MMaassaarryykkoovvaa uunniivveerrzziittaa vv BBrrnněě –– PPřříírrooddoovvěěddeecckkáá ffaakkuullttaa aa

ČČeesskkáá ssppoolleeččnnoosstt pprroo bbiioocchheemmiiii aa mmoolleekkuulláárrnníí bbiioollooggiiii

pod záštitou

rektora Masarykovy univerzity prof. RNDr. Jiřího Zlatušky, CSc. děkana Přírodovědecké fakulty MU doc. RNDr. Milana Gelnara, CSc.

VVIIIIII.. PPrraaccoovvnníí sseettkkáánníí bbiioocchheemmiikkůů aa mmoolleekkuulláárrnníícchh bbiioollooggůů

Sborník příspěvků

3. – 4. února 2004

Konferenční centrum USKM Vinařská v Brně

PŘEDEŠLÁ PRACOVNÍ SETKÁNÍ BIOCHEMIKŮ A MOLEKULÁRNÍCH BIOLOGŮ

14. červenec 1997 ; 21. leden 1998; 3. únor 1999; 9. únor 2000; 14. únor 2001; 7. únor 2002; 29. leden 2003

http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm

Vážení přátelé, dovolujeme si Vás přivítat na osmém Pracovním setkání biochemiků a molekulárních biologů v Brně. Těší nás Váš vzrůstající zájem o naše pravidelná setkání, na jehož základě jsme jej rozšířili na již dvoudenní a přesunuli jeho pořádání do větších prostor. Doufáme, že se nám společně podařilo vytvořit program, ve kterém si každý z nás najde spoustu nových a zajímavých informací z ostatních zúčastněných pracovišť. Zároveň přejeme hodně úspěšných prezentací I našim doktorandům, stejně jako v minulém roce Česká společnost pro biochemii a molekulární biologii a organizuící Katedra biochemie PřF Masarykovy university se rozhodly finančně ocenit nejlepší prezentace v anglickém jazyce v Sekci mladých. Současně vyhlašujeme veřejnou hlasovací soutěž o nejhezčí/nejlépe prezentované postery na Setkání, jejichž autory oceníme malým dárkem.. Přejeme Vám, abyste z Brna odjížděli spokojeni a my Vás opět mohli přivítat při následujících příležitostech. V neposlední řadě bychom chtěli poděkovat také firmám, bez jejichž účasti bychom nemohli takové setkání uskutečnit a které do značné míry umožňují námi prezentované výsledky realizovat. Vaši organizátoři Michaela Wimmerová, Libuše Trnková, Petr Beneš a Petr Zbořil Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta Kotlářská 2, 611 37 Brno Tel: 541129406, Fax: 541129623 E-mail: michaw@chemi.muni.cz; http://orion.chemi.muni.cz/Setkani/index.htm Obsah sborníku Přednášky 3 – 21 Sekce mladých 22 – 37 Postery 39 – 79 Autorský rejstřík 80 – 81 Prezentace firem 82 – 95

2

ZVÝŠENÁ EXPRESE V

INCREASE IN VIMENTIN EX

Petr Beneš1, Eva Zahradníčk

1Masarykova univerzita v Brně,biolo

2 Masarykova univerzita v Brněproteo

Diferenciace krevních b

morfologických a fyziologických transformovaná onkogenem v-mzabraňuje dokončení monocyticksetrvávají ve stádiu monoblastů. esteru TPA, inhibitorem histonovBM2 se zvýšenou expresí exogeRXR), respektive proteinů Jun, ktpřekonat také působením kyseliny

Při studiu změn proteomk indukci exprese proteinu o mMALDI-TOF byl tento protein idewesternovým přenosem jsme prokBM2 během inkubace s TPA i TSna buňky BM2 se zvýšenou prodJun. Tyto výsledky jsme poimunoflourescencí. Zatímco u kovelmi řídkou síť vimentinových indukovány k makrofágové divimentinových filament nejen v bl

Tyto výsledky ukazují, onkogenem v-myb (BM2) dochákterá souvisí s vytvořením husté súrovně exprese vimentinu je tedy s Tato práce byla sponzorována gtělovýchovy a granty č. 301/03/D0

PŘEDNÁŠKY

IMENTINU JAKO MARKER DIFERENCIACE MONOBLASTŮ BM2 PRESSION AS A MARKER OF BM2 MONOBLAST DIFFERENTIATION

ová1, Hana Konečná2, Zbyněk Zdráhal2, Jan Šmarda1

Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární gie, Kotlářská 2, 611 37 Brno , Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a miky, Kotlářská 2, 611 37 Brno

uněk je doprovázena významnými změnami jejich vlastností. Buněčná linie BM2 je linie kuřecích monoblastů yb viru ptačí myeloblastózy. Exprese tohoto onkogenu é/makrofágové diferenciační dráhy a buňky BM2 proto Tuto blokádu lze překonat např. působením forbolového ých deacetyláz trichostatinem A (TSA). V případě buněk nních jaderných receptorů pro kyselinu retinovou (RAR, eré podporují aktivitu endogenních RAR, lze tuto blokádu retinové (RA). u buněk BM2 navozené TPA jsme zjistili, že dochází olekulové hmotnosti 55 kDa. Hmotnostní spektrometrií ntifikován jako cytoskeletární protein vimentin. Následným ázali, že intracelulární hladina vimentinu stoupá u buněk

A. Nárůst hladiny vimentinu je patrný také po působení RA ukcí jaderných receptorů RAR, RXR, respektive proteinů tvrdili u všech uvedených linií rovněž nepřímou ntrolních nestimulovaných buněk BM2 jsme pozorovali vláken poblíž jádra, u všech buněčných linií, které byly ferenciaci, dochází k výraznému zvýšení hustoty sítě ízkosti jádra, ale především v cytoplazmě. že během diferenciace monoblastů transformovaných

zí k výraznému nárůstu intracelulární hladiny vimentinu, ítě vimentinových filament v buněčné cytoplazmě. Zvýšení polehlivým diferenciačním markerem buněk BM2.

rantem MSM 143100008 Ministerstva školství mládeže a 22 a 301/03/1055 Grantové agentury České republiky.

3

LYMPHOCYTE ACTIVATION RECEPTORS: NEW STRUCTURAL PARADIGMS IN THE GROUP V OF C-TYPE LECTINS

Karel Bezouška

Center for Molecular Interactions and Biotransformation of Drugs, Faculty of Science, Charles University Prague and Institute of Microbiology, Academy of Sciences of Czech Republic, Prague, Czech Republic. E-mail: bezouska@biomed.cas.cz

C-type (calcium-dependent) animal lectins are widely distributed carbohydrate-binding receptors important in many immune recognition processes. These molecules are defined by a small globular protein domain, the carbohydrate-recognition domain, of about 100 amino acids that can be variously positioned into the context of other protein domains in either soluble, type I membrane, or type II membrane proteins. Depending on the details of protein architecture, a total of 7 groups of C-type lectins have been defined: the proteoglycans, the hepatic lectins, the collectins, the selectins, natural lymphocyte receptors, mannose macrophage receptors, and lectins with isolated carbohydrate-recognition domains.

From the point of view of structural biology, our understanding of the structure – function relationships in the C-type lectin family remains fragmentary. By far the best characterized molecule of the whole family is the soluble mannose binding protein studied protein crystallography. This protein binds to calcium ions in the ligand-binding domain, and the binding of calcium is intimately linked to the recognition of carbohydrates [1,2].

Receptors of natural killer lymphocytes have been also structurally characterized. Since this group is evolutionarily most divergent, interesting structural paradigms have been observed with regard to binding of calcium, carbohydrates, and other ligands. In NKR-P1, calcxium may not be easily removed by chelating agents because of its unique chemical nature [3]. In CD69, binding of calcium causes a structural shift in amino acids important for binding of carbohydrates [4]. Structural studies have also allowed to understand an interesting preference of these receptors for either linear (NKR-P1, Fig.1) or branched (CD69, Fig.2) sugars. Remodeling of the binding surface in CD94 or Ly-49 opens the way for specific recognition of protein and peptide ligands, which seems to be characteristic for entire group.

1. Drickamer K. (1992) Nature 360, 183. 2. Weis W.I. (1996) Annu. Rev. Biochem. 65, 441. 3. Bezouška K. (1994) JBC 269, 16952. 4. Pavlíček J. (2003) Biochemistry 42, 9295. Supported by Ministry of Education of Czech Republic (MSM113100001), by Institutional Research Concept AVOZ5020903, and by Volkswagen Foundation (project I/74 679).

4

Fig.1 Fig.2

Binding of carbohydrates by two activation receptors of lymphocytes, NKR-P1 (Fig.1) and CD69 (Fig.2). NKR-P1 binds chitotetraose, CD69 binds GlcNAc 1,2 and 3

5

PROTEOMOVÁ ANALÝZA BAKTERIE PARACOCCUS DENITRIFICANS A KONSTRUKCE 2-DE DATABÁZE BÍLKOVIN

PROTEOME STUDY ON BACTERIUM PARACOCCUS DENITRIFICANS AND CONSTRUCTION OF 2-DE PROTEIN DATABASE

Pavel Bouchal, Petra Přecechtělová*, Zbyněk Zdráhal** and Igor Kučera*

*Department of Biochemistry, **Laboratory of Mass Spectrometry of Biomolecules, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic

Paracoccus denitrificans is a non-fermentative, facultatively autotrophic soil

bacterium often studied in the field of bioenergetics, particularly due to resemblance of its aerobic respiratory chain to that of mitochondria. Also an aspect of a great nutritional adaptability was discovered, related to the ability of exploiting various electron donors and electron acceptors for maintenance and growth. To discuss mechanisms underlying regulation of gene expression by growth conditions, a high-throughput proteome mapping is one of the most effective tools to-date.

For 2-DE gel analysis of whole-cell extract and its membrane fraction, newly optimized methods using isoelectric focusation with immobilized pH gradient in the first dimension and denaturing SDS-PAGE in the second dimension were used. Using this approach, more than 800 protein spots of total cell extract and membrane fraction were detected in the range pI 3-10 and Mr 15-100 kDa.

In order to follow the dynamics of protein expression under different growth conditions, we compared complex protein composition of whole cells of P. denitrificans cultivated (i) aerobically, (ii) anaerobically with nitrate (as electron acceptor), (iii) anaerobically with nitrite, (iv) anaerobically with nitrous oxide. We also observed effect of azide on protein expression, which is known to induce some denitrification enzymes under aerobic conditions. For this reason, we compared protein composition of whole cells as well as its membrane fraction grown (i) aerobically, (ii) aerobically with addition of 0.4 mM sodium azide, (iii) anaerobically with nitrate, (iv) anaerobically with nitrite (whole cells only), (v) anaerobically with nitrite and addition of 0.4 mM sodium azide (whole cells only). By combined statistical and quantitative evaluation of set 30 large format 2-DE gels, we followed alterations in the quantity of protein spots. We detected significant differences related to the growth on various terminal electron acceptors and sodium azide; the results will be presented and discussed.

49 protein spots have been submitted for analysis by peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF MS. However, the genome of P denitrificans have not been completely sequenced yet and, currently, information about only 98+126 proteins is available from Swiss-Prot/TrEMBL database. Due to this fact, we were able to identify only 8 proteins up to-date. Among them, nitrite reductase and succinate dehydrogenase are key enzymes in P. denitrificans metabolism.

We also compared expression data of nitrite reductase obtained by proteome analysis with measurement of nitrite reductase enzyme activity. These data were in a good agreement.

The quantitative data and protein maps are kept in a database in PDQUEST format. This database is going to become web-accessible.

This work was supported by grants No. 203/01/1589 from the Grant Agency of Czech

Republic and No. 740/2002 from Czech Ministry of Education.

6

MOŽNOSTI ANALÝZY EXPANZE TRINUKLEOTIDOVÝCH OPAKOVÁNÍ POMOCÍ ELEKTROCHEMICKÝCH SENZORŮ

POSSIBILITIES OF ANALYSIS OF TRINUCLEOTIDE REPEAT EXPANSION BY MEANS OF ELECTROCHEMICAL SENSORS

Miroslav Fojta, Luděk Havran, Marie Vojtíšková, Emil Paleček Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, 612 65 Brno; fojta@ibp.cz

Trinukleotidová opakování (trinucleotide repeat sequences, TRS) se běžně vyskytují

v lidském genomu (tzv. „mikrosatelity“). Tyto sekvence jsou přirozeně náchylné k expanzi (prodlužování jejich délky). S expanzí určitých TRS souvisí řada dědičných neurodegenerativních onemocnění, včetně myotonické dystrofie (expanze tripletů CTG), Huntingtonovy chorey (CAG), syndromu fragilního chromozomu X (CGG) nebo Friedrichovy ataxie (GAA)1, 2. Analýza délky příslušných TRS je tudíž důležitých kritériem při diagnostice těchto chorob, včetně diagnostiky na prenatální či prekoncepční úrovni. Obvykle využívané metody jsou založené na Southernově přenosu DNA a hybridizaci se sondou komplementární k jednomu řetězci TRS, nebo na PCR amplifikaci genomového lokusu obsahujícího TRS a stanovní délky amplikonu pomocí agarózové elektroforézy2.

V oblasti vývoje metod, které by se mohly v blízké budoucnosti uplatnit v DNA diagnostice, je značná pozornost věnována elektrochemickým biosenzorům3. Tato zařízení jsou obecně méně nákladná než např. optické analyzátory, jsou vysoce citlivá, poskytují rychlou odpověď a v principu umožňují vysoce paralelní analýzu. V nedávné době byly elektrochemické metody využity i při detekci expanze TRS. Thorp a kol. navrhli metodu založenou na měření elektrokatalytického signálu guaninových zbytků v sekvenci CTG.CAG imobilizované na povrchu elektrody4. Délka TRS byla vypočtena z velikosti měřeného signálu vztaženého na počet imobilizovaných molekul, které byly koncově radioaktivně značeny.

V naší laboratoři jsme navrhli tzv. dvoupovrchovou metodu elektrochemické analýzy hybridizace DNA, založenou na hybridizaci DNA na povrchu magnetických mikročástic a následné elektrochemické detekci. Tento postup jsme nedávno využili pro stanovení délky TRS GAA.TTC, spojené s Friedrichovou ataxií5. Naše metoda, která dobře pracuje i při analýze „skutečných“ klinických vzorků, zahrnuje PCR amplifikaci příslušného genomového lokusu, modifikaci denaturovaného amplikonu komplexem OsO4, 2,2’-bipyridin (Os,bipy, kovalentně modifikující pyrimidinové, ale nikoli purinové baze), zachycení cílového řetězce obsahujícího (GAA)n sekvenci na magnetických kuličkách, a jeho hybridizaci se sondou (TTC)12 značenou biotinem. Na tuto sondu se poté naváže streptavidin značený alkalickou fosfatázou, katalyzující přeměnu 1-naftylfosfátu na 1-naftol, který je stanoven elektrochemicky. Čím je délka TRS větší, tím větší počet molekul sondy hybridizuje s jednou molekulou cílové DNA a tím větší je měřený signál, který je normalizován na počet zachycených molekul cílové DNA. Ten je zjištěn měřením signálu Os,bipy, navázaného na cílový řetězec v sekvencích lemujících TRS. V poslední době jsme ukázali, že tato metoda pracuje dobře i v „jednopovrchovém“ uspořádání, kdy jak hybridizace DNA, tak měření signálu probíhá na povrchu grafitové elektrody. Práce byla financována grantem GAAV č. A4004402.

Literatura: (1) Sutherland, G. R.; Richards, R. I. Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92, 3636-3641. (2) Campuzano, V.; et al. Science 1996, 271, 1423-1427. (3) Palecek, E.; Fojta, M. Anal. Chem. 2001, 73, 74A-83A. (4) Yang, I. V.; Thorp, H. H. Anal Chem 2001, 73, 5316-5322. (5) Fojta, M.; Havran, L.; Vojtíšková, M.; Palecek, E. submitted 2004

7

INTERAKCE UMLČENÉHO TRANSGENNÍHO LOKUSU S HOMOLOGNÍM LOKUSEM IN TRANS

IN TRANS INTERACTION OF SILENCED TRANSGENIC LOCUS WITH A HOMOLOGOUS LOCUS

Miloslava Fojtová, Aleš Kovařík

Laboratoř molekulární epigenetiky, Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno

Transgenní organismy jsou významným nástrojem studia regulace základních

molekulárně-biologických dějů. Mechanismus regulace exprese genů pomocí malých molekul RNA, který se ukázal být obecným a zásadním fenoménem, byl odhalen právě pomocí experimentů prováděných na modelovém transgenním organismu (červ Caenorhabditis elegans s vneseným genem pro syntézu GFP, „green fluorescein protein“ 1). Je prokázáno, že analogické principy, kterými je regulována exprese vnesených genů a genových rodin, platí i pro geny endogenní.

Transgenní rostliny Nicotiana tabacum nesou kazetu obsahující reportérový gen pro bakteriální neomycinfosfotransferázu II (nptII) pod kontrolou silného virového promotoru 35S. V rostlině HeLo2, která intenzívně exprimuje gen nptII, je tato kazeta přítomna jako jednokopiová inzerce (lokus 2). V rostlině HeLo1 je transgen uspořádán jako obrácená repetice (lokus 1) a je umlčen na posttranskripční úrovni. DNA genu nptII je u této linie metylována na 3´ konci přepisované části. Dlouhodobou kultivací HeLo1 v tkáňové kultuře došlo ke změně epigenetického stavu transgenního lokusu: výrazné de novo metylaci promotoru a zároveň k poklesu metylace v nesymetrickém sekvenčním motivu v přepisované oblasti genu nptII. S těmito změnami byla spojena i změna mechanismu umlčení transgenu z posttranskripčního na transkripční 2. Epimutovaný lokus 1 byl označen 1E.

Z předchozích experimentů je známo, že posttranskripčně umlčený lokus 1 je schopen interakce s homologním lokusem ve smyslu navození jeho metylace a umlčení 3. Zajímalo nás, jestli bude mít tuto schopnost i transkripčně umlčený lokus 1E. Analýza hybridních rostlin obsahujících lokus 2 a lokus 1E ukázala, že epimutovaný lokus 1 není schopen komunikace s homologním lokusem 2: nebyla detekována metylace lokusu 2 ani v genu nptII ani v oblasti promotoru 35S. Expresní analýza genu nptII na úrovni RNA (Northern blot) a proteinu (NPTII ELISA) prokázala hladinu transkriptu nptII, respektive proteinu NPTII, na úrovni řádově srovnatelné s neumlčenou rostlinou HeLo2. Na základě těchto výsledků je možno usuzovat, že v tomto transgenním systému je umlčovací potence transgenního lokusu spojená s jeho aktivní transkripcí. Práce je financována grantem GAČR 521/04/0775. Literatura: 1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., Mello, C.C. Nature 1998,

391, 806-811. 2. Fojtová, M., Van Houdt, H., Depicker, A., Kovařík, A. Plant Physiol. 2003, 133, 1-11. 3. Van Houdt, H., Kovařík, A., Van Montagu, M., Depicker, A. FEBS Lett. 2000, 467, 41-

46.

8

ELEKTROAKTIVITA AVIDINU A STREPTAVIDINU ELECTROACTIVITY OF AVIDIN AND STREPTAVIDIN

Luděk Havran, Sabina Billová, Emil Paleček

Biofyzikální ústav AVČR, Královopolská 135, Brno raven@ibp.cz

Avidin a streptavidin jsou proteiny, které se vyznačují velmi silnou afinitou k nízkomolekulárnímu vitamínu biotinu [1]. Oba proteiny jsou strukturně velmi podobné. Streptavidin, ale na rozdíl od avidinu, nemá ve svém řetězci aminokyseliny obsahující síru. Tento fakt významným způsobem ovlivňuje jeho elektrochemické chování. Velmi silné interakce (strept)avidin – biotin se často využívá v biotechnologiích. Biotin, který je kovalentně zachycen na zkoumanou molekulu, se váže na (strept)avidin nesoucí reaktivní značku. V závislosti na typu značky je pak zvolena metoda detekce. V minulosti byla za použití elektrochemických metod studována interakce avidinu s biotinem předavším na uhlíkových elektrodách [2-4]. V těchto pracích je interakce detekována za použití biotinu modifikovaného redox-aktivními značkami. Podle literatury [3, 4] je avidin pokládán za elektroinaktivní. Existuje pouze jedna práce popisující elektrochemické chování avidinu a streptavidinu na rtuťových elektrodách [5]. V této práci je signál avidinu přisuzován redukci S-S vazby. Zkoumali jsme elektroaktivitu avidinu a streptavidinu na rtuťových a uhlíkových elektrodách. Zjistili jsme, že oba proteiny poskytují na uhlíkových elektrodách signály odpovídající oxidaci zbytků tyrosinu a tryptofanu. Na rtuťových elektrodách avidin dává pík redukce sloučeniny síra-rtuť a dále pak signály katalytického vylučování vodíku tzv. Brdičkovu reakci a pík H [6]. Streptavidin v důsledku nepřítomnosti síru obsahujících aminokyselin poskytuje pouze pík H. Dále jsme zjistili, že u avidinu dochází v důsledku jeho vazby k biotinu ke změnám všech pozorovaných signálů. Byly také zkoumány adsorpčně/desorpční vlastnosti avidinu a jeho komplexu s biotinem. V důsledku vazby biotinu je míra adsorpce komplexu avidin-biotin k povrchu elektrody menší než v případě samotného avidinu. Ze získaných výsledků vyplývá, že elektrochemické metody lze úspěšně použít pro monitorování vazby biotinu - avidin. Práce vznikla za podpory grantu KJB4004302 Grantové agentury AVČR. [1] N.M. Green, in Methods in Enzymology, (Eds.: M. W. E. E. A. Bayer), Academic Press, London, 1990, 51. [2] D. Athey, M. Ball, C.J. McNeil, Ann. Clin. Biochem. 1993, 30, 570. [3] K. Sugawara, S. Tanaka, H. Nakamura, Bioelectrochem. Bioenerg. 1994, 33, 205. [4] K. Sugawara, Y. Yamauchi, S. Hoshi, K. Akatsuka, F. Yamamoto, S. Tanaka, H. Nakamura, Bioelectrochem. Bioenerg. 1996, 41, 167. [5] E. Buckley, J.M.F. Alvarez, M.R. Smyth, R. O'Kennedy, Electroanalysis 1991, 3, 43. [6] M. Tomschik, L. Havran, M. Fojta, E. Palecek, Electroanalysis 1998, 10, 403.

9

AROMATÁZA – KLÍČOVÝ ENZYM STEROIDOGENESE AROMATASE – KEY ENZYME OF STEROIDOGENESIS

1Petr Hodek, 1Tomáš Koblas, 2Pavel Trefil 1Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40

Prague 2, The Czech Republic, hodek@natur.cuni.cz 2BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs, a. s., Pohoří

Chotouň, CZ-254 49 Jílové, The Czech Republic, trefil@bri.cz

Cytochrome P450 19, aromatase (CYP19), is an unique enzyme which builds a phenolic ring A of all estrogens, female sex hormones. This enzyme is present in ovary, placenta, testis, prostata tissues and in much lower levels in adipose and brain tissue. Since estrogens are known cell proliferators, they are frequently expressed in tumors of e.g. breast. Moreover, some metabolites of estrogens (catecholes) are also carcinogens. Inhibition of aromatase is of a particular interest in prophylaxis and/or treatment of various cancer diseases. The modulation of CYP19 activity might significantly change the estrone/testosterone ratio and consequently change the experimental animal sex phenotype. In case of e.g. chicken, female masculinization, resulting in lowered body fat and increased volume of muscles, might be important in the respect of the chicken meat production.

Natural plant compounds, flavonoids, are potential CYP19 inhibitors. Hence, synthetic flavonoids, 7,8-benzoflavone (ANF) and its thio-analogue (SANF), were tested in vivo as food additive for hatched animals. Resulting changes of CYP expression, steroid hormone levels, body composition, and chicken behavior were monitored. Application of ANF within the fattening period of broiler chickens resulted in statistically significant difference (P<0.01) in the weight of the testis (4.7g) in comparison to controls (1.2g). Moreover, spermatogenesis started very early (the 10th week) - 4 weeks earlier than in the control group. Ovary of treated hens was heavier (P<0.05) in comparison to control groups and the beginning of their laying period was at least one week earlier comparing to the control group.

However, much less is known about their metabolism. In the model microsomal systém, 5,6-dihydrodiol, 7,8-dihydrodiol and 5,6-epoxid of ANF were determined as the major ANF metabolites. SANF is not metabolized into any hydroxy-derivatives in the microsomal system used. This compound is converted to ANF first and then it undergoes its regular metabolism.

In addition, an administration of ANF or SANF results also in induction of different CYPs in various organs (liver, column, testis). It is clear that flavonoids might enhance CYP-mediated activation of carcinogens and/or metabolism of drugs. Thus, intake of food additives and herb extracts containing flavonoids has to be considered with caution.

The work was supported by the grant MSM-113100001 from The Czech Ministry of Education.

10

SECRETED ASPARTIC PROTEINASES OF CANDIDA PARAPSILOSIS: ACTIVATION AND SPECIFICITY OF TWO ISOENZYMES

SEKRETOVANÉ ASPARTÁTOVÉ PROTEÁZY KVASINKY CANDIDA PARAPSILOSIS: AKTIVACE A SPECIFITA DVOU ISOENZYMŮ

Jiří Dostál, Michaela Merkerová, Iva Pichová and Olga Hrušková-Heidingsfeldová Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Flemingovo nám.2, Praha 6, 166 10

Candida parapsilosis is an opportunistic pathogen that causes infections in immunocompromised individuals. The pathogenic Candida species produce secreted aspartic proteinases (Saps), which play an important role in Candida infectivity. Three genes coding for Saps have been found in C. parapsilosis so far. Two of them have been studied before (1), but only the gene product of SAPP1 has been characterized on the enzymological level: the Sapp1p isoenzyme was isolated from C. parapsilosis culture supernatants and its substrate specificity was studied (2). However, the mechanism of Sapp1p activation remained unclear. Controversial results have been published with respect to SAPP2 gene product. SAPP2 was believed to code for a proteinase that was expressed on a very low level or under not identified conditions. According to an alternative hypothesis, SAPP2 was considered to be a pseudogene (1,3,4). To address these problems, the Sapp1p and Sapp2p precursors were expressed in E. coli, purified to homogeneity and stored at pH 7.5. The Sapp1p precursor was autocatalytically processed within 30 minutes following the transfer to acidic pH, yielding an active enzyme. However, the cleavage occurred one residue downstream from the N-terminus that has been identified using an authentic Sapp1p (= the proteinase isolated from C. parapsilosis culture supernatant): D↓SISL... A synthetic peptide derived from the processing site was cleaved by Sapp1p at both sites: ...KR↓D↓SISL. These data suggest that Sapp1p can be autocatalytically processed in a pepsinogen-like manner but there may be also another strategy involving a processing proteinase that recognizes the Arg-Lys sequence. Autocatalytical processing of Sapp2p precursor in acidic pH proceeded very slowly, up to three days. The cleavage occurred eight residues upstream from the expected site. Therefore, precursor cleavage was tested using trypsin that was chosen as a substitute for a serine type processing proteinase. Trypsin cleaved the Sapp2p precursor at the expected site: KR↓SSPSS...Proteolytic activity of the protein processed by trypsin was higher than that of the autocatalytically processed one. The resulting Sapp2p differed substantially from Sapp1p in the substrate specificity, showing no preference for aromatic residues adjacent to scissile bonds. Peptide substrates designed for pepsin and were cleaved by Sapp2p at different sites and on lower rate. Despite of the sequence similarity, the Sapp1p and Sapp2p isoenzymes differ in the mode of activation and in the substrate specificity. 1. De Viragh, P.A., et al. (1993) J.Gen.Microbiol. 139, 335-342. 2. Pichová, I., et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268, 2669-2677. 3. Fusek, M., et al. (1993) FEBS Lett. 327, 108-112. 4. Hrušková-Heidingsfeldová, O., et al. (2001) Collect. Czech. Chem. Commun. 66, 1707-

1719. Supported by IGA MZ NI/6485-3

11

REPARACE PLASMIDOVÉ DNA pUC19 V BUŇKÁCH E. COLI PO PUSOBENÍ CIS-PLATINY

M. Hyršová1, E. Janovská2, V. Brabec2, M. Vojtíšková 2

1 Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta MU v Brně 2 Biofyzikální ústav AV ČR, 61265 Brno

Úspěšné využití ciplatiny v chemoterapii nádorových onemocnění může být omezeno vyvolanou nebo vnitřní resistencí buňky. Cytotoxicita cisplatiny se odvíjí od její schopnosti vytvářet kovalentní DNA adukty , přitom tyto adukty mohou být z DNA odstraněny především nukleotidovou excisní reparací (NER). NER je tudíž považován za centrálního hráče v „úspěchu“ cisplatinové cytotoxicity jak v eukaryontních, tak i v prokaryotních buňkách, kde se zejména reparace účastní komplex uvrABC proteinů. Pro studium reparačních mechanismů v buňce po působení cisplatiny bylo využito plasmidové DNA pUC19 transformované do baterie isogenetických kmenů E.coli s normální nebo DNA defektní reparační kapacitou, jednoduchých uvr A a dvojitých mutant uvrA, recA kmene WP2 . Transformované kmeny WP2 (wt) a WP2 (uvrA) nesoucí plasmid pUC19 vykazovaly podstatně výšší citlivost vůči působení 10um cisplatiny (20 hod, 37o C) ve srovnání s původními kmeny. U vzorků plasmidové DNA pUC19 izolovaných z isogenetických kmenů E. coli po modifikaci cisplatinou za podmínek in situ a in vivo nebyla prokázána inhibice štěpení BamHI, svědčící o přítomnosti intrařetězového GG aduktu platiny v této sekvenci, na rozdíl od modifikované DNA pUC19 in vitro. Další typ cisplatinového aduktu, vytvoření meziřetězové příčné vazby (ICL) na DNA , byl prokázán denaturační alkalickou agarózovou elektoroforézou a to na modifikovaných vzorcích DNA pUC19 za rozdílných podmínek, což s velkou pravděpodobností svědčí o obtížnosti odstranění ICL lézí pro buněčné reparační systémy.

HYBRIDNÍ MOLEKULY KOLICINŮ U/Y A JEJICH INTERAKCE S IMUNITNÍM PROTEINEM

HYBRID COLICINS U/Y AND THEIR INTERACTION WITH COGNATE IMMUNITY PROTEINS

Magda Janalíková, David Šmajs

Biologický ústav LF MU, Joštova 10, 662 43 Brno Přes sekvenční podobnost kolicinů U a Y nejsou producenti kolicinů U a Y zkříženě imunní. Pro studium protein-proteinových interakcí mezi kolicinem a jeho imunitním proteinem jsme zkonstruovali sedm hybridních genů pro kolicin U/Y. Plazmidy nesoucí tyto geny byly transformovány do E. coli a z těchto buněk byly následně izolovány hybridní koliciny. Zkoumali jsme jejich letální účinek na buňky transformované plazmidem nesoucí gen pro imunitní protein kolicinu U a kolicinu Y. Buňky bez imunitního proteinu sloužily jako kontrola. Zjistili jsme, že aminokyselinové zbytky kolicinů U a Y, důležité pro interakci s jejich imunitními proteiny, jsou rozdílné. Pro interakci kolicinu U s jeho imunitním proteinem je klíčový aminokyselinový zbytek G580. Navíc v rekognici imunitního proteinu kolicinem U hraje významnou roli aminokyselinový zbytek F576. Třetí interakční místo je distálně od SpeI místa kolicinového genu (v 34 aminokyselinách na C-konci - z nichž je u kolicinu U a Y 12 rozdílných). Oproti tomu u kolicinu Y jsou pro tutéž interakci významné aminokyselinové zbytky V590 a Y586. Menší význam pro interakci kolicinu Y s imunitním proteinem má také

12

aminokyselinový zbytek A594 a/nebo A595. I zde se předpokládá vliv interakčního místa v C-terminálních 34 aminokyselinách.

