Vliv opakovaného podání metamfetaminu Vliv opakovaného podání metamfetaminu a metanandamidu na expresi DRD1, DRD2 a metanandamidu na expresi DRD1, DRD2

a CB1 receptorů a CB1 receptorů v myším mesencefalu v myším mesencefalu

Michal Jurajda, Leoš Landa

Seminář Ústavu patologické fyziologie LF MU 26. 11. 2010

Studie ve kterých jsou hodnoceny účinky na pozorovatelné aktivity, odpovědi nebo preference u zvířat, včetně rozlišovacích pokusů.

BEHAVIORÁLNÍ FARMAKOLOGIE

použití zvířecích modelů

živý organismus, jehož studium podle určitých pravidel dovoluje reprodukovat a analogicky odvozovat chování a fenomény vyskytující se u člověka nebo dalších živočišných druhů.

definice zahrnuje modely určené pro studium fyziologických i patologických procesů a zákonitostí

Zvířecí model

Nejrozšířenější metody zvířecích modelů závislostí

zaměřeny na schopnost návykových látek přímo ovlivnit chování zvířat

definice závislosti je zde formulována jako behaviorální vzorec kompulzivního užívání drog, charakterizovaný nepřekonatelnou potřebou

-užívat drogu

- zajišťovat její přísun

- velkou tendencí k relapsu při abstinenci (Jaffe, 1975)

Zvířecí modely závislostí (rozdělení):

Modely založené na pozitivní posilovací vlastnosti drogy

Modely averzivních vlastností po vysazení drogy

Operantní autoaplikace (self-administrace)

Odměna vyvolaná stimulací mozku

Preference místa

„Drug discrimination“ (rozpoznání, rozlišení drogy)

Operantní autoaplikace (self-administrace) u zvířat drogově závislých

Averze k místu

Modely založené na pozitivní posilovací vlastnosti drogy

Operantní autoaplikace (self-administrace – i.v., p.o.)

zneužívané látky jsou zvířaty snadno autoaplikovány

látky, které jsou ochotně autoaplikovány korespondují s látkami majícími vysoký návykový potenciál

tento vztah je tak silný, že je autoaplikace považována za prediktivní model návykového potenciálu látky

vodič s katétrem

infúzní pumpa

„neaktivní otvor“

„aktivní otvor“

katétr

PC

Vztah mezi endokanabinoidním systémem a metamfetaminovými mechanizmy v mozku

další experimenty s využitím jiných animálních modelů

saline 1,0 2,0 3,0 5,00

20

40

60

80

100

120

dose [mg/kg]

Effect of AM 251 pretreatment

% o

f M

ET

H b

aselin

ere

sp

on

din

g

* * * *

* p<0.01

Times Cited: 38

METAMFETAMIN

Endokanabinoidní systém CB receptory + endogenní ligandy

CB1 receptory (CNS)

CB2 receptory (buňky imunitního systému)

anandamid 2-arachidonoyl glycerolnoladin éter

syntetická forma METANANDAMID

Nepřímé sympatomimetikum (uvolňuje DA a NA, psychostimulans)

Metanandamid a metamfetaminMetanandamid a metamfetamin

zvýšení odpovědi po

opakované aplikaci látky

(většinou behaviorální:lokomoce, stereotypní pohyby)

snížená odpověď na účinky látky,která musí být pro dosaženístejného efektu podávána ve stále vyšších dávkách

podmínkou jeintermitentní podávání látky

látka je většinou podávánav kratších intervalech či kontinuálně

Uplatnění při závislosti na psychotropní látky(při odvykání stačí k vyvolání účinků menší množství drogy)

ToleranceTolerance

SenSenzzitizaceitizace(Robinson & Berridge, 1993)

Látky vyvolávající závislost

Behaviorální senzitizace

rozvojexprese

Zkřížená senzitizace = zvýšená odpověď na testovanou látku může být vyvolána předchozí opakovanou aplikací odlišné látky než je látka testovaná

Příklady zkřížené senzitizace:

tetrahydrokanabinolem k morfinu (Cadoni et al., 2001)

tetrahydrokanabinolem k heroinu (Lamarque et al., 2001

Příklady senzitizace:

amfetamin (Costa et al., 2001)

kokain (Elliot, 2002)

opiody (De Vries et al., 1999)

kanabinoidy (Cadoni et al., 2001)

Vliv ligandů kanabinoidních receptorů na senzitizaci k účinkůmmetamfetaminu na lokomoci u myší

