor 2). Het

blokkeren van de SLIT activiteit herstelt de angiocriene geïnduceerde tumorgroei en motiliteit terwijl

verhoogde SLIT2 de groei en motiliteit verminderd51. EphA2 onderdrukt de SLIT2 gen expressie in het

endotheel waardoor de angiocriene gemedieerde tumorgroei en metastasering, door het blokkeren

van tumorsuppressieve signalen, wordt vergemakkelijkt51.

6.2. Expressieprofiel van SLIT2 in humane mammatumoren

De expressie van genen die coderen voor SLITs en hun Robo-receptoren zijn vaak onderdrukt in

humane tumortypes, waaronder mammatumoren50. Aangetoond is dat SLIT2 frequent geïnactiveerd is

in mammatumoren door hypermethylatie van de cytosine-guanine dinucleotide rijke plaats (CpG

eilanden) in de promotorregio en door verlies van heterozygositeit46,49,50. Dit suggereert een rol voor

deze signaalweg als suppressor van de tumorigenese50.

Ongeveer 63% van de mammatumoren vertonen LOH. In humane mammatumoren zijn geen

somatische mutaties van SLIT2 waargenomen maar epigenetische inactivatie kwam vaak voor46,50.

Hypermethylatie van CpG eilanden in de promotorregio van tumor suppressor genen is een

epigenetisch mechanisme dat leidt tot inactivatie van deze genen via onderdrukking van de

transcriptie46,49. DNA methylatie is een enzym-geïnduceerd chemische modificatie die voorkomt in de

CpG eilanden van de genpromotor. Mammatumoren in situ en invasieve mammatumoren vertonen

een verhoogde mate van SLIT2 promotor hypermethylatie in vergelijking met melkklieren zonder

pathologie. Er was geen significant verschil aantoonbaar tussen de frequentie van hypermethylatie

van SLIT2 tussen mammatumoren in situ en invasieve mammatumoren49.

Naast hypermethylatie zorgen ook andere mechanismen voor de silencing van SLIT2 aangezien er

ook mammatumoren gevonden zijn die ook zonder hypermethylatie toch geen SLIT2 expressie

hebben49.

6.3. Expressieprofiel van SLIT2 in caniene mammatumoren

Het caniene SLIT2 gen vertoont een grote gelijkenis met die van de mens. De expressie van de

verschillende SLIT mRNAs in normale caniene melkklieren en mammatumoren is onderzocht door

Tanno et al. via reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Uit dit onderzoek bleek dat

in normale melkklieren SLIT mRNAs op een laag niveau tot expressie gebracht worden terwijl de

meeste maligne tumoren een verhoogde SLIT2 mRNA expressie vertonen47. Tussen benigne en

maligne tumoren van de melkklieren werd geen significant verschil in expressie waargenomen. Maar

in vergelijking met normaal melkklierweefsel vertoonden de benigne en maligne mammatumoren een

gestegen expressie van SLIT2. Daarnaast is de expressie van SLIT2 significant gereduceerd in

caniene metastasen vanuit de melkklieren in vergelijking met goedaardige primaire adenomas52.

15

SLIT2 kan daardoor aanzien worden als een potentiële marker voor de diagnose van maligne

tumoren. Een relatief verhoogde expressie van het SLIT2 gen toont aan dat het gen mogelijk niet

beïnvloed wordt door epigenetische inactivatie en kan een belangrijke rol spelen in het ontwikkelen

van caniene mammatumoren. Het is mogelijk dat SLIT2 in maligne mammatumoren de angiogenese

stimuleert47.

De rol van SLIT2 in tumor progressie versus tumor suppressie is nog dubieus. Sommige onderzoeken

ondersteunen zowel de remmende als bevorderende functie van SLIT2 voor de tumorgroei en

metastasering in mammatumoren.

SLIT2 vertoont een tumor suppressor activiteit en is geïnactiveerd in verschillende tumoren zoals

mammatumoren. Anderzijds leveren andere studies het bewijs dat SLIT2 het metastaseren vanuit de

tumor naar de lymfeknopen zou bevorderen. Daarnaast is aangetoond dat de interactie tussen

maligne cellen en tumor-geassocieerde bloedvaten cruciaal is voor tumorale celgroei, overleving en

metastasering van de tumorale cellen51.

7. Het tumor suppressor gen Breast Cancer Susceptibility Gene 1 (BRCA1)


BRCA1 is een groot gen dat bestaat uit 24 exons welke coderen voor 1863 aminozuren. De expressie

van BRCA1 is weefselafhankelijk en komt het meest voor in de testis en de thymus. BRCA1 wordt

echter ook tot expressie gebracht in melklier- en ovariumweefsel. De rol van BRCA1 als tumor

suppressor gen is nog niet volledig omschreven. BRCA1 speelt vermoedelijk een rol bij de transcriptie

regulatie, de controle van de celcyclus, bij de handhaving van de genetische stabiliteit en bij het DNA

herstel van oxidatieve DNA beschadiging gedurende de celcyclus53,54,55.

Recente analyses van alternatieve splicing toonden aan dat mogelijk 70% van de humane genen

isovormen hebben. Alternatieve splicing is een proces dat in eukaryoten wordt aangewend om de

genexpressie te reguleren en een functionele diversiteit van proteïnen te krijgen. Door alternatieve

splicing van mRNA ontstaan vele genproducten met verschillende functies uit één coderende

sequentie. Alternatieve splicing speelt vermoedelijk een belangrijke rol in tumorigenese door

inactivatie van de tumor suppressor, door gain-of-function of door proteïnen die tumorontwikkeling

promoten. Door Miao Lixia et al. zijn negen isovormen van BRCA1 aangetoond. Alle negen isovormen

van BRCA1 hadden een deletie van exon 11b door het mechanisme van 5’ alternatieve splicing. Exon

11 is het langste exon (3456 nucleotiden) van de 24 exons van BRCA1. Daarnaast zijn andere

plaatsen van alternatieve splicing gelokaliseerd in exon 2, 3, 9 en 10. De isovormen hebben de

mogelijkheid voor een functioneel proteïne te coderen wanneer de originele reading frame (ORF)

behouden blijft bij de alternatieve splicing56.

Verder onderzoek naar de mRNA varianten van BRCA1 en hun functies zou belangrijk kunnen zijn om

de ontwikkeling van mammatumoren beter te begrijpen56.

