GE Healthcare Life Sciences

Vero细胞流感病毒在WAVE生物反应器

中的Cytodex微载体无血清培养工艺

应用指南 28-9992-69 AA 疫苗

本工艺研究的目的是建立一个无动物源性成分的病毒培养

工艺，用于Vero细胞流感病毒的生产。最终的工艺快速简

单，易于放大和工业化生产。本研究评估了下列关键参

数：培养基组成、细胞消化、培养基添加剂、搅拌和病毒

感染参数。不同的培养基和蛋白酶对细胞的影响采用静态

培养方式进行评估。作为优化WAVE生物反应器中细胞生

长条件的一部分，评估了多种添加剂和不同摇动条件的影

响。接下来，对胰酶浓度和病毒储液稀释度进行比较，

以找到最佳病毒感染参数。最后，验证了使用微载体和

WAVE生物反应器用于Vero细胞中病毒培养整个工艺的稳

定性和可重复性。数据显示，已经建立了一个稳定可靠的

工艺，使用WAVE生物反应器在无动物源性成分培养条件

下使用Cytodex 1微载体贴壁的Vero细胞生产流感病毒。

使用一次性Cellbag*生物反应器的WAVE生物反应器（图

1）易于安装，无需清洗和验证，操作灵活成本低，快速

方便的取代传统不锈钢搅拌反应器。

介绍

流感病毒疫苗的培养工艺多数仍采用传统鸡胚培养方式。

这种方法劳动强度大，而且需要较大的生产厂房和空间，

不易于规模化生产放大和自动控制。

流感大流行的威胁，对快速生产大量流感疫苗的需求也随

之上升。流感疫苗在鸡胚中的生产依赖于鸡胚的有限供

应。疫苗生产从鸡胚向细胞培养方法和一次性产品的转换

提供了生产灵活性，将显著减少疫苗临床试验和报批的时

间，从而有效缩短上市周期。因此，新型的基于细胞培养

的疫苗生产工艺是确保更快速反应的一种有效方法，成为

技术发展的趋势。

多个细胞株已经广泛用于病毒类疫苗的生产。本研究使用

的Vero细胞，目前已经成为用于多种人用疫苗生产的公认

平台。因为在人疫苗生产中必须避免动物来源的成分，本

研究中经过优化的病毒培养工艺是完全无动物源性成分

的。

图1.具有WAVEPODII*反馈控制器和一次性Cellbag生物反应器的

WAVE生物反应器。

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材料与方法

细胞株、维持和扩增

源自非洲绿猴肾细胞的Vero细胞购自ATCC（Nr. CCL81）。

细胞在含有三种不同添加剂的无动物源性无血清培养基中

进行培养：Pluronic** F-68 (Sigma-Aldrich)、大豆蛋白胨

(Fluka)和大豆来源的胰酶抑制剂(Sigma-Aldrich; 1 mg/mL溶

解在磷酸盐缓冲液[PBS]中)。Vero细胞在Cytodex 1微载体

(GE Healthcare)上进行接种和扩增，然后使用WAVE20/50

生物反应器(GE Healthcare)中进行病毒感染和生产。

为了在T形瓶中维持培养或在Cell Factory (Nunc)中细胞扩

增，Vero细胞先用PBS-EDTA (Sigma-Aldrich)洗涤，然后

使用重组蛋白酶TrypLE** Select (Invitrogen)或Accutase**