CENTRÁLNÍ LABORATOŘ SPECIÁLNÍCH TECHNIK NA MASARYKOVĚ UNIVERZITĚ

CORE FACILITY AT MASARYK UNIVERSITY

Hana Konečná, Eliška Nejedlá, Eva Paděrová, Zbyněk Zdráhal, Břetislav Brzobohatý Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta,

Laboratoř funkční genomiky a proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno Laboratoř funkční genomiky a proteomiky (FGP) je jednou ze čtyř základních složek celku ILBIT (Integrované laboratoře biomedicínských technologií), v němž má být současně s vlastním výzkumným programem soustředěna špičková instrumentace a kvalifikovaný servis zajišťující práce na dalších vědeckých projektech MU a spolupracujících institucích v rámci budovaného univerzitního kampusu v Brně-Bohunicích. Univerzita tak vytváří intelektuální a technickou infrastrukturu nezbytnou k řešení komplexních výzkumných projektů. Myšlenka vytvoření pracoviště typu core facility, které zprostředkovává akademické komunitě přístup k pokročilým technologiím prostřednictvím sdílení finančně náročné instrumentace a její kvalifikované obsluhy, je na MU systematicky rozvíjena od roku 1996, kdy v rámci Laboratoře molekulární fyziologie rostlin vznikla Centrální laboratoř speciálních technik molekulární biologie (CL). V současné době poskytuje CL na objednávku syntézu a purifikaci oligonukleotidů a rovněž kompletní konzultační činnost spojenou s navrhováním, purifikací a použitím oligonukleotidů. Na genetických analyzátorech provádí sekvenování DNA, analýzu fragmentů DNA a zajišťuje interpretaci sekvencí. Disponuje separačními technikami, jako je vysokotlaká, nízkotlaká a perfúzní chromatografie a jednorozměrná a dvourozměrná gelová elektroforéza. FGP personálně zajišťuje chod Laboratoře hmotnostní spektrometrie biomolekul (LMSB), která je součástí Laboratoře pro analýzu proteomu, a je vybavena LC-MS a MALDI-TOF MS instrumentací. Hlavním předmětem činnosti LMSB je analýza a identifikace proteinů. Jedním z hlavních poslání CL je poskytovat pomoc při zavádění nových experimentálních přístupů (semináře, exkurze, praktická cvičení, konzultace). CL umožňuje diplomantům a studentům doktorského studia proniknout do hloubky studované problematiky s využitím pokročilé instrumentace a pod vedením zkušených specialistů. V rámci výuky předmětů Kurs základů genomiky a Kurs základů proteomiky, které jsou nabízeny studentům magisterského a doktorského studia Laboratoří funkční genomiky a proteomiky, CL zpřístupňuje studentům špičkovou instrumentaci v oblasti genomiky a proteomiky. Všechny detailní informace obdrží zájemci na http://www.sci.muni.cz/LMFR/. Centrální laboratoř je řádným členem Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF), mezinárodní organizace sdružující obdobná univerzitní pracoviště. CL byla vybavena z prostředků MŠMT Posílení výzkumu na vysokých školách (projekt VS96096). LMSB byla vybavena z prostředků Přírodovědecké fakulty MU (FRIM) a prostředky na další dovybavení byly získány z FRVŠ 796/2003 a MSM 143100005. Obě laboratoře jsou podporovány z grantového projektu MSM 143100008.

13

ROZDÍLY GENOMŮ BLÍZCE PŘÍBUZNÝCH TREPONEM A JEJICH SPECIFICKÁ

DETEKCE GENOME DIFFERENCES OF CLOSELY RELATED TREPONEMES AND THEIR

SPECIFIC DETECTION

Petra Matějková1, David Šmajs1, Steven J. Norris2 a George M. Weinstock3

1Biologický ústav LF MU v Brně, Joštova 10, Brno 662 43, Česká republika 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Texas, Houston Medical

School, 6431 Fannin Street, Houston TX 77030, USA 3Human Genome Sequencing Centre, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Alkek

N1519, Houston, TX 77030, USA Druh Treponema pallidum zahrnuje 3 pro člověka patogenní poddruhy. Tyto poddruhy – pallidum, pertenue a endemicum - způsobují přes velice blízkou sekvenční příbuznost onemocnění s odlišnou klinickou manifestací. Jedná se o syfilis, yaws a endemickou syfilis. V současnosti používaná serologická diagnostika nedokáže zachytit časná stadia treponemální infekce ani odlišit jednotlivá treponemální onemocnění navzájem. Předpokládaná vysoká sekvenční příbuznost genomů patogenních poddruhů T. pallidum je přitom předurčuje ke komparativním genomickým studiím k indentifikaci kontrétních sekvenčních rozdílů. Těch lze využít pro specifickou diagnostiku jednotlivých treponemálních patogenů a zvýšení diagnostické citlivosti. Technikou DNA microarray hybridizací nebyly identifikovány výrazné rozdíly v genomové struktuře poddruhů pallidum a pertenue (kmenů Gauthier, Samoan D a CDC-2). Verifikačními sekvenacemi byly odhaleny výhradně jednonukleotidové záměny. Nalezli jsme celkem 19 jednonukleotidových polymorfismů (SNP), z nichž 12 znamená záměnu aminokyseliny v polypeptidovém řetězci treponemálních proteinů. Charakteristické rozložení jednonukleotidových záměn mezi kmeny poddruhu pertenue umožnilo navržení specifické diagnostiky. Tato diagnostika je založena na PCR amplifikaci, jejíž diferenciační podmínkou je přítomnost komplementárního nukleotidu na 3´-konci amplifikačního primeru. V současné době je k dispozici protokol k detekci SNP319-241 (záměna adeninu za cytosin v pozici 241 genu kódujícího domnělý membránový lipoprotein TmpC, TP0319) odlišující kmen T. pallidum subsp. pallidum Nichols od kmenů poddruhu pertenue. Mezi kmeny poddruhu pertenue lze odlišit kmen CDC-2 detekcí SNP806-578 specifickou pro tento kmen; kmen Gauthier lze od ostatních odlišit detekcí SNP319-396. Tyto diagnostické postupy budou testovány na souboru seropozitivních syfilitických ser a bude stanovena jejich reálná diagnostická účinnost.

Podporováno grantem IGA MZ ČR č. NF NI/7351-3.

VYUŽITÍ MACROARRAY PRO STUDIUM MUTOVANÉHO PROTEINU P53

Petr Müller1, Roman Hrstka1, Miroslav Strnad2, Bořivoj Vojtěšek 1

1 Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, Brno 65653 2 Laboratoř růstových regulátoru, PřF UP, Šlechtitelů 11, Olomouc 783 71

Protein p53 je nádorový supresor fungující jako transkripční faktor. Při genotoxickým

stresu dochází v buňce k jeho aktivaci, váže se na DNA a spouští transkripci genů

14

zodpovědných za zástavu buněčného cyklu i apoptozu. Inaktivace p53 bodovou mutací se tak stává zásadním krokem při maligní transformaci buňky. Velké procento bodových mutací v DNA vazebné doméně p53 vede k nestabilitě konformace proteinu. Tyto mutace jsou často teplotně senzitivní a stávají se tak vhodným cílem pro terapii založené na jejich reaktivaci. V předchozích pracích jsme prokázali teplotně senzitivní charakter mutovaného proteinu p53 285Lys v buňkách nádorové linie karcinomu prsu BT474. Prokázali jsme změnu konformace mutanta při přechodu do 32°C a obnovení jeho DNA vazebné schopnosti. Rovněž jsme potvrdili obnovení exprese p53-regulovaných proteinů p21 a MDM2, která byla dále zvýšena při použití Cdk inhibitoru Roscovitinu. Cílem této práce bylo zjistit, zda reaktivace mutovaného p53 285Lys vede k obnovení transaktivace na všech promotorech genů regulovaných pomocí p53. Pro tento experiment byla vybrána macroarray analyzující hladinu mRNA genů, které buď regulují aktivitu p53 (upstream) a nebo jsou pomocí p53 exprimovány (dowstream).

Nádorová linie BT474 byla vystavena jednak teplotě 37°C (kontrola) , nebo 24 hodin teplotě 32°C. Současně byly buňky ovlivněny 20uM Roscovitinem silně stabilizujícím hladinu p53 v buňce. Z výsledků vyplývá, že mutovaný protein p53 reaktivovaný při teplotě 32°C a stabilizovaný pomocí Cdk inhibitoru Roscovitinu je schopný mnohonásobně zvýšit expresi proteinů vedoucích k zástavě buněčného cyklu či k reparaci DNA. Reaktivace však nevedla k dostatečnému zvýšení genů regulujících apoptózu. Pomocí této metody byla rovněž detekována nepřiměřeně vysoká exprese silně proapoptotického genu PUMA. Exprese tohoto genu v našem experimentu nevykazovala závislost na reaktivaci mutovaného p53 a proto může tento výsledek vést k podezření na defekt v tomto genu ve smyslu delece, translokace mutace apod.

Tato práce byla podporována granty: GA-ČR 301/02/0831, MŠM 153100008 a VZMZ 00020980501

METABOLISM OF IODINE IN THE RAT IS MARKEDLY AFFECTED BY HIGH BROMIDE INTAKE

Stanislav Pavelka

Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 611 37 Brno and Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, 142 20 Prague 4

Goitrogenic effects of excessive bromide in adult male and female rats are summarized. In addition to the effects on the rat thyroid, we also survey interferences of exogenous bromide with the whole-body metabolism of iodine, as documented in a series of our recent papers [1-9]. We suggest that high levels of bromide in the organism of experimental animals can influence their iodine metabolism in two parallel ways: by a decrease in iodide accumulation in the thyroid, and by a rise in iodide excretion by kidneys. By accelerating the renal excretion of iodide, excessive bromide can also influence the pool of exchangeable iodide in the thyroid. Moreover, our recent results concerning the influence of high bromide intake in the lactating rat dam on iodine and bromide transfer to the sucklings, and the impact of seriously decreased iodine content and increased bromide concentration in mother’s milk on the young, are discussed. We must state, however, that the virtue of the toxic effects of excessive bromide on the thyroid gland and its interference with the biosynthesis of thyroid hormones, as well as the exact mechanism of bromide interference with postnatal developmental processes have not been so far elucidated.

15

References [1] Pavelka S. (2004) In: Elements and Their Compounds in the Environment. Occurence, Analysis

and Biological Relevance, 2nd ed. (Merian E. et al., eds.). Wiley-VCH Verlag, Weinheim, Vol. 3, Part IV, pp.

[2] Pavelka S. (2004) Physiol. Res., submitted.[3] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J., Švandová E. (2000a) Biol. Trace Elem. Res. 76,

57-66. [4] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2000b) Biol. Trace Elem. Res. 76, 67-74. [5] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2001a) Biol. Trace Elem. Res. 82, 125-132. [6] Pavelka S., Babický A., Vobecký M., Lener J. (2001b) Biol. Trace Elem. Res. 82, 133-142. [7] Pavelka S., Babický A., Lener J., Vobecký M. (2002) Food Chem. Toxicol. 40, 1041-1045. [8] Vobecký M., Babický A., Pavelka S., Lener J. (2000) J. Trace Microprobe Tech. 18, 467-473. [9] Vobecký M., Babický A., Pavelka S. (2003) Food Chem. Toxicol., submitted.

VYUŽITÍ siRNA A MICROARRAYS V ONKOLOGII APPLICATION OF siRNA AND MICROARRAY TECHNOLOGIES

IN CANCER RESEARCH

Šárka Pospíšilová, Boris Tichý, Soňa Štruncová, Romana Borská a Jiří Mayer Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika, FN Brno,

Černopolní 9, 625 00 Brno

Nové možnosti onkologické diagnostiky a protinádorové terapie jsou stále více spojovány s rozvojem molekulárně biologických technologií. V poslední době se v řadě oblastí onkologického výzkumu začínají uplatňovat DNA čipy (microarrays), které umožní detailní charakterizaci nádorové tkáně z hlediska míry genové exprese a porovnání nádorového expresního profilu s tkání zdravou. Významným pomocníkem při studiu funkce jednotlivých genů hrajících významnou úlohu při maligní transformaci buňky a jejich vlivu na regulaci buněčného cyklu je využití jevu RNA interference. RNAi zprostředkovaná dvouřetězcovými molekulami RNA byla popsána jako mechanismus ochrany buňky před buněčnými parazity a jako mechanismus post-transkripčního utlumování genové exprese (gene silencing). siRNA (small interfering RNA), vznikající z dlouhých dsRNA molekul působením enzymu DICER, se stávají součástí komplexu RISC (RNA-induced silencing complex), který s vysokou specificitou váže cílové komplementární mRNA. Striktního požadavku na komplementaritu lze úspěšně využívat k rozpoznání a odlišení mutantních nebo chimerních mRNA molekul a specificky je inaktivovat. siRNA molekuly tak mohou být cíleny proti nejčastějším genetickým změnám navozujícím maligní transformaci buněk jako jsou genové přestavby v důsledku chromozomálních translokací (především u leukémií, lymfomů a sarkomů – např. EWS-FLI1 u Ewingova sarcomu), ale také mohou utlumit nežádoucí expresi genů podporujících progresi buněčného cyklu - např. anti-apoptotických faktorů nebo mutatních forem antionkogenu p53. Protein p53, který je mutován ve více než 50% lidských nádorových buněk, ztrácí mutacemi nebo nesprávnými post-translačními modifikacemi schopnost podílet se na regulaci buněčného cyklu a aktivovat apoptotické dráhy, a proto se utlumení exprese nefunkčního proteinu p53 a jeho substituce wt-p53 jeví jako progresívní protinádorová terapie.

Práce byla podporována grantem MŠMT 1K04017C a výzkumným záměrem MZ 00065 26 97 05.

16

POUŽITÍ RAPD TYPIZACE PRO IDENTIFIKACI LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS A SUBSP. CREMORIS

USING OF RAPD FINGERPRINTING FOR IDENTIFICATION OF LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS AND SUBSP. CREMORIS

Jana Prodělalová, Bohuslav Rittich

Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Tvrdého 14, 602 00, Brno, Česká republika

Bakterie rodu Lactococcus patří mezi nejvýznamnější zástupce skupiny bakterií mléčného kvašení. Při výrobě fermentovaných mléčných výrobků se jako startovací kultury používají dva poddruhy Lactococcus lactis, lactis a cremoris. Vzhledem k jejich odlišným technologickým vlastnostem je nezbytné od sebe oba poddruhy odlišit. Tradičně jsou pro odlišení L. lactis subsp. lactis a subsp. cremoris používány růstové a biochemické charakteristiky, jako je růst při odlišných teplotách, tolerance ke zvýšeným koncentracím chloridu sodného a schopnost hydrolyzovat arginin. Tento způsob identifikace je časově náročný a nemusí být zcela spolehlivý. Proto se používají různé rychlejší a vhodnější molekulární metody. Cílem práce bylo použít metodu RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) pro typizaci souboru kmenů L. lactis. Pro typizaci byla použita sada sedmi RAPD primerů. Kmeny byly analyzovány také pomocí PCR s druhově a poddruhově specifickými primery. Na základě hodnocení vzniklých RAPD profilů byly kmeny rozděleny do dvou skupin. První skupina byla vytvořena kmeny zařazenými na základě amplifikace s druhově a poddruhově specifickými primery zařazeny do poddruhu L. lactis subsp. lactis. Druhá skupina byla vytvořena kmeny zařazenými na základě PCR s druhově a poddruhově specifickými primery do poddruhu L. lactis subsp. cremoris. Práce byla podporována grantem FRVŠ 552/2003

BAKTERIOFÁGY DRUHU CITROBACTER YOUNGAE BACTERIOPHAGES OF CITROBACTER YOUNGAE

Slováčková Hana

Biologický ústav LF MU, Joštova 10, Brno 602 00 Metodou křížového vpichového pokusu bylo v souboru 55 testovaných kmenů Citrobacter youngae nalezeno 10 lyzogenních kmenů tohoto druhu. Současně bylo vybráno 5 kmenů citlivých k produkovaným mírným bakteriofágům. Příslušné fágy byly po izolaci z produkčních kmenů pomnožovány metodami odpichu z izolovaných plaků a vymýváním z plaků. Jako kontrola byl přiřazen dobře prostudovaný fág λ druhu Escherichia coli (citlivý kmen K12). Cílem práce je charakterizace izolovaných mírných bakteriofágů druhu Citrobacter youngae, a to na základě morfologie jejich plaků, spektra aktivity, schopnosti indukce (chemické i fyzikální) a morfologie fágových částic. Spektrum aktivity fágů bylo testováno na souboru 25 vybraných indikátorových kmenů gramnegativních druhů Citrobacter youngae (10), Kluyvera ascorbata (1), Leclercia adecarboxylata (2), Escherichia coli (5), Escherichia fergusonii (1), Escherichia hermanii (1), Providencia rettgeri (1), Shigella sonnei (3) a Shigella flexneri (1). Izolované bakteriofágy jsou aktivní vždy jen v rámci svého druhu. Morfologie plaků je většinou

17

charakterizována velmi drobnými rozměry (0,2–1,9 mm). Všechny izolované fágy tvoří matné plaky, některé jsou až nevýrazné, jiné pak nápadně drobné (tečkovité). Nevyskytuje se kolem nich lytické halo. Určité citrobakterové fágy, lyzující stejné citlivé kmeny, vytvářejí plaky podobné až shodné. Ostatní fágy vykazují významnou rozdílnost v morfologii plaků. Zda jsou bakteriofágy s podobnou morfologií plaků totožné, bylo zjišťováno testováním všech bakteriofágů na necitlivých (specificky imunních) indikátorových kmenech a následně porovnáváno s hostitelským spektrem příslušných fágů. Tímto postupem byla nalezena shodnost bakteriofágů ve dvou dvojicích 6/12 a 11/12 a také 18/26 a 19/26. Chemická indukce mitomycinem C a fyzikální indukce UV zářením vedla ke zvýšení produkce fágů o jeden až dva řády (oproti neindukované kontrole) u šesti z celého souboru. Další charakterizace izolovaných fágů byla provedena pomocí elektronové mikroskopie, která ukázala lambdoidní charakter citrobakterových fágů. Všechny bakteriofágy tedy mají ikozaedrické hlavičky a dlouhé kontraktilní bičíky podobné fágu λ. Navíc ve vzorcích určitých fágů (18/26,19/26) se často vyskytovaly struktury podobné fágovým bičíkům a ve třech dalších vzorcích (12/29,31/47,54/39) se nalézaly polymery bakteriocinů. V další práci bude zkoumána ještě imunologická podobnost těchto fágů s fágem λ.

INTERAKCE KOLICINŮ U A Y S REKOMBINANTNÍMI IMUNITNÍMI PROTEINY INTERACTION OF COLICINS U AND Y WITH RECOMBINANT IMMUNITY

PROTEINS

D. Šmajs, P. Matějková Biologický ústav LF MU, Joštova 10, 662 43 Brno

Pro identifikaci aminokyselinových zbytků imunitního proteinu kolicinu U a Y interagujících s kolicinem U a Y byly použity dvě základní techniky. První z nich spočívala v konstrukci hybridních proteinů mezi imunitními proteiny kolicinů U a Y a druhý přístup spočíval v cílené mutagenezi genu pro imunitní protein kolicinu U tak, aby změny v aminokyselinové sekvenci odpovídaly sekvenci imunitního proteinu kolicinu Y. Bylo připraveno 16 odlišných hybridních genů pro imunitní protein a 29 konstruktů zahrnujících záměnu 44 odlišných aminokyselinových zbytků (z celkového počtu 54 odlišných). U těchto konstruktů byla testována imunita ke kolicinům U, Y, A, B a N. Imunitní protein kolicinu U je zcela specifický pro kolicin U a nepřináší imunitu proti žádnému jinému testovanému kolicinu. Oproti tomu imunitní protein kolicinu Y přináší jak specifickou imunitu proti kolicinu Y (i když ne tak výraznou jako imunitní protein kolicinu U ke kolicinu U), tak částečnou imunitu ke kolicinu U a A (nikoliv však k sekvenčně příbuzným kolicinům B a N). Aminokyseliny významné pro imunitu ke kolicinu U jsou lokalizovány mezi zbytky 13 - 19 imunitního proteinu. Tyto aminokyseliny jsou lokalizovány v 1. transmembránovém úseku imunitního proteinu. Další interakční místo se předpokládá ve druhém a čtvrtém transmembránovém úseku. U imunitního proteinu kolicinu Y je pravděpodobné, že interakční místo s kolicinem Y tvoří aminokyselinové zbytky druhého a čtvrtého transmembránového úseku, které navzájem spolupracují a kódují imunitu ke kolicinu Y jen tehdy, jsou-li přítomny současně.

18

STUDY ON MECHANISM OF ACTION OF A CHEMOTHEPEUTIC ELLIPTICINE AS A MEAN TO DEVELOPE ANTICANCER DRUGS OF NEW GENERATIONS

Marie Stiborová1, Eva Frei2

1Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 22Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg

Ellipticine is an alkaloid exhibiting potent antineoplastic and anti-HIV activities. This

agent and some its derivatives are used in the therapy of breast cancer and leukemia and have multiple cellular targets. Among these, the inhibition of topoisomerase II after intercalation into DNA, was hitherto considered the most important property for its cytotoxicity. Recently, we found that ellipticine also acts as alkylation (arylation) agents, covalently binding to DNA in vitro and in vivo. The formation of the major DNA adduct is dependent on the activation of ellipticine by cytochrome P450 (CYP) and peroxidases [1-3]. The most potent activating human enzyme is CYP3A4, followed by CYP1A1 and CYP1A2 [1-3].

Here we show that ellipticine-DNA adducts are also formed in target tumor tissue, namely, in breast tumors of rats treated with ellipticine. The levels of DNA adducts are higher in tumor tissue than in healthy breast cells. In addition, we found that these adducts are generated in human cancer cells in culture. Ellipticine cytotoxicity against human breast adenocarcinoma MCF-7 cells, human leukemia HL-60 and CCRF-CEM cells is correlated with formation of ellipticine-derived DNA adducts.

In order to elucidate the mechanisms of ellipticine-DNA adduct formation, we focused on identification of the target deoxynucleotides in DNA for ellipticine binding and on the cytochrome P450- and peroxidase-mediated metabolism of this drug. We identified deoxyguanosine as the target for ellipticine binding to DNA after its activation of CYPs and peroxidases. Peroxidases (lactoperoxidase and myeloperoxidase expressed in target tumor tissues) oxidize ellipticine to dimer and N(2)-oxide of ellipticine as major and minor metabolites, respectively. Five ellipticine metabolites containing an oxygen atom in their molecules (M1-M5) are generated by CYPs; two of them were identified to be 9-hydroxy- and 7-hydroxyellipticines. The metabolites M3 and M5 were identified to be 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of ellipticine, respectively, while the structure of metabolite M2 has not yet been exactly characterized. 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of ellipticine are metabolites responsible for formation of two major ellipticine-derived adducts generated on deoxyguanosine in DNA. The reaction mechanism of their formation is proposed.

Activation of ellipticine to a DNA binding species by CYPs and peroxidases is an interesting finding in view of the compound’s activity against breast cancer and leukemia. The results obtained in this study might, moreover, be employed for development of new drugs suitable for gene therapy and tumor targeting.

References 1) Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675 (2001). 2) Stiborová M., Stiborová-Rupertová M., Bořek-Dohalská L., Wiessler M., Frei E.: Chem.

Res. Toxicol., 16, 38-47 (2003). 3) Stiborová M., Breuer A., Aimová D., Stiborová-Rupertová M., Wiessler M., Frei E.: Int. J.

Cancer, 107, 885-890 (2003). Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM 113 00001).

19

PROTEIN C-JUN INDUKUJE EXPRESI CYKLINU A V MONOBLASTECH BM2

C-JUN PROTEIN INDUCES EXPRESSION OF CYCLIN A IN BM2 MONOBLASTS

Petr Vaňhara1,2, Vítězslav Bryja2, Sabina Ševčíková1, Jan Šmarda1 1Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární

biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno, 2 Centrum buněčné terapie, Karlova univerzita, Praha a Oddělení molekulární embryologie, ÚEM AV ČR, 613 00 Brno

Aktivační protein 1 (AP-1) je transkripční faktor, který jako součást buněčných signálních drah, zprostředkovává odpověď buňky na mimobuněčné podněty ovlivněním exprese cílových genů. AP-1 i jeho jednotlivé složky jsou účinnými regulátory proliferace různých buněčných typů, ale přesný vztah mezi AP-1 a vlastními regulátory buněčného cyklu není dosud plně objasněn. Jedním z proteinů, který se podílí na sestavení AP-1 je transkripční faktor Jun, jehož přirozená buněčná forma c-Jun i zkrácená virová forma v-Jun zpomaluje proliferaci monoblastů transformovaných onkogenem v-myb viru ptačí myeloblastózy (BM2). Pro objasnění protirůstového účinku proteinů Jun jsme sledovali změny exprese a/nebo aktivity některých klíčových regulátorů cyklu (cyklin-dependentních kináz CDK2, CDK4, CDK6 a cyklinů D1, D2, A, E) v buňkách BM2 inducibilně exprimujících geny v-jun a c-jun a to jak v podmínkách sérové deprivace (LS), tak v podmínkách plné saturace růstovými faktory (NS). Prokázali jsme, že s výjimkou genu CDK2, který se exprimuje v nezměněné míře v podmínkách LS i NS, je exprese ostatních regulátorů zřetelně snížena v podmínkách LS. Srovnávací analýzou parentální linie BM2 s jejími deriváty BM2cJUN a BM2vJUN, které proteiny Jun syntetizují v závislosti na přítomnosti induktoru (ZnCl2) bylo zjištěno, že indukce exprese c-jun a v menší míře také v-jun v buňkách BM2cJUN, resp. BM2vJUN stimuluje expresi cyklinu A. Uvedený jev byl patrný v podmínkách NS i LS. Exprese cyklinů D1, D2, E, stejně jako kináz CDK2, CDK4 a CDK6, vyšší buněčnou hladinou proteinů Jun ovlivněna nebyla. Abychom otestovali, zda se vyšší hladina cyklinu A v buňkách BM2vJUN a BM2cJUN projeví také změnou aktivity příslušné CDK, srovnali jsme aktivitu CDK2 v buňkách BM2vJUN, resp. BM2cJUN, s aktivitou CDK2 nalezenou v kontrolní linii BM2. Ve srovnání s podmínkami NS, došlo v podmínkách sérové deprivace k snížení aktivity CDK2 v liniích BM2 a BM2vJUN. V linii BM2cJUN kultivovaných v podmínkách LS a NS nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v aktivitách CDK2. Také při srovnání aktivity CDK2 v buňkách BM2, BM2vJUN a BM2cJUN v podmínkách NS nebyly zaznamenány statisticky významné rozdíly. Naopak v podmínkách sérové deprivace je patrný trend zvýšené aktivity CDK2 v linii exprimující c-jun, který není patrný u linií BM2 a BM2vJUN. Z těchto výsledků vyplývá, že mechanismus, kterým protein c-Jun inhibuje růstu monoblastů BM2, patrně spočívá v posílení exprese cyklinu A a nadměrné aktivaci CDK2. Tato práce byla podporována výzkumným záměrem MSM143100008 Ministerstva školství mládeže a tělovýchovy ČR.

20

STRUKTURNÍ A TERMODYNAMICKÁ CHARAKTERIZACE INTERAKCÍ MEZI PA-IIL LEKTINEM BAKTERIE PSEUDOMONAS AERUGINOSA A

POVRCHOVÝMI OLIGOSACHARIDY NA POVRCHU BUNĚK

Michaela Wimmerová1, Charles Sabin2, Edvard P. Mitchell3, Martina Budová1, Catherine Gautier2 and Anne Imberty2

1Department of Biochemistry and National Centre for Biomolecular Research, Masaryk University, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Czech Republic, 2CERMAV-CNRS, BP 53, 38041 Grenoble, France 3ESRF- Experiments Division, BP 200, F-38043 Grenoble, France

Chronická kolonizace plic oportunistickým patogenem Pseudomonas aeruginosa je hlavní příčinou vysoké mortality a morbidity pacientů s cystickou fibrosou. Mutace v genu kodujícímu CTFR protein (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) je příčinou pozměněného transportu iontů, jež ovlivňuje mnohé tělesné orgány především však plíce, střeva, játra a pankreas. Toto vrozené onemocnění vede mimo jiné k pozměněné glykosylaci glykokonjugátů povrchových epitelií a slinných a plicních mucinů. U pacientů s cystickou fibrosou bylo prokázáno zvýšené množství fukosylovaných oligosacharidů Lewis typu, často doprovázané zvýšenou sialylací a/nebo sulfatací. P. aeruginosa produkuje dva lektiny úzce spojené s jeho virulencí: PA-IL, jež specificky rozpoznává D-galaktosu, a PA-IIL, vážícího L-fukosu. PA-IIL lektin je charakterizován vysokou afinitou k fukose s asociační konstantou Ka = 0.3 x 106 M-1, jež je neobvyklá pro interakce lektinů s monosacharidy. Tato afinita je dána zapojením dvou vápenatých iontů do interakce se sacharidem, jež je unikátní mezi známými lektiny [1]. Detailní pohled do vazebného místa PA-IIL umožnil vymezit tři hydroxylové skupiny sacharidu podílejících se na přímé interakci s vápenatými ionty. Na tomto základě byla provedena strukturní a termodynamická charakterizace interakce PA-IIL s dalšími stereochemicky příbuznými monosacharidy. Další kroky jsou zaměřeny na stadium biologicky zajímavých oligosacharidů, především antigenních determinant serie Lewis. Molekulární dokování Lewis a a Lexis X trisacharidů do vazebného místa PA-IIL objasnilo preferenci lektinu k oligosacharidům Lewis X typu. Lepší porozumění těchto interakcí může být základem navrhování specifických ligandů jako základu protibakteriálních antiadhezivních terapeutik.

[1] E. Mitchell, C. Houles, D. Sudakevitz, M. Wimmerová, C. Gautier, S. Pérez, A.M. Wu, N. Gilboa-Garber & A. Imberty (2002) Structural basis for oligosaccharide-mediated adhesion of Pseudomonas aeruginosa in the lungs of cystic fibrosis patients. Nature Struct. Biol. 9, 918-921. Práce byla podporována grantovým projektem MŠM 14310005.

21

LC-MS A CE V PRAKTICKÉ VÝUCE ANALÝZY PROTEOMU NA MU.

Zbyněk Zdráhal1, Jan Preisler2, Hana Konečná1, Eva Táborská3, Michaela Wimmerová4,

Zdenek Glatz4, Josef Havel2 a Břetislav Brzobohatý1

1Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno

2Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

3Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

4Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta, Biochemický ústav, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Analýza proteomu je dalším postupným krokem k dokonalému pochopení procesů v

buňce. Identifikace proteinů a sledování jejich expresních profilů za daných podmínek umožňuje určit jejich roli v jednotlivých buněčných procesech. Porozumění dynamiky proteomu představuje jeden z důležitých předpokladů pro řešení problémů základního výzkumu, tak pro rozvoj medicínských a biotechnologických aplikací. Z tohoto důvodu se stává proteomika, disciplína zabývající se analýzou proteomu, nedílnou součástí výuky na vysokých školách zaměřených na biologické,chemické, biotechnologické a biomedicínské obory.