Přístroj pro snímání motorické a explorační aktivity zvířat „Actitrack“ (Panlab s. l., Španělsko)

uběhnutá vzdálenost

tvar trajektorie

doba strávená rychlým pohybem

doba strávenou bez pohybu

panáčkování

Příklady měřených parametrů v testu otevřeného pole

vhodné pro testování účinku psychostimulačně působících látek, protože jejich aplikace se jasně projeví na zmíněných lokomočních prvcích chování

Rozdělení plochy na jednotlivé oblasti

Typické trajektorie v jednotlivých skupinách

Naivní myš Myš po 1. aplikaci metamfetaminu

Senzitizovaná myš

Pomocí tohoto modelu se nám podařilo prokázat:rozvoj zkřížené behaviorální senzitizace k psychostimulační látce metamfetaminu po předchozí opakované aplikaci agonisty kanabinoidních CB1 receptorů metanandamidu

potlačení tohoto fenoménu po předchozí opakované společné aplikaci metamfetaminu a antagonisty kanabinoidních CB1 receptorů, látky AM 251

Landa, L., Šlais, K., Šulcová A. Involvement of cannabinoid CB1 and CB2 receptor activity in the development of behavioural sensitization to methamphetamine effects in mice. Neuroendocrinology Letters 2006; 27: 63-69

Experimentální design

V = vehikulum, Met = metamfetamin, Can = metanandamid

Žádné aplikace

Žádné aplikace

1 2 3

Can 0.5 mg/kg/den i. p.n2

Open

field

Met 2.5 mg/kg/den i.p. n1

1413121110987654Den

V

V

MetMet

MetMet

V1

V2

M

C

MM

CM

Uběhnutá vzdálenost

V = myši po první aplikacivehikula

M = myši po 1. aplikacimetamfetaminu

MM = senzitizované myši

V = myši po aplikaci vehikula

C = myši po první aplikaci metanandamidu

CM = zkříženě senzitizované myši

Graf 1

NS

0

500

1000

1500

2000

2500

3000p < 0.05

p < 0.05

p < 0.01

0

500

1000

1500

2000

2500

NS

p < 0.01p < 0.01

Relativní exprese

• Relativní exprese jednotlivých druhů receptorů v myším mesencefalu byly stanoveny na úrovni mRNA pomocí real time PCR.

• Byla použita technologie TaqMan sond• Exprese byla vztažena k expresi Gapdh

Relativní exprese

• Experimentální zvířata byla usmrcena „přetržením vazu“

• Mozek byl okamžitě vypreparován z kalvy opláchnut ve fyziologickém roztoku a po přetětí v sagitální rovině stabilizován v patřičném množství RNAlater

Relativní exprese

• Izolace celkové RNA byla provedena pomocí kitu RNAeasy mini (Qiagen)

• Reverzní transkripce byla provedena pomocí kitu Omniscript (Qiagen) s použitím oligo dT primerů

Relativní exprese CB1 receptoru v 1. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression CNR

Median 25%-75% Min-Max F B D

Group

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

rela

t exp

ress

ion

CN

R

V

MMM

0,03

Relativní exprese CB1 receptoru v 2. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression CNR

Median 25%-75% Min-Max A C E

Group

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

rela

t exp

ress

ion

CN

R

VCM

C

0,03

0,003

0,0008

Relativní exprese D1 receptoru v 1. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression DRD1

Median 25%-75% Min-Max F B D

Group

0,0004

0,0005

0,0006

0,0007

0,0008

0,0009

0,0010

0,0011

rela

t exp

ress

ion

DR

D1

VM

MM

0,0008

Relativní exprese D1 receptoru v 2. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression DRD1

Median 25%-75% Min-Max A C E

Group

0,0004

0,0006

0,0008

0,0010

0,0012

0,0014

0,0016

rela

t exp

ress

ion

DR

D1

VCMC

0,03

0,02

Relativní exprese D2 receptoru v 1. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression DRD2

Median 25%-75% Min-Max F B D

Group

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

0,010

0,011

rela

t exp

ress

ion

DR

D2

V

M MM

Relativní exprese D2 receptoru v 2. větvi experimentu

Boxplot by Group

Variable: relat expression DRD2

Median 25%-75% Min-Max A C E

Group

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

rela

t exp

ress

ion

DR

D2

VCM

C

ZÁVĚRY I (behaviorální část experimentu) ZÁVĚRY I (behaviorální část experimentu)

1) Znovu bylo potvrzeno, že opakovaná aplikace metamfetaminu vyvolá behaviorální senzitizaci k jeho stimulačním účinkům

2) Stimulace kanabinoidních CB1 receptorů agonistou metanandamidem vedla ke vzniku zkřížené senzitizace k

metamfetaminu

ZÁVĚRY II - PCR část experimentu ZÁVĚRY II - PCR část experimentu (CB1 receptory) (CB1 receptory)

3) Výsledky studie pomocí real time PCR ukázaly signifikantně zvýšenou expresi CB1 mRNA po poslední dávce opakovaných

aplikací Met (tzn. u senzitizovaných zvířat).