(PAA Laboratories)进行消化。

微载体准备

微载体Cytodex 1终浓度为3 g/L (1)。微载体先进行水化，

并在硅化的玻璃容器(Sigmacote**, Sigma-Aldrich)用PBS洗

涤三次，之后在121℃下高压灭菌15分钟（2）。然后用

培养基洗涤后，转移到Cellbag生物反应器中。

WAVE 生物反应器

WAVEPODII反馈控制器与WAVE生物反应器一起使用以自

动控制pH、温度、氧气、CO₂和混合等参数。Vero细胞在

Cellbag-10L中培养，工作体积为2 L。培养条件为37℃，

pH 7.2，5% CO₂。用新型光纤溶氧电极监测溶氧。

细胞取样和计数

对于常规培养，Vero细胞在T型瓶中每周被传代两次。细

胞工厂被用于细胞扩增。消化的Vero细胞样品使用台盼蓝

染色方法在Cedex** HiRes细胞分析仪（Innovatis）上进

行计数。

WAVE生物反应器中生长的细胞每天取样以测定细胞密

度和细胞形态。细胞悬液样品经过袋子内置的无菌取样

口在连续摇动状态下取出。样品（1 mL）被转移到一根

试管中，然后去除800 μL的上清，同时加入等体积的工

作染色液（0.1%结晶紫溶解于0.1 M柠檬酸和1% Triton**

X-100）。然后上清漩涡振荡45秒，最后在Bürker血球计

数板中计数细胞核。

细胞形态和贴附

使用连接照相机（Eclipse TS100, Nikon）的倒置显微镜观

察细胞形态及微载体上的贴附状态。

Vero细胞Cytodex 1微载体贴壁

评估不同的摇动参数和培养基组成以确定适合Vero细胞

贴附到Cytodex 1微载体的最佳条件。在工作体积为2 L的

Cellbag-10L中进行细胞培养。所有的培养都接种4×10⁵

细胞/mL。参考文献3中介绍的摇动参数略作修改如下所

示：

• 间歇摇动6小时（1 6 r p m / 4 . 5°摇动2分钟，然后0

rpm/0°静止18分钟）。为了促进细胞铺展，培养物在

切换到连续摇动（11 rpm/4.5°）前保持2小时静止。

• 间歇摇动6小时（1 6 r p m / 4 . 5°摇动2分钟，然后0

rpm/0°静止8分钟）。为了促进细胞铺展，培养物在切

换到连续摇动（11 rpm/4.5°）前保持2小时静止。

• 连续摇动（11 rpm/4.5°）。

• 连续摇动（12 rpm/5°）

• 连续摇动（12 rpm/5°），然后在24小时后提高速度到

（14 rpm/5°）

病毒储液制备

Influenza A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) IVR145 WHO

（源自鸡胚）在Vero细胞中经过传代适应。建立工作病

毒储液，并使用组织培养感染剂量50(TCID)50测试病毒感

染性。计算五次TCID50分析的平均值得到病毒储液滴度为

106.9。

工艺开发

工艺开发被分为两部分：细胞贴壁和生长；病毒感染。

细胞贴壁和生长的优化

评估下列参数：

培养基组成

• VP-SFM (Invitrogen)

• OptiPRO**-SFM (Invitrogen)