V loňském roce byla stávající proteomická instrumentace (1) doplněna díky grantové podpoře MŠMT. Byl dovybaven LC/MS systém a pořízena instrumentace pro kapilární zónovou elektroforézu. Zatímco kapalinová chromatografie na reversní fázi ve spojení on-line s hmotnostní spektrometrií LC-MS, resp. LC-MSMS je jedním ze základních nástrojů pro analýzu peptidů, identifikaci proteinů a studium jejich post-translačních modifikací, CZE je díky svému odlišnému separačnímu principu perspektivní alternativní separační technikou pro peptidy resp. proteiny vhodnou také pro on-line spojení s MS. V současné době je tato instrumentace společně se stávající instrumentací zařazena do praktické výuky studentů PřF a LF v těchto předmětech: PřF - Kurz základů proteomiky (Bi8202), Metody separace proteinů (C6270), Klinická biochemie-cvičení (C6230), Speciální metody–laboratorní cvičení (C8102) a LF - Klinická biochemie-cvičení (VLKB091). (1) www.sci.muni.cz/proteom Instrumentace byla pořízena z dotace MŠMT a z projektu FRVŠ 796/2003. Práce byla podporována grantovým projektem MŠM 143100008.

H STRUCTURAL STUDIE

Bauerová H.1, Veverka V1Institute of Organic C

2NMR Labo In Mason-Pfizer monkey polyprotein precursors are attractive model for invesNMR structure of fully fostructures of both wt PR anretroviral proteases. The mproteases is a lack of intstabilizing the dimer of M-favor of the dimer by addinrole of the β-sheet. We alsodimers and consequently suggesting that reversible oregulates maturation of M-P

DEVELOPMENT OF LSPECIFIC DETECTIO

VÝVOJ LATERAL FLOSPECIFICK

Martina Blažková1, P

1:Department of BiocheTec

2:Agrotechnology anResearch Centre,

The genus Listeria currL. seeligeri, L. innocua, by these gram-positive bbeen recognized as an idisease symptoms or everare, the vast majority ostillbirths and neonatal sconsidered to be aviruleruminants and L. seeliglisteriosis. The most fr(particularly those madfermented raw-meat sau

22

SEKCE MLADÝC

S OF THE 12 kDa FORM OF PROTEASE FROM MASON-PFIZER MONKEY VIRUS

.2, Zábranský A.1, Lang J.2, Ruml T.2, Hrabal R.2, and Pichová I.1 hemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech

Republic, Prague ratory, Institute of Chemical Technology in Prague

virus the assembly of immature capsids and the cleavage of temporary and spatially separated processes making the virus an tigation of protease activation. Here we present high resolution lded monomer of 12 kDa M-PMV protease (PR). The overall d the Cys mutant follow the conservative structural motif of other ost prominent difference from the canonical fold of retroviral

erfacial β-sheet, which leads to the loss of the principal force PMV PR. The equilibrium monomer-dimer can be shifted back in g a substrate or an inhibitor partially compensating for the missing show that cysteines C7 and C106 play a crucial role in stabilizing in dramatic increasing of proteolytic activity of M-PMV PR xidative modification of cysteines within Gag polyproteins tightly MV assembled immature capsids.

ATERAL FLOW IMMUNOASSAYS FOR GENERAL AND N OF LISTERIA SPP. AND LISTERIA MONOCYTOGENES W IMMUNOASSAYS PRO DETEKCI RODU LISTERIA A OU DETEKCI LISTERIA MONOCYTOGENES

avel Rauch1, Jan H. Wichers2 and Aart van Amerongen2 mistry and Microbiology, Institute of Chemical Technology, hnická 5, 16628 Praha, Czech Republic d Food Innovations (A&F), Wageningen University and P.O. Box 59, 6700 AA, Wageningen, The Netherlands

ently includes six species: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. welshimeri, and L. grayi. The infectious disease caused acteria is known as listeriosis. Only L. monocytogenes has

mportant food borne pathogen that may cause a variety of n death in both man and animal. L. ivanovii infections are f reported isolations of this species being from abortions, epticemias in sheep and cattle. The other Listeria spp. are nt, although L. innocua may occasionally cause disease in eri has been implicated in at least one case of human equently contaminated foods are raw milk, soft cheeses e from unpasteurized milk), ice cream, raw vegetables, sages, raw and cooked poultry and raw and smoked fish.

23

Food producers and distributors as well as public health authorities have great interest in timely detection of Listeria contamination. We present here the development of Lateral Flow ImmunoAssay (LFIAs) for general detection of genus Listeria and specific determination of Listeria monocytogenes. Two polyclonal antisera had previously been developed. With these antisera ELISA's had been set up, one specific for Listeria spp., and the other specific for L. monocytogenes. In the present study these antibodies are used to develop LFIA's that only require the addition of sample into the sampling window. These simple and rapid strip tests are based on the principle of immunochromatography. Detector antibody is conjugated on colloidal carbon particles, used as a mobile phase immunosensor. Capture antibody is immobilized in line onto nitrocellulose membrane. The antibody-antigen-antibody complex (sandwich assay) is visualized as a black line. Acknowledgement: This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic, No. 525/03/0350.

VLIV ROSTLINNÝCH HORMONŮ CYTOKININŮ NA PROTEOM ARABIDOPSIS THALIANA

ARABIDOPSIS THALIANA PROTEOME INFLUENCED BY PLANT HORMONES CYTOKININS

Gabriela Böhmová, Pavlína Váňová, Hana Konečná, Zbyněk Zdráhal, Břetislav Brzobohatý

Department of Functional Genomics and Proteomics, Faculty of Science, Masaryk University,

Kotlářská 2, CZ-61137 Brno, Czech Republic Cytokinins are essential plant hormones that control several processes such as cell division, shoot meristem initiation, leaf and root differentiation, chloroplast biogenesis, stress tolerance, and senescence. An experimental set-up to analyse dynamics of changes in the proteome in response to regulated changes in endogenous levels of cytokinins is being established. In the long-term, the proteome-based approach is expected to deepen our knowledge of the biological functions of cytokinins. The classical proteome analysis with the aim of finding a set(s) of proteins whose expression level is influenced by cytokinins was performed. Total proteins extracted from Arabidopsis thaliana wild-type (Col0) and mutant lines with increased level of endogenous cytokinins (amp1), were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Computer analysis of two-dimensional gels revealed the association of a set of proteins showing a differential expression with the mutant lines when grown under the same conditions as a wild type. Altogether 14 qualitatively different spots in gels with pH range 3-10 and 23 spots in gels with pH range 4-7 were found. Two significant proteins from each group were digested in gel and identified by mass spectrometry. This work was supported by grants MSM143100008 and FRVŠ 796/2003 from the Ministry of Education of the Czech Republic.

24

FRAGILE X SYNDROME: THE ROLE OF FRAGILE X MENTAL RETARDATION PROTEIN (FMRP) IN THE SYNAPTIC PLASTICITY

Romana Borská, Martin Trbušek

Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika, Centrum molekulární biologie a genové terapie, Černopolní 9, 625 00 Brno

Fragile X syndrome, the most common form of inherited mental retardation, is caused by

the loss of the FMRP protein in FraX patients. FMRP is predominantly found in neurones of hipoccampus and cerebellum and is synthetized in response to mGluR activation. FMRP is suspected to participate in the synaptic plasticity of neurons by acting on posttranslational control of gene expression. It is an RNA-binding protein that associates with mRNAs together with other proteins to form large ribonucleoprotein complexes that associate with translating polyribosomes near the synapses. Therefore, one of the important steps to understand the molecular pathogenesis of FraX syndrome is identification of the mRNAs and proteins that are bound by FMRP.

We compared the gene expression in B lymphoblastoid cell lines derived from FraX patients and healthy men using differential display. We identified a gene coding for the heat shock protein Hsp90β, which significantly exhibited decreased mRNA expression in all FraX cell lines.

Hsp90β is specifically involved in the folding or conformational regulation of central signal transduction molecules, particularly of steroid hormone receptors. From this point of view it is interesting that Hsp90 protein regulates the growth and differentiation of axons and dendrites in developing brain through the regulation of steroid hormone estrogen. FraX patients as well as FMRP knockout mice show higher density of abnormally thin and long dendritic spines. Also another prominent feature of fragile X syndrome, abnormalities in hypothalamic-pituitary system, which is regulated by circulating glucocorticoids, might have direct cause in Hsp90 deregulation. The fragile X patients exhibit increased levels of cortisol, a hormone of the hypotalamic-pituitary-adrenal axis associated with stress, which, in addition, was shown to regulate Hsp90 mRNA (1, 2). References: 1) Hessl D., Glaser B., Dyer- Friedman J., Blasey C., Hastie T., Gunnar M., Reiss A.L. 2002.

Cortisol and behavior in fragile X syndrome. PNEC 27(7), 855-72 2) Sathiyaa R., Campbell T., Vijayan M.M. 2001. Cortisol modulates HSP90 mRNA

expression in primary cultures of trout hepatocytes. CBP 129, 679-685 This work was supported by the Scientific programme CEZ/MZ 98/0001/00209627

RECOMBINANT ANTIBODIES IN ENVIRONMENTAL ANALYSIS

Jiří Brichta Test Line Clinical Diagnostics s. r.o., Křižíkova 68, 612 00 Brno

Antibody engineering by molecular aproaches gathered steam for the technology of antibody production, particularly in the area of immunotherapy and diagnostics. The development fueled by novel technologies for the in vitro isolation of antibodies from combinatorial libraries and their functional expression in bacteria. This lesson presents an overview of the methods available for the de novo generation of recombinant antibodies, for engineering

25

antibodies with increased antigen affinity, and for the production of antibody fragments. Applications of recombinant antibodies in the field of environmental analysis are also presented, and complemented by results obtained with antibody clone selection using Griffin1. phage display library.

DETEKCE ESCHERICHIA COLI POMOCÍ MULTIPLEX PCR DETECTION OF ESCHERICHIA COLI BY MULTIPLEX PCR

Mgr. Kateřina Horáková)1, RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D.)2, RNDr. Petr Mlejnek, Ph.D.

)1Katedra mikrobiologie PřF MU, Tvrdého 14, 60300 Brno )2Výzkumný ústav vodohospodářský TGM, Dřevařská 12, 65757 Brno

)3Ústav biologie LF UP, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc

Lactose fermentation and glucuronide hydrolysis are the biochemical hallmarks used for conventional identification of E. coli according to the Czech standards ČSN EN ISO 9308-1, TNV 75 7835 and TNV 75 7837. Nevertheless it is well known that these routinely applied methods have many drawbacks. Polymerase chain reaction was used for precise and more sensitive detection of the genes coding for lacZ (β-D-galactosidase / lactose fermentation), uid (β-D-glucuronidase) and gene cyd (cytochrome-d-oxidase / respiratory chain protein). Our results indicated that simultaneous detection of above-mentioned three genes provided very reliable evidence for presence of Escherichia coli in water samples. Primers for amplification of gene specific DNA fragments derived from lacZ, uid, and cyd were carefully designed so that we were able to amplify all three DNA fragments in one tube - multiplex PCR. Therefore our approach for identification of Escherichia coli using multiplex PCR is also relatively inexpensive.

TISSUE SPECIFIC ALTERNATIVE SPLICING IN THE GENE FOR AHP5, A HISTIDINE-CONTAINING PHOSPHOTRANSFER PROTEIN FROM ARABIDOPSIS

THALIANA. TKÁŇOVĚ SPECIFICKÝ ALTERNATIVNÍ SESTŘIH GENU AHP5, PŘENAŠEČE SIGNÁLU V DVOU-KOMPONENTNÍM SYSTÉMU U ROSTLINY ARABIDOPSIS

THALIANA.

Hradilova J1, Brzobohatý B2* 1Laboratory of Plant Molecular Physiology, Masaryk University Brno, Faculty of Science,

Kotlářská 2, 611 37, Brno, Czech Republic 2Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Kralovopolská 135,

61265 Brno, Czech Republic.

A multistep two-component system is involved in signal transduction in Arabidopsis and consists of a sensory histidine kinase, a phosphotransfer factor and a response regulator. Factors with histidine-containing phosphotransfer domains (AHPs) transfer the phosphoryl group from membrane localised receptor (histidine kinases) to effectors (response regulators) localised in the nucleus. Five AHPs have been identified in Arabidopsis. AHPs are small proteins (14,5 – 18 kDa), with a predicted acidic isoeletric point (5.5–3.9) and a typical phosphotransfer domain, including the conserved sequence XHQXKGSSXS. AHP5 comprises six exons and five introns. RNA was prepared using Trizol reagent from different

26

plant tissues: leaves, roots, shoot, flowers, siliques and seedlings. Using RT-PCR we detected two products (AHP5s and AHP5l). Following sequencing, the second intron was found intact at position 211 bp in the longer product (AHP5l). Real time RT-PCR showed that the ratio between spliced and nonspliced products is in tested tissues significant different. Other AHPs (AHP1, AHP2, AHP3 and AHP4) were established to be normally spliced. AHP5l comprises two open reading frames, and in the longer of them the phosphotransfer domain is preserved intact as the original reading frame is not altered. This protein has a predicted molecular mass of 11.7kDa and the putative isoeletric point is 7.72.

NEW ELISA TECHNIQUE FOR ANALYSIS OF P53 PROTEIN/DNA BINDING PROPERTIES

DETEKCE VAZBY PROTEINU P53 NA DNA POMOCÍ NOVÉ ELISA TECHNIKY

Eva Jagelskáa ,Václav Brázdaa, Petr Pečinkaa, Šárka Pospíšilováb and Emil Palečeka

a Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135, Brno, Czech Republic

bMasaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, Brno, Czech Republic The p53 tumour suppressor protein is one of the most important topics in cancer research. Its function is associated with the ability to bind DNA in a sequence-specific manner and to operate as a transcription factor. In the present study, we have developed a rapid and reliable method for analysing sequence-specific binding of p53 protein to DNA using a modified enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this p53/DNA-ELISA, we used streptavidin-coated microplates to capture biotynylated oligonucleotides containing p53 consensus sequences (p53CON). This newly developed nonradioactive assay allows the detection of p53/DNA complexes using different monoclonal antibodies recognising p53 and has comparable or higher sensitivity to more complicated radioactive methods. Using this method, we can detect binding of endogenous p53 to p53CON and activation of p53 protein for sequence-specific DNA binding. Variations of the basic protocol have also been developed to perform competition experiments and to study p53 binding to natural binding sequences. This modified DNA-ELISA is applicable for screening p53 properties from various sources in a short time. PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍHO ZNAČENÉHO PROTEINU CD69 PRO MĚŘENÍ

NMR SPEKTER PREPARATION OF RECOMBINANT LABELED CD69 FOR NMR SPECTRA

EVALUATION

Daniel Kavan1, Karel Bezouška 1,2

1 Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 8, 128 40 Praha

2 Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha Molecule CD69 belongs to the C-type family lectins, that is lectins binding Ca2+ ion.

The structure of human CD69 is quite well known, however knowledge of its rat analogue are much less compact and possible NMR spectra will be surely very valuable acquisition to its structure description. Evaluation of NMR spectra however require isotope labeled protein so not only the rich media production but also the minimal ones must be optimised.

27

DNA coding CD69 molecule was acquired from total RNA of RNK-16 cell line and inserted into pET-30(a)+ vector (Novagen). Recombinant protein was produced in BL-21 DE3 Gold cells (Stratagene) into inclusion bodies. After its isolation and purification came refolding of CD69 in vitro by its quick dilution. Here came the first problem: according to reducing to oxidizing agent ratio there were two forms of protein with different mobility on non-reducing SDS gels caused probably by different cysteine-cyssteine bonds. The right disulfide bonds form was revealed by means of mass spectrometry.

The protein purification was pursued on the S-Sepharose FF column in buffer pH 5.8 and by linear gradient elution into 1M NaCl, followed by gel filtration on Superdex 200 HR column. Even after these steps there were found some lower amount of contaminants.

From 2 l of M9 media we have obtained about 7-10 mg well-folded protein moreover well-soluble (up to 15 mg/ml).

Next task is a perfect purification of protein and reproducing the whole process with production on 15NH4Cl labeled M9 medium. NMR spectra evaluation will be done in specialized laboratory.

STRUKTURNÍ POHLED DO SPECIFITY RALSTONIA SOLANACEARUM

LECTIN RS-IIL STRUCTURAL INSIGHT INTO SPECIFICITY OF RALSTONIA SOLANACEARUM

LECTIN RS-IIL

Nikola Kostlánová1, Edward P. Mitchell2, Nechama Gilboa-Garber3, Michaela Wimmerová1 and Anne Imberty4

1National Centre for Biomolecular Research and Department of Biochemistry, Masaryk University, Kotlářska 2, 61137 Brno, Czech Republic, 2E.S.R.F. Experiments Division, BP 220, F-38043, Grenoble Cedex, France, 3Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat-Gan 52900, Israel, 4CERMAV-CNRS, BP 53, F-38041, Grenoble, Cedex 09, France

Carbohydrates are essential components of life and play significant roles in each organism including host – pathogen interactions. Lectins that specially recognize sugar components can be involved in primary recognition of host organism and thus they are candidates responsible for pathogenicity of bacterium[1].

Ralstonia solanacearum is a devasting soil-borne plant pathogen with a global distribution and wide host range [1]. It is phylogenetically related to an animal pathogen Pseudomonas aeruginosa that express two soluble lectins, PA-IL and PA-IIL respectivelly. Both lectins are closely associated with the virulence of the bacterium [2].

The contribution is focused on structural characterization of R. solanacearum lectin RS-IIL that shows high sequence similarity with the PA-IIL lectin.

RS-IIL was crystallized by hanging drop vapor diffusion method and the diffraction data at 1.70Å resolution were collected under cryogenic conditions (100K) on the beamline ID14-2, at ESRF, Grenoble, France. The protein crystallizes in I222 space group with unit cell a = 59.1, b = 61.7, c = 74.8 Å. Phasing of native RS-IIL was perfomed by the molecular replacement of the crystal structure of the PA-IIL/fucose complex (PDB 1L7L). To obtain RS-IIL/sugar complexes protein was directly co-crystallized with α-methyl-D- mannoside. The RS-IIL crystal contains one monomer of 113 amino acids per asymmetric unit, together with two Ca2+ ions and one α-Me-mannoside residue. The quaternary structure is created by four monomers and both monomeric and tetrameric arrangements are very similar to the ones

of PA-IIL [3]. Whilst calcium binding loop is fully conserved in both lectins different specificity is based on three different amino acids altered in the “specificity” loop.

28

[1] Salanoubat, M., Genin, S., Artiguenave, F., Gouzy, J., et al. Nature. 415, 497-502 (2002)

[2] Gilboa-Garber, N.: Lectins of Pseudomonas aeruginosa: Properties, biological effects and applications in Microbial Lectins and Agglutinins: Properties and Biological Activity (Mirelman, D., ed.), 255-269, John Wiley & Sons, New York (1996)

[3] Sudakevitz, D., Kostlánová, N., Blatman-Jan, G.,Mitchell, E., Lerrer, B., Wimmerová, M. Katcoff, D.J., Imberty, A., Gilboa-Garber, N., Molecular Microbiology, in press (2004)

Superimposition of α-Me-mannoside in RS-IIL binding site and α-mannose in PA-IIL binding site

IDENTIFICATION OF BIFIDOBACTERIA USED TO FERMENT DAIRY PRODUCTS BY POLYMERASE CHAIN REACTION AND AMPLIFIED

RIBOSOMAL DNA RESTRICTION ANALYSIS

IDENTIFIKACE BIFIDOBAKTERÍ VYUŽÍVANÝCH V MLÉKÁRENSKÉM PRŮMYSLU POMOCÍ POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE A RESTRIKČNÍ

ANALÝZY AMPLIFIKOVANÉ RIBOZOMALNÍ DNA

Křížová J., Španová A., Rittich B. Masaryk University in Brno, Faculty of Science, Department of Microbiology

Tvrdého 14, 602 00 Brno The genus Bifidobacterium comprises 30 species, of which only a few species can be used as probiotics. Probiotic propertis can be characterised as a collection of favourable effects on human´s organism as e.g. supression of lactose intolerance, prevention of gastrointestinal diseases, reduction of cholesterol level, stimulation of immune system and anticancerogene activity. The only species of human origine (especially gastrointestinal tract) have got benefitial influence on human health. These species are used to ferment dairy products and subsequently applied as oral probiotics. Therefore it is important to develope rapid and accurate method for identification and differantiation of these bifidobacterial species. The focus of this work was to verify the accuracy of the original identification of 14 bifidobacterial strains from the collection of dairy cultures Laktoflóra by molecular biological methods. The strains were cultivated on MRS medium with cysteine, anaerobically at 37oC for 24 or 48 hours respectively. DNA was isolated by phenol extraction. On the basis of cellular morphology all the studied strains were tested whether they belong to the genus Bifidobacterium by the genus specific PCR with primers Pbi F1 and Pbi R2 (Roy and Sirois, 2000) or to the genus Lactobacillus (primers LbLMA1-rev and R 16-1)( Dubernet et al., 2002). Strains belonging to the genus Bifidobacterium were further examined by the species specific PCR with primers Bi ADO-1,2; Bi BIF-1,2; Bi BRE-1,2; Bi LON-1,2; Bi INF-1,2; Bi CAT-1,2 (Matsuki et al., 1999); Ban F2 and Pbi R1 (Roy and Sirois, 2000).

29

The second method used to clarify the original identification of the strains was the amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). This method is based on the amplification of 16S rDNA region by use of primers Pbi F1 and Pbi R2 and subsequent restriction of the genus specific PCR product 914 bp by enzymes Bam HI, Sau3 AI and TaqI. Identification of the studied strains by ARDRA method correspond with the results obtained by the species specific PCR method. On the basis of obtained results it is evident, that the ARDRA method and genus and species specific PCR method are available for the differentiation and identification of some species of bifidobacteria usually used in dairying. 1) Roy D., Sirois S. (2000). FEMS Microbiol. Lett. 191, 17-24. 2) Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H. (1999). Appl. Environ. Microbiol. 65, 4506-4512. 3) Dubernet S., Desmasures N., Guéguen M. (2002). FEMS Microbiol. Lett. 214, 271-75. GENETIC AND MOLECULAR ANALYSIS OF T-DNA MUTATIONS IN ARABIDOPSIS THALIANA GENETICKÁ A MOLEKULÁRNÍ ANALÝZA T-DNA MUTACÍ U ARABIDOPSIS THALIANA

Zdeňka Kyjovská, Jana Řepková, Markéta Dudová Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra Genetiky a molekulární

biologie,Kotlářská 2, Brno 602 00 Embryogenesis in higher plants, that is, embryo development. Developing embryo of most cotyledonous angiosperms proceeds through a series of shape changes, going from zygotic to preglobular, through globular, heart and torpedo to the mature cotyledon embryo. Many genes are expressed during this cascade process in a highly co-ordinated manner to ensure that the zygote develops into an organised multicellular structure. Genetic approaches have been particularly useful for identifying important genes involved in embryo development. Much of the work in this field has been done thaliana L. (Heynh.) as a model for dicotyledonous species. Genetic analysis of embryogenesis in plants has revealed a great number of genes responsible for the formation of viable seeds. In the study presented here, two different T-DNA embryonic lethal mutats of Arabidopsis thaliana were analysed at the genetic and molecular level.The mutations were confirmed to be monogenic and recessive-lethal by genetic analysis. Mutant embryos were blocked in certain steps in the process necessary for embryo viability and development, therefor they belong to the embryo-lethal class of mutants. The mutations were localised to the genetic map of A. thaliana by DNA marker analysis. There were used SSR (Simple Sequence Repeats) and CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) markers. The results showed linkage of the embryo-lethal mutant gene (1293 line) to nga63 marker on Arabidopsis chromosome one. The gene from line name’s CoY 7 was located on chromosom four near to nga1139 SSR marker.

PŘÍPRAVA KRÁLIČÍHO POLYKLONÁLNÍHO SÉRA PROTI NÍZKOMOLEKULÁRNÍM LEKTINOVÝM RECEPTORŮM NK-BUNĚK

PREPARATION OF RABBIT POLYCLONAL SERA AGAINST LOWMASS LECTINE RECEPTORS OF NK-CELLS

Ondřej Lukšan1, Karel Bezouška 1,2

1 Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, Hlavova 8, 128 40 Praha

2 Mikrobiologický ústav AV ČR, Vídeňská 1083, 142 20 Praha

The preparation of polyclonal antibodies against recombinant proteins is often considred to be a routine technique. Yet, successful immunisation resulting high titres of the produced antibodies depends on many factors such as frequency and dose of injected antigen, use of adjuvans, choice of animal, health of animal, etc…

In our laboratory we aimed to prepare polyclonal rabbit antibodies against recombinant forms of NK cell receptors produced in E. coli . The use of soluble antigens was preferred to immunisation with proteins in polyacrylamide gels.

3 rabbits were injected 3 times in 3-4 weeks periods by rat CD69, human CD69 and human NKG-2D. The animals were bled 7-10 days after each partial immunisation. The amount of antibodies was determined in isolated sera using methods ELISA, Western blot and Dot blot. RESULTS: After 1st booster immunisation rCD69 hCD69 hNKG-2D

Fig.1: Titration of antibody; dilution of antibody: control, 1:102, 1:5x102, 1:103, 1:2x103,1:5x103, 1:104,

1:5x104, 1:105, 1:5x105, 1:106, control; lower part – preimune sera, upper part – sera after 1st booster immunisation

After 2nd booster immunisation

30

rCD69 hCD69 hNKG-2D

Fig.2: Titration of antibody; dilution of antibody:

control,1:102, 1:5x102, 1:103, 1:5x103, 1:104; lower part – preimune sera, upper part – sera after 1st booster immunisation

CONCLUSIONS: Our method prooved usefull for the production of high titer antibodies. These antibodies will be used for the characterisation of NK-cell receptors especialy in membrane microdomains.

31

ZVÝŠENÁ DYNAMIKA MUP-I V PŘÍTOMNOSTI LIGANDU: DŮKAZ POMOCÍ MD SIMULACE A NMR RELAXACE

INCREASED DYNAMICS OF MUP-I IN PRESENCE OF LIGAND: EVIDENCE FROM MD SIMULATION AND NMR SPIN RELAXATION

Pavel Macek1, Petr Novák1, Hana Křížová1, Lukáš Žídek1, Vladimír Sklenář1

1 Masaryk University Brno, Faculty of Science, National Centre for Biomolecular Research Kotlářská 2, 611 37 Brno

Nowadays it is accepted that the structure of proteins must be treated as a time-dependent model, where fluctuations about an average structure are present. To gain insight into how dynamical properties of major urinary protein (MUP-I) change in presence of a ligand, the picosecond to nanosecond time scale dynamics of MUP-I have been studied by the MD simulations and by the NMR spin relaxation experiments. Dynamic properties of MUP-I upon ligand binding is in contrast with those that are typical for most proteins. Backbone NMR 15N relaxation results show a small but significant increase of order parameters (S2), indicating that the molecule maintains its overall molecular shape and structure upon the ligand binding, while the backbone dynamics is inreased. Molecular dynamic simulations performed with and without the ligand produce results consistent with NMR measurements and confirm X-ray difraction results, showing qualitative agreement amongst these three methods. Furthermore careful investigation of the MD simulations provides a potential molecular mechanism of the increased backbone flexibility. This work is supported by a research grant: Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (LN00A016) Grant Agency of the Czech Republic (203/00/0511)

ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA NATIVNÍHO A AGREGOVANÉHO ALPHA-SYNUCLEINU, PROTEINU, KTERÝ SE ÚČASTNÍ NA

NEURODEGENERATIVNÍCH ZMĚNÁCH VEDOUCÍCH K PARKINSONOVĚ CHOROBĚ

ELECTROCHEMICAL ANALYSIS OF NATIVE AND AGGREGATED ALPHA-SYNUCLEIN PROTEIN INVOLVED IN PARKINSON DISEASE

Michal Masařík1, Agata Stobiecka2, René Kizek3, František Jelen1, Wolfgang Hoyer4,

Thomas M. Jovin4, Emil Paleček1

1Institute of Biophysics of the Academy of Sciences of the Czech republic, Kralovopolska 135, 612 65 Brno, CzechRepublic

2Institute of Animal Reproduction and Food Research of the Polish Academy of Sciences, Tuwima 10, 10 – 747 Olsztyn, Poland

3Faculty of agronomy, Mendel University of agriculture and forestry, Zemedelska 1, 613 00 Brno, Czech Republic

4Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, Am Faßberg 11, D-37077 Göttingen, Germany

Parkinson´s disease (PD) is characterized by a loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra, leading to the major clinical and pharmacological abnormalities that characterize the disease. Some surviving nigral dopaminergic neurons contain cytosolic filamentous inclusions known as Lewy bodies (LBs) and Lewy neurites (LNs) are also involved in pathogenesis of

32

Alzheimers disease (AD), multiple system atrophy (MSA) and amyotropic lateral disease (ALS). The major fibrillar material of LBs and LNs was shown to be alpha-synuclein (α-synuclein). α-synuclein is a 14 kDa protein highly expressed in various parts of the brain and was first described as a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminals. Natively is unfolded but undergoes aggregation leading to fibrillar structures. The aggregation of α-synuclein is promoted by a variety of agents including metal ions, lipids, pesticides and conditions that generate oxidative stress. Well known methods for determination α-synuclein aggregation are CD spectroscopy, fluorescent measurement (Thioflavin T binding assay), electron microscopy and scanning force microscopy. In this work we studied oxidation of tyrosine residues in native and aggregated α-synuclein at carbon electrodes and measured the so-called peak H at mercury electrodes. We observed large differences in the behaviour of native and aggregated α-synuclein at both carbon and mercury electrodes. Using peak H it was possible to detect subnanogram amounts of α-synuclein. We belive that electrochemical methods will significantly contribute to a better understanding of α-synuclein properties. The research is supported by GACR 204/03/0566

1. Hoyer W, Antony T, Cherny D, Heim G, Jovin TM, Subramaniam V. (2002) J. Mol. Biol. 322: 383-393

2. Antony T, Hoyer W, Cherny D, Heim G, Jovin TM, Subramaniam V. (2003) J. Biol. Chem. 278 (5): 3235-3240

3. Sulzer D. (2001) Nat. Med. 7 (12): 1280-1282 4. Trnková L., Kizek R., Vacek J. (2002): Bioelectrochemistry, 56: 57-61 5. Kizek R., Trnková L., Paleček E. (2001): Anal. Chem., 73: 4801- 4807

6. Strouhal M., Kizek R., Vacek J., Trnková L., Němec M. (2003): Bioelectrochemistry 60: 29-36

APPLICATION OF AFLP FOR TYPING OF SALMONELLA ENTERICA SEROTYPE

TYPHIMURIUM VYUŽITIE METÓDY AFLP NA TYPIZÁCIU SALMONELLA ENTERICA SÉROTYP

TYPHIMURIUM

Eva Mikasová, Hana Drahovská, Ján Turňa Department of Molecular Biology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University,

Bratislava, Slovakia, e-mail: mikasova@fns.uniba.sk

The AFLP (amplified fragment length polymorphism) method was optimized for typing of Salmonella Typhimurium strains. Firstly, chromosomal DNA was isolated from bacteria by phenol extraction or alternatively by solid phase extraction with commercial columns. Both methods gave sufficient amounts of high quality DNA, the later being faster and more convenient. Chromosomal DNA was than digested simultaneously with restriction endonucleases EcoRI and MseI and oligonucleotide adapters were ligated to the ends of DNA fragments. After ligation DNA was amplified by PCR with primers complementary to the ends of molecules. Optimized two step PCR protocol was used: firstly 20 cycles of preamplification with primers E00 and M00 (without selective nucleotides) were employed

33

and then preamplification products were used as template in amplification with 3´extended primers M02 (contained extra cytosine) and E01 (contained extra adenine and fluorescent dye FAM). Protocol without preamplification was also tested, but many unspecific DNA fragments were observed in AFLP profiles in this case. Fluorescent PCR products were separated on capillary electrophoresis on DNA sequencer ABI310 (Applied Biosystems). Molecular size standard TAMRA-500 was internally added to every sample. In evaluation the molecular weight of DNA peaks was calculated, presence/absence of reproducible DNA fragments (generally higher than 300 fluorescence units) was scored and Similarity between profiles was calculated by coefficient of Dice. The high reproducibility of this AFLP protocol was confirmed by repeated analyzing of chromosomal DNA from standard salmonella strain. The variability of 28 strains of S. Typhimurium, isolated from food and animal sources, was studied by optimezed method. We observed high strain to strain similarity as Dice coefficients fell in the range of 94 – 100%. According to the presence of several DNA fragments strains were separated to six AFLP groups. AFLP clustering corresponded with antibiotic rezistance profiles and presence of integrons in strains.