16

Fig. 6: De vermoedelijke structuren van het volledige BRCA1 cDNA (A) en

van de isovorm BRCA1 delta11b (B). (naar Sugiura et al., 2007)

7.2. Expressieprofiel van BRCA1 in humane mammatumoren

Humaan BRCA1 is een “familiaal borstkanker gevoeligheidsgen” 53 en is geassocieerd met de

progressie van humane mammatumoren54. De meerderheid van BRCA1 mutaties veroorzaken

afwijkingen in het proteïne door indel-mutaties (dit zijn mutaties waarbij 1 of meer nucleotiden worden

ingevoegd of juist verloren gaan) en door nonsense mutaties (dit zijn mutaties waarbij het nieuwe

codon een stopcodon wordt met als gevolg dat het proteïne ingekort wordt)57. Verscheidene BRCA1

splicing varianten, ook wel isovormen genoemd, zijn aangetoond in verschillende humane weefsels

met opvallende verschillen in expressie patronen. Verminderde BRCA1 mRNA en proteïne expressie

is aangetoond in sporadische mammatumoren. In veel normale cellen is een hoge expressie van

volledig BRCA1 en delta11b aanwezig. In de humane BRCA1 isovorm delta11b ontbreekt een groot

deel van exon 11. Vermoedelijk spelen deze isovormen een rol in normaal melkklierweefsel.

Kiemcellijn veranderingen van het BRCA1 gen zijn verantwoordelijk voor 5-10% van de humane

erfelijke vormen van mammatumoren57. Een groot aantal verschillende kiemcellijn mutaties zijn

geïdentificeerd waarvan de meerderheid aanleiding geven tot een vroegtijdig stopcodon in het

transcript53. In sporadische mammatumoren, daarentegen, is geen bewijs gevonden van BRCA1

mutaties. Echter, de reductie van BRCA1 mRNA en de verhoogde methylatie van de BRCA1 promotor

regio in vergelijking met normale melkklieren, suggereert een potentiele rol voor BRCA1 in

sporadische mammatumoren53.

7.3. Expressieprofiel van BRCA1 in caniene mammatumoren

Over de rol van BRCA1 in caniene mammatumoren is nog weinig beschreven.Uit onderzoek van

Sugiura et al. kwam naar voor dat de isovorm delta11b voorkomt in alle normale melkklieren en dat de

nucleotide sequentie ongeveer gelijk is aan de gelijknamige isovorm splicing variant die gevonden is

bij de mens. Het aantal exon11-missende producten, waaronder delta11b, is gedaald in de meeste

tumoren. De resultaten tonen aan dat veranderingen in de expressie van isovormen kunnen optreden

in tenminste een deel van de caniene mammatumoren53.

17

Fig. 7: De expressie van normaal en gemuteerd BRCA1 in normale en

tumorale cellen. (naar Kim et al., 2010)

Bij honden zijn normale BRCA1 proteïnen aanwezig in normaal melkklierepitheel maar deze zijn

zeldzaam in maligne tumoren en metastasen. Gemuteerde BRCA1 proteïnen, welke een hogere

moleculaire massa hebben, werden niet aangetoond in normaal melkklierweefsel en zijn bijna niet

aanwezig in benigne tumoren. Deze gemuteerde BRCA1 proteïnen komen echter in grote

hoeveelheden voor in maligne tumoren (figuur 7)54.

8. Het tumor suppressor gen Breast Cancer Susceptibility Gene 2 (BRCA2)


Het BRCA2 proteïne is een tumor suppressor en zijn functie wordt geassocieerd aan een interactie

met het RAD51 proteïne58,59. Het BRCA2 proteïne activeert het RAD51 tot het uitvoeren van DNA

recombinatie en herstel van dubbelstrengs DNA breuken. Door deze interactie speelt het BRCA2

proteïne een belangrijke rol in het behoud van de genomische stabiliteit. Algemeen wordt

aangenomen dat de genomische instabiliteit waargenomen bij BRCA2-deficiënte cellen te wijten is

aan het feit dat het proteïne zijn functie als tumor suppressor niet kan uitvoeren59.

Inactivatie van het BRCA2 kan gebeuren door verlies van heterozygositeit (Loss of Heterozygosity -

LOH) en is daardoor betrokken bij de ontwikkeling van mammatumoren59.

Het humane BRCA2 gen bestaat uit 27 exons die coderen voor een 11-12 kb transcript. De volledige

lengte van het humane BRCA2 cDNA codeert voor een protein bestaande uit 3418 aminozuren58,59.

Het caniene BRCA2 is 11 kb lang, codeert voor 3471 aminozuren en is dus 53 aminozuren langer dan

het humane BRCA2. Op het niveau van nucleotiden is de homologie tussen caniene en humane

BRCA2 DNA 76% en op het niveau van aminozuren sequentie 68%58,60.

Ondanks de lage overeenkomst tussen caniene en humane BRCA2 zijn er toch sterk gelijkende

regio’s gevonden onder andere in exon 11 en exon 2758. Exon 11 is het grootse exon van het BRCA2

gen en bevat de regio die codeert voor 8 ‘repeats’ van het BRC domein60. BRCA2 gaat een interactie

aan met RAD51 via BRC repeats in de centrale regio van exon1160,61. Weinig is bekend over de rol

van exon 11 van het BRCA2 gen in caniene mammatumoren, maar bij honden zijn in exon 11 wel

18

nucleaire polymorfismen gevonden die kunnen resulteren in substitutie van aminozuren58,60.

Vergeleken met de sequenties bij normale melkklieren zijn in het exon 11 van BRCA2 in

mammatumoren een totaal van 19 types genetische afwijkingen geïdentificeerd waaronder missense

mutaties (68%) en stille mutaties (32%). Van deze 19 mutaties zijn 2 mutaties aanwezig in de regio

van een BRC repeat domein, de andere mutaties vallen buiten deze BRC repeat domeinen60.

Exon 27 is gelokaliseerd aan het einde van het BRCA2 gen. Dit exon bevat sequenties die coderen

voor de C-terminus en het 3’-UTR van het BRCA259. In de sterk geconserveerde domeinen van de C-

terminus bevinden zich onder andere het RAD51 interactie domein en de nucleaire lokalisatie signalen

(NLSs)58. De NLSs in de C-terminus zijn erg belangrijk voor de nucleaire lokalisatie van het humane

BRCA2. Deletie van de C-terminale NLSs voorkomt de verplaatsing van BRCA2 naar de kern met als

gevolg het niet functioneren van het BRCA2 proteïne. Dit zou gedeeltelijk ook gelden voor het caniene

BRCA2. Het is dus mogelijk dat de mate van BRCA2 verplaatsing naar de kern, geassocieerd kan

worden met mammatumor morbiditeit bij honden59.