4) Zvýšení exprese CB1 mRNA po první dávce metanandamidu, které bylo následováno snížením exprese CB1 mRNA po

provokující dávce metamfetaminu (tzn. u zkříženě senzitizovaných zvířat).

ZÁVĚRY III - PCR část experimentuZÁVĚRY III - PCR část experimentuD1 receptory D1 receptory

5) Zvýšení exprese D1 mRNA po poslední dávce opakovaných aplikací Met (tzn. u senzitizovaných zvířat). .

6) Zvýšení exprese D1 mRNA po první dávce metanandamidu, které bylo následováno nesignifikantním snížením exprese CB1 mRNA po provokující dávce metamfetaminu (tzn. u zkříženě

senzitizovaných zvířat).

ZÁVĚRY IV - PCR část experimentuZÁVĚRY IV - PCR část experimentuD2 receptory D2 receptory

7) Změny v expresi D2 mRNA nebyly signifikantní vůbec mezi žádnými skupinami ani u zvířat senzitizovaných ani u zvířat

zkříženě senzitizivaných k účinkům Met.

ZÁVĚRY V (PCR část experimentu) ZÁVĚRY V (PCR část experimentu)

Uvedené výsledky naznačují, že podání metamfetaminu a metanandamidu může vyvolat změny na genomové úrovni, které jsou zřejmě zapojeny v senzitizačních procesech, přinejmenším v

neuronech středního mozku myší u senzitizovaných zvířat.

Existující údaje o roli dopaminových D1 a D2 receptorů nebo jejich interakcí v procesech "posilujícího" účinku ("reinforcement") látek problematiku zcela neobjasňují a jsou dosti protichůdné (Ikemoto

et al., 1997; Bratcher et al., 2005; Kleinman et al. 2006).

Naše prezentované výsledky naznačují, přinejmenším na genomové úrovni, zapojení CB1 receptorů a D1 receptorů, nikoli však D2

receptorů v podmínkách behaviorální senzitizace k metamfetaminu a zkřížené senzitizace metanandamidem k metamfetaminu.

VÝSTUPY:

Landa, L., Jurajda, M. Behavioural sensitization to methamphetamine affects expression of cannabinoid CB1 receptors in mouse midbrain. Behavioural Pharmacology 2007, 18, Suppl. 1, S27-S28

Landa, L., Jurajda, M. Acute and repeated exposure to methamphetamine changes expression of CB1 receptor in mesencephalon of the mouse brain. European Neuropsychopharmacology 2007, 17, Suppl. 4, S557

Landa, L., Jurajda, M. Stanovení exprese genu pro kanabinoidní CB1 receptor pomocí real time PCR v myším mesencephalonu po senzitizaci metamfetaminem. Psychiatrie, 2008, Suppl. 1, 45

Landa, L., Jurajda, M. Akutní a opakovaná aplikace metamfetaminu ovlivňuje expresi genů pro kanabinoidní CB1 receptor a dopaminový D1 receptor v myším mezencefalu. In: Quo vadis, psychiatria?, Galén, 2008, 95 - 96

Landa, L., Jurajda, M.Behavioural sensitization to methamphetamine affects expression of dopamine D1 receptors in mouse midbrain. The International Journal of Neuropsychopharmacology, 2008, Vol. 11, Suppl. 1, 234

Landa, L., Jurajda, M. Repeated exposure to methamphetamine and methanandamide changes relative expression of D1 receptor in mouse midbrain. European Neuropsychopharmacology, 2008, 18, Suppl. 4, S542 – S543

Landa, L., Jurajda, M. Repeated methamphetamine administration changes the relative expression of D1 receptor but not of D2 receptor in mouse midbrain. In: Abstracts of Regional CINP Congress, Bratislava, 27. – 30. November,

2008, 41

Landa, L., Jurajda, M. Exprese genů pro dopaminové D1, 2 receptory v myším mesencephalonu po zkřížené senzitizaci kanabinoidem k metamfetaminu. Psychiatrie, 2009, Suppl. 1, 48

Děkujeme za pozornost