NMR STUDY OF PACE11 FROM THE HYPERTHERMOPHILIC ARCHAEON PYROCOCCUS ABYSSI

M. Nálezková1, D. Marion2, A. de Groot2, P. Gans2, L. Blanchard2

1National Centre for Biomolecular Research, PřF MU, Kotlářská 2, 61137 Brno, Czech Republic, 2L’Institut de Biologie Structural, 41, rue Jules Horowitz, 38027 Grenoble, France

The analysis of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi genome showed that some proteins are highly conserved between Archaea and Eukaryotes. 32 proteins have been listed and called the PACE proteins (Proteins of Archaea Conserved in Eukaryotes) (1). The project is to study by NMR PACE11. This protein has been characterized recently as a monomeric phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) involved in the Coenzyme A (CoA) biosynthesis pathway (2). This pathway, consisting of 5 steps thus involving 5 enzymes, has been described in Bacteria and Eukaryotes but not in Archaea. PPAT is involved in 4th step of the CoA biosynthesis, catalyzing the reversible transfer of an adenylyl group from ATP to 4‘-phosphopantetheine giving dephosphoCoA (dPCoA). So far the 3D structure of only a bacterial PPAT (from E. coli and T. Thermophilus) has been solved (3). PACE11 shows very low sequence identity with these bacterial proteins. PACE11 project is to get structural and dynamical information of this protein. PACE11 is PPAT of Pyrococcus abyssi, which is composed of 157 residues. In order to get enough protein for the NMR study a synthetic gene of PACE11 (having no E. coli rare codons) was cloned into the pET28a plasmid and the expression of the gene was tested showing a very good production of PACE11. A 15N sample was then prepared and the 1H-15N HSQC recorded on this sample showed that PACE11 is well folded. (1) Matte-Tailliez O, Zivanovic Y, Forterre P. (2000), Trends Genet 12, 533-536 (2) Armengaud J, Fernandez B, Chaumont V, Rollin-Genetet F, Finet S, Marchetti C,

Myllykallio H, Vidaud C, Pellequer JL, Gribaldo S, Forterre P, Gans P. (2003), J Biol Chem 278, 31078-31087

(3) Izard T. (2002), J Mol biol 315, 487-495

34

VLIV REDOX STAVU PROTEINU p53 A MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK NA SELEKTIVNÍ VAZBU p53 K NADŠROUBOVICOVÉ DNA

EFFECTS OF THE p53 REDOX STATE AND MONOCLONAL ANTIBODIES ON p53 SUPERCOIL-SELECTIVE DNA BINDING

Hana Pivoňkováa, Marie Brázdováa, Kateřina Němcováa, Bořivoj Vojtěšekb, Miroslav Fojtaa

aLaboratoř biofyzikální chemie a molekulární onkologie, Biofyzikální ústav AV ČR, Královopolská 135, 612 65 Brno, tel.: 541 517 197, e-mail: hapi@ibp.cz

bMasarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno Protein p53 is one of the best known tumor suppressors. The main function of this protein is to maintain genetic integrity via controlling proliferation and cell cycle. The p53 ability to bind DNA is essential for these functions. It is known that protein p53 can bind DNA sequence specifically (in a p53 consensus sequence – p53CON) via its central (core) domain and sequence nonspecifically via its C-terminal DNA binding site (CTDBS). Some time ago it was found out that full length bacterially expressed p53 bind selectively supercoiled DNA (scDNA) in dependence on presence of the CTDBS. DNA binding of p53 can be influenced by the protein phosphorylation, acetylation and/or by binding of other proteins. We have studied binding of full length p53 to DNA using 1) monoclonal antibodies mapping different epitopes of protein p53 and 2) oxidation of cysteine residues in its central domain. We have found that reduced protein p53 in absence of antibodies bound selectively to scDNA in presence of 3 kb linear DNA or 20-mer oligonucleotide (with or without p53CON). Complexes of p53 with monoclonal antibodies mapping the CTDBS bound equally sc and linDNA without p53CON but preferred linDNA with p53CON. Such p53 immune complexes could bind DNA only via its sequence specific site within its central (core) domain. The same immune complex with oxidized protein did not bind DNA because oxidized p53 has no active DNA binding site. Oxidized p53 bound selectively scDNA in absence of monoclonal antibodies but with a lower preference than the reduced protein. On the other hand antibodies mapping N-terminal domain of p53 did not change the ability of p53 bind scDNA regardless of its redox state. These results suggest that C-terminal DNA binding domain of full length protein is responsible for the selective binding to supercoiled DNA. This work was supported by a grant of GACR No. 204/02/0734

INHIBICE OXIDACE SÍRY ARSENEM U BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS

FERROOXIDANS INHIBITION OF ELEMENTAL SULFUR OXIDATION BY ARSENIC IN

ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS

Blanka Pokorná, Martin Mandl, Pavla Gavlasová Katedra biochemie, PřF MU, Kotlářská 2, Brno 611 37

This work deals with the inhibitory effects of arsenic ions on the oxidation of elemental sulfur by acidophilic chemolithoautotrophic mesophilic bacteria Acidithiobacillus ferrooxidans. The bacteria play an important role in nature and biotechnology because they are involved in the biodegradation of sulfide minerals, including arsenopyrite. Its biooxidation is inhibited by arsenite and arsenate ions as well as by other toxic metals. Inhibition of elemental sulfur oxidation by arsenic is a part of overall inhibitory reactions.

35

The kinetic analysis of the inhibition of sulfur biooxidation by As(III,V) in the bacterial suspension demonstrated a non-competitive type of inhibition, which is summarized in the following table:

As(III) As(V) EC50 = 1,25 mmol l-1 EC50 = 80 mmol l-1

Ki = 1,3 ± 0,3 mmol l-1 Ki = 46,8 ± 8,8 mmol l-1 It was found that the inhibitory effect of As(III,V) in the growing culture was much lower than that in bacterial suspension obtained after bacteria separation from the growing culture. Bacteria under active growth probably have a detoxification system and arsenic ions are transported out of the cells. The absence of ATP could explain the inability of separated bacteria to transport toxic ions. We observed an As(V)-reductase activity which could increase the inhibitory effect of As(V). In the growing culture, the concentration of As(III) remained identical all the time but in samples that contained only As(V), As(III) started to appear after a few days. To explain the As(V)-reductase activity, different chemical As(V) reductions were investigated using possible sulfur metabolites. We assume that the As(V)-reductase activity is probably due to the effect of Na2S2O3 and Na2SO3. In addition to these metabolites, there is another possibility of As(V) reduction by iodinin, a metabolic pigment isolated by our group. The pH of environment seems not to have any influence on the As(V)-reductase activity. The activity is directly connected with the growing cells. When the bacteria stoped growing, the As(V)-reductase activity was not observed. The observed As(V)-reductase activity could have an unfavorable effect on the production of the more toxic As(III). The low rate of the As(V) reduction indicates the low concentration of sulfur metabolite or a low rate constant of the reduction reaction.

SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY – DIAGNOSTICKÝ A PROGNOSTICKÝ NÁSTROJ K URČOVÁNÍ MÍRY PLODNOSTI

SPERM CHROMATIN STRUCTURE ASSAY – A DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC TOOL FOR FERTILITY ASSESSMENT

Roman Rybář, Ludmila Faldíková, Martin Faldyna, Marie Machatková, Jiří Rubeš

Veterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno, Czech Republic Analysis of sperm parameters is very important for predicting the outcome of assisted reproductive techniques and is necessary for determination of fertility potential of males tested for artificial insemination. In our study we have determined the level of bull and boar sperm DNA damage by Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). This test is based on increased susceptibility of altered DNA (strand breaks) in sperm nuclear chromatin to in situ denaturation measured by flow cytometry after staining with acridine orange (AO). AO associated with single (denaturated) and double (native) stranded DNA emits red and green light, respectively. Chromatin damage is then quantified by red/(red + green) fluorescence. Each semen sample contains the main population (spermatozoa with non-detectable DNA Fragmentation Index – non-detectable DFI) and spermatozoa with increased chromatin damage (spermatozoa with detectable DNA Fragmentation Index - DFI). Spermatozoa with detectable DFI are divided into two subsets (moderate and high DFI, according to the level of sperm chromatin damage). The next evaluated parameter is the percentage of immature cells

36

(HDS; cells with High DNA Stainability). We measured sperm SCSA parameters in a total of 37 bulls in two groups from different localities and 68 boar samples from one locality. Significantly higher DFI was detected in six bulls (16.2% of all bulls tested) and a significantly higher percentage of HDS (immature cell forms) was found in another six bulls (16.2%) in comparison with all bulls. The means of high DFI and HDS of bulls from the second group were statistically higher than those from the first group (P<0.01). Five individual boars (7.4% of all boars tested) had significantly higher DFI and 18 boars (26.5%) had significantly higher HDS compared to the other boars. Both DFI and HDS were significantly higher in a single boar compared to the others. Boars tended to have significantly higher percentages of high DFI and HDS (P<0.0001) in comparison to bulls. In bulls, the highest DFI and HDS were 20.8% and 3.5%, respectively while for boars these were 17.6% and 10.2%, respectively. No significant correlations were found between DFI and HDS. This method has also been widely used in the field of infertility treatment in human medicine all over the world as this method correlates poorly or does not correlate at all with standard parameters of human semen quality. No correlations between standard semen characteristics and SCSA parameters of 21 men suffering from infertility problems attending the centre for assisted reproduction were found. This sensitive procedure seems to be convenient as additional method for semen quality detection both in men and in farm animals before their exploitation in breeding.

THE ROLE OF THE ARABIDOPSIS HOMEOBOX GENE KNAT1 IN SHOOT DEVELOPMENT

Přemysl Souček1,2, Petr Klíma1,2, Alena Reková1, Břetislav Brzobohatý1,2

1 Institute of Biophysics AS CR, Královopolská 135, CZ-61265, Brno, Czech Republic 2 Dept. of Functional Genomics and Proteomics, Masaryk University, Kotlářská 2, CZ-

61137, Brno, Czech Republic Plant homeobox genes participate in various developmental processes such as embryo development, organogenesis, meristem maintenance etc. Based on their sequence similarity the homeobox genes were sorted into several subclasses. KNAT1, the member of a subfamily of the Knotted1-like homeobox genes, is involved in the formation of inflorescence stem architecture, including internodes and pedicels elongation. The presence of KNAT1 transcripts in the shoot apical meristem and altered leaf phenotype of KNAT1 overexpressing plants indicate possible role in meristem growth regulation and leaf morfogenesis. Partial phenotypical similarity of 35S-KNAT1 plants to cytokinin overproducing plants lead to formulation of hypothesis, that cytokinins and homeobox gene KNAT1 act in the same signaling pathway. To verify this hypothesis we investigated the rate of KNAT1 expression in apexes, hypocotyls and leaves of plants having both endogenously and exogenously increased levels of cytokinin. A transcription activation system (pOp/LhG4) was used for raising the cytokinin production by expressing the bacterial isopentenyltransferase (ipt). All tested lines carried marker gene GUS downstream of KNAT1 promoter (this transgene has been established for histochemical analysis). GUS staining technique of plants treated/untreated by artificial cytokinin benzyladenin or of those expressing/unexpressing ipt shows negative correlation between cytokinin level and KNAT1 expression in apexes. None of the plants show staining in leaves. Thus serrated leaves of the cytokinin overproducing plants are not the result of the ectopic expression of KNAT1 in blades.

37

In contrast to inflorescence stem, where KNAT1 expression is localized to cortical tissue, in hypocotyls the staining is concentrated in vasculature or vasculature connected tissues. The length of hypocotyl has been shown to be directed by light intensity. The weaker illumination of the plants the longer hypocotyls they form. In our experiments we have shown that cytokinins have the ability to cooperate in the process of hypocotyl elongation and that KNAT1 gene is one of those, the expression of which depends on light illumination not only in hypocotyls but also in apexes. Apperently, weaker light intensity leads to KNAT1 induction as well as hypocotyl elongation. This work was supported by grants MSM143100008 and LN00A081 from the Ministry of Education of the Czech Republic and a grant IAA5004001 from the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic.

APLIKACE METODY SDS-PAGE V TAXONOMII GRAMPOSITIVNÍCH KOKŮ THE APPLICATION OF THE SDS-PAGE METHOD IN THE CLASSIFICATION

OF GRAM-POSITIVE COCCI

Vlastimil Štětina1 1 Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Česká sbírka mikroorganismů,

Tvrdého 14, 602 00 Brno

The analysis of protein profiles of bacteria belongs among methods useful for taxonomic studies of both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The method is used in its standardized form - the sds-page electrophoresis of whole-cell proteins is used. The capability of the method for the identification purposes is comparable to the biochemical methods. In the Czech Collection of Microorganisms the analysis of the protein profiles has been applied to characterization of members of the Gram-positive group of bacteria, both catalase negative cocci and catalase positive cocci. Examples of the using of the protein analysis method are given: characterization of bacteriocins producing enterococci (Enterococcus faecium group), characterization of representatives of novobiocin resistant, oxidase positive staphylococci, unusual isolate - Staphylococcus piscifermentans identification, characterization of macrococci-like isolates. This work was supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 301/02/1505) and the Ministry of Education of the Czech Republic (project "KONTAKT" 164/2002-2003).

38

PREPARATIVNÍ SDS-PAGE: PURIFIKACE NUKLEOKAPSIDOVÉHO PROTEINU N VIRU REPRODUKČNÍHO A RESPIRAČNÍHO SYNDROMU PRASAT

EXPRIMOVANÉHO PROSTŘEDNICTVÍM BAKULOVIROVÉHO VEKTORU V HMYZÍCH BUŇKÁCH

PREPARATIVE SDS-PAGE: PURIFICATION OF THE NUCLEOCAPSID PROTEIN N OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS EXPRESSED BY MEANS OF A BACULOVIRUS VECTOR IN INSECT CELLS

R. Tesařík, I. Pšikal, E. Kosinová, L. Rodák

Veterinary Research Institute, 621 32 Brno, Hudcova 70, Czech Republic e-mail: tesarik@vri.cz

Preparative SDS-PAGE of the recombinant nucleocapsid protein N (rN) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was performed using a Prep Cell Model 491 (Bio-Rad) connected to FPLC system (Pharmacia). Protein N of the European serotype of PRRSV (V-516) was expressed using a recombinant baculovirus expression system Bac-N-Blue (Invitrogen). Complete protein N gene was cloned into pBlueBac4.5 transfer vector that contain strong polyhedrin promotor, signals for termination of transcription, polyadenylation and other sequences neccesary for homologous recombination. Transfer vector was co-transfected with linearised baculovirus Bac-N-BlueTMDNA into insect cell (Sf-9) and after homologous recombination yielded recombinant baculovirus that was able to replicate and infect insect cell. The selection of recombinant baculoviruses (occ-) capable to express the protein N was done by β-galactosidase assay. The production and identity of the ~15kD recombinant protein N was tested by SDS-PAGE under reducing condition and by immunoblotting with a PRRS-positive polyclonal porcine blood serum.

The recombinant protein N was purified from the cell mixtures by preparative electrophoresis. Denaturing polyacrylamide tube gels (37mm ID) for stacking (4%, 1cm) and resolving (14%, 7.5cm) were used. After sample application (5 x 106 infected cells per 3ml of SDS-PAGE sample buffer) the running conditions were set to constant power 12W for 12h. Fractions of 2.5ml were collected and analyzed by SDS-PAGE and by immunoblotting. Fractions including of pure nucleocapsid protein N were pooled and used as described above. The concentrations of purified rN ranged from 80 to 250 µg/ml. Total yield of rN was 1mg per one run (the purity above 95%).

An indirect ELISA using purified rN as the antigen (2µg/ml) was developed for detecting antibodies against PRRSV in swine sera. Validation of this assay was done with 154 samples of sera previously tested by the diagnostic set IDEXX HerdCheck® ELISA. Specificity of indirect rELISA was 100% and sensitivity reached 90%. The results indicate that expression of recombinant nucleocapsid protein N of PRRSV in insect cells followed by preparative SDS-PAGE purification contribute to the high quality antigen preparation for diagnostic use. Acknowledgement: This work was supported by the Ministry of the Agriculture of the Czech Republic (MZE-M03-99-01).

Y

METABOLISM OF ABY CY

Dagmar Aimováa, Jitka Poljakováa, Z

Dohalskáa, Jan Sejbalb, Rob

aDepartment of Biochemistry, bDepCharles University, Albertov

cDepartment of Molecular ToxicologFeld 280, 6

Ellipticine and several of its deriva

exhibiting significant antineoplastic anP450 (CYP)-dependent metabolism ofefficient metabolite(s) forming DNA adare the most efficient enzymes activatthese data, ellipticine might be considgenotoxic side effects are dependent oof ellipticine metabolites formed by CYwe investigated the metabolites of this

Five metabolites containing an oxyfrom ellipticine by CYPs; two of theellipticines. Both of these metabolitemetabolites M3 and M5 were identellipticine, respectively. The location M2, has not been determined as yetellipticine metabolites (M2, M3, M5).metabolites responsible for formation deoxyguanosine in DNA. The reaction

References [1] Stiborova M., Breuer A., Aimova

J. Cancer 107 (6): 885-890 (2003).[2] Stiborova M., Bieler C.A., Wiessle

(2001). [3] Frei E., Bieler C.A., Arlt V., Wiess

295 (2002). [4] Stiborova M., Stiborova-Rupertova

Res. Toxicol. 16 (1): 38-47 (2003). Supported by Grant Agency of the CzEducation of the Czech Republic (grant

POSTER

NTICANCER DRUG ELLIPTICINE TOCHROMES P450

uzana Manhartováa, Anna Březinováa, Lucie Bořek-ert Owenc, Eva Freic and Marie Stiborováa

artment of Organic Chemistry, Faculty of Science, 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic; y, German Cancer Research Center, In Neuenheimer 9120 Heidelberg, Germany

tives isolated from Apocyanaceae plants are alkaloids d anti-HIV activities. We described that cytochrome ellipticine leads to activation of this agent to more ducts iv vivo [1] and in vitro [2,3,4]. CYP3A4 and 1A

ing ellipticine to form DNA adducts. On the basis of ered a drug, whose pharmacological efficiency and/or n its metabolic activation in target tissues. The pattern

Ps has not been characterized so far. Therefore, here anticancer drug formed by CYP catalyzed reactions. gen atom in their molecules (M1-M5) were generated m were identified to be 9-hydroxy- and 7-hydroxy-s were predominantly formed by CYP1A1/2. The ified to be 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of of the hydroxy group in further ellipticine metabolite, . CYP3A is the major enzyme generating all three 5-hydroxyellipticine and N(2)-oxide of ellipticine are of two major ellipticine-derived adducts generated on mechanism of their formation is discussed.

D., Stiborova-Rupertova M., Wiessler M., Frei E.: Int. r M., Frei E.: Biochem Pharmacol 62 (12): 1675-1684

ler M., Stiborová M.: Biochem Pharmacol 64 (2): 289-

M., Borek-Dohalska L., Wiessler M., Frei E.: Chem.

ech republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of MSM 113100001).

39

40

STUDIUM BIOLOGICKÉ AKTIVITY NAFTOCHINONŮ STUDY OF BIOLOGICAL ACTIVITY OF NAPHTHOQUINONES

Petr Babula1, René Kizek2, Ladislav Havel3, Miroslav Strnad4, Zdeněk Sladký1

1Ústav přírodních léčiv, VFU Brno, Palackého ¼, 602 00 Brno 2Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1,613 00 Brno

3Ústav botaniky a fyziologie rostlin, MZLU Brno, Zemědělská 1,613 00 Brno ,4Laboratoř růstových regulátorů UP a AV ČR, UP Olomouc, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc

Hledání nových antibakteriálních a cytotoxických látek se v době, kdy prudce narůstá incidence civilizačních chorob, dostává do popředí zájmu mnoha vědních oborů. Mezi nově zkoumané látky patří také naftochinony, mezi které patří také juglon, plumbagin a lawson. Některé vystupují jako hlavní obsahové látky hospodářsky zcela nevýznamných rostlin, jako je např. masožravá láčkovka Dionaea muscipula Ell.

V našich testech byly naftochinony ve formě extraktů z rostlin, které je obsahují, podrobeny testování na potenciální antimikrobní a antifungální aktivitu, některé jednotlivě izolované naftochinony pak byly podrobeny testům na potenciální cytotoxicitu a inhibici některých tyrosinkináz.

Pro studium antimikrobní a antifungální aktivity extraktů byla zvolena disková difůzní metoda, jako testované mikroorganizmy byly zvoleny Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus CCM4223 a Candida albicans GD8186. V našich testech byl zjištěn výrazný efekt metanolického a petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. a Nepenthes sp. na Staphyloccocus aureus a velmi výrazný antifungální efekt metanolického i petroléterového extraktu Dionaea muscipula Ell. na patogen Candida albicans. Testy prokázaly jen malou citlivost Escherichia coli k testovaným extraktům. Plumbagin, juglon, 3-hyroxy-1,4-naftochinon a lawson byly testovány na cytotoxické vlastnosti na nádorových buněčných liniích K-562 (chronická myeloidní leukémie) a MCF7 (karcinom prsu). Plumbagin, 3-hyroxy-1,4-naftochinon a juglon prokázaly velmi výrazný cytotoxický efekt srovnatelný s efektem některých komerčně využívaných cytostatik. Proto byly tyto látky testovány na inhibici kináz CDK1/CDK2. Efekt na inhibici těchto kináz byl ovšem málo výrazný, jejich cytotoxický efekt nebylo možné připsat na vrub pouze inhibici těchto kináz. Některé práce ukazují na schopnost naftochinonů interkalovat do DNA, jiné prokazují inhibici inkorporace thymidinu do DNA nádorových buněk. Dle mého názoru je tento efekt zprostředkován chemickými vlastnostmi naftochinonů spolu s výše popsanými jevy. Co se vztahu struktury a cytotoxického efektu naftochinonů týká, ukazuje se, že roli zde hraje substituent v poloze 2 naftochinonového skeletu. Literatura

1.) Elangovan V., Ramamoorthy N., Balasubramanian S., Sekar N., Govinsamy S.: Studies of antiproliferative effect of some naturally occuring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma – 180 cell lines, Indian Journal of Pharmacology 26, 266-269 (1994)

2.) Plyta Z., Li T., Papageorgiu V., Mellidis A., Assimopoulou A.: Inhibition of topoisomerase I by naphthoquinone derivates, Bioorg. Med. Chem. Letter 8, 23, 3385-3390 (1998)

3.) Fujii N., Yamashita Y., Arima Y., Nagashima M., Nakano H.: Induction of topoisomerase II-mediated DNA claevage by the plant naphthoquinones plumbagin and shikonin, Antimicr. Agents Chemother. 36, 12, 2589-2594 (1992)

41

4.) Muto N., Inouye K., Inada A., Nakanishi T., Tan L.: Inhibition of cytochrome p-450 linked monoogygenase systems by naphthoquinones, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146, 2, 487-494 (1987)

Poděkování Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

VLIV GENŮ DOBY DO KVETENÍ NA EXPRESI GENU FLC. INFLUENCE OF FLOWERING TIME GENES ON THE FLC GENE EXPRESSION.

Simona Balková, Pavel Lízal, Jiřina Relichová

Masarykova Univerzita Brno, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno, Česká republika

Cílem práce bylo zavedení metodiky a stanovení vlivu vybraných genů pozdnosti na expresi genu FLC (Flowering Locus C) u modelového objektu Arabidopsis thaliana. Bylo vybráno osm genů podílejících se na regulaci přechodu rostliny z vegetativní do reprodukční fáze vývoje, které byly již dříve charakterizovány pomocí pozdně kvetoucích mutantů. Geny M63 a M73 byly na základě předchozích pokusů zařazeny do autonomní dráhy regulace doby do kvetení a pomocí zbylých šesti genů (dn, L4, L5, L6-1, L6 a Spi) byla charakterizována nová metylační dráha. Při přechodu rostlin do reprodukční vývojové fáze hraje významnou roli gen FLC, jehož produkt působí jako inhibitor tohoto přechodu. V případě autonomní regulační dráhy je znám indukční účinek mutantních genů této dráhy na expresi genu FLC. Cílem bylo potvrdit tento indukční účinek u dvou pozdně kvetoucích mutací (M63 a M73) a zjistit jaký vliv mají na expresi genu FLC mutantní geny metylační dráhy. Byla zavedena metodika stanovení exprese genu FLC u mutantních linií metodou RT-PCR. U standardních linií S96 a Di-G, které představují genetické pozadí použitých linií, nebyla zjištěna přítomnost transkriptu genu FLC. Naopak u všech osmi pozdně kvetoucích mutantů byl gen FLC exprimován. Analýzou jednotlivých orgánů mutantní rostliny Spi byla prokázána exprese pouze v orgánech vegetativní vývojové fáze. U mutantních genů autonomní regulační dráhy (M63 a M73) byl tedy potvrzen indukční vliv těchto genů na expresi genu FLC. Dále bylo zjištěno, že mutantní geny nově charakterizované metylační dráhy mají také indukční účinek na expresi genu FLC a byl tak potvrzen předpoklad, že i geny této dráhy regulují přechod rostliny z vegetativní do reprodukční vývojové fáze přes centrální inhibitor FLC. Bylo potvrzeno, že u pozdně kvetoucích rostlin dochází při přechodu do reprodukční fáze vývoje k utlumení syntézy tohoto inhibitoru kvetení. Tato práce vznikla za finanční podpory grantového projektu Grantové agentury České republiky č.521/02/P127.

42

STUDIUM VLIVU TĚŽKÝCH KOVŮ NA RŮST BAKTÉRIÍ EFFECT OF HEAVY METALS ON GOWTH BACTERIA

Jana Batůšková1, Pavla Novotná1, Josef Zehnálek1, Jan Vacek1, Libuše Trnková3

René Kizek1

1Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno,2Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv, Hudcova 56a, 621 00 Brno, 3Katedra teoretické

a fyzikální chemie PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno,

Nejrůznější zdroje znečištění přinutily mikroorganismy, rostliny i živočichy k vytvoření ochranných mechanismů. V jejich životním prostředí je přítomna celá škála prvků včetně těžkých kovů (Mr > 5 g.cm–3), které představují jednu z nejvýznamnějších skupin toxických látek. Mechanismy detoxifikace a metabolismus těžkých kovů jsou intenzivně studovány u různých organismů. Zenk uvádí, že experimentálně bylo po expozici ionty kadmia studováno již 200 druhů rostlin. V naší práci jsme využili spektrální techniky pro studium růstu bakteriálních kultur a pro stanovení těžkých kovů (kadmia a olova) v biologické matrici bylo využito elektroanalytických technik. Elektrochemické analýzy byly provedeny na přístroji AUTOLAB v tříelektrodovém systému zapojení VA-Stand 663 Methrom s pracovní rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE) – povrch kapky 0.4 mm2, referentní Ag/AgCl/3 M KCl a pomocnou Pt-elektrodou. Pro stanovení nanomolárních až pikomolárních koncentrací kadmia v buněčných extraktech jsme především využívali diferenční pulzní anodickou rozpouštěcí voltametrii (Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry - DPASV) ve spojení s visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE).

Baktérie Escherichia coli a Staphylococcus epidermidis byly kultivovány nejdříve na živném agaru při teplotě 37 °C. Kadmium bylo do média přidáno v koncentraci 1, 5 a 10 µmol/l a médium bylo intenzivně třepáno. Růstové křivky byly sestrojeny změřením absorbance při 600 nm na přístroji Hewlett Packard 8453. Na základě našich získaných výsledků jsme pozorovali růstovou depresi u obou bakteriálních druhů. Obranné mechanismy a vstup těžkých kovů do bakterií není stále plně objasněn, a zcela jistě zde bude hrát významnou roli metallothionein a metallothioneinu podobné proteiny. Poděkování Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

Literatura 1) Oehme I., Wolfbeis O.S., Mikrochim. Acta, 126, 177–192, 1997 2) Robards K., Starr P., Analyst, 116, 1247–1273, 1991 3) Macka M., Haddad P.R., Electrophoresis, 18, 2482–2501, 1997 4) Strouhal, M., Kizek, R., Vacek, J., Trnková, L., Němec, M., Bioelectrochemistry, 60, 29–36, 2003 5) Kizek R., Trnková L., Ševčíková S., Šmarda J., Jelen F., Anal. Biochem., 301, 8–13, 2002 6) Kizek R., Vacek J., Trnková L., Klejdus B., Kubáň V., Chem. Listy 97, 1003–1006, 2003

43

PŘÍPRAVA VHODNÝCH SOND PRO IDENTIFIKACI T-DNA MUTANTŮ ARABIDOPSIS THALIANA METODOU SOUTHERNOVA PŘENOSU.

PREPARATION OF SUITABLE PROBES FOR IDENTIFICATION OF T-DNA MUTANTS BY SOUTHERN HYBRIDIZATION IN ARABIDOPSIS THALIANA.

Jana Bedřichová, Jana Řepková

Masarykova Univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2, 602 00 Brno

Arabidopsis thaliana je modelový organismus, často využívaný při inzerční mutagenezi s cílem identifikovat jednotlivé rostlinné geny. Pomocí inzercí T-DNA lze sledovat lokalizaci přerušeného genu a jeho důsledek pro organismus. Začlenění T-DNA do rostlinného genomu vede k inzerční mutaci, která má genotypové i fenotypové projevy. Místo, kam se inzert do genomu začlenil, můžeme zjistit na úrovni fenotypu, ale především na úrovni DNA molekulárními metodami. K jednoznačnému důkazu identifikace primárních transformantů slouží metoda Southernova přenosu. Touto metodou lze efektivně zjistit přítomnost či absenci sekvencí inzertu, počet kopií inzertu a informaci o jeho možném přeuspořádání. Cílem projektu bylo vytvořit vhodné sondy, které budou hybridizovat k pravé a levé hraniční sekvenci inzertu a sondu pro oblast obsahující gen NPT II (neomycinphosphotransferase) kódující rezistenci ke kanamycinu. Pro přípravu sond byl použit plazmidový vektor pBGF-0, který byl naštěpen různými enzymy v restrikčních místech vyskytujících se na T-DNA a PCR amplifikace s vhodnými primery nasedající na vnitřní oblast genu NPTII. Rostlinná genomová DNA, která je výchozím materiálem pro Southernův přenos, byla získána z transgenních linií KAT, které vznikly vakuovou infiltrací rostlin A. thaliana na pozadí Wasiljevskaja bakteriemi Agrobacterium tumefaciens. Součástí inzertu těchto linií je signální gen GFP se specifickým promotorem KAT1 zajišťující expresi genu v buňkách průduchů. Takto připravené sondy budou dále využity při identifikaci a podrobné analýze primárních transformantů A. thaliana. Výsledky uváděné v této publikaci byly získány za finanční podpory projektu MSM 143100008 uděleného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.

