Virus 검사에 PCR 의 응용

발표 : R2 김영철

PCR 을 이용한 virus 검사항목• HPV (16,18)• Polioma Virus (BK,J

C) - RFLP• CMV• Parvovirus• HSV type 1,2• HHV type 6

• Rhinovirus• Enterovirus• Coronavirus• Mumpes virus• HCV

Virus 검사에서 검체의 채취

• 호흡기 검체 - nasopharyngeal aspirate

• 대변 - 발병 후 4 일 이내에 채취• 혈액 - sodium citrate tube

• 뇌척수액 - 혈액이 섞이지 않게• 면봉검체 - 수포성 :26G 주사기• 소변 - 중간뇨 10 mL

• 기타검체 - 마르기쉬운 검체 : 운송배지

DNA 분리방법• Lysis: 0.5% SDS, Proteinase K

• Purification of nucleic acid : Extraction with Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol

• Concentrating Nucleic acid: Ethanol precipitation, sodium acetate

• DNA washing

• DNA solubulization

RNA 분리방법• Lysis:Tri-reagent

• Phase separation: chloroforum

• RNA precipitation: isopropyl alcohol, Glycogen

• RNA washing

• RNA solubulization

Coprecipitants

• During centrifugation, carriers generate a visible pellet that facilitates handling of the target nucleic acid

• Glycogen, Linear polyacryamide, Yeast tRNA

Determination of DNA conc.

• Beer-Lambert Law• dsDNA 50 ug/mL 의 흡광도는 260 nm 에서 1.00• sDNA 33 ug/mL 의 흡광도는 260 nm 에서 1.00• sRNA 40 ug/mL 의 흡광도는 260 nm 에서 1.00• Concentration of DNA (ug/mL) = (A260-A320) X 50 ug/mL X dilution• Measure of purity of isolated nucleic acid : ratio of the absorbance at 260 nm and 280 nm

PCR 의 원리• Denaturation

• Annealing

• Extension

PCR reaction mixture

Component Vol./reaction Final conc./reaction

Template DNA Variable < 1 ug/reaction

dNTP mix (10 mM each) 2 uL 200 uM of each dNTP

Primer A Variable 0.1 –0.5 uM

Primer B Variable 0.1 –0.5 uM

Taq polymerase 0.5 uL 2.5 U

PCR buffer 10 uL

D.W

Total volume 100 uL

The amount of PCR product

• Product = 2n x l x m

A

(n: number of heat cycle, l: lengnth of amplified fragments in base pairs,

m: average mass of a base pair(constant),

A: Avogadro, number, 6 x 1023)

Detection

• Sensitivity of detection with ethidium bromide – 10 ng of DNA 가 검출될 수 있다 .

• 기타 염색에서의 검출율 Polyester-backed polyacrylamide gel 에서는

silver stainning 을 하면 picogram 까지 검출할 수 있다 .

Quantitation of nucleic acids

• Absorbance at 260 nm by spectrophotometer

• Emission at 458 nm in the presence of Hoechst 33258 by fluorometer

• Dipstick (a kit from Invitrogen)

• Ethidium bromide spot test by

UV transilluminator

Staining nucleic acids

• Ethidium bromide- staining DNA in gels(~10 ng/band)

• Methyene blue

• Silver staining

- < 1.0 ng of DNA

analyze single-stranded DNA by SSCP

• SYBR dyes

Summary

• Labor intensive 하지만 bcr-abl gene rearrangement 검사와 같이 1 년에 몇 case되지 않는 경우 기존 기구를 이용하여 setting 할 수 있겠습니다 .

• Nucleic acid 분리방법의 standard method를 이해함으로써 상품화된 시약을 평가 할 수 있겠습니다 .