Een ander belangrijke rol van de BRCA2 C-terminus is de interactie met het RAD51 recombinase.

Esashi et al. rapporteerde deze interactie bij mensen en recent is deze interactie ook aangetoond bij

honden59. Verlies van RAD51 activiteit door mutaties, onder andere door missense mutaties, kan

leiden tot ongecontroleerde celgroei en tumorvorming60. Missense variaties kunnen namelijk een

invloed hebben op de interactie tussen BRCA2 en RAD51 maar verder onderzoek is hierover echter

nog nodig59.

8.2. Expressieprofiel van BRCA2 in humane mammatumoren

In het geval van humane mammatumoren is ongeveer 1 op de 10 gevallen erfelijk en zijn mutaties in

BRCA2 voor 30% erfelijk. Bij de mens is LOH gevonden in zowel erfelijke als niet-erfelijke vormen van

mammatumoren. Verondersteld wordt dat LOH een mechanisme is voor het ontstaan van tumoren bij

patiënten die een erfelijke mutatie hebben in het BRCA2. Voor het detecteren van LOH bestaat er een

makkelijke en snelle PCR methode en het analyseren van LOH is een methode om de relatie tussen

de pathogenese van mammatumoren en BRCA2 mutaties verder op te helderen59.

Kiemcellijn mutaties in het BRCA2 gen zijn significante risico-indicatoren voor mammatumoren bij

vrouwen, vooral van erfelijke mammatumoren. Bij mensen leidt inactivatie van BRCA2 door LOH tot

een verhoogd risico op de ontwikkeling van mammatumoren (56-68%). Somatische mutaties

(verworven mutaties in somatische cellen die niet kunnen worden doorgegeven aan de volgende

generatie) van BRCA2 kunnen geassocieerd zijn met agressieve lymfeknoopmetastasen en spelen

een belangrijke rol in de pathogenese van mammatumoren60.

BRCA1 en BRCA2 genen behoren tot dezelfde genenfamilie, maar mammatumoren van vrouwen met

BRCA1 en BRCA2 mutaties verschillen histologisch van elkaar. BRCA1 tumoren vertonen meer

histologische afwijkingen in vergelijking met gezonde cellen (hogere tumorgraad) en hebben minder

oestrogeen en progesteron receptoren. Ze zijn daarnaast ook geassocieerd met een slechte prognose

van de sporadische vormen van borstkanker. Over BRCA2 tumoren is minder bekend, maar wel lijkt

het erop dat sporadische BRCA2 tumoren zich kunnen omvormen tot tumoren met een hogere

tumorgraad (meer histologische afwijkingen ten op zichte van de gezonde cel)57.

19

Fig. 8: Het werkingsmechanisme van het pRB in hypergefosforyleerde (A) en

hypogefosforyleerde (B) vorm. (naar Boulay et al., 2011)

8.3. Expressieprofiel van BRCA2 in caniene mammatumoren

Sommige hondenrassen (o.a. English Springer Spaniels) zijn meer gevoelig voor de ontwikkeling van

mammatumoren wat suggereert dat het kan gaan om een erfelijke vorm van kanker. In caniene

mammatumoren is chromosomale aneuploidie aangetroffen waardoor het dus goed mogelijk is dat

reparatieproteïnen zoals BRCA2 en RAD51, betrokken zijn in de etiologie van caniene

mammatumoren met een erfelijk karakter59.

Klopfleish et al. vergeleken de expressie van BRCA2 en RAD51 in maligne tumoren en in hun

lymfeknoop metastasen. Uit hun onderzoek kwam naar voor dat verminderde expressie van BRCA2

en RAD51 mRNA aanwezig is in benigne tumoren en verhoogde expressie aanwezig is in lymfeknoop

metastasen in vergelijking met normaal melkklierepitheel. Dit is indicatief voor een

gemeenschappelijke rol van deze genen in de ontwikkeling van caniene mammatumoren55. Uit

onderzoek komt naar voren dat de expressie van caniene BRCA2 in mammatumoren de helft is van

de expressie van BRCA2 in normale melkklieren. De BRCA2 expressie in de mammatumor van een

LOH positieve hond kan toch nog voldoende zijn voor bescherming tegen tumorigenese. In het

algemeen vereist een tumor suppressor gen, zoals humane BRCA2, een mutatie of verlies van beide

allelen voor het ontstaan van tumoren. Het resultaat dat voortkwam uit het onderzoek van Yoshikawa

et al. gaf aan dat caniene mammatumoren een functioneel beschadigd caniene BRCA2 gen tot

expressie brengt61.

9. Het tumor suppressor gen Retinoblastoma gen (RB)


Het retinoblastoma gen proteïne (pRB) is geïdentificeerd als een tumor suppressor proteïne omdat het

afwezig of gemuteerd is in vele humane tumoren62, 63.

Het pRB is een nucleair fosfoproteïne dat een centrale rol speelt in de regulatie van de celcyclus via

het G1-checkpoint met als gevolg de inhibitie van de celcyclusprogressie naar de S-fase. Het weinig

gefosforyleerde pRB inhibeert proliferatie door onderdrukking van de activiteit van E2F transcriptie

factoren met als gevolg een gelimiteerde expressie van celcyclus regulerende proteïnen.

Hyperfosforylatie van pRB resulteert in dissociatie van E2Fs met als gevolg progressie van de G1-fase

naar de S-fase van de celcyclus (figuur 8)62,63,64,65.

20

In de literatuur zijn tegenstrijdige bevindingen gerapporteerd met betrekking tot de apoptotische

versus de anti-apoptotische rol van het pRB63. De meeste studies hebben echter een apoptotische

functie van het pRB aangetoond en dat is meer in overeenstemming met zijn rol als tumor suppressor.

De cellulaire functies van het pRB zijn goed onderzocht maar het effect van de afwijkingen in het RB

gen op tumorgroei is nog niet volledig bekend63.