重组蛋白酶（用于传代前的细胞消化）

• TrypLE Select

• Accutase

培养基添加剂（用于替代动物血清）

• Pluronic F-68，一种非离子型乙烯和环氧丙烯共聚物，

被用作消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定

剂，常用于各种生物反应器。

• 大豆蛋白胨，脱脂大豆粉的木瓜蛋白酶 /胰酶消化产

物，是维生素和碳水化合物的极好的来源。

• 大豆胰酶抑制剂 在细胞培养中用于抑制细胞消化期间

的胰酶活性，尽可能减少细胞损伤/死亡。

摇动条件

• 摇动条件如上文Vero细胞Cytodex 1微载体贴壁中所述。

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Vero细胞在T型瓶中的生长

Vero细胞在T型瓶中使用VP-SFM或OptiPROSFM培养基进

行扩增。细胞传代是先用PBS-EDTA洗涤T型瓶一次，然

后加入TrypLE Select或Accutase在37℃孵育大约2分钟。

在Cedex HiRes细胞分析仪中测定细胞数和活力。细胞以

4×104细胞/cm2的密度被接种到新的T型瓶中，然后在

37℃含有5%CO₂的恒温培养箱中培养。

Vero细胞在WAVE生物反应器中的生长

为了更好的支持细胞在无血清培养中生长，细胞培养基中

添加Pluronic F-68、大豆蛋白胨(Soy peptone)和胰酶抑制

剂。使用上面列出的摇动条件（见第2页）对不同培养基

添加剂的细胞生长进行评估。

病毒感染参数的优化

在T型瓶和WAVE生物反应器中的感染

使用范围为1:1000到1:5000的病毒稀释倍数进行T型瓶和

WAVE生物反应器的感染。使用的胰酶（猪胰酶，Sigma-

Aldrich）浓度为5到25 µg/mL。使用TCID50检测法测定病

毒滴度。Vero细胞在96孔板中生长，用10倍系列稀释的

病毒悬液感染，然后孵育5天。显示细胞病变效应的孔被

计数，然后根据Reed and Müench的方法计算TCID50滴度

（4）。

使用Biacore*（GE Healthcare）测定血凝素浓度（HA）

（5）。

结果

细胞贴壁和生长的优化

Vero细胞在T型瓶中的生长

在VP-SFM或OptiPRO-SFM培养基中生长的Vero细胞在T型

瓶中经过七次传代后评估细胞生长和形态。采用VP-SFM

的平均倍增时间为30小时；采用OptiPRO-SFM观察到的

倍增时间略短，为25小时。对于每次传代，使用TrypLE

Select或Accutase重组蛋白酶消化细胞。

使用这两种蛋白酶进行细胞消化，倍增时间无明显差别。

然而，用TrypLE处理的培养物根据显微镜观察具有略好的

细胞形态（图2A VS 2B）。

Vero细胞在微载体上的贴壁和生长

为了研究细胞贴壁和生长，Vero细胞使用OptiPRO-SFM培

养基中在24孔板内的Cytodex 1上生长。在接种到Cytodex

1之前，细胞使用TrypLE消化。

在孵育1小时后，细胞开始贴附到微载体上，如图3A所

示。细胞在22小时后铺展和开始增殖（图3B）。48小时

后，细胞被均匀分布，且微载体接近汇合（图3C）。

A)

B)

A) B) C)

图2.Vero细胞分别使用TrypLE Select或Accutase进行细胞消化，

在OptiPRO-SFM中生长48小时。A）使用TrypLE的OptiPRO-SFM

培养基；B）使用Accutase的OptiPRO-SFM培养基。

图3.采用OptiPRO-SFM培养基在Cytodex 1上生长的Vero细胞形态。在孵育A）1小时；B）22小时和C）48小时后的细胞形态。

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Vero细胞在WAVE生物反应器中的生长

从静止培养移动到搅拌混合反应器系统意味着细胞将经受

混合带来的剪切力。可以向培养基中加入剪切力保护剂

Pluronic F-68。为了获得无动物源性成分的培养条件，可

以使用大豆蛋白胨而不是血清，然后加入胰酶抑制剂以灭

活蛋白酶。

当比较间歇式和连续式摇动条件进行贴壁时（见第2

页），可以观察到在微载体上分布细胞的明显差别。当使

用连续摇动条件时，细胞均匀度被提高。为了在连续摇

动条件中获得一个稳定可靠的接种，通过测试三个不同

浓度（0.1%、0.2%和0.3%）评估大豆蛋白胨的作用，同

时保持胰酶抑制剂和Pluronic F-68的浓度在20 mg和0.2%

不变。根据显微镜观察评估贴壁和生长（数据此处未列

出）发现，最佳的大豆蛋白胨浓度为0.3%。所需要的胰

酶抑制剂的量取决于用于细胞消化的TrypLE的量。例如，

当100 mL的TrypLE被加入2 L培养物时，使用20 mg的胰

酶抑制剂。获得最佳的细胞生长需要添加这三种添加剂

（Pluronic F-68, 0.2%; soy peptone, 0.3%和胰酶抑制剂，

2L培养物加20 mg），如图4和5所示。

病毒感染参数的优化

T型瓶中感染

感染时的细胞密度大约为1.1×106细胞/mL，收获时间

（TOH）为感染后3天。每天对细胞进行目视检查以观察

细胞病变效应（CPE）。使用TCID50对收获的材料进行分

析（数据未列出）。关于CPE和病毒滴度，用于感染的最

佳条件是胰酶浓度为12.5 µg/mL，病毒稀释度为1:1000。

根据病毒储液滴度106.9、病毒稀释度1:1000和细胞密度

1.1 × 106细胞/mL计算病毒感染复数（MOI）。 计算的

MOI为0.004。

WAVE生物反应器中的感染

为了研究工艺稳定性和可重复性，在WAV E生物反应

器中，使用3 g/L的Cytodex 1微载体和含0.2% Pluronic

F-68、0.3%大豆蛋白胨和20 mg胰酶抑制剂的OptiPRO-

SFM培养基进行2升规模多个批次的培养。为了获得均匀

和稳定可靠的细胞生长，选择下列摇动条件：12 rpm/5°

摇动24小时贴壁，然后提高到14 rpm/5°直到收获。起

始的Vero细胞密度为0.4×106细胞/mL。微载体在48小时

后接近汇合（图6）。感染参数为：MOI, 0.004; TOI, 48 h;