STRESOVÁ ODEZVA KAROTENOGENNÍCH KVASINEK NA PŮSOBENÍ EXOGENNÍCH STRESOVÝCH FAKTORŮ

STRESS RESPONSE OF CAROTENOGENIC YEASTS TO EXOGENOUS STRESS FACTORS

Drábková M., Kočí R., Kubešová J., Márová I., Omelka L.

Technical University in Brno, Faculty of Chemistry, Department of Food Chemistry and Biotechnology, Purkyňova 118, 612 00 Brno, Czech Republic

Different types of environmental and physiological stress conditions constantly challenge all living organisms. Stress responses are of particular importance in microorganisms, whose environment is highly variable and conditions such as temperature, osmolarity and nutrient availability are far from constant. In this work two strains of red yeasts (Rhodotorula glutinis, Sporidiobolus salmonicolor) producing carotenoids as protective agents against oxidative stress and/or UV damage were exposed to several types of exogenous stress: oxidative stress (2-10 mM H2O2), osmotic stress

44

(2-10% NaCl), heavy metals (3-5 mM NiCl2), temperature (20-45°C) and intensity of aeration. During the experiment growth characteristics, production of carotenoids, ergosterol and glycerol were followed. Carotenoids were overproduced mainly under oxidative stress, but the other stresses also led to changes in pigment formation. Both tested strains were very sensitive to higher concentration of NaCl and NiCl2. In Sporidiobolus salmonicolor addition of 10 mM H2O2 into production medium led to about 3-fold increase of �-carotene production, while pigment production by Rhodotorula glutinis was higher in medium with 5 mM H2O2. However, in both strains, addition of low amount of NaCl (2 mmol/l) into inoculum medium followed by addition of H2O2 (5 mmol/l) into production medium led to higher production of carotenoids (3.5-times) and to increased tolerance not only to the same stress factor but also to stress caused by other agents. Higher temperature (34 - 40°C) as well as optimal amount of oxygene in cultivation medium led to increased of carotenoid production too. The production of glycerol, which acts as osmoregulator was completely inverse to �-carotene production. Overproduction of carotenoids in yeast cells increases their ability and/or adaptability to grow under various stress conditions. Yeast cells exhibited cross-protection against different stress agents, thus, carotenoids probably take part in general stress response of red yeast.

TESTOVÁNÍ NOSIČŮ AKTIVOVANÝCH IONTY LANTHANOIDŮ PŘI ŠTĚPENÍ PLAZMIDOVÉ DNA

TESTING OF CARRIERS ACTIVATED WITH LANTHANIDE IONS BY CLEAVAGE OF PLASMID DNA

Magdaléna Dudová, Alena Španová, Bohuslav Rittich

Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14, 602 00 Brno

Pro štěpení plazmidové DNA se využívají enzymy – restrikční endonukleázy. Kromě přírodních enzymů lze ke štěpení použít i neenzymatické systémy, např. kovy vzácných zemin – lanthanoidy. V případě použití volných lanthanoidových iontů je obtížné definovaně ukončit reakci ( např. při použití EDTA bylo zjištěno, že vzniklé cheláty rovněž štěpí plazmidovou DNA). Tento problém lze odstranit použitím nosičů funkcionalizovaných chelátovými skupinami, které jsou aktivovány vhodnými ionty. Bylo testováno použití nemagnetických nosičů, aktivovaných ionty lanthanoidů, při štěpení plazmidové DNA pBR322. Jako nosiče byly použity: methakrylátový kopolymer se skupinami EDTA (ethylen diamino tetraoctová kyselina) a Chelex 100 – polystyren se skupinami IDA (iminodioctová kyselina). Nosiče byly aktivovány vybranými lanthanoidovými ionty – Nd3+, La3+, Pr3+, Gd3+ a Eu3+. Štěpící směs pro každý ion obsahovala 0,3 µl plazmidové DNA pBR322 (1 µg/µl), 2 µl reakčního HEPES pufru ( 0,05 M), 10 µl nosiče aktivovaného příslušným lanthanoidovým iontem a 7,7 µl sterilní vody. Štěpící reakce probíhala při 76°C. Štěpení plazmidové DNA bylo sledováno pomocí gelové elektroforézy na agaróze, na níž lze rozlišit různé strukturní formy plazmidu: nadšroubovici, relaxovanou formu vznikající po ss zlomu v jednom řetězci a lineární formu vznikající po ds zlomu obou řetězců. Bylo zjištěno, že ionty zavádějí do plazmidové DNA jak ss, tak ds zlomy. Rozdíly v rychlosti štěpení plazmidové DNA lze vysvětlit různými vlastnostmi jednotlivých iontů i použitých nosičů

45

IDENTIFIKACE A CHARAKTERIZACE GENŮ DETERMINUJÍCÍCH EMBRYOGENEZI PROSTŘEDNICTVÍM T-DNA MUTACÍ ARABIDOPSIS

THALIANA IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF GENES DETERMINING EMBRYOGENESIS BY MEANS OF T-DNA MUTATIONS IN ARABIDOPSIS

THALIANA

Markéta Dudová, Zdeňka Kyjovská, Jana Řepková, Tomáš Kocábek2 MU v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2,

611 37 Brno Jihočeská univerzita, České Budějovice2

Jedním z nejlépe prostudovaných zástupců rostlin v oblasti molekulární biologie a genetiky je Arabidopsis thaliana, huseníček rolní. V roce 2000 bylo v rámci projektu The Arabidopsis Geonome Initiative kompletně dokončeno sekvencování genomu této rostliny. V současné době je v popředí snaha o identifikaci funkcí jednotlivých genů a jejich vzájemných vztahů. Tato práce se zaměřila na genetickou a molekulární analýzu tří nových mutantních linií, které byly indukovány T-DNA inzerční mutagenezí a nesou embryonální defekty. Inzert T-DNA nese selektovatelný gen pro enzym hygromycinfosfotransferázu. U jednotlivých linií byl mutantní fenotyp sledován prostřednictvím studia anatomie embryogeneze metodou projasňování semen chloralhydrátem. U linie 1321 byl pozorován defekt embrya ve stádiu zralosti doprovázený defektem tvorby pigmentu. U linie 1293 byla inhibována tvorba listových primordií, jejímž důsledkem byla absence děloh u embrya. Atypické dělení buněk v apikální části embrya od globulárního stádia vývoje bylo pozorováno u linie 1265. Podrobná genetická analýza generací F1 a F2 potomstva křížení rostliny standardní a heterozygotní pro sledované mutace potvrdila jejich monogenní a recesivní typ dědičnosti. U linie 1293 bylo provedeno genetické mapování mutantní alely lokusu prostřenictvím DNA markerů. Byla potvrzena vazba s mikrosatelitovým markerem nga 63 a pozice sledovaného lokusu byla určena na 10,4 cM od začátku chromozomu 1. Obsahem další analýzy bude ověření kosegregace T-DNA inzertu s mutací, což bude rozhodující pro volbu strategie izolace jednotlivých genů. Výsledky uváděné v této publikaci byly získány za finanční podpory projektů MSM 143100008 a FRVŠ 64/547 udělených Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.

ANALÝZA PROTEOMU POLYVALENTNÍHO BAKTERIOFÁGA 812 PROTEOME ANALYSIS OF THE POLYVALENT BACTERIOPHAGE 812

Eyer, L.1, Konečná, H.2, Zdráhal, Z.2, Preisler, J.3, Pantůček, R.1, Doškař, J.1

1 Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

2Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky, Kotlářská 2, 611 37 Brno

3Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Bakteriofág 812 je polyvalentní stafylokokový fág, lyzující široké spektrum druhů rodu Staphylococcus, převážně pak kmeny druhu S. aureus. Pro své lytické vlastnosti je vhodným kandidátem pro fágovou terapii, při níž jsou bakteriofágy využívány pro léčbu

46

stafylokokových infekcí, převážně těch, které jsou vyvolány kmeny rezistentními k antibiotikům. V této práci se zaměřujeme na analýzu fágového proteomu, a to především na strukturní a lytické proteiny, které mají vztah k rozmezí hostitele. Fág 812 byl pomnožen na kmeni S. aureus SA812, purifikován ultracentrifugací v gradientu CsCl a dialyzován proti vodě. DNA uvolněná z fágových částic byla odstraněna DNázou I. Fágové proteiny byly denaturovány krátkodobým povařením s pufrem obsahujícím SDS a DTT a analyzovány jednorozměrnou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Po obarvení gelu pomocí Coomassie Brilliant Blue nebo stříbra bylo nalezeno přibližně 15 pruhů. 6 z nich bylo výrazných. K identifikaci proteinů v 12 pruzích byla použita metoda peptidového mapování. Proteiny byly podrobeny specifickému štěpení trypsinem a m/z získaných peptidů (peptidové mapy) pro daný protein byly změřeny MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight) hmotnostní spektrometrií. Tyto peptidové mapy byly porovnávány s teoretickými peptidovými mapami již známých proteinů fága 812. Aminokyselinové sekvence těchto proteinů byly získány přepisem známých sekvencí fágové DNA. Z dosud analyzovaných proteinů byly identifikovány tři, z nichž dva jsou určeny jako strukturní - hlavní kapsidový a hlavní bičíkový protein, funkce třetího proteinu zatím nebyla zjištěna. V současné době studujeme rozdíly v proteomu fága 812 a příbuzných fágů SK311 a U16 s cílem zjistit, jak tyto rozdíly souvisejí s jejich odlišným hostitelským rozmezím. Práce byla podporována granty MŠM 143100008, GAČR 203/03/0515 a FRVŠ 796/2003.

ANALÝZA POSTTRANSLAČNÍCH MODIFIKACÍ PROTEINU P53, NA PANELU BUNĚČNÝCH LINIÍ SE ZNÁMÝM STATUTEM P53, PO ÚČINKU CYTOSTATIK.

Šárka Helánová, Petr Müller, Roman Hrstka, Pavla Češková a Bořivoj Vojtěšek

Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno

P53 je oligomerní fosfoprotein, který se váže na specifické sekvence DNA a tím aktivuje nebo inaktivuje transkripci cílových genů jak in vivo tak in vitro. Různé funkce proteinu p53 jsou regulovány sérií jeho postranslačních modifikací jako jsou fosforylace nebo acetylace. Jedním z nejdůležitějších míst fosforylace proteinu p53 je serin 15 jehož modifikace vede k rozrušení vazby mezi p53 a MDM2 a má za následek (i) stabilizaci nemutované formy proteinu p53, (ii) porušení jeho transportu z jádra a (iii) stimulaci jeho transkripční aktivity spojené se zvýšenou asociací s koaktivátorem p300. Druhou kritickou modifikací proteinu p53 je fosforylace serinu 392 na C-konci. Studie podporující onkogení účinek proteinu p53 ukázaly, že bodové mutace v genu kódujícím p53 protein mají za následek vznik strukturálně odlišného proteinu 53. Tyto bodové mutace, které vykazují různé biologické vlastnosti, byly rozděleny do dvou funkčních tříd: (i) mutace v místech, která přímo ovlivňují kontakt s DNA a (ii) mutace podílející se na stabilizaci strukturální integrity této domény. Přestože tyto fosforylace mohou ovlivnit konformační změny nemutovaného i mutovaného proteinu p53 a tím rovněž změnit jeho DNA vazebnou aktivitu, skutečný význam fosforylace p53 na serinech 15 a 392 ve vztahu k tumorigenezi lidských nádorů s aberantní expresí mutované formy proteinu p53 je stále nejasný. Úloha různých typů používaných cytostatik na posttranslační modifikace proteinu p53 je rovněž nejasná a je nutné provést danou analýzu nejen ve vztahu k mutované a nemutované formě proteinu p53, ale také k typu bodové mutace.

Cílem naší studie bylo zjistit zda existuje souvislost mezi statutem posttranslačních modifikací proteinu p53 na obou výše zmiňovaných místech a reakcí nádorových buněčných linií na používaná cytostatika. Naše výsledky ukazují, že vlivem použití rozdílných cytostatik

47

dochází k rozdílné fosforylaci proteinu p53 na serinu 15 a serinu 392. Tyto fosforylace však neovlivňují DNA vazebnou aktivitu ani stabilitu proteinu p53 jak je známo u nemutované formy proteinu p53. Dle získaných výsledků vyplývá, že typ bodové mutace může ovlivnit výsledný stupeň modifikace. Práce byla podporována granty IGA MZ ČR 7131-3/2002 a GA ČR 301/02/0831

VZTAH BAKTERIE ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS OXIDUJÍCÍ ANORGANICKÉ SIRNÉ LÁTKY K BIOOXIDACI PYRITU

Šárka Helánová1, Alena Španová2, Martin Mandl1, Pavel Bouchal1

1Katedra biochemie, 2Katedra mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Oxidace pyritu je důležitým procesem při biodegradaci sulfidových odpadů

kontaminujícím životní prostředí kyselinou sírovou. Ze sledování procesu biooxidace pyritu pomocí minerální elektrody vyplývá, že bakterie rostoucí na síře nejsou schopné oxidovat pyrit, naopak spíše dochází k vytvoření redukčních podmínek v roztoku s pyritem v přítomnosti bakterií. Buňky Acidithiobacillus ferrooxidans dlouhodobě udržované na síře jako substrátu postupně ztrácí schopnost okamžitě oxidovat pyritový koncentrát a Fe2+. Oxidace nastává až po lag fázi zřejmě způsobené indukcí železooxidujícího systému. Délku lag fáze ovlivňuje pH, buňky v lag fázi vykazují mnohem větší citlivost k aciditě. Zjištěným limitujícím faktorem je dusík, malé množství NH4

+ obnoví původní parametry rychlosti oxidace pyritu.

Naše kinetická měření potvrzují předpoklady, že při dlouhodobé oxidaci síry dochází ke ztrátě schopnosti A. ferrooxidans oxidovat Fe2+ a pyrit, tato pozorovaná fenotypová změna byla již v literatuře popsána a byla klasifikována jako reverzibilní transpozomová mutace. Tento závěr autoři učinili na základě kultivačních experimentů na pevném mediu . Případná přítomnost lag fáze v důsledku indukce železooxidujícího systému nemohla být detekována. Na základě našich výsledků se domníváme, že změny ve schopnosti oxidace jednotlivých substrátů lze vysvětlit spíše adaptačními mechanizmy než mutací. Pro objasnění metabolických změn u A. ferrooxidans v průběhu adaptace byla provedena analýza proteomu. Předběžné výsledky svědčí o změnách v proteomovém složení u bakterií v jednotlivých stupních adaptace ze sirného substrátu na Fe2+.

Jelikož průkaz přítomnosti A. ferrooxidans v kultuře je založen na schopnosti oxidovat Fe2+, a právě tato schopnost se v důsledku dlouhodobých adaptačních procesů ztrácí, byla nově zavedena a optimalizována molekulárně biologická detekce přítomnosti A. ferrooxidans pomocí sekvence genu pro 16S RNA. Byla optimalizována lyze buněk kultivovaných na pevném médiu s následnou izolací a purifikací DNA, byla optimalizována vlastní PCR reakce, purifikace PCR produktů a probíhá optimalizace sekvenace amplifikovaného fragmentu DNA o délce 1,4 kb. Tato práce byla podporována grantem GAČR č. 525/04/1309

48

STUDIUM ODBOURÁVÁNÍ SÍŤOVANÝCH POLYSACHARIDŮ MIKROBIÁLNÍMI PEKTINASAMI

THE STUDY OF THE DEGRADATION OF CROSS-LINKED POLYSACCHARIDES BY MICROBIAL PECTINASES

Jančeková L., Omelková J., Bednář M.

Brno University of Technology, Faculty of Chemistry, Purkyňova 118, Brno 61200, jancekova@fch.vutbr.cz

The enzymatic degradation of pectic acid, and its modified forms by polygalacturonase from pectolytic complex Rohament P was studied. Pectic (polygalacturonic) acid (PGA) is usually prepared from natural pectin by deesterification. Pectin and PGA are polysaccharides existing in the cell walls of land-plant tissues, and seaweeds, where they function as an intercell cementing material. They are the natural substrates of pectolytic enzymes. These can be classified according to their mode of action on the galacturonan part of the pectin molecule. Polygalacturonase catalyzes the hydrolytic cleavage of α(1→4) galacturonan linkages of pectin. The modified water-insoluble forms were prepared from unmodified biopolymers by crosslinking with 1,3-bis(3-chloro-2-hydroxypropyl)imidazolium hydrogen sulphate. It was shown that insoluble forms underwent, similarly as with soluble ones, the enzymatic degradation. The enzymatic degradation of water-insoluble and water-soluble polymers was investigated by analysis of the quantity of reducing groups. The results obtained by this method were used to determine the kinetic constants of water-insoluble forms of polymer.

STUDIUM MEMBRÁNOVÉ TOPOLOGIE CYTOCHROMŮ P450 POMOCÍ

FOTOLABILNÍCH SLOUČENIN STUDY OF MEMBRANE TOPOLOGY OF CYTOCHROMES P450 USING

PHOTOLABILE COMPOUNDS

Martin Karabec1, Miroslav Šulc1,2, Petr Hodek1

1 Charles University in Prague, Faculty of Nature Science, Department of Biochemistry, Hlavova 2030, 128 43 Prague 2

2 Institute of Microbiology AV CR, Vídeňská 1083, 142 20 Prague 4 The cytochromes P450 are located in membrane of endoplasmic reticulum. The

membrane topology of the mammalian P450 cytochromes has been studied intensively by computational approaches, proteolysis, chemical modification, genetic engineering, and immunochemistry. Recent results shows, that cytochrome P450 core is hold in membrane by one or two transmembrane helixes, located at the NH2- terminal end. And also part of enzyme body might be inserted into membrane. We are going to approach this topic by using photoaffinity labeling, which is a chemical modification technique used to study protein structure and interactions. Highly reactive intermediate which is able to modify amino acid residues of a protein is generated by UV-light irradiation at certain place and exact time. For phenobarbital-inducible cytochrome P450 2B4 was designed diamantane like probe 3-azidiamantane [spiro-(diazirine-3,3’-diamantane)], whom high affinity is also proved for cytochrome P450 1A1. Label is deuterized for easier identification by mass spectroscopy.

49

To examine topology of cytochrome P450 anchoring we use bilayer of phosphatidylcholine as membrane substitute. Its high hydrophobic medium considers high solubility of our hydrophobic label in this phospholipid bilayer. Upon photolysis (366 nm) deuterized 3-azidiamantane gives highly reactive carbene intermediate, which modifies amino acid residues, contained in transmembrane peptides or in part of body that might be fitted-in to bilayer. Modified enzyme and its transmembrane anchor are cleaved by proteases and labeled peptides are separated on HPLC RP C18. Separated peptides are analyzed on MALDI TOF and MS-DECA, where we search for double peaks differenced m/z=2, because our photolabile probe was not deuterized for 100%, but there was used mixture of deuterized and not deuterized 3-azidiamantane during our experiment. This study was supported by Grant MSM-113100001 from Ministry of Education of the Czech Republic.

PREPARATION OF SUBCELLULAR SYSTEMS OF YEAST CANDIDA TROPICALIS AND THEIR PHENOLHYDROXYLASE ACTIVITY

PŘÍPRAVA SUBCELULÁRNÍCH SYSTÉMŮ KVASINKY CANDIDA TROPICALIS A JEJICH FENOLHYDROXYLASOVÁ AKTIVITA

Jan Páca Jr.a, Veronika Sucháa, Michal Tureka, Veronika Kremláčkováa, Iva Mátlováa, Jan

Pácab, Marie Stiborováa

aKatedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40 Praha 2, Česká republika.

bÚstav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika.

Řada složek životního prostředí je v současné době kontaminována fenolickými látkami. Zdroje kontaminace jsou především odpadní vody z rafinérií ropy, výroby celulosy, provozů tepelného zpracování uhlí atd. Kvasinky rodu Candida tropicalis jsou schopné využívat fenolu jako zdroje uhlíku a energie. Hydroxylace fenolu na katechol je prvním, limitujícím krokem aerobní degradace fenolu. Následné přeměny tohoto produktu katalyzují enzymy štěpící aromatické dihydroxyderiváty. Katechol-1,2-dioxygenasa (EC 1.13.11.1) oxiduje katechol za vzniku kyseliny cis, cis-mukonové (ORTHO dráha), která se dále metabolizuje na acetyl CoA a sukcinát. Pokud se na metabolismu katecholu podílí katechol-2,3-dioxygenasa (EC 1.13.11.2), jedná se o META dráhu vedoucí k tvorbě semialdehydu kyseliny 2-hydroxymukonové, z které se dále tvoří pyruvát. Konečné produkty obou drah vstupují do intermediárního metabolismu buňky. Eukaryotní mikroorganismy obecně preferují štěpení aromatického kruhu katecholu ORTHO drahou. Cílem práce bylo poznat nejefektivnější metodu pro dezintegraci buněk kvasinky Candida tropicalis k získání dostatečného množství mikrosomální a cytosolární frakce těchto buněk. Obě subcelulární frakce jsou nutné pro sledování enzymů účinných v prvém kroku biodegradace fenolu studovaným mikroorganismem, hydroxylaci fenolu na katechol. V této práci byla tedy dále zjišťována fenolhydroxylasová aktivita v obou získaných frakcích. Z kvasinek C. tropicalis, rostoucích ve třech různých mediích v přítomnosti glukosy, fenolu nebo obou těchto zdrojů uhlíku, byly nejvhodnější zjištěnou desintegrační metodou (tj. vymražováním buněk kapalným dusíkem v kombinaci s mechanickou desintegrací) buňky desintegrovány a následně z nich izolovány subcelulární kompartmenty, mikrosomy a cytosol. V obou těchto buněčných frakcích byla sledována aktivita enzymů potenciálně schopných oxidovat fenol. Zatímco žádná aktivita

50

nebyla detekována v mikrosomech a cytosolu buněk rostoucích na glukose, buněčné kompartmenty C. tropicalis, rostoucí v mediu obsahujícím fenol, vykazovaly fenolhydroxylasovou aktivitu. V mikrosomech byla zaznamenána indukce hlavních složek monooxygenasového systému se smíšenou funkcí, cytochromu P450 (EC 1.14.15.1) a NADPH:cytochrom P450 reduktasy (EC 1.6.2.4), schopných hydroxylovat fenol. Stejně tak i v cytosolu došlo působením fenolu k indukci flavoproteinové monooxygenasy, NADPH-dependentní fenolhydroxylasy (EC 1.14.13.7). S využitím originálně vyvinuté metody HPLC a pomocí hmotnostních analýz bylo zjištěno, že fenol je monooxygenasami C. tropicalis oxidován na katechol. V práci porovnáváme účinnost hydroxylačních enzymů obou buněčných kompartmentů s cílem jejich potenciálního využití v bioremediacích.

Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM 1131 00001).

CLONING AND EXPRESSION OF CRT GENES FROM ERWINIA CAROTOVORA KLONOVÁNÍ A EXPRESE CRT GENŮ Z ERWINIA CAROTOVORA

Kubešová J., Pokorná J., Drábková M., Márová I., Omelka L.

VUT- Fakulta chemická, Purkyňova 118, 612 00 Brno

The bacteria Erwinia carotovora is gram-negative epiphytic non-photosynthetic bacterium with aerobic metabolism, which produces carotenoids (phytoene, lycopene, β-carotene, β-cryptoxanthin, zeaxanthin, zeaxanthin glucosides) and pectinolytic, cellulolytic and proteolytic enzymes. Caroteinds are industrially significant pigments with antioxidant activity, which act as protective agents against reactive oxygen species and UV irradiation. Carotenoid production in E. carotovora is encoded by crt gene cluster containing 6 genes localized on dsDNA. In this work possibility of cloning and expression of crt gene cluster isolated from Erwinia carotovora in recipient strain E.coli DH5α was tested. Isolation of crt genes was proved using XbaI, EcoRI and HindIII restriction endonucleases. Plasmid vector pHSG298 with insert on size about 900 bp was used for transformation of chemically competent E.coli DH5α cells. Transformants were selected based on genotype as well as fenotype changes: a) resistance of transformants to kanamycin encoded by pHSG298, b) formation of orange-coloured E.coli colonies, c) isolation and analysis of size of recombinant plasmid, d) HPLC analysis of carotenoids produced by recombinant E.coli cells. In individual transformants lutein, lycopene, β-carotene and phytoene were demonstrated. Amount of carotenoids isolated from E.coli cells transformed by pHSG298crt was higher than those from E.carotovora cells.

REACTIONS OF PLANT AMINE OXIDASES WITH N6-AMINOALKYL DERIVATIVES OF ADENINE

Zbyněk Lamplot1, Marek Šebela1, Alessandra Padiglia2, Rosaria Medda2, Giovanni Floris2

and Pavel Peč1 1Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783

71 Olomouc 2Department of Sciences Applied to Biosystems, University of Cagliari, Città Universitaria, I-

09042 Monseratto (CA), Italy

51

Plant copper-containing amine oxidases (EC 1.4.3.6) catalyse the oxidation of various amines. The best substrates of the enzymes are the diamines cadaverine (pentane-1,5-diamine) and putrescine (butane-1,4-diamine). Once there was a hypothesis that the enzymes could oxidise cytokinins - plant hormones derived from adenine [Hare, P.D. and van Staden, J. (1994) Physiol. Plant., 91, 128]. However, detailed experiments on this topic did not confirm this. Conversely, it has been shown that cytokinins are inhibitors of amine oxidases [Galuszka, P. et al. (1998) J. Enzyme. Inhib. 13, 457].

We have synthesised several N6-aminoalkyl derivatives of adenine using an established method. The synthesis was based on the reaction of 6-chloropurine with various C3 and C4 diamines (bases) in butanol by heating at 90-110 oC in the presence of triethylamine. Crude preparations were purified by repeated crystallisation. The final purity of products was checked by measuring the corresponding melting points, by elemental analysis and mass spectrometry. The compounds prepared were as follows: N6-(4-aminobutyl)adenine, ABAD, (from putrescine); N6-(3-aminopropyl)adenine, APAD (from propane-1,3-diamine); N6-(4-amino-trans-but-2-enyl)adenine, ATBAD (from trans-but-2-ene-1,4-diamine); N6-(4-amino-cis-but-2-enyl)adenine, ACBAD (from cis-but-2-ene-1,4-diamine) and N6-(4-aminobut-2-ynyl)adenine, ABYAD (from but-2-yne-1,4-diamine).

The above-mentioned compounds were tested in reactions with three plant copper-containing amine oxidases isolated from grass pea (Lathyrus sativus), lentil (Lens esculenta) and a Mediterranean shrub (Euphorbia characias). First, reaction rates of conversion were measured to decide between substrate and inhibitory properties of the compounds toward the enzymes. For substrates (ABAD, ATBAD), Km values and the reaction stoichiometry were measured. For inhibitors (APAD, ACBAD, ABYAD), kinetic measurements were performed to determine the inhibition type and potency. APAD and ACBAD seem to be competitive inhibitors of all three enzymes. For ABYAD, the mechanism of inhibition is still uncertain. Anaerobic absorption spectra measured after the additions of ABAD and ATBAD to the enzymes clearly confirmed their interaction with the cofactor topaquinone. This interaction leads to the formation of the semiquinone radical form of the cofactor showing characteristic absorption maxima as it is for any usual substrate. This work was supported by the grants MSM 153100010 and 14 BI3 (within the Czech-Italian co-operation) from the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic.

DETECTION OF CYP1A1 PROTEIN IN HUMAN HEPATIC MICROSOMES AND ITS RELATIONSHIPS WITH ENZYME ACTIVITY

Marie Stiborová, Václav Martínek, Helena Rýdlová, Tomáš Koblas, Petr Hodek

Department of Biochemistry,Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128

40 Prague 2, The Czech Republic, stiborov@natur.cuni.cz, vacmar@natur.cuni.cz

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) has been implicated in the conversion of numerous polycyclic aromatic hydrocarbons into reactive species capable of binding covalently to DNA and has therefore been postulated to be involved in the initiation of carcinogenesis [1]. To date, there is conflicting evidence for the expression of CYP1A1 protein in human liver. In this study, western immunoblotting employing a partially purified polyclonal chicken anti-rat CYP1A1 antibody having extremely high efficiency to recognize human CYP1A1 was used to detect CYP1A1 in human hepatic microsomes. The used antibody did not cross-react with human CYP1B1, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2E1 and 3A4, but did strongly recognize

52

CYP1A1. However, there was a very weak cross-reactivity of the antibody with human CYP1A2, ~80-fold less compared with CYP1A1. A detection sensitivity of western blot analysis with this antibody was as low as 0.005 pmol CYP1A1 per lane. Human hepatic microsomal samples from nine American Caucasian donors were analyzed for the CYP1A1 expression. In immunoblots, the anti-rat CYP1A1 antibody reacted with two immunoreactive bands in most analyzed human hepatic microsomal samples. The faster migrating protein band was CYP1A1 as shown by N-terminal sequencing previously (Stiborová et al. Cancer Res. 62, 5678-5684, 2002). CYP1A1 expression levels varied significantly among the different human microsomes (0.03 - 0.4 pmol/mg protein). Significant correlations between the immunoreactive content of human CYP1A1 and activities selectively catalyzed by this enzyme (oxidation of Sudan I in the presence of a CYP3A4 inhibitor, ketoconazole) corroborated the content of enzymatically active CYP1A1 protein in human microsomal samples analyzed in our study. In conclusion, CYP1A1 appears to be expressed in human liver at low levels, being present at ~0.65% of the total hepatic CYP complement.

References

[1] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer Res. 2002, 62, 5678-5684.

Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of Education of the Czech Republic (MSM 113100001).

GUANYL ARYLATION OF TRANSFER RNA BY CARCINOGENIC SUDAN I (1-PHENYLAZO-2-HYDROXYNAPHTHALENE, SOLVENT YELLOW 14)

ACTIVATED BY PEROXIDASE

Marie Stiborová1, Václav Martínek1, Marcela Semanská1, Jan Seibal2, Heinz H. Schmeiser3, Eva Frei3

1Department of Biochemistry, 2Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic, stiborov@natur.cuni.cz

3Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, In Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany

1-(Phenylazo)-2-hydroxynaphthalene (Sudan I, Solvent Yellow 14) is a liver and urinary

bladder carcinogen in mammals. Peroxidases in presence of H2O2 oxidize Sudan I to reactive intermediates (radicals), which are able to covalently modify DNA, RNA and proteins [1]. This covalent adducts differ from those formed from Sudan I activated by cytochromes P450 [2]. Present study is focused on further characterization of the major adduct formed in nucleic acids.