9.2. Expressieprofiel van RB in humane mammatumoren

Kiemcellijn mutaties in het RB gen zijn sterk geassocieerd met de ontwikkeling van retinoblastoma bij

kinderen. Recente bewijzen laten zien dat er een verhoogd risico bestaat op de ontwikkeling van

verschillende maligne tumoren, oa mammatumoren, bij patienten die genezen zijn van erfelijk

retinoblastoma63,66. Daarnaast zijn in verschillende maligniteiten somatische veranderingen van het

RB gen gevonden zoals verlies van RB expressie, hypermethylatie van de RB-promotor en in

zeldzame gevallen grote genetische deleties van het RB gen. Berge et al. rapporteerden voor het

eerst puntmutaties in het het RB gen in mammatumoren. Een puntmutatie leidt tot een aminozuur

substitutie in pRB en heeft een effect op de stabiliteit van het pRB en op de functie van pRB, namelijk

een verminderde apoptotische capaciteit in vergelijking met het wild-type pRB63. Verwacht wordt dat

genduplicatie een anti-tumorgenetisch effect heeft omdat RB een tumor suppressor is. Het feit dat het

zelfde fenomeen zich voordoet in gemetastaseerde mammatumoren, samen met amplificatie van het

complete RB gen, toont aan dat duplicatie van RB-locus niet anti-carcinogeen is maar eerder een

neutraal of zelfs een carcinogeen effect heeft66.

De frequentie van RB gen mutaties in metastasen is niet gestegen in vergelijking met primaire

mammatumoren en dit geeft mogelijk aan dat mutaties in het RB gen geen grote rol spelen in het

ontstaan van metastasen (figuur 9)66.

Fig. 9: De verdeling van RB deleties en amplificaties in primaire en

metastatische mammatumoren. (uit Berge et al., 2011)

21

9.3. Expressieprofiel van retinoblastoma gen (RB) in caniene mammatumoren

Verlies van celcyclus controle door veranderingen in de RB-cascade komt regelmatig voor in

verschillende humane tumoren, maar er is momenteel nog weinig bekend over de rol van RB in

tumoren van gedomesticeerde dieren zoals de hond67. Nakagawa et al. toonden aan dat de expressie

van het RB gen erg verschillend is tussen de monsters van gecultiveerde adenocarcinoma cellen en

ook tussen cellen van primaire en metastatische oorsprong in een individueel dier68.



Het p63 gen is een homoloog van het p53 tumor suppressor gen69,70. Het proteïne dat gecodeerd

wordt door het p63 gen wordt geassocieerd met een belangrijke rol in de celproliferatie, in de

differentiatie, in de veroudering en in de adhesie van gestratificeerde epitheelcellen. Het p63 kan

verschillende biologische functies uitoefenen in diverse tumoren70. Het p63 is daarnaast noodzakelijk

voor het in standhouden van de epitheliale stamcelpopulatie en voor de normale ontwikkeling van

epitheliale organen zoals melkklierweefsel69,70,71. Mutaties in p63 zijn geassocieerd met ernstige

defecten in de ontwikkeling van de melkklier69. Het p63 gen wordt consistent tot expressie gebracht in

de basaalcellen van verschillende types meerlagige epithelia en in de myoepitheliale cellen van het

melkklierweefsel. Hierdoor wordt p63 beschouwd als een mogelijke marker voor stamcellen69.

De transcriptie van het p63 gen is gebaseerd op 2 verschillende promotoren. Alternatieve splicing is

verantwoordelijk voor 2 proteïnegroepen met 6 isovormen die ondanks hun structurele homologie

verschillende functies uitoefenen. Drie isovormen bevatten het N-terminaal transcriptie domein en

worden aangeduid met “TA-“. Deze isovormen zijn in staat om het p53 gen te activeren waardoor ze

apoptose kunnen induceren, de celcyclus kunnen reguleren en bijgevolg te functioneren als een tumor

suppressor proteïne. De andere 3 isovormen hebben geen N-terminaal transcriptie domein en worden

aangeduid met “∆N-“ 70,72,73. Deze hebben in vergelijking met de TA-groep een tegenovergestelde

werking in het reguleren van de celcyclus en apoptose. Het ∆Np63 functioneert als een dominant-

negatieve inhibitor van TAp63 isotypes en p5370,72,74. Het ∆Np63 kan bovenstaande functies

uitoefenen via directe proteïne-proteïne interactie of door competitie voor de bindingsplaatsen op

DNA-niveau70,74. Het ∆Np63 induceert dus proliferatie en groei van tumorcellen door bescherming van

de cel tegen apoptose. Dit is aangetoond zowel in vitro als in vivo73,74.

De definitieve rol van het p63 gen als oncogen of tumor suppressor gen in de ontwikkeling van

tumoren is nog controversieel. Studies die een p63-deficiënt model gebruikten toonden aan dat

muizen niet gevoelig waren voor chemisch-geïnduceerde tumoren en suggereren daarom een

oncogenetische functie voor p63. Dit wordt gesteund door het feit dat overexpressie van ∆Np63

voorkomt in diverse humane epitheliale tumoren en dat dit gecorreleerd kon worden met de overleving

en de handhaving van de proliferatieve capaciteit van tumorcellen. In tegenstelling tot deze rol in het

bevorderen van het ontstaan van tumoren, wordt p63 expressie ook geassocieerd met een gunstige

prognose in andere tumoren. Het verlies van de expressie wordt dan geassocieerd met progressie tot

22

meer invasieve en metastatische tumoren. Dit toont aan dat p63 als een metastatische suppressor

zou kunnen werken.

In de melkklier wordt p63 tot expressie gebracht in myoepitheliale cellen. Ze werken daar als tumor

suppressor en brengen vele celadhesie proteïnen tot expressie. Hierdoor wordt gesuggereerd dat

downregulatie van ∆Np63 ook mogelijk de expressie van deze proteïnen zou kunnen beinvloeden met

als gevolg metastasering door een hogere motiliteit van de cellen. Verder onderzoek is nog nodig om

de definitieve rol van p63 te achterhalen70.


Overexpressie van p63 komt voor in een aantal primaire humane epitheliale tumoren. Hierdoor wordt

aangenomen dat p63 mogelijk een rol kan spelen in de groei en ontwikkeling van deze tumoren. Deze

overexpressie komt voornamelijk voor in squamous celcarcinomen waardoor p63 dus een rol als

oncogen zou kunnen spelen in dit soort neoplasme71.

In humane mammatumoren vindt expressie van p63 plaats in de normale gezonde myoepitheliale

cellen. Het p63 kan als marker worden gebruikt om tumoren in situ te onderscheiden van invasieve

tumoren. De normale, histologisch niet afwijkende, myoepitheliale cellen zijn namelijk in steeds

mindere mate aanwezig in invasieve tumoren. In invasieve tumoren wordt daarom minder p63

aangetroffen70.