TOH, 72 h; 温度,37℃。目测检查所有批次的CPE（图7），

并使用TCID50分析病毒滴度（图8）。感染24小时后观察

到早期病变效应（图7A），然后细胞从微载体上脱落，

并在感染72小时后被病毒裂解（图7B）。

A) B)

0 24 48

(×10

6 cel

ls/m

L)

(h)

with supplementswithout supplements

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

A) B)

A) B)

图4.在48小时生长后的细胞形态。A）无添加剂；B）有添加

剂。

图6.Vero细胞在WAVE生物反应器中的微载体接种后的细胞形

态。接种后A）5小时和B）48小时。

图7. WAVE生物反应器中的培养物的病毒感染后的CPE。A）感染

后24小时；B）感染后72小时。

图5.添加剂对细胞生长的影响。

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培养期间血凝素浓度和病毒滴度的动力学

在感染后的不同时间点取样。使用Biacore检测法测定血

凝素（HA）浓度，使用TCID50分析病毒感染滴度。结果如

图9所示。在相对早期（感染后12小时）出现滴度峰值，

而HA浓度的上升会延迟几天。

结果和讨论

本工艺研究的目的是建立一种无动物源性成分的培养工

艺，用于在Vero细胞中生产流感病毒，最终获得了一种易于

放大和适合工业化生产的快速、简单可靠的培养工艺。例

如，使用一次性Cellbag在WAVE生物反应器中的流感病毒的

生产是传统不锈钢生物反应器的一种快速和方便的替代，因

为WAVE很容易安装，不需要清洗，操作灵活成本低。

我们已经能够在无动物源性成分的条件中生长这些培养

物。从制药法规安全的角度来看，在人类疫苗生产中避免

任何动物成分十分重要，而且它对于活的病毒疫苗至关重

要，因为灭活外来病毒的选择十分有限。

本研究确定了用于WAVE生物反应器最适的摇动条件。为

了确定无血清条件下尽可能减少剪切力的最佳条件，测试

了许多参数，通过对微载体上生长的Vero细胞的形态学检

查来评估。发现在微载体上提供均匀的细胞分布十分重

要。

最佳收获时间根据在感染后相对早期达到峰值的病毒滴度

来确定。对于裂解疫苗或亚单位疫苗，病毒滴度不是最

关键的因素，为了获得最大量的病毒抗原（在本例中为

HA），往往有可能在稍后收获。

在本研究中，我们没有研究放大的影响。然而，这里使用

的所有方法和设备目前已经被用于商业上大规模的疫苗生

产。

根据TCID 50值的计算表明，假设总工艺收率为20%，剂

量为107感染性病毒颗粒，从2升培养物中可以生产大约

50,000剂量的单价活流感病毒（LIV）疫苗。因此，一个

100升的WAVE反应器将能够生产2,500,000剂量的单价活

疫苗。

优化后的疫苗生产工艺的简单流程图如图10所示。

1 2 3 4 5 6 7

Tite

r (lo

g 10)

109876543210

图8.WAVE生物反应器中七批不同的2升流感病毒的TCID50值。

图9.培养期间HA和TCID50的动力学。

图10.Vero细胞在WAVE生物反应器中使用Cytodex微载体的流感病毒培养的工作流程图。

72 96 12024 48 144Time post-infection (h)

HA (µg/mL)TCID50 (log10)

12

10

8

6

4

2

0

12

10

8

6

4

2

0

Vero Vero

WAVEA/Solomon

Islands/H1N1 TCID50

参考文献

1. Data file: Cytodex surface microcarriers, GE

Healthcare,18-1060-61, Edition AF (2009).

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4. Reed, L. J. and Müench, H. A simple method of

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493–497 (1938).

5. Application note: Biacore biosensor assays for

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28-9771-57,Edition AB (2010).

©2011 General Electric Company-All rights reserved2011年11月

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