Transfer RNA (tRNA) was reacted with Sudan I activated by peroxidase, and the adducts formed were analyzed by 32P-postlabelling technique. Two enrichment procedures (1-butanol extraction and nuclease P1 digestion) of this technique were employed for detection and quantitation of the adducts formed in tRNA. Co-chromatographic analyses of adduct spots obtained by reaction with tRNA or homopolyribonucleotides showed that the major Sudan I-tRNA adduct was formed by reaction of peroxidase-activated Sudan I with guanosine. Because amount of adducts isolated from modified tRNA was insufficient for further characterization, enzymatic synthesis of appropriate standard was carried out. Guanosine 5´-monophosphate, guanosine and/or deoxyguanosine was incubated with Sudan I in presence of

53

horseradish peroxidase and H2O2. The adduct corresponding to that found in tRNA was isolated utilizing combination of extraction, TLC and HPLC methods.

These adduct standards were characterized by UV/Vis absorbance spectroscopy and mass spectrometry. It is evident that the whole Sudan I molecule (with the intact conjugated system) is bound to (deoxy)guanosine residues. More detailed structural characterization of the major Sudan I adduct was conducted using NMR. Free radical localized in position 4 of Sudan I molecule attacks either 2N or 6O atom of guanine part of the (deoxy)guanosine molecule. To finalize the structural characterization of the major Sudan I adduct in tRNA, other techniques including IR spectrometry will be utilized. References

[1] Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M., and Hradec, J. Carcinogenesis, 11: 1843-1848, 1990.

[2] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer Res. 2002, 62, 5678-5684.

Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of Education of the Czech Republic (MSM 113100001).

STUDY ON BINDING OF PEROXIDASE-MEDIATED RADICALS OF 1-PHENYAZO-2-NAPHTHOL (SUDAN I) AND ELLIPTICINE TO GLYCOPROTEINS

Václav Martínek1, Karel Bezouška1, Eva Frei2, Marie Stiborová1

1Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic, vacmar@natur.cuni.cz, stiborov@natur.cuni.cz

2Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, In Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany

Glycosylation is one of the major naturally occurring modifications of the covalent

structure of proteins. Although much is known about the structure and biosynthesis of oligosaccharides in glycoproteins, the central question of how glycosylation contributes to the glycoprotein structure and function is not entirely clear. Many specific effects have been observed, such as regulation of intracellular traffic and localization of proteins, modulation of their immunological properties, participation in cell-cell interactions, stabilization of protein conformation, protection of proteins from proteolysis, enhancement in their solubility, and many others [1]. In the present work, we show another role of carbohydrate moiety of glycoproteins; it might also contribute to protect proteins from covalent modification of their molecules by radicals.

To study this subject, several model proteins with different degree of glycosylation were examined for their modification by radicals generated from two xenobiotics [1-phenylazo-2-hydroxynaphthalene (Sudan I) and ellipticine]. Both these chemicals form radicals during their oxidation by peroxidases. Sudan I is a liver and urinary bladder carcinogen in mammals. This carcinogen is metabolically activated by cytochromes P450 and peroxidases to reactive species binding covalently to nucleic acids and proteins [2,3]. Ellipticine is an alkaloid exhibiting significant antineoplastic and anti-HIV activities. This anticancer agent is oxidized by peroxidases via a radical mechanism and this reaction might participate in enhancing its pharmacological efficiencies [4]. The levels of binding of radicals generated from both xenobiotics by peroxidases are dependent on degree of protein glycosylation, being highest for non-glycosylated proteins: human serum albumin, bovine serum albumin and lysozyme,

54

and followed by asilofetuin > calf fetuin > chicken ovomucoid > Tamm-Horsfall glycoprotein and �1-acid glycoprotein. The results showed in the study demonstrate for the first time a novel role of carbohydrate parts of glycoprotein molecules, namely, their protective effects against modification by xenobiotic-derived radicals.

References

[1] Wang C, Eufemi M, Turano C, Giartosio A: Biochemistry 35, 7299-307 (1996). [2] Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M., and Hradec, J. Carcinogenesis,

11: 1843-1848, 1990. [3] Stiborová M., Martínek V., Rýdlová H., Hodek P., Schmeiser H.H., Frei E.: Cancer

Res. 2002, 62, 5678-5684. [4] Frei E., Borek-Dohalska L., Wiessler M., Stiborova M.: Proc. Am. Assoc. Cancer Res.

42, 252 (2001).

Supported by Grant Agency of Charles University (241/2001/B/CH/PrF) and Ministry of Education of the Czech Republic (MSM 113100001).

VYUŽITÍ AVIDIN-BIOTINOVÉ TECHNOLOGIE PRO ELEKTROCHEMICKOU DETEKCI NUKLEOVÝCH KYSELIN

USING OF AN AVIDIN-BIOTIN TECHNOLOGY FOR ELECTROCHEMICAL DETECTION OF NUCLEIC ACIDS

Michal Masařík1, René Kizek2, Jan Vacek2, Libuše Trnková3, Ladislav Havel4,

František Jelen1

1Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, Královopolská 135, 612 65 Brno 2Ústav chemie a biochemie MZLU Brno

3Katedra teoretické a fyzikální chemie PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno 4Ústav botaniky a fyziologie rostlin MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Bakterie Streptomyces avidinii produkuje streptavidin (STV), který váže biotin ze

svého okolí. STV je tetramer o čtyřech identických podjednotkách složených z osmi antiparalelních β-skládaných listů STV (Mr 16 500) je složen ze 159 aminokyselin (obsahuje 6 molekul tyrosinů a 6 tryptofanů).

Nedávno jsme publikovali modifikaci uhlíkové pastové elektrody STV. Elektrodový systém se skládal z modifikované pastové uhlíkové pracovní elektrody (uhlík:minerální olej; STV), Ag/AgCl/3M KCl (referenční elektroda) a pomocné platinové elektrody. Množství uhlíku a minerálního oleje ovlivňuje elektrochemickou odpověď STV přítomného v pracovní elektrodě. Zjistili jsme, že maximální signál 10 µg/mL STV přítomného v pracovní elektrodě získáme při poměru 70 : 30% (uhlík:minerální olej). Elektrochemické měření technikou adsorptivní přenosové square wave voltametrie (AdT SWV) bylo provedeno v prostředí acetátového pufru. Studovali jsme vliv různých koncentrací (5 – 500 ng/mL) STV přidaných do pastové elektrody. Zaznamenané výšky oxidačních signálů STV vykazovaly lineární závislost vyjádřenou rovnicí: y = 1.0043x + 9.0444 (R2 = 0.996). Limit detekce STV přítomného v pracovní elektrodě byl pod 5 ng/mL. Změnou výšek elektrochemických signálů STV bylo možné pozorovat vazbu STV s biotinem. Biotin vázající se na STV vede k rychlému poklesu oxidačního signálu STV. Tohoto jevu jsme využili k analýze nukleových kyselin značených biotinem. Analyzovaný vzorek biotinylované nukleové kyseliny byl adsorbován z 6 µL a elektroda omyta v 80% ethanolu (odmytí nespecificky vázané DNA). AdT SWV poskytovala tři oxidační signály. Kolem potenciálu 0.6 V byl sledován signál STV

55

přítomného v elektrodě, kolem potenciálu 0.8 V byl pozorovatelný oxidační signál guaninu a kolem 1.0 V se objevuje oxidační signál adeninu. Studované elektrochemické signály STV, guaninu a adeninu se mění v závislosti na jejich koncentraci. Se vzrůstající koncentraci biotinylem značené nukleové kyselin signál STV klesá a signály guaninu a adeninu vzrůstají. Nejnižší detekované koncentrace biotinylované nukleové kyseliny se pohybovaly kolem 5 µg/mL.

Poděkování Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004. Literatura: Gonzales M. et al.: J. Biol. Chem. 272, 11288–11294, (1997). Kurzban P.G. et al.: J. Biol. Chem. 266, 14470–14477, (1997). González M. et al.: Biol. Eng., 16, 67–72, (1999). Buckley E. et al.: Electroanal., 3, 43–47, (1991). Masarik M, Kizek R, Kramer KJ, Billova S, Brazdova M, Vacek J, Bailey M, Jelen F, Howard JA.: Anal. Chem., 75, 2663-2669, (2003). Kizek R, Vacek J, Trnkova L, Klejdus B, Kuban V.: Chem. Listy, 97, 1003-1006, (2003). Kizek R, Havran L, Fojta M, Palecek E.: Bioelectrochemistry, 55, 119-121, (2002). Fojta M, Havran L, Billova S, Kostecka P, Masarik M, Kizek R.: Electroanal., 15, 431-440, (2003).

STANOVENÍ ISOFLAVONŮ POMOCÍ VYSOKO-ÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ

ISOFLAVONE DETERMINATION BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH ELECTROCHEMICAL DETECTION

Radka Mikelová1, Jitka Petrlová1, Bořivoj Klejdus1, René Kizek1, Josef Zehnálek1, Vojtěch

Adam1, Jan Vacek1, Libuše Trnková2 a Vlastimil Kubáň1 1Ústav chemie a biochemie, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Zemědělská 1, CZ-

611 37 Brno 2Katedra teoretické a fyzikální chemie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy university,

Kotlářská 2, CZ-611 37 Brno

Přírodní rostlinné metabolity můžeme rozdělit do tří hlavních skupin: terpeny, alkaloidy a fenylpropanoidy a jim příbuzné fenolické sloučeniny. Jednou z nejvýznamnějších skupin fenolických sloučenin jsou flavonoidy. Skupina zahrnuje více než 4 500 sloučenin obsahující podskupinou isoflavonoidů. Mezi nejznámější isoflavony patří aglykony daidzein, genistein, formononetin a biochanin A, jakož i jejich glykosidy daidzin, genistin, ononin a sissostrin. Bylo prokázáno, že tyto chemické sloučeniny mají estrogenní účinek u řady druhů savců a vyvolávající falešnou říji. Řada studií prokázala na pokusech se zvířaty i na tkáňových kulturách významnou roli těchto fytoestrogenů v přijímané potravě v prevenci osteoporosy, menopausy, nádorových a srdečních onemocnění. Flavony jsou zastoupeny především v čeledích Fabaceae a Viciacae. V menší míře se vyskytují také v řadě dalších čeledí jako jsou Papilionaceae, Iridaceae, Myristicaceae, Compositae, Amaranthaceae a Rosaceae. Bobovité rostliny jsou jedny z nejvýznamnějších složek potravy ve světě. Tato skupina rostlin je velmi intenzivně zkoumána, protože v nich byly prokázány vysoké koncentrace isoflavonů, jako je daidzein a genistein. V naší práci jsme stanovovali rostlinné isoflavony pomocí elektrochemických (square wave voltammetry) a chromatografických metod (high-performance liquid chromatography with

multidimensional coulometric detection) pro stanovení daidzeinu a genisteinu v biologické matrici. Vyvinuli jsme velmi senzitivní a reprodukovatelnou metodu pro detekci významných rostlinných isoflavonů v lidské moči. Limit detekce na kolonu (LOD 3.S/N) byl 5 pg (19 fmol). Detekční limit byl závislý na potenciálu aplikovaném na detekční elektrody.

56

Genistein

Daidzein

O

O

OH

OH

O

O

OH

OHOH

Literatura 1. Mitani, K., Narimatsu, S., Kataoka, H.: (2003) J. Chromatogr. A, 986, 169-177 2. Nurmi, T., Adlercreutz, H.: (1999) Anal. Biochem., 274, 110-117 3. Klejdus, B., Štěrbová-Vitamvásová, D., Kubáň, V.: (2001) Anal. Chim. Acta, 450, 81-97 4. Liggins, J., Bluck, L.J.C., Coward, W.A., Bingham, S.A.: (1998) Anal. Biochem, 264, 1-7 5. Klejdus, B., Štěrbová, D., Stratil, P., Kubáň, P.: (2003) Chem. Listy, 97, 530-539 6. Klejdus, B., Kizek, R., Vacek, J., Zehnálek, J., Trnková, L., Kubáň, V.: (2003) J. Chrom. B,

odesláno Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

HUMAN ENZYMES INVOLVED IN METABOLISM OF CARCINOGENIC 2-NITROANISOLE: EVIDENCE FOR ITS OXIDATIVE DETOXICATION BY

HUMAN CYTOCHROMES P450 Markéta Mikšanováa, Miroslav Šulca, Helena Rýdlováa, Heinz H. Schmeiserb, Eva Freib and

Marie Stiborováa aDepartment of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40

Prague 2, The Czech Republic, bDepartment of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer

Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany

2-Nitroanisole (2-NA) is an important industrial pollutant and a potent carcinogen for rodents. Determining the capability of humans to metabolize 2-NA, and understanding which human cytochrome P450 (P450) enzymes are involved in its activation and/or detoxification is important in the assessments of individual susceptibility to this environmental carcinogen. We compared the ability of hepatic microsomal samples from different species including human to metabolize 2-NA. Comparison between experimental animals and human P450 enzymes is essential for the extrapolation of animal carcinogenicity data to assess human health risk. Human hepatic microsomes generated the pattern of 2-NA metabolites reproducing that formed by hepatic microsomes of rats and rabbits. An O-demethylated metabolite of 2-NA, 2-nitrophenol, and two ring-oxidized metabolites of this metabolite (2,6-dihydroxynitrobenzene and 2,X-dihydroxynitrobenzene) were produced. No nitroreductive metabolism leading to the formation of o-anisidine was evident with hepatic microsomes of all species. Likewise, no DNA binding of 2-NA metabolite(s) measured with either tritium-labeled 2-NA or the 32P-postlabeling technique was detectable in microsomes. Therefore, hepatic microsomal P450s are enzymes responsible for detoxification of this environmental carcinogen. Using hepatic microsomes of rabbits pre-treated with specific P450 inducers, microsomes from Baculovirus transfected insect cells expressing recombinant human P450

57

enzymes, purified P450 enzymes, and selective P450 inhibitors we found that human recombinant P450 2E1, 1A1 and 2B6, as well as orthologous rabbit P450 enzymes are the most efficient enzymes metabolizing 2-NA. The role of specific P450 enzymes in the human hepatic microsomal metabolism of 2-NA was investigated by correlating the P450-dependent catalytic activities in each microsomal sample with the levels of individual metabolites formed by the same microsomes and by examining the effects of agents that can inhibit specific P450 enzymes in 2-NA metabolism. Based on these studies, we attribute most of 2-NA oxidation metabolism in human microsomes to P450 2E1. These results, the first report on the metabolism of 2-NA by human P450 enzymes, clearly demonstrate that P450 2E1 is the major human enzyme detoxifying this carcinogen in human liver. Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/03/0283) and the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).

IDENTIFICATION OF GENOTOXICITY OF o-ANISIDINE AND ITS CARCINOGENIC POTENTIAL FOR HUMANS: EVIDENCE FOR o-ANISIDINE-

DERIVED DNA ADDUCT FORMATION IN RATS AND IN VITRO AFTER ITS METABOLIC ACTIVATION BY HUMAN CYTOCHROMES P450

Marie Stiborováa, Markéta Mikšanováa, Miroslav Šulca, Lenka Vondráškováa, Andrea

Breuerb, Heinz H. Schmeiserb, Eva Freib aDepartment of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 128 40

Prague 2, The Czech Republic, bDepartment of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer

Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany

2-Methoxyaniline (o-anisidine) is an important pollutant and a potent carcinogen for rodents. The mechanism of its carcinogenicity was investigated in this study. Here, we used two direct independent methods, namely 32P-postlabelling and 14C-labeled o-anisidine to show that o-anisidine binds covalently to DNA in vitro after its activation by human hepatic microsomes. We also investigated the capacity of o-anisidine to form DNA adducts in vivo. Male Wistar rats, used as animal models, were i.p. treated with o-anisidine, and DNA samples from various organs were analyzed by 32P-postlabeling. Two o-anisidine-specific DNA adducts, identical to those found in vitro, were detected in urinary bladder, and to a lesser extent, in liver, kidney and spleen. The highest level of DNA adducts was found in the target organ of the o-anisidine carcinogenicity, the urinary bladder (4.1 adducts per 107 nucleotides). These results, demonstrating o-anisidine covalent binding to DNA after metabolic activation in vitro and in vivo, indicate a genotoxic mechanism of o-anisidine carcinogenicity. To provide information on the nature of the adducts formed in vivo, they were co-chromatographed in two independent systems with standardized deoxyguanosine adducts produced by reaction of an o-anisidine metabolite, N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, with deoxyguanosine 3’-monophosphate in vitro. Based on this analysis, two DNA adducts found in rats were identified to be deoxyguanosine adducts derived from this o-anisidine metabolite. Formation of o-anisidine-DNA adducts during the o-anisidine oxidation by human hepatic microsomes, identical with those formed in rat in vivo indicates a potential of human hepatic microsomal enzymes to activate this carcinogen in human. Indeed, the proximate carcinogenic metabolite of o-anisidine, N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, is produced by oxidation catalyzed with human hepatic microsomes. Understanding which human enzymes are involved in such metabolic activation is useful in evaluating individual susceptibility to this environmental

58

carcinogen. We compared the ability of nine human hepatic microsome samples to catalyze o-anisidine oxidation. The role of specific cytochrome P450 (CYP) enzymes in the human hepatic microsomal metabolism of o-anisidine was investigated by correlating the CYP-dependent catalytic activities in each microsomal sample with the levels of individual metabolites formed by the same microsomes and by examining the effects of agents that can inhibit specific CYP enzymes in o-anisidine metabolism. Based on these studies, we attribute most of o-anisidine oxidation in human microsomes to CYP2E1. Using microsomes from Baculovirus transfected insect cells expressing recombinant human CYP enzymes and purified CYP enzymes, the participation of this enzyme in o-anisidine oxidation was confirmed. The results of our study, the first report on the potential of the human microsomal CYP enzymes to contribute to the activation of o-anisidine, strongly suggest a carcinogenic potency of this rodent carcinogen for humans. Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/03/0283) and the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).

POLYGALAKTURONÁZY PRODUKOVANÉ V PRIEBEHU RASTU AUREOBASIDIUM PULLULANS IZOLOVANÉHO Z LESNEJ PÔDY A ICH

PRAVDEPODOBNÝ VPLYV NA FYTOPATOGÉNNOSŤ MIKROORGANIZMU POLYGALACTURONASES PRODUCED DURING GROWTH OF

AUREOBASIDIUM PULLULANS FROM THE FOREST SOIL AND THEIR POSSIBLE INFLUENCE ON THE PHYTOPATHOGENITY OF MICROORGANISM.

Jiřina Omelková , Helena Čigašová, Emília Breierová and Eva Stratilová

Faculty of Chemistry of Technical University of Brno, Purkyňova 118, CZ-612 00 Brno Institute of Chemistry of Slovak Academy of Sciences, Dúbravská cesta 9, SK-845 38

Bratislava

Aureobasidium pullulans is an yeast-like microorganism able to utilize pectin as a single C-source. This ability is bound with the production of pectolytic enzymes. Polygalacturonases, enzymes with random action pattern on polymeric substrate (pectate) and exopolygalacturonases, enzymes cleaving this substrate from nonreducing end and forming D-galactopyranuronic acid as the sole product are considered to be the main pectolytic enzymes produced by Aureobasidium pullulans. Identical conditions of cultivation of Aureobasidium pullulans isolated from forest soil and pathogenic fungus Aspergillus niger on pectin medium were used in aim to compare the production of polygalacturonases by these two microorganisms and find the possible explanation for the pathogenic character of fungus and saprophytic character of Aureobasidium. Aspergillus niger produced both endo- and exoenzymes during the whole cultivation, while Aureobasidium pullulans produced endopolygalacturonases only in the first phases of cultivation. These enzymes may support the colonization of plant material by microorganism because of their destruction effect on the plant cell wall. Only the presence of extracellular exopolygalacturonases without marked effect on the cell walls was detected in the later phases of growth. The first phase characterized by the production of endoenzymes was prolonged in the presence of some stress factors and the behaviour of Aureobasidium pullulans responded the behaviour of pathogenic fungus Aspergillus niger. Acknowledgement. This work was supported by the VEGA grant No. 2/3160/23.

59

PHENOL BIODEGRADATION BY MIXED MICROBIAL POPULATION IN FLOW

REACTORS BIODEGRADACE FENOLU SMĚSNOU MIKROBIÁLNÍ POPULACÍ

V PRŮTOČNÝCH REAKTORECH

Jan Páca Jr.a, Jan Pácab, Alena Kostečkováb, Marie Stiborováa

aKatedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128 40 Praha 2, Česká republika, Tel: +420-221951285, Fax: +420-2219521283, e-mail:

jan.paca@volny.cz

bÚstav kvasné chemie a bioinženýrství, Vysoká škola chemicko technologická, Technická 5, 166 28 Praha 6, Česká republika; Tel: +420-224353785, Fax: +420-224355051, e-mail:

Jan.Paca@vscht.cz V současné době je vedle fyzikálně chemických či chemických způsobů odstraňování škodlivých látek z prostředí platnou variantou také biologické čištění, avšak za podmínky, že dané látky jsou biologicky rozložitelné. Biologické čištění je ekonomicky výhodnější oproti fyzikálně chemickým a chemickým procesům při stejné účinnosti čištění. Fenol patří mezi aromatické polutanty, které jsou přítomny v průmyslových odpadech, a to hlavně z výrob koksárenských, petrochemických, farmaceutických a z výrob umělých hnojiv, barviv, výbušnin, fungicidů a fenolformaldehydových pryskyřic. Z odpadních vod je fenol vzhledem k rychlejšímu a všestranějšímu metabolismu mikroorganismů lépe odstraňován v aerobním prostředí. Práce se zabývá problematikou degradace fenolu z vodného prostředí. K degradaci byly použity náplňové reaktory. Pro imobilizaci buněk byla použita kokosová vlákna, dva druhy pěnového polyuretanu, porézní skleněné kuličky a expandovaná břidlice. Jako biokatalyzátor sloužila speciálně připravená směsná mikrobiální populace. Byly používány dva typy bioreaktorů. Degradace probíhaly při teplotě 30 °C a pH 7,2. Testováno bylo, který z použitých materiálů je pro imobilizaci buněčné populace nejvhodnější, dále vliv vstupní koncentrace fenolu a z toho plynoucí vliv organické zátěže na provozní charakteristiku bioreaktorů. Výsledky ukázaly, že degradační aktivita biosystému závisí na velikosti vstupní zátěže a na materiálu náplně reaktorů. Podporováno GAČR (grant 104/03/0407) a Ministerstvem školství České republiky (MSM 1131 00001).

FUNCTIONAL MORPHOLOGY OF NASAL MUCOUSE MEMBRANE

FUNKČNÍ MORFOLOGIE NOSNÍ SLIZNICE

Hana Pácováa, Jaromír Astla, Jindřich Martínek b

aKlinika Otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, V Úvalu 84, 150 00 Praha 5, Česká republika, Tel.: +420-224434397, e-mail:

HPac@seznam.cz

bÚstav pro histologii a embryologii, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 4, 128 01 Praha 2, Česká republika, Tel.: +420-224968127, e-mail: jmart@1fl.cuni.cz

60

Aktuální stav životního prostředí, jež je díky civilizační zátěži znečištěno chemickými i biologickými polutanty, do značné míry ovlivňuje všechny organizmy včetně člověka. Za normálních okolností je to právě nosní sliznice, která jako široká brána pravidelné výměny dýchacích plynů přichází s těmito látkami do bezprostředního kontaktu. Proto je v literárních datech i v zaměření vědeckých prací věnována značná pozornost nejen klasické morfologii, ale stále aktuálněji, a to v souvislosti s rozvojem molekulárně biologických aspektů vědeckého výzkumu, funkci jednotlivých složek této významné součásti horních dýchacích cest. Zatímco fyzikálním a chemickým vlivům na stavbu nosní sliznice byly věnovány početné patofyziologické studie, dosud otevřenou otázkou zůstává průběh, regulace a výsledky obranných reakcí v nosní sliznici. V širokém slova smyslu sem patří slizniční imunita, kterou můžeme rozdělit na celulární a humorální složku. Rozhodujícím faktorem pro nastartování obranné reakce je detekce antigenů, na níž se podílejí membránové receptory kompetentních buněk. Protože pro T a B lymfocyty musí být antigen předložen v imobilizovaném stavu, zajímalo nás, zda se v nosní sliznici vyskytují tzv. antigenprezentující elementy, které ve vazivu představují především makrofágy, kdežto v epitelu se kromě prostupujících fagocytujících bloudivých buněk mohou nalézat též tzv. dendritické buňky. Tyto elementy se nám podařilo prokázat na submikroskopické úrovni jako buňky se zpravidla světlejší cytoplazmou a často dlouhými výběžky, které zasahují na značnou vzdálenost mezi buňkami víceřadého cylindrického epitelu výstelky nosních průduchů. Pro plasticitu humorální odpovědi na přítomný antigen, či komplex antigen imunoglobulin, svědčí nálezy možnosti diapedézy lymfocytů z postkapilárního řečiště mezi specializovanými vysokými endotelovými buňkami. Podobně byla dokumentována transformace B-lymfocytů v efektorové plazmatické buňky jako přímé producenty imunoglobulinů. Použití molekulárního markeru, v podobě značeného chřipkového viru, dovoluje identifikovat jako významnou komunikační cestu v nosní sliznici i oblast vývodů drobných seromucinózních žlázek, které patří k normální výbavě nosní sliznice. Výsledky ukázaly, že nosní sliznice představuje významnou cestu, jejímž prostřednictvím může být nejen nastartována obranná reakce organizmu, ale v případě jejího selhání i zdroj alergických rekcí, jak to dokládají nálezy heparinocytů nejen ve slizničním vazivu, ale i v epitelu. Podporováno grantem IGA MZČR č. NC 7487-3.

METABOLISM OF BROMIDE IS INFLUENCED BY SODIUM INTAKE

Stanislav Pavelka Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 611 37 Brno and Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, 142 20 Prague 4

We have tested our hypothesis [1] that the biological half-life of bromide depends on the magnitude of sodium intake rather than on the intake of chloride, as it is generally assumed in the literature, and that it would depend on the physiological state of the animal. In the present paper, we have demonstrated the parallel course of the excretion rates of sodium and bromide ions in adult male rats administered simultaneously with 24Na-sodium chloride and 82Br-bromide. These excretion rates were inversely proportional to the magnitude of sodium intake in the animals.

61

In addition, we investigated the biological half-life of bromide in animals situated in very different physiological states, namely in lactating and non-lactating female rats as well as in young rats of varying ages (2, 4, 6, and 10 weeks of age). The radioactivity retained in mothers and in whole litters was measured in vivo at appropriate time intervals (up to 240 h) after the application of 82Br-bromide to the mothers. The time course of the changes in the 82Br radioactivity of the young was calculated as the difference between the rate of 82Br intake in mother’s milk and the 82Br excretion through the kidneys into the urine [2]. Non-weaned young rats (12 d-old) had the longest half-life (269 h) and lactating dams the shortest (44 h). The determined values obviously reflect a struggle of the animal’s organism for maintaining constancy of the internal milieu. The values demonstrate that non-weaned young apparently conserve sodium, while lactating dams, due to their large food intake, waste sodium. References [1] Pavelka S. (2003) In: Trace Elements in Human: New Perspectives (Ermidou-Pollet S., Pollet S., eds.), University of Athens, Athens, Part I, pp 615-624. [2] Babický A., Vobecký M., Pavelka S. (2004) Food Chem. Toxicol., submitted.

HORIZONTAL TRANSFER OF THE ETA GENE IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Pekarová Mária., Růžičková Vladislava Department of Genetics and Molecular Biology, Faculty of Science, Masaryk University,

Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic, The genes encoding virulence factors in Staphylococcus aureus are generaly located on the variable genetic elements such as prophages, transposons, plasmids or pathogenicity islands. Exfoliative toxins A and B are the main cause of the toxic epidermolyses, ranging from localised blisters to extensive exfoliation, affecting primarily newborns, young children and immunosuppressed adults with underlying disease [1]. Gene for ETA is located on a prophage genome integrated into the bacterial host chromosome whereas etb gene is located on a large plasmid [2, 3]. The aim of this work was to demonstrate the transfer of eta gene carried by phage into the chromosome of new bacterial host. Three temperate bacteriophages �435, �557 and �531 of serological groups A and B respectively, were used for the horizontal tranfer of eta gene. These phages were isolated by means of UV induction from the genomes of three clinical strains of S. aureus involved in two outbreaks of pemphigus neonatorum in maternity hospitals of two geographically distant towns in 1998. The recipient strain of S. aureus termed 1039 doesn´t produce DNase nor restriction enzyme and doesn´t carry any prophage therefore it will be available to recieve extraneous DNA [4]. This strain was infected by phages � 435, � 557 and � 531. PCR detection proved transfer of eta gene and presence of the prophages in the genomes of lysogens 1039. The SmaI macrorestriction fragments of the lysogens were compared with those of recipient strain and the integration site of eta gene was detected. We found that �557 and �531 integrated into the same SmaI macrorestriction fragment (365 kb). Integration of �435 into the fourth largest fragment resulted in its change in size from 310 kb to 360 kb.

Our results demonstrate a way of the horizontal transfer of the genes encoding exfoliative toxin A among the strains of Staphylococcus aureus. They also contribute to

62

elucidate the evolutionary processes considering the role of the mobile genetic elements such as bacteriophages occuring in natural environment of these pathogens. References: [1] Ladhani, S., Joannou, C. L., Lochrie, D. P., Evans, R. W., Poston S. M. (1999) Clin. Microbiol. Rev. 12, 224-242. [2] O'Toole P. W., Foster T. J. (1987) J. Bacteriol. 169, 3910-3915. [3] Warren, R. L. (1980) Infect. Immun. 30, 601-606. [4] Yoshizawa, Y. (1985) Jikeikai Med. J. 32, 415-421. Supported by the grant No. CEZ: J07/98:143100008, Ministry of Education, Czech Republic.

POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ PRO ANALÝZU OBRAZU RŮSTU EMBRYÍ SMRKU ZTEPILÉHO (PICEA ABIES /L./ KARST.)

COMPUTER PROCESSING FOR IMAGE ANALYSIS OF GROWTH OF EMBRYOS OF NORWAY SPRUCE (PICEA ABIES /L./ KARST.)

Jiří Petřek1, Helena Vlašínová1, René Kizek2, Jan Vacek2, Jan Víteček1, Ladislav Havel2

1Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno, j.petrek@email.cz

V našich experimentech byly využity klony smrku ztepilého (Picea abies (L.) Karst.) a

smrku pichlavého (Picea pungens Engelm.). Somatická embrya byla kultivována v klastrech tvořící skupiny raných somatických embryí SRSE na pevném médiu. Růst SRSE byl studován jak vážením tak pomocí počítačové obrazové analýzy. Ke snímání obrazu byla použita CCD-kamera (CCD, Sony, UVP–GDS 8 000) pevně fixovaná ke stativu a počítačové programy GRAB-IT a Image-Pro. CCD-kamera digitalizuje skupiny raných somatických embryí (SRSE) a poskytuje údaje o jejich ploše se střední relativní chybou 0.31 %. Při různém nastavení objektivu kamery byly programem IMAGE-PRO PLUS vypočítány různé velikosti ploch u totožných SRSE smrku. Zjistili jsme, že se stoupajícím rozlišením klesá velikost plochy jednotlivých SRSE. Při rozlišení 2.8 až 3.6 pixelů na mm2 je digitalizovaná plocha nadhodnocena asi o 16% a hodnoty plochy jsou velmi variabilní neboť není správně nerozeznán okraj SESE. Jak se ukázalo při vyšším rozlišení kritického detailu se variabilita výrazně snižuje. Pro naše další experimenty bylo vybráno rozlišení kritického detailu 5 pixelů na mm2, což je zajišťuje dobré určení hodnoty plochy SRSE a je vhodné pro konstantní nastavení metody. Námi vytvořené konstantní nastavení metody nám umožnilo studovat pouze změny plochy SRSE. Metoda umožnila velmi rychle a snadno vypočítat plochu všech digitalizovaných SRSE při jejich automatickém načtení v programu. SRSE P. abies klonu 2/32 byla současně vážena a snímána CCD-kamerou. Průměrné relativní přírůstky hmotnosti a plochy SRSE v průběhu čtrnáctidenní kultivace vykazovaly lineární trend (y = 14.872x - 9.6697 R2 = 0.99; y = 9.0561x - 6.0197 R2 = 0.9833) avšak směrnice jejich přímek se od sebe výrazně liší. Pozorovali jsme, že hmotnost SRSE v porovnání s jejich plochou roste rychleji, a to po celou dobu kultivace. Pozorované rozdíly jsou pravděpodobně způsobeny výraznějším růstem SRSE do výšky. I přes zjištěný rozdíl obou metod je určení plochy SRSE vhodným nástrojem pro stanovení růstové charakteristiky SRSE.