Mutaties in het p63 gen komen niet frequent voor in humane tumoren, dit in tegenstelling tot andere

leden van dezelfde familie zoals p5373.


Uit onderzoek van Gama A. et al. blijkt dat p63 als marker voor basale of myoepitheliale cellen in

caniene melkklierweefsel, net zoals bij de mens, een hoge sensitiviteit en specificiteit heeft69,70. Het is

daarom een betrouwbare nucleaire marker voor deze cellen in normale en neoplastische

melkklierweefsels69. Voor de classificatie van caniene mammatumoren is een goede identificatie van

het celtype gewenst en p63 kan hiervoor gebruikt worden door middel van immunohistochemie69,71.

Een immunoreactiviteit van 100% is gevonden in myoepitheliale cellen van normaal, hyperplastisch en

benigne tumoraal melkklierweefsel. Maligne mammatumoren vertonen in 72% van de gevallen p63

expressie69.

Uit onderzoek van Bertagnolli et al. blijkt dat een verlies van immunoreactiviteit voor p63 in

myoepitheliale cellen voorkomt wanneer tumoren ontwikkelen van benigne naar maligne en van lokaal

naar invasief70. Deze resultaten zijn ook waargenomen in humane mammatumoren. Verlies van p63

expressie komt simultaan voor met maligne progressie. Uit hetzelfde onderzoek blijkt dat, in

vergelijking met benigne tumoren, in maligne tumoren zowel verlies van p63 als van ∆Np63

voorkomen. Deze resultaten zijn tegenstrijding omdat verlies van ∆Np63 expressie juist de

evolutionaire capaciteit van de tumoren vermindert. De verklaring van Bertagnolli et al. hiervoor is dat

de TAp63 isovorm niet aangetoond kan worden omdat er bewijs bestaat dat deze isovorm al actief

kan zijn in zeer lage hoeveelheden. Deze kleine hoeveelheden vallen in sommige tumoren onder de

detectielimiet van immunohistochemie. De biologische relatie tussen TAp63 en ∆Np63 kan uit balans

23

zijn in carcinomen van gemengde tumoren wat zou kunnen leiden tot een predominantie van de

oncogenetische rol van het ∆Np63. Het is echter ook mogelijk dat de daling van ∆Np63 in carcinomen

in benigne gemengde tumoren belangrijk kan zijn voor de ontwikkeling van benigne gemengde

tumoren tot carcinomen. In deze gevallen werkt ∆Np63 initieel als oncogen en simultaan als een

tumorsuppressor70.

Uit onderzoek van Genelhu et al. komt, net zoals bij Bertagnolli et al., naar voren dat maligne tumoren

minder, door immunohistochemie aangetoonde, p63 positieve cellen hebben dan benigne tumoren72.

24

Discussie.

De in deze literatuurstudie opgenomen tumor suppressor genen zijn slechts een greep uit de vele

genen die een rol kunnen spelen bij het ontstaan van mammatumoren. De genoemde tumor

suppressor genen zijn allemaal aangetoond bij humane en bij caniene mammatumoren. Hoewel deze

tumor suppressor genen dus zowel bij de mens als bij de hond voorkomen worden, behalve

overeenkomsten, ook verschillen opgemerkt, bijvoorbeeld in de expressieprofielen van de tumor

suppressor genen (tabel 4).

Tabel 4: Het expressieprofiel van de tumor suppressor genen in mammatumoren

bij de hond en bij de mens. ?: onbekend, verder onderzoek nodig; ↓: verminderde expressie gevonden in de

mammatumor; ↑: verhoogde expressie gevonden in de mammatumor.

Een mogelijke verklaring voor de gevonden verschillen in de expressieprofielen van de tumor

suppressor genen zou kunnen zijn dat er verschillen bestaan in de mutaties of verschillen in de

epigenetische veranderingen (wijziging van het fenotype zonder dat het genotype verandert) in de

humane en in de caniene mammatumoren. Verder onderzoek is hiervoor echter nodig.

Daarnaast is het onderzoek naar de verschillende genen nog niet volledig afgerond en is er recent

nieuwe informatie verzameld waardoor eerdere bevindingen in twijfel worden getrokken. Het p21 gen

kan hiervoor als voorbeeld genomen worden. Dit gen werd eerst beschreven als een cycline kinase

inhibitor maar recent werd er gevonden dat p21 ook een rol speelt in de celcyclusvoortgang en in de

bescherming van de cel tegen apoptose. Door deze bevinding werd de functie van het p21 in twijfel

getrokken.

De expressieprofielen van de genen p53, PTEN, BRCA1 en BRCA2 zijn vergelijkbaar in humane en

caniene mammatumoren. Hierdoor zou het mogelijk zijn dat therapieën die toegepast worden bij

humane mammatumoren en die gebaseerd zijn op de beïnvloeding van deze genen en hun proteïnen,

misschien ook wel toepasbaar kunnen zijn bij caniene mammatumoren met dezelfde afwijkingen in

deze genen. Voor de andere in deze literatuurstudie bestudeerde tumor suppressor genen zijn

Tumorsuppressor genen Hond Mens

p21 ↑ ↓↑

p27 ↓ ↓↑

p53 ↓ ↓

PTEN ↓ ↓

SLIT2 ↓↑? ↓↑?

BRCA1 ↓ ↓

BRCA2 ↓ ↓

RB ? ↓

p63 ? ?

25

verschillen gevonden in de expressieprofielen bij humane en caniene mammatumoren. Voor deze

genen is verder onderzoek dus nodig om een uitspraak te doen of de therapieën die bij de mens

toegepast worden eventueel ook toepasbaar zouden kunnen zijn bij de hond.

Het is niet realistisch te verwachten dat één enkele individuele biomarker een prognostische waarde

zal hebben die belangrijk genoeg is om klinisch bruikbaar te zijn. Kanker is namelijk een ziekte die

gekenmerkt wordt door meerdere primaire veranderingen in het DNA, zoals mutaties en

amplificaties11,66. Elke verandering op zich leidt tot een cascade van secundaire consequenties en

veranderingen. Zo kunnen er talloze veranderingen mogelijk zijn in een individuele kankercel welke

zouden kunnen leiden tot maligne gedrag11.

Recente bevindingen suggereren dat het wellicht voor een beperkt aantal genen mogelijk is dat een

afwijking in dit gen toch verantwoordelijk zou kunnen zijn voor tumorvorming en/of metastasering66

waardoor deze individuele genen toch als markers zouden gebruikt kunnen worden.

Tabel 5: mogelijke markers voor mammatumoren bij de mens en de hond.

? : relevantie als eventuele marker is nog niet bekend; + : vermoedelijk een

marker; - : waarschijnlijk geen marker

Een individuele marker, voor het maken van een onderscheid tussen benigne en maligne

mammatumoren, kan alleen maar een goede marker zijn als er duidelijke verschillen in de expressie

van de genen aantoonbaar zijn.

Als voorbeeld kunnen de genen PTEN of p63 aangehaald worden. Voor deze genen werd gevonden

dat een verminderde genexpressie dan wel de afwezigheid van het door dit gen gecodeerde proteïne

geassocieerd kon worden met maligne mammatumoren. Een normale genexpressie dan wel de

aanwezigheid van het door dit gen gecodeerde proteïne kon worden geassocieerd met benigne

mammatumoren (tabel 5).

De genen p21 en p27, daarentegen, kunnen niet als marker gebruikt worden omdat de expressie van

het p21 gen en het p27 gen in zowel maligne als in benigne tumoren voorkomt (tabel 5). Hierdoor kan

het klinische onderscheid tussen benigne en maligne tumoren op basis van dit gen of op basis van het

door dit gen gecodeerde proteïne moeilijk gemaakt worden1.

Tumorsuppressor genen Hond Mens

p21 - ?

p27 - +

PTEN + +

SLIT2 + ?

p63 + +

26

Referentielijst

1. Yazawa M., Setoguchi A., Hong S., Uyama R., Nakagawa T., Kanaya N., Nishimura R., Sasaki N., Masuda K., Ohno K., Tsujimoto H. (2003). Effect of an adenoviral vector that expresses the canine p53 gene on cell growth of canine osteosarcoma and mammary adenocarcinoma cell lines. American Journal of Veterinary Research 64, 880-888.

2. Lana S.E., Rutteman G.R., Withrow S.J. (2007). Tumors of the Mammary Gland. In: Withrow & MacEwen’s Small Animal Clinical Oncology, Fourth Edition, Saunders, p. 619-623.

3. Henry C.J. (2007). The Etiology of Cancer: Chemical, Physical, and Hormonal Factors. In: Withrow & MacEwen’s Small Animal Clinical Oncology, Fourth Edition, Saunders, p. 16.

4. Henry C.J. (2009). Tumors of the Abdominal Cavity: Mammary Tumors. In: Henry C.J. and Higginbotham M.L. (Editors) Cancer Management in Small Animal Practice, Saunders, p. 275-277.

5. Argyle D.J., Khanna C. (2007). Tumor Biology and Metastasis. In: Withrow & MacEwen’s Small Animal Clinical Oncology, Fourth Edition, Saunders p. 38-39.

6. Klopfleisch R., Gruber A.D. (2009). Differential expression of cell cycle regulators p21, p27 and p53 in metastasizing canine mammary adenocarcinomas versus normal mammary glands. Research in Veterinary Science 87, 91-96.

7. Gartel A.L., Radhakrishnan S.K. (2005). Lost in transcription: p21 repression, mechanisms, and consequences. Cancer Research 65, 3980–3985.

8. El-Deiry W.S., Harper J.W., O’Connor P.M., Velculescu V.E., Canman C.E., Jackman J., Pietenpol J.A., Burrell M., Hill D.E., Wang Y., et al. (1994). WAF1/CIP1 is induced in p53- mediated G1 arrest and apoptosis. Cancer Research 54, 1169–1174. 9. Somasundaram K., Zhang H., Zeng Y.X., Houvras Y., Peng Y., Wu G.S., Licht J.D., Weber

B.L., El-Deiry W.S. (1997). Arrest of the cell cycle by the tumoursuppressor BRCA1 requires the CDK-inhibitor p21WAF1/CiP1. Nature 389, 187– 190.

10. Ellis P.A., Lonning P.E., Borresen-Dale A., Aas T., Geisler S., Akslen L.A., Salter I., Smith I.E., Dowsett M. (1997). Absence of p21 expression is associated with abnormal p53 in human breast carcinomas. British Journal of Cancer 76, 480–485.

11. Elledge R.M., Allred D.C. (1998). Prognostic and predictive value of p53 and p21 in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment 52, 79-98.

12. Dong Y., Chi S.L., Borowsky A.D., Fan Y., Weiss R.H. (2004). Cytosolic p21Waf1/Cip1 increases cell cycle transit in vascular smooth muscle cells. Cell Signal 16, 263–269. 13. Decesse J.T., Medjkane S., Datto M.B., Cremisi C.E. (2001). RB regulates transcription of the

p21/WAF1/CIP1 gene. Oncogene 20, 962–971. 14. Michieli P., Chedid M., Lin D., Pierce J.H., Mercer W.E., Givol D. (1994). Induction of WAF1/CIP1 by a p53-independent pathway. Cancer Research 54, 3391–3395. 15. Abukhdeir A.M., Park B.H. (2008). P21 and p27: roles in carcinogenesis and drugresistance. Expert Reviews in Molecular Medicine 10, e19. 16. Yang W., Klos K.S., Zhou X., Yao J., Yang Y., Smith T.L., Shi D., Yu D. (2003). ErbB2

overexpression in human breast carcinoma is correlated with p21Cip1 upregulation and tyrosine-15 hyperphosphorylation of p34Cdc2: poor responsiveness to chemotherapy with cyclophoshamide methotrexate, and 5- fluorouracil is associated with Erb2 overexpression and with p21Cip1 overexpression. Cancer 98, 1123–1130. 17. Knappskog S., Chrisanthar R., Staalesen V., Borresen-Dale A.L., Gram I.T., Lillehaug J.R.,

Lonning P.E. (2007). Mutations and polymorphisms of the p21B transcript in breast cancer. International Journal of Cancer 121, 908–910.

18. Dong Y., Chi S.L., Borowsky A.D., Fan Y., Weiss R.H. (2004). Cytosolic p21Waf1/Cip1 increases cell cycle transit in vascular smooth muscle cells. Cell Signal 16, 263–269. 19. Slingerland J., Pagano M. (2000). Regulation of the cdk inhibitor p27 and its deregulation in

cancer. Journal of Cell Physiology 183, 10–17. 20. Fredersdorf S., Burns J., Milne A.M., Packham G., Fallis L., Gillett C.E., Royds J.A.,Peston D.,

Hall P.A., Hanby A.M., Barnes D.M., Shousha S., O’Hare M.J., Lu X. (1997). High level expression of p27(kip1) and cyclin D1 in some human breast cancer cells: inverse correlation between the expression of p27(kip1) and degree of malignancy in human breast and colorectal cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA 94, 6380–6385.