63

Literatura (1) Petřek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Vacek, J.; Víteček, J.; Havel, L. MendelNET,

Brno, 2003; p 32. (2) Petřek, J.; Vacek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Havel, L. Plant Cell Rep. 2004,

submitted. (3) Petřek, J.; Vlašínová, H.; Kizek, R.; Vacek, J.; Víteček, J.; Havel, L. Lesnická práce

2004, in press. (4) Vacek, J.; Petřek, J.; Havel, L.; Klejdus, B.; Kizek, R. VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2003; p 64. Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

TESTOVÁNÍ VLIVU MAGNETICKÝCH NOSIČŮ NA BÁZI CELULÓZY NA

PRŮBĚH PCR TESTING OF CELLULOSE BASED MAGNETIC CARRIERS ON THE PCR

COURSE

Kateřina Petrová, Alena Španová, Bohuslav Rittich Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra mikrobiologie, Tvrdého 14,

602 00 Brno

Magnetické nosiče na bázi celulózy nacházejí uplatnění v řadě molekulárně diagnostických metod. Při jejich použití v PCR však nesmějí interferovat s komponentami PCR, protože interference by vedla ke snížení citlivosti PCR, případně k falešně negativním výsledkům reakce. Bylo testováno 8 magnetických nosičů: A57 (celulóza-ferrit), A58 (celulóza-magnetit), A59 (kyselina alginová-magnetit), A101 (ferrit), A109 (ferrit modifikovaný 4-aminofenylovými skupinami), A110 (ferrit modifikovaný 2-aminoethylovými skupinami, A112 (ferrit modifikovaný kyselinou alginovou), A114 (magnetit modifikovaný kyselinou alginovou). Byl testován vliv těchto magnetických nosičů, případně komponent používaných pro jejich syntézu, na průběh PCR. Testování bylo prováděno s DNA izolovanou z bakterií rodu Bifidobacterium. V PCR směsi byly k amplifikaci použity čtyři různé koncentrace DNA a rodově specifické primery Pbi F1 a Pbi R2, které jsou komplementární ke konzervativním sekvencím v oblasti pro 16S rDNA (1). Specifický PCR produkt o délce 914 bp byl detekován pomocí agarózové gelové elektroforézy. Výsledky PCR reakcí byly srovnávány s pozitivními kontrolami. Jako pozitivní kontrola sloužila DNA rodu Bifidobacterium ve čtyřech různých koncentracích, která byla přidávána do PCR směsi bez magnetických nosičů. Na základě srovnání intenzit pásů na gelu bylo zjišťováno, zda magnetické nosiče snižují citlivost PCR, případně zda reakci úplně inhibují. Výsledky ukázaly u různých nosičů změnu citlivosti PCR, případně úplnou inhibici PCR. Dále ukázaly na rozdíl mezi magnetickými nosiči s inkorporovaným ferritem nebo magnetitem. Použitá literatura: (1) D.Roy, S.Sirois, FEMS Microbiol. Lett. 191(2000), 17-24.

64

ANTICANCER DRUG ELLIPTICINE IS OXIDIZED BY PEROXIDASES TO REACTIVE SPECIES BINDING TO DNA

Jitka Poljakováa, Jan Sejbalb, Miroslav Šulca, Eva Freic and Marie Stiborováa

aDepartment of Biochemistry, bDepartment of Organic Chemistry, Faculty of Science,

Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2, The Czech Republic, cDepartment of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer

Feld 280, 61920 Heidelberg, Germany

Ellipticine and its more soluble derivatives exhibit promising results in the treatment of breast cancer and acute myeloblastic leukemia. The inhibition of topoisomerase II after intercalation into DNA was considered an important property for its cytotoxicity. The CYP-dependent activation leading to DNA adducts formation, we found to be generated in vitro and in vivo, is a novel mechanism for the ellipticine pharmacological action [1,2,3]. Target tumor cells express, beside CYP1A1, 1B1, 3A4, also peroxidases (myeloperoxidase or lactoperoxidase). Since the participation of peroxidases in metabolism of ellipticine has not been identified yet, the aim of the present work is to extend our knowledge on this issue. Lactoperoxidase, myeloperoxidase and a model plant peroxidase (from horseradish) were used in our study. Ellipticine is oxidized by all these peroxidases via a radical mechanism. Using mass spectrometry (MALDI-TOF, EI) and NMR we found that ellipticine is primarily oxidized to a one-electron reaction product (radical) producing a dimer as the major metabolite. Peroxidase attacks a nitrogen atom of a pyrrole ring of the ellipticine skeleton to form a radical, which is subsequently bound to carbon C9 in the second molecule of ellipticine. Its formation of ellipticine is inhibited by radical trapping agents (glutathione, NADH) and by DNA or deoxyguanosine 3’-monophosphate. Another ellipticine metabolite formed by peroxidases is N(2)-oxide of ellipticine. The same metabolite is formed also by CYP-mediated reactions. During oxidation of ellipticine by peroxidases, two ellipticine-DNA adducts, which were generated by CYP-mediated reaction [1,2], are also formed. An identity of adducts formed by CYPs and peroxidases were confirmed by co-chromatography on TLC and HPLC. Deoxyguanosine was determined as a target deoxynucleoside for ellipticine covalent binding in DNA. The involvement of myeloperoxidase and lactoperoxidase in an increase of ellipticine pharmacological efficiency in the target tumor tissues is discussed. REFERENCES

1. Stiborová M., Bieler C.A., Wiessler M., Frei E.: Biochem. Pharmacol., 62, 1675-1684 (2001).

2. Frei E., Bieler C.A., Arlt V.M., Wiessler M., Stiborová M.: Biochem. Pharmacol., 64, 289-295 (2002)

3. Stiborova M., Breuer A., Aimova D., Stiborova-Rupertova M., Wiessler M., Frei E.: Int. J. Cancer, 107, 885-890 (2003).

Supported by Grant Agency of the Czech Republic (grant 203/01/0996) and the Ministry of Education of the Czech Republic (grant MSM 113100001).

65

DETERMINATION OF BOND BETWEEN PROTEIN P53 AND DNA BINDING SEQUENCE USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH

ELECTROCHEMICAL DETECTION STANOVENÍ VAZBY PROTEINU P53 NA DNA VAZEBNOU SEKVENCI POMOCÍ

VYSOKO-ÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE S ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ

David Potěšil1,2, Jitka Petrlová1, Jan Vacek1, Marie Brázdová3, Jana Zelená1, Přemysl Lubal2

René Kizek1

1Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno, 2Katedra analytické chemie, PřF MU, Kotlářská 2, 611 37 Brno, 3Heinrich Pette Inst Expt Virol & Immunol, Dept

Tumor Virol, Univ Hamburg, D-2000 Hamburg, Germany

Již v roce 1979 byl objeven velmi důležitým nádorovým supresorový gen p53. Jeho označení p53 vychází z hodnoty jeho molekulové váhy (Mr 53 000). Je proteinem transkripčním, je složený ze čtyř pod-jednotek (celkem 393 aminokyselin), které jsou v buňce běžně přítomny ve velmi nízké koncentraci. Nastane-li poškození buněčné DNA, např. účinkem radiace, genotoxickými sloučeninami, lékem a pod., podjednotky p53 se začnou shlukovat a vytvářet aktivní formu p53. Tato forma je pak schopna regulace (indukce nebo inhibice) pomocí vazby na poškozenou DNA. Indukuje např. transkripci proteinů, které zastavují buněčný cyklus (p21WAFI, gadd-45), opravují poškozenou DNA (p53R2), nebo aktivují či inhibují apoptózu (aktivace: Bax; inhibice: BCL-xL). V buňce se však mohou objevovat látky, které na tvorbu p53 působí negativně. Příkladem takových látek může být MRP (multidrug resistence – associated protein), který způsobuje odolnost nádorových buněk k některým cytostatikům, nebo protein VEGF (Vascular endothelial growth factor), jehož působením je indukována tvorba nových cév nutných pro vyživování rostoucího nádoru.

V poslední době bylo zjištěno, že vznik aktivní formy p53 je závislý na přítomnosti iontů zinku v buňce, které v proteinu p53 koordinačně stabilizují specifickou doménu afinitní k DNA. Uvnitř centrální domény proteinu p53 je vázán vždy jeden atom zinku aminokyselinovými zbytky cysteinu a histidinu (Cys176, His179, Cys238 a Cys242). Odstraníme-li zinek s proteinu chelatačními činidly dojde ke změně konformace s neschopností tvořit vazbu s DNA, což vede ke ztrátě regulačních schopností proteinu p53. Podobný efekt má i záměna atomu zinku za jiný kovový kation, jako je např. Cd(II) a Co(II). Možnosti analytického stanovení interakce proteinů a nukleových kyselin jsou značně omezené a nebyly prozatím do všech podrobností popsány. I když hlavním současným nástrojem studia interakcí může posloužit gelová elektroforéza na polyakrylamidovém či agarózovém gelu, je u ní značná nevýhodou poměrně zdlouhavá příprava vzorků a obtížná reprodukovatelnost získaných výsledků. Zjednodušení a zautomatizování analýzy bez destrukce vzorku nabízí kombinace elektrochemie a vysoko-účinné kapalinové chromatografie. Literatura

1. Uldrijam S., Kotala, V., Vojtěšek, B. Chem. Listy, 96, 2002, 145-149. 2. Rejthar, A., Vojtěšek, B.: Obecná patologie nádorového růstu, Grada 2002. 3. Masařík, M., Kizek, R., Kramer, KJ. et al.: Anal. Chem. 75, 2003, 2663-2669. 4. Brázdová, M. Kizek, R., Havran, L. et al.: Bioelectrochemistry, 55, 2002, 115-118. 5. Trnková L., Kizek, R., Vacek, J.: Bioelectrochemistry, 55, 2002, 131-133. 6. Kizek, R., Trnková, L., Paleček, E. Anal. Chem. 73, 2001, 4801- 4807. 7. Vojtěšek, B., Bartek J., Mydgley CA.: J. Imunol. Methods. 151, 1992, 237-244 8. Fischer, CJ., Gillett, CE., Vojtěšek, B. et. al.: Brit. J. Cancer. 69, 1994, 26-31

66

Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

STUDY OF ANTIMUTAGENIC ACTIVITY OF SOME SORTS OF GREEN TEA. STUDIUM ANTIMUTAGENNÍ AKTIVITY VYBRANÝCH DRUH ZELENÉHO ČAJE

Ptáček P., Mikulcová A., Macuchová S., Márová I., Pekař M. VUT- Fakulta chemická, Purkyňova 118, 612 00 Brno

The term antimutagen is used to indicate any agent that reduces the number of

spontaneous or induced mutations. Important factors in the induction of mutagenesis and carcinogenesis are oxygen free radicals, which are considered to be major contributors to DNA damage. The diet contains a wide variety of compound appear to act as antioxidants and antimutagens. Thus, the possibility to alter cell response to mutagen by dietary factors has opened a new frontier for cancer control.

In this work biological effects of five sorts of green tea were analyzed using antimutagenicity test with Sacchromyces cerevisiae D7 strain. In this test the frequency of spontaneous convertants at the tryptophan locus (trp 5-12/trp 5-27) and revertants at the isoleucine locus (ilv 1-92/ilv 1-92) was tested. Tea extracts (extracted by hot water, 10 – 30 g of dry tea/ 100 ml) were allowed to be positive antimutagens based on their ability to inhibit the mutagenic effect of standard mutagen 4-nitroquinoline-1-oxid. Content of tea catechins in tested extracts was determined by RP-HPLC. Antioxidant capacity of extracts was analyzed using Randox „Total antioxidant status“ kit.

Content of tea catechins in tested samples ranged in 500 – 2000 mg/100 g of dry tea and 2000 – 3000 mg/100 g of (-)catechin and (-)catechin gallate, respectively. All tested extracts exhibited high antioxidant capacity and high positive antimutagenicity. Treatment of D7 cells by tea extracts led to 40 – 60 per cent on average of inhibition of trp convertants frequence and to 40 – 50 per cent of inhibition of ilv revertants frequence. In most samples significant dependence of antimutagenic effect on extract concentration was observed. Catechin standards did not show so high antimutagenic effects as green tea extracts, so, catchins probably are not major component responsible for complex antigenotoxic effects of tea extracts.

DETEKCE MUTACÍ V GENU SCN5A ZAPŘÍČIŇUJÍCÍCH SYNDROM

PRODLOUŽENÉHO QT-INTERVALU DETECTION OF SCN5A MUTATION WHICH CAUSE LONG QT-SYNDROME

Martina Raudenská, Ivo Papoušek, Karel Chroust

Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Inherited long QT syndrome (LQTS) is caused by mutations in seven genes including

SCN5A, encoding the alpha-subunit of the human cardiac voltage-dependent sodium channel. Long QT syndrome is an inherited disorder that results in lengthened cardiac repolarization. It can lead to sudden onset of torsades de pointes, ventricular fibrillation, and death. In LQT3 (type of LQTS), various mutations in SCN5A were identified, which produce a gain of

67

channel function. Prolongation of the QT interval is a known risk factor for syncope, seizures and sudden cardiac death. The most patients with QT prolongation have an acquired cause, but congenital forms of QT prolongation are being increasingly recognized.

The aim of this study was to screen SCN5A for mutations in patients with the LQTS phenotype and their relatives. Due to multiple loci and considerable size of these LQTS genes, their mutation detection represents a challenge that is partially met by the conventional screening method of single-stranded conformational polymorphism (SSCP). SSCP enables fast and sensitive analysis of PCR-amplified DNA fragments. The aim of this work was then to implementate and modify experimental parametrs of polymerase chain reaction (PCR) and SSCP methodology. After verification of primer characteristics optimalization of PCR for fragments of SCN5A gene was done. Particularly annealing temperature was optimized. PCR products were analyzed by SSCP. Products, which contain some discrepancy, were purified and subsequently sequenced. Total amount of 364 samples was screened. No mutation causing LQTS was found. Tato práce byla sponzorována grantem IGA NA 7424-3/2003 a FRVŠ 551/2003.

THE ENVIRONMENTAL POLLUTANT AND POTENT MUTAGEN 3-NITROBENZANTHRONE INDUCES EXPRESSION OF CYTOCHROME P450 1A IN

RAT

Marie Stiborová1, Helena Rýdlová1, Lucie Kutnerová1, Jana Hájková1, Eva Frei2, Heinz H. Schmeiser3

1Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Albertov 2030, 12840 Prague 2

2Division of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, Heidelberg 3Department of Nephrology, Hopital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Brussels

The environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone (3-nitro-7H-benz[d,e]anthracen-

7-one) is one of the most mutagenic nitroaromatic compounds identified in diesel exhaust and airborne particulate matter1. It is suspected to be a human carcinogen1. After metabolic activation it binds covalently to DNA that was documented by detection of specific DNA adducts2,3. Understanding which enzymes are involved in 3-nitrobenzanthrone (3-NBA) metabolism is important in the assessment of individual susceptibility to this molecule and its mechanism of carcinogenity. In this work we studied influence of this pollutant on the expression of various hepatic cytochromes P450, which have been found to be capable of activating 3-nitrobenzanthrone4.

The expression levels of different cytochromes P450 (CYP1A1, 1A2, 2B, 2E1 and 3A4) were determined in hepatic and renal microsomal fractions of rats pre-treated intraperitoneally with 0.4, 4.0 or 40.0 mg of 3-NBA/kg of body weight and compared with those of untreated control rats. Western blotting and consecutive immunoquantification employing chicken polyclonal antibodies raised against these CYPs were utilized. Evident increase in content of hepatic CYP1A1 and 1A2 was detected, being 10 times higher in rats pre-treated with 40.0 mg of 3-NBA/kg than in control samples for both CYPs. The increase in content of CYP1A1 itself in this sample seemed to be even higher (~ 15-fold). The level of renal CYP1A1/2 was also enhanced, namely, 4-fold. To support these results, we examined specific catalytic activities of several cytochromes P450 in all hepatic microsomal fractions, using marker substrates of individual CYPs. EROD (7-ethoxyresorufin O-deethylation) activity, corresponding to both CYP1A1 and 1A2, was significantly increased in rats pre-

68

treated with highest dose of 3-NBA. Our results demonstrate that 3-nitrobenzanthrone largely induces the expression of cytochrome P450 1A1 and 1A2 in rats. References: 1 Enya T., Suzuki H., Watanabe T., Hirayama T., Hisamatsu Y.: Environ. Sci. Technol. 31, 2772-2776, 1997 2 Bieler Ch. A., Wiessler M., Erdinger L., Suzuki H., Takeji E., Schmeiser H. H.: Mutation Research 439, 307-311, 1999 3 Arlt V. M., Bieler Ch. A., Mier W., Wiessler M., Schmeiser H. H.: Int. J. Cancer 93, 450-454, 2001 4 Arlt V. M., Stiborová M., Hewer A., Schmeiser H. H., Phillips D. H.: Cancer Research 63, 2752-2761, 2003

THERMOSTABLE CONJUGATES OF PLANT AMINE OXIDASES WITH β-CYCLODEXTRIN PRESERVE THE ORIGINAL ENZYMATIC ACTIVITY

Marek Šebela1, David Kopečný1, Zbyněk Lamplot1, Jan Havliš2, Henrik Thomas3 and Andrej

Shevchenko3 1Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783

71 Olomouc, Czech Republic 2Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2,

CZ-611 37 Brno, Czech Republic 3Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Pfotenhauerstrasse 108, D-

01307 Dresden, Germany

Plant copper-containing amine oxidases (EC 1.4.3.6) catalyse the oxidation of various amine substrates to form the corresponding aldehydes, ammonia and hydrogen peroxide. The enzymes from garden pea (PSAO, Pisum sativum) and grass pea (GPAO, Lathyrus sativus) can be both isolated in high yields as homogeneous preparations with high specific activity. They show a relatively good thermostability, however, prolonged incubations at temperatures above 60 oC result in a drop in the catalytic activity.

We have prepared conjugates of PSAO and GPAO with the oligosaccharide �-cyclodextrin (BCD) to improve their thermostability. The conjugation was performed using an established method. BCD was first oxidised by sodium periodate to obtain a reactive polyaldehyde. Then the polyaldehyde reacted with the enzymes via free lysyl groups in a buffered solution containing sodium cyanoborohydride as a reducing agent. Biochemical properties of the obtained conjugates (BCD-PSAO and BCD-GPAO) were characterised.

The prepared BCD-conjugates were active in amine oxidation but they showed partially decreased specific activities in comparison with those of the original enzyme samples. Conversely, Km values for the substrates putrescine and cadaverine remained unchanged. The thermostability was increased. Both BCD-conjugates could be incubated at 65oC for 30 min without any dramatic loss in activity. Some activity (around 5%) was still detectable even after the incubation at 75 oC. The conjugates contained around 30% of neutral sugars in their molecules (measured by a colorimetric method with glucose as a standard). Mass spectra patterns of trypsin digests of BCD-PSAO and BCD-GPAO were completely different from those of the native enzymes. Molecular mass values for BCD-PSAO and BCD-GPAO were determined using gel chromatography. SDS-PAGE could not give reliable results because the conjugates migrated only very slowly and remained at the top of a conventional 10% running gel. Whereas both native PSAO and GPAO showed a molecular mass value of 145 kDa, their

69

BCD-conjugates provided a higher value of about 180 kDa. This was in a good agreement with the amount of modified lysyl groups determined by a spectrophotometric method.

The described BCD-conjugates of PSAO and GPAO thus represent good candidates for biotechnological applications, where amine oxidation is needed to be performed at higher temperatures. This work was supported by the grants KONTAKT ME664 and MSM 153100013 from the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic.

POLYMORFISMUS PRIONOVÉHO GENU U OVCÍ VE VZTAHU KE SCRAPII POLYMORPHISM OF THE SHEEP PRION GENE IN RELATION TO SCRAPIE

Jarmila Sedláčková, Ján Matiašovic, Petr Hořín

Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno

Scrapie (klusavka) je smrtelné neurologické onemocnění ovcí, které spolu s BSE u skotu patří mezi nejčastější zvířecí spongioformní encefalopatie. Tato nemoc se vyskytuje po celém světě mimo Austrálii a Nový Zéland. Klusavkou trpí zejména ovce a kozy, ale experimentálně se jí podařilo nakazit i jiné zvířecí druhy. Tímto onemocněním trpí samci i samice většiny plemen s nejvyšším výskytem okolo 3,5 roku života. Podstatou všech TSE (transmisibilní spongioformní encefalopatie) je hromadění abnormálního patologického proteinu v nervových buňkách, kde posléze způsobí jejich zánik a uvolnění do extracelulárního prostoru. Vznikají tak amyloidem tvořené plaky, které jsou typické pro spongioformní degeneraci nervového systému. Inkubační doba závisí na míře a typu infekce a genotypu prionového genu ovce. Přesný způsob infekce není dodnes přesně znám, ale je jisté, že onemocnění se šíří poměrně snadno. Infekce může přežívat v kotcích a krmivu a je velmi odolná vůči desinfekčním prostředkům.

Cílem této práce bylo charakterizovat polymorfismus ve vybraném úseku (PrP) prionového genu a to u plemen chovaných v ČR ve vztahu k národnímu programu na ozdravení od scrapie. Vypracovat a standardizovat metodiku genotypizace PrP genu použitelnou pro účely národního programu (PCR-SSCP), srovnat ji s výsledky PCR-RFLP provedenými v SVÚ Jihlava a specifitu ověřit sekvenováním.

Gen o velikosti 31 412 bp se skládá ze tří exonů, CDS obsahuje 771 bp a výsledný produkt genu obsahuje 257 aminokyselin. Pro studium scrapie je nutné znát částečnou sekvenci 3. exonu PrP genu - je důležitá přítomnost určité aminokyseliny v polohách 136, 154 a 171.

V poloze 136 se může vyskytovat alanin (A) nebo valin (V), v poloze 154 arginin (R) a histidin (H), v poloze 171 se může objevovat arginin (R), glutamin (Q) a histidin (H).

Prostřednictvím metody PCR se specifickými ovčími primery byl amplifikován úsek dlouhý 227 bp a následnou vertikální chlazenou elektroforézou na 13 % PAA gelu s 5 % glycerolem odděleno a jasně identifikováno pět odlišných SSCP vzorů. Tyto vzory byly pojmenovány dle přítomnosti aminokyseliny v jednotlivých polohách – ARR, ARQ, ARH, AHQ, VRQ - byly potvrzeny sekvenací a sloužily následně jako známé kontroly.

Podle National Scrapie Plan byly genotypy uspořádány do pěti skupin. První skupina zahrnuje jen homozygoty ARR/ARR a jde tedy o ovce, které jsou geneticky nejvíce odolné ke scrapii. Druhá skupina obsahuje heterozygoty ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ - ovce s

70

genetickou rezistencí ke scrapii, ale potřebnou selekcí při budoucím křížení. Ve třetí skupině se nacházejí heterozygoti ARQ/ARH, ARQ/AHQ, AHQ/ARH a homozygoti AHQ/AHQ, ARH/ARH a ARQ/ARQ - ovce s nízkou rezistencí ke scrapii, ale mohou být použity při křížení až do konce roku 2004. Čtvrtá skupina zahrnuje jen ARR/VRQ - genotyp náchylný ke scrapii, který lze výjimečně použít při kontrolovaném křížení ve schváleném programu. Poslední skupinu tvoří ovce s genotypy AHQ/VRQ, ARH/VRQ, ARQ/VRQ, VRQ/VRQ s vysokou vnímavostí ke scrapii, berani musí být kastrováni nebo poraženi.

Celkem bylo vyšetřeno 377 ovcí 9 plemen, vypočteny alelové frekvence. Na základě získaných statistických dat lze považovat alelu ARR za alelu s ochranným efektem. Alela ARQ je spojena s vnímavost ke scrapii a bude využita při selekci.

Na základě získaných výsledků lze konstatovat, že metoda PCR-SSCP je vhodná a spolehlivá pro odhalení a určení polymorfismu PrP genu. Práce byla částečně podporována grantem Svazu chovatelů ovcí a koz ČR.

VLIV RŮSTOVÝCH REGULÁTORŮ NA PROLIFERACI BUNĚK TABÁKU (NICOTIANA TABACUM L.) BY-2

THE INFLUENCE OF GROWTH REGULATORS TO PROLIFERATION OF TOBACCO BY-2 CELLS

Jan Sláma1, Lenka Andrýsková1, Ladislav Havel1, Jan Víteček1, Jan Vacek2, René Kizek2

1Ústav botaniky a fyziologie rostlin, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno 2Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Buněčná suspenzní kultura tabáku (Nicotiana tabacum L.) linie BY-2 byla testována na předpokládaný vliv vybraných růstových regulátorů na indukci apoptosy. Byl sledován vliv N6-benzylaminopurinu (BAP), 6-(γ,γdimetylallylamino)purinu - (2iP), kinetinu, thidiazuronu, m-topolinu, zeatinu a 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D) na proliferaci buněk BY-2 v závislosti na koncentraci a době jejich působení. Přímým počítáním buněk pomocí počítací komůrky bylo zjištěno, že při aplikaci mikromolárních koncentrací těchto růstových regulátorů dochází ke snížení buněčné hustoty vůči kontrole. Vliv studovaných látek na životaschopnost (viabilitu) byl testován pomocí fluorescenčních barviv fluoresceindiacetátu (FDA) a propidium jodidu (PI). FDA vstupuje přes intaktní cytoplazmatickou membránu do buněk, kde je hydrolyzován esterasami a při pozorování pod fluorescenčním mikroskopem buňky vykazují intenzivní zelenou fluorescenci. Naproti tomu, PI do živých buněk nevstupuje, takže jeho detekovatelný signál značí poškození buněk (červeně fluoreskující buňky). Využitím tohoto způsobu barvení byl zjištěn pokles počtu živých buněk BY-2 v rozmezí od 10 – 100% ve srovnání s kontrolní variantou. Došlo k výraznému zpomalení nebo dokonce zastavení buněčné proliferace. Námi testované deriváty purinu - BAP, 2iP, kinetin a zeatin v koncentracích řádově desítek mikromolů blokovaly buněčnou proliferaci a bylo možné pozorovat typické morfologické a biochemické znaky apoptosy, včetně smršťování protoplastu, kondenzace chromatinu a degradace jaderné DNA na oligonukleosomy. Zatímco vliv m-topolinu na snížení počtu živých buněk nebyl tak výrazný. V případě, že buňky BY-2 byly kultivovány v přítomnosti nepurinového růstového regulátoru thidiazuronu, nebyl pozorován výraznější rozdíl ve srovnání s kontrolní variantou. Pokud byla 2,4-D aplikována v desítkách mikromolů k jednotlivým růstovým regulátorům, byl u BAP, 2iP a zeatinu pozorován řádově o desítky procent vyšší počet živých buněk, což

71

bylo pravděpodobně způsobeno protektivním účinkem 2,4-D na buňky BY-2 vystavené vlivu těchto těchto zmíněných růstových regulátorů.

Poděkování Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004. Literatura 1) Havel L, Durzan DJ, Bot. Acta, 109, 268-277, 1996 2) Havel L, Durzan DJ, J. Int. Plant. Sci., 157, 8–16, 1996 3) Kasparovsky T, Milat ML, Humbert C, Blein JP, Havel L, Mikes V, Plant. Physiol. Biochem., 41, 495-501, 2003 4) Gahan PB, Wang L, Bowen ID, et al., Plant Cell Tiss Org. 72 (3): 237-245 MAR 2003 5) Vermeulen K, Strnad M, Krystof V, et al., Leukemia, 16 (3): 299-305 MAR 2002)

3-NITROBENZANTHRONE, THE ENVIRONMENTAL POLLUTANT AND POTENT MUTAGEN, FORMS DNA ADDUCTS AFTER METABOLIC

ACTIVATION BY HUMAN HEPATIC CYTOSOLS: EVIDENCE FOR ACTIVATION BY NAD(P)H:QUINONE OXIDOREDUCTASE AND SULFOTRANSFERASES 1A1

AND 1A2

Marie Stiborová1, Volker M. Arlt2, Heinz H. Schmeiser3, Eva Frei3, David H. Phillips2 1Department of Biochemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 40 Prague 2,

2Institute of Cancer Research, Section of Molecular Carcinogenesis, Brookes Lawley Building, Cotswold Road, Sutton, Surrey SM2 5NG, UK,

3Department of Molecular Toxicology, German Cancer Research Center, 69 120 Heidelberg

Determining the capability of humans to metabolise the suspected carcinogen 3-nitrobenzanthrone (3-NBA) and understanding which human enzymes are involved in its activation are important in the assessment of individual susceptibility to this environmental contaminant found in diesel exhaust and ambient air pollution.

We compared the ability of twelve human hepatic cytosolic samples to catalyse DNA adduct formation by 3-NBA. Using two enrichment procedures of the 32P-postlabelling method, nuclease P1 digestion and butanol extraction, we found that all hepatic cytosols were competent to activate 3-NBA. DNA adduct patterns with multiple adducts, qualitatively similar to those found recently in vivo in rats [1,2] were observed.