21. Tan P., Cady B., Wanner M., Worland P., Cukor B., Magi-Galluzzi C., Lavin P., Draetta G., Pagano M., Loda M. (1997). The cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small (T1a,b) invasive breast carcinomas. Cancer Research 57, 1259–1263.

27

22. Toyoshima H., Hunter T. (1994). P27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21. Cell 78, 67–74.

23. Muto T., Wakui S., Takahashi H., Maekawa S., Masaoka T., Ushigome S., Furusato M. (2000). p53 Gene Mutations Occuring in Spontaneous Benign and Malignant Mammary Tumors of the Dog. Veterinary Pathology Online 37, 248-253.

24. Veldhoen N., Watterson J., Brash M., Milner J. (1999). Identification of tumor-associated and germ line p53 mutations in canine mammary cancer. British Journal of Cancer 81, 409-415.

25. Freeman D.J., Li A.G., Wei G., Li H.H., Kertesz N., Lesche R., Whale A.D., Martinez-Diaz H., Rozengurt N., Cardiff R.D., Liu X., Wu H. (2003). PTEN tumor suppressor regulates p53 protein levels and activity through phosphatase-dependent and –independent mechanisms. Cancer Cell 3, 117–130. 26. Mayr B., Reifinger M., Alton K. (1999). Novel Canine Tumor Suppressor Gene p53 Mutations

in Cases of Skin and Mammary Neoplasms. Veterinary Research Communications 23, 285-291.

27. Chu L.L., Rutteman G.R., Kong J.M.C., Ghahremani M., Schmeing M., Misdorp W., van Garderen E., Pelletier J. (1998). Genomic organization of the canine p53 gene and its mutational status in canine mammary neoplasia. Breast cancer research and treatment 50, 11-25.

28. Veldhoen N., Stewart J., Brown R., Milner J. (1998). Mutations of the p53 gene in canine lymphoma and evidence for germ line p53 mutations in the dog. Oncogene 16, 249-255.

29. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. (1994). Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene: Clues to Cancer Etiology and Molecular Pathogenesis. Cancer Research 54, 4855-4878.

30. MacVean D.W., Monlux A.W., Anderson P.S., Silberg S.L., Roszel J.F. (1978). Frequency of canine and feline tumors in a defined population. Veterinary Pathology 15, 700-715.

31. Ressel L., Millanta F., Caleri E., Innocenti V.M., Poli A. (2009). Reduced PTEN Protein Expression and Its Prognostic Implications in Canine and Feline Mammary Tumors. Veterinary Pathology Online 46, 860-868.

32. Tamguney T., Stokoe D. (2007). New insights into PTEN. Journal of Cell Science 120, 4071–4079.

33. Planchon S.M., Waite K.A., Eng C. (2008). The nuclear affairs of PTEN. Journal of Cell Science 121, 249–253.

34. Shi W., Zhang X., Pintilie M., Ma N., Miller N., Banerjee D., Tsao M.S., Mak T., Fyles A., Liu F.F. (2003). Dysregulated PTEN-PKB and negative receptor status in human breast cancer.

International Journal of Cancer 104, 195–203. 35. Kanae Y., Endoh D., Yokota H., Taniyama H., Hayashi M. (2006). Expression of the PTEN

tumor suppressor gene in malignant mammary gland tumors of dogs. American Journal of Veterinary Research 67, 127-133.

36. Maehama T., Dixon J.E. (1998). The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. Journal of Biological Chemistry 273:13375–13378.

37. Depowski P.L., Rosenthal S.I., Ross J.S. (2001). Loss of expression of the PTEN gene protein product is associated with poor outcome in breast cancer. Modern Pathology 14, 672–676.

38. Tomohiko M., Dixon J.E. (1998). The Tumor Suppressor, PTEN/MMCA1, Dephosphorylates the Lipid Second Messenger Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate. The Journal of Biological Chemistry 273, 13375-13378.

39. Tamura M., Gu J., Tran H., Yamada K.M. (1999). PTEN Gene and Integrin Signaling in Cancer. Journal of the National Cancer Institute 91, 1820-1828.

40. Kotelevets L., Bruyneel E., Mareel M., Chastre E. (2001). The lipid phosphatase activity of PTEN is critical for stabilizing intercellular junctions and reverting invasiveness. The Journal of Cell Biology 155, 1129–1135.

41. Tamura M., Gu J., Tran H., Yamada K.M. (1999). PTEN gene and integrin signaling in cancer. Journal of the National Cancer Institute 91,1820–1828. 42. Qiu C., Lin D., Wang J., Wang L. (2008). Expression and significance of PTEN in canine

mammary gland tumours. Research in Veterinary Science 85, 383–388. 43. Myers M.P., Pass I., Batty I.H., Van der Kaay J., Stolarov J.P., Hemmings B.A., Wigler M.H., Downes C.P., Tonks N.K. (1998). The lipid phosphatase activity of PTEN is critical for its tumor suppressor function. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (PNAS) 95, 13513-13518.

28

44. Bose S., Crane A., Hibshoosh H., Mansukhani M., Sandweis L., Parsons R. (2002). Reduced expression of PTEN correlates with breast cancer progression. Human Pathology 33, 405–409.

45. Qui C.W., Lin D.G., Wang J.Q., Li C.Y., Deng G.Z. (2008). Expression and significance of PTEN and VEGF in canine mammary gland tumours. Veterinary Research Communications 32, 463-472.

46. Dallol A., Fernandes Da Silva N., Viacava P., Minna J.D., Bieche I., Maher E.R., Latif F. (2002). Slit2, A Human Homologue of the Drosophila Slit2 Gene, Has Tumor Suppressor Activity and Is Frequently Inactivated in Lung and Breast Cancers. Cancer Research 62, 5874-5880.

47. Tanno T., Tanaka Y., Sugiura T., Akiyoshi H., Takenaka S., Kuwamura M., Yamate J., Ohashi F., Kubo K., Tsuyama S. (2006). Expression Patterns of the slit Subfamily mRNA in Canine Malignant Mammary Tumors. The Journal of veterinary medical science the Japanese Society of Veterinary Science 68, 1173-1177.

48. Qiu H., Zhu J., Yu J., Pu H., Dong R. (2011). Slit2 is Epigenetically Silenced in Ovarian Cancers and Suppresses Growth when Activated. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 12, 791-795.

49. Kim G., Lee K.H., Choi Y.D., Lee J.S., Lee J.H., Nam J.H., Choi C., Park M.H., Yoon J.H. (2011). Detection of Slit2 promoter hypermethylation in tissue and serum samples from breast cancer patients. Virchows Archive : an international journal of pathology 459, 383-390.

50. Marlow R., Strickland P., Lee J.S., Wu X., PeBenito M., Binnewies M., Le E.K., Moran A., Macias H., Cardiff R.D., Sukumar S., Hinck L. (2008). Slits Suppress Tumor Growth In vivo bij Silencing Sdf1/Cxcr4 within Breast Epithelium. Cancer Research 68, 7819-7827.

51. Brantley-Sieders D.M., Dunaway C.M., Rao M., Short S., Hwang Y., Gao Y., Li D., Jiang A., Shyr Y., Wu J.Y., Chen J. (2010). Angiocrine Factors Modulate Tumor Proliferation and Motility through EphA2 Repression of Slit2 Tumor Suppressor Function in Endothelium. Cancer Research 71, 976-987.

52. Klopfleish R., Klose P., Gruber A.D. (2010). The Combined Expression Pattern of BMP2, LTBP4, and DERL1 Discriminates Malignant From Benign Canine Mammary Tumors. Veterinary Pathology 47, 446-454.

53. Sugiura T., Matsuyama S., Akiyosi H., Takenaka S., Yamate J., Kuwamura M., Aoki M., Shimada T., Ohashi F., Kubo K. (2007). Expression Patterns of the BRCA1 Splicing Variants in Canine Normal Tissues and Mammary Gland Tumors. The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science 69, 587-592.

54. Kim J.H., Yu C.H., Yhee J.Y., Im K.S., Sur J.H. (2010). Lymphocyte Infiltration, Expression of Interleukin (IL), IL-6 and Expression of Mutated Breast Cancer Susceptibility Gene-1 Correlate with Malignancy of Canine Mammary Tumours. Journal of Comporative Pathology 142, 177-186.

55. Klopfleish R, Gruber A.D. (2009). Increased Expression of BRCA2 and RAD51 in Lymph Node Metastases of Canine Mammary Adenocarcinomas. Veterinary Pathology 46, 416-422. 56. Lixia M., Zhijian C., Chao S., Chaojiang G., Congyi Z. (2007). Alternative Splicing of

BreastCancer Associated Gene BRCA1 from Breast Cancer Cell Line. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 40, 15-21.

57. Rivera P., Melin M., Biagi T., Fall T., Häggström J., Lindblad-Toh K., von Euler H. (2009). Mammary Tumor Development in Dogs Is Associated with BRCA1 and BRCA2. Cancer Research 69, 8770-8774. 58. Ochiai K., Morimatsu M., Tomizawa N., Syuto B. (2001). Cloning and Sequencing Full Length

of Canine Brca2 and Rad51 cDNA. Journal of Veterinary Medical Science 63, 1103-1108. 59. Yoshikawa Y., Morimatsu M., Ochiai K., Nagano M., Yamane Y., Tomizawa N., Sasaki N.,

Hashizume K. (2005). Analysis of Genetic Variations in the Exon 27 region of the Canine BRCA2 Locus. Journal of Veterinary Medical Science 67, 1013-1017.

60. Hsu W., Huang Y., Chang T., Wong M., Chang S. (2010). Single nucleotide variation in exon 11 of canine BRCA2 in healthy and cancerous mammary tissue. The Veterinary Journal 184 , 351-356.

61. Yoshikawa Y., Morimatsu M., Ochiai K., Nagano M., Tomioka Y., Sasaki N., Hashizume K., Iwanaga T. (2008). Novel Variations and loss of heterozygosity of BRCA2 identified in a dog with mammary tumors. American Journal Of Veterinary Research 69, 1323-1328.

62. Decesse J.T., Medjkane S., Datto M.B., Crémisi C.E. (2001). RB regulates transcription of the p21/WAF1/CIP1 gene. Oncogene 20, 962-971.

29

63. Berge E.O., Knappskog S., Geisler S., Staalesen V., Pacal M., Børresen-Dale A., Puntervoll P., Lillehaug J.R., Lønning P.E. (2010). Identification and characterization of retinoblastoma gene mutations disturbing apoptosis in human breast cancers. Molecular Cancer 9, 173-186.

64. Francis S.M., Chakrabarti S., Dick F.A. (2011). A Context-Specific Role for Retinoblastoma Protein-Dependent Negative Growth Control in Suppressing Mammary Tumorigenesis. PloS one 6, 1-9.

65. Boulay P-L., Schlienger S., Lewis-Saravilli S., Vitale N., Ferbeyre G., Claing A. (2011). ARF1 controls proliferation of breast cancer cells by regulating the retinoblastoma protein. Oncogene 30, 3846-3861.

66. Berge E.O., Knappskog S., Lillehaug J.R., Lønning P.E. (2011). Alterations of the retinoblastoma gene in metastatic breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis 28, 319-326.

67. Lana S.E., Rutteman G.R., Withrow S.J. (2007). Tumors of the Mammary Gland. In: Withrow & MacEwen’s Small Animal Clinical Oncology, Fourth Edition, Saunders, p. 619-623.

68. Nakagawa T., Watanabe M., Ohashi E., Uyama R., Takauji S., Mochizuki M., Nishimura R., Ogawa H., Sugano S., Sasaki N. (2006). Cyclopedic protein expression analysis of cultured canine mammary gland adenocarcinoma cells form six tumours. Research in Veterinary Science 80, 317-323.

69. Gama A., Alves A., Garthner F., Schmitt F. (2003). p63: A Novel Myoepithelial Cell Marker in Canine Mammary Tissues. Veterinary Pathology Online 40, 412-420.

70. Bertagnolli A.C., Cassali G.D., Genelhu M.C.L.S., Costa F.A., Oliveira J.F.C., Gonçalves P.B.D. (2009). Immunohistochemical Expression of p63 and ∆Np63 in Mixed Tumors of Canine Mammary Glands and Its Relation with p53 Expression. Veterinary Pathology Online 46, 407-415.

71. Ramalho L.N.Z., Ribeiro-Silva A., Cassali G.D., Zucoloto S. (2006). The Expression of p63 and Cytokeratin 5 in Mixed Tumors o

Documents

Vergelijking van het expressieprofiel van enkele tumor suppressor … · 2012. 12. 5. · de kern bevindt heeft het een functie als tumor suppressor door de inhiberende effecten