To define the role of human cytosolic reductases in the activation of 3-NBA, we investigated the modulation of 3-NBA-DNA adduct formation by cofactors or selective inhibitors of the NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) and xanthine oxidase (XO). Based on these studies, we attribute most of the activation of 3-NBA in human hepatic cytosols to NQO1, although a role of cytosolic XO cannot be ruled out. With human recombinant NQO1 and XO from butter milk, the major role of NQO1 in the formation of 3-NBA-DNA adducts was confirmed. The role of conjugation enzymes [sulfotransferases (SULTs) and N-acetyltransferases (NATs)] of human cytosolic samples was also examined, using cofactors of these enzymes. On the basis of this analysis, we found the major and minor roles of hepatic SULTs and NATs in activation of 3-NBA, respectively. Using cytosols containing individual human recombinant SULTs, participation of SULT 1A1 and, to a lesser extent, SULT1A2 in 3-NBA activation was found. These results demonstrate for the first time

72

the potential of human NQO1 and SULT 1A1 and 1A2 to contribute to the metabolic activation of 3-NBA. References 1) Arlt V. M., Bieler C. A., Mier W., Wiessler M., Schmeiser H. H.: Int. J. Cancer, 93, 450-

454 (2001). 2) Arlt V.M., Stiborová M., Hewer A., Schmeiser H.H., Phillips D.H.: Cancer Res., 63,

2752-2761 (2003). Supported by Cancer Research UK, Ministry of Education of the Czech Republic (Grant MSM

113100001) and Baden-Württemberg (BWPLUS, BWB 20003). PROTEKTIVNÍ ÚČINEK FLAVONOLIGNANŮ PROTI OXIDATIVNÍMU STRESU

VYVOLANÉMU PEROXIDEM VODÍKU V LIDSKÝCH KERATINOCYTECH A FIBROBLASTECH

PROTECTIVE EFFECT OF FLAVONOILIGNANS AGAINST H2O2-INDUCED OXIDATIVE STRESS IN HUMAN KERATINOCYTES AND FIBROBLASTS

Alena Svobodová, Jitka Psotová, Daniela Walterová

Institute of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine, Palacký University, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic; alf.svoboda@seznam.cz

UV skin exposure induces extensive generation of reactive oxygen species (ROS). These can react with DNA, proteins, fatty acids, and saccharides causing oxidative damage. Such injuries result in a number of harmful effects: disturbed cell metabolism, morphological and ultrastructural changes, attacks on the regulation pathways, alterations in the differentiation, proliferation and apoptosis of skin cells. These processes can lead to photoageing and skin cancer development. Hydrogen peroxide is one of the most frequent form of ROS produced in dermal cells after UV exposure, mainly as a result of UVA action (320-400 nm). For this reason H2O2 is often used as an experimental agent to simulate cell UV damage. One approach to protecting humans from the harmful effects of UV irradiation is the use of active photoprotectives. In recent years naturally occurring herbal compounds such as phenolics have gained considerable attention as protective agents. In this study we have investigated the effects of the selected flavonolignans – silybin and dehydrosilybin, on H2O2-induced keratinocyte and fibroblast damage. The normal human keratinocyte cell line (HaCaT; 1×105 cells/cm2) was incubated in Dulbecco’s modified Eagles’s medium supplemented with 7% fetal calf serum (FCS) for 48 h. Human dermal fibroblasts (BALB; 1×105 cells/cm2) were incubated in Dulbecco’s modified Eagles’s medium supplemented with 5% FCS and 5% newborn calf serum (NCS) for 24 h. The HaCaT/BALB were pretreated with test compounds (10-50 µM) in a medium without serum for 30 min and then H2O2 (0.50 / 0.25 mM; 4 h) was applied. The cytoprotective effect of the test compounds against H2O2 was evaluated using following parameters: neutral red retention, MTT reduction, LDH leakage, and intracellular GSH level. Test compounds exhibited the ability to reduce H2O2-induced keratinocytes and fibroblasts damage. Protective effect of dehydrosilybin was higher than of silybin. At the tested concentration range (1-50 µM) silybin had no cytotoxic effects. Dehydrosilybin from 50 µM in HaCaT and 25 µM in BALB showed low cytotoxicity (10-20%). However, dehydrosilybin at lower concentrations (10-25 µM in HaCaT and 10 µM in BALB) proved much more active

73

than silybin in both cells. The double bond in ring B (C2 = C3) of dehydrosilybin is responsible for its better cytoprotectivity. ACKNOWLEDGEMENT: This work was supported by the internal LF UP grant No. 11501109, GA ČR grant No. 303/02/1097 and Ministry of Education grant MSM 151100003.

PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF ANTIPEPTIDE CHICKEN ANTIBODIES RECOGNIZING CYTOCHROME P-450 73A1 FROM TULIPA

FOSTERIANA PŘÍPRAVA A CHARAKTERIZACE ANTIPEPTIDOVÝCH SLEPIČÍCH

PROTILÁTEK PROTI CYTOCHROMU P-450 73A1 Z TULIPA FOSTERIANA

Soňa Tomková, Petr Hodek Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 2030, 128

40 Praha 2, Česká republika

Cytochromy P-450 (CYP) (EC 1.14.14.1.) patří mezi klíčové enzymy metabolismu cizorodých látek (xenobiotik) i látek endogenních. Vyskytují se jak u živočichů tak u rostlin. Koncentrace rostlinných CYP jsou často nižší než 0,1 nmol/mg proteinu, což je až 30x méně než hladiny pozorované např. v krysích játrech. CYP 73A1 (EC 1.14.13.11.) katalyzuje 4-hydroxylaci kyseliny trans-skořicové na kyselinu p-kumarovou. 4-hydroxylasa kyseliny skořicové(C4H) takto katalyzuje první oxidativní krok ve specificky rostlinné metabolické dráze, vedoucí k syntéze ligninu, flavonoidů, kumarinů a dalších derivátů kyseliny fenylpropanové. Ke studiu CYP jsou často používány protilátky. Cílem této práce bylo navodit produkci, izolovat a charakterizovat protilátky proti dvěma peptidům (MAP) cytochromu P-450 73A1. Dále sledovat jejich hladinu pomocí metody ELISA a potvrdit jejich specifitu proti CYP 73A1 v mikrosomálních preparátech Tulipa fosteriana (kultivary Stressa a Red Emperor) metodou „Western-blot“. Důvodem, proč chceme slepičí protilátky proti CYP 73A1, je možnost detekce tohoto enzymu. K navození produkce protilátek slouží imunizace Důvodem, proč byl u slepic jako imunogen použit pouze peptid a ne celý protein, je fakt, že izolace CYP 73A1 rostlin je náročná a poskytuje velmi malý výtěžek. Protože u tulipánu není známa sekvence CYP 73 A1 (C4H), bylo navíc třeba použít antigenní sekvence C4H z příbuzného druhu: Helianthus tuberosus (Jeruzalémského artyčoku). Protilátky proti těmto peptidům byly použity k detekci C4H (CYP 73A1) z cibulí tulipánu (Tulipa fosteriana). Vybraným peptidům byla zvětšena relativní molekulová hmotnost metodou „Multi Antigen Peptide“ (MAP), aby byly rozpoznány imunitním systémem slepice. Z původních čtyř MAPů a čtyř slepic byly vybrány a přiřazeny dva antigeny dvěma slepicím na základě co nejmenší reaktivity slepičích protilátek s antigeny. Slepice 3 byla imunizována antigenem C: (H-LAQSFEYNYG)8Lys7-OH a slepice 4 antigenem A: (H-PEEFRPERF)8Lys7-OH. Testem ELISA byla detekována hladina specifických protilátkových frakcí s použitím MAP A (slepice 4) a MAP C (slepice 3) jako antigenů. Metodou ELISA jsme ověřili specifitu protilátkových frakcí vůči peptidovým antigenům. Metodou „Western-blot“ byla ověřována specifita protilátkových frakcí vůči celým proteinům (CYP 73A1). Touto metodou bylo u slepice 3 potvrzeno, že protilátka připravená proti MAPu C velmi specificky reaguje s tímto antigenem. Protilátka rozpoznala specificky jedinou zónu o RMH asi 58 000, která může odpovídat CYP 73 A1 (C4H) Tulipa fosteriana pomocí srovnání s RMH C4H Jeruzalémského artyčoku, která je 57 920 (dle Swiss-Prot. DB). Kontrolní protilátka nereagovala se žádným vzorkem C4H. U slepice 4 byla zjištěna menší specifita vůči MAPu A, směs protilátek rozpoznávala i další proteiny. Proto byla frakce s nejvyšší hladinou protilátek afinitně

purifikována. Afinitní chromatografie s imobilizovaným peptidem (MAP) je nová technika. Afinitní purifikací byly získány monospecifické protilátky proti MAP A. ELISA test prokázal porovnáním srovnatelných koncentrací původní protilátky a afinitně purifikované protilátky, že schopnost protilátky rozpoznat antigen se minimálně 9x zvýšila. Protilátka poté rozpoznala specificky jednu zónu o RMH asi 58 000, která může odpovídat CYP 73 A1 (C4H) Tulipa fosteriana. Podařilo se připravit specifické protilátky rozpoznávající cytochrom P-450 73A1.

ROSTLINNÉ ESTERASY JAKO MARKER PRO KONSTRUKCI RŮSTOVÉ KŘIVKY

PLANT ESTERASES AS A MARKER FOR GROWTH CURVE ESTIMATION

Jan Víteček1, René Kizek2, Jiří Petřek1, Jan Vacek2, Ladislav Havel1 1 Ústav botaniky a fyziologie rostlin a 2 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta

MZLU, Zemědělská 1, 613 00 Brno, ČR

Pro dávkovou kultivaci představuje růstová křivka klíčový parametr. K její konstrukci se velmi často využívá sledování svěží hmotnosti nebo sušiny. Tento postup je mnohdy nevýhodný kvůli nutnosti sklidit dostatečně velké množství kultury. Alternativou může být přímé mikroskopické počítání buněk prostřednictvím počítací komůrky. Technika je však časově náročná, vykazuje značnou experimentální chybu a v některých případech ji nelze realizovat kvůli vzniku velkých shluků buněk. Další metody (např. měření optické hustoty a sledování sedimentačních charakteristik) nejsou pro stanovení růstové křivky vždy vhodné neboť v průběhu kultivační doby může dojít ke značným změnám morfologie buněk. Intracelulární esterasy jsou již delší dobu využívány jako marker buněčné životaschopnosti. Kromě toho novější práce naznačují, že aktivita intracelulárních esteras v dané kultuře závisí pouze na počtu životaschopných buněk.

Cílem naší práce bylo vyvinout experimentálně nenáročnou metodu stanovení aktivity intracelulárních esteras v rostlinné suspenzní kultuře a ověřit, zda lze intracelulární esterasy využít jako marker pro konstrukci růstové křivky. Pro tyto účely jsme použili buněčnou suspenzi tabáku (linie BY-2) a dva substráty vhodné pro detekci esteras: p-nitrofenylacetát a fluoresceindiacetát. Esterasy štěpí p-nitrofenylacetát za vzniku barevného produktu – p-nitrofenolu, který lze detekovat spektrofotometricky při vlnové délce 405 nm. Tento postup nevyžaduje nákladné laboratorní vybavení. Dosažená citlivost metody je však nižší než při použití fluoresceindiacetátu, který při štěpení esterasami poskytuje produkt detekovatelný fluorimetricky (�excitace 490 nm a �emise 514 nm). Druhý zmíněný postup umožňuje stanovit aktivitu esteras v malém množství biologického materiálu. Výsledky získané oběma metodikami potvrzují možnost využit intracelulárních esteras jako markeru pro konstrukci růstové křivky. ))

74

50 µm50 µm

Snímek buněk BY-2

Literatura

Amano T. a kol. (2003) Analytical BioChoi Y.-J. and Lee B. H. (2001) BioproNatagata a kol. (1992) International Re

í

Rel

ativ

ní a

ktiv

ita

intra

celu

lárn

ích

est

eras

(%

Doba kultivace (h)

Podíl mrtvých buněk

(%)

020406080

100120140

0 50 1000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

ní a

ktiv

ita

intra

celu

lárn

ích

est

eras

(%

Doba kultivace (h)

Podíl mrtvých buněk

(%)

020406080

100120140

0 50 1000

20

40

60

80

100

chemistry 314:1-7 cess and Biosystems Engineering 24:59-63

view of Cytology 132:1-30

75

Steward N. a kol. (1999) Plant Cell Rep 19:171-176 Vitecek J. a kol. (2004) Plant Tis Org Cultur.,submitted. Víteček J. a kol. 5 th International Symposium in the Series Recent Advances in Plant Biotechnology 2003, Stará Lesná, Slovak Republic: 159. Víteček J. a kol. 3. Metodické dny 2003, Ždárské vrchy - Milovy: 73. Víteček J. a kol. MendelNET 2003, Brno: 47.

Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, Grantu 203/02/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA METICILIN REZISTENTNÍCH KMENŮ STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE FAKULTNÍ NEMOCNICI BRNO-BOHUNICE

MOLECULAR DIAGNOSTICS OF METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN FACULTY HOSPITAL BRNO-BOHUNICE

Voborníková Marie, Pantůček Roman, Doškař Jiří

Katedra genetiky a molekulární biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně

Meticilin rezistentní kmeny Staphylococcus aureus (MRSA) jsou jednou z nejčastějších

příčin nozokomiálních nákaz. Ve FN Brno-Bohunice byl první epidemický kmen MRSA izolován v roce 1996 a i když se jej začátkem roku 2000 podařilo eradikovat, byl nahrazen kmeny novými, které jsou studovány v této práci. Z celkově 90 izolátů S. aureus z FN Brno-Bohunice z let 1998-2003, identifikovaných pomocí testu citlivosti k antibiotiku jako meticilin rezistentní, je předmětem této práce soubor 27 vybraných kmenů, v němž jsou zahrnuty izoláty pocházející jak přímo od pacientů, tak z nemocničního prostředí. Pomocí PCR u nich byla ověřena přítomnost genů mecA a femA kódujících proteiny nezbytné pro meticilinovou rezistenci. Pro genotypizaci všech kmenů byla použita metoda pulzní gelové elektroforézy (PFGE). Porovnání SmaI makrorestrikčních spekter umožnilo rozdělit kmeny do 10 skupin. Byl určen typ stafylokokové chromozomální kazety mec (SCCmec), což je mobilní genetický element obsahující zejména geny podmiňující různé typy rezistence. Dále byl v genomech těchto kmenů pomocí multiplex PCR určen obsah profágů séroskupin A, B, Fa a Fb.

V testované skupině izolátů byly nejčastější zcela identické podskupiny kmenů označené podle typu makrorestrikčního spektra a typu SCCmec jako 1a/IIIA (6 izolátů shodně z popáleninového centra z let 1999 a 2000), 2e/IV (2 izoláty z různých oddělení z let 2001 a 2002) a 2e/III vykazující odlišnosti v obsahu profágů (9 izolátů). Zbylé kmeny měly jedinečný genotyp. Na základě epidemiologických šetření lze vyslovit hypotézu, že zdrojem kmenů může být centrum pro popálené a nejčastější cestou přenosu ruce ošetřujícího personálu. Studium genotypu kmenů MRSA přispívá k objasnění původu a cest šíření těchto kmenů.

Tato práce byla podporována grantem GA ČR č. 301/02/1505.

76

EXPRESE REKOMBINATNÍHO XPA PROTEINU POMOCÍ BEZBUNĚČNÉHO RTS SYSTÉMU

M. Vojtíšková1, I. Sedlářová2, K. Stehlíková1 , Brabec V. 1

1 Biofyzikální ústav AV ČR, 61265 Brno 2 Katedra genetiky a mol. bioologie, Přírodovědecká fakulta MU v Brně

Pro studium mechanismu nukleotidové excisní reparace (NER) na vzorcích DNA modifikovaných chemoterapeutickým účinnými látkami ( např. cis-diamminodichlorplatinou, cis DDP) jsme zavedli metody pro expresi a purifikaci rekombinantního XPA proteinu. Plasmid pET15b. XPA (1) s klonovanou cDNA byl použit pro in vitro syntézu proteinů v translačním systému (RTS, Roche) pro rychlou přípravu rekombinantních proteinů, které nevyžadují následnou postranslační modifikaci. RTS využívá standartními metodami purifikovanou DNA příslušného rekombinantního plasmidu v množství cca 10 – 15 ug templátu. Princip metody spočívá v simultánní transkripci a translaci v 1 ml pracovním prostoru a s10 ml zásobní částí reakční kyvety, umístěné do RTS přístroje s nastavitelnou teplotou, časem a měnitelnými otáčkami magnetického míchadla. Reakční produkt, rekombinantní protein, je následně koncentrován v pracovním prostoru. Podmínky reakce se řídí typem proteinu, obvykle ale je dosaženo množství až stovek ug v průběhu několika hodin. Naše zkušenosti s využitím přípravy rekombinantních proteinů v RTS budou diskutovány. Literatura:

(1) Missura M., et al. : EMBO J., 20 (2001) 3554 – 3564 Tato práce byla podpořena grantem GAAV č. A5004101 MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR IDENTIFICATION OF EXFOLIATIVE TOXIN-PRODUCING STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS

Voller Jiří, Růžičková Vladislava

Department of Genetics and Molecular Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic

Exfoliative toxins A (ETA) and B (ETB) are the principal causative agents of staphylococcal epidermolyses. Bullous impetigo and its generalized form staphylococcal scalded skin syndrome (SSSS) usually affect newborns, although adults with underlying disease, such as immunodeficiency and renal failure, can be affected as well [1, 2]. Characteristic intraepidermal cleavage leading to blistering is caused by toxin-mediated proteolysis of desmoglein 1, a protein critical for integrity of desmosome [3]. The aim of this work was to optimize multiplex PCR for detection of the genes encoding exfoliative toxins ETA and ETB, gene for the holin and for a part of the nucleotide sequence unique to Staphylococcus aureus described previously [4]. For amplification of these loci we used primers originally designed for conventional one-step PCR [5, 6]. The conditions of the multiplex PCR were optimized according to the criteria described previously [7]. The multiplex PCR assay was tested on the DNA templates of the set of 36 exfoliatin-positive strains of S. aureus isolated in various maternity units where outbreaks of pemphigus neonatorum had been reported during years 1998 - 2002. Using the multiplex PCR assay, we were able not only to identify the virulence genes eta and etb, but also to detect in

77

one-tube reaction the variable elements carrying these genes, i.e., prophages belonging to the phage serogroup B and a plasmid.

We conclude that the simultaneous amplification of more than one locus in the same reaction makes the reported multiplex PCR a rapid and convenient screening assay for reliable identification of exfoliatin-producing strains of S. aureus.

References: [1] Ladhani S., Joannou C.L., Lochrie D.P., Evans R.W., Poston S.M. (1999) Clin. Microbiol.

Rev. 12, 224-242. [2] Farrel A.M. (1999) Lancet 354, 880-1. [3] Hanakawa Y., Schechter N.M, Lin C., Garza L., Li H., Yamaguchi T., Fudaba Y.,

Nishifuji K., Sugai M., Amagai M., Stanley J. R. (2002) J. Clin. Invest. 110, 53-60. [4] Štěpán J., Pantůček R., Růžičková V., Rosypal S., Hájek V., Doškař J. (2001) Cell.

Probes 15, 249-257. [5] Yamaguchi T., Hayashi T., Takami H, Nakasone K., Ohnishi M., Nakayama K., Yamada

S., Komatsuzawa H., Sugai M. (2000) Mol. Microbiol. 38, 694-705. [6] Johnson W.M., Tyler S.D., Ewan E.P., Ashton F.E., Pollard D.R., Rozee K.R. (1991) J.

Clin. Microbiol. 29,426-30. [7] Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. (1997) Biotechniques

23, 504-11. Supported by the grant No. CEZ: J07/98:143100008, Ministry of Education, Czech Republic.

SLEDOVÁNÍ TOXICITY A GENOTOXICITY HALOGENOVANÝCH ALIFATICKÝCH UHLOVODÍKŮ U DROSOPHILA MELANOGASTER TOXICITY AND GENOTOXICITY OF HALOGENATED ALIPHATIC

HYDROCARBONES IN DROSOPHILA MELANOGASTER

Veronika Zajíčková, Karel Chroust

Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a molekulární biologie, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Halogenated hydrocarbons are organic substances used especialy in industry and agriculture. They can threaten human population and whole ecosystem by their potential toxic and genotoxic effects. Two of them: 2-chloroacetonitrile and 2-chloropropane were evaluated for toxic activity and chloroacetonitrile also for genotoxic activity. Somatic mutations and recombinations test (SMART) in the wings of Drosophila melanogaster was adopted. Third-instar larvae trans-heterozygous for the third chromosome recesive markers multiple wing hairs (mwh) and flare-3 (flr3) were exposed to different concentrations of the test substances for 48 hours. Than the 50% lethal concentration (LC50) of the tested substances was determined. Genetic changes induced in somatic cells of the wing`s imaginal discs lead to the formation of mutant clones on the wing blade. Induced mutations and recombinations are detected as single or twin spots (mwh and flr phenotype) on the wing of survived adults. Recording of the frequency and the size of different spots allows quantitative determination of the mutagenic and recombinogenic effects. It was confirmed that both hydrocarbons have toxic effects. Lethal concentrations of 2-choroacetonitrile - 1,24µg/l and lethal concentration of 2-chloropropane - 146,3µg/l were

defined. There was a significant difference between genotoxic activity of chloroacetonitrile and negative control. This work was supported by MSMT 14100008.

UREÁZOVÁ AKTIVITA V SEMENECH VYBRANÝCH DRUHŮ ROSTLIN UREASE ACTIVITY IN SEEDS OF SELECTED PLANT SPECIES

Josef Zehnálek, Jitka Petrlová, Jana Zelená, Jan Hradecký, Jan Vacek, René Kizek

Ústav chemie a biochemie, MZLU Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno

Enzym ureáza (EC 3.5.1.5, močovina amidohydroláza) je obecně rozšířeným enzymem u rostlin a je přítomna u řady eukaryotických mikroorganismů a baktérií, u vyšších živočichů nebyla prokázána. Močovina je nejvýznamnějším dusíkatým hnojivem rostlin v řadě zemí (Čína, Indie, Spojené Státy). Enzym ureáza hraje klíčovou roli v katalýze rozkladu močoviny za vzniku oxidu uhličitého a amoniaku.

C=ONH2

NH2

+ OH2 NH3 + CO22

Ureáza je enzym, který vykazuje absolutní substrátovou specifitu, což znamená, že hydrolyzuje pouze močovinu a nereaguje s žádnou jinou sloučeninou (ani se substituovanými močovinami nebo biuretem). Pro stanovení aktivity enzymu byla vypracována řada přímých i nepřímých analytických metod. Nejběžnější jsou detekce amoniaku reakcí s indofenolem, stanovení 14CO2 a řada enzymatických reakcí spojených se spektrofotometrickým měřením oxidace NADPH. Ureázu můžeme získat přímou extrakcí ze semen některých vyšších rostlin a takto získaný preparát použít k rozladu močoviny. V naší práci jsme optimalizovali extrakční postup izolace enzymu ureázy z vybraných potravinářsky významných semen rostlin (bob, hrách, sója, kukuřice a slunečnice). Testovali jsme extrakci ureázy ve vodě, ethanolu a fosfátovém pufru. Mírou rychlosti enzymové reakce bylo pak množství amoniaku vzniklého za časovou jednotku. Množství amoniaku bylo stanoveno spektrofotometricky na základě reakce s Nesslerovým činidlem (tetrajodortuťnatan draselný). Vzniklý produkt má červenohnědé zbarvení a lze jej stanovit měřením absorbance při 436 nm. Semenné extrakty získané z různých druhů rostlin byly dále testovány a výsledky jsou ukázány na obrázku 1. Nejvyšší aktivitu ureázy vykazovala semena sóji a neočekávaně i slunečnice a kukuřice. Získané výsledky naz čují, že v semenech řady potravinářsky využitelných rostlin je přítomna ureáza ve vyšší konc ntraci.

Poděkování Práce na téMZLU č. 432Grantu 203/0

78

nae

0.0

40.0

80.0

120.0

Akt

ivita

ure

ázy

(%)

Bob

Hrách

Sója

Kukuřice

Slunečnice

to publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty 1 00001, FRVŠ 1203/2003 a 2004, Národního výzkumného centra LN00A081, 2/0422 od GA ČR a IGA MZLU 2004.

79

Literatura: Zehnálek J., Minár J., Honza J.: Rost. Výrob 36, 797–804, 1990 Zehnálek J., Minár J., Vicherková M.: Rost. Výrob 33, 653–662, 1987 Zehnálek J., Procházka S.: Rost. Výrob 32, 403–409, 1986 Witte C-P., Medina-Escobar, N.: Anal. Biochem. 290, 102-107, 2001 Witte C-P, Tiller S. A., Taylor M. A., Davies H. V.: Plant Physiol. 128, 1129-1136, 2002

K

80

A

Adam · 55 Aimová · 39 Andrýsková · 70 Arlt · 71 Astl · 59

B

Babula · 40 Balková · 41 Batůšková · 42 Bauerová · 22 Bednář · 48 Bedřichová · 43 Beneš · 3 Bezouška · 4, 26, 30, 53 Billová · 8 Blanchard · 33 Blažková · 22 Böhmová · 23 Borská · 15, 24 Bořek-Dohalská · 39 Bouchal · 5, 47 Brabec · 11, 76 Brázda · 26 Brázdová · 34, 65 Breierová · 58 Breuer · 57 Brichta · 24 Bryja · 19 Brzobohatý · 12, 21, 23, 25, 36Březinová · 39 Budová · 20

Č

Češková · 46 Čigašová · 58

D

De Groot · 33 Dostál · 10 Doškař · 45, 75 Drábková · 43, 50 Drahovská · 32 Dudová Magdaléna · 44 Dudová Markéta · 29, 45

E

Eyer · 45

AUTORSKÝ REJSTŘÍ

F

Faldíková · 35 Faldyna · 35 Floris · 50 Fojta · 6, 34 Fojtová · 7 Frei · 18, 39, 52, 53, 56, 57, 64,

67, 71

G

Gans · 33 Gautier · 20 Gavlasová · 34 Gilboa-Garber · 27 Glatz · 21

H

Hájková · 67 Havel · 21, 40, 54, 62, 70, 74 Havliš · 68 Havran · 6, 8 Helánová · 46, 47 Hodek · 9, 48, 51, 73 Horáková · 25 Hořín · 69 Hoyer · 31 Hrabal · 22 Hradecký · 78 Hradilova · 25 Hrstka · 13, 46 Hrušková-Heidingsfeldová · 10 Hyršová · 11

Ch

Chroust · 66

I

Imberty · 20, 27

J

Jagelská · 26 Janalíková · 11 Jančeková · 48 Janovská · 11 Jelen · 31, 54 Jovin · 31

K

Karabec · 48 Kavan · 26 Kizek · 31, 40, 42, 54, 55, 62,

65, 70, 74, 78 Klejdus · 55 Klíma · 36 Koblas · 9, 51 Kocábek · 45 Kočí · 43 Konečná · 3, 12, 21, 23, 45 Kopečný · 68 Kosinová · 38 Kostečková · 59 Kostlánová · 27 Kovařík · 7 Kremláčková · 49 Křížová · 28, 31 Kubáň · 55 Kubešová · 43, 50 Kučera · 5 Kutnerová · 67 Kyjovská · 29, 45

L

Lamplot · 50, 68 Lang · 22 Lízal · 41 Lubal · 65 Lukšan · 30

M

Macek · 31 Macuchová · 66 Machatková · 35 Mandl · 34, 47 Manhartová · 39 Marion · 33 Márová · 43, 50, 66 Martínek · 51, 52, 53, 59 Masařík · 31, 54 Matějková · 13, 17 Matiašovic · 69 Mátlová · 49 Mayer · 15 Medda · 50 Merkerová · 10 Mikasová · 32 Mikelová · 55 Mikšanová · 56, 57 Mikulcová · 66 Mitchell · 20, 27 Mlejnek · 25

81

Mlejnková · 25 Müller · 13, 46

N

Nálezková · 33 Nejedlá · 12 Němcová · 34 Norris · 13 Novák · 31 Novotná · 42

O

Omelka · 43, 50 Omelková · 48, 58 Owen · 39

P

Páca · 49, 59 Páca Jr. · 49, 59 Pácová · 59 Paděrová · 12 Padiglia · 50 Paleček · 6, 8, 26, 31 Pantůček · 45, 75 Papoušek · 66 Pavelka · 14, 60 Peč · 50 Pečinka · 26 Pekarová · 61 Pekař · 66 Petrlová · 55, 65, 78 Petrová · 63 Petřek · 62, 74 Phillips · 71 Pichová · 10, 22 Pivoňková · 34 Pokorná · 34, 50 Poljaková · 39, 64 Pospíšilová · 15, 26 Potěšil · 65 Preisler · 21, 45 Prodělalová · 16 Přecechtělová · 5 Psotová · 72 Pšikal · 38 Ptáček · 66

R

Raudenská · 66 Rauch · 22 Reková · 36 Relichová · 41 Rittich · 16, 28, 44, 63

Rodák · 38 Rubeš · 35 Ruml · 22 Růžičková · 61, 76 Rybář · 35 Rýdlová · 51, 56, 67

Ř

Řepková · 29, 43, 45

S

Sabin · 20 Sedláčková · 69 Sedlářová · 76 Seibal · 52 Sejbal · 39, 64 Semanská · 52 Shevchenko · 68 Schmeiser · 52, 56, 57, 67, 71 Sklenář · 31 Sladký · 40 Sláma · 70 Slováčková · 16 Souček · 36 Stehlíková · 76 Stiborová · 18, 39, 49, 51, 52,

53, 56, 57, 59, 64, 67, 71 Stobiecka · 31 Stratilová · 58 Strnad · 13, 40 Suchá · 49 Svobodová · 72

Š

Šebela · 50, 68 Ševčíková · 19 Šmajs · 11, 13, 17 Šmarda · 3, 19 Španová · 28, 44, 47, 63 Štětina · 37 Štruncová · 15 Šulc · 48, 56, 57, 64

T

Táborská · 21 Tesařík · 38 Thomas · 68 Tichý · 15 Tomková · 73 Trbušek · 24 Trefil · 9 Trnková · 42, 54, 55 Turek · 49

Turňa · 32

V

Vacek · 42, 54, 55, 62, 65, 70, 74, 78

Van Amerongen · 22 Vaňhara · 19 Váňová · 23 Veverka · 22 Víteček · 62, 70, 74 Vlašínová · 62 Voborníková · 75 Vojtěšek · 13, 34, 46 Vojtíšková · 6, 11, 76 Voller · 76 Vondrášková · 57

W

Walterová · 72 Weinstock · 13 Wichers · 22 Wimmerová · 20, 21, 27

Z

Zábranský · 22 Zahradníčková · 3 Zdráhal · 3, 5, 12, 21, 23, 45 Zehnálek · 42, 55, 78 Zelená · 65, 78

Ž

Žídek · 31

Bio-Consult LaboratTel/fax

tel a fa

East Po

tel.: 235 31 kan

Knihkupe

tel: 420 541 129 fax: 4

KRtel: 25

Mtel.: 57-7

MERtel.: 548

Otel a fax

Sigmtel: 420 246 003 20

TopTel/F

SPONZORUJÍCÍ FIRMY

ories, spol. s r. o., Božejovická 145 P.O. Box 7, Praha 4, 142 01 : +420 2 4447 1239; e-mail: info@bioconsult.cz

www.bioconsult.cz

Biotech a.s, Služeb 4, 108 52 Praha 10 x: 420 272 701 739, email: biotech@biotech.cz

www.biotech.cz

rt Praha s.r.o., Rubličova 1/969, 161 00 Praha 6 Bezplatná telefonní linka: 800100529

81 77, fax: 233 31 24 28, email: eastport@eastport.cz, celář Brno, tel: 51735 38 36, fax: 51735 38 36

www.eastport.cz

ctví MALÉ CENTRUM, Kotlářská 2, 611 37 Brno 202 (prodej), 420 541 129 544, 420 541 129 630 (kancelář) 20 541 129 630, email: mcentrum@sci.muni.cz

www.malecentrum.sci.muni.cz

D s.r.o, Plzeňská 552/265, 155 00 Praha 5 1 626 019, fax: 271 769 852, e-mail: krd@krd.cz

www.krd1.cz

.G.P., s r.o., Kvítková 1575, 760 01 Zlín 21 21 40; fax: 57-721 17 24; e.mail: mgp@mgp.cz Pražská kancelář: tel + fax: 2-244 362 37

www.mgp.cz

CI, s.r.o., Hviezdoslavova 55b627 00 BRNO 428 411; fax 548 211 485; e-mail:merci@merci.cz

www.merci.cz

ptoteam s.r.o., Kyjevská 6, 160 00 Praha 6 : 224 315 650; e-mail: zdenek.rudel@optoteam.cz

www.optoteam.cz

a-Aldrich s.r.o., Pobřežní 46, 186 21 Praha 8 0, fax: 420 246 003 291, e-mail: czecustsv@europe.sial.com

www.sigma-aldrich.com

-Bio, s.r.o., J. Jovkova 3262, 143 00 Praha 4 ax: 241 77 00 91; e-mail: top-bio@top-bio.cz

www.top-bio.cz